DE69729449T2

DE69729449T2 - Rekombinante alpha-2,3-sialyltransferasen und deren verwendung

Info

Publication number: DE69729449T2
Application number: DE69729449T
Authority: DE
Inventors: Michel Gilbert; W. Warren WAKARCHUK; Martin N. YOUNG; P. Michael Carina Brisbane JENNINGS; Richard Edward Moxon
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: CA2256645C; ES2231867T3; EP0906432A1; JP2001503961A; DK0906432T3; CA2256645A1; US6096529A; WO1997047749A1; EP0906432B1; JP3905130B2; US6210933B1; DE69729449D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Sialyltransferasen sind eine Gruppe von Glycosyltransferasen, die Sialinsäure von einem aktivierten Zuckernukleotid auf Akzeptoroligosaccharide übertragen, die man an Glycoproteinen, Glycolipiden oder Polysacchariden findet. Sialylierte Oligosaccharide spielen wichtige Rollen bei der Zell-Zell-Erkennung, der Zelldifferenzierung und verschiedenen Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen in Säugetiersystemen. Die große Zahl von sialylierten Oligosaccharid-Strukturen führte zur Charakterisierung vieler verschiedener Sialyltransferasen, die an der Synthese dieser Strukturen beteiligt sind. Bezogen auf die Bindungs- und Akzeptorspezifitäten der soweit untersuchten Sialyltransferasen wurde festgestellt, daß wenigstens 13 unterschiedliche Sialyltransferase-Gene in Säugetiersystemen vorkommen (Tsuji, S. et al. (1996) Glycobiology 6: v–vii).
Sialylierte Glycokonjugate werden auch in Bakterien gefunden (Preston, A. et al. (1996) Crit. Rev. Microbiol. 22: 139–180; Reuter, G. et al. (1996) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377: 325–342), und es wird angenommen, daß sie in Säugetierglycolipden vorkommende Oligosaccharide vortäuschen, um der Immunantwort des Wirts zu entgehen (Moran, A. P. et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16: 105–115). Die Bedeutung von sialyliertem Lipooligosaccharid (LOS) für die Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae ist gesichert (Smith et al., (1992) FEMS Microbiol. Lett. 100: 287–292), während im Falle von N. meningitidis sowohl die Polysialinsäure-Kapsel als auch das sialylierte LOS als wichtig für die Pathogenität erkannt wurden (Vogel, U. et al. (1996) Med. Microbiol Immunol. 186: 81–87).
Trotz ihrer Bedeutung als bewiesene oder potentielle Virulenzfaktoren wurden nur wenige bakterielle Sialyltransferasen kloniert (Weisgerber, C. et al. (1991) Glycobiol. 1: 357–365; Frosch, M. et al. (1991) Mol. Microbiol. 5: 1251–1263; Gilbert, M. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 28271–28276) oder gereinigt (Yamamoto, T. et al. (1996) J. Biochem. 120: 104–110). Die an der Synthese der Polysialinsäure-Kapseln beteiligten α-2,8-Sialyltransferasen wurden sowohl von Escherichia coli (Weisgerber, C. et al. (1991) Glycobiol. 1: 357–365) als auch N. meningitidis (Frosch, M. et al. (1991) Mol. Microbiol. 5: 1251–1263) kloniert und exprimiert. Es wurden Glycosyltransferasen aus N. gonorrhoeae, die an der Synthese von Lipooligosaccharid (LOS) beteiligt sind, kloniert (US-Patent Nr. 5,545,553).
Aufgrund der biologischen Aktivität ihrer Produkte wirken Säugetier-Sialyltransferasen im allgemeinen in spezifischen Geweben, Zellkompartements und/oder -entwicklungsstufen, um präzise Sialyloglycane zu erzeugen. Bakterielle Sialyltransferasen unterliegen nicht den gleichen Einschränkungen und können einen weiteren Bereich von Akzeptoren nutzen, als die der Säugetier-Sialyltransferasen. Beispielsweise wurde gezeigt, daß die α-2,6-Sialyltransferase aus Photobacterium damsela Sialinsäure auf terminale Galactose-Reste überträgt, die in der 2- oder 3-Position fucosyliert bzw. sialyliert werden (Kajihara, Y. et al. (1996) J. Org. Chem. 61: 8632–8635). Eine derartige Akzeptorspezifität wurde bisher für Säugetier-Sialyltransferaseen noch nicht berichtet.
Bakterielle Glycosyltransferasen sind für eine Anzahl von Anwendungen nützlich, wie beispielsweise für die Synthese von gewünschten Oligosacchariden mit biologischer Aktivität. Die Identifizierung und Charakterisierung von neuen bakteriellen Glycosyltransferasen ist daher bei der Entwicklung dieser Technologien nützlich. Die vorliegende Erfindung erschließt diese und andere Vorteile.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäure-Moleküle bereit, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid codiert und die mit SEQ ID NO: 1 oder 3 bei einer Temperatur von 60°C in einer Lösung hybridisiert, die 1,0 M Na⁺-Ionen, pH 7,0 bis 8,3, enthält. Typischerweise codiert die Polynukleotidsequenz für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kD, beispielsweise eines, wie in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigt ist. Beispiele für Polynukleotidsequenzen sind in SEQ ID NO: 1 und 3 gezeigt. Das Nukleinsäure-Molekül kann aus Neisseria meningitidis oder N. gonorrhoeae isoliert sein.
Wenn eine Expression des Enzyms gewünscht wird, kann das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ferner ein Expressionselement umfassen, das eine Promotorsequenz enthält, die funktionsgerecht mit der Polynukleotidsequenz verknüpft ist. Bei einigen Ausführungsformen ist der Promotor in prokaryotischen Zellen wie beispielsweise E. coli aktiv. Es werden ferner Zellen (z. B. E. coli) bereitgestellt, die die rekombinante Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Anfügung eines Sialinsäure-Rests an ein Akzeptormolekül, das einen terminalen Galactose-Rest aufweist, bereit. Die Verfahren umfassen das Inkontaktbringen des Akzeptormoleküls mit einem aktivierten Sialinsäure-Molekül und einer α2,3-Sialyl transferase gemäß der vorliegenden Erfindung. Der terminale Galactose-Rest kann mittels einer α- oder β-Verknüpfung mit einem zweiten Rest in dem Akzeptormolekül verknüpft sein.
Beispielhafte Verknüpfungen schließen ein β1,4- und β1,3-Verknüpfungen. Die aktivierte Sialinsäure ist typischerweise CMP-Neu5Ac.
Definitionen
Die erfindungsgemäßen Sialyltransferasen sind nützlich zur Übertragung eines Monosaccharids von einem Donorsubstrat auf ein Akzeptormolekül. Die Anfügung erfolgt im allgemeinen am nicht-reduzierenden Ende einer Oligosaccharid- oder Kohlenhydrat-Einheit eines Biomoleküls. Biomoleküle, wie sie hierin definiert werden, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein biologisch signifikante Moleküle wie Kohlenhydrate, Proteine (z. B. Glycoproteine) und Lipide (z. B. Glycolipide, Phospholipide, Sphingolipide und Ganglioside).

Hierin werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Ara	= Arabinosyl;
Fru	= Fructosyl;
Fuc	= Fucosyl;
Gal	= Galactosyl;
GalNAc	= N-Acetylgalacto;
Glc	= Glucosyl;
GlcNAc	= N-Acetylgluco;
Man	= Mannosyl; und
NeuAc	= Sialyl(N-acetylneuraminyl).

Die erfindungsgemäßen Sialyltransferasen können dazu verwendet werden, Sialinsäure-Reste verschiedener Formen an Akzeptormoleküle anzufügen. Typischerweise ist die Sialinsäure 5-N-Acetylneuraminsäure (NeuAc) oder 5-N-Glycolylneuraminsäure (NeuGc). An deren Stellen können jedoch auch andere Sialinsäuren verwendet werden. Für einen Überblick über unterschiedliche Formen von Sialinsäure, die gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, vergleiche Schauer, Methods in Enzymology, 50: 64–89 (1987) und Schaur, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 40: 131–234.
Donorsubstrate für Glycosyltransferasen sind aktivierte Nukleotidzucker. Derartige aktivierte Zucker bestehen im allgemeinen aus Uridin-, Guanosin- und Cytidin-diphosphat-Derivaten der Zucker, bei denen das Nukleosid-diphosphat als austretende Gruppe dient. Das Donorsubstrat für die Sialyltransferasen der Erfindung sind aktivierte Zuckernukleotide, die die gewünschte Sialinsäure aufweisen. Beispielsweise ist im Falle von NeuAc der aktivierte Zucker CMP-NeuAc.
Bei Oligosacchariden wird davon ausgegangen, daß sie ein reduzierendes Ende und ein nicht-reduzierendes Ende aufweisen, unabhängig davon ob das Saccharid am reduzierenden Ende tatsächlich ein reduzierender Zucker ist. Gemäß der akzeptierten Nomenklatur werden Oligosaccharide hierin mit dem nicht-reduzierenden Ende auf der linken Seite und dem reduzierenden Ende auf der rechten Seite dargestellt.
Alle hierin beschriebenen Oligosaccharide werden beschrieben mit dem Namen oder der Abkürzung für das nicht-reduzierende Saccharid (z. B. Gal), gefolgt von der Konfiguration der glycosidischen Bindung (α oder β), der Ringbindung, der Ringstellung des an der Bindung beteiligten reduzierenden Zuckers, und dann dem Namen oder der Abkürzung des reduzierenden Saccharids (z. B. GlcNAc). Die Verknüpfung zwischen zwei Zuckern kann beispielsweise ausgedrückt werden als 2,3, 2–3, oder (2,3). Jedes Saccharid ist eine Pyranose oder Furanose.
Viel von Nomenklatur und von allgemeinen Laborarbeitsweisen, die in dieser Anmeldung benötigt werden, werden gefunden in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Das Manual wird nachfolgend als "Sambrook et al." bezeichnet.
Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Polymer in entweder einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form, und wenn keine anderen Einschränkungen gemacht werden, umfaßt er bekannte Analoge von natürlichen Nukleotiden, die mit den Nukleinsäuren auf eine Weise hybridisieren, die der von natürlich vorkommenden Nukleotiden ähnlich ist. Wenn nichts anderes angegeben wird, schließt eine spezielle Nukleinsäureseqeunz ihre komplementäre Sequenz ein.
Ein erfindungsgemäßes "Sialyltransferase-Polypeptid" ist ein Sialyltransferaseprotein oder ein Fragment davon, das in der Lage ist, die Übertragung einer Sialinsäure von einem Donorsubstrat (z. B. CMP-NeuAc) auf ein Azkeptormolekül zu katalysieren. Typischerweise sind derartig Polypeptide den hierin offenbarten beispielhaften Proteinen im wesentlichen ähnlich.
Der Begriff "funktionsgerecht verknüpft" bezieht sich auf eine funktionelle Verknüpfung zwischen einer Kontrollsequenz für die Nukleinsäureexpression (wie einen Promotor, eine Signalsequenz oder eine Anordnung von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen) und einer zweiten Nukleinsäuresequenz, wobei die Expressions-Kontrollsequenz die Transkription und/oder Translation der Nukleinsäure beeinflußt, die der zweiten Sequenz entspricht.
Der Begriff "rekombinant", wenn er unter Bezugnahme auf eine Zelle verwendet wird, gibt an, daß die Zelle eine heterologe Nukleinsäure repliziert, oder ein Peptid oder Protein exprimiert, für das eine heterologe Nukleinsäure codiert. Rekombinante Zellen können Gene enthalten, die in der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht gefunden werden. Rekombinante Zellen können auch Gene enthalten, die in der nativen Form der Zelle gefunden werden, wobei die Gene auf künstliche Weise modifiziert und wieder in die Zelle eingeführt wurden. Der Begriff umfaßt auch Zellen, die eine Nukleinsäure enthalten, die für die Zelle endogen ist, die modifiziert wurde, ohne die Nukleinsäure aus der Zelle zu entfernen. Derartige Modifikationen schließen diejenigen ein, die durch Genersatz, ortsspezifische Mutation und verwandte Techniken erhalten werden.
Eine "heterologe Sequenz" oder eine "heterologe Nukleinsäure", ist, wenn hierin verwendet, eine, die aus einer Quelle stammt, die der speziellen Wirtszelle fremd ist, oder die, wenn sie aus der gleichen Quelle stammt, gegenüber ihrer Originalform modifiziert ist. Somit schließt ein heterologes Glycosyltransferase-Gen in einer prokaryotischen Wirtszelle ein Glycosyltransferase-Gen ein, das für die spezielle Wirtszelle endogen ist, das modifiziert wurde. Die Modifizierung der heterologen Sequenz kann zum Beispiel erfolgen durch Behandlung der DNA mit einem Restriktionsenzym, um ein DNA-Fragment zu erzeugen, das in der Lage ist, funktionsgerecht mit dem Promotor verknüpft zu werden. Techniken wie beispielsweise eine ortsspezifische Mutagenese sind ebenfalls zur Modifikation einer heterologen Sequenz nützlich.
Eine "Untersequenz" bezeichnet eine Sequenz aus Nukleinsäuren oder Aminosäure, die einen Teil einer längeren Sequenz von Nukleinsäuren bzw. Aminosäuren (z. B. ein Polypeptid) umfassen.
Eine "rekombinante Expressionskassette" oder einfach eine "Expressionskassette" ist ein Nukleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch hergestellt wurde, mit Nukleinsäureelementen, die in der Lage sind, die Expression eines Strukturgens in Wirten, die mit derartigen Sequenzen kompatibel sind, zu beeinflussen. Expressionskassetten beinhalten wenigstens Promotoren und gegebenenfalls Transkriptionsterminierungssignale. Typischerweise beinhaltet die rekombinante Expressionskassette eine zu transkribierende Nukleinsäure (z. B. eine Nukleinsäure, die für ein gewünschtes Polypeptid codiert) und einen Promotor. Es können auch zusätzliche Faktoren, wie sie hierin beschrieben werden, verwendet werden, die zur Bewirkung der Expression notwendig oder hilfreich sind. Beispielsweise kann eine Expressionskassette Nukleotidsequenzen beinhalten, die für eine Signalsequenz codieren, die die Sekretion eines exprimierten Proteins aus der Wirtszelle steuert. Transkriptions-Terminationssignale, Verstärker und andere Nukleinsäuresequenzen, die die Genexpression beeinflussen, können ebenfalls in einer Expressionskassette enthalten sein.
Der Begriff "isoliert" soll sich auf ein Material beziehen, das weitgehend oder im wesentlichen frei von Komponenten ist, die das Enzym normalerweise begleiten, wenn es in seinem nativen Zustand gefunden wird. Somit schließen die erfindungsgemäßen Enzyme keine Materialien ein, die normalerweise mit ihrer in situ-Umgebung assoziiert sind. Typischerweise sind isolierte Proteine der Erfindung wenigstens etwa 80% rein, üblicherweise wenigstens etwa 90%, und vorzugsweise wenigstens etwa 95% rein, und zwar gemessen anhand der Bandenintensität in einem mit Silber angefärbten Gel oder einem anderen Verfahren zur Bestimmung der Reinheit. Die Proteinreinheit oder -homogenität kann auf zahlreiche dem Fachmann bekannte Arten angezeigt werden, beispielsweise durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Proteinprobe, gefolgt von einer Sichtbarmachung durch Anfärben. Für bestimmte Zwecke kann eine hohe Auflösung benötigt werden, und HPLC oder ein ähnliches Mittel zur Reinigung angewandt werden.
Der Begriff "identisch" bezeichnet im Kontext von zwei Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen die Reste in den beiden Sequenzen, die gleich sind, wenn sie so ausgerichtet werden, daß sie eine maximale Entsprechung zeigen. Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen für Vergleichszwecke kann z. B. mittels des lokalen Homologie-Logarithmus von Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mittels des Homologieausrichtungsalgorithmus von Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mittels der Methode einer Suche nach Ähnlichkeiten von Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mittels computerisierter Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion, erfolgen.
Ein weiterer Algorithmus, der zur Bestimmung der Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der beschrieben wird in Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410. Software zur Durchführung einer BLAST-Analyse ist öffentlich zugänglich über das National Center for Biotechnologiy Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Bei diesem Algorithmus werden zuerst Sequenzpaare mit einer hohen Trefferzahl (high scoring sequence pairs (HSPs) identifiziert, indem man kurze Wörter einer Länge W in der Abfragesequenz identifiziert, die entweder übereinstimmen oder eine Schwellen-Trefferzahl P mit positivem Wert erfüllen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbasis-Sequenz ausgerichtet werden. T wird als Nachbarwort-Trefferzahlschwelle (Altschul et al., supra) bezeichnet. Diese ersten Nachbarwort-Treffer wirken als Keime für den Beginn von Abfragen, um längere HSPs zu finden, die diese enthalten. Die Worttreffer werden entlang jeder Sequenz in beide Richtungen verlängert, und zwar soweit, wie die kumulative Ausrichtungs-Trefferzahl erhöht werden kann. Die Verlängerung der Worttreffer in jede Richtung wird beendet wenn: die kumulative Ausrichtungs-Trefferzahl um eine Größe X gegenüber ihrem maximalen erreichten Wert absinkt; die kumulative Trefferzahl auf Null oder darunter absinkt, und zwar aufgrund der Akkumulation von einer oder mehreren Rest-Ausrichtungen mit negativer Trefferzahl; oder das Ende einer jeden Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Standards eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Tefferzahlmatrix (vgl. Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919) Ausrichtungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 sowie einen Vergleich von beiden Strängen.
Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; vergleiche z. B. Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787. Ein Maß für die Ähnlichkeit, das durch den BLAST-Algorithmus geliefert wird, ist die kleinste Summen-Wahrscheinlichkeit, (P(N)), die eine Angabe der Wahrscheinlichkeit liefert, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Beispielsweise wird eine Nukleinsäure als einem Glycosyltransferase-Gen oder einer -cDNA ähnlich angesehen, wenn die kleinste Summen-Wahrscheinlichkeit bei einem Vergleich der Test-Nukleinsäure mit einer Glycosyltransferasenukleinsäure weniger als etwa 1 beträgt, vorzugsweise weniger als etwa 0,1, stärker bevorzugt weniger als etwa 0,01 und am stärksten bevorzugt weniger als 0,001.
Der Begriff "erhebliche Identität" oder "erhebliche Ähnlichkeit" gibt im Zusammenhang mit einem Polypeptid an, daß ein Polypeptid eine Sequenz aufweist mit einer wenigstens 70%igen Sequenzidentität (oder Ähnlichkeit) mit einer Referenzsequenz, oder vorzugsweise 80%, oder noch stärker bevorzugt 85% Sequenzidentität (oder Ähnlichkeit) mit der Referenzsequenz, oder am stärksten bevorzugt 90% Identität (oder Ähnlichkeit) innerhalb eines Vergleichsfensters von etwa 10 bis 20 Aminosäureresten. Eine Angabe, daß Polypeptidsequenzen im wesentlichen identisch oder ähnlich sind bedeutet, daß ein Peptid immunologisch reaktiv gegenüber Antikörpern ist, die gegen das zweite Peptid erzeugt wurden.
Eine Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen im wesentlich identisch sind bedeutet, daß ein Polypeptid, für das die erste Nukleinsäure codiert, immunologisch mit dem Polypeptid, für das die zweite Nukleinsäure codiert, kreuzreagiert.
Eine andere Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen eine erhebliche Identität aufweisen, bedeutet, daß die zwei Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
"Binden/bindet in erheblichem Umfang" bezieht sich auf die komplementäre Hybridisierung zwischen einer Sonden-Nukleinsäure und einer Ziel-Nukleinsäure und umfaßt geringere Fehlpassungen, die dadurch ausgeglichen werden können, daß man die Stringenz des Hybridisierungsmediums vermindert, um den gewünschten Nachweis der Ziel-Polynukleotidsequenz zu erreichen.
Der Ausdruck "hybridisiert spezifisch mit" bezieht sich auf das Binden, Duplizieren oder Hybridisieren eines Moleküls mit nur einer speziellen Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einer komplexen Mischungs- (z. B. einer gesamten zellulären) DNA oder RNA vorhanden ist.
Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsequenz hybridisiert, jedoch nicht mit anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich in unterschiedlichen Umständen. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß sie etwa 50°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei definierter Ionenstärke und definiertem pH. Der Tm ist diejenige Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Sonden, die der Zielsequenz komplementär sind, im Gleichgewicht mit der Zielsequenz hybridisieren. (Da die Zielsequenzen im allgemeinen im Überschuß vorhanden sind, sind bei Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Typischerweise sind stringente Bedingungen diejenigen, bei denen die Salzkonzentration geringer ist als etwa 1,0 M Na-Ion, typischerweise etwa bei einer Konzentration von 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen (oder anderen Salzen) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) und wenigstens 60°C für lange Sonden (z. B. von mehr als 50 Nukleotiden) beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie beispielsweise Formamid erreicht werden.
Die Ausdrücke "bindet spezifisch an ein Protein" oder "ist spezifisch immunoreaktiv mit", wenn sie unter Bezugnahme auf einen Antikörper verwendet werden, beziehen sich auf eine Bindungsreaktion, die für die Anwesenheit des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen Biologien kennzeichnend ist. Somit binden unter vorgegebenen Immunoassay-Bedingungen die angegebenen Antikörper vorzugsweise an ein spezielles Protein, während sie nicht in erheblicher Menge an andere Proteine binden, die in der Probe vorhanden sind. Ein spezifisches Binden an ein Protein unter derartigen Bedingungen benötigt einen Antikörper, der im Hinblick auf seine Spezifität für ein spezielles Protein ausgewählt ist. Es kann eine Vielzahl von Immunoassay-Formaten dazu verwendet werden, Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem speziellen Protein immunreaktiv sind.
Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig dazu verwendet, monoklonale Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem Protein immunreaktiv sind. Vgl. Harlow and Lane (1988), Antikörper, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, bezüglich einer Beschreibung von Immunoassay-Formaten und Bedingungen, die angewandt werden können, um eine spezifische Immunreaktivität zu bestimmen.
Eine "konservative Substitution" bedeutet, wenn man ein Protein beschreibt, eine Veränderung der Aminosäurezusammensetzung des Proteins, die die Aktivität des Proteins nicht erheblich verändert. Somit bedeuten "konservativ modifizierte Variationen" einer speziellen Aminosäuresequenz Aminosäuresubstitutionen solcher Aminosäuren, die für die Proteinaktivität nicht kritisch sind, oder die Substitution von Aminosäuren durch andere Aminosäuren, die ähnliche Eigenschaften aufweisen (z. B. sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht-polar sind, usw.), so daß die Substitutionen selbst von kritischen Aminosäuren die Aktivität nicht substantiell verändern. Tabellen für eine konservative Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren liefern, sind dem Fachmann gutbekannt. Nachfolgend werden 6 Gruppen angegeben, die jeweils Aminosäure enthalten, die Beispiele für konservative gegenseitige Substitutionen darstellen:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

Vergleiche auch Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company. Zusätzlich sind auch individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder eine geringe Prozentzahl von Aminosäuren ändern, hinzufügen oder entfernen in einer codierten Sequenz ebenfalls "konservativ modifizierte Variationen".
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt zwei Elektropherogramme, die übereinandergelegt wurden, um den Grad der Sialyltransferase-Aktivität zu illustrieren, die in einer 1,5 ml E. coli-Kultur festgestellt wird, die mit 1000 pfu aus der genomischen DNA-Bank von N. meningitidis in λZAPH infiziert ist. Die dünne Linie ist ein Durchgang, bei dem die Reaktion keinen CMP-Neu5Ac-Donor enthielt, und die dicke Linie ist eine von einem Durchgang, der den CMP-Neu5Ac-Donor enthielt. Es wurde gezeigt, daß der Peak bei 6,6 Minuten mit FCHASE-α-2,3-Sialyl-N-acetyllactosamin comigriert.
2 zeigt Strukturen der Fluorophore, die bei dem Kapillar-Elektrophorese-Assay der α-2,3-Sialyltransferase verwendet wurden. 2A: Wenn die 8-Aminopyren-1,4,6-trisulfonsäure reduktiv auf reduzierende Disaccharide aminiert wird, wird das reduzierende Ende ringgeöffnet. R1 = OH (NAc, wenn R2 = LacNac); R2 = Gal-α, Gal-β-N-Acetyllactosamin; Lacto-N-neotetraose; Lacto-N-tetraose; Gal-α-(1→4)-Gal-β-(1→4). 2B R = Gal-α; Gal-β; Lactose; N-Acetyllactosamin; Gal-α-(1→4)-Gal-β-(1→4).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die Praxis der vorliegenden Erfindung involviert die Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuren und die Expression von Genen in transfizierten Wirtszellen. Molekulare Kloniertechniken zur Erreichung dieser Zwecke sind dem Fach mann bekannt. Dem Fachmann ist eine große Vielzahl von Klonier- und In-vitro-Vervielfältigungsverfahren bekannt, die für die Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Expressionsvektoren geeignet sind. Beispiele für diese Techniken und Vorgehensanweisungen, die ausreichen, Fachleute durch zahlreiche Klonierübungen hindurchzuleiten, werden gefunden in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Vols 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; und Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, ein gemeinschaftliches Unternehmen zwischen Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement).
Herstellung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
Nukleinsäuren, die für Sialyltransferase-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, können nach irgendeinem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, wozu beispielsweise das Klonieren und die Spaltung von geeigneten Sequenzen oder die direkte chemische Synthese nach Verfahren wie beispielsweise dem Phosphotriester-Verfahren von Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90–99; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109–151; das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859–1852; und das Festträgerverfahren gemäß US-Patent Nr. 4,458,068 gehören.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, die für eine Sialyltransferase codiert, nach Routine-Klonierverfahren isoliert. Eine Nukleotidsequenz einer Sialyltransferase, wie sie hierin bereitgestellt wird, wird dazu verwendet, Sonden zu erhalten, die spezifisch mit einem Sialyltransferase-Gen in einer Probe einer Genom-DNA hybridisieren, oder mit einer Sialyltransferase-mRNA in einer Gesamt-RNA-Probe (z. B. in einem Southern oder Northern Blot). Wenn einmal die Ziel-Sialyltransferasenukleinsäure identifiziert ist, kann sie nach Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden.
Die gewünschten Nukleinsäuren können auch unter Verwendung gutbekannter Vervielfältigungstechniken kloniert werden. Beispiele für Protokolle, die ausreichen, Fachleute durch In-vitro-Vervielfältigungsverfahren zu führen, einschließlich der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Ligasekettenreaktion (LCR), der Qβ-Replikasevervielfältigung sowie anderer RNA-Polymerase-vermittelten Techniken können gefunden werden in Berger, Sambrook und Ausubel, sowie in Mullis et al. (1987) US-Patent Nr. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1. Oktober, 1990) C & EN, 36–47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81–94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291–294; Wu und Wallace (1989) Gene 4: 560; und Barringer et al. (1990) Gene 89: 117. Verbesserte Verfahren für das Klonieren von in vitro vervielfältigten Nukleinsäuren werden beschrieben in Wallace et al., US-Patent Nr. 5,426,039. Geeignete Primer für eine Verwendung bei der Vervielfältigung von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sind in dem Beispielsteil weiter unten beschrieben.
Die Sialyltransferasenukleinsäure kann auch dadurch kloniert werden, daß man ihr exprimiertes Produkt mit Hilfe von Assays nachweist, die auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften des exprimierten Proteins beruhen. Beispielsweise kann man eine klonierte Sialyltransferasenukleinsäure aufgrund der Fähigkeit eines Polypeptids, für das die Nukleinsäure codiert, die Übertragung einer Sialinsäure von einem Donor auf eine Akzeptoreinheit zu katalysieren, nachweisen. Gemäß einem bevorzugten Verfahren wird Kapillarelektrophorese dazu verwendet, die Reaktionsprodukte nachzuweisen. Dieser hochsensitive Assay beinhaltet die Verwendung entweder von Monosaccharid- oder Disaccharid-Aminophenyl-Derivaten, die mit Fluorescein markiert sind, wie weiter unten sowie in Wakarchuk et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (45): 28271–276 beschrieben wird.
Gemäß einiger Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Sialyltransferasenukleinsäuren zu modifizieren. Ein Fachmann kennt viele Arten zur Erzeugung von Änderungen in einem gegebenen Nukleinsäure-Konstrukt. Derartige gutbekannte Verfahren schließen ein die ortsspezifische Mutagenese, die PCR-Vervielfältigung unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide, die Behandlung von Zellen, die die Nukleinsäure enthalten, mit mutagenen Mitteln oder mit Strahlung, die chemische Synthese eines gewünschten Oligonukleotids (in Verbindung mit einer Verknüpfung und/oder Klonierung zur Erzeugung von langen Nukleinsäuren) sowie andere gutbekannte Techniken. Vgl. beispielsweise Giliman und Smith (1979) Gene 8: 81–97, Roberts et al (1987) Nature 328: 731–734.
Herstellung von Expressionskassetten, die für Sialyltransferasen der Erfindung codieren
Die Sialyltransferase-Sequenzen der Erfindung werden in Expressionskassetten für eine Expression in einer gewünschten Wirtszelle mit hohen Ausbeuten inkorporiert. Eine typische Expressionskassette enthält einen Promotor, der funktionsgerecht mit der gewünschten DNA-Sequenz verknüpft ist. In einer einzelnen prokaryotischen Zelle können mehr als ein Sialyltransferase-Polypeptid exprimiert werden, indem man mehrere Transkriptionskassetten in einem einzigen Expres sionsvektor anordnete, oder daß man unterschiedliche selektierbare Marker für jeden der Expressionsvektoren verwendet, die in der Klonierstrategie verwendet werden.
Herkömmlich verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen, die hierin als solche definiert werden, die Promotoren für die Transkriptionsinitiierung, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Operator sowie zusammen mit Ribosom-Bindungsstellensequenzen, schließen ein allgemein verwendete Promotoren wie die beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose (lac)-Promotorsysteme (Change et al., Nature (1977) 198: 1056), das Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057), den tac-Promotor (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21–25); und den lambda-abgeleiteten P_L-Promotor und die N-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). Das spezielle Promotorensystem ist für die Erfindung nicht kritisch, und irgendein geeigneter Promotor, der in Prokaryoten funktioniert, kann verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung können entweder konstitutive oder regulierte Promotoren verwendet werden. Regulierte Promotoren können vorteilhaft sein, weil man die Wirtszellen bis zu hohen Dichten züchten kann, bevor die Expression der Sialyltransferase-Polypeptide induziert wird. Eine starke Expression von heterologen Proteinen verlangsamt in gewissen Situationen das Zellwachstum. Regulierte Promotoren, die für eine Verwendung in E. coli besonders geeignet sind, schließen ein den Bakteriophagen lambda P_L-Promotor, den hybriden trp-lac-Promotor (Amann et al. Gene (1983), 25: 167; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21, und den Bakteriophagen T7-Promotor (Studier et al., J. Mol. Biol. (1986); Tabor et al. (1985)). Diese Promotoren und ihre Verwendung werden in Sambrook et al., supra diskutiert.
Für die Expression von Sialyltransferase-Polypeptiden in prokaryotischen Zellen, die nicht E. coli sind, ist ein Promotor erforderlich, der in der speziellen prokaryotischen Spezies funktioniert. Derartige Promotoren können aus Genen erhalten werden, die aus der Spezies kloniert wurden, oder es können heterologe Promotoren verwendet werden. Beispielsweise funktioniert der hybride trp-lac-Promotor zusätzlich zu E. coli auch in Bacillus.
Eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) wird üblicherweise in die erfindungsgemäßen Expressionskassetten eingeschlossen. Eine RBS in E. coli besteht beispielsweise aus einer Nukleotidsequenz mit einer Länge von 3 bis 9 Nukleotiden, die 3 bis 11 Nukleotide stromaufwärts des Initiierungscodons angeordnet sind (Shine und Dalgarno, Nature (1975) 254: 34; Steitz, in Biological regulation and development: Gene expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, S. 349, 1979, Plenum Publishing, NY).
Zur Erhöhung der Expression kann eine Translationskopplung verwendet werden. Diese Strategie verwendet ein kurzes stromauf angeordnetes offenes Leseraster, das sich von einem stark exprimierten Gen ableitet, das dem Translationssystem eigen ist, das stromab des Promotors angeordnet ist, sowie eine Ribosomen-Bindungsstelle, die nach einigen wenigen Aminosäure-Codons von einem Terminierungscodon gefolgt wird. Direkt vor dem Terminierungscodon liegt eine zweite Ribosomen-Bindungsstelle, und hinter dem Terminierungscodon befindet sich ein Startcodon für die Initiierung der Translation. Dieses System löst die sekundäre Struktur in der RNA auf, was eine wirksame Initiierung der Translation ermöglicht. Vgl. Squires, et al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 16297–16302.
Die Sialyltransferase-Polypeptide können intrazellulär exprimiert werden oder aus der Zelle sekretiert werden. Intrazelluläre Expression führt häufig zu hohen Ausbeuten.
Wenn nötig, kann die Menge an löslichem, aktivem Sialyltransferase-Polypeptid dadurch erhöht werden, daß man Neufaltungs-Prozeduren durchführt (vgl. z. B. Sambrook et al., supra; Marston et al., Biol. Technology (1984) 2: 800; Schoner et al., Biol. Technology (1985) 3: 151). Bei Ausführungsformen, bei denen die Sialyltransferase-Polypeptide aus der Zelle sekretiert werden, entweder in das Periplasma oder in das extrazelluläre Medium, ist die DNA-Sequenz mit einer abspaltbaren Signalpeptidsequenz verknüpft. Die Signalsequenz steuert die Verlagerung des Sialyltransferase-Polypeptids durch die Zellmembran hindurch. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor für eine Verwendung in E. coli, der eine Promotor-Signalsequenzeinheit aufweist, ist pTA1529, die den E. coli-phoA-Promotor und eine Signalsequenz enthält (vgl. z. B. Sambrook et al., supra; Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985), 82: 7212; Talmadge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 3988; Takahara et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2670).
Die erfindungsgemäßen Sialyltransferase-Polypeptide können auch als Fusionsproteine hergestellt werden. Dieser Ansatz führt häufig zu hohen Ausbeuten, weil normale prokaryotische Kontrollsequenzen die Transkription und Translation steuern. In E. coli werden häufig locZ-Fusionen dazu verwendet, heterologe Proteine zu exprimieren. Geeignete Vektoren sind leicht verfügbar, wie beispielsweise solche der pUR-, pEX- und pMR100-Reihen (vgl. z. B. Sambrook et al., supra). Für bestimmte Anwendungen kann es wünschenswert sein, nach der Reinigung die Nicht-Sialyltransferase-Aminosäuren aus dem Fusionsprotein anzuspalten. Das kann nach irgendeinem von verschiedenen Verfahren erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich einer Spaltung mit Cyanogenbromid, einer Protease oder mit Faktor X_a (vgl. z. B. Sambrook et al., supra; Itakura et al., Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 73: 106; Nagai et al., Nature (1984) 309: 810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA (1986), 83: 561). Spaltstellen können in das Gen für das Fusionsprotein an dem gewünschten Spaltpunkt eingearbeitet werden.
Ein geeignetes System zur Gewinnung von rekombinanten Proteinen aus E. coli, das die Integrität ihrer N-Termini erhält, wurde beschrieben von Miller et al., Biotechnology 7: 698–704 (1989). Bei diesem System wird das Gen von Interesse als C-terminale Fusion mit den ersten 76 Resten des Hefe-Ubiquitin-Gens hergestellt, das eine Peptidase-Spaltstelle aufweist. Die Spaltung an der Verknüpfung der zwei Einheiten führt zur Herstellung eines Produkts mit einem intakten authentischen N-terminalen Rest.
Expression von erfindungsgemäßen Sialyltransferasen
Erfindungsgemäße Sialyltransferasen können in einer Vielzahl von Wirtszellen exprimiert werden, zu denen gehören E. coli, andere bakterielle Wirte, Hefen sowie höhere eukaryotische Zellen, wie beispielsweise COS-, CHO- und HeLa-Zellinien sowie Myelom-Zellinien. Beispiele für nützliche Bakterien schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla und Paracoccus. Das rekombinante Proteingen wird funktionsgerecht mit geeigneten Sequenzen für die Expressionssteuerung für jeden Wirt verknüpft. Für E. coli schließt dieses einen Promotor wie T7, trp oder lambda-Promotoren ein, eine Ribosomen-Bindungsstelle sowie vorzugsweise ein Signal für die Transkriptionsterminierung. Für eukaryotische Zellen schließen die Kontrollsequenzen einen Promotor und vorzugsweise einen Verstärker ein, der sich ableitet von Immunglobulin-Genen, SV40, Cytomegalovirus usw. sowie eine Polyadenylierungssequenz, und sie können Splicing-, Donor- und Akzeptor-Sequenzen einschließen.
Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die gewählten Wirtszellen nach gutbekannten Verfahren transferiert werden, wie beispielsweise der Calciumchlorid-Transformation für E. coli und der Calciumphosphat-Behandlung oder Elektroporierung für Säugetierzellen. Durch die plasmide transformierte Zellen können aufgrund einer Beständigkeit gegen Antibiotika ausgewählt werden, die durch Gene verliehen wird, die auf den Plasmiden enthalten sind, wie beispielsweise die amp-, gpt-, neo- und hyg-Gene.
Wenn sie einmal exprimiert sind, können die rekombinanten Sialyltransferase-Polypeptide nach Standardverfahren des Fachgebiets gereinigt werden, wozu gehören die Ammoniumsulfat-Fällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dgl. (vgl. allgemein R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990)). Im wesentlichen reine Zusammensetzung mit einer wenigstens 90 bis 95%igen Homogenität sind bevorzugt, und eine Homogenität von 98 bis 99% oder mehr ist besonders bevorzugt. Wenn sie einmal gereinigt sind, und zwar teilweise oder wie gewünscht zur Homogenität, können die Polypeptid verwendet werden (z. B. als Immunogene für die Antikörpererzeugung).
Der Fachmann versteht, daß die Glycosyltransferase-Proteine modifiziert werden können, ohne daß ihre biologische Aktivität vermindert wird. Einige Modifizierungen können vorgenommen werden, um das Klonieren, die Expression oder die Inkorporierung des Zielmoleküls in ein Fusionsprotein zu erleichtern. Derartige Modifikationen sind Fachleuten gutbekannt und schließen beispielsweise ein ein Methionin, das an den Aminoterminus angefügt wird, um eine Initiierungsstelle zu erhalten, oder zusätzliche Aminosäuren (z. B. poly His), die an irgendeinen Terminus angehängt werden, um bequem angeordnete Restriktionsstellen oder Terminierungscodons oder Reinigungssequenzen zu erzeugen.
Verwendung von Sialyltransferasen
Die Erfindung liefert Verfahren zur Verwendung von Sialyltransferasen, die nach den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, um gewünschte Oligosaccharide (die aus zwei oder mehr Sacchariden zusammengesetzt sind) herzustellen. Die erfindungsgemäßen Glycosyltransferase-Reaktionen laufen in einem Reaktionsmedium ab, das wenigstens eine Glycosyltransferase, ein Donorsubstrat, einen Akzeptorzucker und typischerweise ein lösliches zweiwertiges Metallkation enthalten. Die Verfahren beruhen auf der Verwendung von Glycosyltransferase zur Katalysierung der Anfügung eines Saccharids an ein Substratsaccharid. Beispielsweise stellt die Erfindung Verfahren zur Anfügung von Sialinsäure an einen Galactose-Rest in einer α2,3-Verknüpfung bereit, indem man eine Reaktionsmischung, die eine aktivierte Sialinsäure (z. B. CMP-NeuAc) enthält, mit einer Akzeptoreinheit umsetzt, die eine Gal-Rest aufweist, und zwar in Gegenwart einer Sialyltransferase, die nach den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Es ist eine Vielzahl von Verfahren zur Verwendung von Glycosyltransferasen zur Synthese gewünschter Oligosaccharid-Strukturen bekannt. Beispielhafte Verfahren werden beispielsweise beschrieben in WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993), und in den US-Patenten 5,352,670, 5,374,541 und 5,545,553.
Die wie hierin beschrieben hergestellten Sialyltransferasen können in Kombination mit zusätzlichen Glycosyltransferasen verwendet werden. Beispielsweise kann man eine Kombination aus Sialyltransferase und Glycosyltransferasen verwenden. Bei dieser Gruppe von Ausführungsformen können die Enzyme und Substrate in einer ersten Reaktionsmischung kombiniert werden, oder die Enzyme und Reagenzien für einen zweiten Glycosyltransferase-Cyclus können vorzugsweise dem Reaktionsmedium zugesetzt werden, wenn einmal der erste Glycosyltransferase-Cyclus sich seinem Abschluß nähert. Indem man zwei Glycosyltransferase-Cyclen in Folge in einem einzigen Behälter durchführt, werden die Gesamtausbeuten gegenüber Arbeitsweisen verbessert, bei denen eine intermediäre Spezies isoliert wird. Außerdem wird die Aufreinigung und die Entsorgung von Extralösemitteln und Nebenprodukten vermindert.
Die nach den obigen Verfahren hergestellten Produkte können ohne Reinigung verwendet werden. Es ist jedoch üblicherweise bevorzugt, das Produkt zu gewinnen. Es können gutbekannte Standardtechniken zur Gewinnung von glycosylierten Sacchariden wie beispielsweise die Dünn- oder Dickschichtchromatographie, die Ionenaustauschchromatographie oder eine Membranfiltration angewandt werden. Es ist für die Gewinnung bevorzugt, eine Membranfiltration, stärker bevorzugt unter Verwendung einer Membran für die Umkehrosmose, oder eine oder mehrere Säulenchromatographie-Techniken anzuwenden, wie nachfolgend hierin und in der hierin zitierten Literatur diskutiert wird. Beispielsweise kann eine Membranfiltration, wobei die Membranen eine Schnittstelle für das Molekulargewicht von etwa 3000 bis etwa 10 000 aufweisen, zur Entfernung von Proteinen verwendet werden. Eine Nanofiltration oder Umkehrosmose kann dann dazu verwendet werden, Salze zu entfernen. Nanofilter-Membranen stellen eine Klasse von Membranen für die Umkehrosmose dar, die monovalente Salze hindurchlassen, jedoch polyvalente Salze und ungeladene gelöste Stoffe mit mehr als etwa 100 bis 700 Dalton zurückhalten, und zwar in Abhängigkeit von der verwendeten Membran. Somit werden bei einer typischen Anwendung nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Saccharide in der Membran zurückgehalten, und kontaminierende Salze treten hindurch. Unter Verwendung der artiger Techniken können die Saccharide (z. B. Sialyllactose) mit einer im wesentlichen 100%igen Reinheit hergestellt werden, und zwar nach Maßgabe von Protonen-NMR und TLC.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt das Klonierung und die erste Charakterisierung von Genen aus N. meningitidis und N. gonorrhoeae, die für Sialyltransferasen codieren. Das Klonieren wurde durch Verwendung einer hochsensitiven Screeningprozedur erreicht, die auf der Expression von Enzymaktivität beruhte.
Experimentelle Arbeitsweisen
Bakterienstämme – Die folgenden N. meningitidis-Stämme wurden in dieser Untersuchung verwendet: Immunotyp L3MC58 (NRCC #4728); Immunotyp L3406Y (NRCC #4030) Immunotyp L7M982B (NRCC #4725). DNA aus N. gonorrhoeae F62 (ATCC 33084) war ein freundliches Geschenk von Dr. Wendy Johnson (Health Canada, Ottawa).
Grundlegende Verfahren für rekombinante DNA – Die Plasmid-DNA-Isolierung, die Restriktionsenzym-Verdauungen, die Reinigung von DNA-Fragmenten für das Klonieren, Verknüpfungen, Transformationen und DNA-Sequenzieren wurden so durchgeführt, wie von dem Enzym-Lieferanten empfohlen wird, oder vom Hersteller des Kits, der für die jeweilige Prozedur verwendet wurde. PCR wurde mit Pwo-Polymerase durchgeführt, wie vom Hersteller beschrieben wird (Boehringer Mannheim, Laval, PQ). Restriktionsenzyme und Enzyme für die DNA-Modifikation wurden von New England Biolabs LTD., Mississauga, Ont. bezogen. Qiaprep-Säulen waren von Qiagen Inc., Chatsworth CA, USA. Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem automatisierten DNA-Sequenzierer von Applied Biosystems (Montreal PQ)-Modell 370 A, durchgeführt, unter Verwendung des Sequenzierkits des Herstellers.
Klonieren und Sequenzieren der Sialyltransferase aus N. meningitidis – Die Genombank wurde unter Verwendung von 3 bis 5 kb-Fragmenten einer teilweisen HaeIII-Verdauung der chromosomalen DNA von N. meningitidis MC58 in λZAPII (Stratagene, La Jolla CA) als Vektor hergestellt (Jennings, M. P., et al. (1995) Mol. Micobiol. 18, 729–740). Die λZAPII-Bank wurde bei niedriger Dichte ausplattiert, und 3600 in Vertiefungen isolierte Plaques wurden in Pools von 100 ausgewählt. Phagensuspensionen wurden wie vorher beschrieben hergestellt (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N. Y.) und dazu verwendet, 1,5 ml Kulturen von E. coli XL1-Blue zu infizieren (in LB-Medium mit 0,2 Maltose, 10 mM MgSO₄ und 2 mM IPTG), die 4,5 Stunden gezüchtet wurden. Es wurde bis zu 1% Toluol zugesetzt, und die Zellen wurden dann auf Sialyltransferase-Aktivität untersucht, wie unten beschrieben wird. Die positiven Pools wurden ausplattiert, und danach wurden Plaques in Pools von 5 ausgewählt, und wiederum auf Aktivität untersucht. Positive Pools von 5 wurden dann dazu verwendet, individuelle Klone zu isolieren, die Sialyltransferase-Aktivität exprimierten. Phagemide, die das Sialyltransferase-Gen enthielten, wurden aus den positiven λZAPII-Klonen ausgeschnitten, und zwar unter Verwendung des ExAssist-Helferphagen und der SOLR E. coli-Stammes, wie vom Lieferanten Stratagene beschrieben wird. Die DNA-Sequenz für den 2,1 kb-Insert von pNST-01 wurde bestimmt, und PCR-Primer auf der Basis dieser Sequenz wurden dazu verwendet, die Gene aus DNA zu vervielfältigen, die hergestellt worden war aus N. meningitidis 406Y, M982B und N. gonorrhoeae F62. Die Primersequenzen waren der 5'-Primer SIALM-5F (nt 540-569 in NST-01-Insertsequenz, die NdeI-Stelle ist in kursiver Schrift gezeigt) 45 mer 5' C TTA GGA GGT CAT ATG TTC AAT TTG TCG GAA TGG AGT TTT AGG 3', und der 3'-Primer SIALM-16R (nt 1685-1658 der NST-01-Insertsequenz, die SalI-Stelle ist kursiv gezeigt) 42 mer: 5'CC TAG GTC GAC TCA TTA ATT TTT ATC GTC AAA TGT CAA AAT C3'.
Nachweis der Sialyltransferase durch Western Blotting – Das Genprodukt wurde in E. coli dadurch entdeckt, daß man zuerst ein Plasmid konstruierte, das aus dem ersten ORF aus pNST-01 bestand, und dem Peptid-tag für eine Immundetektion mit anti-c-myc-Antikörper, wie vorher beschrieben (MacKenzie, R. C., et al. (1994) Biol. Technology 12, 390–395). Dieses Konstrukt wurde unter Verwendung der folgenden Primer für die PCR-Vervielfältigung hergestellt, 5'-Endprimer war der Standard M13 "Revers"-Primer, und 3'-Endprimer SIALM-18R: (SalI-Stelle in kursiv, und der c-myc-tag in fett) 5'CC TAG GTC GAC TAC TTA GTT CAG GCT TTC TTC GCT GAT CAG TTT TTG TTC ATT TTT ATC GTC AAA TGT CAA AAT CGG G3' 78-MER. Das PCR-Produkt wurde in dem Vektor pT7-7 (Tabor, S. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1074–1078) kloniert, und die Proteinexpression wurde dann mit IPTG induziert. Western Blotting wurde durchgeführt wie vorher beschrieben (MacKenzie, R. C., et al. (1994) Biol. Technology 12, 390–395).
Messung der Sialyltransferase-Aktivität – Die Sialyltransferase-Aktivität von N. meningitidis MC58L3, 406Y L3 und M982B L7 und die E. coli mit pNST-Plasmiden wurden in Toluol behandelten Zellen oder zellfreien Extrakten, die wie bereits beschrieben hergestellt worden waren, gemessen (Wakarchuk et al. (1996), J. Biol. Chem. im Druck). Akzeptoren wurden von Aminophenylglycosiden abgeleitet, die mit 6(5-Fluorescein-carboxamido)-hexansäurebernsteinsäureester (FCHASE) umgesetzt worden waren, und sie wurden wie bereits beschrieben hergestellt (Wakarchuk et al. (1996), J. Biol. Chem., im Druck). Die Reaktionen auf das Enzym wurden durchgeführt bei 37°C in 20 μl MES-Puffer, 50 mM pH 6,0, 10 mM MnCl₂, mit 0,2 oder 1,0 mM markiertem Akzeptor, 0,2 mM CMP-Neu5Ac-Donor und unterschiedlichen Enzymmengen, entweder aus rohen bakteriellen Extrakten oder aus Extrakten von rekombinantem E. coli mit dem klonierten Gen. Die rekombinanten Enzyme wurden für 10 bis 120 Minuten untersucht, während die Extrakte aus N. meningitidis 1 bis 15 h inkubiert wurden. Die Reaktionen wurden dadurch beendet, daß man die Reaktion 1 : 100 mit 10 mM NaOH verdünnte. Diese Proben wurden dann geeignet in Wasser verdünnt, und zwar vor der Analyse mittels Kapillarelektrophorese.
Die Kapillarelektrophorese (CE) wurde durchgeführt mit einem Beckman (Fullerton, CA) P/ACE 5510, ausgerüstet mit einem 3 mW Argon-Ionenlaser induzierten Fluoreszenzdetektor, λ-Anregung = 488 nm, λ-Emission = 520 nm. Die Kapillare war reines Siliciumdioxid 75 μ × 47 cm, mit dem Detektor bei 40 cm. Die Kapillare wurde vor jedem Durchgang durch Waschen mit 0,2 M NaOH für 2 min, Wasser für 2 Minuten und 25 mM Natriumtetraborat, pH 9,4, für 2 Minuten konditioniert. Proben wurden durch Druckinjektion für 2 bis 5 Sekunden injiziert, und die Auftrennung wurde bei 15 kV, 75 μA durchgeführt. Die Peak-Integration wurde mit der Beckman System Gold (Version 8.1)-Software durchgeführt.
Für einen raschen Nachweis einer Enzymaktivität wurden Proben aus der Transferase-Reaktionsmischung durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel-60-TLC-Platten (E. Merck) untersucht. Ein Spot aus 0,5 bis 1,0 μl der Reaktion wurde luftgetrocknet und die Platte wurde mit Ethylacetat/Methanol/Wasser/Essigsäure 7 : 2 : 1 : 0,1 entwickelt. Nach dem Trocknen waren die Akzeptor- und Produktspots zu erkennen, indem man die Platte mit einer 365 nm UV-Lampe bestrahlte. Der Produkt-R_f unter diesen Bedingungen betrug 0,05.
Präparative Sialyltransferase-Reaktionen – Präparative Enzymreaktionen wurden als gekoppelte Enzymreaktionen mit der klonierten N. meningitidis CMP-Neu5Ac-Synthetase durchgeführt.
Die Reaktionen enthielten 25 mm HEPES pH 7,5, 0,2 mM Dithiothreit und 10 mM MgCl₂, 400 mU/ml CMP-Neu5Ac-Synthetase, 300 mU/ml anorganische Pyrophosphatase (Sigma), 1,5 mM CTP, 1,5 mM Neu5Ac, und 50 mU Sialyltransferase (basierend auf FCHASE-Aminophenyl-LacNAc als Akzeptor). Der Akzeptor, FCHASE-Aminophenyl-Lac oder FCHASE-Aminophenyl-LacNAc, wurde in dem Röhrchen unter Vakuum eingetrocknet, und die Reagenzien wurden dann dem Röhrchen zugesetzt; die Konzentration an FCHASE-Aminophenylglycosid in diesen Reaktionen betrug 1 mM. Die Reaktionen wurden bei 30°C für 3 bis 5 h durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das FCHASE-Aminophenylglycosid an eine Sep-Pak C18-Reversphasen-Kassette (Waters) gebunden, durch Waschen mit Wasser entsalzt und dann in 50% Acetonitril eluiert.
Bestimmung der Verknüpfungsspezifität der Sialyltransferase – Das Produkt einer präparativen Sialyltransferasereaktion wurde mittels NMR untersucht. Proben für NMR wurden nach dem TLC-Verfahren hergestellt, und wurden dann dreimal aus D₂O getrocknet, bevor die Spektren aufgenommen wurden. Die Sammlung der NMR-Daten erfolgte mit einem Bruker AMX 500-Spektrometer. Die Spektren wurden bei 540 K in 5 mm-Röhrchen bei einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 mg FCHASE-Aminophenylglycosid in 0,5 ml D₂O aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen der Protonen in D₂O sind relativ auf das HOD-Signal ausgedrückt (4,348 bei 340 K).
Ergebnisse
Nachweis und Charakterisierung einer α-2,3-Sialyltransferase-Aktivität aus N. meningitidis – Der ursprüngliche Teil dieser Arbeit wurde mit dem N. meningitidis-Stamm 406Y L3 durchgeführt, der ein LOS aufweist, das mit dem des Stammes MC58 identisch ist, jedoch einen unterschiedlichen Kapseltyp aufweist. Beide genannten Stämme bringen den L3-Immunotyp LOS hervor, der aus einem Lacto-N-neotetraose-Zweig mit einer α-2,3-Sialinsäure am terminalen Galactose-Rest besteht (Pavilak, V., et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 141146–14152). Beide genannten Stämme erzeugten leicht nachweisbare Mengen an α-2,3-Sialyltransferase, selbst wenn man nur eine einzelne Kolonie (107 Zellen) mit dem Assay auf CE-Basis verwendete. Ein Rohextrakt aus N. meningitidis 406Y L3 wurde dazu verwendet, um Material zur Bestimmung der Verknüpfung des Sialosids, das synthetisiert wird, herzustellen, und das Enzym wurde durch NMR seines Produkts als eine β-Galactosid-α-2,3-sialyltransferase verifiziert. Mit Hilfe des kompletten ¹H wurde eine Zuordnung der Verbindungen durchgeführt. Es wurde gefunden, daß die chemischen ¹H-Verschiebungen denjenigen von veröffentlichten Strukturen ähnlich waren, die α-2,3-Sialyl-Gal-Strukturen enthielten (Pavliak, V., et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 14146–14152). Es wurde ferner ein NOE längs der glycosidischen Bindung H₃-Sialinsäure nach H₃ Gal beobachtet, und eine Long-Range-Kopplung von C₂-Sialinsäure zu H₃ von Gal bestätigte, daß die α-2,3-Sialyl-Gal-Bindung vorhanden war.
Eine Variation der Reaktionsbedingungen zeigte, daß das Enzym ein pH-Optimum von 6,0 aufwies, und die Aktivität wurde durch Zugabe von entweder 10 mM MgCl₂ 2-fach stimuliert oder von 10 mM MnCl₂ 3-fach stimuliert. Es bestehen jedoch keine stringenten Metallanforderungen, da es in Gegenwart von 5 mM EDTA aktiv war. Diese gleichen Bedingungen waren auch für das Enzym aus Rohextrakten von MC58, 406Y und für die rekombinanten Enzyme aus MC58 optimal. Das natürliche Enzym war überwiegend mit der Zellmembranfraktion assoziiert (86% im Zellmembranpellet nach einer Zentrifugation bei 100 000 × g). Es war jedoch für die Aktivität kein Detergenz erforderlich, und viele der üblichen Detergenzien, die geprüft wurden, inhibierten stattdessen das Enzym, mit der Ausnahme von Triton X-100 bis zu 0,2%. Unter Verwendung dieses Verfahrens konnte in M982B L7-Zellen keine Aktivität nachgewiesen werden.
Klonieren und Sequenzieren des Sialyltransferase-Gens aus N. meningitidis MC58 – Unter Verwendung des CE-LIF-Assays beobachteten wir eine Sialyltransferase-Aktivität bei einem von fünf Malen, wenn wir eine 2 ml IPTG-induzierte E. coli XL1-Blue-Kultur mit 1000 pfu aus der N. meningitidis MC58-Genombank in λZAPII (1) infizierten. Die Bildung des Produktpeaks in dem Elektropherogramm erforderte die Zugabe von CMP-Neu5Ac, und er wanderte in gleicher Weise wie der Sialidase-empfindliche Produktpeak, der durch das natürliche Enzym gebildet wurde. Der Peak in dem CE-Elektropherogramm entspricht 20 Attomol (2 × 10^–17 mol) an Produkt. Einzelne Klone, die die Sialyltransferase exprimierten, wurden nach einer "Teile und Herrsche"-Strategie erhalten, indem man nacheinander Pools aus 100 pfu aus λZAPII-Bank von MC58 screente, Pools von 5 pfu, die aus dem ersten positiven Pool erhalten wurden, und schließlich wurden bei geringer Dichte individuelle Plaques plattiert. Das ursprüngliche Screening lieferte zwei positive Pools von 100 pfu aus insgesamt 36. Aus einem dieser Pools wurden 60 Pools von 5 pfu gescreent, und es wurden 3 positive Pools erhalten. Aus den positiven Pools der 5 pfu wurden viele individuelle positive Klone erhalten, und es zeigte sich, daß die daraus ausgeschnittenen pBluescript SK-Phagemide ein 2,1 kb-Insert trugen.
Der 2,0 kb-Insert wurde an beiden Strängen sequenziert (GenBank Accession No. U60660), und es wurde in GENEBANK eine BLASTX-Recherche durchgeführt, um irgendeine Homologie mit vorher sequenzierten Genen zu identifizieren. Die Analyse lieferte zwei partielle ORF (nt 1–141 und nt 1825–2039), die an gegenüberliegenden Enden des 2,1 kb Inserts angeordnet waren, die eindeutig homolog mit verschiedenen bakteriellen Isocitrat-Dehydrogenasen (60–85% Identität) bzw. verschiedenen bakteriellen Cytochrom c'-Proteinen waren. Ein dritter ORF (nt 573–1685) wurde als lst (Lipooligosaccharid-Sialyltransferase) bezeichnet und zeigte eine signifikante Homologie mit einem Haemophilus influenzae-Gen, das als lsg-ORF2 bezeichnet wurde (Genbank Accession No. M94855). Eine paarweise Ausrichtung der Translationsprodukte von lsg und lsg-ORF2 zeigte, daß ihre aa-Sequenzen 29,3% Identität und 56,3% Ähnlichkeit teilen.
Das lst-Genprodukt hat zwei potentielle Startcodons. Dabei ist es wahrscheinlicher, daß das zweite verwendet wird, da die diesem Startcodon unmittelbar folgende Sequenz eine nicht-spaltbare Leader-Sequenz zu sein schein (Nakai, K., et al. (1991) Proteins: Structure, function and genetics 11, 95–110), und stromauf eine potentiell sehr gute Ribosomen-Bindungsstelle (AG-GGA) auftritt.
Ein Vergleich von Sialyltransferase-Genen aus unterschiedlichen N. meningitidis-Isolaten und N. gonorrhoeae – Die Isolation von Genen aus N. meningitidis 406Y L3 (GenBank U60661, SEQ ID NO: 1 und 2), M982B L7 (GenBank U60663) und N. gonorrhoeae F62 (GenBank U60664, SEQ ID NO: 3 und 4) wurde mit PCR-Primern auf der Basis des Gens aus MC58 L3 (GenBank U60660) bewirkt. Es wurden 12 Basenunterschiede festgestellt, was zu 5 Aminosäureunterschieden zwischen den beiden Genen aus den L3-Immunotyp-Stämmen führte, und 19 Unterschieden im Gen aus M982BL7 im Vergleich mit MC58, und 12 Unterschieden in der M982BL7-Sequenz verglichen mit der von 406Y L3. Das Gen aus M982B L7 enthält eine Frameshift-Mutation an nt. 454 und wird folglich für ein Rumpfprotein aus nur 151 Aminosäuren codieren.
Das Gen aus N. gonorrhoeae F62 (SEQ ID NO: 3) zeigte 61 nt. Unterschiede, verglichen mit dem N. meningitidis MC58, 62 nt Unterschiede, verglichen mit den 406Y L3-Gen, und 66 verglichen mit dem M982B L7-Gen. Die Unterschiede in der DNA-Sequenz des N. gonorrhoeae F62-Gens führen zu 16 oder 17 Aminosäureunterschieden im Protein, wenn man mit MC58 L3 bzw. 406Y L3 vergleicht.
Expression des Sialyltransferase-Gens – Die Enzym- aktivität in E. coli, die die pNST-Plasmide tragen, war leicht nachzuweisen, und diese Expression des lst-Gens hing ab von dem aus dem Vektor stammenden lac-Promotor, da keine Enzymaktivität nachweisbar war, wenn die Orientierung des Gens invertiert war. Es gab eine wenigstens 30-fach stärkere Enzymaktivität aus den pNST0-01-enthaltenden Klonen, verglichen mit N. meningitidis L3-Stämmen. Die Expression des lst-Gens war jedoch nicht hoch genug, um einen einfachen Nachweis eines überexprimierten Proteins durch SDS-PAGE-Analyse zu erlauben. Es wurde daher ein Plasmid konstruiert, um einen c-myc-Immunnachweis-Peptid-tag am C-Terminus des Proteins einzuführen. Wenn dieses Plasmid verwendet wurde, um das lst-Gen zu exprimieren, konnten wir ein immunreaktives Protein mit einer Mr von 41 000 nachweisen, das geringfügig kürzer ist als die vorausgesagte Größe des lst-Genprodukts. Wir beobachteten ferner, daß das rekombinante Enzym überwiegend (76%) in der löslichen Fraktion der Zellextrake vorlag, im Gegensatz zu der Situation, die bei den N. meningitidis-Extrakten erhalten worden war.
Akzeptorspezifität der lst-Sialyltransferase – Der natürliche Akzeptor für dieses Enzym ist eine terminale N-Acetyllactosamin-Sequenz am Lacto-N-neotetraose-Zweig des LOS aus L3-Immunotypen. Wir fanden, daß das Enzym die folgenden synthetischen Saccharide als Akzeptoren verwenden würde: FCHASE-Aminophenyl-LacNAc, FCHASE-Aminophenyl-Lac und FCHASE-Aminophenyl-Gal, bei Aktivitätsverhältnissen 1 : 0,29 : 0,03.
Diskussion
Die Verfügbarkeit eines hochsensitiven Enzymassays war wesentlich dafür, ein Screening auf Klone durchführen zu können, die die N. meningitidis α-2,3-Sialyltransferase exprimieren. Der Assay nutzt einen Glycosyltransferase- Akzeptor, der leicht zu synthetisieren ist, und er benötigt keine speziell konstruierte CE-Ausrüstung, wie vorher für den ultrasensitiven Nachweis von Glycosyltransferase-Reaktionen beschrieben wurde (Zhao, J. Y., et al. (1994) Glycobiol. 4, 239–242). Die in dieser Studie verwendeten Akzeptoren wurden aus verbreitet verfügbaren Glycosiden hergestellt, und die verwendeten Fluorophore und die CE-Ausrüstung war kommerziell erhältlich. Wir waren in der Lage, zuverlässig Attomol (10^–18 mol)-Mengen von Reaktionsprodukten nachzuweisen, was mehr als adequat für ein Screening auf α-2,3-Sialyltransferase-Expression war.
Das lst-Gen aus MC58 L3 tritt zwischen zwei Genen auf, die nichts mit der LOS-Synthese zu haben, Isocitrat-Dehydrogenase und Cytochrome c', und es ist kein Teil eines LOS-Syntheseoperons, anders als andere N. meningitidis-LOS-Glycosyltransferasen (Jennings, M. P. et al. (1995) Mol. Microbiol. 18, 729–740). Das ist der Situation bei der E. coli und N. meningitidis α-2,8-Polysialyltransferase ähnlich, die an der Kapselbiosynthese beteiligt ist, obwohl diese Gene der CMP-Neu5Ac-Synthetase benachbart sind (Ganguli, S. et al. (1994) J. Bacteriol. 176, 4583–9). Es ist interessant zu spekulieren, daß das lst-Gen allein aufgrund irgendeiner Art eines Transpositionsereignisses gefunden wird, obwohl wir keinen Beweis für Insertionselemente oder Transposon-ähnliche Sequenzen haben, die das Gen flankieren. Eine Sequenzanalyse und Datenbasis-Vergleiche zeigten, daß diese Gen sich sowohl von der Säugetier α-2,8-Sialyltransferase-Familie unterscheidet als auch von der bakteriellen α-2,8-Sialyltransferase-Familie, und den bakteriellen 3-Desoxy-α-mannooctulosonsäure-Transferasen, die einen verwandten Zucker auch von einem CMP-Donor übertragen. Es wurde jedoch gezeigt, daß das lsg-Gen den lsg-02-Genprodukt aus H. Influenzae ähnlich war. Obwohl für lsy-ORF2 gezeigt wurde, daß es an der LOS-Biosynthese beteiligt ist, kann dieses jedoch möglicherweise nicht für eine α-2,3-Sialyltransferase codieren, da berichtet wurde, daß es an der Expression eines Gal-GlcNAc-LOS-Epitops beteiligt ist (McLaughlin, R. et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 6455–6459). Für das Klonieren des N. gonorrhoeae-Gens wurde der F62-Stamm verwendet, da er als beiden Spezies gemeinsam nachgewiesen wurde (Jennings, M. P., et al. (1995), Mol. Microbial. 18, 729–740). Eine Prüfung des Gens, das sich von N. gonorrhoeae F62 ableitet, zeigt nur eine geringe Anzahl von Unterschieden, was ähnlich anderen LOS-Biosynthesegen-Vergleichen von N. Meningitidis und N. gonorrhoeae ist (Jennings, M. P. et al. (1995) Mol. Microbial. 18, 729–740).
Das Protein, für das das lst-Gen codiert, scheint ein nicht-spaltbares Signalpeptid aufzuweisen, und computerunterstützte Voraussageprogramme suggerieren, daß die Sialyltransferase ein integrales Protein der inneren Membran ist. Die Originalarbeiten, die die Sialyltransferase-Aktivität von sowohl N. meningitidis und N. gonorrhoeae beschreiben, suggerieren, daß die ST ein äußeres Membranprotein wäre, und zwar deshalb, weil die Enzymaktivität durch eine Triton X-100-Extraktion aus ganzen Zellen extrahiert wird (Mandrell, R. E., et al. (1993), Microb. Pathog. 14, 315–327; Mandrell, R. E., et al. (1993) Microb. Pathog. 14, 315–327). Wir haben beobachtet, daß die Aktivität von N. meningitidis-Extrakten eine Assoziation der Aktivität mit der Membranfraktion aufweist, daß jedoch bei E. coli die Aktivität überwiegend löslich zu sein scheint.
Daß dieses Gen bei der Sialylierung von LOS funktioniert, wird aus einer Untersuchung von N. meningitidis M982B L7 geschlossen, das ein natürlicher Sialyltransferase-Mutant zu sein scheint. Das Sialyltransferase-Gen, das aus diesem L7-Stamm erhalten wurde, enthält eine Frame-Shift-Mutation bei nt. 454, die es in dem rekombinanten Plasmid, das es trägt, inaktiv macht, was mit unserer Beobachtung übereinstimmt, das in M982B-Zellen keine Sialyltransferase-Aktivität nachweisbar ist. Dieser Stamm erzeugt die gleiche Lacto-N- neotetraose wie die L3-Stämme, sialyliert jedoch seine LOS nicht. Die Akzeptorspezifität für das L3-Enzym gegenüber synthetischen Akzeptoren zeigt eine starke Präferenz für N-Acetyllactosamin gegen Lactose oder Galactose. Ferner wurde das Reaktionsprodukt unter Verwendung von Enzym aus N. meningitidis und FCHASE-LacNAc-Akzeptor unzweideutig durch NMR als FCHASE-α-2,3-Sialyl-acetyllactosamin bestimmt.
Der Expressionsgrad des rekombinanten Gens beträgt 50 bis 100 U pro Liter Kultur, basierend auf Assays mit dem FCHASE-Lac-Nac-Akzeptor.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt Versuche, die die Struktur und Spezifität der rekombinanten α-2,3-Sialyltransferase aus Neisseria meningitidis weiter untersuchen.
Experimentelle Arbeitsweise
Grundlegende Verfahren für rekombinante DNA – Die Plasmid-DNA-Isolierung, die Restriktionsenzym-Verdauungen, die Reinigung von DNA-Fragmenten für das Klonieren für Verknüpfungen, Transformationen und DNA-Sequenzieren wurden so durchgeführt, wie von dem Enzym-Lieferanten empfohlen wird, oder vom Hersteller des Kits, der für die jeweilige Prozedur verwendet wurde. PCR wurde mit Pwo-Polymerase durchgeführt, wie vom Hersteller beschrieben wird (Boehringer Mannheim Laval, PQ). Restriktionsenzyme und Enzyme für die DNA-Modifikation wurden von New England Biolabs LTD., Mississauga, Ont. bezogen.
Proteinanalyse – Die Proteinkonzentratiοn wurde unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kits von Pierce (Rockford, IL) bestimmt. SDS-PAGE und Western-Blotting-Analyse von Proteinen, die auf PVDF-Membranen übertragen worden waren, wurde wie bereits oben beschrieben durchgeführt, außer daß der primäre Antikörper von Invitrogen (San Diego, CA) war.
Konstruktion des Expressionsplasmids – Das vollständige N. meningitidis α-2,3-Sialyltransferase-Gen wie auch eine 0,57 kb Stromauf-Sequenz wurden unter Verwendung des Standard M13 "Revers"-Primers als 3'-Primer und von SIALM-17R als 5'-Primer vervielfältige (63-mer: 5'CCTAG-GTCGACTCATTAGTGGTGATGGTGGTGATGATTTTTATCGTCAAATGTCAAAATCGGG-3'; SalI-Stelle ist in fetten Kursivbuchstaben gezeigt; die Sequenz, die für His₆-Schwanz codiert, ist unterstrichen) sowie mit pNST-01 als Matrize. Das Plasmid pNST-18 wurde dadurch konstruiert, daß man das PCR-Produkt mit EcoRI und SalI verdaute und in eine modifizierte Version von pcWori+ (16) klonierte, in dem das lacZα-Genfragment entfernt wurde.
Herstellung und Reinigung der α-2,3-Sialyltransferase – Eine Kultur von E. coli BMH71-18/pNST-18 wurde dazu verwendet, eine 1 l-Kultur zu beimpfen, die Luria-Bouillonmedium (10 g Trypton, 5 g NaCl und 10 g Hefeextrakt pro Liter) mit 150 mg/l Ampicillin enthielt. Die 1 l-Kultur ließ man über Nacht bei 37°C wachsen und verwendete sie, 20 l Terrific-Bouillonmedium zu inokulieren (16 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4 und 0,8% Glycerin pro Liter), das 150 mg/l Ampicillin enthielt. Die 21 l-Kultur ließ man bei 30°C in einem 28 l-New Brunswick-Scientific (Edison, NJ)-Fermenter (Modell MF 128S) wachsen, bis A₅₀₀ = 0,55, und wurde dann mit 0,5 mM IPTG induziert. Nach 17 Stunden wurden die Zellen gesammelt, durch Ultrafiltration konzentriert, mit 0,85% NaCl gewaschen und zentrifugiert. Die Zellpaste (12 g Naßgewicht) wurde in 60 ml von 20 mM Tris pH 8 resuspendiert, und es wurden Zellextrakte hergestellt, indem man einen Avestin C5-Emulsiflex-Zellzerstörer (Avestin, Ottawa, Ont.) verwendete. Ein Proteasen-Inhibitor-Cocktail (Complete^TM von Boehringer Mannheim) wurde dem Extrakt zugesetzt, der zweimal bei 20 000 xg (r_max) 30 min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde 1 h bei 205 800 × g (r_max) zentrifugiert, und das Pellet wurde in 10 mM HEPES pH 7, 0,5 m NaCl und 0,2% Triton-X-100 resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde 2 h bei 4°C gerührt und 1 h bei 205 800 × g re-zentrifugiert. Der Überstand wurde auf zwei 5 ml HiTrap-Chelatisierkolonnen (Pharmacia Biotech), die mit Ni²⁺ beladen waren, aufgegeben, wobei die maximale Belastung 25 mg Totalprotein bei jeden Durchgang betrug. Die Säulen wurden mit einem 60 bis 800 mM-Imidazol-Gradienten in 10 mM HEPES (pH 7) entwickelt, der 0,5 M NaCl und 0,2% Triton X-100 enthielt.
Primäre Sequenzanalyse der α-2,3-Sialyltransferase – Gereinigte α-2,3-Sialyltransferase, 500 Lg, wurde in 6 M Guanidinium-HCl, 100 mM Tris pH 8,3 aufgelöst, mit DTT reduziert (5 Äquivalent/mol Proteinthiol) und mit Iodessigsäure (10 Äquivalent/mol Proteinthiol) S-carboxymethyliert. Die Reaktionsmischung wurde dann gründlich gegen Wasser dialysiert. Es wurde eine automatisierte Gasphasen-Aminosäuresequenzierung auf einem Applied-Biosystems (Foster City, CA) Protein-Sequenziersystem durchgeführt, das einen Gasphasensequenzer vom Modell 470A beinhaltete, ausgerüstet mit einem On-line-Modell 120A PTH-Analysator unter der Kontrolle eines Modell 900A-Kontroll- und Datenanalyse-Moduls. Für die Spaltung mittels CNBr wurden 100 μg S-carboxymethylierte α-2,3-Sialyltransferase in 500 μl 88%ige (v/v) Ameisensäure gelöst, gefolgt von der Zugabe von 50 μg CNBr. Die Reaktionsampulle wurde mit Argon gespült, verschlossen und in der Dunkeheit 24 Stunden inkubiert. Für den Trypsin-Verdau wurden 100 μg S-carboxymethylierter α-2,3-Sialyltransferase in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, gelöst. Trypsin von Sequenzierqualität (Boehringer Mannheim) wurde in einem 1 : 100 (w/w)-Verhältnis zugesetzt, und diese Mischung wurde 3 h bei 37°C inkubiert, wonach die Zugabe von Trypsin und die Inkubation wiederholt wurde. Die gefriergetrockneten tryptischen und CNBr-Spaltprodukte wurden in 50 μl 0,1% Trifluoressigsäure aufgelöst, und über eine Synchropack 1 mm × 10 cm RP-8 HPLC-Säule (Keystone Scientific Inc., Bellefonte, PA) unter Verwendung eines 0–90% Acetonitril-Gradienten in 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure fraktioniert. Massenanalyse wurde durch direkte Infusion der HPLC-Ausflusses in ein Fisons-Instruments (Manchester, U. K.) VG-Elektrospray-Quattro-Triple-Quadrupole-Massenspektrometer mit einem Massenbereich von 3500 amu/e durchgeführt.
Messung der Sialyltransferase-Aktivität und Untersuchung von Oligosaccharid-Akzeptoren – FCHASE-markierte Oligosaccharide wurden wie oben beschrieben hergestellt, währen die APTS-markierten Oligosaccharide durch reduktive Aminierung von reduzierenden Sacchariden nach dem Verfahren hergestellt wurden, das beschrieben wird von Guttman et al. (Anal. Biochem. 233: 234 (1996)). Der Gal-β-APTS-Akzeptor leitete sich vom Markieren von Lactose ab; der Gal-α-APTS-Akzeptor leitete sich von einer Markierung von Melibiose ab; und der N-Acetyllactosamin (LacNAc)-Akzeptor wurde durch APTS-Markierung von Chirobiose hergestellt, gefolgt von einer enzymatischen Modifizierung mit boviner β-Galactosyltransferase, umd die LacNAc-Einheit herzustellen; der Gal-α-1,4-Gal-β-Akzeptor wurde enzymatisch aus β-Gal-APTS mit Hilfe der α-1,4-Galactosyltransferase aus N. meningitidis synthetisiert. Alle Produkte der reduktiven Aminierung wurden durch Gelpermeationschromatographie über Toyopearl HW40F (Sigma-Aldrich), 1,5 cm × 15 cm Säule gereinigt, wobei Wasser als Elutionsmittel verwendet wurde. Es ist zu erwähnen, daß bei all diesen Molekülen der terminale reduzierende Zucker während des Markierungsprozesses ringgeöffnet wurde. APTS-Saccharide wurden unter Messung des A₄₅₅ quantifiziert, und unter Verwendung eines Extinktionskoeffienten von 17160 M^–1 cm^–1. Die TMR-markierten Oligosaccharide wurden hergestellt, wie von Zhao et al. (1994) Glycobiology 4: 239–242 beschrieben ist. Für die TMR-markierten Akzeptoren nutzten wir einen Extinktionskoeffizienten von 80 000 M^–1 cm^–1 zur Quantifizierung. Die Sialyltransferase-Aktivität wurde routinemäßig unter Verwendung von 0,5 mM FCHASE-N-Acetyllactosamin als Akzeptor und unter den oben beschriebenen Assay-Bedingungen gemessen. Für die Messung von K_m und k_cat-Werten wurden Assays mit den APTS-markierten Sacchariden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Assays wurden überwacht, so daß für alle Akzeptorkonzentrationen nicht mehr als 10% Umwandlung zum Produkt eintrat. Die Bereiche der Akzeptor- und Donor-Konzentrationen wurden empirisch bestimmt, und dann wurde ein Bereich, der 0,2 K_m bis 5 K_m überspannte, dazu verwendet, um die Werte zu erhalten. Die Daten wurden unter Verwendung der Grafit^TM 3,0-Software-Package (Erithacus Software, London, UK) untersucht.
Die Reaktionsmischungen aus den FCHASE- und APTS-markierten Akzeptoren wurden mittels Kapillarelektrophorese analysiert, die mit Beckman Instruments (Fullerton, CA) P/ACE 5510 durchgeführt wurde, das mit 3 mW Argon-Ionenlaser induziertem Fluoreszenzdetektor ausgerüstet war, λ-Anregung = 488 nm, λ-Emission = 520 nm. Die Kapillare bestand aus reinem Siliciumdioxid 75 μ × 57 cm, mit dem Detektor bei 50 cm. Die Kapillare wurde vor jedem Durchgang durch Waschen mit 0,2 M NaOH für 2 min, Wasser für 2 min und entweder 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, oder Natriumtetraborat, pH 9,3, 2 min, konditioniert. Proben wurden durch Druckinjektion für 2 bis 5 Sekunden eingeführt, und die Trennung wurde bei 18 kV, 75 μA durchgeführt. Die Peakintegration wurde mit der Beckman-PACE-Station-Software (Version 1) durchgeführt.
Die Reaktionsmischungen der TMR-markierten Akzeptoren wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel-60-TLC-Platten (Merck) analysiert, unter Verwendung von Isopropanol/1-Butanol/0,1 M HCl (2 : 1 : 1) als Lösemittel für die Entwicklung und einer 365 nm UV-Lampe für den Nachweis der Produkte.
Sialylierung von FCHASE-Thio-N-acetyllactosamin mit N-Acetyl-, N-Propionyl- und N-Glycolyl-Neuraminsäure – Die 50 μl-Reaktionsmischungen enthielten 0,8 mM Akzeptor und 2 mM von entweder Neu5Ac, Neu5Gc oder Neu5Pr, in 100 mM Tris pH 7,5, 0,2 mM DTT, 10 mM MgCl₂, mM CTP, mit 50 mU anorganischer Pyrophosphatase (Sigma). 48 mU CMP-Neu5Ac-Synthetase, 5 mU gereinigte α-2,3-Sialyltransferase. Die Reaktionsmischungen wurden bei 32°C 90 min inkubiert, und die Produktbildung wurde mittels TLC-Analyse verfolgt. Die Massen der sialylierten Produkte wurden im negativen Iοnenmodus an einem VG Quattrotriple-Quadrupole-Massenspektrometer (Fisons Instruments) gemessen.
Präparative Synthese von Neu5Ac-α-(2→3)-Gal-α-(1→4)-Gal-β-FCHASE – Eine 1,2 ml Reaktionsmischung, die zusammengesetzt war aus 1,48 mM FCHASE-Lac, 2,0 mM, UDP-Gal, in 50 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM MuCl₂, 5 mM DTT und 3 U (1 mg) α-1,4-Glycosyltransferase aus N. meningitidis, wurden bei Raumtemperatur 80 Minuten inkubiert, wonach zu dieser Zeit die Reaktion gemäß TLC vollständig zu sein schien (Wakarchuk, et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 19166–19173). Die Reaktionsmischung wurde dann mit Wasser auf 20 ml verdünnt und durch SepPak C-18 Umkehrphasenchromatographie entsalzt. Das Produkt wurde in 50% Acetonitril eluiert und zur Trockene eingedampft. Die α-2,3-Sialyltransferase-Reaktion wurden in 1 ml von 2,4 mM FCHASE-Lac-Gal, 5 mM CTP, 5 mM Neu5Ac, in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 0,2 mM DTT und 0,1% Triton x-100 mit 0,5 U α-2,3-Sialyltransferase (Triton X-100-Extrakt aus der E. coli-Membranpräparation) und 2,5 U CMP-Neu5Ac-Synthetase durchgeführt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, und man ließ sie 2 Stunden ablaufen, nach welchen Zeitpunkt die Reaktion abzentrifugiert wurde, um einen Niederschlag zu entfernen, und es wurden weitere 0,5 U α-2,3-Sialyltransferase zugesetzt, und man ließ die Reaktion über Nacht stehen. Das Produkt wurde wiederum durch SepPak-Chromatographie isoliert und wie oben beschrieben durch präparative TLC gereinigt (Wakarchuk, W. W. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 19166–19173). Das Material wurde in D₂O ausgetauscht und mittels NMR-Spektroskopie zur Strukturanalyse untersucht.
NMR-Daten wurden auf einem Bruker AMX 500-Spektrometer unter Verwendung von Standard-Bruker-Software aufgenommen, wie bereits beschrieben (Wakarchuk, W. W. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 19166–19173). Ein Teil der NMR-Probe wurde für eine Methylierungsanalyse verwendet. Das lyophilisierte Material wurde mit Iodmethan in Dimethylsulfoxid methyliert, das einen Überschuß Kalium(methylsuccinyl)methanid enthielt, wie bereits beschrieben (20), während man in der Hydrolysestufe 2 M Trifluoressigsäure verwendete.
Ergebnisse
Herstellung und Reinigung der α-2,3-Sialyltransferase – Die N. meningitidis α-2,3-Sialyltransferase wurde in E. coli überexprimiert, unter Verwendung eines Konstrukts (pNST-18), das 0,57 kb der ursprünglichen Stromaufsequenz, das vollständige Strukturgen und eine 5'-Sequenz enthielt, die für einen His₆-Schwanz codierte. Eine Deletion 0,57 kb-Stromaufsequenz verminderte die Produktion von α-2,3-Sialyltransferase um wenigstens 90% (Daten nicht gezeigt), weshalb folglich diese Sequenz für die Überexprimierung vorgesehen wurde, obwohl die Gründe für diesen Effekt nicht untersucht wurden. Eine 21 l-Kultur von E. coli BMH71-18 führte zu einer Produktion von 750 U/l nach 17 Stunden nach IPTG-Induktion. Wenn Zellhomogenisate mittels einer Folge von 20 000 × g und 205 800 × g Zentrifugationen fraktioniert wurden, wurden 45% der α-2,3-Sialyltransferase-Aktivität in dem 20 000 × g Pellet gefunden, und 50% der Aktivität wurden in dem 205 800 × g Pellet gefunden, und weniger als 5% der Aktivität wurden in dem Überstand der 205 800 × g gefunden. Analyse durch SDS-PAGE (1), gefolgt von einem Nachweis mit einem Anti-His₆-Antikörper, bestätigte, daß die α-2,3-Sialyltransferase mit den Membranen assoziiert war (205 800 × g Pellet) und weniger mit der löslichen Fraktion des Extrakts (205 800 × g Überstand).
Unter Verwendung von Puffern, die 0,2% Triton X-100 enthielten, konnten wir 60 bis 70% der Aktivität extrahieren, die mit den Membranen assoziiert war. SDS-PAGE-Analyse, gefolgt von einer Scanning-Densitrometrie des Coomassie-angefärbten Gels zeigte, daß die α-2,3-Sialyltransferase 35% des Gesamtproteins in dem Triton X-100-Extrakt (1) repräsentierte. Daraus errechneten wir eine Gesamtmenge an α-2,3-Sialyltransferase in dem Extrakt von 1 l Kultur als etwa 250 mg. Der Triton X-100-Extrakt wurde auf eine IMAC-Säule gegeben, und die α-2,3-Sialyltransferase eluierte in den Fraktionen, die zwischen 400 und 550 mM Imidazol enthielten. Die gereinigte α-2,3-Sialyltransferase wies eine spezifische Aktivität von 1,44 U/mg auf, und die gesamte Reinigungsausbeute betrug 1,1% (Tabelle 1).
SDS-PAGE-Analyse der gereinigten α-2,3-Sialyltransferase zeigte zwei Banden mit einer scheinbaren molaren Masse von 41 kDa bzw. 83 kDa. Da die abgeleitete Aminosäuresequenz eine Masse von 43,4 kDa voraussagt, wird angenommen, daß die 41 kDa-Form eine monomere Form der α-2,3-Sialyltransferase ist, während die 83 kDa-Form eine dimere Form darstellen würde. Eine Scanning-Densitrometrie des Gels ergab, daß die monomere Form und die dimere Form 90% bzw. 10% des gesamten gereinigten Proteins ausmachten. Beide Banden wurden mit Hilfe des Anti-His₆-Antikörpers nachgewiesen, und sie waren beide aktiv, wenn man entsprechende ungefärbte Teile des Gens ausschnitt und in Puffer renaturierte, der 0,2% Triton x-100 und 0,2 mM DTT enthielt. In einigen der Präparationen gab es auch ein schwaches Band eines Materials mit hoher molarer Masse, das so gut wie nicht in das Gel eindrang und das ebenfalls mit dem Anti-His₆-Antikörper reagierte.
Analyse der Primärsequenz der gereinigten α-2,3-Sialyltransferase – Die erhaltene Sequenz stimmte mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2, GenBank U60660) überein. Die Aminosäuresequenz zeigte ferner, daß der Hauptteil der rekombinanten α-2,3-Sialyltransferase einen prozessierten N-Terminus enthielt, da die Hauptsequenz mit dem zweiten Rest (Gly) begann, während eine weniger häufige (jedoch ausgeprägte) Sequenz mit dem N-terminalen Met-Rest begann.
Die reduzierte und S-carboxymethylierte α-2,3-Sialyltransferase wurde ebenfalls unter Verwendung von CNBr (Spaltung von Peptidbindungen angrenzend an Met) und Trypsin (Spaltung von Peptidbindungen angrenzend an Lys und Arg) gespalten. Die Peptide wurden durch LC-ESI-MS analysiert, und die beobachteten Massen wurden mit den Massen einer computer-generierten Liste von allen möglichen Peptiden verglichen, die man entweder durch CNBr- oder Trypsinspaltung erhielt. Die erhaltenen Peptide lieferten 95% der abgeleiteten Aminosäuresequenz und schlossen N-terminale und C-terminale Peptide ein (CB3 und CB14).
Enzymmatische Eigenschaften – Unter Verwendung von entweder FCHASE-LacNac oder APTS-markierten Akzeptoren (2) erhielten wir einen optimalen pH von 6 für die gereinigte α-2,3-Sialyltransferase. Die Aktivität wurde durch die Anwesenheit von 20 mM MgCl₂ dreifach stimuliert, und durch Anwesenheit von 20 mM MuCl₂ 4-fach, obwohl diese Metalle keine essentiellen Faktoren darstellten, da das Enzym selbst in Gegenwart von 5 mM EDTA aktiv war. Obwohl MnCl₂ den besten stimulatorischen Effekt bei einem Kurzzeitassay (5 min) lieferte, wurde die α-2,3-Sialyltransferase in seiner Gegenwart bei Langzeit (> 30 min)-Inkubationen ausgefällt.
Folglich wurde MgCl₂ für präparative Synthesen bevorzugt. DTT hatte keinen Effekt auf die Aktivität, wenn man in dem 1 bis 20 mM-Bereich prüfte. Die Nukleotide CMP und CDP wirkten hemmend, wobei eine Konzentration von 1 mM CMP eine 80%ige Hemmung in einem Standardassay liefert, und CDP eine 40%ige Hemmung bei der gleichen Konzentration lieferte.
Sialylierung von FCHASE-N-Acetyllactosamin mit N-Acetyl-, N-Propionyl- und N-Glycolylneuraminsäure – Die Fähigkeit der α-2,3-Sialyltransferase zur Nutzung anderer Donoren als dem CMP-Neu5Ac wurde unter Anwendung gekoppelter Reaktionen mit der N. meningitidis CMP-Neu5Ac-Synthetase getestet, um Neu5Gc oder Neu5Pr in Gegenwart von CTP zu aktivieren. Eine Kontrollreaktion mit Neu5Ac lieferte eine vollständige Umwandlung des Akzeptors (FCHASE-LacNAc) in 60 min, während die Reaktion mit Neu5Pr 90 min benötigte, um vollständig abzulaufen. Die Reaktion mit Neu5Gc erreichte eine etwa 90%ige Umwandlung nach einer Inkubation von 120 min. Die Produkte wurden mittels Massenspektrometrie analysiert, und die beobachteten Massen lagen innerhalb von 0,1% der erwarteten Massen, was bestätigte, daß in jedem Falle der Akzeptor mit dem erwarteten Sialinsäure-Analogen (Neu5Ac, Neu5Gc oder Neu5Pr) sialyliert worden war.
Prüfung von Oligosaccharid-Akzeptoren für die α-2,3-Sialyltransferase – Die Akzeptorspezifität der α-2,3-Sialyltransferase wurde zuerst dadurch qualitativ untersucht, daß man verschiedene Fluorphor-markierte Oligosaccharide verwendete, die einen terminalen Gal-Rest enthielten (Tabelle II). Die Überprüfung der FCHASE-markierten Oligosaccharide zeigte, daß die α-2,3-Sialyltransferase sowohl α- als auch β-verknüpfte Gal als Akzeptor nutzen kann. Die Gal konnte ein Monosaccharid-Glycokonjugat sein, wobei das Enzym aber auch Gal-α nutzt, wenn sie mit Gal-β(1→4)-Glc-β verknüpft ist, wie im P^k-Antigen, sowie die Gal-β, wenn diese mit entweder Glc oder GlcNAc verknüpft ist.
Daß die Sialinsäure α-(2→3) gegenüber dem Gal-α stand, wenn FCHASE-P^k als Akzeptor verwendet wurde, wurde durch die Methylierungsanalyse bestätigt sowie durch eine detaillierten Zuordnung des NMR-Spektrums des Produkts aus einer präparativen Synthese dieser Verbindung. Die saure Hydrolyse einer permethylierten Probe des sialylierten Produkts lieferte etwa äquimolare Mengen von 2,4,6-Tri-O-methyl-Gal:2,3,6-tri-O-methyl-Gal und 2,3,6-Tri-O-methyl-Glc. Das zeigte, daß die Oligosaccharid-Einheit 3-verknüpfte Gal-, 4-verknüpfte Gal- und 4-verknüpfte Glc-Reste enthielt. Eine vollständige Zuordnung des NMR-Spektrums des sialylierten Produkts wurde durch ¹H-¹H- und ¹H-¹³C-Korrelationsexperimente der chemischen Verschiebung erreicht (Tabelle III). Die chemischen Verschiebungsdaten sind mit der vorgeschlagenen Struktur konsistent (Masoud, H. et al. (1997) Biochemistry 36: 2091–2103; die zum niedrigen Feld verschobenen Werte für die Gal-α-C-3- und H-3-Resonanzen im Vergleich mit den unsubstituierten Analogen [¹H: ca. 0,2 ppm, ¹³C: ca. 2,8 ppm (Masoud, H. et al. (1997) Biochemistry 36: 2091–2103)] zeigten die Neu5Ac-α-(2,3)-Gal-α-Verknüpfung an, auf die außerdem das Auftreten eines NOE zwischen H-3-Protonen des Neu5Ac und Gal-α-Resten hinwies.
Die Untersuchung der TMR-markierten Oligosaccharide zeigte, daß die α-2,3-Sialyltransferase eine terminale Gal nutzen kann, die entweder β-(1→3) oder β(1→4) mit GlcNAc verknüpft ist, solange die GlcNAc nicht mit Fucose substituiert ist (z. B. Lewis-X). Die α-2,3-Sialyltransferase tolerierte auch Schwefel als Verknüpfungsatom, da wir eine Produktbildung mit Gal-β-thio-FCHASE und Gal-β-(1→4)-GlcNAc-β-thio-FCHASE beobachteten.
Bestimmung der kinetischen Konstanten – Wir fanden eine scheinbare K_m von 20 μM für die Donor-CMP-Neu5Ac, unter Verwendung als Akzeptor entweder von LacNAc-APTS (bei 0,8 mM) oder von Lacto-N-neotretraose-APTS (bei 0,2 mM). Es wurde keine nennenswerte Substratinhibierung beobachtet, wenn das Enzym mit bis 1 mM CMP-Neu5Ac untersucht wurde. Unter Verwendung einer CMP-Neu5Ac-Konzentration von 200 μM ermittelten wir die kinetischen Konstanten für verschiedene APTS-markierte Oligosaccharide (Tabelle IV). Die α-2,3-Sialyltransferase zeigte eine vergleichbare Aktivität gegenüber den beiden Monosaccharidakzeptoren (α- und β-verknüpftes Gal). Eine 5,5-fache Verminderung des scheinbaren k_cat/K_m wurde beobachtet, wenn die terminale Gal α-(1→4) mit Gal-β-(1→4)-Glc-β verknüpft war. Andererseits stieg das scheinbare k_cat/K_m gegenüber terminaler Gal-β um das Fünffache an, wenn β-(1→4) verknüpft war mit GlcNAc (LacNAc) sowie 10-fach, wenn der Akzeptor Lacto-N-neotretraose war. Das scheinbare k_cat/K_m mit der β-(1→3) verknüpften Gal in Lacto-N-tetraose war jedoch vergleichbar mit den Monosaccharidakzeptoren und war folglich 10-fach niedriger als mit der β-(1→4)-verknüpften Gal in Lacto-N-neotretraose.
Diskussion
Untersuchungen der Akzeptorspezifität für verschiedene Säugetier-α-2,3-Sialyltransferasen haben gezeigt, daß sie für den terminalen Zucker, den der terminalen Gal nächsten Zucker und die Verknüpfung zwischen diesen beiden Zuckern spezifisch sind (Kitagawa, H. et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 194: 375–382). Wir bestimmten die Affinität des bakteriellen Enzyms für verschiedene Akzeptoren, um seine Eigenschaften mit denen seiner Säugetier-Äquivalente zu vergleichen, und seine Eignung für eine Verwendung in einer chemisch-enzymatischen Synthese zu ermitteln. Es wurden enzymatische kinetische Parameter mit APTS-markierten Sacchariden gemessen, die den Vorteil aufwiesen, löslicher zu sein als FCHASE-markierte Saccharide, und die weiterhin für einen ultrasensitiven Assay unter Verwendung einer Kapillarelektrophorese und einer Laser-induzierten Fluoreszenz detektion geeignet waren. Wir beobachteten, daß das bakterielle Enzym durch Verknüpfungen mit dem vorletzten Zucker beeinflußt war, daß es jedoch eine terminale Gal modifizierte, die α-verknüpft entweder mit Gal oder einem Algycon war. Die Umsatzzahl und die Spezifitätskonstante für derartige Akzeptoren (Tabelle IV) zeigt, daß sie ziemlich gut verwertet werden.
Die scheinbaren K_m und k_cat-Werte von den anderen Akzeptoren zeigten, daß die α-2,3-Sialyltransferase eine Aktivität aufwies, die damit konsistent war, welche Oligosaccharide als Akzeptoren in dem Eltern-L3-Immunotyp LOS als Akzeptoren präsentiert wurden. So zeigte, wie vorausgesagt worden wäre, Lacto-N-neotetraose das höchste k_cat/K_m, während das Disaccharid LacNAc fast genauso spezifisch war. Die α-2,3-Sialyltransferase kann auch Lacto-N-tetraose nutzen, da jedoch die terminale Gal β-(1→3)-verknüpft ist, ist die Aktivität 10-fach geringer als mit Lacto-N-neotetraose. Säugetier-α-2,3-Sialyltransferasen sind ebenfalls in der Lage, sowohl β-(1→3)- als auch β-(1→4)-verknüpfte Gal zu nutzen, wobei jedoch einige eine Präferenz für Gal-β-(1→3) aufweisen, während andere eine Präferenz für Gal-β-(1→4) aufweisen, sowie ein Verhältnis der Aktivitäten, das ähnlich dem ist, das mit dem bakteriellen Enzym beobachtet wird (Kitagawa, H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394–1401).
Es wurde gezeigt, daß gewisse Säugetier-Sialyltransferasen verschiedene Analoge von Sialinsäure-Donoren nutzen können, und daß diese Eigenschaft dazu verwendet werden kann, sialylierte Oligosaccharide mit modifizierter biologischer Aktivität zu synthetisieren (Higa, H. H. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 8838–8849; Zou, W. et al. (1996) Carbohydr. Res. 296: 209–228). Unter Anwendung gekoppelter Reaktionen mit der N. meningitidis CMP-Neu5Ac-Synthetase fanden wir, daß die N. meningitidis α-2,3-Sialyltransferase alternative Donoren wie Neu5Pr und Neu5Gc nutzen kann, obwohl die Geschwindigkeiten niedriger waren als mit Neu5Ac.
Die qualitative Untersuchung von Akzeptor-Oligosacchariden zeigte, das N. meningitidis α-2,3-Sialyltransferase Schwefel als Verknüpfungsatom sowohl im Falle eines Monosaccharid- (β-Gal-thio-FCHASE)- als auch eines Disaccharid (Gal-β-(1→4)-GlcNAc-β-thio-FCHASE)-Akzeptors toleriert. Diese Eigenschaft ist von Nutzen, um aktivierte Oligosaccharide zu synthetisieren, die als Donoren in chemischen Synthesen verwendbar sind (Rademann, J. et al. (1996), Tetrahedron Lett. 37: 3989–3990).
Die gereinigte α-2,3-Sialyltransferase benötigte die Anwesenheit von Triton X-100, um in Lösung zu bleiben, und zeigte eine Tendenz, auszufallen, wenn sie durch Ultrafiltration auf über 1 mg/ml (1 bis 2 U/ml) konzentriert wurde. Versuche, die dimere Form durch Gelfiltration von der monomeren Form zu trennen, scheiterten, da beide Formen als ein einziger sehr breiter Peak eluierten, während die Gesamtausbeute sehr gering war. Es ist bekannt, daß gereinigte α-2,3-Sialyltransferase dazu neigt, Aggregate zu bilden, und leicht durch unspezifische Adsorption verlorengehen kann, selbst in Gegenwart eines Detergens. Tatsächlich wurde die α-2,3-Sialyltransferase aus Neisseria niemals aus einer natürlicheh Quelle gereinigt, und die geringe Reinigungsausbeute, die aus einem Überexpressionssystem erhalten wird, weist darauf hin, weshalb eine Reinigung dieses Enzyms aus einer Wildtypquelle sehr schwierig war. Die genaue Lokalisierung (innere oder äußere Membran) wurde experimentell nicht bestimmt, es besteht jedoch kein Zweifel, daß die α-2,3-Sialyltransferase mit Membranen assoziiert ist, sowohl in Neisseria als auch wenn sie in E. coli überexprimiert wird.
Die obigen Beispiele werden angeführt, um die Erfindung zu illustrieren, jedoch nicht, um ihren Bereich einzuschränken. Andere Varianten der Erfindung sind für einen Fachmann leicht erkennbar und werden von den nachfolgenden Ansprüchen umfaßt. Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die hierin zitiert werden, werden hiermit für alle Zwecke durch Referenz inkorporiert.
Tabelle I Zusammenfassung der Reinigung der α-2,3-Sialyltransferase Beispiel für die Ausbeute und spezifische Aktivität, die erhalten werden, wenn die α-2,3-Sialyltransferase aus 0,6 l einer Kultur von E. coli, die pNST-18 trug, gereinigt wurde
Tabelle II Akzeptorspezifität der gereinigten rekombinanten α-2,3-Sialyltransferase
Tabelle III ¹H- und ¹³C-NMR chemische Verschiebungen^a für die Oligosaccharid-Einheit von Neu5Ac-α-(2,3)-Gal-α-(1→4)-Gal-β-(1→4)-Glc-β-FCHASE
Tabelle IV K_m- und k_cat-Werte für APTS-markierte Akzeptoren für die gereinigte rekombinante α-2,3-Sialyltransferase
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Polynucleotidsequenz umfaßt, die für ein α2,3-Sialyltranferase-Polypeptid kodiert und die mit der Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1 bei einer Temperatur von 60°C in einer Lösung hybridisiert, die 1,0 M Na⁺-Ionen, pH 7,0 bis 8,3, enthält.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Polynucleotidsequenz für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kD kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Polynucleotidsequenz für eine α2,3-Sialyltransferase kodiert, wie sie in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Polynucleotidsequenz eine ist, wie sie in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nucleinsäuremolekül aus Neisseria Meningitidis isoliert ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das außerdem eine Promotorsequenz umfaßt, die funktionsgerecht mit der Polynucleotidsequenz verknüpft ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei die Polynucleotidsequenz außerdem mit einer zweiten Polynucleotidsequenz verknüpft ist, die für ein zweites Polypeptid kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei der Promotor in eukaryotischen Zellen aktiv ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei der Promotor in prokaryotischen Zellen aktiv ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, wobei der Promotor in E. Coli aktiv ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid kodiert, das eine Sequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Polynucleotidsequenz umfaßt, die für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid kodiert und die mit der Nucleinsäure von SEQ ID NO: 3 bei einer Temperatur von 60°C in einer Lösung hybridisiert, die 1,0 M Na⁺-Ionen, pH 7,0 bis 8,3, enthält.
Nucleinsäure nach Anspruch 12, wobei die Polynucleotidsequenz für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kD kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei die Polynucleotidsequenz für eine α-Sialyltransferase kodiert, wie sie in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei die Polynucleotidsequenz eine ist, wie sie in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei das Nucleinsäuremolekül aus Neisseria Gonorrhoeae isoliert ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, das außerdem eine Promotorsequenz aufweist, die funktionsgerecht mit der Polynucleotidsequenz verknüpft ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei die Polynucleotidsequenz außerdem mit einer zweiten Polynucleotidsequenz verknüpft ist, die für ein zweites Polypeptid kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei der Promotor in eukaryotischen Zellen aktiv ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei der Promotor in prokaryotischen Zellen aktiv ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20, wobei der Promotor in E. Coli aktiv ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid kodiert, das eine Sequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist.
Zelle, die eine rekombinante Expressionskassette aufweist, die einen Promotor enthält, der funktionsgerecht mit einer Polynucleotidsequenz verknüpft ist, die für ein α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid kodiert und die bei einer Temperatur von 60°C in einer Lösung, die 1,0 M Na⁺-Ionen, pH 7,0 bis 8,3, enthält, mit der Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 hybridisiert.
Zelle nach Anspruch 23, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
Zelle nach Anspruch 23, wobei die Zelle E. Coli ist.
Zelle nach Anspruch 23, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
Zelle nach Anspruch 23, wobei die Polynucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 ist.
Zelle nach Anspruch 23, wobei die Polynucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 ist.
Isoliertes α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid mit einer Sequenz, die zu wenigstens 80% mit SEQ ID NO: 2 identisch ist.
α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid nach Anspruch 29, das ein Molekulargewicht von etwa 40 kD aufweist.
α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid nach Anspruch 29, das eine Sequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NΟ: 2 gezeigt ist.
Isoliertes α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid mit einer Sequenz, die zu wenigstens 80% mit SEQ ID NO: 4 identisch ist.
α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid nach Anspruch 32, das ein Molekulargewicht von etwa 40 kD aufweist.
α2,3-Sialyltransferase-Polypeptid nach Anspruch 32, das eine Sequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist.
Verfahren zum Anfügen eines Sialinsäurerests an ein Akzeptormolekül, das einen terminalen Galactoserest aufweist, wobei das Verfahren das Umsetzen des Akzeptormoleküls mit einem aktivierten Sialinsäuremolekül und einer α2,3-Sialyltranferase umfaßt, die eine Sequenz aufweist, die zu wenigstens 80% mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 identisch ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der terminale Galactoserest über eine α-Verknüpfung mit einem zweiten Rest in dem Akzeptormolekül verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der terminale Galactoserest über eine β-Verknüpfung mit einem zweiten Rest in dem Akzeptormolekül verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Verknüpfung eine β1,4-Verknüpfung ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Verknüpfung eine β1,3-Verknüpfung ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die aktivierte Sialinsäure CMPNeu5Ac ist.