KR100552025B1 - 지방족 α,ω-디니트릴로부터 락탐의 제법 - Google Patents

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Abstract

지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서, 지방족 α,ω-디니트릴은 먼저, 지방족 니트릴라제 (EC 3.5.5.7) 활성을 갖거나, 또는 니트릴 히드라타제 (EC 4.2.1.84) 및 아미다제 (EC 3.5.1.4) 활성의 조합을 갖는 촉매를 사용하여 수용액중에서 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염으로 전환된다. 이어서, ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염은 중간체 ω-니트릴카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산을 단리시킴 없이 수용액에서의 수소화에 의해 직접 상응하는 락탐으로 전환된다. 지방족 α,ω-디니트릴이 또한 α-탄소 원자에서 비대칭적으로 치환되는 경우, ω-니트릴기의 가수분해로부터 생성된 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염이 니트릴라제에 의해 98%가 넘는 국부선택도로 생성되므로써 후속 수소화 동안 가능성 있는 2종의 락탐 생성물 중에서 1종만이 생성된다. 목적하는 국부선택적 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 활성을 선택하는 반면, 원치않는 활성을 없애는 열처리 방법도 또한 제공된다.
효소 촉매, 니트릴 히드라타제, 아미다제, 코마모나스

Description

지방족 α,ω-디니트릴로부터 락탐의 제법{PREPARATION OF LACTAMS FROM ALIPHATIC α,ω-DINITRILES}
본 발명은 생물학 및 화학 기술의 조합에 의해 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 지방족 α,ω-디니트릴은 먼저, 지방족 니트릴라제 (EC 3.5.5.7) 활성을 갖거나, 또는 니트릴 히드라타제 (EC 4.2.1.84) 및 아미다제 (EC 3.5.1.4) 활성의 조합을 갖는 촉매를 사용하여 수용액중에서 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염으로 전환된다. 이어서, ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염은 중간체 ω-니트릴카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산을 단리시킴 없이 수용액에서의 수소화에 의해 직접 상응하는 락탐으로 전환된다. 지방족 α,ω-디니트릴이 또한 α-탄소 원자에서 비대칭적으로 치환되는 경우, ω-니트릴기의 가수분해로부터 생성된 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염이 니트릴라제에 의해 98%가 넘는 국부선택도 (regioselectivity)로 생성되므로써 후속 수소화 동안 가능성 있는 2종의 락탐 생성물 중에서 1종만이 생성된다.
니트릴은 용이하게는 여러가지 화학적 방법에 의해 상응하는 카르복실산으로 전환되지만, 이들 방법에는 전형적으로는 강산 또는 강염기 반응 조건, 및 높은 반응 온도가 요구되고, 일반적으로 원치않는 부산물 및(또는) 원치않는 부산물로서 다량의 무기 염류가 생성된다. 니트릴 기질이 효소 촉매된 가수분해에 의해 상응하는 카르복실산으로 전환되는 방법은 종종 화학적 방법 보다 선호되며, 이는 이들 방법이 종종 주변 온도에서 진행되고, 강산 또는 강염기 반응 조건의 사용이 요구되지 않으며, 다량의 원치않는 부산물이 생성되지 않기 때문이다. 니트릴의 효소 촉매되는 가수분해가 화학적 가수분해에 비해 유리한 또다른 점은 여러 지방족 또는 방향족 디니트릴의 가수분해의 경우, 효소 촉매된 반응은 매우 국부선택적 (regioselective)일 수 있어서 2개의 니트릴기 중 하나만이 상응하는 카르복실산 암모늄 염으로 가수분해된다는 점이다.
니트릴은 니트릴라제 효소에 의해 아미드가 중간에 형성됨이 없이 수용액에서 상응하는 카르복실산 암모늄 염으로 전환된다. 방향족 니트릴을 상응하는 카르복실산 암모늄 염으로 가수분해하는 방향족 니트릴라제의 용도는 여러 해 동안 공지되어 왔으나, 지방족 니트릴라제의 용도가 보고된 것은 최근의 일이다. 고바야시 (Kobayashi) 등의 문헌 (Tetrahedron, (1990) vol. 46, 5587-5590; J. Bacteriology, (1990), vol. 172, 4807-4815)에는 지방족 니트릴의 상응하는 카르복실산 암모늄 염으로의 가수분해를 촉매하는, 로도콕커스 로도크러스 (Rhodococcus rhodochrous) K22로부터 단리된 지방족 니트릴라제가 기재되어 있으며, 여기서 여러 지방족 α,ω-디니트릴은 또한 가수분해되고, 글루타로니트릴은 촉매로서 휴지 세포를 사용하여 4-시아노부티르산 암모늄 염으로 100% 몰 전환률로 전환된다. 지방족 α,ω-디니트릴류를 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염 또는 디카르복실산 디암모늄 염으로 전활시킬 수 있는, 코마모나스 테스토스테로니 (Comamonas testosteroni)로부터의 니트릴라제는 단리되어 왔고 (캐나다 특허 출원 CA 제2,103,616호 (1994/02/11); S. Levy-Schil 등, Gene, (1995), vol. 161, 15-20), 아디포니트릴의 가수분해의 경우, 5-시아노발레르산 암모늄 염의 아디프산 디암모늄 염으로의 전환이 완료되기 전에 5-시아노발레르산 암모늄 염은 약 88%의 최대 수율로 얻어진다.
그라들리 (M. L. Gradley) 및 노울스 (C. J. Knowles)의 문헌 (Biotechnology Lett., (1994), vol. 16, 41-46)에는 몇몇의 2-메틸알킬니트릴의 가수분해를 위해 지방족 니트릴라제 활성을 갖는 로도콕커스 로도크러스 NCIMB 11216의 현탁액을 사용하는 것이 보고되어 있다. (+/-)-2-메틸부티로니트릴의 2-메틸부티르산 암모늄 염으로의 전환이 완전하게 얻어지는 반면, (+/-)-2-메틸헥산니트릴의 가수분해는 (+)-에난티오머에 대해 에난티오머특이적 (enantiospecific)인 것으로 나타난다. 벤기스-가버 (C. Bengis-Garber) 및 구트만 (A. L. Gutman)의 문헌 (Appl. Microbiol. Biotechnol., (1989), vol. 32, 11-16)에서는 몇몇의 디니트릴의 가수분해를 위한 촉매로서 로도콕커스 로도크러스 NCIMB 11216이 사용된다. 이 문헌에서, 푸마로니트릴 및 숙시노니트릴은 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환되는 반면, 글루타로니트릴, 아디포니트릴 및 피멜로니트릴은 상응하는 디카르복실산 디암모늄 염으로 전환된다.
니트릴 히드라타제 (NHase) 및 아미다제의 2종 효소의 조합은 또한 수용액에서 지방족 니트릴을 상응하는 카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 이 때, 지방족 니트릴은 초기에 니트릴 히드라타제에 의해 아미드로 전환된 후, 아미드는 아미다제에 의해 상응하는 카르복실산 암모늄 염으로 전환된다. 광범위한 세균 종은 다양한 범위의 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 갖는 것으로 공지되어 있으며, 로도콕커스, 슈도모나스 (Pseudomonas), 알칼리제네스 (Alcaligenes), 아르트로박터 (Arthrobacter), 바실러스 (Bacillus), 박테리듐 (Bacteridium), 브레비박테륨 (Brevibacterium), 코리네박테륨 (Corynebacterium) 및 미크로콕커스 (Micrococcus)가 포함된다. 이들 미생물의 수현탁액 및 단리된 효소 모두는 니트릴을 아미드 및 카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 데 사용되어 왔다.
회니케-슈미트 (P. Hoenicke-Schmidt) 및 슈나이더 (M. P. Schneider)의 문헌 (J. Chem. Soc., Chem. Commun., (1990), 648-650)에서는 니트릴 및 디니트릴을 각각 카르복실산 암모늄 염 및 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키기 위해 고정화된 로도콕커스 종 균주 CH 5가 사용된다. 이 세포는 기질의 92% 전환률을 기준으로 79%의 단리된 수율로 글루타로니트릴을 4-시아노부티르산 암모늄 염으로 전환시키는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성 모두를 갖는다. 블라켈리 (A. J. Blakely) 등의 문헌 (FEMS Microbiology Lett., (1995), vol. 129, 57-62)에서는 말로노니트릴 및 아디포니트릴을 국부특이적으로 (regiospecifically) 가수분해하여 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염만을 생성하기 위해 로도콕커스 AJ270 현탁액의 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성이 사용된다. 야마다 (H. Yamada) 등의 문헌 (J. Ferment. Technol., (1980), vol. 58, 495-500)에는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 모두를 함유하는 슈도모나스 종 K9를 사용하여 글루타로니트릴을 4-시아노부티라미드, 4-시아노부티르산, 글루타르산 및 암모니아의 혼합물로 가수분해하는 것이 기재되어 있다. 야마모또 (K. Yamamoto) 등의 문헌 (J. Ferment. Bioengineering, 1992, vol. 73, 125-129)에는 트랜스-1,4-디시아노시클로헥산을 트랜스-4-시아노시클로헥산카르복실산 암모늄 염으로 수율 99.4%로 전환시키기 위해 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성 모두를 갖는 코리네박테륨 종 CH 5 세포를 사용하는 것이 기재되어 있다.
모레아우 (J. L. Moreau) 등의 문헌 (Biocatalysis, (1994), vol. 10. 325-340)에는 브레비박테륨 종 R312 (니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성)를 사용하여 아디포니트릴을 중간체인 5-시아노발레르산의 형성을 통해 아디프산, 아디파미드 및 아디팜산으로 가수분해하는 것이 기재되어 있다. 케리지 (A. Kerridge) 등의 문헌 (Biorg. Medicinal Chem., (1994), vol. 2, 447-455)에는 프로키랄 3-히드록시글루타로니트릴 유도체를 상응하는 (S)-시아노산 암모늄 염으로 가수분해시키기 위해 브레비박테륨 종 R312 (니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성)를 사용하는 것이 보고되어 있다. 유럽 특허 제178,106 B1호 (1993년 3월 31일)에는 바실러스, 박테리듐, 미크로콕커스 또는 브레비박테륨으로부터 유도된 모노니트릴라제 활성 (니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제/아미다제의 조합으로서 정의됨)을 이용하여 지방족 디니트릴의 시아노기 중 하나를 상응하는 카르복실산, 아미드, 에스테르 또는 티오에스테르로 선택적 변형시키는 것이 기재되어 있다. 니트릴라제 활성 또는 니트릴 히드라타제/아미다제 활성을 갖는 세균성 촉매의 여러 예들 이외에, 아사노 (Y. Asano) 등의 문헌 (Agric. Biol. Chem., (1980), vol. 44, 2497-2498)에는 진균성 푸사륨 메리스모이데스 (Fusarium merismoides) TG-1에 의해, 글루타로니트릴은 4-시아노부티르산 암모늄 염으로, 그리고 2-메틸글루타로니트릴은 4-시아노펜탄산 암모늄 염으로 가수분해된다는 것이 입증되어 있다.
수용액중의 지방족 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염을 수소화하여 직접 상응하는 락탐을 생성하는 것은 선행기술에서 발견될 수 없었다. 근접한 관련 기술에서, 미국 특허 제4,329,498호에는 라니 니켈 촉매 #2를 사용하여 암모니아로 포화된 무수 에탄올에서 무콘산 모노니트릴을 6-아미노카프로산 (6-ACA)으로 수소화하는 것이 기재되어 있다. 수소화 촉매를 제거한 후, 6-ACA의 에탄올성 용액을 170 ℃ 내지 200 ℃로 가열하면 6-ACA의 카프롤락탐으로의 고리화가 예상된다. 1 N 수산화나트륨 용액에서 촉매로서 라니 니켈을 사용한 수소화에 의해 β-퀴녹살리닐프로파노산 (E. C. Taylor 등, J. Am. Chem. Soc., (1965), vol. 87, 1984-1990) 또는 관련된 2-(2-카르복시에틸)-3(4H)-퀴녹살론 (E. C. Taylor 등, J. Am. Chem. Soc., (1965), vol. 87, 1990-1995)의 환원성 고리화는 생성 혼합물로부터 촉매를 제거하고, 생성된 여액을 산성화시킨 후에만 상응하는 5원 고리 락탐을 생성하는 것으로 보고되어 있다. 상기 문헌의 저자들은 이들 환원의 모든 경우에 "락탐 형성은 산성 용액에서만 진행될 수 있다" (1992 페이지, 둘째 단락)고 말하고 있으며, 이것은 아마도 양자화된 카르복실산의 존재 및 카르복실레이트 염의 부재를 요 한다. 미국 특허 제4,730,040호에는 수소화 촉매의 존재하에 5-포르밀발레르산의 수용액을 암모니아 및 수소와 반응시킨 후, 암모니아를 생성 혼합물로부터 분리시키고, 생성된 6-ACA의 용액을 300 ℃로 가열하는, 카프롤락탐의 제조 방법이 개시되어 있다.
선행 문헌에는 니트릴 및 디니트릴을 여러가지 산 암모늄 염으로 전환시키는 데 사용되어 온 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성 모두를 갖는 단세포가 개시되어 왔다. 그러나, 본 발명의 수소화 반응 조건하에 (즉, 과량의 첨가된 수산화암모늄을 함유하는 수용액에서) 지방족 ω-아미노카르복실산의 암모늄 염을 고리화시켜 상응하는 락탐을 생성하는 것이 기재되어 있는 선행기술은 아직 발견되지 않았다. 근접한 관련 기술에서, 여러 반응 조건하에서 지방족 ω-아미노카르복실산 (암모늄 염은 아님)을 상응하는 락탐으로 고리화시키는 것은 보고되어 왔다. 마레스 (F. Mares) 및 쉬한 (D. Sheehan)의 문헌 (Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev., (1978), vol. 17, 9-16)에는 용매로서 물 또는 에탄올을 사용하여 6-아미노카프로산 (6-ACA)을 카프롤락탐으로 고리화시키는 것이 기재되어 있다. 물에서의 고리화 반응은 1 몰/㎏ (약 1 M) 미만의 농도에서 가역적이고, 카프롤락탐의 농도는 온도가 증가함에 따라 증가하며, 6-ACA 및 카프롤락탐의 전체 농도 0.85 몰/㎏ (약 0.85 M)에서 카프롤락탐의 백분율은 180 ℃의 38.7%에서 250 ℃의 92.2%로 증가되는 것으로 보고되어 있다. 에탄올중에서, 카프롤락탐은 200 ℃에서 수율 98%로 얻어지며, 이는 보고되기로는 물에서 우세한 분자내 알킬암모늄 카르복실레이트 형태의 6-ACA 보다 에탄올에서의 유리산/유리아민 형태의 6-ACA를 더 선호하는 화학평 형에 있어서의 이동에 기인한다. 6-ACA로부터 카프롤락탐의 제조 방법은 또한 미국 특허 제4,599,199호에 기재되어 있으며, 여기서 6-ACA는 수증기의 존재하에 290 ℃ 내지 400 ℃에서 암모니아 유동층내로 도입된다. 반응 동안 생성된 물을 연속 제거하여 톨루엔중에서 알루미나 또는 실리카 겔상의 지방족 ω-아미노산을 환형탈수시키므로써 5-, 6- 및 7원 고리 락탐을 합성하는 것은 블레이드-폰트 (A. Blade-Font)의 문헌 (Tetrahedron Letters, (1980), vol. 21, 2443-2446)에 보고되어 있다. 유리 아미노기 (양자화되어 있지 않음)는 환형탈수가 일어나는 데 요구되는 것으로 보고되어 있다.
메틸아민을 함유하는 수용액에서 지방족 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염을 수소화하여 직접 상응하는 N-메틸 락탐을 생성하는 것이 기재되어 있는 선행기술은 아직 발견되지 않고 있다. 근접한 관련 기술에서, 1,5-디메틸-2-피롤리돈은 140 ℃ 및 68-136 기압 (1000-2000 psig)의 수소압에서 라니 니켈 촉매를 사용하여 물에서 레불린산 및 메틸아민의 수용액을 수소화시키므로써 제조된다 (R. L. Frank 등, Org. Sytheses, (1954), Coll. Vol. 3, 328-329). 이어서, 생성된 4-N-메틸아미노펜타논산 메틸암모늄 염은 생성 혼합물을 여과하고, 여액을 증류시켜 물 및 메틸아민을 제거하므로써 상응하는 락탐으로 고리화된다. N-알킬 락탐은 또한 2-메틸글루타로니트릴, 1차 알킬아민 및 수소화 촉매를 함유하는 수성 혼합물을 직접 수소화시키므로써 제조되며, 이 방법에서 1,3-디알킬피페리돈-2와 1,5-디알킬피페리돈-2의 혼합물이 생성된다 (미국 특허 제5,449,780호). N-치환된 2-피롤리디논은 110-130 ℃에서 γ-발레롤락톤과 알킬 아민을 반응시킨 후, 생성된 혼합물을 250-270 ℃로 가열시키면서 물을 증류제거하므로써 제조된다 (F. B. Zienty 및 G. W. Steahly, J. Am. Chem. Soc., (1947), vol. 69, 715-716).
락탐 또는 N-알킬락탐을 제조하는 상기 방법은 하기 1가지 이상의 단점들을 갖는다: 용매로서 물을 사용하는 경우 고수율의 락탐을 얻기 위한 250 ℃가 넘는 온도의 사용, 락탐 형성으로의 화학평형을 유도하기 위한 반응 혼합물로부터의 물의 제거, 락탐 형성을 우세하게 하기 위한 반응 혼합물 pH의 산성값으로의 조절, 또는 출발 물질이 거의 용해될 수 없는 유기 용매의 사용. 이들 중 많은 방법에서 원치않는 폐 수증기 또는 용이하게 분리되지 않는 생성물의 혼합물이 발생된다.
본 발명은 상기한 바와 같은 단점을 해결하면서, 지방족 α,ω-디니트릴을 상응하는 락탐 또는 N-메틸락탐으로 고수율로 전환시키는 방법을 제공하고자 하며, 이러한 목적은 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 방법에 있어서 효소 촉매로서 매우 유용한 미생물을 제공함으로써 이루어진다.
본 발명은
(a) 수성 반응 혼합물중의 지방족 α,ω-디니트릴을 1) 지방족 니트릴라제 활성, 또는 2) 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하는 효소 촉매와 접촉시켜 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 단계,
(b) (a) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와 접촉시켜 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 중간체 ω-니트릴카르복실산, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 단리시킴 없이 직접 상응하는 락탐으로 전환시키는 단계, 및
(c) (b) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물로부터 락탐을 회수하는 단계
를 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐의 제조 방법에 관한 것이다.
(b) 단계 이전에, 수산화암모늄, 암모니아 기체 또는 메틸아민은 (a) 단계의 수성 생성 혼합물에 첨가될 수 있다. 이 첨가는 존재하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 양에 대해 0 내지 4 몰 당량일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 하기 화학식 1의 지방족 α,ω-디니트릴을 사용한다.
NCCXa(R)(CH2)nCN
식 중, a=0 또는 1이고, a=1인 경우 X=수소이며, R=H, 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬리덴이고, n=1 또는 2이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 세포 자체 촉매를 처리하여 지방족 α,ω-디니트릴의 상응하는 ω-시아노카르복실산 암모늄 염으로의 전환을 촉매할 수 있는 국 부선택적 니트릴라제 활성 또는 니트릴 히드라타제 활성을 선택하는 방법이다. 처리되는 세포 자체 촉매는 (1) 목적하는 국부선택적 니트릴라제 활성 또는 국부선택적 니트릴 히드라타제 활성, 및 (2) 원치않는 비국부선택적 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 활성의 2가지 유형의 활성을 특징으로 한다. 세포의 처리는 세포 자체 촉매를 10 내지 120 분 동안 약 35 ℃ 내지 70 ℃의 온도로 가열하여 원치않는 비국부선택적 니트릴라제 활성 또는 니트릴 히드라타제 활성을 없애고 목적하는 국부선택적 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 활성을 보존하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 미생물 세포 자체, 투과성 미생물 세포, 미생물 세포 추출물의 1종 이상의 세포 성분, 및 부분 정제된 효소(들) 또는 정제된 효소(들)의 형태의 효소 촉매를 사용한다. 이들 효소 촉매는 담체상에 고정화될 수 있다. 지방족 니트릴라제 활성을 특징으로 하고 본 방법에 유용한 미생물로는 악시도보락스 팍실리스 (Acidovorax facilis) 72-PF-15 (ATCC 55747), 악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 (ATCC 55745) 및 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)가 있다. 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하고 본 방법에 유용한 미생물로는 코마모나스 테스토스테로니 (Comamonas testosteroni) 5-MGAM-4D (ATCC 55744)가 있다.
또다른 실시양태는
(a) 수성 반응 혼합물중의 하기 화학식 2 또는 3의 지방족 α,ω-디니트릴을 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746), 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATCC 55747), 악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 (ATCC 55745) 및 코마모나스 테스토스테 로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 촉매와 접촉시켜 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키고,
(b) (a) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와 접촉시켜 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 중간체 ω-니트릴카르복실산, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 단리시킴 없이 직접 상응하는 락탐으로 전환시키며,
(c) (b) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물로부터 락탐을 회수하는
것을 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐의 제조 방법이다.
Figure 112005022603507-pat00001
Figure 112005022603507-pat00002
식 중, R1 및 R2는 모두 H이며, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 H, 치환 되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 방법의 또다른 실시양태는
(a) 수성 반응 혼합물중의 하기 화학식 4 또는 5의 지방족 α,ω-디니트릴을 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)와 접촉시켜 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키고,
(b) (a) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와 접촉시켜 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 중간체 ω-니트릴카르복실산, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 단리시킴 없이 직접 상응하는 락탐으로 전환시키며,
(c) (b) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물로부터 락탐을 회수하는
것을 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐의 제조 방법이다.
Figure 112005022603507-pat00003
Figure 112005022603507-pat00004
식 중, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되며, R7 또는 R8 중 어느 하나 또는 모두는 H가 아니다.
최종적으로, 하기 화학식 6 및 7의 신규한 화합물이 제공된다.
Figure 112005022603507-pat00005
식 중, M+은 H+ 또는 NH4 +이다.
Figure 112005022603507-pat00006
식 중, M+은 H+ 또는 NH4 +이다.
본 발명은
(a) 수성 반응 혼합물중의 지방족 α,ω-디니트릴을 1) 지방족 니트릴라제 활성, 또는 2) 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하는 효소 촉매와 접촉시켜 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 단계,
(b) (a) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와 접촉시켜 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 중간체 ω-니트릴카르복실산, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 단리시킴 없이 직접 상응하는 락탐으로 전환시키는 단계, 및
(c) (b) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물로부터 락탐을 회수하는 단계
를 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐의 제조 방법에 관한 것이다.
(b) 단계 이전에, 수산화암모늄, 암모니아 기체 또는 메틸아민은 (a) 단계의 수성 생성 혼합물에 첨가될 수 있다. 이 첨가는 존재하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 양에 대해 0 내지 4 몰 당량일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 하기 화학식 1의 지방족 α,ω-디니트릴을 사용한다.
<화학식 1>
NCCXa(R)(CH2)nCN
식 중, a=0 또는 1이고, a=1인 경우 X=수소이며, R=H, 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬리덴이고, n=1 또는 2이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 세포 자체 촉매를 처리하여 지방족 α,ω-디니트릴의 상응하는 ω-시아노카르복실산 암모늄 염으로의 전환을 촉매할 수 있는 국부선택적 니트릴라제 활성 또는 니트릴 히드라타제 활성을 선택하는 방법이다. 처리되는 세포 자체 촉매는 (1) 목적하는 국부선택적 니트릴라제 활성 또는 국부선택적 니트릴 히드라타제 활성, 및 (2) 원치않는 비국부선택적 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 활성의 2가지 유형의 활성을 특징으로 한다. 세포의 처리는 세포 자체 촉매를 10 내지 120 분 동안 약 35 ℃ 내지 70 ℃의 온도로 가열하여 원치않는 비국부선택적 니트릴라제 활성 또는 니트릴 히드라타제 활성을 없애고 목적하는 국부선택적 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 활성을 보존하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 미생물 세포 자체, 투과성 미생물 세포, 미생물 세포 추출물의 1종 이상의 세포 성분, 및 부분 정제된 효소(들) 또는 정제된 효소(들)의 형태의 효소 촉매를 사용한다. 이들 효소 촉매는 담체상에 고정화될 수 있다. 지방족 니트릴라제 활성을 특징으로 하고 본 방법에 유용한 미생물로는 악시도보락스 팍실리스 (Acidovorax facilis) 72-PF-15 (ATCC 55747), 악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 (ATCC 55745) 및 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)가 있다. 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하고 본 방법에 유용한 미생물로는 코마모나스 테스토스테로니 (Comamonas testosteroni) 5-MGAM-4D (ATCC 55744)가 있다.
또다른 실시양태는
(a) 수성 반응 혼합물중의 하기 화학식 2 또는 3의 지방족 α,ω-디니트릴을 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746), 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATCC 55747), 악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 (ATCC 55745) 및 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소 촉매와 접촉시켜 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키고,
(b) (a) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와 접촉시켜 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 중간체 ω-니트릴카르복실산, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 단리시킴 없이 직접 상응하는 락탐으로 전환시키며,
(c) (b) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물로부터 락탐을 회수하는
것을 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐의 제조 방법이다.
<화학식 2>
Figure 112005022603507-pat00007
<화학식 3>
Figure 112005022603507-pat00008
식 중, R1 및 R2는 모두 H이며, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 H, 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 방법의 또다른 실시양태는
(a) 수성 반응 혼합물중의 하기 화학식 4 또는 5의 지방족 α,ω-디니트릴을 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)와 접촉시켜 지방족 α,ω-디니트릴을 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키고,
(b) (a) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물을 수소 및 수소화 촉매와 접촉시켜 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 중간체 ω-니트릴카르복실산, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염, ω-아미노카르복실산 또는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 단리시킴 없이 직접 상응하는 락탐으로 전환시키며,
(c) (b) 단계로부터 생성된 수성 생성 혼합물로부터 락탐을 회수하는
것을 포함하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐의 제조 방법이다.
<화학식 4>
Figure 112005022603507-pat00009
<화학식 5>
Figure 112005022603507-pat00010
식 중, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 H, 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되며, R7 또는 R8 중 어느 하나 또는 모두는 H가 아니다.
최종적으로, 하기 화학식 6 및 7의 신규한 화합물이 제공된다.
<화학식 6>
Figure 112005022603507-pat00011
식 중, M+은 H+ 또는 NH4+이다.
<화학식 7>
Figure 112005022603507-pat00012
식 중, M+은 H+ 또는 NH4 +이다.
<생물학적 기탁물에 대한 간단한 설명>
본 발명자들은 부다페스트 조약하에 하기 표 1의 생물학적 기탁을 행하였다.
기탁자 식별 표시 국제 수탁 번호 기탁일
코모모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D ATCC 55744 1996년 3월 8일
악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 ATCC 55745 1996년 3월 8일
악시도보락스 팍실리스 72W ATCC 55746 1996년 3월 8일
악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 ATCC 55747 1996년 3월 8일
본 명세서에서 "ATCC"는 미국 20852 메릴랜드주 록빌 파클론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) 국제 기탁 기관을 칭한다. "ATCC 번호"는 ATCC에 기탁시 배양물에 대한 수탁 번호이다.
효소 및 화학 반응의 조합을 이용하는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 락탐을 고수율로 제조하는 방법이 개발되었다. α,ω-디니트릴이 비대칭적으로 치환되는 경우, 2종의 가능성 있는 락탐 생성물 중 1종에 대한 높은 국부선택도가 나타난다 (반응식 1).
Figure 112005022603507-pat00013
식 중, a=0 또는 1, a=1인 경우 X=수소, n=1 또는 2, R=H, 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알케닐, 또는 치환되지 않거나 또는 치환된 알킬리덴, 및 R1=H, -CH3이다.
본 발명의 생성물은 농업 및 제약 산업에서 높은 가치의 중합체, 용매 및 화학물질용 전구체로서 유용하다. 본 발명의 방법은 용매로서 물을 사용하는 경우, 250 ℃ 미만의 온도를 사용하여 고수율의 락탐을 얻는다. 이미 공지된 화학적 락탐 제법에 비해, 청구된 본 발명에서는 폐기물의 발생이 거의 없고, 생성물의 회수를 용이하게 하는 것이 가능하게 된다.
본 출원에서, 달리 특별하게 언급되지 않는 한, 하기의 약어 및 정의가 적용된다:
"효소 촉매"는 니트릴라제 활성, 또는 니트릴 히드라타제 활성 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하는 촉매를 칭한다. 촉매는 미생물 세포 자체, 투과성 미생물 세포(들), 미생물 세포 추출물의 1종 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소(들) 또는 정제된 효소(들)의 형태일 수 있다.
"수소화 촉매"는 그 자신은 소모되거나 또는 화학적 변화를 겪지 않으면서 수소화를 가속시키는 물질을 칭한다.
"수성 생성 혼합물"은 상응하는 공정 단계로부터 생성된 생성물을 함유하는 수성 혼합물을 칭하기 위해 사용된다.
A. 지방족 α,ω-디니트릴의 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로의 고수율 및 높은 국부선택도를 갖는 전환
본 발명의 상기 방법의 제1 단계는 효소 촉매를 사용하여 지방족 α,ω-디니트릴을 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 것이다. 효소 촉매는 α,ω-디니트릴을 직접 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 (반응식 2) 니트릴라제 활성을 갖거나, 또는 지방족 α,ω-디니트릴을 초기에 니트릴 히드라타제에 의해 ω-니트릴알킬아미드로 전환한 후, 이어서 아미다제에 의해 ω-니트릴알킬아미드를 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로 전환시키는 (반응식 3) 니트릴 히드라타제 (NHase) 및 아미다제의 2개 효소 활성의 조합을 갖는다.
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신규한 미생물 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)는 지방족 니트릴 또 는 디니트릴에 노출된 토양 견본으로부터 단리되며, 이것은 질소 공급원으로서 2-에틸숙시노니트릴을 이용할 수 있다. 2-메틸글루타로니트릴 (2-MGN) 또는 2-에틸숙시노니트릴 (2-ESN)과 같은 비대칭적으로 치환된 α-알킬-α,ω-디니트릴의 가수분해를 위해 미생물 세포 자체 촉매가 사용되는 경우, 생성물의 혼합물이 얻어진다. 가수분해 반응의 과정에 걸쳐, 상응하는 디카르복실산 모노아미드 및 디카르복실산은 목적하는 ω-니트릴카르복실산 이외에 추가로 생성된다. 단시간 동안 50 ℃의 적합한 완충액에서 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)의 현탁액을 가열하는 것은 원치않는 디카르복실산 모노아미드의 생성을 촉매하는 (그리고 아미다제에 의해 상응하는 디카르복실산으로 더 전환되는), 세포 자체 촉매의 원치않는 니트릴 히드라타제 활성을 실활시킨다는 것이 밝견되었다. 이 방식으로, α-알킬-α,ω-디니트릴을 ω-니트릴기의 가수분해로부터 생성된 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염으로만 전환시키는 니트릴라제 활성을 갖는 세포 자체 촉매가 제조된다.
50 ℃에서 1 시간 동안 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)의 현탁액을 열처리하므로써, 2-메틸글루타로니트릴 (2-MGN)을 4-시아노펜탄산 (4-CPA) 암모늄 염으로, 2-메틸렌글루타로니트릴 (2-MEGN)을 4-시아노-4-펜텐산 (4-CPEA) 암모늄 염으로, 또는 2-에틸숙시노니트릴 (2-ESN)을 3-시아노펜탄산 (3-CPA) 암모늄 염으로 가수분해하는 미생물 세포 자체 촉매가 매우 높은 국부선택도로 생성되어, 디니트릴의 전환이 완료될 때 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염은 ω-니트릴기의 가수분해에 의해 98% 이상의 수율로 생성된다 (표 2).
α,ω-디니트릴 ω-니트릴/산 암모늄 염 농도 (M) 수율 (%)
2-MGN 4-CPA(NH4 +) 0.10 99.3
상동 상동 0.40 99.4
상동 상동 1.00 99.4
상동 상동 1.85 98.8
상동 상동 2.00 98.9
2-MEGN 4-CPEA(NH4 +) 1.25 100
상동 상동 2.00 100
2-ESN 3-CPA(NH4 +) 0.10 100
상동 상동 0.40 100
상동 상동 1.00 100
상동 상동 1.25 100
디니트릴을 완전히 전환시킬 때, 지방족 디니트릴의 단지 1개 니트릴기만을 아미드기 또는 카르복실산기로 선택적 가수분해하는 어떠한 비효소적 방법도 현재는 없다. 이러한 반응이 모노아미드 또는 모노산 가수분해 생성물에 대한 높은 선택도를 얻기 위해 불완전환 전환률 (<20% 전환률)로 진행되는 경우, 디니트릴을 후속 반응으로 재순환시키기 위해 미반응 디니트릴로부터 생성물을 단리시키기 위해 분리 단계가 요구된다. 비효소적 가수분해 반응은 또한 전형적으로 종종 강산 또는 강염기의 존재하에 승온에서 니트릴 또는 디니트릴 용액을 가열하는 것을 포함하는 반면, 상술한 효소 촉매된 반응은 대기 온도에서 산 또는 염기의 첨가 없이 중성 pH의 수용액에서 수행된다.
원치않는 부산물 형성의 원인이 되는 단지 매우 낮은 수준의 원치않는 니트릴 히드라타제 활성을 초래하는 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 균주의 2종의 돌연변이체가 제조된다. 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATCC 55747) 및 악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 (ATCC 55745)의 이들 돌연변이 균주는 지방족 α,ω-디니트릴을 상응하는 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염으로 가수분해하기 위한 촉매로서 사용되기 전에 세포의 열처리를 요하지 않는다. 열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 및 처리되지 않은 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746), 및 처리되지 않은 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATCC 55747) 돌연변이 균주를 사용하여 2-MGN의 가수분해에 의해 생성된 4-CPA 및 2-메틸글루타르산 (2-MGA)의 수율 비교가 하기 표 3에 나타나 있다.
촉매 [2-MGN] (M) 4-CPA (% 수율) 2-MGA (% 수율)
처리되지 않은 악시도보락스 팍실리스 72W 0.10 62.7 34.6
열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W 0.10 99.3 0.7
처리되지 않은 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 0.10 96.8 3.6
열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W 0.40 99.4 0.6
처리되지 않은 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 0.40 98.8 1.2
열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W 1.00 98.7 1.3
처리되지 않은 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 1.00 99.2 0.8
열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)가 치환되지 않은 지방족 α,ω-디니트릴 숙시노니트릴 (SCN, 1.25 M) 또는 글루타로니트릴 (GLN, 1.5 M)의 수용액의 가수분해용 촉매로서 사용되는 경우, 상응하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염 3-시아노프로피온산 (3-CPRA) 및 4-시아노부티르산 (4-CBA)는 각각 99.7% 및 92.3%의 수율로 생성되고, 상응하는 디카르복실산은 단지 부산물로서 관찰된다. 이와 동일한 촉매가 아디포니트릴 (ADN)을 5-시아노펜탄산 (5-CPA) 암모늄 염으로 전환하는 데 사용되는 경우, 아디프산 (ADA) 디암모늄 염이 주생성물 (>50% 수율)이다. 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 및 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATCC 55747) 중 어느 것도 5-CPA 암모늄 염을 고수율로 제조하기 위한 촉매로서는 적합하지 않다.
지방족 니트릴 또는 디니트릴에 노출되어 질소 공급원으로서의 여러 니트릴 또는 아미드상에서 배양될 수 있는 토양 견본으로부터 단리된 30종 이상의 상이한 미생물 배양물은 5-CPA 생성에 대한 고선택도를 위해 스크리닝되었다. 몇몇 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 갖는 제2의 신규한 미생물인 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)가 단리되었다 (질소 공급원으로서 2-메틸글루타라미드를 사용함). ADN의 가수분해용 세포 자체 촉매로서 사용되는 경우, 생성된 생성 혼합물은 ADA 디암모늄 염, 아디파미드 (ADAM) 및 아디팜산 (ADMA)를 주성분으로 하고, 5-CPA 암모늄 염은 단지 적은 수율로 관찰된다. 미생물을 단시간 동안 50 ℃로 가열하므로써, 원치않는 니트릴 히드라타제 활성은 크게 실활되고, ADN을 5-시아노발레라미드로 전환시키는 니트릴 히드라타제 활성 및 5-시아노발레라미드를 5-CPA 암모늄 염으로 전환시키는 아미다제를 갖는 미생물 촉매가 남게 되는 것으로 다시 한번 밝혀졌다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D를 1 시간 동안 50 ℃로 열처리하므로써, ADN의 전환이 완료될 때 5-CPA를 97% 정도의 고수율로 생성하는 미생물 세포 촉매가 초래된다. 열처리에 의해 원치않는 니트릴 히드라타제는 제거하면서, 동시에 디니트릴을 시아노산으로 전환시키기 위한 비교적 열-안정한 니트릴라제 활성 또는 니트릴 히드라타제 활성은 남기는 능력은 이전에 공지되지 않았고 예측될 수도 없었으며, 이는 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 효소의 온도 안정성이 공지되지 않았기 때문이다. 10 내지 120 분 동안 35 ℃ 내지 70 ℃의 온도로 열처리하므로써, 기재된 유용한 효과가 초래될 것으로 예상된다.
B. 5원 또는 6원 고리 락탐의 제법
수용액중의 지방족 α,ω-디니트릴의 효소 촉매된 가수분해에 의해 생성되는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염 생성 혼합물을 직접 수소화시키므로써 5원 또는 6원 고리 락탐을 고수율로 제조하는 방법이 발견되었다. 이 방법에는 수소화 단계 이전에 가수분해 반응의 생성 혼합물로부터 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염을 단리시키는 것이 요구되지도 않고, 또한 수소화 이전에 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 유리산으로의 전환 (예를 들어, 4-CPA 암모늄 염의 4-CPA로의 전환), 또는 고리화 이전에 수소화 생성 혼합물로부터 생성된 ω-아미노카르복실산 암모늄 염의 단리 및 암모늄 염의 유리 카르복실산으로의 전환이 요구되지도 않는다.
효소 촉매를 사용하여 지방족 α,ω-디니트릴로부터 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염을 함유하는 수성 생성 혼합물을 생성한 후 (반응식 4), 효소 촉매를 제거하고, 적합한 수소화 촉매의 존재하에 생성된 수용액과 수소 및 화학양론적 과량의 첨가되는 암모니아 (예를 들면, 수산화암모늄)를 반응시키므로써, 지방족 ω-아미노카르복실산 암모늄 염을 함유하는 수용액이 생성되는 것으로 예상되었다 (반응식 5).
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니트릴을 상응하는 아민으로 수소화하는 동안 과량의 암모니아를 사용하는 것은 생성물 ω-아미노카르복실산에 의해 이민 중간체 (니트릴기를 아민으로 수소화하는 동안 생성됨)의 환원성 알킬화를 제한하는 데 요구되며, 이는 이량체 형성 및 수율 감소를 초래한다. 이 기술은 양호하게 문서화되어 있고 (De Bellefon 등, Catal. Rev. Sci. Eng., (1994), vol. 36, 459-506), 일반적으로 니트릴 수소화 업계의 숙련자들에 의해 실시된다.
선행기술을 근거로, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 수소화에 의해 생성되는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염은 목적하는 락탐을 생성하기 위해 열적으로 유도된 고리화 반응 (반응식 7)이 수행될 수 있기 전에 유리산으로 전환되어 단리 (반응식 6)되어야 할 것으로 예상된다.
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마레스 등 (상기 문헌 참조)에 따르면, 6-아미노카프로산 (6-ACA) (반응식 7, n=3, R=H) 및 카프롤락탐은 물에서 1.0 몰/㎏ (약 1.0 M) 미만의 농도에서 가역적 평형 혼합물로서 존재하고, 카프롤락탐의 농도는 온도 증가와 함께 증가된다. 6-ACA 및 카프롤락탐의 전체 농도 0.85 몰/㎏ (약 0.85 M)에서, 카프롤락탐의 백분율은 마레스 등에 의해 180 ℃의 38.7%에서 250 ℃의 92.2%로 증가되는 것으로 보고되어 있다.
과량의 암모니아가 첨가되어 존재하고 반응 혼합물의 pH가 pH 9 내지 pH 10인 경우, 6-ACA의 암모늄 염이 200 ℃ 미만의 수소화 온도에서 고리화되어 상당량의 카프롤락탐이 생성된다는 것은 예상되지 않았다. 6-아미노카프로산의 카르복실산기 및 양자화된 아민기의 pKa 값은 각각 4.373 및 10.804이며 (Lange's Handbook of Chemistry, J. A. Dean, ed., 14th edn., (1992), McGraw-Hill, NY, p. 8.22 (6-아미노헥산산으로서)), NH4 +의 pKa 값은 9.25이다. 반응 혼합물 pH 9 내지 10에서, 6-ACA의 99.997% 이상은 카르복실산의 암모늄 염으로서 용액중에 존재하고, 또한 6-아미노카프로산 암모늄 염의 아민기의 대략 절반도 또한 양자화되는 것으로 계산될 수 있다. 따라서, 하기 반응식 8로 나타내지는 고리화 반응 중간체로부터의 히드록실 음이온 (-OH)의 변위가 선호되지 않는, 본 발명의 수소화 조건하에서 상당량의 6-ACA 암모늄 염이 고리화되어 카프롤락탐이 생성될 것으로 예상되지는 않았다.
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5-CPA 암모늄 염 (ADN의 효소적 가수분해에 의해 제조됨)의 수용액의 수소화가 70 ℃ 내지 160 ℃의 온도에서 0 M 내지 2.0 M NH4OH의 존재하에 수행되는 경우, 부산물 형성이 거의 없는, 5-CPA의 6-ACA 암모늄 염으로의 완전한 전환이 관찰되었고, 예상된 바와 같이 3% 미만의 수율의 카프롤락탐 (생성된 7원 고리 락탐)이 얻어진다 (표 4).
온도 (℃) 5-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 시간 (h) 5-CPA 전환률 (%) 카프롤락탐 (%)
70 1.0 0 2 100 0.7
70 1.0 1.0 2 100 0.7
70 1.0 1.5 2 94 0.8
70 1.0 2.0 2 84 0.8
120 1.0 0 2 99 0.9
120 1.0 1.0 2 100 0.9
120 1.0 1.5 2 97 1.0
120 1.0 2.0 2 97 1.1
160 1.0 0 2 97 2.5
160 1.0 1.0 2 84 2.3
160 1.0 1.5 2 97 3.0
160 1.0 2.0 2 95 2.7
수율 3% 미만의 카프롤락탐은 또한 ADN의 효소적 가수분해에 의해 제조된 5-CPA의 암모늄 염의 수소화에 대해서와 동일한 수소화 반응 조건하에서 인증된 6-ACA와 수산화암모늄을 혼합하므로써 제조된 수용액이 처리되는 경우에 또한 얻어진다. 70 ℃에서 5-CPA 암모늄 염의 수소화에 의해 제조되는 수용액중의 6-ACA의 암모늄 염의 고리화는 먼저 수소화 촉매를 제거한 후, 약 1.0 M의 6-ACA 암모늄 염 생성 혼합물을 2 시간 동안 280 ℃로 가열하므로써 200 ℃ 보다 높은 온도에서 시도되었다. 수율 18% 미만의 카프롤락탐이 생성되었다 (표 5).
온도 (℃) 6-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 시간 (h) 카프롤락탐 (%)
280 1.0 0 2 17.8
280 1.0 1.0 2 17.2
280 1.0 1.5 2 11.0
280 1.0 2.0 2 9.0
280 1.0 2.5 2 3.1
이들 결과로부터, 단지 매우 낮은 수율의 카프롤락탐이 과량의 암모니아의 존재하에 5-CPA 암모늄 염의 수용액의 직접 수소화에 의해 얻어진다는 것이 입증된다. 이것은 특히 과량의 수산화암모늄의 존재하에 6-ACA 암모늄 염이 고리화될 수 없다는 관점에서 예상되었다.
3-시아노펜탄산 (3-CPA) 암모늄 염 (2-에틸숙시노니트릴 (2-ESN)의 효소적 가수분해에 의해 제조됨) 또는 4-시아노발레르산 (4-CPA) 암모늄 염 (2-메틸글루타로니트릴 (2-MGN)의 효소적 가수분해에 의해 제조됨)의 수성 혼합물이 과량의 암모니아의 존재하에 70 ℃ 내지 160 ℃에서 수소화되는 경우, 상응하는 ω-아미노카르복실산 암모늄 염이 제조되고, 이들 염은 상응하는 락탐으로의 고리화 반응이 수행되기 전에 유리산으로서 단리되어야 할 것으로 기대된다 (5-CPA 암모늄 염에 대한 경우와 마찬가지임). 카르복실산의 pKa 값, 및 생성물 4-아미노-3-에틸부티르산 또는 5-아미노-4-메틸펜탄산의 양자화된 아민 관능기가 보고되어 있지 않음에도 불구하고, 이들 pKa 값들은 6-ACA 이성질체의 pKa 값과 유사하다고 가정하는 것이 타당하다.
예상외로, 라니 니켈 및 pH 9-10의 과량의 암모니아의 존재하에 70 ℃ 내지 180 ℃의 온도에서 2 시간 동안 3-CPA 암모늄 염 (2-ESN의 효소적 가수분해에 의해 제조됨)의 수용액을 수소화하므로써, 직접 수율 91% 이하의 상응하는 락탐 4-에틸피롤리딘-2-온 (4-EPRD)이 생성된다 (표 6).
온도 (℃) 3-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 중량% 라니 Ni 시간 (h) 3-CPA (% 전환률) 4-EPRD (% 수율)
70 1.0 2.0 5 2 7 1.5
120 1.0 2.0 5 2 55 22.7
140 1.0 2.0 5 2 71 55.4
140 1.0 2.0 10 2 100 89.9
160 1.0 2.0 5 2 100 90.1
160 1.0 2.0 10 2 100 91.3
180 1.0 2.0 5 2 100 86.1
180 1.0 2.0 10 2 100 90.0
4-EPRD의 수율은 또한 첨가된 수산화암모늄의 농도 증가와 함께 증가되며 (카르복실산의 암모늄 염으로서 이미 존재하는 암모늄 이온 농도 이외에 추가됨), 이것은 이량체 및 중합체를 생성하는 널리 공지된 환원성 알킬화 반응을 제한하기 위해, 첨가된 암모니아의 존재하에 모노니트릴산의 암모늄 염의 수용액중의 수소화를 수행함이 바람직함을 나타낸다 (표 7).
온도 (℃) 3-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 중량% 라니 Ni 시간 (h) 3-CPA (% 전환률) 4-EPRD (% 수율)
160 1.0 0 5 2 99 80.1
160 1.0 1.0 5 2 99 87.6
160 1.0 2.0 5 2 100 90.1
160 1.0 3.0 5 2 100 85.4
180 1.0 0 5 2 100 75.1
180 1.0 1.0 5 2 100 85.8
180 1.0 2.0 5 2 100 88.5
180 1.0 3.0 5 2 100 90.0
라니 니켈 및 과량의 암모니아의 존재하에 pH 9-10에서 160 ℃에서 2 시간 동안 4-CPA 암모늄 염 (2-MGN의 효소적 가수분해에 의해 생성됨)의 수용액을 수소화하므로써, 직접 상응하는 락탐 5-메틸-2-피페리돈 (5-MPPD)이 96%만큼 높은 수율로 생성된다 (표 8).
온도 (℃) 4-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 중량% 라니 Ni 시간 (h) 4-CPA (% 전환률) 5-MPPD (% 수율)
160 1.0 0 5 2 100 85.6
160 1.0 2.0 5 3 100 96.4
180 1.0 2.0 5 2 100 91.4
180 1.0 3.0 5 2 100 89.5
3-시아노프로피온산 (3-CPRA) 또는 4-시아노부티르산 (4-CBA)의 암모늄 염 (상응하는 α,ω-디니트릴의 효소적 가수분해에 의해 생성됨)의 수용액의 수소화에 의해, 상응하는 락탐 2-피롤리돈 및 2-피페리돈이 각각 91.0% 및 93.5%의 수율로 생성된다. 4-시아노-4-펜텐산 (4-CPEA) 암모늄 염 (2-메틸렌글루타로니트릴의 효소적 가수분해에 의해 생성됨)의 수용액의 수소화에 의해, 니트릴 및 탄소-탄소 2중 결합이 수소화되어 5-메틸-2-피페리돈이 수율 85% 이하로 생성되게 된다.
니트릴을 아민으로 수소화하는 동안 환원성 알킬화를 제한하기 위해 과량의 암모니아 (수산화암모늄으로서 임)를 수소화 반응에 첨가하므로써, 몇몇의 부산물 형성 반응들이 또한 추가로 일어날 수 있다 (De Bellefon 등, Catal. Rev. Sci. Eng., (1994), vol. 36, 459-506). 니트릴로부터 아미드 또는 카르복실산을 제조하는 통상의 방법은 산 또는 염기 촉매의 존재하에 니트릴의 수성 혼합물을 가열하는 것이라는 것은 당업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명에 사용되는 수소화 조건하에 모노니트릴 카르복실산의 암모늄 염의 예상되는 경쟁 반응은 디카르복실산 모노아미드 암모늄 염 또는 디카르복실산 디암모늄 염을 생성하는 니트릴기의 염기-촉매된 가수분해일 것이다. 이들 원치않는 아미드/산 및 디카르복실산 암모늄 염 부산물은 수소화 동안 생성되나, 락탐의 수율에 비해 매우 낮은 수율로 생성된다.
과량으로 존재하는 암모니아와 생성물 락탐과의 제2 부산물 형성 반응에 의해, 락탐과 예상되는 가암모니아분해 생성물인 ω-아미노카르복사미드와의 평형 혼합물이 생성될 수 있을 것이다. 본 발명의 반응 조건하에 얻어지는 고수율의 5원 및 6원 고리 락탐으로부터, 생성물 락탐의 가암모니아분해 (또는 염기-촉매된 가수분해)는 중요하지 않은 것으로 제안된다.
지방족 α,ω-디니트릴로부터의 락탐의 생성 이외에, N-메틸락탐은 4-CPA 또는 3-CPA의 암모늄 염의 수용액의 수소화시 암모니아를 메틸아민으로 치환시키므로써 제조된다. 메틸아민 (양자화된 아민에 대한 pKa 값 10.62) 1 내지 4 당량을 암모늄 이온 (pKa 9.25) 1 당량을 함유하는 4-CPA의 수용액에 첨가하므로써, 상당량의 유리 암모니아가 생성될 것으로 예상된다 (물에서 양자화된 메틸아민 및 암모늄 이온의 pKa 값의 상대적인 차이에 기인함). 이어서, 이 유리 암모니아는 니트릴기의 수소화 동안 생성된 중간체 이민과 반응하기 위해 양자화되지 않은 메틸아민과 경쟁하여 각각 5-아미노-4-메틸펜탄산과 5-N-메틸아미노-4-메틸펜탄산의 암모늄 염의 혼합물이 생성되며, 이것은 차례로 고리화되어 각각 5-MPPD 및 1,5-디메틸-2-피페리돈 (1,5-DMPD)이 생성된다.
4-CPA의 암모늄 염의 1.0 M 수용액의 수소화에 의해 생성되는 5-MPPD 및 1,5-DMPD의 상대 수율은 촉매의 선택에 따라 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 알루미나상의 라니 니켈 및 루테늄은 각각 3.0 M 메틸아민의 존재하에서도 주요한 락탐 생성물로서 5-MPPD가 생성되는 반면, 동일한 메틸아민 농도에서 촉매로서 5% Pd/C 또는 4.5% Pd/0.5% Pt/C가 사용되는 경우 1,5-DMPD가 주요 생성물이다. 촉매로서 5% Pd/C가 사용되는 경우, 1,5-DMPD의 수율은 메틸아민의 농도 증가와 함께 증가된다 (표 9).
온도 (℃) 4-CPA(NH4 +) (M) CH3NH2 (M) 촉매 시간 (h) 4-CPA (% 전환률) 1,5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율)
160 1.0 3.0 Ra-Ni 2 100 19.2 68.5
160 1.0 3.0 RuAl2O3 2 100 19.0 63.5
140 1.0 3.0 Pd/C 2 99 83.4 0
160 1.0 1.0 Pd/C 2 100 53.5 0
160 1.0 1.25 Pd/C 2 100 68.3 0
160 1.0 1.5 Pd/C 2 100 76.4 0
160 1.0 2.0 Pd/C 2 100 81.5 0
160 1.0 3.0 Pd/C 2 100 81.7 7.8
160 1.0 4.0 Pd/C 2 100 88.4 1.9
180 1.0 3.0 Pd/C 2 97 73.0 6.6
160 1.4 2.3 Pd/Pt/C 2 99 94.0 3.1
Pd/C 촉매를 사용하여 140 ℃에서 1.0 M 3-CPA 암모늄 염의 수용액의 수소화시 암모니아를 2.0 M 메틸아민으로 치환하므로써, 4-에틸-1-메틸피롤리딘-2-온 (4-EMPRD) 및 4-EPRD가 96% 전환률에서 각각 69.8% 및 20.4% 수율로 생성된다.
<바람직한 실시양태의 설명>
<방법 및 물질>
ω-니트릴카르복실산 제조용 미생물 촉매
악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 및 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)의 2종의 미생물은 지방족 α,ω-디니트릴의 상응하는 ω-니트릴카르복실산으로의 전환용 미생물 촉매로서 사용되기 위해 단리되었다.
악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)은 미국 텍사스주 오렌지에서 수집된 토양으로부터 단리되었다. 하기 표 10의 배지를 사용하는 표준 농축 과정이 사용되었다 (E2 기초 배지, pH 7.2).
E2 기초 배지 g/L
KH2PO4 1.4
NaH2PO4 0.69
시트르산나트륨 0.1
CaCl2·2H2O 0.025
KCl 0.5
NaCl 1.0
MgSO4·7H2O 0.5
FeSO4·7H2O 0.05
CoCl2·6H2O 0.01
MnCl2·4H2O 0.001
ZnCl2 0.0005
NaMoO4·2H2O 0.0025
NiCl2·6H2O 0.01
CuSO4·2H2O 0.005
비오틴 0.0002
폴릭산 0.0002
피리독신·HCl 0.001
리보플라빈 0.0005
티아민·HCl 0.00005
니코틴산 0.0005
판토텐산 0.0005
비타민 B12 0.00001
p-아미노벤조산 0.0005
하기 표 11의 보충물이 상술한 농축용 E2 기초 배지에 사용되었다.
균주 농축 질소 공급원 다른 보충물
악시도보락스 팍실리스 72W 0.2%(v/v) 에틸숙시노니트릴 0.3% (v/v) 글리세롤
균주는 본래 농축 니트릴상의 배양 및 암모니아 생성을 근거로 선택되었다. 단리된 물질은 박토 브레인 하트 인퓨젼 아가 (Bacto (등록상표) Brain Heart Infusion Agar (미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코사))상에서의 통과를 반복한 후, 농축 니트릴로부터 암모니아 생성물을 스크리닝시키므로써 정제되었다. 정제된 균주는 그람 네가티브 시험 플레이트를 사용한 비올로그 (Biolog (등록상표)) 시험 시스템 (미국 캘리포니아주 헤이워드)에서의 이들의 탄소 공급원 이용 프로파일을 근거로 동정되었다.
니트릴 가수분해 활성을 시험하기 위해, 글루코스 10 g/L를 갖는 E2 기초 배지를 사용하여 악시도보락스 팍실리스 72W를 배양하였다. 배지는 25 mM (±)-2-메틸글루타로니트릴로 보충되었다. 보충된 E2 배지의 10 mL 용적은 동결된 원래 배양물 0.1 mL로 접종되었다. 실온 (22-25 ℃)에서 250 rpm의 셰이커상에서 밤새 배양된 후, 접종물 10 mL는 2 L 플라스크내의 프레쉬 배지 990 mL에 첨가되었다. 세포는 배지에서 기포가 형성되기에 충분히 빠른 속도로 교반시키면서 실온에서 밤새 배양되었다. 세포는 원심분리에 의해 채취되어 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.2)/15% 글리세롤로 1회 세척되었고, 농축된 세포 페이스트는 드라이 아이스상에서 즉시 동결되어 -65 ℃에서 저장되었다. 10 mM 아디포니트릴은 또한 1 리터 발효액으로 사용되었다. 발효는 16-20 시간의 배양 후 중단되었다. 세포 현탁액은 4 ℃로 냉각되어 원심분리에 의해 채취되었으며, pH 7.2의 0.05 M 인산염 완충액에서 15% 글리세롤로 1회 세척된 후, -60 ℃에서 동결되었다. 해동된 세포 페이스트는 니트릴 가수분해 활성의 시험에 사용되었다. 미생물의 목적하는 특성은 아미다제 활성을 방해함 없이 디니트릴 화합물을 국부특이적으로 공격할 수 있는 니트릴 가수분해 활성이다. 미생물은 돌연변이를 겪는 경향이 있다. 몇몇의 돌연변이들은 목적하는 니트릴 전환에 유리할 수 있다. 따라서, 천연 균주의 돌연변이도 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다.
표준 농축 과정은 또한 상술한 표준 펜텐산 배지에 1/10 농도로 비타민을 가지므로써 변성된 pH 7.2의 E2 기초 배지를 사용하여 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D에 사용되었다. 하기 표 12의 보충물들이 농축을 위한 변성된 E2 기초 배지에 사용되었다.
균주 농축 질소 공급원 다른 보충물
코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D 2-메틸글루타라미드 (MGAM; 1.0% w/v) 글리세롤 (0.6%)
균주는 본래 농축 니트릴아미드상의 배양을 근거로 선택되었다. 단리물은 상기 배지를 사용하여 아가 플레이트상에서의 통과를 반복하므로써 정제되었다. 정제된 균주는 그람 네가티브 시험 플레이트를 사용하여 비올로그 (등록상표) 시험 시스템 (미국 캘리포니아주 소재의 헤이워드사)상의 이들의 탄소 공급원 이용 프로파일을 근거로 동정되었다.
니트릴 가수분해 활성을 시험하기 위해, 글루코스 또는 글리세롤 6.0 g/L로 변성된 E2 기초 배지가 세포 물질의 배양에 사용되었다. 배지는 1.0% MGAM으로 보충되었다. 보충된 E2 배지 50 mL를 함유하는 차단되지 않은 (unbaffled) 250 mL 셰이크 플라스크는 동결된 원래 배양물 0.2 mL로 접종되고 200 rpm의 셰이커상에서 30 ℃에서 72 시간 동안 배양되었다. 세포는 원심분리에 의해 채취되어 pH 7.0의 20 mM KH2PO4 10 mL로 세척되었다. 세포는 국부특이적 가수분해를 위해 HPLC를 사용하여 pH 7.0의 20 mM KH2PO4, 및 0.1 M 메틸글루타로니트릴 또는 메틸글루타라미드를 함유하는 10 mL 반응물에서 스크리닝되었다. 미생물의 목적하는 특성은 아미다제 활성을 방해함 없이 디니트릴 화합물을 국부특이적으로 공격할 수 있는 니트릴 가수분해 활성이다. 미생물은 돌연변이를 겪는 경향이 있다. 몇몇의 돌연변이들은 목적하는 니트릴 전환에 유리할 수 있다. 따라서, 천연 균주의 돌연변이조차 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 특정 유기물에 제한되지는 않으나, 목적하는 특성을 보유하는 이들의 변종 및 돌연변이체의 사용이 포함된다. 이러한 변종 및 돌연변이체는 x-선, UV-선 및 화학적 돌연변이 유발요인과 같은 여러 공지된 수단들에 의해 천연 균주로부터 생성될 수 있다.
방법 설명을 위한 생체촉매를 제조하기 위해 (실시예 1-26), 하기 표 13의 배지들이 사용되었다.
균주 배지
72-PF-15 라우리아-베르타니 배지 (Lauria-Bertani Medium) (박토 (Bacto (등록상표) 트립톤, 10 g/L + 박토 (등록상표) 효모 추출물, 5 g/L + NaCl, 10g/L) + 0.5% (w/v) 숙신산나트륨?6H2O
72W E2+1% (w/v) 글루코스 + 0.4% (w/v) 아디파미드
5-MGAM-4D E2+1% (w/v) 글루코스 + 0.2% (w/v) 프로피오나미드
배양을 시작하기 위해, 적절한 배지 10 mL가 동결 원래 배양물 0.1 mL로 접종되었다. 250 rpm으로 셰이킹시키면서 28 ℃에서 밤새 배양한 후, 배양 세포 현탁액은 2 L 플라스크내의 동일한 배지 1 L로 운반되어 28 ℃에서 셰이킹하면서 계속하여 배양되었다. 이어서, 1 L 배양 세포 현탁액은 10 L 발효 용기내의 동일한 배지 9 L에 첨가되어 계속하여 배양되었다. 발효기내에서의 명목상의 조건은 ≥80% 산소 포화도, 25 ℃, pH 7.2, 300-1000 rpm이었다. 20-91 시간 후, 용기는 8-12 ℃로 냉각되었고, 글리세롤이 최종 농도 10%에 이를 때까지 첨가되었다. 세포 물질은 원심분리에 의해 채취되었다. 농축된 세포 페효모는 드라이 아이스상에서 즉시 동결되어 사용시까지는 -70 ℃에서 저장되었다. E2 기초 배지에서의 세포 배양을 위한 탄소 및 질소 공급원으로서 이바지하는 여러 다른 보충물들은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. 복합 영양 배지 뿐만 아니라 이들도 생체촉매를 제조하는 데 사용될 수 있다. 상술한 특정 배지는 제한적인 것으로 보여져서는 않된다.
NHase 활성이 부족한 악시도보락스 팍실리스 72W의 돌연변이 균주의 선택
2-MGN을 4-CPA로 가수분해하는 동안 원치않는 2-메틸글루타르산 부산물을 생성하는 능력이 감소된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746)의 돌연변이체는 탄소 및 에너지 공급원으로서 2-MGN을 사용할 수 없음을 근거로 선택되었다. 특히, LB/숙신산염 배지 (1% (w/v) 박토-트립톤 (미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코사), 0.5% (w/v) 박토-효모 추출물 (디프코사), 1% (w/v) NaCl, 0.5% (w/v) 숙신산나트륨 6수화물)상에서 배양된 균주 악시도보락스 팍실리스 72W의 밤샘 배양물은 돌연변이제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 100 ㎍/mL 용액에 대략 30 분 동안 노출되었다. 이로 인해 배양물내의 생존가능 세포는 99.9% 감소되었다. 돌연변이 세포내의 돌연변이 유발-요인은 pH 7.2의 멸균된 1 M 인산나트륨 완충액에서 원심분리에 의해 세척 제거되었다. 세척된 세포는 L/B 숙신산염 배지에서 재현탁되어 30 ℃에서 밤새 배양되었다. 이어서, 세포는 pH 7.2의 멸균된 50 mM 인산나트륨 완충액에서 원심분리에 의해 세척되어 0.2% (v/v) 2-메틸글루타로니트릴, 0.2 ㎎/mL의 항생제 시클로세린 및 40 ㎍/mL의 피페라실린을 함유하는 E2 최소 배지 (글루코스가 없음)에서 재현탁되었다. 세포는 30 ℃에서 밤새 접종되었고 pH 7.2의 멸균된 50 mM 인산나트륨 완충액에서 다시 세척되었다. 세척된 세포는 플레이트 당 40-100 콜로니-형성 단위의 농도에서 E2 최소 배지 (글루코스가 없음) 더하기 0.2% (v/v) 2-메틸글루타로니트릴 및 0.5% (w/v) 숙신산나트륨 6수화물의 비선택성 배지를 함유하는 아가 플레이트상에 분무되었다. 플레이트는 대략 48 시간 동안 30 ℃에서 접종되어 콜로니가 발육되도록 하였다. 발육된 콜로니는 E2 최소 배지 (글루코스가 없음) 더하기 0.2% (v/v) 2-MGN의 선택성 배지를 함유하는 아가 플레이트상으로 복제 위치시켰다. 플레이트는 48 시간 동안 30 ℃에서 접종되어 콜로니가 발육되도록 하였다. 목적하는 품질을 갖는 돌연변이체는 선택성 배지상에서 그다지 잘 배양되지는 않았다. 따라서, 48 시간 후, 복제된 플레이트는 비교되었고, 비선택성 배지상에서만 성장을 나타내는 균주는 추가의 시험을 위해 저장되었다.
전체적으로, 대략 5,120 콜로니가 89개 플레이트로부터 관찰되었고, 목적하는 품질을 갖는 19개 균주가 동정되었다. 이들 돌연변이 균주는 액상의 E2 최소 배지 (글루코스가 없음) 더하기 0.2% (v/v) 2-MGN에서의 성장에 대해 추가 시험되었다. 이 배지에서 성장을 거의 나타내지 않거나 또는 전혀 나타내지 않은 균주는 E2 최소 배지 (글루코스가 없음) 더하기 0.2% (v/v) 2-MGN 및 0.5% (w/v) 숙신산나트륨 6수화물로 이루어진 액상 배지에서의 배양 동안 2-메틸글루타르산을 생성하는 이들의 능력에 대해 스크리닝되었다. 이 방법의 결과로, 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATCC 55747) 및 악시도보락스 팍실리스 72-PF-17 (ATCC 55745)로서 동정된 2종의 돌연변이 균주는 2-메틸글루타르산을 생성하는 이들의 능력이 크게 감소되었으므로 추가 발육을 위해 선택되었다.
<지방족 α,ω-디니트릴 가수분해 반응>
지방족 ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염을 함유하는 수용액은 상응하는 지방족 α,ω-디니트릴을 적절한 효소 촉매 (상기 A부에서 동정됨)의 수현탁액과 혼합하므로써 제조된다. 미생물 세포 자체는 전처리 없이 촉매로서 사용될 수 있다. 별법으로, 이들은 중합체 매트릭스 (예를 들어, 알기네이트 비드 또는 폴리아크릴아미드 겔 (PAG) 입자)내 또는 불용성 고상 담체 (예를 들어, 셀라이트)상에 고정화되어 촉매의 회수 및 재사용을 용이하게 할 수 있다. 세포를 중합체 매트릭스내 또는 불용성 고상 담체상에 고정화시키는 방법은 널리 보고되어 왔으며 당업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 니트릴라제 효소, 또는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 효소는 또한 세포 자체로부터 단리되어 촉매로서 직접 사용될 수 있거나, 또는 효소(들)는 중합체 매트릭스내 또는 불용성 담체상에 고정화될 수 있다. 이들 방법들도 또한 널리 보고되어 당업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다.
본 발명에서 출발 물질로서 사용되는 지방족 α,ω-디니트릴의 일부는 단지 중간 정도로 물에 가용성이다. 이들의 용해도는 또한 용액의 온도 및 수성 상에서의 염의 농도 (완충액 및(또는) ω-니트릴카르복실산 암모늄 염)에 따라 좌우된다. 예를 들어, 아디포니트릴의 용해도 한계는 약 0.60 M (25 ℃, 20 mM 인산염 완충액, pH 7)이고, 동일한 조건하에서 2-메틸글루타로니트릴의 용해도 한계는 약 0.52 M인 것으로 측정된다. 이 경우, 출발 α,ω-디니트릴의 용해도 한계 보다 더 큰 농도에서 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 수용액은 초기에 효소 촉매 및 용해된 α,ω-디니트릴을 함유하는 수성 상 및 유기 상 (용해되지 않은 α,ω-디니트릴)의 2개 상으로 이루어지는 반응 혼합물을 사용하여 생성된다. 반응이 진행됨에 따라, 디니트릴은 수성 상에 용해되고, 결국 단일 상의 생성 혼합물이 얻어진다.
반응 혼합물에서의 효소 촉매의 농도는 효소 촉매의 촉매 특이 활성에 따라 좌우되고, 반응의 목적하는 속도를 얻기 위해 선택된다. 가수분해 반응에서 촉매로서 사용되는 미생물 세포의 습윤 세포 중량은 전형적으로 전체 반응 용적 1 mL 당 습윤 세포 0.001 g 내지 0.100 g, 바람직하게는 0.002 g 내지 0.050 g의 범위이다. 미생물 세포의 특이 활성 (IU/g 습윤 세포 중량)은 알고있는 중량의 미생물 세포 촉매를 사용하여, 25 ℃에서 디니트릴 기질 0.10 M 용액이 목적하는 ω-니트릴카르복실산 생성물로 전환되는 속도로 측정하므로써 결정된다. 효소 활성의 IU (국제 단위)는 1 분 당 기질 1 마이크로몰을 생성물로 전환시키는 데 요구되는 효소 활성의 양으로서 정의된다.
가수분해 반응의 온도는 반응 속도 및 효소 촉매 활성의 안정성 모두를 최적화되도록 선택된다. 반응의 온도 범위는 현탁액의 빙점 (약 0 ℃) 보다 바로 높은 온도 내지 60 ℃, 바람직하게는 5 ℃ 내지 35 ℃일 수 있다. 미생물 세포 촉매 현탁액은 증류수 또는 반응의 초기 pH를 5.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0으로 유지하는 완충액의 수용액에서 세포를 현탁시키므로써 제조될 수 있다. 반응이 진행됨에 따라, 반응 혼합물의 pH는 상응하는 디니트릴의 니트릴 관능기로부터 카르복실산의 암모늄 염이 형성됨으로 인해 변할 수 있다. 반응은 진행되어 pH 조절 없이 디니트릴의 전환을 완료할 수 있거나 또는 적합한 산 또는 염기는 목적하는 pH를 유지하기 위해 반응의 과정에 걸쳐 첨가될 수 있다.
α,ω-디니트릴의 전환 완료시 생성 혼합물내의 지방족 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 최종 농도는 0.001 M 내지 지방족 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 용해도 한계의 범위일 수 있다. 전형적으로, ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 농도는 0.10 M 내지 0.20 M이다. 가수분해 반응의 생성 혼합물은 원심분리 및(또는) 여과에 의한 효소 촉매의 회수 후에 후속하는 수소화 반응에 직접 사용될 수 있다. ω-니트릴카르복실산은 또한 진한 HCl을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 2.0 내지 2.5로 조정하고, 생성된 용액을 염화나트륨으로 포화시키며, ω-니트릴카르복실산을 에틸 아세테이트, 에틸 에테르 또는 디클로로메탄과 같은 적합한 유기 용매로 추출하므로써 생성 혼합물로부터 단리될 수 있다 (촉매의 제거 후임). 이어서, 합친 유기 추출물은 목적하는 생성물이 고수율 및 고순도 (전형적으로 98-99% 순도)로 생성되도록 적합한 건조제 (예를 들어, 황산마그네슘)와 합쳐져서 함께 교반되어 여과되고, 용매는 제거 (예를 들어, 회전 증발에 의함)된다. 필요에 따라, 생성물은 재결정 또는 증류에 의해 추가로 정제될 수 있다.
<ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 수소화/고리화>
촉매 수소화는 지방족 니트릴로부터 지방족 아민을 제조하기 위한 바람직한 방법이다. 본 발명에서, 수소화 동안 생성되는 ω-아미노카르복실산은 상응하는 5원 또는 6원 고리 락탐으로 고리화된다. ω-니트릴카르복실산의 암모늄 염의 수용액 (상응하는 지방족 α,ω-디니트릴의 효소적 가수분해에 의해 생성된 수성 생성 혼합물의 원심분리 및 여과에 의해 제조됨)은 먼저, 농축된 수산화암모늄 및 물과 혼합하여, 첨가되는 수산화암모늄의 1 내지 4 화학양론양을 함유하는 용액이 생성된다. 수산화암모늄은 수소화 과정 동안 ω-아미노카르복실산을 생성하므로써 ω-니트릴카르복실산의 환원성 알킬화를 제한하기 위해 첨가된다. 반응 혼합물중에 존재하는 ω-니트릴카르복실산의 양에 대해 2 내지 3배 화학양론적 과량의 수산화암모늄이 목적하는 락탐의 최적 수율을 달성하는 데 바람직하다. 선택적으로는, 암모니아 기체가 반응 혼합물에 첨가되는 수산화암모늄을 대신할 수 있다. 수소화 반응 혼합물중의 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 초기 농도는 용액의 5 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 7.5 중량% 내지 12.5 중량%일 수 있다.
N-메틸락탐의 제조의 경우, 메틸아민은 반응 혼합물중에 존재하는 ω-니트릴카르복실산의 양에 대해 1 내지 4 화학양론양을 사용하여 수산화암모늄 또는 암모니아를 대신할 수 있다. 반응 혼합물에 존재하는 ω-니트릴카르복실산의 양에 대해 3 내지 4배 화학양론적 과량의 메틸아민이 목적하는 N-메틸락탐의 최적 수율을 달성하는 데 바람직하다.
이어서, 상술한 수소화 반응 혼합물에 적합한 수소화 촉매가 첨가되고, 생성 혼합물은 수소 기체 압력하에 가열되어 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염이 상응하는 5원 또는 6원 고리 락탐으로 전환된다. 이 목적에 적합한 수소화 촉매에는 이리듐, 오스뮴, 로듐, 루테늄, 백금 및 팔라듐과 같은 여러 백금족 금속, 및 또한 코발트, 구리, 니켈 및 아연과 같은 여러 다른 전이 금속이 포함된다 (이에 제한되는 것은 아님). 촉매는 (예를 들어, 라니 니켈 또는 산화백금으로서) 지지되지 않을 수 있거나 또는 (예를 들어, 탄소상의 팔라듐, 알루미나상의 백금 또는 규조토상의 니켈로서) 지지될 수 있다 .
수소화 촉매는 선택된 반응 조건하에 목적하는 반응 속도 및 출발 물질의 전체 전환률을 얻기에 충분한 최소 농도로 사용된다. 이 농도는 실험에 의해 용이하게 결정된다. 촉매는 반응시 사용되는 ω-니트릴카르복실산 100 부 당 촉매 0.001 내지 20 중량부 이상의 양으로 사용될 수 있다. 반응 혼합물에 부가되는 촉매의 양은 전형적으로 1% 내지 10% (촉매의 중량/ω-니트릴카르복실산의 중량), 바람직하게는 3% 내지 5%이다. 라니 니켈 (예를 들어, Cr-조촉매 라니 니켈 촉매 (그레이스 다비죤 라니 (Grace Davison Raney) 2400 활성 금속 촉매))는 락탐을 생성하기 위해 첨가되는 암모니아의 존재하에 반응 진행에 바람직한 촉매이나, 탄소상의 5% 또는 10% 팔라듐 또는 탄소상의 4.5% 팔라듐/0.5% 백금은 N-메틸락탐을 생성하기 위해 첨가되는 메틸아민의 존재하에 반응 진행에 바람직하다.
수소화 온도 및 압력은 매우 광범위할 수 있다. 온도는 일반적으로 45 ℃ 내지 200 ℃, 바람직하게는 70 내지 180 ℃일 수 있다. 수소압은 일반적으로 대략 대기압 내지 약 100 기압, 바람직하게는 30 내지 60 기압일 수 있다. 수소화는 반응 혼합물의 pH 조정 없이 수행되며, 수산화암모늄, 암모니아 또는 메틸아민을 과량 첨가하면 일반적으로 pH가 9 내지 12가 된다. 이 pH 범위내에서, 정확한 값은 상용성 비간섭 염기 또는 산을 첨가하므로써 목적하는 pH를 얻기 위해 조정될 수 있다. 적합한 염기에는 알칼리 금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염 및 인산염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니며, 적합한 산에는 염산, 황산 또는 인산이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
가수분해 반응 동안의 미생물 세포 촉매의 용해 또는 촉매 제조로부터 존재하는 오염물은 수소화 반응 혼합물 (예를 들어, 티올)내로 도입되어 촉매 활성을 피독시킬 수 있다. 수소화 촉매의 피독 또는 실활은 가수분해 생성 혼합물로부터 단리되고 수소화 이전에 정제되는 동일한 ω-니트릴카르복실산의 수용액의 수소화를 이용한 미생물 가수분해를 경유하여 생성된 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염 혼합물의 수소화와 비교될 때, 전혀 관찰되지 않았다.
락탐 또는 N-메틸락탐은 먼저 혼합물을 여과하여 수소화 촉매를 회수하므로써 수소화 생성 혼합물로부터 용이하게 단리될 수 있고, 이어서 생성물은 생성된 수성 여액으로부터 직접 증류될 수 있다. 고리화 반응 동안 생성되거나 또는 반응 혼합물에 첨가되는 암모니아는 또한 재순환을 위해 이 증류 방법에 의해 회수될 수 있고, 폐 생성물로서 원치않는 무기 염이 발생되는 것을 면한다. 락탐 또는 N-메틸 락탐은 또한 수소화 혼합물을 여과시키고, 여액을 진한 HCl을 사용하여 pH 약 7로 조정하고, 염화나트륨으로 포화시키며, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 또는 에틸 에테르와 같은 유기 용매를 사용하여 락탐 또는 N-메틸락탐을 추출하고 (회분식 또는 연속식 추출), 증류 또는 결정화에 의해 유기 추출물로부터 회수하므로써 회수될 수 있다. 실시예를 수행함에 있어서, 이 방법에 대해 보고된 단리된 수율은 최적화된 것은 아니고, 이 방법은 단순히 분석 및 화학적 동정의 확인을 위한 정제된 생성물을 얻기 위해 사용되었다.
본 발명을 더욱 예증하는 데 이바지하나, 이에 제한되지는 않는 하기 실시예들에서, 지방족 α,ω-디니트릴의 % 회수율 및 미생물 가수분해 반응 동안 형성된 가수분해 생성물의 % 수율은 (달리 기록하지 않는 한) 반응 혼합물중에 존재하는 α,ω-디니트릴의 출발 양을 기준으로 하였고, 굴절률 검출기, 및 수펠코실 (Supelcosil) LC-18-DB 칼럼 (25 ㎝ x 직경 4.6 ㎜) 또는 바이오-라드 (Bio-Rad) HPX-87H 칼럼 (30 ㎝ x 직경 7.8 ㎜)을 사용한 HPLC에 의해 측정하였다. ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 수용액의 수소화에 의해 생성된 락탐 및 N-메틸락탐의 수율은 (달리 기록하지 않는 한) 반응 혼합물중에 존재하는 ω-니트릴카르복실산 암모늄 염의 출발 농도를 기준으로 하였고, DB-1701 모세관 (30 m x 내경 0.53 ㎜, 막 두께 1 마이크론)을 사용한 기체 크로마토그래피에 의해 측정하였다.
<실시예>
<실시예 1>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
먼저, 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 0.60 g (습윤 세포 중량)을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 위치시킨 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 12 mL를 첨가하였다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액에 전체 부피 12 mL로 재현탁시켰다. 2-메틸글루타로니트릴 0.1081 g (0.114 mL, 1.00 mmol, 0.100 M)을 15 mL 폴리프로필렌 제2 원심분리관내로 칭량한 후, 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 현탁액 (0.494 g 습윤 세포 중량) 9.89 mL를 첨가하고, 생성된 현탁액을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상에서 혼합하였다. 시료 (0.300 mL)를 채취하여 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리 (Millipore Ultrafree)-MC 여과 유닛 (10 K MWCO)에 위치시키고, 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL와 혼합하였다. 1.0 M HCl 충분량을 첨가하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추고, 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 1.0 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 93.3% 및 0.7%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 2 (비교예)>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포를 사용하여 실시예 1에 기재된 수순을 반복하였다. 1.0 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 62.7% 및 34.6%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 3>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
먼저, 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 1.136 g (습윤 세포 중량)을 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 위치시킨 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 21.6 mL를 첨가하였다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액에 전체 부피 22.7 mL로 재현탁시켰다. 2-메틸글루타로니트릴 0.4355 g (0.458 mL, 4.00 mmol, 0.403 M)을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 칭량한 후, 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 현탁액 (0.477 g 습윤 세포 중량) 9.54 mL를 첨가하고, 생성된 현탁액을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상에서 혼합하였다. 시료 (0.300 mL)를 증류수로 1:4로 희석시킨 후, 원심분리시켰으며, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (10 K MWCO)에 위치시키고, 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL와 혼합하였다. 1.0 M HCl 충분량을 첨가하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추고, 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 4.0 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 99.4% 및 0.6%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 4>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
2-메틸글루타로니트릴 1.086 g (1.143 mL, 10.04 mmol, 2상 반응, 1.00 M 생성물)을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상의 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관내에서 혼합된 열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 현탁액 (0.443 g 습윤 세포 중량) 8.86 mL와 혼합한 것을 제외하고는 실시예 3에 기재된 수순을 반복하였다. 시료 (0.300 mL)를 증류수로 1:10으로 희석시킨 후, 원심분리시켰으며, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (10 K MWCO)에 위치시키고, 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 (HPLC 외부 표준 용액) 수용액 0.020 mL와 혼합하였다. 1.0 M HCl 충분량을 첨가하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추고, 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 15.25 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 98.7% 및 1.3%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 5>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
50 ℃에서 1 시간 동안의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 (ATCC 55747)의 현탁액을 사용하여 실시예 1에 기재된 수순을 반복하였다. 3.0 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 96.8% 및 3.6%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 6>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
50 ℃에서 1 시간 동안의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 (ATCC 55747)의 현탁액을 사용하여 실시예 3에 기재된 수순을 반복하였다. 2-메틸글루타로니트릴 0.4355 g (0.458 mL, 4.00 mmol, 0.403 M)과 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 세포 현탁액 (0.477 g 습윤 세포 중량) 9.54 mL의 혼합물을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상의 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관에서 혼합하였다. 6.0 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 98.8% 및 1.2%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 7>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
50 ℃에서 1 시간 동안의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 (ATCC 55747)의 현탁액을 사용하여 실시예 4에 기재된 수순을 반복하였다. 2-메틸글루타로니트릴 1.086 g (1.143 mL, 10.04 mmol, 1.00 M)과 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 (ATCC 55747) 세포 현탁액 (0.443 g 습윤 세포 중량) 8.86 mL의 혼합물을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상의 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관에서 혼합하였다. 15.25 시간 후, 4-시아노펜탄산 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 99.2% 및 0.8%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 8>
4-시아노펜탄산의 단리
자성 교반 바아를 넣은 2 L 삼각 플라스크내로 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) (동결시키기 전에 미리 50 ℃에서 1 시간 동안의 열처리를 하지 않음) 150 g (습윤 세포 중량)을 칭량하였다. 이어서, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)을 첨가하여 전체 부피 1.50 L로 만들었다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 50 ℃로 1 시간 동안 물중탕에서 가열하고, 이어서 얼음/물 냉각조에서 10 ℃로 냉각하여 원심분리시켰으며, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액 1.50 L에 재현탁시키므로써 1 회 세척한 후, 원심분리시켰다. 세척된 세포 펠렛을 자성 교반 바아를 넣은 4 L 삼각 플라스크로 운반한 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)에 전체 부피 2.5 L로 현탁시켰다. 2-메틸글루타로니트릴 129.6 g (136.4 mL, 1.20 mol, 0.400 M)을 교반하면서 첨가하고, 동일한 인산염 완충액을 사용하여 최종 부피를 3.00 L로 조정하였다. 혼합물을 25 ℃에서 교반하고, 시료를 규칙적인 간격으로 채취하여 HPLC에 의해 분석하였다. 21.5 시간 후, 4-시아노펜탄산 (4-CPA) 및 2-메틸글루타르산의 HPLC 수율은 각각 99.5% 및 0.5%이었으며, 2-메틸글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
반응 혼합물을 원심분리시키고, 재사용을 위해 세포 펠렛을 회수하였으며, 생성된 상등액을 버리고, YM-10 필터 (10K MWCO)를 장착한 아미콘 (Amicon) 2.5 L 여과 유닛을 사용하여 여과시켰다. 여액을 4.0 L 플라스크에 위치시키고, 용액의 pH를 6 N HCl을 사용하여 2.5로 조정하였다. 이어서, 이 용액에 염화나트륨을 포화될 때까지 교반하면서 첨가한 후, 생성된 용액의 1.0 L 부분을 에틸 에테르 4 x 500 mL로 추출하였다. 합친 에테르 추출물을 건조시키고 (MgSO4), 여과시켰으며, 용액을 감압에서 회전 증발에 의해 1.0 L로 농축시켰다. 이어서, 이 용액에 헥산 1.2 L 및 에틸 에테르 0.200 mL를 첨가하고, 생성된 용액을 -78 ℃로 냉각시켰다. 생성된 화이트 결정질 고체를 신속한 진공 여과에 의해 단리시키고, 냉 (5 ℃) 헥산 300 mL로 세척하였다. 잔류 용매를 고진공 (20 Pa (150 mtorr))하에 제거하여 4-시아노펜탄산 (융점 31.9-32.6 ℃)이 120.3 g (79%의 단리된 수율) 생성되었다.
<실시예 9>
4-시아노펜탄산 (암모늄 염)
실시예 8로부터의 회수된 세포 펠렛을 2-메틸글루타로니트릴의 4-시아노펜탄산 암모늄 염으로의 가수분해를 위한 연속 3.0 L 뱃치 반응에 여러번 재사용하였다. 세포 수현탁액중의 디니트릴의 용해도를 능가하는, 0.400 M이 넘는 2-메틸글루타로니트릴의 농도에서, 남아있는 2-메틸글루타로니트릴이 반응 혼합물에 용해될 수 있을 때까지 이들 반응을 2상 수성/유기 혼합물로서 진행시켰다. 하기 표 14에는 생성된 4-CPA 암모늄 염의 최종 농도, 4-CPA 및 2-메틸글루타르산의 % 수율을 나타내었다. 세포 촉매의 건조 중량을 기준으로 (1 g 습윤 중량 = 0.20 g 건조 중량) 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 1 g 건조 중량 당 4-CPA 86 g이 생성되었다.
반응 회수 시간 (h) [4-CPA(NH4)] (M) 4-CPA (% 수율) 2-MGA (% 수율)
1 23 0.40 99.5 0.5
2 22 0.40 99.1 0.9
3 46 1.00 99.2 0.8
4 50 1.00 99.4 0.6
5 99 1.85 98.8 1.2
6 261 2.00 98.9 1.1
<실시예 10>
3-시아노펜탄산 (암모늄 염)
먼저, 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 0.60 g (습윤 세포 중량)을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 위치시킨 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 10 mL를 첨가하였다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액에 전체 부피 10 mL로 재현탁시켰다. 2-에틸숙시노니트릴 0.1080 g (0.112 mL, 1.00 mmol, 0.100 M)을 15 mL 폴리프로필렌 제2 원심분리관내로 칭량한 후, 악시도보락스 팍실리스 72W 세포 현탁액 (0.5 g 습윤 세포 중량) 8.00 mL를 첨가하고, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)을 사용하여 전체 부피를 10.0 mL로 조정하였으며, 생성된 현탁액을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상에서 혼합하였다. 시료 (0.300 mL)를 채취하여 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시키고 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 1.0 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-에틸숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 11>
3-시아노펜탄산 (암모늄 염)
전체 부피 10.0 mL (인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 조정됨)의, 2-에틸숙시노니트릴 0.4337 g (0.449 mL, 4.01 mmol, 0.401 M) 및 열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATTC 55746) 세포 현탁액 (0.5 g 습윤 세포 중량) 8.00 mL를 사용하여 실시예 10에 기재된 수순을 반복하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하여 물로 1:4로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시켰으며, 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 8.0 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-에틸숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 12>
3-시아노펜탄산 (암모늄 염)
전체 부피 10.0 mL (인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 조정됨)의, 2-에틸숙시노니트릴 1.087 g (1.13 mL, 10.1 mmol, 2상 반응, 1.01 M 생성물) 및 열처리된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATTC 55746) 세포 현탁액 (0.5 g 습윤 세포 중량) 8.00 mL를 사용하여 실시예 10에 기재된 수순을 반복하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하여 물로 1:10으로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시켰으며, 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과시켜 HPLC에 의해 분석하였다. 71 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-에틸숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았으며, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 13>
3-시아노펜탄산의 단리
자성 교반 바아를 넣은 4.0 L 삼각 플라스크내로 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 161 g 및 27 ℃의 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 1.60 L를 위치시켰다. 교반하면서 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 2-에틸숙시노니트릴 325 g (336.0 mL, 3.00 몰)을 교반하면서 첨가하고, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 혼합물의 전체 부피를 2.40 L로 조정하였다. 생성된 혼합물을 27 ℃에서 교반하고, 시료 (0.100 mL)를 채취하였으며, 물로 1:10으로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시켜 0.750 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 183 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-에틸숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 원심분리시키고, 세포 펠렛을 재사용을 위해 회수하였으며, 생성된 상등액 2.3 L를 버리고, YM-10 필터 (10K MWCO)를 장착한 아미콘 2.5 L 여과 유닛을 사용하여 여과시켰다. 여액중의 3-시아노펜탄산 암모늄 염의 농도는 1.26 M이었다.
1.26 M 3-시아노펜탄산 암모늄 염을 함유하는 상술한 여액의 300 mL 부분을 6 N HCl 약 60 mL를 사용하여 pH 2.5로 조정한 후, 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 에테르 4 x 200 mL를 사용하여 추출하였다. 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과시켰으며, 28 ℃ 및 감압하에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다. 생성된 미황색 점성 오일을 고진공 (6.7 Pa (50 mtorr))하에 교반시켜 28 ℃에서 잔류 용매를 제거한 후, 2-3 시간 동안 -20 ℃로 냉각시켜 결정질 화이트 고체 (45.9 g, 96% 수율)로서 3-시아노펜탄산 (융점 33.0-34.0 ℃)이 생성되었다.
<실시예 14>
3-시아노펜탄산 (암모늄 염)
50 ℃에서의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 (ATCC 55747)의 현탁액을 사용하여 실시예 10에 기재된 수순을 반복하였다. 1.0 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-에틸숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 15>
3-시아노펜탄산 (암모늄 염)
전체 부피 10.0 mL (인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 조정됨)의, 2-에틸숙시노니트릴 0.4325 g (0.455 mL, 4.00 mmol, 0.400 M) 및 50 ℃에서의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 돌연변이 균주 72-PF-15 (ATTC 55747)의 현탁액 (0.5 g 습윤 세포 중량) 8.00 mL를 사용하여 실시예 14에 기재된 수순을 반복하였다. 25 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 남아있는 2-에틸숙시노니트릴은 전혀 없었고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 16>
3-시아노펜탄산 (암모늄 염)
전체 부피 10.0 mL (인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 조정됨)의, 2-에틸숙시노니트릴 1.087 g (1.14 mL, 10.1 mmol, 2상 반응, 1.01 M 생성물) 및 50 ℃에서의 열처리를 하지 않은 악시도보락스 팍실리스 72-PF-15 (ATTC 55747)의 현탁액 (0.5 g 습윤 세포 중량) 8.00 mL를 사용하여 실시예 14에 기재된 수순을 반복하였다. 71 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 76.6%이었으며, 남아있는 2-에틸숙시노니트릴의 수율은 25.1%이었고, 다른 부산물은 관찰되지 않았다.
<실시예 17>
4-시아노-4-펜텐산의 단리
자성 교반 바아를 넣은 500 mL 삼각 플라스크내로 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 (동결되기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 50.0 g 및 27 ℃의 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 450 mL를 위치시켰다. 교반하면서 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 원심분리시켜 상등액을 버렸다. 세포 펠렛을 1.0 L 플라스크에서 인산칼륨 완충액에 (20 mM, pH 7.0) 전체 부피 863 mL로 재현탁시킨 후, 2-메틸렌글루타로니트릴 133 g (137.0 mL, 1.25 몰)을 27 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 세포 수현탁액내의 디니트릴의 용해도를 능가하는, 0.400 M이 넘는 2-메틸렌글루타로니트릴의 농도에서, 남아있는 2-메틸렌글루타로니트릴이 반응 혼합물에 용해될 수 있을 때까지 이들 반응을 2상 수성/유기 혼합물로서 진행시켰다. 시료 (0.100 mL)를 채취하여 물로 1:10으로 희석시키고, 원심분리시킨 후, 상등액 0.150 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시켜 0.150 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.150 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 26 시간 후, 4-시아노-4-펜텐산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-메틸렌글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 원심분리시키고, 세포 펠렛을 재사용을 위해 회수하였으며, 상등액을 YM-10 필터 (10K MWCO)를 장착한 아미콘 2.5 L 여과 유닛을 사용하여 여과시켰다. 여액중의 4-시아노-4-펜텐산 암모늄 염의 최종 농도는 1.298 M이었다.
상술한 4-시아노-4-펜텐산 암모늄 염 생성 혼합물을 함유하는 여액의 100 mL 부분을 6 N HCl을 사용하여 pH 2.7로 조정한 후, 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 에테르 4 x 100 mL를 사용하여 추출하였다. 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과시켰으며, 28 ℃ 및 감압에서 회전 증발에 의해 100 mL로 감소시켰다. 에테르 용액에 헥산 200 mL를 첨가하고, 생성된 용액을 -78 ℃로 냉각시켰다. 결정화된 생성된 화이트 고체를 신속한 진공 여과에 의해 단리시키고, 냉 (5 ℃) 헥산 100 mL로 세척하였다. 잔류 용매를 고진공 (20 Pa (150 mtorr))하에 제거하여 4-시아노-4-펜텐산 (융점 26.5-27.0 ℃, -20 ℃에서 저장됨) 9.80 g (60%의 단리된 수율)이 생성되었다.
<실시예 18>
4-시아노-4-펜텐산 (암모늄 염)
실시예 17로부터의 회수된 세포 펠렛 (악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포)을 2-메틸렌글루타로니트릴의 4-시아노-4-펜텐산 암모늄 염으로의 가수분해를 위한 제2 연속 1.0 L 뱃치 반응에 재사용하였다. 세포 수현탁액중의 디니트릴의 용해도를 능가하는, 0.400 M이 넘는 2-메틸렌글루타로니트릴의 농도에서, 남아있는 2-메틸렌글루타로니트릴이 반응 혼합물에 용해될 수 있을 때까지 이들 반응을 2상 수성/유기 혼합물로서 진행시켰다. 세포 펠렛을 1.0 L 플라스크에서 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)에 전체부피 781 mL로 재현탁시킨 후, 2-메틸렌글루타로니트릴 212 g (219.0 mL, 2.00 몰)을 27 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하여 물로 1:20으로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.150 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시키고, 0.150 M N-메틸프로피오나미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.150 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 53 시간 후, 4-시아노-4-펜텐산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 2-메틸렌글루타로니틀은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 19>
3-시아노프로판산 (암모늄 염)
먼저, 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 0.50 g (습윤 세포 중량)을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 위치시킨 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 10 mL를 첨가하였다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액에 전체 부피 10 mL로 재현탁시켰다. 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)에 전체 부피 8.0 mL로 용해된 숙시노니트릴 0.3236 g (4.00 mmol, 0.400 M)을 15 mL 폴리프로필렌 제2 원심분리관내로 위치시킨 후, 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 현탁액 (0.10 g 습윤 세포 중량) 2.00 mL를 첨가하고, 생성된 현탁액을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상에서 혼합하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하고, 물로 1:4로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.150 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시키고 0.1 M HCl 0.015 mL 및 0.100 M 프로피온산의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.150 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 3.0 시간 후, 3-시아노펜탄산의 HPLC 수율은 100%이었으며, 숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았고, 다른 부산물도 관찰되지 않았다.
<실시예 20>
3-시아노프로판산의 단리
자성 교반 바아를 넣은 500 mL 삼각 플라스크내로 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 열처리함) 20.0 g 및 27 ℃의 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 200 mL를 위치시켰다. 교반하면서 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 원심분리시켜 상등액을 버렸다. 이 세척 과정을 반복하였다. 생성된 세포 펠렛을 숙시노니트릴 101.1 g (1.25 몰, 1.25 M)을 함유하는 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)에 전체 부피 1.00 L로 재현탁시켰고, 생성된 혼합물을 27 ℃의 물중탕에 위치된 1 L 플라스크에서 교반하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하고, 물로 1:10으로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.150 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시켜 0.1 M HCl 0.015 mL 및 0.100 M 프로피온산의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.150 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 1.0 시간 후, 3-시아노프로판산 및 숙신산의 HPLC 수율은 각각 99.7% 및 0.3%이었으며, 숙시노니트릴은 전혀 남아있지 않았다. 반응 혼합물을 원심분리시키고, 상등액을 YM-10 필터 (10K MWCO)를 장착한 아미콘 2.5 L 여과 유닛을 사용하여 여과시켰다. 여액중의 3-시아노프로판산 암모늄 염의 최종 농도는 1.31 M이었다.
상술한 3-시아노프로판산 암모늄 염 생성 혼합물을 함유하는 여액의 200 mL 부분을 6 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 후, 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 에테르 4 x 200 mL를 사용하여 추출하였다. 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과시켰으며, 감압에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다. 생성된 무색 오일을 에틸 에테르 150 mL에 용해시킨 후, 헥산 100 mL를 첨가하였으며, 생성된 용액을 -78 ℃로 냉각시켰다. 결정화된 생성된 화이트 고체를 진공 여과에 의해 단리시키고, 잔류 용매를 고진공 (20 Pa (150 mtorr))하에 제거하여 3-시아노프로판산 (융점 49.5-51.0 ℃) 14.32 g (55%의 단리된 수율)이 생성되었다.
<실시예 21>
4-시아노부티르산 (암모늄 염)
먼저, 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 0.50 g (습윤 세포 중량)을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 위치시킨 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 10 mL를 첨가하였다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액에 전체 부피 10 mL로 재현탁시켰다. 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)에 전체 부피 6.0 mL로 용해된 글루타로니트릴 0.3830 g (4.03 mmol, 0.400 M)을 15 mL 폴리프로필렌 제2 원심분리관내로 위치시킨 후, 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 현탁액 (0.20 g 습윤 세포 중량) 4.00 mL를 첨가하고, 생성된 현탁액을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상에서 혼합하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하고, 물로 1:4로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.150 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)로 위치시키고, 0.1 M HCl 0.015 mL 및 0.150 M 아세트산칼륨의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.150 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 4.0 시간 후, 4-시아노부티르산 및 글루타르산의 HPLC 수율은 각각 85.1% 및 8.2%이었으며, 남아있는 글루타로니트릴은 5.7%이었다.
<실시예 22>
4-시아노부티르산의 단리
자성 교반 바아를 넣은 250 mL 삼각 플라스크내로 동결된 악시도보락스 팍실리스 72W (ATCC 55746) 세포 (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 열처리함) 15.0 g 및 27 ℃의 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 135 mL를 위치시켰다. 교반하면서 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 원심분리시켜 상등액을 버렸다. 이 세척 과정을 반복하였다. 생성된 세포 펠렛을 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)에 전체 부피 100 mL로 재현탁시켰고, 이 세포 현탁액을 자성 교반 바아, 글루타로니트릴 42.78 g (0.450 몰) 및 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 157.2 mL를 함유하는 500 mL 플라스크에 첨가하였다. 1.5 M 글루타로니트릴을 함유하는 생성된 혼합물을 27 ℃에서 교반시켰다. 시료 (0.100 mL)를 채취하고, 물로 1:10으로 희석시켜 원심분리시켰다. 이어서, 상등액 0.200 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (0.22 마이크론)에 위치시켜 0.1 M HCl 0.020 mL 및 0.150 M 아세트산칼륨의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.200 mL와 혼합하였다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 4.0 시간 후, 4-시아노부티르산 암모늄 염 및 글루타르산 디암모늄 염의 HPLC 수율은 각각 92.3% 및 7.7%이었으며, 글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
반응 혼합물을 원심분리시키고, 상등액을 YM-10 필터 (10K MWCO)를 장착한 아미콘 2.5 L 여과 유닛을 사용하여 여과시켰다. 상술한 4-시아노부티르산 암모늄 염 생성 혼합물을 함유하는 여액을 6 N HCl을 사용하여 pH 3.5로 조정한 후,염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 에테르 4 x 300 mL를 사용하여 추출하였다. 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과시켰으며, 감압에서 회전 증발에 의해 용매를 제거한 후, 진공하 (13.3 Pa (100 mtorr))에서 교반하여 결정화가 유지되는 담황색 오일로서 4-시아노부티르산 35.3 g (62% 수율)이 생성되었다. 이 고체를 5 ℃의, 1:1의 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화시켰다 (융점 39.6-40.2 ℃).
<실시예 23>
5-시아노펜탄산 (암모늄 염)
먼저, 동결된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744) 세포 (동결시키기 전에 50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 2.0 g (습윤 세포 중량)을 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관내로 위치시킨 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 30 mL를 첨가하였다. 세포를 해동하여 현탁시킨 후, 생성된 현탁액을 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 생성된 세포 펠렛을 동일한 인산염 완충액에 전체 부피 30 mL로 재현탁시켰다. 아디포니트릴 0.1085 g (0.114 mL, 1.00 mmol, 0.100 M)을 15 mL 폴리프로필렌 제2 원심분리관내로 칭량한 후, 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 9.29 mL 및 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744) 세포 현탁액 (0.040 g 습윤 세포 중량) 0.60 mL를 첨가하고, 생성된 현탁액을 27 ℃에서 회전식 플랫폼상에서 혼합하였다. 시료 (0.300 mL)를 채취하여 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (10 K MWCO)에 위치시키고, 0.750 M N-에틸아세타미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL 및 1.0 M HCl 충분량과 혼합하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추었다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 5.0 시간 후, 5-시아노펜탄산, 아디팜산, 아디파미드 및 아디프산의 HPLC 수율은 각각 96.6%, 1.7%, 1.4% 및 0.3%이었으며, 아디포니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 24>
5-시아노펜탄산 (암모늄 염)
전체 부피 10.0 mL (인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 조정함)의, 아디포니트릴 0.4338 g (0.457 mL, 4.01 mmol, 0.401 M) 및 열처리된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744) 세포 현탁액 (0.20 g 습윤 세포 중량) 3.0 mL를 사용하여 실시예 23에 기재된 수순을 반복하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하고, 물로 1:4로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (10 K MWCO)에 위치시키고, 0.750 M N-에틸아세타미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL 및 1.0 M HCl 충분량과 혼합하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추었다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 5 시간 후, 5-시아노펜탄산, 아디팜산, 아디파미드 및 아디프산의 HPLC 수율은 각각 94.0%, 4.0%, 0.6% 및 1.4%이었으며, 아디포니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 25>
5-시아노펜탄산 (암모늄 염)
전체 부피 10.0 mL (인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)으로 조정함)의, 아디포니트릴 1.084 g (1.14 mL, 10.0 mmol, 2상 반응, 1.00 M 생성물) 및 열처리된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744) 세포 현탁액 (0.50 g 습윤 세포 중량) 7.5 mL를 사용하여 실시예 23에 기재된 수순을 반복하였다. 시료 (0.100 mL)를 채취하고, 물로 1:10으로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.180 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (10 K MWCO)에 위치시키고, 0.750 M N-에틸아세타미드의 수용액 (HPLC 외부 표준 용액) 0.020 mL 및 1.0 M HCl 충분량과 혼합하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추었다. 생성된 용액을 여과하여 HPLC에 의해 분석하였다. 24.0 시간 후, 5-시아노펜탄산, 아디팜산, 아디파미드 및 아디프산의 HPLC 수율은 각각 90.0%, 4.2%, 0.0%, 및 5.7%이었으며, 아디포니트릴은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 26>
5-시아노펜탄산의 단리
자성 교반 바아를 넣은 2 L 삼각 플라스크내로 27 ℃의 인산칼륨 완충액 (20 mM, pH 7.0) 1.72 L중의 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744) 세포 (50 ℃에서 1 시간 동안 미리 열처리함) 4.0 g의 현탁액을 위치시켰다. 이어서, 현탁액에 아디포니트릴 270.4 g (284.3 mL, 2.5 몰, 최종 생성물 농도 약 1.25 M)을 교반하면서 첨가하고, 생성된 혼합물을 27 ℃에서 교반하였다. 시료 (0.200 mL)를 채취하고, 물로 1:5로 희석시켜 원심분리시킨 후, 상등액 0.200 mL를 밀리포어 울트라프리-MC 여과 유닛 (10K MWCO)에 위치시켰으며, 1.0 M HCl 충분량을 첨가하여 시료의 pH를 약 2.5로 낮추었다. 생성된 용액을 여과시켜 HPLC에 의해 분석하였다. 63 시간 후, 가수분해 반응은 상당히 느려졌으므로 동일한 미생물 세포 촉매 10.0 g을 혼합물에 추가로 첨가하였다. 86 시간 후, 5-시아노펜탄산, 아디팜산, 아디파미드 및 아디프산의 HPLC 수율은 각각 88.2%, 4.7%, 6.6% 및 0.0%이었으며, 아디포니트릴은 전혀 남아있지 않았다. 반응 혼합물을 원심분리시키고, 상등액을 YM-10 필터 (10K MWCO)를 장착한 아미콘 2.5 L 여과 유닛을 사용하여 여과시켰다.
5-시아노펜탄산 암모늄 염 (1.13 M)을 함유하는 상술한 생성 혼합물의 여액의 200 mL 부분을 6 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 후, 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 에테르 4 x 200 mL로 추출하였다. 합친 에테르 추출물을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 여과시켰으며, 감압에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다. 실온 및 고진공 (8.0 Pa (60 mtorr))하에서 5 시간 동안 무색 액체를 교반시키므로써 남아있는 에테르를 제거하여 5-시아노펜탄산 27.32 g (95%의 단리된 수율)이 생성되었다. 이어서, 5-시아노펜탄산을 분해 없이 110-112 ℃에서 진공 (10.0 Pa (75 mtorr))하에 증류시켰다.
<실시예 27>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 5-메틸-2-피페리돈
100 mL 눈금 실린더에 1.85 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (0.1 몰 4-시아노펜탄산 암모늄 염, 2-메틸글루타로니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨, 실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물)을 함유하는 수성 반응 혼합물 54.4 mL를 위치시킨 후, 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.2 몰 NH3) 12.9 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 4-시아노펜탄산 암모늄 염 및 첨가된 수산화암모늄의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 2.0 M이었다. 생성된 용액에 크롬-조촉매 라니 니켈 (그레이스 다비죤 라니 (등록상표) 2400 활성 금속 촉매) 0.631 g (4-시아노펜탄산 1 중량 당 5 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (Dispersimax (등록상표)) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 (Autoclave Engineers EZE-Seal) 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시키고, 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압하에서 160 ℃로 3 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석은 5-메틸-2-피페리돈 96.4% 수율을 나타내었고, 4-시아노펜탄산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다.
반응 혼합물을 여과시켜 촉매를 제거한 후, 6 N HCl로 pH를 6.0으로 조정하였으며, 염화나트륨으로 포화시켰다. 생성된 용액을 디클로로메탄 100 mL를 사용하여 5 회 추출하고, 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조하여 여과시켰으며, 감압하에 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 무색 오일이 생성되었다. 남아있는 용매를 진공 (13 Pa (0.1 ㎜Hg))하에서 제거한 후, 오일을 결정화시켜 화이트 고체를 형성하였으며, 이것을 -75 ℃의 에틸 에테르 150 mL로부터 재결정화하여 5-메틸-2-피페리돈 (융점 55.5-56.2 ℃) 6.69 g (59%의 단리된 수율)이 생성되었다.
<실시예 28>
4-시아노펜탄산으로부터의 5-메틸-2-피페리돈
전체 부피 100 mL의, 결정질 4-시아노펜탄산 (실시예 8에 기재된 단리로부터임) 12.71 g (0.100 몰) 및 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.3 몰 NH3) 19.34 mL를 사용하여 실시예 27에 기재된 반응을 반복하였다. 4-시아노펜탄산 암모늄 염 및 암모니아의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 2.0 M이었다. 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석은 5-메틸-2-피페리돈 91.1% 수율을 나타내었으며, 4-시아노펜탄산은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 29>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 5-메틸-2-피페리돈
1.0 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물), 0 내지 3.0 M 수산화암모늄, 및 Cr-조촉매 라니 니켈 촉매 (라니 2400), 탄소상의 5% 팔라듐, 탄소상의 10% 팔라듐, 알루미나상의 5% 루테늄 또는 알루미나상의 10% 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 5 중량% 또는 10 중량% (4-시아노펜탄산의 중량에 대한) 수소화 촉매를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압에서 유리 셰이커 관에서 진행시키고, 160 ℃ 또는 180 ℃에서 상응하는 락탐 5-메틸-2-피페리돈 (5-MPPD)의 생성에 대해 시험하여 하기 표 15에 나타내었다.
온도 (℃) 촉매 [NH4OH] (M) 중량% 촉매 시간 (h) 3-CPA (% 전환률) 4-EPRD (% 수율)
160 라니 2400 0 5 2 100 85.6
160 라니 2400 2.0 5 3 100 96.4
160 라니 2400 3.0 5 2 100 86.5
160 5% Pd/C 2.0 5 2 10 0
160 10% Pd/C 2.0 5 2 14 0
160 5% Ru/Al2O3 2.0 5 2 15 0
160 10% Ru/Al2O3 2.0 5 2 20 0
180 라니 2400 2.0 5 2 100 91.4
180 라니 2400 3.0 5 2 100 89.5
<실시예 30>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온
100 mL 눈금 실린더내로 1.26 M 3-시아노펜탄산 암모늄 염 (0.1 몰 3-시아노펜탄산 암모늄 염, 2-에틸숙시노니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨, 실시예 13의 여과된 생성 혼합물)을 함유하는 수성 반응 혼합물 79.4 mL를 위치시킨 후, 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.2 몰 NH3) 12.9 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 3-시아노펜탄산 암모늄 염 및 첨가된 수산화암모늄의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 2.0 M이었다. 생성된 용액에 크롬-조촉매 라니 니켈 (그레이스 다비죤 라니 (등록상표) 2400 활성 금속 촉매) 0.631 g (3-시아노펜탄산 1 중량 당 5 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (등록상표) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시키고, 4 시간 동안 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압하에서 160 ℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물 분석은 4-에틸피롤리딘-2-온 90.7% 수율을 나타내었고, 3-시아노펜탄산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 31>
3-시아노펜탄산으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온
전체 부피 100 mL의, 결정질 3-시아노펜탄산 (실시예 13에 기재된 단리로 부터임) 12.71 g (0.100몰) 및 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.3 몰 NH3) 19.34 mL를 사용하여 실시예 30에 기재된 반응을 반복하였다. 3-시아노펜탄산 암모늄 염 및 첨가된 수산화암모늄의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 2.0 M이었다. 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물 (2 시간의 반응 시간)의 분석은 4-에틸피롤리딘-2-온 92.1% 수율을 나타내었으며, 3-시아노펜탄산은 전혀 남아있지 않았다.
생성 혼합물을 여과시켜 촉매를 제거한 후, 6 N HCl로 pH 7.0으로 조정하고, 염화나트륨으로 포화시켰다. 생성된 용액을 디클로로메탄 100 mL로 4 회 추출하고, 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조하여 여과시키고, 감압하에 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 무색 오일이 생성되었다. 남아있는 용매를 진공 (13 Pa (0.1 ㎜Hg))하에 제거한 후, 오일을 에틸 에테르 150 mL에 용해시키고, 이것을 -78 ℃로 냉각시켰다. 1 시간 후, 결정화된 화이트 고체를 진공 여과에 의해 수집하여 4-에틸피롤리딘-2-온 (융점 40.5-41.5 ℃)이 총 8.96 g (79%의 단리된 수율) 생성되었다.
<실시예 32>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온
수소화에 적용된 온도가 140 ℃인 것을 제외하고는 실시예 30에 기재된 반응을 기재된 바와 같이 정확하게 반복하였다. 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석 (4 시간의 반응 시간)은 4-에틸피롤리딘-2-온 87.2% 수율을 나타내었으며, 3-시아노펜탄산은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 33>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온
크롬-조촉매 라니 니켈 (그레이스 다비죤 라니 (등록상표) 2400 활성 금속 촉매) 1.262 g (3-시아노펜탄산 1 중량 당 10 중량%)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 30에 기재된 반응을 기재된 바와 같이 정확하게 반복하였다. 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석 (1.5 시간의 반응 시간)은 4-에틸피롤리딘-2-온 91.0% 수율을 나타내었으며, 3-시아노펜탄산은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 34>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온 (온도 의존)
1.0 M 3-시아노펜탄산 (3-CPA) 암모늄 염 (실시예 13으로부터의 여과된 생성 혼합물), 2.0 M 수산화암모늄, 및 5 중량% 또는 10 중량% (3-시아노펜탄산의 중량에 대한) Cr-조촉매 라니 니켈 촉매 (라니 2400)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 70 ℃ 내지 180 ℃의 온도에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 고압 액체 크로마토그래피에 의해 3-CPA의 전환률을, 기체 크로마토그래피에 의해 4-에틸피롤리딘-2-온 생성을 하기 표 16과 같이 분석하였다.
온도 (℃) 4-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 중량% 라니 Ni 시간 (h) 3-CPA (% 전환률) 4-EPRD (% 수율)
70 1.0 2.0 5 2 7 1.5
120 1.0 2.0 5 2 55 22.7
140 1.0 2.0 5 2 71 55.4
140 1.0 2.0 10 2 100 89.9
160 1.0 2.0 5 2 100 90.1
160 1.0 2.0 10 2 100 91.3
180 1.0 2.0 5 2 100 86.1
180 1.0 2.0 10 2 100 90.0
<실시예 35>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온 (NH4OH 농도 의존)
1.0 M 3-시아노펜탄산 (3-CPA) 암모늄 염 (실시예 13으로부터의 여과된 생성 혼합물), 0 M 내지 3.0 M 수산화암모늄, 및 5 중량% (3-시아노펜탄산의 중량에 대한) Cr-조촉매 라니 니켈 촉매 (라니 2400)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 160 ℃ 또는 180 ℃의 온도에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 고압 액체 크로마토그래피에 의해 3-CPA의 전환률을, 기체 크로마토그래피에 의해 4-에틸피롤리딘-2-온의 생성을 하기 표 17과 같이 분석하였다.
온도 (℃) 3-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 중량% 라니 Ni 시간 (h) 3-CPA (% 전환률) 4-EPRD (% 수율)
160 1.0 0 5 2 99 80.1
160 1.0 1.0 5 2 99 87.6
160 1.0 2.0 5 2 100 90.1
160 1.0 3.0 5 2 100 85.4
180 1.0 0 5 2 100 75.1
180 1.0 1.0 5 2 100 85.8
180 1.0 2.0 5 2 100 88.5
180 1.0 3.0 5 2 100 90.0
<실시예 36>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸피롤리딘-2-온 (3-CPA 농도 의존)
각각 1.0 M, 1.5 M 또는 2.0 M 3-시아노펜탄산 (3-CPA) (실시예 13으로부터의 여과된 생성 혼합물로부터 단리됨), 및 2.0 M, 3.0 M 또는 4.0 M 수산화암모늄을 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 160 ℃ 또는 180 ℃의 온도에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 고압 액체 크로마토그래피에 의해 3-CPA의 전환률을, 기체 크로마토그래피에 의해 4-에틸피롤리딘-2-온의 생성을 하기 표 18과 같이 분석하였다.
온도 (℃) 3-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 중량% 라니 Ni 시간 (h) 3-CPA (% 전환률) 4-EPRD (% 수율)
160 1.0 2.0 5 2 100 90.1
160 1.5 3.0 5 2 99 76.1
160 2.0 4.0 5 2 99 80.0
180 1.0 2.0 5 2 100 88.5
180 1.5 3.0 5 2 99 77.3
180 2.0 4.0 5 2 99 84.1
<실시예 37>
5-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 카프롤락탐
1.0 M 5-시아노펜탄산 (5-CPA) 암모늄 염 (아디포니트릴의 효소적 가수분해로부터 제조됨, 실시예 26으로부터의 여과된 생성 혼합물), 0 M 내지 2.5 M 수산화암모늄, 및 5 중량% (5-시아노펜탄산의 중량에 대한) Cr-조촉매 라니 니켈 촉매 (라니 2400)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 70 ℃ 내지 160 ℃의 온도에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 고압 액체 크로마토그래피에 의해 5-CPA의 전환률을, 기체 크로마토그래피에 의해 카프롤락탐의 생성을 하기 표 19와 같이 분석하였다.
온도 (℃) 5-CPA 암모늄 염 (M) [NH4OH] (M) 시간 (h) 5-CPA (% 전환률) 카프롤락탐 (% 수율)
70 1.0 0 2 100 0.7
70 1.0 1.0 2 100 0.7
70 1.0 1.5 2 94 0.8
70 1.0 2.0 2 84 0.8
70 1.0 2.5 2 99 0.8
120 1.0 0 2 99 0.9
120 1.0 1.0 2 100 0.9
120 1.0 1.5 2 97 1.0
120 1.0 2.0 2 97 1.1
160 1.0 0 2 97 2.5
160 1.0 1.0 2 84 2.3
160 1.0 1.5 2 97 3.0
160 1.0 2.0 2 95 2.7
70 ℃에서 5-CPA 암모늄 염의 수소화에 의해 제조된 수성 생성물 혼합물중의 6-아미노카프로산 (6-ACA)의 암모늄 염 (상술한 바와 같음)을, 먼저 여과에 의해 수소화 촉매를 제거한 후, 약 1.0 M 6-ACA 암모늄 염 반응 혼합물을 2 시간 동안 280 ℃로 가열하므로써 보다 높은 온도에서 고리화시켰다.
온도 (℃) 6-ACA 암모늄 염 (M) (상술한 바와 같이 제조됨) [NH4OH] (M) 시간 (h) 카프롤락탐 (% 수율)
280 1.0 0 2 17.8
280 1.0 1.0 2 17.2
280 1.0 1.5 2 11.0
280 1.0 2.0 2 9.0
280 1.0 2.5 2 3.1
<실시예 38>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
1.0 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물), 3.0 M 메틸아민, 및 Cr-조촉매 라니 니켈 촉매 (라니 2400), 탄소상의 5% 팔라듐, 알루미나상의 5% 팔라듐, 알루미나상의 5% 루테늄 또는 탄소상의 4.5%팔라듐/0.5% 백금으로 이루어진 군으로부터 선택된 수소화 촉매의 5 중량% 또는 10 중량% (4-시아노펜탄산의 중량에 대한)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 160 ℃에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 1,5-디메틸-2-피페리돈 (5-DMPD) 및 5-메틸-2-피페리돈 (5-MPPD)의 생성물에 대해 하기 표 21과 같이 분석하였다.
온도 (℃) 촉매 중량% 촉매 시간 (h) 4-CPA (% 전환률) 5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율)
160 라니 2400 5 2 100 19.2 68.5
160 라니 2400 10 2 100 21.7 69.1
160 5% Ru/Al2O3 5 2 100 19.0 63.5
160 5% Pd/C 5 2 99 81.7 7.8
160 5% Pd/Al2O3 5 2 93 77.2 4.6
160 4.5% Pd/0.5% Pt/C 5 2 97 77.8 6.2
<실시예 39>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
1.0 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물), 1.0 M 내지 3.0 M 메틸아민, 및 탄소상의 5% 팔라듐의 5 중량% (4-시아노펜탄산의 중량에 대한)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 140 ℃에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 1,5-디메틸-2-피페리돈 (5-DMPD), 5-메틸-2-피페리돈 (5-MPPD) 및 2-메틸글루타르산 (2-MGA)의 생성물에 대해 하기 표 22와 같이 분석하였다.
온도 (℃) 촉매 시간 (h) [CH3NH2] (M) 4-CPA (% 전환률) 5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율) 2-MGA (% 수율)
140 5% Pd/C 2 1.0 100 53.3 0 0.7
140 5% Pd/C 2 1.25 100 65.8 0 0.7
140 5% Pd/C 2 1.5 99 74.5 0 0.8
140 5% Pd/C 2 2.0 98 80.2 0 1.0
140 5% Pd/C 2 3.0 99 83.4 0 1.1
<실시예 40>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
1.0 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물), 1.0 M 내지 4.0 M 메틸아민, 및 탄소상의 5% 팔라듐의 5 중량% (4-시아노펜탄산의 중량에 대한)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 160 ℃에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 1,5-디메틸-2-피페리돈 (5-DMPD), 5-메틸-2-피페리돈 (5-MPPD) 및 2-메틸글루타르산 (2-MGA)의 생성물에 대해 하기 표 23과 같이 분석하였다,
온도 (℃) 촉매 시간 (h) [CH3NH2] (M) 4-CPA (% 전환률) 5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율) 2-MGA (% 수율)
160 5% Pd/C 2 1.0 100 53.5 0 0.7
160 5% Pd/C 2 1.25 100 68.3 0 0.8
160 5% Pd/C 2 1.5 100 76.4 0 0.9
160 5% Pd/C 2 2.0 100 81.5 0 1.8
160 5% Pd/C 2 3.0 99 81.7 7.8 3.3
160 5% Pd/C 2 4.0 99 88.4 1.9 2.6
<실시예 41>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
1.0 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물), 3.0 M 내지 4.0 M 메틸아민, 및 탄소상의 5% 팔라듐 또는 탄소상의 4.5% 팔라듐/0.5% 백금의 5 중량% (4-시아노펜탄산의 중량에 대한)를 함유하는 5 mL 수성 반응 혼합물의 수소화를 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압 및 180 ℃에서 2 시간 동안 유리 셰이커 관에서 진행시킨 후, 1,5-디메틸-2-피페리돈 (5-DMPD), 5-메틸-2-피페리돈 (5-MPPD) 및 2-메틸글루타르산 (2-MGA)의 생성물에 대해 하기 표 24와 같이 분석하였다.
온도 (℃) 촉매 [CH3NH2] (M) 4-CPA (% 전환률) 5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율) 2-MGA (% 수율)
180 5% Pd/C 3.0 97 73.0 6.6 -
180 4.5% Pd/0.5% Pt/C 3.0 96 69.0 1.9 23.9
180 5% Pd/C 4.0 95 66.6 2.6 33.5
<실시예 42>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
100 mL 눈금 실린더에 1.84 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (0.1 몰 4-시아노펜탄산 암모늄 염, 2-메틸글루타로니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨, 실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물)을 함유하는 수성 반응 혼합물 54.4 mL를 위치시킨 후, 40 중량% 메틸아민 (9.31 g 메틸아민, 0.3 몰) 25.8 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 4-시아노펜탄산 암모늄 염 및 메틸아민의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 3.0 M이었다. 생성된 용액에 탄소 분말상의 5% Pd 0.636 g (4-시아노펜탄산 1 중량 당 5 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (등록상표) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시키고, 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압에서 4 시간 동안 160 ℃로 가열하였다. 시료 (약 1.5 mL)를 반응의 분석 과정에 걸쳐 샘플링 관을 경유하여 제거하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석은 1.5-디메틸-2-피페리돈 72.8%, 5-메틸-2-피페리돈 3.5% 및 2-메틸글루타르산 19.9%의 수율을 나타내었으며, 4-시아노펜탄산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다.
생성 혼합물 (샘플링 후 61 mL)을 여과시켜 촉매를 제거한 후, 6 N HCl로 pH를 7.0으로 조정하고, 염화나트륨으로 포화시켰다. 생성된 용액을 에틸 에테르 100 mL를 사용하여 4 회 추출하고, 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조하여 여과시켰으며, 감압하에 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 무색 액체가 생성되었다. 이 액체를 467 Pa (3.5 torr)에서 증류시키고, 70.0-71.5 ℃에서 분별 비등시켜 생성된 1,5-디메틸-2-피페리돈 (5-DMPD) 4.65 g (60%의 단리된 수율)을 수집하였다.
<실시예 43>
3-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 4-에틸-1-메틸피롤리딘-2-온
100 mL 눈금 실린더에 1.26 M 3-시아노펜탄산 암모늄 염 (0.1 몰 3-시아노펜탄산 암모늄 염, 2-에틸숙시노니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨, 실시예 13에서 여과된 생성 혼합물)을 함유하는 수성 반응 혼합물 79.4 mL를 위치시킨 후, 40 중량% 메틸아민 (6.21 g 메틸아민, 0.2 몰) 17.2 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 3-시아노펜탄산 암모늄 염 및 메틸아민의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 2.0 M이었다. 생성된 용액에 탄소 분말상의 5% Pd 0.636 g (3-시아노펜탄산 1 중량 당 5 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (등록상표) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시키고, 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압하에서 4 시간 동안 140 ℃로 가열하였다. 시료 (약 1.5 mL)를 반응의 분석 과정에 걸쳐 샘플링 관을 경유하여 제거하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석은 4-에틸-1-메틸피롤리딘-2-온의 69.8% 수율 및 4-에틸피롤리딘-2-온의 20.4% 수율을 나타내었으며, 3-시아노펜탄산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다.
생성 혼합물 (샘플링 후 80 mL)을 여과하여 촉매를 제거한 후, 6 N HCl로 pH를 7.0으로 조정하고, 염화나트륨으로 포화시켰다. 생성된 용액을 디클로로메탄 100 mL를 사용하여 4 회 추출하고, 합친 유기 추출물을 황산마그네슘상에서 건조하여 여과시켰으며, 감압하에 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 무색 액체가 생성되었다. 이 액체를 2133 Pa (16 torr)에서 분별 증류시키고, 100 ℃에서의 분별 비등물을 수집하였다 (5.15 g, 51% 수율). 생성된 4-에틸-1-메틸피롤리딘-2-온은 불순물로서 <5% 4-에틸피롤리딘-2-온을 함유하였으므로, 액체를 5333 Pa (40 torr)에서 재증류시키고, 128 ℃에서 분별 비등시켜 생성된 4-에틸-1-메틸피롤리딘-2-온 (4-EMPRD)을 3.71 g (37%의 단리된 수율)을 수집하였다.
<실시예 44>
4-시아노-4-펜텐산 암모늄 염으로부터의 5-메틸-2-피페리돈
100 mL 눈금 실린더에 1.30 M 4-시아노-4-펜텐산 암모늄 염 (0.1 몰 4-시아노펜탄산 암모늄 염, 실시예 17에서 2-메틸렌글루타로니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨)을 함유하는 수성 반응 혼합물 77.0 mL를 위치시킨 후, 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.2 몰 NH3) 12.9 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 4-시아노-4-펜텐산 암모늄 염 및 첨가된 수산화암모늄의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 2.0 M이었다. 생성된 용액에 크롬-조촉매 라니 니켈 (그레이스 다비죤 라니 (등록상표) 2400 활성 금속 촉매) 0.626 g (4-시아노-4-펜텐산 1 중량 당 5 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (등록상표) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시켰으며, 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압하에서 5 시간 동안 50 ℃로 가열하고, 3 시간 동안 160 ℃로 추가로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 기체 크로마토그래피에 의한 최종 반응 혼합물의 분석은 5-메틸-2-피페리돈의 85.0% 수율을 나타내었으며, 4-시안-4-펜텐산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 45>
3-시아노프로피온산 암모늄 염으로부터의 2-피롤리디논
100 mL 눈금 실린더에 1.31 M 3-시아노프로피온산 암모늄 염 (0.1 몰 3-시아노프로피온산 암모늄 염, 실시예 20에서 숙시노니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨)을 함유하는 수성 반응 혼합물 75.8 mL를 위치시킨 후, 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.3 몰 NH3) 19.4 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 3-시아노프로피온산 암모늄 염 및 첨가된 수산화암모늄의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 3.0 M이었다. 생성된 용액에 크롬-조촉매 라니 니켈 (그레이스 다비죤 라니 (등록상표) 2400 활성 금속 촉매) 0.99 g (3-시아노프로피온산 1 중량 당 10 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (등록상표) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시키고, 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압하에서 4.5 시간 동안 70 ℃로 가열한 후, 5 시간 동안 180 ℃로 추가로 가열하였다. 기체 크로마토그래피에 의한 분석은 2-피롤리디논의 91.0% 수율을 나타내었으며, 3-시아노프로피온산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다.
<실시예 46>
4-시아노부티르산 암모늄 염으로부터의 2-피페리돈
실시예 22에 기재된 수순을 반복하였다. 4.0 시간 후, 4-시아노부티르산 암모늄 염 및 글루타르산 디암모늄 염의 HPLC 수율은 각각 91.7% 및 7.5%이었으며, 글루타로니트릴은 전혀 남아있지 않았다. 원심분리시키고 여과시킨 반응 혼합물중의 4-시아노부티르산 암모늄 염의 최종 농도는 1.42 M이었다. 100 mL 눈금 실린더에 여과된 수성 반응 혼합물 70.6 mL (4-시아노프로피온산 암모늄 염 0.100 몰)를 위치시킨 후, 진한 수산화암모늄 (29.3% NH3, 0.3 몰 NH3) 19.4 mL를 첨가하고, 최종 부피를 증류수로 100 mL로 조정하였다. 4-시아노부티르산 암모늄 염 및 첨가된 수산화암모늄의 최종 농도는 각각 1.0 M 및 3.0 M이었다. 생성된 용액에 크롬-조촉매 라니 니켈 (그레이스 다비죤 라니 (등록상표) 2400 활성 금속 촉매) 1.13 g (4-시아노부티르산 1 중량 당 10 중량%)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 디스퍼시맥스 (등록상표) 터빈형 임펠러가 장착된 300 mL 314 SS 오토클레이브 엔지니어스 EZE-실 교반형 오토클레이브에 채웠다. 반응기를 질소로 플러슁시킨 후, 반응기의 내용물을 1000 rpm으로 교반시키고, 3447 kPa (500 psig)의 수소 기체압하에서 3.5 시간 동안 70 ℃로 가열하였다. 기체 크로마토그래피에 의한 분석은 2-피페리돈의 29.7% 수율을 나타내었으며, 4-시아노부티르산 암모늄 염은 전혀 남아있지 않았다. 온도를 추가로 2 시간 동안 180 ℃로 증가시킨 후, 기체 크로마토그래피에 의한 시료의 분석은 2-피롤리디논의 93.5% 수율을 나타내었다.
<실시예 47>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 5-메틸-2-피페리돈
1.85 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (0.1몰 4-시아노펜탄산 암모늄 염, 2-메틸글루타로니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨, 실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물), 29% 수성 수산화암모늄 5.6 g 및 증류수 44 mL를 함유하는 수성 혼합물 50 mL를 300 mL 오토클레이브에 채웠다. 이 용액에 탄소상 4.5% Pd/0.5% Pt 촉매 0.73 g (4-시아노펜탄산을 기준으로 3 중량%)을 첨가하였다. 오토클레이브를 밀봉하여 수소로 3 회 퍼지시킨 후, 690 kPa (100 psig)의 수소압하에 160 ℃로 가열하고, 천천히 교반시켰다. 160 ℃에서, 압력을 5516 kPa (800 psig)로 높이고, 최고 속도로 교반을 시작하였다. 3 시간 후, 반응기를 냉각시키고, 벤트시켰으며, 질소로 퍼지시켰다. 생성 혼합물의 기체 크로마토그래피 분석은 4-시아노펜탄산의 96% 전환률 및 5-메틸-2-피페리돈의 95.5% 수율 (99.5% 선택도)을 나타내었다.
<실시예 48>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
1.85 M 4-시아노펜탄산 암모늄 염 (0.2 몰 4-시아노펜탄산 암모늄 염, 2-메틸글루타로니트릴의 효소적 가수분해에 의해 제조됨, 실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물) 및 40% 수성 메틸아민 14 g (0.2 몰)을 함유하는 수성 혼합물 100 mL를 300 mL 오토클레이브에 채웠다. 이 용액에 탄소상 4.5% Pd/0.5% Pt 촉매를 첨가하였다. 오토클레이브를 밀봉하고 수소로 3 회 퍼지시킨 후, 690 kPa (100 psig) 수소압하에 반응을 가열시켰으며, 느리게 교반하였다. 반응 온도에서, 압력을 올리고, 교반을 최대 속도로 시작하였다. 주어진 반응 시간 후, 반응기를 냉각시키고, 벤트시켰으며, 질소로 퍼지시켰다. 생성 혼합물의 기체 크로마토그래피 분석을 상이한 반응 조건에서 여러번 수행하였으며, 하기 표 25에 요약하였다.
온도 (℃) H2 (psig) 촉매 하중 (중량%) 시간 (h) 4-CPA (% 전환률) 5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율)
175 300 7.4 3 99 67.8 28.2
160 500 10 2 99 68.6 28.1
145 500 10 2 93 65.2 26.4
<실시예 49>
4-시아노펜탄산 암모늄 염으로부터의 1,5-디메틸-2-피페리돈
4-시아노펜탄산 암모늄 염의 수소화를 상이한 탄소상 Pd 촉매를 사용하여 5516 kPa (800 psig)에서 5 mL 유리 셰이커 관에서 수행하였다. 1.85 M (7 mmol) 수성 5-시아노펜탄산 (실시예 9의 반응 #5로부터의 여과된 생성 혼합물) 4 mL, 40% 메틸아민 0.88 g (11.4 mmol), 및 5% Pd/C 및 4.5% Pd/0.5% Pt/C로 이루어진 군으로부터의 촉매를 관에 채우고, 3 시간 동안 반응시켰다. 상이한 반응 조건에서 25 ℃로 냉각시킨 후, 생성 혼합물의 기체 크로마토그래피 분석을 하기 표 26에 요약하였다.
온도 (℃) 촉매 촉매 하중 (중량%) 시간 (h) 4-CPA (% 전환률) 5-DMPD (% 수율) 5-MPPD (% 수율)
160 5% Pd/C 1.2 2 99 91.8 5.0
160 4.5% Pd/0.5% Pt/C 0.7 2 99 94.0 3.1
150 5% Pd/C 0.7 2 99 92.5 2.2
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
Figure 112005022603507-pat00021
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
Figure 112005022603507-pat00022
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
Figure 112005022603507-pat00023
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
Figure 112005022603507-pat00024
니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하는 단리된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744)가 제공되며, 이것은 지방족 α,ω-디 니트릴로부터 5원 또는 6원 고리 락탐을 제조하는 방법에 있어서 효소 촉매로서 매우 유용하다.

Claims (1)

  1. 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성의 조합을 특징으로 하는 단리된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D (ATCC 55744).
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