DE69731483T2

DE69731483T2 - Beta-l-dioxolanuridin-analoge zur behandlung und vorbeugung von durch ebv, vzv bzw. hv-8 verursachten viralen infektionen

Info

Publication number: DE69731483T2
Application number: DE69731483T
Authority: DE
Inventors: Yung-Chi Cheng; K. Chung CHU; Fucheng Qu
Original assignee: Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: Yale University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2017-11-15
Also published as: DE69731483D1; WO1998020879A1; KR20000069003A; US6022876A; US20010018440A1; ATE281169T1; BR9713074A; CN1244799A; CA2272404A1; EP0956021B1; US6274589B1; AU737209B2; JP2001504468A; EP0956021A4; AU5254998A; AU737209C; EP0956021A1

Description

Diese Erfindung betrifft neuartige L-β-Dioxolan-Uridin-Nukleosid-Analoga und deren Verwendung bei der Herstellung von, Medikamenten für das Verhindern und die Behandlung von Epstein-Barr-Virus, Varizella-Zoster-Virus und Kaposi-Sarkom-Virus, auch bekannt als HV-8.
Hintergrund der Erfindung
Während bakterielle Infektionen des Menschen durch Anwendung vermehrt verfügbarer, antibiotischer Wirkstoffe besser gehandhabt werden können und besser behandelbar sind, bleiben virale Infektionen ein schwierigeres und weniger gut behandelbares Zielgebiet. Dem Bemühen zur Auffindung von Wirkstoffen zum Behandeln viraler Infektionen kommt noch immer hohe Priorität zu.
Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein wichtiges Humanpathogen, das mit dem Herpes-Simplex-Virus (HSV) verwandt ist. Elliot Kieff, Virology, Dritte Auflage. Herausgegeben von B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley et al. Epstein-Barr Virus and its Replication. Kapitel 74, S. 2343–2396, und Alan B. Rickinson and Elliot Kieff, [ibd. Kapitel 75, S. 2397–2446). EBV ist ein lymphotrophes Mitglied der Gattung Lymphocryptovirus und gehört zur Unterfamilie der Gammaherpesvirinae. Ein anderes, neues Humanvirus, das ebenfalls dieser Familie zugehörig ist, ist das mit dem Kaposi-Sarkom assoziierte Herpes-Virus (KSHV/HHV8). Chang et al., Science, 266: 1865–1869 (1994); Cesarman et al., N. Eng. J. Med., 332: 1186–1191 (1995); Soulier et al., Blood, 86: 1276–1280 (1995). Es sind zwei Subtypen von EBV identifiziert worden, deren Genome fast identisch sind, aber es gibt keinen eindeutigen Zusammenhang zwischen EBV-assoziierten Krankheiten und EBV-Subtypen. Abdul-Hamid et al., Virology, 190: 168–175 (1992) und Sample et al., J. Virol., 64: 4084–4092 (1990). Das Genom des lytischen EBV ist eine lineare, doppelsträngige DNA, die zu 60 Mol.-% aus Guanin und Cytosin besteht. Das Genom ist sequenziert worden und kann eine Anzahl virusspezifischer Proteine kodieren, darunter mehrere Enzyme, die an der Synthese von Virus-DNA während der lytischen Infektion von EBV beteiligt sind. In vitro ist die EBV-Infektion in der Regel auf B-Lymphozyten beschränkt, obgleich auch Epithelzellen infiziert sein können. Sixbey et al., Nature, 306: 480–483 (1983). Beim Menschen kann das Virusgenom in B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Epithelzellen nachgewiesen werden. Das EBV-Genom in linearer Form repliziert sich lytisch und kann auch latent als zirkuläre DNA in superhelikaler (supercoiled) Struktur vorliegen. Die Expression des EBV-Genoms in lytisch infizierten Zellen unterscheidet sich signifikant von latent infizierten Zellen. EBV-spezifische DNA-Polymerase, DNase und dThd-Kinase werden in Zellen nur nach lytischer DNA-Replikation exprimiert.
Zellkulturstudien zeigen die zentrale Bedeutung der EBV-DNA-Polymerase für die Replikation von EBV-DNA während einer lytischen Infektion, aber nicht für die Erhaltung der superhelikalen EBV-DNA in latent infizierten Zellen. In latent infizierten oder transformierten Zellen ist ein einmaliger Satz von EBV-Proteinen, einschließlich EBVNA1 und manchmal EBNA LP, 2, 3A, 3B, 3C, LMP-1 sowie LMP-2, exprimiert. Elliot Kieff, Virology, Dritte Auflage. Herausgegeben von B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley et al. Epstein-Barr Virus and its Replication. Kapitel 74, S. 2343–2396, und Alan B. Rickinson und Elliot Kieff, [ibd. Kapitel 75, S. H2397–2446].
Strukturell ist EBV ähnlich wie andere Herpesviren – es besitzt ein Genom aus doppelsträngiger DNA innerhalb eines Nukleokapsids, das von einer Lipidhülle umgeben ist, das virale Glykoproteine enthält. Den Raum zwischen der Hülle und dem Nukleokapsid nimmt ein Tegumentprotein ein.
Während eine primäre EBV-Infektion im Kleinkindalter fast asymptomatisch verläuft, manifestiert sich ein Teil (in manchen Studien bis zu 50%) der serologisch bestätigten Primärinfektionen im Jugendalter oder frühen Erwachsenenleben als infektiöse Mononukleose (IM), auch „Kusskrankheit" genannt. Die Übertragung von EBV erfolgt primär über den Speichel, obgleich manche Infektionen durch Bluttransfusionen übertragen werden. Ein hoher Prozentanteil (> 85%) der Patienten im akuten Stadium einer infektiösen Mononukleose scheidet EBV ab. Mitte der 1970er Jahre wurde EBV als Auslöser des tödlichen IM/X-verknüpften, lymphoproliferativen Syndroms (XLP) bei männlichen Kleinkindern mit X-chromosomal bedingter Immunschwäche identifiziert. Sullivan und Wood, (Immundeficiency Rev., 1: 325–347 (1989). Es wurde außerdem herausgefunden, dass tödlich verlaufende EBV-Infektionen in Zusammenhang mit dem nicht familiären, monophagozytären Syndrom (VAHS) stehen, für das es keine wirksame Therapie gibt. Alan B. Rickinson und Elliot Kieff, Virology, Dritte Auflage. Herausgegeben von B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley et al. Epstein-Barr Virus and its Replication. Kapitel 75, S. 2397–2446, und Craig et al., Am. J. Clin. Path., 97: 189–194 (1992).
Epstein-Barr-Virus gilt außerdem als verursachendes Agens proliferativer B-Zell-Erkrankungen und steht in Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheitszuständen, einschließlich einem seltenen, progressiven Mononukleose-ähnlichen Syndrom und oraler Haarleukoplakie bei AIDS-Patienten. EBV wurde auch mit bestimmten Krebsarten, wie dem Burkitt-Lymphom, dem Nasopharyngealkarzinom, der Hodgkin-Krankheit, einem EBV-assoziierten T-Zell-Lymphom und dem nasalem T-Zell-Lymphom in Verbindung gebracht.
Bestimmte Patienten, vor allem solche mit einem unterdrückten Immunsystem, wie beispielsweise AIDS-Patienten und Organtransplantationspatienten, die mit Immunsuppressiva behandelt werden, sind besonders anfällig gegenüber EBV-Manifestationen, vor allem gegenüber der Entwicklung von EBV-assoziierten Lymphomen.
Chu et al. beschreiben in der PCT-Anmeldung PCT/US95/01253 eine Reihe von L-Nukleosid-Analoga zur Anwendung bei der Behandlung von Infektionen mit dem Hepatitis-B-Virus und dem Epstein-Barr-Virus. Ein in der PCT-Anmeldung offenbarter Wirkstoff, 2'-Fluor-5-methyl-β-L-arabinofuranosyluridin (L-FMAU) zeigte gute Aktivität gegen EBV. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die Anti-EBV-Aktivität bei Substitution einer 5-Methylgruppe von L-FMAU durch eine Bromgruppe zurückging.
Es ist gezeigt worden, dass mehrere Verbindungen in Konzentrationen, die für das Zellwachstum nicht toxisch sind, in der Zellkultur eine Aktivität gegen EBV-Replikation haben. Dazu gehören Acyclovir (ACV), Gancyclovir (DHPG), Pencyclovir, D-FMAU und seine Analoga 5-Bromvinyl-dUrd, Phosphonoformiat- und Phosphorothioat-Oligonukleotide. Siehe Lin et al., Antimicrob. Agents and Chemo., (Februar) 32 (2): 265–267 (1988); Lin et al., Antimicrob. Agents and Chemo., 32 (7): 1068–1072 (1988), Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2767–2770 (1983), Datta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5163–5166 (1980), Datta et al., Virology, 114: 52–59 (1981); Lin et al., Antimicrob. Agents and Chemo., 31: 1431–1433 (1987); Olka und Calendar, Virology, 104: 219–223 (1980); Lin et al., J. Virol., 50: 50–55 (1984); Yao et al., Antimicrob. Agents and Chemo., 37: 1420–1425 (1993) und Yao et al., Biochem. Pharm. (51): 941–947 (1966).
Aufgaben der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen zum Behandeln und/oder Verhindern von Infektionen mit Epstein-Barr-Virus, Varizella-Zoster-Virus und Kaposi-Sarkom-Virus (HV-8) bei Patienten bereit zu stellen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass bestimmte β-L-Dioxolan-Nukleosid-Analoga, die eine Uracilbase und vorzugsweise eine 5-halosubstituierte Uracilbase enthalten, eine unerwartet hohe Aktivität gegen Epstein-Barr-Virus (EBV), Varizella-Zoster-Virus (VZV) und Kaposi-Sarkom-Virus (HV-8) aufweisen. Insbesondere zeigen die Verbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wirksame Hemmung der Replikation des Virus (virales Wachstum) in Kombination mit sehr geringer Toxizität gegenüber den. Wirtszellen (d. h. Tier- oder Humangewebe).
Verbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zeigen primär Verwendbarkeit als Wirkstoffe zum Hemmen des Wachstums oder der Replikation von EBV, des Varizella-Zoster-Virus und des Kaposi-Sarkom-Virus (HV-8). Von diesen Wirkstoffen könnten bestimmte auch zum Hemmen des Wachstums oder der Replikation anderer Viren (beispielsweise HSV) oder zum Behandeln anderer viraler Infektionen und/oder verwandter Krankheitszustände wirksam sein. Andere Wirkstoffe könnten als biologische Sonden für Testzwecke oder als Zwischenstufen bei der Synthese verwandter Nukleosidverbindungen mit pharmakologischer Aktivität verwendet werden.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung finden besondere Anwendung bei der Bekämpfung viraler Infektionen, die Tiere befallen, und insbesondere Menschen, die an Epstein-Barr-Virus-, Varizella-Zoster-Virus- und Kaposi-Sarkom-Virus(HV-8)-Infektionen leiden. Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung bieten ein großes Potenzial als therapeutische Wirkstoffe gegen einen Krankheitszustand (Epstein-Barr-Virus-, Varizella-Zoster-Virus- und Kaposi-Sarkom-Virus(HV-8)-Infektionen), für die es gegenwärtig wenige echte therapeutische Möglichkeiten gibt. Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können alleine oder in Kombination mit Wirkstoffen oder anderen therapeutischen Behandlungen verwendet werden.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind Dioxalon-Nukleosid-Analoga, die eine L-Konfiguration (im Gegensatz zu der natürlichen D-Konfiguration der meisten natürlich vorkommenden Nukleoside) und eine Uracilbase enthalten. Vorzugsweise ist die Uracilbase an Position 5 durch ein Fluor, Chlor, Brom, Iod, Methyl oder Trifluormethyl substituiert, wobei eine Substitution an Position 5 der Uracilbase mit Iod oder Brom besonders bevorzugt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung der Verbindungen zum Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Verwendung in Verfahren zum Hemmen des Wachstums oder der Replikation von EBV, Varizella-Zoster-Virus und Kaposi-Sarkom-Virus (HV-8), umfassend das Aussetzen des Virus einer hemmend wirksamen Menge oder Konzentration mindestens eines der offenbarten L-Nukleosid-Analoga. Dieses Verfahren kann in Vergleichstests, beispielsweise in Tests zur Bestimmung der Aktivitäten von verwandten Anti-EBV-, Anti-VZV- oder Anti-HV-8-Verbindungen, sowie zum Bestimmen der Empfindlichkeit der EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion eines Patienten gegenüber einer der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die vorliegenden Verbindungen werden vorzugsweise verwendet, um EBV-, VZV- oder HV-8-Infektionen bei Menschen zu behandeln oder zu verhindern.
Der therapeutische Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft Verbindungen zum Behandeln oder Verhindern von EBV-, VZV- oder HV-8-Infektionen bei Patienten, vorzugsweise bei menschlichen Patienten, umfassend das Verabreichen antiviral wirksamer Mengen einer oder mehrerer der Verbindungen, um das Wachstum oder die Replikation des Virus in dem zu behandelnden, tierischen oder menschlichen Patienten zu hemmen. In einem bevorzugten Verfahren werden die vorliegenden Zusammensetzungen verwendet, um die Manifestation von EBV-, VZV- oder HV-8-Infektionen bei einem Patienten zu verhindern oder zu verzögern, vor allem eines EBV-bedingten Lymphoms oder Karzinoms, einschließlich des Kaposi-Sarkoms, bei Patienten, einschließlich solcher Patienten, die eine Bluttransfusion hatten und solcher Patienten mit Immundefekt oder Immunschwäche, beispielsweise unter anderem AIDS-Patienten und Transplantationspatienten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen auf der Basis dieser neuartigen chemischen Verbindungen umfassen eine oder Mehrere der oben beschriebenen Verbindungen in einer therapeutisch aktiven Menge zum Behandeln einer viralen, im allgemeinen einer EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion, wahlweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoff, Trägerstoff oder Exzipienten.
Bestimmte der Verbindungen können in pharmazeutischer Dosisform auch als prophylaktische Wirkstoffe zum Hemmen des Wachstums oder der Replikation von EBV, VZV oder HV-8 verwendet werden. Diese sind insbesondere als Anti-EBV-, Anti-VZV- oder Anti-HV-8-Wirkstoffe geeignet. In bestimmten pharmazeutischen Dosisformen, beispielsweise in der Form eines Pro-Pharmakons, könnten ein acyliertes Nukleosid oder ein Nukleosid mit einem Phosphatester bevorzugt sein.
Ohne sich theoretisch zu beschränken, wird angenommen, dass die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung ihre hemmende Wirkung auf das Wachstum oder die Replikation von EBV, VZV oder HV-8 durch das Hemmen der viralen DNA-Polymerase oder durch Einbau von Nukleosiden in die virale DNA induzieren, was einen Kettenabbruch bewirkt. Es wird nicht erwartet, dass die vorliegenden Verbindungen und insbesondere das 5-Brom-L-Nukleosid-Analog der vorliegenden Erfindung ein antivirales Spektrum aufweisen, das sich von dem anderer, bislang in der Literatur veröffentlichter Nukleoside unterscheidet. Für die besondere antivirale Aktivität kann ein besonderer Mechanismus postuliert werden.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch Syntheseverfahren, die einem durchschnittlichen Fachmann bereits bekannt sind, hergestellt und umfassen diverse chemische Syntheseverfahren.
Kurze Beschreibung der Figuren
1, Schema 1, zeigt die chemische Synthese der Dioxolanyl-Zucker-Zwischenstufe 5 aus L-Gulono-γ-lacton 1.
2, Schema 2, zeigt die chemische Synthese einer anomeren Mischung aus dem acetylierten Dioxolanyl-Zucker-Derivat 10 aus 1,6-Anhydro-β-L-gulopyranose 4.
3, Schema 3, zeigt die chemische Synthese des 5-substituierten β-L-Dioxolanylnukleosidanalogs der vorliegenden Erfindung (11, 13, 15, 17, 19 und 21) aus dem Dioxolanyl-Zucker-Derivat 10 und der geschützten, 5-substituierten Uracilbase.
4 ist ein Schaubild, das die Dosis-Wirkungs-Kurve der beiden aktivsten Verbindungen in der Reihe gegen EBV zeigt, (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-bromuracil (β-L-Br-OddU) und (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-ioduracil (β-L-I-OddU).
5 ist ein Schaubild, das die erhaltenen pharmakokinetischen Daten für β-L-Br-OddU bei weiblichen BDF1-Mäusen zeigt.
6 ist ein Schaubild, das die erhaltenen pharmakokinetischen Daten für β-L-I-OddU bei weiblichen BDF1-Mäusen zeigt.
7 ist ein Schaubild, das die Dosis-Wirkung von β-L-I-OddU gegen HV-8 bei der DNA-Hybridisierung gegenüber DHPG zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden in der gesamten Patentschrift die folgenden Definitionen verwendet.
Der Begriff „Patient" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um ein Tier, vorzugsweise einen Menschen, zu beschreiben, der eine Behandlung, einschließlich eine prophylaktische Behandlung, mit den Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung erhält. Bei der Behandlung von solchen Infektionen, Leiden oder Krankheitszuständen, die spezifisch für ein bestimmtes Tier, wie beispielsweise einen menschlichen Patienten, sind, bezieht sich der Begriff Patient auf dieses spezifische Tier.
Der Begriff „Epstein-Barr-Virus" (EBV) wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um das Herpesvirus zu beschreiben, das in Zellkulturen des Burkitt-Lymphoms gefunden wurde. Strukturell ist EBV ähnlich wie andere Herpesviren – es besitzt ein doppelsträngiges DNA-Genom innerhalb eines Nukleokapsids, das von einer Lipidhülle umgeben ist, die virale Glykoproteine enthält. Ein Tegumentprotein besetzt den Raum zwischen der Hülle und dem Nukleokapsid. EBV ist das verursachende Agens der infektiösen Mononukleose. Epstein-Barr-Virus gilt auch als verursachendes Agens proliferativer B-Zellerkrankungen, des lymphoproliferativen Syndroms, des nicht familiären monophagozytären Syndroms und ist mit einer Reihe von Krankheitszuständen verknüpft, einschließlich einem seltenen progressiven, Mononukleose-ähnlichen Syndrom und oraler Haarleukoplakie bei AIDS-Patienten. EBV wurde auch mit bestimmten Arten von Krebs in Verbindung gebracht, beispielsweise dem Burkitt-Lymphom, Nasopharyngealkarzinom, der Hodgkins-Krankheit, dem EBV-assoziierten T-Zell-Lymphom und dem nasalen T-Zell-Lymphom. Bestimmte Patienten, vor allem solche mit unterdrücktem Immunsystem, wie beispielsweise AIDS-Patienten und Organtransplantationspatienten, die mit Immunsuppressiva behandelt werden, sind gegenüber EBV-Manifestationen, besonders der Entwicklung von EBV-assoziierten Lymphomen, besonders anfällig.
Der Begriff „Varizella-Zoster-Virus" (VZV) wird verwendet, um Herpesvirus varicella, auch bekannt als Windpocken oder Herpes Zoster, zu beschreiben. VZV ist ein Herpetovirus und morphologisch identisch mit dem Herpes-Simplex-Virus, das beim Menschen Varizellen (Windpocken) und Herpes Zoster hervorruft. Varizellen sind die Folge einer primären Infektion mit dem Virus. Herpes Zoster ist die Folge einer sekundären Invasion durch dasselbe Virus oder einer Reaktivierung der Infektion, welche in manchen Fällen für eine Anzahl von Jahren latent vorhanden gewesen sein kann.
Der Begriff „Herpes Virus 8" oder HV-8 wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um ein Herpetovirus zu beschreiben, von dem angenommen wird, dass es das verursachende Agens des Kaposi-Sarkoms bei AIDS-Patienten ist. Bei HV-8 und HHV-8 (Humanes Herpesvirus 8) handelt es sich um ein und dasselbe Virus.
Der Begriff „pharmazeutisch annehmbares Derivat" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um alle pharmazeutisch annehmbaren Salze oder Pro-Pharmakon-Formen (wie beispielsweise einen Ester, einen Phosphatester oder ein Salz eines Esters) einer Nukleosidverbindung zu beschreiben, welche, nach Verabreichung an den Patienten, die Nukleosidverbindung oder einen aktiven Metaboliten der Nukleosidverbindung direkt oder indirekt bereit stellen. Im Allgemeinen bilden die freie Nukleosidform oder die Acyl-Pro-Pharmakon-Formen der vorliegenden Erfindung aufgrund des Vorhandenseins einer Uracilbase nur schwer Salze. Die Mono-, Di- und Triphosphatformen der Nukleosidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung bilden jedoch Salze an der Phosphatgruppe. Zu den pharmazeutisch annehmbaren Salzen gehören solche, die aus pharmazeutisch annehmbaren, anorganischen oder organischen Basen und Säuren abgeleitet sind. Geeignete Salze umfassen solche, die aus Alkalimetallen, wie beispielsweise Kalium und Natrium, Erdalkalimetallen, wie beispielsweise Calcium, Magnesium, und Ammoniumsalze, sowie zahlreichen anderen Säuren, die aus dem Stand der pharmazeutischen Technik gut bekannt sind, abgeleitet sind.
Der Begriff „Acyl" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um eine Gruppe an Position 5' des Nukleosid-Analogs (d. h. an der freien Hydroxylposition in der Dioxolanyl-Gruppe) zu beschreiben, die eine lineare, verzweigte oder zyklische C₁-C₂₀-Alkylkette enthält. Die Acylgruppe an der 5'-Position ergibt in Kombination mit der 5'-Hydroxylgruppe einen Ester, der nach der Verabreichung gespalten werden kann, um die freie Nukleosidform der vorliegenden Erfindung herzustellen. Acylgruppen gemäß der vorliegenden Erfindung sind durch folgende Struktur wiedergegeben:
wobei R² unter anderem eine lineare, verzweigte oder zyklische C₁-C₂₀-Alkylkette, Alkoxyalkyl, Aryloxyalkyl, wie beispielsweise Phenoxymethyl, Aryl, Alkoxy ist. Bevorzugte Acylgruppen sind solche, bei denen R² C₁ bis C₃ ist. Acylgruppen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, unter Anderem, auch beispielsweise Benzoyl, substituiertes Benzoyl, wie beispielsweise 3-Chlorbenzoyl, Succinat, Mesylat, Caproyl, Capronsäure, Caprinsäure, Laurylsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure und Ölsäure. Ein durschnittlicher Fachmann kennt die Acylgruppen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, entweder, um die pharmazeutischen Zielverbindungen zu synthetisieren oder als Pro-Pharmakon der Nukleoside gemäß der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff „Phosphatester" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um Monophosphatgruppen an der 5'-Position der Dioxanyl-Gruppe zu beschreiben, die zweifach verestert sind, so dass die Phosphatgruppe neutral wird, d.h. eine neutrale Ladung hat. Phosphatester zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die durch die folgende Struktur dargestellt sind:
wobei R³ unter Anderem ausgewählt ist aus einer linearen, verzweigten oder zyklischen C₁-C₂₀-Alkylgruppe, Alkoxyalkyl, Aryloxyalkyl, wie beispielsweise Phenoxymethyl, Aryl und Alkoxy. Bevorzugte Monophosphatester zur Verwendung in Pro-Pharmakon-Formen gemäß der vorliegenden Erfindung sind solche, bei denen C₁ bis C₂₀ eine lineare oder verzweigtkettige Alkylgruppe, am meisten bevorzugt eine C₁- bis C₃-Alkylgruppe, ist. Phosphatester gemäß der vorliegenden Erfindung sind auch als „Phosphodiester"-Gruppen bekannt, wobei diese Begriffe als Synonyme verwendet werden.
Der Begriff „hemmende wirksame Konzentration" oder „hemmende wirksame Menge" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um Konzentrationen oder Mengen von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, welche das Wachstum oder die Replikation empfindlicher Viren, vor allem einschließlich EBV, VZV und HV-8, wesentlich oder signifikant hemmen.
Der Begriff „therapeutische, wirksame Menge" oder „therapeutisch wirksame Menge" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um Konzentrationen oder Mengen von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, die bei der Behandlung von EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen bei Menschen therapeutisch wirksam sind.
Der Begriff „verhindernde, wirksame Menge" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um Konzentrationen oder Mengen von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, die prophylaktisch wirksam sind, um die Manifestation von EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen oder verwandten Leiden (vor allem ein EBV-assoziiertes Karzinom oder Lymphom und Kaposi-Sarkom) bei Menschen zu verhindern oder zu verzögern.
Der Begriff „L-Konfiguration" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um die chemische Konfiguration der Dioxolan-Uridin-Nukleosidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu beschreiben. Die L-Konfiguration der Zuckergruppe von Verbindungen der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von der D-Konfiguration von Ribosezuckergruppen der meisten natürlich vorkommenden Nukleoside wie beispielsweise Cytidin, Adenosin, Thymidin, Guanosin und Uridin.
Der Begriff „enantiomerisch angereichert" wird in der gesamten Patentschrift verwendet, um ein Nukleosid zu beschreiben, das mindestens etwa 95%, vorzugsweise mindestens etwa 96%, mehr bevorzugt mindestens etwa 97%, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 98% und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 99% oder mehr eines einzelnen Enantiomers dieses Nukleosids enthält. Wenn in dieser Patentschrift auf ein L-Nukleosid Bezug genommen wird, wird vorausgesetzt, dass das Nukleosid ein enantiomerisch angereichertes Nukleosid ist, es sei denn, es ist anders angegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die überraschende Entdeckung, dass die β-L-Dioxanyl-Uridin-Nukleosid-Analoga, die eine Dioxanylgruppe mit einer L-Konfiguration (im Gegensatz zu der natürlich vorkommenden D-Konfiguration) enthalten, eine unerwartet starke Aktivität gegen Epstein-Barr-Virus (EBV), Varizella-Zoster-Virus (VZV) und das Kaposi-Sarkom-Virus (auch bekannt als Herpesvirus-8 oder HV-8) aufweisen. Insbesondere zeigen die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung wirksame Hemmung der Replikation des Virus in Kombination mit sehr geringer Toxizität gegenüber den Wirtszellen (d. h. tierisches oder menschliches Gewebe).
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die unerwartete Entdeckung, dass die Verbindungen (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)- 1,3-dioxanyl-4-yl]-5-bromuracil (β-L-Br-OddU) und (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-ioduracil (β-L-I-OddU) extrem wirksame Anti-EBV-Wirkstoffe mit relativ geringer Toxizität sind, vor allem im Vergleich zu verwandten D-Nukleosid-Analoga, von denen gezeigt worden ist, dass sie Anti-EBV-Aktivität aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Gruppe von Verbindungen nach der Struktur:
wobei R Cl oder Br ist; und
R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acyl- oder Ethergruppe, eine Phosphat-, eine Diphosphat-, Triphosphat- oder Phosphodiestergruppe ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Hemmen des Wachstums oder der Replikation von Epstein-Barr-Virus (EBV), Varizella-Zoster-Virus (VZV) oder dem Kaposi-Sarkom-Virus (HV-8), umfassend das Aussetzen des Virus einer hemmend wirksamen Konzentration einer Verbindung nach der Struktur:
wobei R H, F, Cl, Br, I, CH₃ oder CF3 ist und
R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acyl- oder Ethergruppe, eine Phosphat-, Diphosphat-, Triphosphat- oder Phosphodiestergruppe ist.
In diesem Verwendungsaspekt der vorliegenden Erfindung ist R vorzugsweise Br oder I und R¹ ist am meisten bevorzugt H.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, der an einer durch das Epstein-Barr-Virus, das Varizella-Zoster-Virus oder das Kaposi-Sarkom-Virus verursachten Infektion leidet, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Konzentration oder Menge einer Verbindung nach folgender Struktur an den Patienten:
wobei R H, F, Cl, Br, I, CH₃ oder CF₃ ist und
R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acyl- oder Ethergruppe, eine Phosphat-, Diphosphat-, Triphosphat- oder Phosphodiestergruppe ist.
In diesem Verwendungsaspekt der vorliegenden Erfindung ist R vorzugsweise Br oder I, am meisten bevorzugt I, wenn die Infektion eine EBV-Infektion ist, am meisten bevorzugt Br, wenn die Infektion eine VZV-Infektion ist, und R¹ ist am meisten bevorzugt H.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind hauptsächlich aufgrund ihrer Anti-EBV-, Anti-VZV- und Anti-HV-8-Aktivität nützlich. Die vorliegenden Erfindungen können auch aufgrund anderer antiviraler Aktivität nützlich sein. Darüber hinaus könnten diese Zusammensetzungen Verwendung als Zwischenstufen bei der chemischen Synthese anderer Nukleoside oder Nukleotidanaloga finden, die wiederum als therapeutische Wirkstoffe oder für andere Zwecke nützlich sind, einschließlich ihrer Verwendung bei biologischen Tests oder als biologische Sonden. Vorzugsweise finden diese Verbindungen Anwendung als neuartige Anti-EBV-, Anti-VZV- und Anti-HV-8-Wirkstoffe.
Im allgemeinen umfassen die am meisten bevorzugten antiviralen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung solche, die gegenüber den Wirtszellen weniger toxisch und gegenüber dem Zielvirus aktiver sind. Bestimmte dieser Verbindungen können in pharmazeutischer Dosisform als prophylaktische Wirkstoffe verwendet werden. Diese könnten besonders als Anti-EBV-, Anti-VZV- und Anti-HV-8-Wirkstoffe geeignet sein. Aufgrund ihrer sehr geringen Toxizität in dem Patienten und ihrer hervorragenden, antiviralen Aktivität sind β-L-Br-OddU und β-L-I-OddU besonders wirksame, antiprophylaktische Verbindungen zum Behandeln und/oder Verhindern von EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch Syntheseverfahren hergestellt, die einem durchschnittlichen Fachmann bereits bekannt sind und verschiedene chemische Syntheseverfahren beinhalten, wie sie in wesentlich mehr Einzelheiten in den folgenden Beispielen ausgeführt sind. Im Allgemeinen werden die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert, indem eine zuvor synthetisierte Nukleosidbase an das entsprechende Dioxolanylsynthon kondensiert wird, woraus schließlich ein Nukleosid-Analog mit der gewünschten L-Konfiguration ent steht. In bestimmten Fällen kann der Syntheseweg für ein bestimmtes Nukleosid-Analog von dem allgemeinen Syntheseweg abweichen.
Bei der chemischen Synthese der verschiedenen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein durchschnittlicher Fachmann in der Lage, die vorliegende Erfindung ohne unnötige Versuche anzuwenden. Insbesondere kennt ein durchschnittlicher Fachmann die verschiedenen Schritte, die durchgeführt werden sollten, um einen bestimmten Substituenten an der gewünschten Position der Base oder einen Substituenten an der gewünschten Position der Zuckergruppe einzuführen. Darüber hinaus werden die chemischen Schritte, die unternommen werden, um funktionelle Gruppen, wie beispielsweise unter anderem Hydroxyl- oder Aminogruppen, zu schützen, sowie um die Schutzgruppen von denselben funktionellen Gruppen wieder zu entfernen, als je nach den Umständen der Synthesen geeignet erkannt. In der vorliegenden Erfindung kann eine große Anzahl von Schutzgruppen verwendet werden. Im Falle der Einführung einer oder mehrerer Acylgruppen an der 5'-Position (oder der Uracilbase) des Nukleosids können Standardtechniken, die einem durchschnittlichen Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden. Auch die 5'-Mono-, Di- oder Triphosphate oder Diester der Phosphate (als neutrale Pro-Pharmakon-Formen) können durch aus dem Stand der Technik gut bekannte Verfahren synthetisiert werden.
Im allgemeinen läuft die Synthese der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung ab, indem zuerst das entsprechende Dioxolanylsynthon synthetisiert und dann die substituierte Base an das Dioxolanylsynthon kondensiert wird. Ein geeigneter Syntheseansatz für das Synthetisieren der vorliegenden Erfindung ist in den beiliegenden Schemata 1–3 dargestellt und ist allgemein in den Beispielen beschrieben.
Zum Synthetisieren der vorliegenden Verbindungen können auch verschiedene gleichwertige Syntheseansätze verwendet werden.
Der therapeutische Aspekt betrifft Verfahren zum Behandeln von EBV-, VZV- oder HV-8-Infektionen bei Patienten, umfassend das Verabreichen antiviraler, wirksamer Mengen der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, um das Wachstum oder die Replikation der Viren in dem zu behandelnden Patienten zu hemmen.
Die vorliegenden Verbindungen werden verwendet, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, die wirksam sind, um die Manifestation eines EBV-bedingten Lymphoms oder Karzinoms oder des Kaposi-Sarkoms bei Patienten zu verhindern oder zu verzögern, einschließlich solcher Patienten, die eine Bluttransfusion erhalten haben und solcher Patienten, die einen Immundefekt oder eine Immunschwäche haben, beispielsweise unter anderem AIDS-Patienten und Transplantationspatienten. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer prophylaktisch wirksamen Menge (welche im allgemeinen einer therapeutisch wirksamen Menge entspricht) einer oder mehrerer der Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung an den Patienten, um eine EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion zu verzögern oder zu verhindern.
Auf diesen neuartigen, chemischen Verbindungen beruhende pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen die oben beschrieben Verbindungen in einer therapeutisch wirksamen Menge zum Behandeln einer viralen, besonders einer EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion, wahlweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoff, Trägerstoff oder Exzipienten. Ein durchschnittlicher Fachmann weiß, dass eine therapeutisch wirksame Menge je nach der zu behandelnden Infektion oder dem zu behandelnden Leiden, deren Schweregrad, dem anzuwendenden Behandlungsregime, der Pharmakokinetik des verwendeten Wirkstoffes sowie dem zu behandelnden Patienten (Tier oder Mensch) variiert.
Im allgemeinen ist es bevorzugt, die pharmazeutische Zusammensetzung in oral verabreichbarer Form zu verabreichen, aber bestimmte Formulierungen können über einen parenteralen, intravenösen, intramuskulären, transdermalen, bukkalen, subkutanen Weg oder als Zäpfchen gegeben werden. Intravenöse und intramuskuläre Formulierungen werden bevorzugt in steriler Salzlösung verabreicht. Natürlich kann ein durchschnittlicher Fachmann die Formulierungen im Rahmen der Lehre der Patentschrift modifizieren, um zahlreiche Formulierungen für einen bestimmten Verabreichungsweg bereit zu stellen, ohne die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung instabil zu machen oder ihre therapeutische Aktivität zu beeinträchtigen. Insbesondere können die Modifikationen der vorliegenden Verbindungen, damit sie sich in Wasser oder einem anderen Vehikel besser lösen, beispielsweise leicht durch kleinere Modifikationen (Salzformulierung, Veresterung, etc.) erreicht werden, die einem durchschnittlichen Fachmann gut bekannt sind. Ein Fachmann ist auch in der Lage, den Verabreichungsweg und das Dosisregime einer bestimmten Verbindung zu modifizieren, um die Pharmakokinetik der vorliegenden Verbindungen für den größten Nutzeffekt bei Patienten zu regeln.
In bestimmten pharmazeutischen Dosisformen ist die Pro-Pharmakon-Form der Verbindungen, vor allem einschließlich acylierter (acetylierter oder anderer) Derivate und Etherderivate, Pyridinester, Phosphatester und verschiedener Salzformen der vorliegenden Verbindungen, bevorzugt. Ein durchschnittlicher Fachmann weiß, wie die vorliegenden Verbindungen leicht zu Pro-Pharmakon-Formen modifiziert werden können, um den Transport der aktiven Verbindungen zu der Zielstelle im Wirt, Organismus oder Patienten zu ermöglichen. Gegebenenfalls nutzt der Fachmann darüber hinaus günstige pharmakokinetische Parameter der Pro-Pharmakon-Formen beim Transport der vorliegenden Verbindungen zu einem Zielort innerhalb des Wirtsorganismus oder Patienten, um den geplanten Effekt der Verbindung zu maximieren.
Die Menge der in den therapeutisch aktiven Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthaltenen Verbindung ist eine wirksame Menge zum Behandeln der Infektion oder des Leidens, in bevorzugten Ausführungsformen einer EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion. Im Allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame Menge der vorliegenden Verbindung in einer pharmazeutischen Dosisform im Bereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg oder mehr, bevorzugter bei etwas weniger als etwa 1 mg/kg bis etwa 25 mg/kg des Patienten, oder bei erheblich mehr, je nach verwendeter Verbindung, behandeltem Leiden oder behandelter Infektion und Verabreichungsweg. Im Falle von EBV-, VZV- oder HV-8-Infektionen, die mit β-L-Br-OddU oder β-L-I-OddU behandelt werden, wird die Verbindung bevorzugt in Mengen im Bereich von etwa 1 mg/kg bis etwa 25 mg/kg des Patienten verabreicht, je nach Pharmakokinetik des Wirkstoffes in dem Patienten. Dieser Dosisbereich liefert im Allgemeinen wirksame Blutspiegelkonzentrationen des aktiven Wirkstoffes, die von etwa 0,05 bis etwa 100 Mikrogramm/ml Blut des Patienten reichen können. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung fällt eine prophylaktische oder präventive, wirksame Menge der Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung in denselben Konzentrationsbereich, wie oben für eine therapeutisch aktive Menge ausgeführt, und ist in der Regel dieselbe wie die therapeutisch aktive Menge.
Die Verabreichung der aktiven Verbindung kann von kontinuierlich (intravenöser Tropf) bis zu mehreren oralen Gaben pro Tag (beispielsweise q. i. d.) reichen und, abgesehen von anderen Verabreichungswegen, eine orale, topische, parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, transdermale (welche ein Mittel zur Verstärkung der Penetration umfassen kann), bukkale Verabreichung und die Verabreichung als Zäpfchen umfassen. Orale Tabletten mit magensaftresistenter Beschichtung können ebenfalls verwendet werden, um die Bioverfügbarkeit der Verbindungen bei einem oralen Verabreichungsweg zu verstärken.
Um die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird vorzugsweise eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung nach üblichen pharmazeutischen Mischungstechniken gründlich mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff gemischt, um eine Dosis herzustellen. Ein Trägerstoff kann viele verschiedene Formen annehmen, je nach der Form des Präparats, das für die Verabreichung gewünscht wird, z.B. oral oder parenteral. Bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen in oraler Dosisform kann jedes der üblichen pharmazeutischen Medien verwendet werden. Für flüssige, orale Präparate, wie beispielsweise Suspensionen, Elixiere und Lösungen, können geeignete Trägerstoffe und Zusatzstoffe, einschließlich Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Farbstoffe und dergleichen, verwendet werden. Für feste, orale Präparate, wie beispielsweise Pulver, Tabletten, Kapseln, und für feste Präparate wie Zäpfchen können geeignete Trägerstoffe und Zusatzstoffe, einschließlich Stärken, Zuckerträgerstoffe, wie beispielsweise Dextrose, Mannitol, Laktose und verwandte Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Granulationsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Zerfallsbeschleuniger und dergleichen, verwendet werden. Falls gewünscht, können die Tabletten oder Kapseln durch Standardtechniken magensaftresistent beschichtet oder als Retardformen hergestellt werden. Die Verwendung dieser Dosisformen kann die Bioverfügbarkeit der Verbindungen im Patienten signifikant beeinflussen.
Bei den parenteralen Formulierungen umfasst der Trägerstoff in der Regel steriles Wasser oder wässrige Natriumchloridlösung, obwohl auch andere Inhaltsstoffe, einschließlich solcher, die eine Dispersion unterstützen, enthalten sein können. Wenn steriles Wasser verwendet wird und steril bleiben soll, müssen die Zusammensetzungen und Trägerstoffe natürlich ebenfalls sterilisiert sein. Es können auch injizierbare Lösungen hergestellt werden, in welchem Fall geeignete flüssige Trägerstoffe, Suspensionsmittel und dergleichen angewandt werden können.
Mit den üblichen Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Trägerstoffe können auch liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die zielgerichtet virale Antigene angreifen) hergestellt werden. Dies kann für den Transport freier Nukleosid-, Acylnukleosid- oder Phosphatester-Pro-Pharmakon-Formen der Nukleosidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sein.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen und Zusammensetzungen verwendet, um virale Infektionen von Säugetieren und insbesondere EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen bei Menschen zu behandeln, zu verhindern oder deren Manifestation zu verzögern. In ihren bevorzugten Ausführungsformen werden die Verbindungen verwendet, um EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen, einschließlich vor allem chronische EBV-Infektionen, zu behandeln. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen in Mengen in Bereich von etwa 250 Mikrogramm bis zu etwa 500 mg oder mehr mindestens einmal täglich, vorzugsweise bis zu viermal täglich, in oraler Dosisform verabreicht, um EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen zu behandeln, zu verhindern oder deren Manifestation zu verzögern. Die vorliegenden Verbindungen werden vorzugsweise oral verabreicht, können aber auch parenteral, topisch oder als Zäpfchen gegeben werden.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können aufgrund ihrer geringen Toxizität gegenüber Wirtszellen vorteilhafterweise prophylaktisch eingesetzt werden, um eine EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion zu verhindern oder das Auftreten klinischer Symptome in Zusammenhang mit der viralen Infektion zu verhindern. Die vorliegende Erfindung umfasst daher außerdem Verfahren für die prophylaktische Behandlung viraler Infektionen und insbesondere von EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen. In diesem Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung werden die vorliegenden Zusammensetzungen verwendet, um die Manifestation einer EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion oder von EBV-, VZV- oder HV-8-bedingten Erkrankungen, wie beispielsweise von Lymphomen oder Karzinomen, einschließlich dem Kaposi-Sarkom, bei Patienten zu verhindern oder zu verzögern, einschließlich solcher Patienten, die eine Bluttransfusion erhalten haben und solcher Patienten, die einen Immundefekt oder eine Immunschwäche haben, wie beispielsweise unter anderem AIDS-Patienten und Transplantationspatienten. Dieses prophylaktische Verfahren umfasst das Verabreichen einer Menge einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, die wirksam ist, um die Manifestation der viralen Infektion zu lindern, zu verhindern oder zu verzögern, an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt oder für den ein Risiko zur Entwicklung von EBV-, VZV- oder HV-8-bedingten Symptomen oder -Erkrankungen besteht. Bei der prophylaktischen Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, dass die verwendete, antivirale Verbindung eine geringe Toxizität besitzen sollte und vorzugsweise gegenüber dem Patienten nicht toxisch sein sollte. In diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist besonders bevorzugt, dass die verwendete Verbindung gegen das Virus maximal wirksam und gegenüber dem Patienten minimal toxisch ist. Im Falle von β-L-Br-OddU und β-L-I-OddU, mehr bevorzugt, im Falle von EBV, β-L-I-OddU, mehr bevorzugt, im Falle von VZV, β-L-Br-OddU, können diese Verbindungen für die therapeutische Behandlung im selben Dosisbereich (d. h. etwa 250 Mikrogramm bis etwa 500 mg oder mehr zwischen ein- und viermal pro Tag bei einer oralen Dosisform) wie ein prophylaktischer Wirkstoff zur Verhinderung der Proliferation von EBV, VZV oder HV-8 oder alternativ zur Hinauszögerung der Manifestation einer EBV-, VZV- oder HV-8-Infektion, welche sich in klinischen Symptomen manifestiert, verabreicht werden.
Darüber hinaus können Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung alleine oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden, vor allem einschließlich anderer Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Bestimmte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können wirksam sein, um die biologische Aktivität bestimmter Wirkstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung zu verstärken, indem sie den Metabolismus oder die Inaktivierung anderer Verbindungen verringern und als solche gleichzeitig verabreicht werden, um diesen beabsichtigten Effekt hervorzurufen.
In einer besonders bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von EBV-, VZV- und HV-8-Infektionen wird einem Patienten, der an einer solchen Infektion leidet, eine hemmend wirksame Menge von β-L-Br-OddU und β-L-I-OddU verabreicht, um die Infektion zu behandeln und die Symptome einer solchen Infektion zu lindern.
In einer besonders bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von EBV-Infektionen wird einem Patienten, der an einer EBV-Infektion leidet, eine hemmend wirksame Menge von β-L-I-OddU verabreicht, um die Infektion zu hemmen und die Symptome einer solchen Infektion zu lindern.
In einer besonders bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von VZV-Infektionen wird einem Patienten, der an einer VZV-Infektion leidet, eine hemmend wirksame Menge von β-L-Br-OddU verabreicht, um die Infektion zu hemmen und die Symptome einer solchen Infektion zu lindern.
Ohne theoretische Einschränkung wird angenommen, dass die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung ihre hemmende Wirkung primär auf das Wachstum oder die Replikation des Virus ausüben, indem sie die virale DNA-Polymerase hemmen oder indem die Nukleosidverbindungen in die virale DNA eingebaut werden, was einen Kettenabbruch verursacht.
Die vorliegende Erfindung wird nun, lediglich zur Illustrationszwecken, durch folgende Beispiele beschrieben.
BEISPIELE
Synthese von L-Dioxolanyl-Pyrimidin-Nukleosiden
Im Allgemeinen werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß den hiernach beschriebenen, chemischen Syntheseverfahren synthetisiert. Die chemischen Syntheseverfahren, die zur Synthese der vorliegenden Verbindungen angewandt werden, stellen Modifikationen von aus der Literatur bekannten Verfahrensweisen dar. Die Literaturstellen, aus denen eine verwandte, chemische Reaktion modifiziert worden ist, um die vorliegenden Verbindungen herzustellen, sind in den Beispielen unten aufgeführt.
Die Schmelzpunkte wurden mit einer Mel-temp-II-Laborvorrichtung bestimmt und sind nicht berichtigt. Die NMR-Spektren wurden auf einem Fouriertransformationsspektrometer Bruker 250 oder Bruker 400 aufgezeichnet; chemische Verschiebungen sind in Teilen pro Million (δ) dokumentiert und Signale als s (Singulett), d (Duplett), t (Triplett), q (Quartet), m (Multiplett) und dd (Duplett eines Dupletts) wiedergegeben. Die UV-Spektren wurden mit einem DU-7-Spektrophotometer von Beckmann bestimmt. Die optischen Drehungen wurden mit einem Digitalpolarimeter DIP-370 von JASCO gemessen. DC wurde auf Uniplates (Kieselgelplatten) von Analtech Co. durchgeführt. Elementaranalysen wurden von Atlantic Microlab, Inc., Norcross, GA, durchgeführt. Trockenes 1,2-Dichlorethan, Dichlormethan, Acetonitril, Benzol und Pyridin wurden vor der Verwendung durch Destillation über CaH₂ erhalten. Trockene THF wurde durch Destillation über Na und Benzophenon erhalten, wenn die Lösung eine violette Farbe annahm.
Synthese von 2,3,5,6-Diisopropyliden-L-gulono-γ-lacton (2)
In eine dreihalsige 5 l-Flasche mit einem mechanischen Rührer wurden nacheinander L-Gulono-γ-lacton 1 (100 g, 0,56 mol), wasserfreies Kupfersulfat (279 g) und wasserfreies Aceton (2,5 l, getrocknet über molekularen 4 Å-Molekularsieben) gegeben. Nach dem Beginn des Rührens wurde conc. H₂SO₄ (10 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 Std. lang unter N₂-Atmosphäre gerührt. Die Mischung wurde mit festem Na₂CO₃ neutralisiert und filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockenheit eingeengt und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ (300 ml × 3) und H₂O (300 ml) verteilt. Die kombinierte organische Schicht wurde mit H₂O (300 ml) und gesättigtem Na₂CO₃ (250 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet. Nach Filtration und Einengung bis zur Konsistenz eines Sirups wurde CH₂Cl₂ (200 ml) zugegeben, um den Rückstand aufzulösen, und dann wurde Hexan zugegeben, bis die Lösung eintrübte. Der Feststoff wurde filtriert und mit Hexan gewaschen. Drei Anteile wurden kombiniert und im Vakuum getrocknet. Insgesamt wurden 101,84 g von Produkt 2 erhalten (70,3%, R_f = 0,77 CHCl₃/MeOH, 10 : 1).
Synthese von 2,3,5,6-Diisopropyliden-L-gulono-γ-lactol (3)
In eine dreihalsige 3 l-Flasche, die in einem Ofen getrocknet und dann mit Stickstoff gespült wurde, wurden wasserfreie THF (1 l) und das geschützte Lacton 2 (101,48 g, 0,39 mol) gegeben. Die Lösung wurde gerührt und in einem Trockeneis-Aceton-Eisbad gekühlt. Nachdem die Temperatur der Lösung auf –78°C gefallen war, wurde DIBAL-H (500 ml, 1 M in Hexan) über einen Tropftrichter unter N₂-Atmosphäre tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde 2 Std. lang gerührt, dann wurde Methanol (140 ml) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Es bildete sich ein großer, weißer Klumpen. Es wurde gesättigte Kaliumnatriumtartratlösung zugegeben, bis der Feststoff verschwunden war. Die organische Schicht wurde getrennt, die Wasserschicht mit EtOAc (300 ml × 2) extrahiert. Die kombinierte organische Schicht wurde mit H₂O (400 ml), gesättigtem NaHCO₃ (250 ml) und Sole (250 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Filtration ergab sich nach Verdampfung des Lösungsmittels unter verringertem Druck ein weißer Feststoff, der über eine Säule (Kieselgel, CH₃OH/CH₂Cl₂, 5–10%) gereinigt wurde, um das Produkt 3 zu ergeben (95,05 g, 93%, R_f = 0,64 CH₃OH/CHCl₃, 1 : 10).
1,6-Anhydro-β-L-gulopyranose (4)
In eine 2 l-Flasche wurden Lactol 3 (95 g, 0,36 mol) und 0,5 N HCl (950 ml, 0,47 mol) gegeben. Die Lösung wurde unter Rückfluss 24 Std. lang gerührt, dann wurde die Mischung gekühlt und mit Dowex-2-Harz (HCO₃-Form) auf pH = 6 neutralisiert, wobei das erzeugte CO₂ mittels Luftdurchperlen entfernt wurde. Die Mischung wurde filtriert und das Harz gründlich mit H₂O (1000 ml) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden unter verringertem Druck bis zur Trockenheit eingeengt und der resultierende Rückstand wurde gemeinsam mit absolutem Alkohol eingedampft, bis sich ein Schaumfeststoff bildete. Der Feststoff wurde über eine Säule (Kieselgel, CH₃OH/CH₂Cl₂, 10–25%) gereinigt, wobei ein leicht gelber Feststoff erhalten wurde, der aus absolutem Ethanol rekristallisiert wurde, um einen farblosen Feststoff 4 zu erhalten (25,2 g, 42,2%, R_f = 0,62 CH₃OH/CHCl₃, 1 : 3, m. p. 142–145°C). Ein anderes Produkt, L-Gulose (R_f = 0,25 CH₃OH/CHCl₃) wurde mit 50% CH₃OH-CH₂Cl₃ aus der Säule gewaschen und zu einem schwarzen Rückstand eingeengt, der unter denselben Reaktionsbedingungen wiederverwendet wurde, um 4 (13,5 g, 22,6%) zu erhalten. Der Gesamtertrag beträgt 64,8%. ¹HNMR (DMSO-d6): δ 3,22–3,68 (m, 4H, H-2, -3, -4 und -6a), 3,83 (d, J_6b,6a = 7,25 Hz, 1H, H-6b), 4,22 (pseudo t, J_5,6a = 4,61 und 4,18 Hz, 1H, H-5), 4,46 (d, J_2OH·2 = 6,59 Hz, 1H, 2-OH austauschbar mit D₂O), 4,62 (d, J_3OH·3 = 5,28 Hz, 1H, 3-OH austauschbar mit D₂O), 5,07 (d, J_4-OH,4 = 4,84 Hz, 1H, 4-OH austauschbar mit D₂O), 5,20 (d, J_1,2 = 2,19 Hz, 1H, H-1).
(1'S,2S,4S)-4-[(1,2-Dihydroxy-1,2-O-isopropyliden)ethyl]-2-(hydroxymethyl)dioxolan (6)
Eine Lösung von NaIO₄ (5,5 g, 25,7 mmol, 1,4 Äquiv.) in H₂O (70 ml) wurde 10 Minuten lang bei 0°C über einen Tropftrichter tropfenweise einer Lösung von 4 (3 g, 18,5 mmol) in MeOH (100 ml) zugegeben, und die Mischung wurde mechanisch 15 Min. lang gerührt. Es wurde NaBH₄ (2,1 g, 56 mmol) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde für weitere 10 Min. gerührt. Der weiße Feststoff wurde abfiltriert, und der Feststoff wurde mit MeOH (100 ml) gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde mit 0,5 N HCl bei 0°C neutralisiert, dann bis zur Trockenheit eingeengt und der Rückstand wurde gemeinsam mit absolutem Alkohol (20 ml × 5) eingedampft und weiter im Vakuum über Nacht getrocknet. Um den Rückstand aufzulösen, wurde MeOH (100 ml) zugegeben, der weiße Feststoff abfiltriert, das Filtrat wurde bis zur Trockenheit eingeengt, und dann wurden Trockenaceton (300 ml), p-TsOH·H₂O (4 g) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Std. lang gerührt, dann mit Et₃N neutralisiert, filtriert und zur Konsistenz eines Sirups eingeengt, der über eine Säule (Kieselgel, EtOAc-Hexan, 1 : 1) gereinigt wurde, um 6 (1,6 g, 42%, R_f = 0,71 EtOAc/Hx, 2 : 1) als farbloses Öl zu erhalten.
¹HNMR (DMSO-d6): δ 1,25 und 1,31 (2s, 2 × 3H, Isopropyliden), 3–39 (dd, J_CH2OH,OH = 3,86 Hz, J_CH2OH,OH = 6,09 Hz, 2H, -CH₂OH), 3,61–4,10 (m, 6H, H-4, -5, -1' und -2'), 4,82 (t, J_H2,CH2OH = 3,87 Hz, 1H, H-2), 4,90 (t, J_OH,CH2OH = 6,09 Hz, 1H, -OH, austauschbar mit D₂O).
(1'S,2S,4S)-4-[(1,2-Dihydroxy-1,2-O-isopropyliden)ethyl]-2-(benzoyloxy)dioxolan (7)
Benzoylchlorid (4,4 ml, 37,5 mmol) wurde bei 0°C unter N₂-Atmosphäre über eine Spritze tropfenweise einer Lösung von 6 (5,7 g, 28 mmol) in Pyridin-CH₂Cl₂ (1 : 2,80 ml) zugegeben. Die Temperatur wurde auf Raumtemperatur angehoben. Nach zweistündigem Rühren zeigte DC an, dass die Reaktion abgeschlossen war, und die Reaktion wurde mit MeOH (10 ml) gestoppt. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit eingeengt, der resultierende Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (300 ml) gelöst und mit H₂O (100 ml × 2), Sole (100 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, um einen gelben Sirup zu erhalten, der durch Kieselgel-Säulenchromatographie (EtOAc/Hx, 5–20%) gereinigt wurde, um 7 als farbloses Öl zu erhalten (7,39 g, 86%, R_f = 0,48, EtOAc/Hx, 1 : 3).
¹HNMR (CDCl₃): δ 1,35 und 1,44 (2s, 2 × 3H, Isopropyliden), 3,77–4,51 (m, 8H, H-4, H-5, H-1', CH₂OBz), 5,29 (t, J = 3,78 Hz, 1H, H-2), 7,40–7,60, 8,05–8,09 (m, 3H, 2H, OBz).
(1'S,2S,4S)-4-(1,2-Dihydroxyethyl)-2-[(benzoyloxy)methyl]dioxolan (8)
Zu einer gerührten Lösung von 7 (13,62 g, 45 mmol) in MeOH (30 ml) wurde p-TsOH (1,3 g, 6 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 2 Std. lang gerührt. DC zeigte, dass die Reaktion unvollständig war. Die Lösungsmittel wurden bis auf das halbe Volumen eingedampft, es wurden MeOH (50 ml) und p-TsOH (0,65 g) zugegeben. Nach weiterem einstündigem Rühren wurde die Reaktionsmischung mit Et₃N neutralisiert uns bis zur Trockenheit eingedampft. Der Feststoff wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie (EtOAc/Hx, 10–15%) gereinigt, um 8 als farbloses Öl zu erhalten (9,8 g, 83%, R_f = 0,31, EtOAc/Hx, 2 : 1).
¹HNMR (DMSO-d6): δ 3,43 (m, 2H, H-2'), 3,67–4,1 (m, 4H, H-4, -5, -1'), 4,32 (d, J = 3,73 Hz, 2H, CH₂OBz), 4,60 (t, J = 5,72 Hz, 2'-OH, austauschbar mit D₂O), 5,23 (t, J = 3,96 Hz, 1H, H-2), 7,45–7,7, 7,93–8,04 (m, 3H, 2H, OBz).
(2S,4S)- und (2S,4R)-4-Acetoxy-2-[(benzoyloxy)methyl]dioxolan (10)
Eine Lösung von NaIO₄ (10,2 g, 48 mmol) in H₂O (120 ml) wurde über einen Tropftrichter tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 8 (3,1 g, 11,0 mmol) in CCl₄/CH₃CN (1 : 1, 160 ml) gegeben. Dann wurde RuO₂H₂O (0,03 g) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Std. lang gerührt. DC zeigte an, dass die Reaktion abgeschlossen war. Der Feststoff wurde über ein Celite-Kissen abfiltriert. Das Filtrat wurde bis auf 1/3 Volumen eingedampft, dann wurde CH₂Cl₂ (150 ml) zugegeben, die organische Schicht wurde abgetrennt und die Wasserschicht wurde mit CH₂Cl₂ (50 ml × 3) extrahiert. Die kombinierte organische Schicht wurde mit Sole (100 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, über ein Celite-Kissen filtriert, dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Sirup wurde zusammen mit Trocken-THF (20 ml × 5) eingedampft, dann im Vakuum über Nacht weiter getrocknet, um 9 im Rohzustand (2,9 g) zu erhalten.
Verbindung 9 im Rohzustand wurde in Trocken-THF (60 ml) gelöst, dann wurden unter N2-Atmosphäre Pb(OAc)₄ (5,48 g, 12,4 mmol) und Pyridin (0,83 ml, 10,3 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung 1 Std. lang gerührt wurde, zeigte DC an, dass die Reaktion abgeschlossen war. Der Feststoff wurde über ein Celite-Kissen abfiltriert und mit EtOAc (100 ml) gewaschen. Die kombinierte organische Schicht wurde bis zur Trockenheit eingedampft, dann durch Kieselgel-Säulenchromatographie (EtOAc/Hx, 30–50%) gereinigt, um eine anomere Mischung von 1 0 als farbloses Öl zu erhalten (1,93 g, 63%, R_f = 0,64 und 0,54, Hexan/EtOAc, 2 : 1).
¹HNMR (CDCl₃): δ 1,998, 2,11 (2s, 3H, OAc), 3,93, 4,33 (m, 2H, H-5), 4,43, 4,48 (2d, J = 3,73, 3,74 Hz, 2H, CH₂OBz), 5,46, 5,55 (2t, J = 4,18, 3,63 Hz, 1H, H-2), 6,42 (m, 1H, H-4), 7,33–7,59, 8,00–8,15 (m, 3H, 2H, OBz).
(2S,4S)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]uracil (11) und (2S,4R)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]uracil (12)
Eine Mischung aus Uracil (0,63 g, 5,6 mmol) und HMDS (25 ml), (NH₄)₂SO₄ (5 mg) wurde 5 Std. lang unter N₂-Atmosphäre unter Rückfluss erhitzt. Die resultierende, klare Lösung wurde im Vakuum unter wasserfreien Bedingungen eingeengt, um ein Öl (silyliertes Uracil) zu erhalten, das in trockenem DCE (10 ml) gelöst wurde. Unter N₂-Atmosphäre wurde Dioxalanacetat 10 (1 g, 3,7 mmol) zugegeben, dann wurde TMSOTf (1,4 ml) zugegeben. Die Mischung wurde 2 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt und dann durch Zugabe von gesättigtem NaHCO₃ (aq.) (10 ml) gestoppt. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 30 Minuten gerührt. Die Mischung wurde mit H₂O (50 ml) und CH₂Cl₂ (100 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, die Wasserschicht wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert (80 ml × 3). Die vereinte organische Schicht wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (aq.) (150 ml), H₂O (100 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Filtration, Eindampfen des Lösungsmittels ergaben einen weißen Feststoff (0,936 g, Ertrag: 81%). Die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur 24 Std. lang mit methanolischem Ammoniak behandelt, dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH/CHCl₃ als Eluent gereinigt, um das β-Isomer 11, dann das α-Isomer 12 und eine nicht getrennte Mischung beider Isomere zu erhalten.
β-Isomer 11: R_f = 0,31 (MeOH/CHCl₃, 3 : 10). UV (H20): (pH 7) 261,0 nm (ε 10432), (pH 11) 260,5 nm (ε 7931), (pH 2) 261,0 nm (ε 10651) [(α]_D ²⁵ = E 20,93 (c 0,33, MeOH), ¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,32 (s, NH), 7,80 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,19 (d, J = 4,95 Hz, 1H, H-4'), 5,61 (d, J = 7,98 Hz, 1H, H-5), 5,18 (t, 1H, OH, austauschbar mit D₂O), 4,90 (t, J = 2,75 Hz, 1H, H-2'), 4,02–4,05 (m, 2H, H-5'), 3,62 (d, J = 2,75 Hz, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₈H₁₀O₅N₂: C, 44,86; H, 4,67; N, 13,08. Gefunden: C, 44,94; H, 4,78; N, 13,02.
α-Isomer 12: R_f = 0,35 (MeOH/CHCl₃, 3 : 10), UV (H₂O): (pH 7) 262,0 nm (ε 10648), (pH 11) 261,5 nm (ε 8246), (pH 2) 261,5 nm (ε 11208) [α] _D ²⁵ = –3,28 (c 0,72, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,37 (br.s, NH), 7,58 (d, J = 7,92 Hz, 1H, H-6), 5,61 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-5), 6,13 (dd, J = 5,43 Hz, J = 2,98 Hz, 1H, H-4'), 5,43 (t, J = 3,6 Hz, 1H, H-2'), 5,01 (t, J = 6,02 Hz, OH, austauschbar mit D₂O), 4,26 (dd, J = 5,6 Hz, J = 9,4 Hz, 1H, H-5'), 4,05 (dd, J = 2,9 Hz, J = 9,3 Hz, 1H, H-5'), 3,42 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C_BH₁₀O₅N₂: C, 44,86; H, 4,67; N, 13,08. Gefunden: C, 44,77; H, 4,65; N, 13,00.
Dasselbe Verfahren wurde angewandt, um die anderen 5-substituierten Nukleoside analog zu synthetisieren.
Im Folgenden sind die analytischen Daten für die übrigen L-Nukleosid-Analoga aufgeführt:
(2S,4S)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-fluoruracil (13) und (2S,4R)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-fluoruracil (14)

Daten des β-Isomeren 13: R_f = 0,54 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 268,0 nm (ε 9966), (pH 11) 268,0 nm (ε 7822), (pH 2) 268,0 nm (ε 10128) [α]_D ²⁵ = 7,73 (c 0,25, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,85 (NH), 8,24 (d, 1H, J = 7,17 Hz, H-6), 6,17 (d, 1H, J = 5,58 Hz, H-4'), 5,33 (t, 1H, 5'-OH austauschbar mit D₂O), 4,90 (s, 1H, H-2'), 4,28 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-5'), 4,04 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz, 1H, H-5'), 3,68 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂F: C, 41,38; H, 3,88; N, 12,07. Gefunden: C, 41,62; H, 4,01; N, 11,82.
Daten des α-Isomeren 14: R_f = 0,53 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 268,5 nm (ε 10214), (pH 11) 268,0 nm (ε 8212), (pH 2) 268,5 nm (ε 12223) [α]_D ²⁵ = 5,81 (c 0,29, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,90 (NH), 7,88 (d, J = 6,82 Hz, 1H, H-6), 6,10 (m, 1H, H-4'), 5,49 (t, 1H, J = 3,87 Hz, H-2'), 5,00 (t, 1H, 5'-OH, austauschbar mit D₂O), 4,03–4,29 (m, 2H, H-5'), 3,33 (m, 2H, H-6').
Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂F: C, 41,38; H, 3,88; N, 12,07. Gefunden: C, 41,45; H, 3,87; N, 12,04.

(2S,4S)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-chloruracil (15) und (2S,4R)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-chloruracil (16)

Daten des β-Isomeren 15: R_f = 0,61 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 275,0 nm (ε 9018), (pH 11) 274,5 nm (ε 7408), (pH 2) 276,0 nm (ε 10432). [α]_D ²⁵ = 2,98 (c 0,26, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,86 (NH), 8,37 (s, 1H, H-6), 6,17 (d, J = 5,23 Hz, H-4'), 5,37 (t, J = 5,65 Hz, 1H, 5'-OH austauschbar mit D₂O), 4,92 (s, 1H, H-2'), 4,02–4,34 (m, 2H, H-5'), 3,66 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂Cl: C, 38,63; H, 3,62; N, 11,27. Gefunden: C, 38,39; H, 3,78; N, 11,02.
Daten des α-Isomeren 16: R_f = 0,56 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 276,0 nm (ε 9448), (pH 11) 274,5 nm (ε 8276), (pH 2) 276,5 nm (ε 9509) [α] _D ²⁵ = 5,28 (c 0,31, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,67 (NH), 7,68 (s, 1H, H-6), 5,90 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-4'), 5,31 (t, J = 4,0 Hz, 1H, H-2'), 4,76 (t, 1H, 5'-OH, austauschbar mit D₂O), 4,10 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz, 1H, H-5'), 3,92 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz, 1H, H-5'), 3,24 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂Cl: C, 38,63; H, 3,62; N, 11,27. Gefunden: C, 38,45; H, 3,75; N, 11,13.

(2S,4S)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-bromuracil (17) und (2S,4R)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-bromuracil (18)

Daten des β-Isomeren 17: R_f = 0,61 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 277,0 nm (ε 7229), (pH 11) 276,0 nm (ε 6981), (pH 2) 278,5 nm (ε 9939). [α]_D ²⁵ = 4,61 (c 0,28, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,83 (NH), 8,45 (s, 1H, H-6), 6,16 (d, J = 5,05 Hz, H-4'), 5,36 (t, 1H, 5'-OH austauschbar mit D₂O), 4,92 (s, 1H, H-2'), 4,01–4,34 (m, 2H, H5'), 3,66 (m, 2H, H- 6'). Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂BrO, 7CH₃OH: C, 33,10; H, 3,74; N, 8,87. Gefunden: C, 33,50; H, 3,34; N, 8,46.
Daten des α-Isomeren 18: R_f = 0,58 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 279,0 nm (ε 11825), (pH 11) 276,0 nm (ε 8438), (pH 2) 279,0 nm (ε 11801). [α]_D ²⁵ = 3,67 (c 0,29, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,88 (NH), 7,92 (s, 1H, H-6), 6,07 (dd, 1H, J = 3,17 Hz, 5,4z, H-4'), 5,50 (t, J = 4,0 Hz, 1H, H-2'), 5,01 (t, 1H, 5'-OH, austauschbar mit D₂O), 4,27 (m, 2H, H-5'), 3,41 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₉H₉O₅N₂Br: C, 32,77; H, 2,73; N, 9,56. Gefunden: C, 32,71; H, 3,12; N, 9,45.

(2S,4S)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-ioduracil (19) und (2S,4R)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-ioduracil (20)

Daten des β-Isomeren 19: R_f = 0, 77 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 285,0 nm (ε 6628), (pH 11) 279,0 nm (ε 5593), (pH 2) 287 nm (ε 7350). [α]_D ²⁵ = 7,60 (c 0,25, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,64 (NH), 8,42 (s, 1H, H-6), 6,16 (d, 1H, J = 4,0 Hz, H-4'), 5,30 (br.s, 1H, 5'-OH, austauschbar mit D₂O), 4,93 (s, 1H, H-2'), 4,04–4,31 (m, 2H, H-5'), 3,66 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂I: C, 28,23; H, 2,65; N, 8,24. Gefunden: C, 28,36; H, 2,66; N, 8,18.
Daten des α-Isomeren 20: R_f = 0,75 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 287,5 nm (ε 8946), (pH 11) 278,5 nm (ε 6383), (pH 2) 287,5 nm (ε 9049). [α]_D ²⁵ = –6,75 (c 0,33, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,64 (NH), 7,75 (s, 1H, H-6), 5,92 (dd, 1H, J = 4,0 Hz, H-4'), 5,32 (t, J = 4,0 Hz, 1H, H-2'), 4,78 (t, 1H, 5'-OH, austauschbar mit D₂O), 4,12 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz, 1H, H-5'), 3,95 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz, 1H, H-5'), 3,25 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₈H₉O₅N₂I: C, 28, 23; H, 2, 65; N, 8,24. Gefunden: C, 28,23; H, 2,73; N, 8,17.

(2S,4S)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-trifluormethyluracil (21) und (2S,4R)-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-5-trifluormethyluracil (22)

Daten des β-Isomeren 21: R_f = 0,60 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 261,0 nm (ε 10657), (pH 11) 259,0 nm (ε 7334), (pH 2) 261,0 nm (ε 11036). [α] _D ²⁵ = –5,94 (c 0,27, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,88 (NH), 8,84 (s, 1H, H-6), 6,17 (d, J = 4,9 Hz, 1H, H-4'), 5,40 (t, J = 5,47 Hz, 1H, 5'-OH, austauschbar mit D₂O), 4,94 (s, 1H, H-2'), 4,03–4,39 (m, 2H, H-5'), 3,68 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₉H₉O₅N₂F₃·0,2EtOH: C, 38,73; H, 3,50; N, 9,61. Gefunden: C, 38,92; H, 3,36; N, 9,54.
Daten des α-Isomeren 22: R_f = 0,58 (MeOH/CHCl₃, 1 : 4), UV (H₂O): (pH 7) 260,5 nm (ε 12221), (pH 11) 259,5 nm (ε 6750), (pH 2) 261,0 nm (ε 12342). [α]_D ²⁵ = –2,59 (c 0,26, MeOH).
¹HNMR (DMSO-d₆): δ 11,76 (NH), 7,80 (s, 1H, H-6), 5,91 (dd, 1H, J = 4,0 Hz, H-4'), 5,32 (t, J = 4,0 Hz, 1H, H-2'), 4,82 (t, 1H, 5'-OH austauschbar mit D₂O), 4,00–4,18 (m, 2H, H-5'), 3,31 (m, 2H, H-6'). Anal. berechnet für C₉H₉O₅N₂F₃·0,1H₂O: C, 38,05; H, 3,24; N, 9,86. Gefunden: C, 37,75; H, 3,31; N, 9,80.

Biologische Aktivität von L-Nukleosid-Analoga
Es stellte sich heraus, dass L-OddT gegenüber EBV genauso aktiv war wie L-FMAU. In unseren Studien war die Anti-EBV-Aktivität tatsächlich vermindert, wenn die 5-Methylgruppe von L-FMAU durch die Bromgruppe substituiert wurde. Dies legte nahe, dass eine Halogensubstitution einer Methylgruppe an Position 5 der Uracilbase die Aktivität in den Uridin-L-Nukleosiden eigentlich vermindern würde. Wenn dagegen die 5-Methylgruppe von L-OddT durch die Bromgruppe substituiert wurde, war die Anti-EBV-Aktivität tatsächlich erhöht. Dieses Ergebnis war unerwartet. Nachfolgend sind ausführlichere Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und die biologische Aktivität von L-I-OddU und L-Br-OddU aufgeführt.
VERFAHREN
Zellkulturen
In dieser Studie wurde eine hohe Ausbeute der aus menschlichen P3HR1 abgeleiteten, EBV-produzierenden Zelllinie H1 verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C in einem Feuchtinkubator mit 5% CO₂ in RPMI-Medium gezüchtet, das mit 10% dialysiertem, fetalem Rinderserum (FRS) und 100 μg/ml Kanamycin ergänzt war.
Aussetzen von H1-Zellen gegenüber Wirkstoffen
H1-Zellen wurden vor Beginn der Behandlung zwei Tage lang in der logarithmischen Phase des Wachstums gehalten. Die H1- Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 2 × 10³ Zellen pro Vertiefung in 2 ml frischem Medium mit oder ohne Wirkstoffbehandlung ausgesät und 5 Tage lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Zeitraum der Wirkstoffbehandlung wurden die Zellen pelletiert und verwendet, um den hemmenden Effekt des Wirkstoffs auf EBV-DNA im Slot-Blot-Assay to bestimmen.
Slot-Blot-Assay
Insgesamt 4 × 10⁵, mit den verschiedenen Nukleosid-Analoga (wie unten aufgeführt) behandelte H1-Zellen wurden in 400 μl 10 mM Tris-HCL-Lösung (pH 7,5) durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen lysiert. Das Zelllysat wurde bei 37°C 30 Minuten lang mit RNase A (in einer Endkonzentration von 50 μg/ml) und dann bei 55°C 2 Std. lang mit Proteinase K (in einer Endkonzentration von 100 μg/ml) behandelt. Die Proben wurden denaturiert, indem die Endkonzentration auf 0,4 N NaOH/10 mM EDTA bei pH 8,2 eingestellt wurde. Nach Erwärmen in einem Wasserbad bei 100°C für 10 Minuten wurden die Proben mithilfe eines Verteilers (Manifold) punktweise auf positiv geladene Nylonmembranen aufgetragen. Dann wurde α-³²P-dCTP markiertes EBV-ECORIC-Fragment als Sonde für die DNA-Hybridisierung verwendet. Dieselben Membranen wurden nochmals mit Sonden aus menschlicher Alu-DNA (BAMH1-Fragment) inkubiert, nachdem die EBV-ECORIC-Sonde davon entfernt wurde. Die Autoradiographie-Ergebnisse wurden densitometrisch analysiert. Die Menge an EBV-DNA in behandelten H1-Zellen wurde entsprechend dem Verhältnis von EBV-DNA zu Alu-DNA im Vergleich mit H1-Kontrollzellen ohne Behandlung bestimmt. Dieselben Membranen wurden verwendet, um die Toxizität auf Mitochondrien durch Rehybridisierung mit einer mitochondrialen DNA-Sonde nach Entfernen der Alu-DNA-Sonde zu bestimmen. Siehe beispielsweise Yao et al., Antimic. Agents and Chemo., Juli, 1993, S. 1420–1425; Yao et al., Biochem. Pharm., Band 51, 941–947 (1996) (EBV-Test); Doong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 88, 8495–8499 (Oktober 1991) und Bridges et al., Biochem. Pharm., Band 51, 731–736 (Zytotoxizität und mt-DNA-Tests).
Pharmakokinetik von L-Br-OddU und L-I-OddU in BDF1-Mäusen
Mäuse wurden mit L-Br-OddU behandelt, indem 50 mg/kg oral (po), intraperitoneal (ip) und intravenös (iv) verabreicht wurden. Zu den in 5 gezeigten Zeitpunkten wurde Blut aus dem retroorbitalen Plexus weiblicher BDF1-Mäuse in eine heparinisierte Kapillare gesaugt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation von den gebildeten Elementen getrennt. Dann wurden 100 μl Plasma mit einem gleichen Volumen 30%iger Trichloressigsäure gemischt und 10 Minuten auf Eis gehalten. Nach Zentrifugation wurde der Überstand in ein sauberes Röhrchen überführt, und die Probe wurde mit 100 μl einer Mischung aus Trioctylamin : Freon (45%–55%) gemischt, um die Säure zu extrahieren. Die wässrige Phase wurde in ein sauberes Röhrchen überführt und nochmals mit der Trioctylamin : Freon-Mischung extrahiert. Dann wurden 50 μl der neutralisierten, wässrigen Phase in ein HPLC-System von Perkin Elmer injiziert. Die Proben wurden aus einer C₁₈-Säule von Altech mit einem isokratischen Lösungsmittelsystem aus Wasser bei 2 ml pro Minute eluiert. Die Konzentrationen der unbekannten Proben wurden durch Vergleich mit Standards bekannter Konzentrationen bestimmt.
Im Falle von L-I-OddU erhielten weibliche BDF1-Mäuse 10 mg/kg L-I-OddU oral zum Zeitpunkt Null. Dann wurden zu den in 6 gezeigten Zeitpunkten heparinisierte Blutproben aus dem retroorbitalen Plexus gesaugt. Die gebildeten Elemente wurden durch Zentrifugation entfernt. Dann wurde das Plasma durch Zugabe von Trichloressigsäure extrahiert und der Überstand wurde durch Mischen mit einer Lösung aus Trioctylamin : Freon neutralisiert. Eine Fraktion der wässrigen Probe wurde durch HPLC auf einer ODS-Säule von Beckman und mit 0,03 N Essigsäure/2,5% Acetonitril als Lösungsmittel isoliert. Dann wurden die Plasmaspiegel mit authentischen Kontrollen verglichen.
(1) Struktur-Aktivitäts-Beziehung von L-Dioxolan-Uridin-Analoga in Bezug auf EBV-Zellwachstum und Gehalt an mitochrondrialer DNA (mtDNA)
Da sich herausstellte, dass L-OddU gegen EBV genauso aktiv war wie L-FMAU, wurden strukturelle Analoga mit Halogen- oder Wasserstoffsubstitution der CH₃-Gruppe an 5, die wie hierin weiter oben synthetisiert worden sind, hinsichtlich ihrer Aktivität in Bezug auf das EBV-Zellwachstum und die Toxizität gegenüber mtDNA (oben beschrieben) untersucht. Die Zusammenfassung der Ergebnisse ist wie folgt gezeigt und die Dosis-Wirkungs-Kurve der beiden, gegen EBV aktivsten Verbindungen sind in 4 gezeigt.
TABELLE 2
Schlussfolgerung: L-Br-OddU und L-I-OddU sind die wirkungsvollsten Anti-EBV-Verbindungen, die untersucht worden sind. Sie haben wenig Auswirkung auf die Synthese mitochondrialer oder nukleärer DNA. Dies zeigt sich an ihrem Fehlen von Auswirkungen auf den Gehalt an mitochondrialer DNA und das Zellwachstum sowie an dem Fehlen einer Induktion einer Laktatanreicherung im Medium der mit Wirkstoff behandelten Kulturen. Ihre Spiegelbilder, d.h. Verbindungen mit der natürlichen D-Konfiguration, waren gegen EBV viel weniger aktiv. Darüber hinaus waren L-Br-OddC und L-I-OddC gegenüber EBV ebenfalls inaktiv.
(2) Spektrum antiviraler Aktivität von L-I-OddU
Es wurde die Aktivität von L-I-OddU gegen das Wachstum anderer Viren untersucht. Die Ergebnisse sind wie folgt zusammengefasst.
Tabelle 3
Für HSV-1, HSV-2 und CMV verwendete Plaque-Reduktions-Tests sind zuvor beschrieben worden. Siehe Gao et al., Antimic. Agents and Chemo., Mai 1990, S. 808–812 (HSV-Plaque); Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80, 2767–2770 (Mai 1983) (CMV-Plaque-Reduktions-Test). Die Verfahren zur Testung auf EBV, HBV und HIV wurden ebenfalls wie zuvor beschrieben verwendet. Siehe Yao et al., Antimic. Agents and Chemo., Juli 1993, S. 1420–1425, Yao et al., Biochem. Pharm., Band 51, 941–947 (1996) (EBV-Test); Doong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 88, 8495–8499 (Oktober 1991) (HBV-Test); Mellors et al., Molecular Pharm., 41: 446–451 (1992) und Bridges et al., Biochem. Pharm., Band 51, 731–736 (HOV-Test).
Im Gegensatz zu LFMAU, das gegen EBV und HBV aktiv ist, ist L-I-OddU nur gegen EBV stark aktiv und hat einen EC₅₀-Wert, der mindestens viermal niedriger ist als der von L-FMAU. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass L-I-OddU kaum Aktivität gegen HBV zeigte. Das antivirale Spektrum von L-I-OddU unterscheidet sich von dem aller anderen antiviralen Verbindungen, die bisher in der Literatur beschrieben wurden. Es legt außerdem nahe, dass die Wirkung dieser Verbindung für EBV spezifisch ist.
(3) Dosis-Wirkung von L-I-OddU und L-Br-OddU in Bezug auf die Hemmung der EBV-Replikation
H1-Zellen wurden fünf Tage lang in der angegebenen Dosis diesen beiden Verbindungen ausgesetzt. Der EBV-DNA-Gehalt der mit Wirkstoff behandelten Zellen wurde wie oben beschrieben durch die Slot-Blot-Hybridisierungstechnik geschätzt und mit dem wirkstofffreier Zellen verglichen. L-I-OddU ist in Bezug auf die Hemmung der Synthese von EBV-dann etwas wirksamer als L-Br-OddU. Dosis-Wirkungs-Kurven dieser Analoga erscheinen in 4.
(4) Stabilität von L-I-OddU und L-Br-OddU bei verschiedenen pH-Werten
Um die Möglichkeit der oralen Verwendung von L-I-OddU und L-Br-OddU zur Behandlung von EBV-assoziierten Krankheiten zu untersuchen, ist deren Stabilität bei verschiedenen pH-Werten wichtig. L-I-OddU wurde, wie angegeben, 3 Std. lang bei 37°C verschiedenen pH-Lösungen ausgesetzt. Mittels HPLC mit einer C₁₈-Säule wurde der Prozentanteil der Verbindung, der als L-I-OddU verbleibt, untersucht.
Tabelle 4
Dies legt dringend nahe, dass L-I-OddU und L-Br-OddU oral nutzbar sind, da sie bei pH 2 stabil sind und daher in den oberen Dünndarm (Zwölffingerdarm, Leerdarm, Krummdarm) gelangen können, wo sie sofort resorbiert werden, ohne von der Magensäure wesentlich deaktiviert zu werden.
(5) Vorläufige pharmakokinetische Studie von L-Br-OddU und L-I-OddU bei Mäusen
In BDF1-Mäusen wurde, wie oben ausgeführt, die Pharmakokinetik von L-Br-OddU und L-I-OddU untersucht. Wir haben eine vorläufige, pharmakokinetische Studie durchgeführt, indem wir 50 mg/kg oral (po), intraperitoneal (ip) und intravenös (iv), wie oben ausführlicher beschrieben, verabreicht haben. Für L-Br-OddU waren die mehrphasischen Konzentrationskurven der ip- und der iv-Gruppe ähnlich, daher ist aus Gründen der Einfachheit nur die ip-Kurve gezeigt. Im Falle von L-I-OddU ist die orale Verabreichung gezeigt. Der Plasmaspiegel für jeden Wirkstoff ist in den beiliegenden 5 und 6 gezeigt.
In Bezug auf diese pharmakokinetische Studie kann der Schluss gezogen werden, dass L-Br-OddU und L-I-OddU oral aufgenommen werden können und eine Wirksamkeit von etwa 60% haben, was besser ist als bei L-FMAU.
Anti-VZV-Aktivität von 5-halogensubstituierten L-OddU-Derivaten
Plaque-Reduktions-Test für Varizella-Zoster-Virus (VZV)
Zwei Tage vor der Verwendung wurden menschliche Vorhautfibroblastenzellen (HFF) in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und bei 37°C mit 5% CO₂ und 90% Feuchtigkeit inkubiert. Am Tag des Tests wurde der Wirkstoff in MEM mit 2% FRS zubereitet, dann seriell 1 : 5 in MEM verdünnt, wobei sechs Wirkstoffkonzentrationen verwendet wurden. Die ursprüngliche Ausgangskonzentration war 100 μg/ml bis herunter auf 0,03 μg/ml. Das für die Infektion verwendete Virus wurde in MEM mit 10% FRS bis auf eine gewünschte Konzentration verdünnt, was 20–30 Plaques pro Vertiefung ergab. Das Medium wurde aus den Vertiefungen gesaugt, und in dreifachem Ansatz wurde in jede Vertiefung 0,2 ml Virus gegeben, wobei jede Vertiefung zur Messung der Wirkstofftoxizität 0,2 ml Medium erhielt. Die Platten wurden dann eine Stunde lang inkubiert und alle fünfzehn Minuten geschüttelt. Nach der Inkubation wurde MEM mit den verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen in einem Volumen von 2,0 ml in die jeweiligen Vertiefungen gegeben. An Tag 5 wurde weiteres Medium zugegeben und die Kulturen insgesamt für 10 Tage inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die Flüssigkeit abgesaugt, mit 5% Neutralrot für sechs Stunden gefärbt, gewaschen und die Zahl der Plaques mithilfe eines Stereomikroskops bestimmt. Die Ergebnisse werden mit unbehandelten Kontrollvertiefungen verglichen und die EC₅₀ und CC₅₀-Werte berechnet. Die Ergebnisse erscheinen unten in Tabelle 5.
Tabelle 5 Wirksamkeit und Toxizität von Wirkstoffen gegen Varizella-Zoster-Virus
Die Hemmung von VZV durch halogenierte β-L-OddU-Analoga und insbesondere L-Br-OddU beweist, dass diese Verbindung eine besonders wirksame Verbindung zur Verwendung gegen eine VZV-Infektion ist.
Anti-HV8-Aktivität von L-I-OddU
DNA-Hybridisierung, Dosis-Wirkungs-Versuche
Zu Proben von B-Zell-Lymphomzellen aus einer Körperhöhle (infiziert mit HV-8) in einer Aussädichte von 5 × 10⁵ Zellen pro ml wurde TPA (Phorbolester) in einer Konzentration von 20 ng/ml gegeben. Diesen Proben wurde entweder DHPG (als 20 μM oder 5 μM) oder L-I-OddU (als 20 μM, 5 μM, 0,25 μM oder 0,125 μM) zugegeben. Die Proben wurden über einen Zeitraum von 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet, und die DNA wurde durch Zugabe von 1 ml DNAzol(TM)-Reagenz zu 10⁷ Zellen und Lysieren der Zellen durch vorsichtiges Pipettieren extrahiert. Die DNA in dem Lysat wurde dann durch die Zugabe von 0,5% Ethanol (100%) ausgefällt. Die Proben wurden durch Umdrehen gemischt und 3 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt. Das DNA-Präzipitat wurde dann zweimal mit 1 ml 95%igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde dann 5–15 Minuten an der Luft getrocknet und dann in 300 μl 8 mM Natriumhydroxid resuspendiert. Nachdem die DNA gelöst war, wurde die Lösung mit 44 μl 0,1 M HEPES neutralisiert. Dann wurde die DNA-Konzentration gemessen, und 2,5 μg DNA aus jeder Probe wurden mit BAM H1-Restriktionsenzym 1 Stunde lang bei 37°C verdaut. Die verdaute DNA jeder Probe wurde dann auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und über Nacht auf Hybond-N-Papier übertragen. Der DNA-Blot wurde über Nacht mit einer HV-8 (HHV-8)-Sonde hybridisiert. Am nächsten Tag wurde der Blot gewaschen und mehrere Tage einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der Film wurde dann entwickelt, und die Dichte einer jeden Bande wurde mithilfe eines Phosphoimagers bestimmt.
Die Ergebnisse der obigen Versuche erscheinen in der beiliegenden 7. Wie diese Ergebnisse beweisen, war die prozentuale Hemmung der DNA-Hybridisierung mit L-I-OddU in verschiedenen Konzentrationen signifikant höher als die DNA-Hybridisierung bei DHPG, und zeigte somit höhere Anti-HV-8-Aktivität für L-I-OddU bei dieser Zelllinie. L-I-OddU ist in vivo voraussichtlich ein wirksamer Anti-HV-8-Wirkstoff. Es ist anzumerken, dass DHPG in einer Konzentration von 5 μM keine Hemmung der Hybridisierung zeigte.
Für Experten versteht sich, dass die vorangehende Beschreibung und die vorangehenden Beispiele die Anwendung der vorliegenden Erfindung veranschaulichen.

Claims

Verbindung nach der Struktur:
wobei R Cl oder Br ist; und R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acyl- oder Ethergruppe, eine Phosphat-, eine Diphosphat-, Triphosphat- oder Phosphodiestergruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R Br ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Phosphodiestergruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹ H ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung nach der Struktur
wobei R H, F, Cl, Br, I, CH₃ oder CF₃ ist und R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acyl- oder Ethergruppe, eine Phosphat-, Diphosphat-, Triphosphat- oder Phosphodiestergruppe ist, wahlweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoff, Exzipienten oder Trägerstoff, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von EBV-, VZV- oder HV-8-Infektionen bei Patienten.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei R Br oder I ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Phosphodiestergruppe ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–7, wobei R I ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–7, wobei R Br ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–7, wobei R Br oder I und R² H ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–7, wobei R Br oder I und R¹ H oder eine C₁- bis C₂₀-Acylgruppe ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei R I ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei R Br ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–13, wobei die virale Infektion durch das Varizella-Zoster-Virus hervorgerufen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–13, wobei die virale Infektion durch das Epstein-Barr-Virus hervorgerufen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–13, wobei die virale Infektion durch das Kaposi-Sarkom-Virus (HV-8) hervorgerufen ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-ioduracil oder (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-bromuracil in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoff, Exzipienten oder Trägerstoff, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Infektionen, die durch das Epstein-Barr-Virus, das Varizella-Zoster-Virus oder das Kaposi-Sarkom-Virus hervorgerufen werden.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Zusammensetzung (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-ioduracil umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Zusammensetzung (2S,4S)-1-[(Hydroxymethyl)-1,3-dioxanyl-4-yl]-5-bromuracil umfasst.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung nach der Formel:
wobei R H, F, Cl, Br, I, CH₃ oder CF₃ ist und R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acyl- oder Ethergruppe, eine Phosphat-, Diphosphat-, Triphosphat- oder Phosphodiestergruppe ist, zum Herstellen einer Zusammensetzung zum Verhindern oder Verzögern der Manifestation eines EBV-bedingten Lymphoms oder Krebs oder eines Kaposi-Sarkoms bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Patient eine Immunschwäche hat und R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Phosphodiestergruppe ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Patient ein Organtransplantationspatient ist und R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Phosphodiestergruppe ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Patient eine Bluttransfusion erhalten hat und R¹ H, eine C₁- bis C₂₀-Acylgruppe, eine Phosphatgruppe oder eine Phosphodiestergruppe ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–23, wobei R I oder Br ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–24, wobei R¹ H ist.