ES2231867T3 - Alfa-2-3-sialiltransferasas recombinantes y sus usos. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN LA ESTRUCTURA Y LA ESPECIFICIDAD DE LAS AL 2,3 - SIALILTRANSFERASAS RECOMBINANTES DE NEISSERIA SPP. TAMBIEN SE PRESENTA SU USO EN LA PRODUCCION DE ESTRUCTURAS DESEADAS DE HIDRATOS DE CARBONO.

Description

\alpha-2,3-sialiltransferasas recombinantes y sus usos.

Antecedentes de la invención

Las sialiltransferasas son un grupo de glucosiltransferasas que transfieren ácido siálico de un nucleótido con azúcar activado hasta los oligosacáridos aceptores encontrados en glucoproteínas, glucolípidos o polisacáridos. Los oligosacáridos sializados (modificados con ácido siálico) desempeñan papeles importantes en el reconocimiento célula - célula, en la diferenciación celular y en diversas interacciones receptor - ligando en sistemas de mamíferos. El gran número de estructuras de oligosacárido sializado ha conducido a la caracterización de muchas sialiltransferasas diferentes que participan en la síntesis de estas estructuras. Basándose en la especificidad de la unión y del aceptor de las sialiltransferasas estudiadas hasta ahora, se ha determinado que al menos 13 genes distintos de la sialiltransferasa están presentes en los sistemas de mamífero (Tsuji, S., et al. (1996) Glycobiology 6:v-vii).

Los conjugados sializados también se encuentran en bacterias (Preston, A. et al. (1996) Crit. Rev. Microbiol. 22:139-180; Reuter, G. et al. (1996) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377:325-342) y se cree que imitan a los oligosacáricos encontrados en los glucolípidos de mamífero para escapar a la respuesta inmunológica del huésped (Moran, A.P. et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16:105-115). Se ha establecido la importancia del lipooligosacárido (LOS) sializado en la patogenia de Neisseria gonorrhoeae (Smith et al., (1992) FEMS Microbiol Lett. 100:287-292), mientras que para N. meningitidis se encontró que tanto la cápsula de ácido polisiálico como el LOS sializado son importantes en la patogenia (Vogel, U. et al. (1996) Med. Microbiol. Immunol. 186:81-87).

Pese a su importancia como factores de virulencia demostrada o potencial, pocas sialiltransferasas bacterianas se han clonado (Weisgerber, C. et al. (1991) Glycobiol. 1:357-365; Frosch, M. et al. (1991) Mol. Microbiol. 5:1251-1263; Gilbert, M. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:28271-28276) o purificado (Yamamoto, T. et al. (1996) J. Biochem. 120:104-110). Las \alpha-2,8-sialiltransferasas que participan en la síntesis de las cápsulas de ácido polisiálico se han clonado y expresado tanto de Escherichia coli (Weisgerber, C. et al. (1991) Glycobiol. 1:357-365) como de N. meningitidis (Frosch, M. et al. (1991) Mol. Microbiol. 5:1251-1263). Las glucosiltransferasas de N. gonorrhoeae que participan en la síntesis del lipooligosacárido (LOS) se han clonado (patente de los EE.UU. número 5.545.553).

Debido a la actividad biológica de sus productos, las sialiltransferasas de mamífero generalmente actúan en tejidos, compartimentos celulares y/o fases del desarrollo específicos para crear los sialiloglucanos precisos. Las sialiltransferasas bacterianas no se someten a las mismas limitaciones y pueden utilizar una variedad más amplia de aceptores que las sialiltransferasas de mamífero. Por ejemplo, se ha demostrado que la \alpha-2,6-sialiltransferasa de Photobacterium damsela transfiere ácido siálico a residuos de galactosa terminales que están fucosilados o sializados en la posición 2 ó 3, respectivamente (Kajihara, Y. et al. (1996) J. Org. Chem. 61:8632-8635). Tal especificidad por el aceptor no se ha notificado hasta ahora para las sialiltransferasas de mamífero.

Las glucosiltransferasas bacterianas son útiles en varias aplicaciones, tal como la síntesis de oligosacáridos deseados con actividad biológica. Por tanto, la identificación y caracterización de nuevas glucosiltransferasas bacterianas es útil en el desarrollo de estas tecnologías. La presente invención proporciona éstas y otras ventajas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido \alpha-2,3-sialiltransferasa y que hibrida con las SEQ. ID. números 1 ó 3 en una disolución que contiene ion Na^{+} 1,0 M, pH 7,0 - 8,3, a una temperatura de 60ºC. Normalmente, la secuencia polinucleotídica codifica para un polipéptido \alpha-2,3-sialiltransferasa que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD, por ejemplo, tal como se muestra en las SEQ. ID. números 2 ó 4. Ejemplos de secuencias polinucleotídicas se muestran en las SEQ. ID. números 1 y 3. La molécula de ácido nucleico puede aislarse de Neisseria meningitidis o N. gonorrhoeae.

Si se desea la expresión de la enzima, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden comprender además una expresión que contenga una secuencia de promotor unida funcionalmente a la secuencia polinucleotídica. En algunas realizaciones, el promotor es activo en las células procariotas, tal como E. coli. También se proporcionan las células (por ejemplo, E. coli) que comprenden el "cassette de expresión" recombinante de la invención.

La invención comprende además métodos para añadir un residuo de ácido siálico a una molécula aceptora que comprende un residuo de galactosa terminal. Los métodos comprenden poner en contacto la molécula aceptora con una molécula de ácido siálico activado y una \alpha-2,3-sialiltransferasa de la invención. El residuo de galactosa terminal puede unirse mediante un enlace \alpha o \beta a un segundo residuo en la molécula aceptora. Ejemplos de enlaces incluyen enlaces \beta1,4 y \beta1,3. El ácido siálico activado normalmente es CMP-Neu5Ac.

Definiciones

Las sialiltransferasas de la invención son útiles para transferir un monosacárido de un sustrato donante a una molécula aceptora. La adición generalmente tiene lugar en el extremo no reductor de un resto de hidrato de carbono u oligosacárido en una biomolécula. Las biomoléculas tal como se definen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a moléculas biológicamente significativas, tales como hidratos de carbono, proteínas (por ejemplo, glucoproteínas), y lípidos (por ejemplo, glucolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y gangliósidos).

En el presente documento se usan las siguientes abreviaturas:

Ara = arabinosil;

Fru = fructosil;

Fruc = fucosil;

Gal = galactosil;

GalNAc = N-acetil galacto;

Glc = glucosil;

GlcNAc = N-acetil gluco;

Man = manosil; y

NeuAc = sialil (N-acetil neuraminil).

Las sialiltransferasas de la invención pueden usarse para añadir residuos de ácido siálico de diferentes formas a las moléculas aceptoras. Normalmente, el ácido siálico es ácido 5-N-acetil neuramínico, (NeuAc) o ácido 5-N-glicolilneuramínico (NeuGc). Sin embargo, pueden usarse otros ácidos siálicos en su lugar. Para una revisión de las diferentes formas de ácido siálico adecuadas en la presente invención, véase Schauer, Methods in Enzymology, 50:64-89 (1987), y Schaur, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 40:131-234.

Los sustratos donantes para las glucosiltransferasas son azúcares activados de nucleótidos. Tales azúcares activados generalmente consisten en derivados difosfato de la uridina, guanosina y citidina de los azúcares en los que el nucleósido difosfato sirve como grupo saliente. El sustrato donante para las sialiltransferasas de la invención son nucleótidos con azúcares activados que comprenden el ácido siálico deseado. Por ejemplo, en el caso de NeuAc, el azúcar activado es CMP-NeuAc.

Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, sea o no el sacárido en el extremo reductor, de hecho, un azúcar reductor. Según la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se representan en el presente documento con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha.

Todos los oligosacáridos descritos en el presente documento se describen con el nombre o la abreviatura del sacárido no reductor (por ejemplo, Gal), seguido por la configuración del enlace glucosídico (\alpha o \beta), el enlace en anillo, la posición en el anillo del sacárido reductor que participa en el enlace y después el nombre o abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlcNAc). La unión entre los dos azúcares puede expresarse, por ejemplo, como 2,3, 2-3, o (2,3). Cada sacárido es una piranosa o furanosa.

Gran parte de la nomenclatura y de los procedimientos de laboratorio requeridos en esta solicitud pueden encontrarse en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. El manual se denomina en lo sucesivo "Sambrook et al."

El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o de ribonucleótido, tanto en la forma de cadena simple como doble y, a menos que se limite de otro modo, engloba a análogos conocidos de nucleótidos naturales que hibridan con ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos que se producen en la naturaleza. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria de la misma.

Un "polipéptido sialiltransferasa" de la invención es una proteína sialiltransferasa o fragmento de la misma que puede catalizar la transferencia de un ácido siálico desde un sustrato donante (por ejemplo, CMP-NeuAc) a una molécula aceptora. Normalmente, tales polipéptidos serán sustancialmente similares a las proteínas dadas como ejemplo descritas en el presente documento.

El término "funcionalmente unido" se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor, una secuencia señal o una serie de sitios de unión al factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en la que la secuencia de control de la expresión afecta a la transcripción y/o a la traducción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

El término "recombinante", cuando se usa con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificada por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden contener genes encontrados en la forma nativa de la célula en la que los genes se modifican y se reintroducen en la célula por medios artificiales. El término también engloba células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado sin suprimir el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen las obtenidas por sustitución génica, mutación específica de sitio y técnicas relacionadas.

Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", tal como se usa en el presente documento, es una o uno que se origina de una fuente externa a la célula huésped particular o, si es de la misma fuente, que está modificada con respecto a su forma original. Por tanto, un gen de glucosiltransferasa heterólogo en una célula huésped procariota incluye un gen de glucosiltransferasa que es endógeno para la célula huésped particular que se ha modificado. La modificación de la secuencia heteróloga puede producirse, por ejemplo, tratando el ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que puede unirse funcionalmente al promotor. Técnicas tales como la mutagénesis dirigida al sitio también son útiles para modificar una secuencia heteróloga.

Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprende una parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo, polipéptido), respectivamente.

Un "cassette de expresión recombinante" o simplemente un "cassette de expresión" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, con elementos de ácido nucleico que pueden afectar a la expresión de un gen estructural en los huéspedes compatibles con tales secuencias. Los cassettes de expresión incluyen al menos promotores y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. Normalmente, el cassette de expresión recombinante incluye un ácido nucleico que ha de transcribirse (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido deseado) y un promotor. También pueden utilizarse factores adicionales necesarios o útiles para llevar a cabo la expresión, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un cassette de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican para una secuencia señal que dirige la secreción de una proteína expresada desde la célula huésped. Las señales de terminación de la transcripción, los enhancers (potenciadores) y otras secuencias de ácidos nucleicos que influyen en la expresión génica, también pueden incluirse en un cassette de expresión.

El término "aislado" se refiere a material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan a la enzima tal como se encuentra en su estado natural. Por tanto, las enzimas de la invención no incluyen materiales normalmente asociados con su entorno in situ. Normalmente, las proteínas aisladas de la invención al menos son puras en un 80%, normalmente al menos en aproximadamente el 90% y, preferiblemente, al menos puras en aproximadamente el 95%, medido mediante intensidad de banda sobre un gel teñido con plata u otro método para determinar la pureza. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante varios medios bien conocidos en la técnica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteínas, seguido por visualización tras la tinción. Para ciertos propósitos se necesitará alta resolución y se utilizará HPLC o un medio similar para la purificación.

El término "idéntico" en el contexto de dos secuencias polipeptídicas o de ácidos nucleicos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para lograr la máxima correspondencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante la puesta en práctica informatizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección.

Un algoritmo adicional que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo supone identificar primero pares de secuencias con puntuación alta (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que, o bien corresponden, o bien satisfacen cierta puntuación T con umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra contigua (Altschui et al, citado anteriormente). Estas coincidencias iniciales de palabra contigua actúan como iniciador para comenzar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Las coincidencias de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras que la puntuación de alineamiento acumulativa puede aumentarse. La extensión de la coincidencia de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae en la cantidad X desde su máximo valor obtenido; la puntuación acumulativa se hace cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o cuando se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919), los alineamientos (B) de 50, la expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que puede producirse por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar al ADNc o gen de la glucosiltransferasa si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con un ácido nucleico de glucosiltransferasa es inferior a aproximadamente 1, preferiblemente inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

El término "identidad sustancial" o "similitud sustancial" en el contexto de un polipéptido indica que un polipéptido comprende una secuencia con una identidad (o similitud) de secuencia de al menos el 70% con respecto a una secuencia de referencia, o preferiblemente del 80%, o más preferiblemente una identidad (o similitud) de secuencia del 85% con respecto a la secuencia de referencia, o más preferiblemente una identidad (o similitud) del 90% con respecto a una ventana de comparación de aproximadamente 10-20 residuos de aminoácidos. Una indicación de que dos secuencias polipeptídicas son sustancialmente idénticas o similares es que un péptido sea inmunológicamente reactivo con anticuerpos generados frente al segundo péptido.

Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido para el que codifica el primer ácido nucleico tenga reactividad cruzada inmunológica con el polipéptido para el que codifica el segundo ácido nucleico.

Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas.

Se "une(n) sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana y comprende incompatibilidad menor que puede adaptarse reduciendo la restricción de los medios de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia polinucleotídica diana.

La locución "que hibrida específicamente con", se refiere a la unión, duplicidad o hibridación de una molécula sólo con una secuencia nucleotídica particular en condiciones restrictivas cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total).

El término "condiciones restrictivas" se refiere a las condiciones bajo las que una sonda hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean de aproximadamente 50ºC menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica, el pH y la concentración de ácido nucleico definidos) a la que el 50% de las sondas complementarias a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. (Dado que las secuencias diana están presentes generalmente en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio). Normalmente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente ion Na^{+} 1,0 M, normalmente de aproximadamente una concentración de ion Na^{+} (u otras sales) de 0,01 a 1,0 M, a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para las sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes, tales como
formamida.

Las locuciones "se une específicamente a una proteína" o "es específicamente inmunorreactivo con", cuando se refieren a un anticuerpo, se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Por tanto, en las condiciones de inmunoanálisis indicadas, los anticuerpos especificados se unen preferiblemente a una proteína particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a una proteína en tales condiciones requiere que se seleccione un anticuerpo por su especificidad para una proteína particular. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoanálisis para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoanálisis ELISA en fase sólida se usan habitualmente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoanálisis que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad
específica.

Una "sustitución conservadora", cuando se describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína que no altera sustancialmente la actividad de la proteína. Por tanto, las "variaciones modificadas de manera conservadora" de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o a la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácido, básico, cargado positiva o negativamente, polar o no polar, etc.) de manera que las sustituciones de incluso los aminoácidos críticos no alteren sustancialmente la actividad. En la técnica son bien conocidas las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos de función similar. A continuación se enumeran seis grupos que contienen aminoácidos que son ejemplos de sustituciones conservadoras entre sí:

1)

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2)

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3)

Asparagina (N), Glutamina (Q);

4)

Arginina (R), Lisina (K);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Véase también Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman y Company.

Además, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o suprimen un aminoácido individual o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada también son "variaciones modificadas de manera conservadora".

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra dos electroferogramas superpuestos para ilustrar el nivel de actividad de sialiltransferasa encontrada en un cultivo de 1,5 mL de E. coli infectado con 100 ufp del banco genómico de ADN de N. meningitidis en \lambdaZAPH. La línea delgada es de una serie en la que la reacción no contenía el donante CMP-Neu5Ac y la línea gruesa es de una serie de contenía el donante CMP-Neu5Ac. En el pico a 6,6 minutos se demostró una migración conjunta de FCHASE-\alpha-2,3-sialil-N-acetil-lactosamina.

La figura 2 muestra las estructuras de los fluoróforos usados en el ensayo de electroforesis capilar de \alpha-2,3-sialiltransferasa. Figura 2A: cuando el ácido 8-aminopireno-1,4,6-trisulfónico sufre una aminación reductiva en disacáridos reductores, el extremo reductor es el de anillo abierto. R1 = OH (NAc cuando R2 = LacNAc); R2 = Gal-\alpha, Gal-\beta-1 N-acetil-lactosamina; Lacto-N-neotetraosa; Lacto-N-tetraosa; Gal-\alpha-(1\rightarrow4)-Gal-\beta(1\rightarrow4). Figura 2B: R = Gal-\alpha; Gal-\beta; Lactosa; N-acetil-lactosamina; Gal-\alpha-(1\rightarrow4)-Gal-\beta(1\rightarrow4).

Descripción de la realización preferida

La práctica de esta invención supone la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células huésped transfectadas. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines son conocidas en la técnica. Una amplia variedad métodos de clonación y de amplificación in vitro adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes, tales como los vectores de expresión, es bien conocida por las personas expertas. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas expertas a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Green Publising Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1994 Apéndice).

Preparación de los ácidos nucleicos de la invención

Los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos sialiltransferasas de esta invención pueden prepararse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica incluyendo, por ejemplo, la clonación y la restricción de las secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; El método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22:1859-1862; y el método de soporte sólido de la patente de los EE.UU. número 4.458.066.

En una realización preferida, un ácido nucleico que codifica para una sialiltransferasa se aísla mediante los métodos de clonación habituales. Una secuencia nucleotídica de una sialiltransferasa como la proporcionada en el presente documento, se usa para proporcionar sondas que hibriden específicamente con un gen de sialiltransferasa en una muestra de ADN genómico o con un ARNm de sialiltransferasa en una muestra de ARN total (por ejemplo, en un Southern o Northern blot). Una vez identificado el ácido nucleico diana de sialiltransferasa, puede aislarse según los métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica.

Los ácidos nucleicos deseados también pueden clonarse usando técnicas de amplificación bien conocidas. Ejemplos de protocolos suficientes para dirigir personas expertas a través de métodos de amplificación in vitro, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por la replicasa Q\beta y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, así como Mullis et al. (1987), patente de los EE.UU. número 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim y Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Sci. USA 87:1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560; y Barringer et al. (1990) Gene 89:117. Métodos mejorados de clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallace et al., patente de los EE.UU. número 5.426.039. Cebadores adecuados para su uso en la amplificación de los ácidos nucleicos de la invención se describen en la sección de los ejemplos, más adelante.

El ácido nucleico de sialiltransferasa también puede clonarse detectando su producto expresado mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de la proteína expresada. Por ejemplo, se puede identificar un ácido nucleico de sialiltransferasa clonado mediante la capacidad de un polipéptido codificado por el ácido nucleico para catalizar la transferencia de un ácido siálico desde un donante hasta un resto aceptor. En un método preferido, se emplea electroforesis capilar para detectar los productos de reacción. Este ensayo sumamente sensible supone el uso de derivados fenilamino de monosacáridos o disacáridos que se marcan con fluoresceína, tal como se describe más adelante y en Wakarchuk et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (45):28271-276.

En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar los ácidos nucleicos de sialiltransferasa de la invención. Un experto reconocerá muchas formas de generar alteraciones en un constructo de ácido nucleico dado. Tales métodos bien conocidos incluyen mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR usando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que contienen el ácido nucleico a agentes mutagénicos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por ejemplo, junto con ligamiento y/o clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y otras técnicas bien conocidas. Véase, por ejemplo, Gilimann y Smith (1979) Gene 8:81-97, Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734.

Preparación de cassettes de expresión que codifican para las sialiltransferasas de la invención

Las secuencias de sialiltransferasas de la invención se incorporan en cassettes de expresión para una expresión de alto nivel en una célula huésped deseada. Un cassette de expresión habitual contiene un promotor unido funcionalmente a la secuencia de ADN deseada. Puede expresarse más de un polipéptido sialiltransferasa en una única célula procariota colocando múltiples cassettes de transcripción en un único vector de expresión o utilizando marcadores diferentes que pueden seleccionarse para cada uno de los vectores de expresión que se emplean en la estrategia de clonación.

Secuencias de control procariotas comúnmente usadas, que se definen en el presente documento que incluyen promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de unión al ribosoma, incluyen promotores comúnmente usados tales como los sistemas promotores de la beta-lactamasa (penicilinasa) y la lactosa (lac) (Change et al., Nature (1977) 198:1056), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057), el promotor tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25); y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake et al., Nature (1981) 292:128). El sistema promotor particular no es crítico para la invención y puede usarse cualquier promotor disponible que funcione en procariotas.

En la presente invención pueden usarse promotores constitutivos o regulados. Los promotores regulados pueden ser ventajosos porque las células huésped pueden hacerse crecer en grandes densidades antes de inducir la expresión de los polipéptidos sialiltransferasa. La expresión de alto nivel de las proteínas heterólogas ralentiza el crecimiento celular en algunas situaciones. Los promotores regulados especialmente adecuados para su uso en E. coli incluyen el promotor P_{L} del bacteriofago lambda, el promotor híbrido trp-lac (Amann et al. Gene (1983) 25:167; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:21, y el promotor del bacteriofago T7 (Studier et al., J. Mol. Biol. (1986); Tabor et al., (1985)). Estos promotores y su uso se tratan en Sambrook et al., citado anteriormente.

Para la expresión de los polipéptidos sialiltransferasa en células procariotas distintas a E. coli, se requiere un promotor que funcione en la especie procariota particular. Tales promotores pueden obtenerse de genes que se han clonado de la especie o pueden usarse promotores heterólogos. Por ejemplo, el promotor híbrido trp-lac funciona en Bacillus además de en E. coli.

Un sitio de unión al ribosoma (RBS) se incluye convenientemente en los cassettes de expresión de la invención. Por ejemplo, un RBS en E. coli, consiste en una secuencia nucleotídica de 3-9 nucleótidos de longitud localizada en los nucleótidos 3-11 aguas arriba del codón de iniciación (Shine y Dalgarno, Nature (1975) 254:34; Steitz, en Biological regulation and development: Gene expression (ed. R.F. Goldberger). Vol. 1, pág. 349, 1979, Plenum Publishing, NY).

Puede usarse acoplamiento de traducción para potenciar la expresión. La estrategia utiliza un corto marco de lectura abierto aguas arriba derivado de un gen altamente expresado natural para el sistema de traducción, que se coloca aguas abajo del promotor, y un sitio de unión al ribosoma seguido tras algunos codones de aminoácidos por un codón de terminación. Justo antes del codón de terminación hay un segundo sitio de unión al ribosoma y tras el codón de terminación hay un codón de iniciación para la iniciación de la traducción. El sistema disuelve la estructura secundaria en el ARN, permitiendo la iniciación eficaz de la traducción. Véase Squires, et al., (1988). J. Biol. Chem. 263:16297-16302.

Los polipéptidos sialiltransferasa pueden expresarse intracelularmente o pueden secretarse de la célula. La expresión intracelular a menudo da como resultado altos rendimientos. Si es necesario, puede aumentarse la cantidad de polipéptido sialiltransferasa activo y soluble realizando procedimientos de replegamiento (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Marston et al., Biol Technology (1984) 2:800; Schoner et al., Biol Technology (1985) 3:151). En las realizaciones en las que los polipéptidos sialiltransferasa se secretan de la célula, ya sea en el periplasma o en el medio extracelular, la secuencia de ADN se une a una secuencia peptídica señal de escisión. La secuencia señal dirige la translocación del polipéptido sialiltransferasa a través de la membrana celular. Un ejemplo de un vector adecuado para su uso en E. coli que contiene una unidad de secuencia señal del promotor es pTA1529, que tiene la secuencia señal y el promotor phoA de E. coli (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:7212; Talmadge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:3988; Takahara et al., J. Biol. Chem. (1985) 260:2670).

Los polipéptidos sialiltransferasa de la invención también pueden producirse como proteínas de fusión. Este enfoque a menudo da como resultado altos rendimientos, porque las secuencias control procariotas normales dirigen la transcripción y la traducción. En E. coli, a menudo se usan fusiones locZ para expresar proteínas heterólogas. Vectores adecuados están fácilmente disponibles, tales como las series pUR, pEX y PMR100 (véase, por ejemplo Sambrook et al., citado anteriormente). Para ciertas aplicaciones, puede ser deseable escindir los aminoácidos que no son de sialiltransferasa de la proteína de fusión tras la purificación. Esto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo la escisión mediante bromuro de cianógeno, una proteasa o mediante el Factor X_{a} (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Itakura et al., Science (1977) 198;1056; Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:106; Nagai et al., Nature (1984) 309:810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:561). Los sitios de escisión pueden obtenerse por ingeniería genética en el gen para la proteína de fusión en el punto de escisión deseado.

Miller et al., Biotechnology 7:698-704 (1989) ha descrito un sistema adecuado para obtener proteínas recombinantes a partir de E. coli que mantengan la integridad de sus extremos N-terminal. En este sistema, el gen de interés se produce como una fusión C-terminal de los primeros 76 residuos del gen de la ubiquitina de levadura que contiene un sitio de escisión de peptidasa. La escisión en la unión de los restos da como resultado la producción de una proteína que tiene un residuo N-terminal auténtico intacto.

Expresión de las sialiltransferasas de la invención

Las sialiltransferasas de la invención pueden expresarse en una variedad de células huésped, incluyendo E. coli, otros huéspedes bacterianos, levaduras y varias células eucariotas superiores, tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares de mieloma. Ejemplos de bacterias útiles incluyen, pero no se limitan a, Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus. El gen de proteína recombinante se unirá funcionalmente a las secuencias de control de la expresión apropiadas para cada huésped. Para E. coli esto incluye un promotor tal como los promotores de T7, trp o lambda, un sitio de unión al ribosoma y, preferiblemente, una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucariotas, las secuencias control incluirán un promotor y, preferiblemente, un enhancer derivado de los genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación y pueden incluir secuencias de corte y empalme (splice) del donante y el aceptor.

Los vectores de expresión de la invención pueden transferirse en la célula huésped elegida mediante métodos bien conocidos, tal como transformación con cloruro de calcio para E. coli y tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para células de mamífero. Las células transformadas por los plásmidos pueden seleccionarse por la resistencia a antibióticos conferida por los genes contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg.

Una vez expresados, los polipéptidos sialiltransferasa recombinantes pueden purificarse según procedimientos habituales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, generalmente, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente del 90 al 95% de homogeneidad, y son más preferidas del 98 al 99% o más de homogeneidad. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden utilizarse entonces (por ejemplo, como inmunogenes para la producción de anticuerpos).

Un experto reconocería que pueden hacerse modificaciones a las proteínas glucosiltransferasas sin perder su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden hacerse para facilitar la clonación, la expresión o la incorporación de la molécula objetivo en una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) situados sobre cualquier terminal para crear sitios de restricción o codones de terminación o secuencias de purificación convenientemente situados.

Usos de sialiltransferasas

La invención proporciona métodos de utilización de sialiltransferasas producidas usando los métodos descritos en el presente documento para preparar oligosacáridos deseados (que están compuestos por dos o más sacáridos). Las reacciones glucosiltransferasa de la invención tienen lugar en un medio de reacción que comprende al menos una glucosiltransferasa, un sustrato donante, un azúcar aceptor y normalmente un catión metálico divalente soluble. Los métodos se basan en el uso de una glucosiltransferasa para catalizar la adición de un sacárido a un sacárido sustrato. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para añadir ácido siálico a un residuo de galactosa en una unión \alpha2,3, poniendo en contacto una mezcla de reacción que comprende un ácido siálico activado (por ejemplo, CMP-NeuAc) con un resto aceptor que comprende un residuo de Gal en presencia de una sialiltransferasa que se ha preparado según los métodos descritos en el presente documento.

Se conocen varios métodos de utilización de las glucosiltransferasas para sintetizar las estructuras de oligosacárido deseadas. Ejemplos de métodos se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl. Chem., 65:753 (1993) y en las patentes de los EE.UU. 5.352.670, 5.374.541 y 5.545.553.

La sialiltransferasa preparada tal como se describe en el presente documento puede usarse en combinación con glucosiltransferasas adicionales. Por ejemplo, puede usarse una combinación de sialiltransferasa y galactosiltransferasas. En este grupo de realizaciones, las enzimas y los sustratos pueden combinarse en una mezcla de reacción inicial o preferiblemente pueden añadirse enzimas y reactivos para un segundo ciclo de glucosiltransferasa al medio de reacción una vez que el primer ciclo de la glucosiltransferasa se ha acercado a la finalización. Al realizar dos ciclos de glucosiltransferasa en secuencia en un único recipiente, se mejoran los rendimientos globales con respecto a los procedimientos en los que se aísla una especie intermedia. Además, se reduce la limpieza y la supresión de los subproductos y disolventes de más.

Los productos producidos mediante los procesos anteriores pueden utilizarse sin purificación. Sin embargo, normalmente se prefiere recubrir el producto. Pueden usarse técnicas habituales, bien conocidas, para la recuperación de los sacáridos glucosilados, tal como cromatografía en capa fina o capa gruesa, cromatografía de intercambio iónico o filtración de membrana. Se prefiere usar filtración de membrana, más preferiblemente utilizando una membrana de ósmosis inversa o una o más técnicas de cromatografía en columna para la recuperación tal como se trata más adelante en el presente documento y en la bibliografía citada en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse filtración de membrana en la que las membranas tienen un punto de corte de peso molecular de aproximadamente 3000 hasta aproximadamente 10.000 para eliminar proteínas. La nanofiltración u ósmosis inversa puede usarse entonces para eliminar sales. Las membranas de nanofiltro son una clase de membranas de ósmosis inversa que pasan sales monovalentes pero que retienen sales polivalentes y solutos no cargados mayores a aproximadamente 100 hasta aproximadamente 700 Daltons, dependiendo de la membrana usada. Por tanto, en una aplicación habitual, los sacáridos preparados mediante los métodos de la presente invención se retendrán en la membrana y las sales contaminantes pasarán a su través. Usando tales técnicas, los sacáridos (por ejemplo, sialil-lactosa) pueden producirse con una pureza de esencialmente el 100%, tal como se determina por RMN protónica y CCF (cromatografía en capa fina).

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la clonación y la caracterización inicial de genes de N. meningitidis y N. gonorrhoeae que codifican para sialiltransferasas. La clonación puede lograrse mediante el uso de un procedimiento de selección sumamente sensible basado en la expresión de la actividad enzimática.

Procedimientos experimentales

Cepas bacterianas - En este estudio se utilizaron las siguientes cepas de N. meningitidis: inmunotipo L3 MC58 (NRCC 4728); inmunotipo L3 406Y (NRCC 4030); inmunotipo L7 M982B (NRCC 4725). El ADN de N. gonorrhoeae F62 (ATCC 33084) fue un amable obsequio de la Dra. Wendy Johnson (Health Canada, Ottawa).

Métodos básicos de ADN recombinante - El aislamiento del ADN del plásmido, las digestiones con enzimas de restricción, la purificación de fragmentos de ADN para clonación, los ligamientos, las transformaciones y la secuenciación del ADN se realizaron según lo recomendado por el proveedor de la enzima o por el fabricante del kit usado para el procedimiento particular. Se realizó PCR con polimerasa Pwo tal como describe el fabricante (Boehringer Mannheim, Laval, PQ). Las enzimas de restricción y de modificación del ADN se compraron de New England Biolabs LTD., Mississauga, Ont. Las columnas Qiaprep procedían de Qiagen Inc., Chatsworth CA, EE.UU. La secuenciación del ADN se realizó con un secuenciador de ADN automatizado modelo 370A de Applied Biosystems (Montreal PQ) usando el kit de secuenciación de ciclo (cycle sequencing) del fabricante.

Clonación y secuenciación de sialiltransferasa de N. meningitidis - La librería genómica se preparó usando fragmentos de 3 - 5 kb de un digesto parcial de HaeIII del ADN cromosómico de N. meningitidis MC58 en \lambdaZAPII (Stratagene, La Jolla, CA) como el vector (Jennings, M.P., et al. (1995) Mol Microbial. 18, 729-740). La librería de \lambdaZAPII se sembró en placa a baja densidad y 3600 placas bien aisladas se recogieron en grupos de 100. Se realizaron las suspensiones del fago tal como se describió anteriormente (Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed) Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y.) y se usaron para infectar cultivos de 1,5 mL de E. coli XL1-Blue (en medio LB con maltosa 0,2, MgSO_{4} 10 mM e IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) 2 mM) que se hicieron crecer durante 4,5 h. Se añadió tolueno al 1% y las células se sometieron entonces a ensayo para determinar la actividad sialiltransferasa tal como se describe más adelante. Los grupos positivos se sembraron en placa, después se recogieron las placas en grupos de 5 y se analizaron de nuevo para determinar la actividad. Después se utilizaron grupos positivos de 5 para aislar clones individuales que expresaban actividad sialiltransferasa. Fagémidos que llevaban el gen de sialiltransferasa se suprimieron de los clones \lambdaZAPII positivos usando el fago helper ExAssist y la cepa de E. coli SOLR, tal como se describe por el proveedor Stratagene. Se determinó la secuencia de ADN para el inserto de 2,1 kb de pNST-01 y se usaron cebadores de PCR basados en esta secuencia para amplificar los genes de ADN preparados de N. meningitidis 406Y, M982B y N. gonorrhoeae F62. Las secuencias del cebador fueron 5' cebador SIALM-5F, (nucleótidos 540-569 en la secuencia inserto de NST-01, sitio Ndel mostrado en cursiva) 43 monómeros 5' C TTA GGA GGT CAT ATG TTC AAT TTG TCG GAA TGG AGT TTT AGG 3' y 3' cebador SIALM-16R, (nucleótidos 1685-1658 de la secuencia inserto de NST-01, sitio SalI mostrado en cursiva) 42 monómeros: 5'CC TAG GTC GAC TCA TTA ATT TTT ATC GTC AAA TGT CAA AAT C 3'.

Detección de la sialiltransferasa por Western Blotting - El producto génico se detectó en E. coli construyendo primero un plásmido que consistía en el 1^{er} ORF (marco de lectura abierto) de pNST-01, y el péptido marcador para la inmunodetección con el anticuerpo anti-c-myc, tal como se describió anteriormente (MacKenzie, R.C., et al. (1994) Biol. Technology 12, 390-395). Este constructo se realizó utilizando los siguientes cebadores para amplificación por PCR: el cebador del extremo 5' fue el cebador "inverso" M13 habitual, y el cebador del extremo 3' fue SIALM-18R: (sitio SalI en cursiva y marcador c-myc en negrita) 5' CC TAG GTC GAC TCA TTA GTT CAG GCT TTC TTC GCT GAT CAG TTT TTG TTC ATT TTT ATC GTC AAA TGT CAA AAT CGG G3' 78 monómeros. El producto de PCR se clonó en el vector pT7-7 (Tabor, S., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1074-1078) y la expresión de la proteína se indujo entonces con IPTG. Se realizó Western blotting tal como se describió anteriormente (MacKenzie, R.C., et al. (1994) Biol. Technology 12, 390-395).

Medición de la actividad sialiltransferasa - La actividad sialiltransferasa de N. meningitidis MC58L3, 406Y L3 y M982B L7, y E. coli que lleva los plásmidos pNST se midió en células tratadas con tolueno o en extractos libres de células preparados tal como se describió anteriormente (Wakarchuk, et al. (1996) J. Biol. Chem en Press). Los aceptores se derivaron de fenilaminoglucósidos que se habían hecho reaccionar con el éster succimidílico del ácido 6(5-fluoresceín-carboxamido)-hexanoico (FCHASE) y se prepararon tal como se describió anteriormente (Wakarchuk, et al. (1996) J. Biol. Chem en Press). Las reacciones para la enzima se realizaron a 37ºC en 20 \mul de tampón MES, 50 mM, pH 6,0, MnCl_{2} 10 mM con aceptor marcado 0,2 o 1,0 mM, donante CMP-Neu5Ac 0,2mM y diversas cantidades de enzima, o bien a partir de extractos bacterianos brutos o de extractos de E. coli recombinante con el gen clonado. Las enzimas recombinantes se sometieron a ensayo durante 10 - 120 minutos, mientras que los extractos de N. meningitidis se incubaron 1 - 15 h. Las reacciones se terminaron diluyendo la reacción 1:100 con NaOH 10 mM. Estas muestras se diluyeron entonces apropiadamente en agua antes del análisis mediante electroforesis capilar.

La electroforesis capilar (EC) se llevó a cabo con un modelo P/ACE 5510 de Beckman (Fullerton, CA) equipado con un detector de fluorescencia inducido por láser de ión argón de 3 mW, \lambda de excitación = 488 nm, \lambda de emisión = 520 nm. El capilar fue sílice sin recubrir de 75 \mu x 47 cm, con el detector a 40 cm. El capilar se acondicionó antes de cada serie lavando con NaOH 0,2 M durante 2 minutos, agua durante 2 min, y tetraborato de sodio 25 mM, pH 9,4 durante 2 min. Las muestras se introdujeron mediante inyección a presión durante 2 - 5 segundos y la separación se realizó a 15 kV, 75 \muA. La integración de los picos se realizó con el software Beckman System Gold (versión 8.1).

Para la detección rápida de la actividad enzimática, las muestras de la reacción transferasa se examinaron mediante cromatografía en capa fina sobre placas de CCF de sílice 60 (E. Merck). Una mancha de 0,5 - 1,0 \mul de la reacción se secó al aire y la placa se reveló con acetato de etilo / metanol / agua / ácido acético 7:2:1:0,1. Tras el secado, las manchas del aceptor y del producto pudieron observarse mediante la iluminación de la placa con una lámpara UV de 365 nm. El Rf (coeficiente de reparto) del producto en estas condiciones fue de 0,05.

Reacciones de sialiltransferasa preparativas - Las reacciones enzimáticas preparativas se realizaron como reacciones enzimáticas acopladas con la CMP-Neu5Ac sintetasa clonada de N. meningitidis. Las reacciones contenían HEPES 25 mM pH 7,5, ditiotreitol 0,2 mM y MgCl_{2} 10 mM, 400 mU/mL de CMP-Neu5Ac sintetasa, 300 mU/mL de pirofosfatasa inorgánica (Sigma), CTP 1,5 mM, Neu5Ac 1,5 mM y 50 mU de sialiltransferasa (basado en FCHASE-fenilamino-LacNAc como el aceptor). El aceptor, FCHASE-fenilamino-Lac o FCHASE-fenilamino-LacNAc, se secó en el tubo a vacío y los reactivos se añadieron entonces al tubo; la concentración de FCHASE-fenilaminoglucósido en estas reacciones fue de 1 mM. Estas reacciones se llevaron a cabo a 30ºC durante 3 - 5 h. Tras la reacción, el FCHASE-fenilaminoglucósido se unió a un cartucho de fase inversa Sep-Pak C18 (Waters), se desaló lavando con agua y después se eluyó en acetonitrilo al 50%.

Determinación de la especificidad de unión de la sialiltransferasa - El producto de una reacción de sialiltransferasa preparativa se examinó por RMN. Las muestras para RMN se prepararon mediante el método de CCF y después de liofilizaron a partir de D_{2}O 3 veces antes de la recogida de los espectros. La recogida de los datos de RMN se realizó con un espectrómetro Bruker AMX 500. Los espectros se registraron a 540 K en tubos de 5 mm a una concentración de 0,5 - 1,0 mg de FCHASE-fenilaminoglucósido en 0,5 mL de D_{2}O. Los desplazamientos químicos de protones en D_{2}O se expresan en relación con la señal de HOD (hidrógeno-oxígeno-deuterio) (4,348 a 340 K).

Resultados

Detección y caracterización de una actividad 2,3-sialiltransferasa de N. meningitidis - La parte inicial de este trabajo se llevó a cabo con la cepa 406Y L3 de N. meningitidis, que posee un LOS idéntico al de la cepa MC58, pero tiene un tipo de cápsula diferente. Ambas cepas elaboran el LOS del inmunotipo L3 que consiste en una ramificación de lacto-N-neotetraosa con un ácido \alpha-2,3-siálico en el residuo de galactosa terminal (Pavliak, V., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14146-14152). Ambas cepas produjeron niveles fácilmente detectables de \alpha-2,3-sialiltransferasa cuando se usa sólo una colonia individual (10^{7} células) con el ensayo basado en EC. El extracto bruto de N. meningitidis 406Y L3 se usó para preparar el material para la determinación de la unión del sialósido que se está sintetizando y la enzima se verificó por RMN de su producto que es una \beta-galactósido \alpha-2,3-sialiltransferasa. A la finalización, se realizó la asignación de ^{1}H de los compuestos. Se encontró que los desplazamientos químicos de ^{1}H eran similares a los de las estructuras notificadas que contienen estructuras de \alpha-2,3-Sialil-Gal (Pavliak, V., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14146-14152). Además, se observó un NOE (efecto nuclear Overhauser) a través del enlace glucosídico H_{3} - ácido siálico con H_{3} Gal, así como un acoplamiento de gran intervalo desde C_{2}-ácido siálico hasta H_{3} de Gal confirmó que estaba presente la unión \alpha-2,3-Sialil-Gal.

La variación de las condiciones de reacción demostró que la enzima tenía un pH óptimo de 6,0 y que la actividad se estimulaba el doble por la adición de MgCl_{2} 10 mM o el triple por MnCl_{2} 10 mM. Sin embargo, no hay requisitos estrictos con respecto al metal, puesto que fue activa en presencia de EDTA 5 mM. Estas mismas condiciones también fueron óptimas para la enzima procedente los extractos brutos de MC58, 406Y y para las enzimas recombinantes de MC58. La enzima natural estuvo en su mayor parte asociada con la fracción de membrana celular (el 86% en el sedimento de membrana celular tras la centrifugación a 100.000 x g). Sin embargo, no se requirió detergente para determinar la actividad y, de hecho, muchos detergentes comunes probados inhibieron a la enzima, con la excepción de Triton X-100 hasta el 0,2%. Usando este método no pudo detectarse la actividad en las células M982B
L7.

Clonación y secuenciación del gen de sialiltransferasa de N meningitidis MC58 - Usando el ensayo EC-FIL (electroforesis capilar - fluorescencia inducida por láser) se observó actividad sialiltransferasa una vez de cinco cuando se infectó un cultivo de E. coli XL1-Blue inducido por 2 mL de IPTG con 1000 ufp de la librería genómica de N. meningitidis en \lambdaZAPII (figura 1). La formación del pico de producto en el electroferograma requirió la adición de CMP-Neu5Ac y migró lo mismo que el pico de producto sensible a sialidasa formado por la enzima natural. El pico en el electroferograma de la EC corresponde a 20 atomoles (2 x 10^{-17} moles) de producto. Los clones individuales que expresaban la sialiltransferasa se obtuvieron mediante una estrategia de "divide y vencerás" que selecciona secuencialmente grupos de 100 ufp de la librería \lambdaZAPII de MC58, grupos de 5 ufp derivados del primer grupo positivo y, finalmente, placas individuales sembradas a baja densidad. La selección inicial dio 2 grupos positivos de 100 ufp de 36. A partir de uno de esos grupos se seleccionaron 60 grupos de 5 ufp y se obtuvieron 3 grupos positivos. De los grupos positivos de 5 ufp se obtuvieron muchos clones positivos individuales y se encontró que los fagémidos pBluescript SK separados de ellos llevaban un inserto de 2,1 kb.

El inserto de 2,0 kb se secuenció en ambas cepas (número de acceso de GenBank U60660) y se llevó a cabo una búsqueda BLASTX en GENEBANK con el fin de identificar cualquier homología con los genes secuenciados anteriormente. Este análisis reveló dos ORF parciales (nucleótidos 1-141 y nucleótidos 1825-2039) situados en extremos opuestos del inserto de 2,1 kb que eran claramente homólogos con varias isocitrato deshidrogenasas bacterianas (identidad del 60-85%) y varias proteínas citocromo c' bacterianas (identidad del 43-63%), respectivamente. Un tercer ORF (nucleótidos 573-1685) se denominó lst (lipooligosacárido sialiltransferasa) y reveló homología significativa con un gen de Haemophilus influenzae denominado lsg-ORF2 (número de acceso de GenBank M94855). La alineación por parejas entre los productos de la traducción de lst y lsg-ORF2 indicó que sus secuencias aa comparten el 29,3% de identidad y el 56,3% de similitud.

El producto génico lst tiene dos codones de iniciación potenciales. Es más probable que se use el segundo de ellos, ya que la secuencia que sigue inmediatamente a este codón de iniciación parece ser una secuencia líder no escindible (Nakai, K., et al. (1991) Proteins: Structure, function and genetics 11, 95-110) y un sitio de unión a ribosomas potencialmente muy bueno (AG-GGA) se produce justo aguas arriba.

Comparación de genes de sialiltransferasa de diferentes aislados de N. meningitidis y N. gonorrhoeae - El aislamiento de los genes de N. meningitidis 406Y L3 (GenBank U60661, SEQ. ID. números 1 y 2), M982B L7 (GenBank U60663) y N. gonorrhoeae F62 (GenBank U60664, SEQ. ID. números 3 y 4) se llevó a cabo con cebadores de PCR basados en el gen de MC58 L3 (GenBank U60660). Se encontraron 12 bases de diferencia, lo que dio como resultado 5 diferencias de aminoácidos entre los 2 genes de las cepas de inmunotipo L3 y 19 diferencias en el gen de M982B L7, en comparación con MC58 y 12 diferencias en la secuencia de M982B L7, en comparación con la de 406Y L3. El gen de M982B L7 contiene una mutación de desplazamiento del marco de lectura en el nucleótido 454 y, en consecuencia, codificaría para una proteína truncada de sólo 151 aminoácidos.

El gen de N. gonorrhoeae F62 (SEQ. ID. número 3) muestra diferencias en 63 nucleótidos en comparación con N. meningitidis MC58, diferencias en 62 nucleótidos en comparación con el gen 406Y L3 y 66 en comparación con el gen M982B L7. Estas diferencias en la secuencia de ADN del gen de N. gonorrhoeae F62 da como resultado diferencias en 16 ó 17 aminoácidos en la proteína, cuando se compara con MC58 L3 Y 406Y L3, respectivamente.

Expresión del gen de sialiltransferasa - La actividad enzimática en E. coli que lleva plásmidos pNST pudo detectarse fácilmente y esta expresión del gen lst dependía del vector derivado del promotor lac, puesto que no hubo actividad enzimática detectable cuando se invirtió la orientación del gen. Al menos hubo una actividad enzimática 30 veces mayor en pNST0-01 que contenía clones en comparación con las cepas L3 de N. meningitidis. Sin embargo, la expresión del gen lst no fue lo suficientemente elevada como para permitir la detección simple de una proteína sobreexpresada por análisis SDS-PAGE. Por tanto, se construyó un plásmido para introducir un péptido marcador de inmunodetección c-myc en el extremo C-terminal de la proteína. Cuando se usó este plásmido para expresar el gen lst, se pudo detectar una proteína inmunorreactiva con un M_{r} de 41.000, que es ligeramente inferior al tamaño predicho del producto del gen lst. También se observó que la enzima recombinante estaba principalmente (en el 76%) en la fracción soluble de los extractos celulares, a diferencia de la situación observada con los extractos de N. meningitidis.

Especificidad por el aceptor de sialiltransferasa de lst - El aceptor natural para esta enzima es una secuencia terminal de N-acetil-lactosamina en la rama de lacto-N-neotetraosa del LOS de los inmunotipos L3. Se encontró que la enzima usaría como aceptores los sacáridos sintéticos: FCHASE-fenilamino-LacNAc, FCHASE-fenilamino-Lac y FCHASE-fenilamino-Gal, a razones de actividad de 1:0,29:0,03.

Discusión

La disponibilidad de un ensayo enzimático sumamente sensible jugó un papel decisivo en la posibilidad de seleccionar clones que expresaran la \alpha-2,3-sialiltransferasa de N. meningitidis. El ensayo utiliza un aceptor de glucosiltransferasa que es fácil de sintetizar y no requiere un equipo de EC especialmente construido como se ha descrito anteriormente para la detección ultrasensible de las reacciones de glucosiltransferasa (Zhao, J.Y., et al. (1994) Glycobiol., 4, 239-242). Los aceptores usados en este estudio se obtuvieron a partir de glucósidos ampliamente disponibles, y los fluoróforos y el equipo de EC utilizado estaban comercialmente disponibles. Se pudieron detectar de manera fidedigna cantidades en atomoles (10^{-18} moles) de productos de reacción, lo que resultó más que adecuado para la selección de la expresión de \alpha-2,3-sialiltransferasa.

El gen lst de MC58 L3 se produce entre dos genes no relacionados con la síntesis de LOS, la isocitrato deshidrogenasa y el citocromo c', y no forma parte de un operón de síntesis de LOS, a diferencia de otras glucosiltransferasas de LOS procedentes de N. meningitidis (Jennings, M.P., et al. (1995) Mol. Microbial. 18, 729-740). Esto es similar a la situación con la \alpha-2,8-polisialiltransferasa de E. coli y N. meningitidis que participa en la biosíntesis de la cápsula, aunque estos genes son adyacentes a CMP-Neu5Ac sintetasa (Ganguli, S., et al. (1994) J. Bacteriol. 176, 4583-9). Es interesante especular que el gen lst se encuentra por sí mismo como resultado de cierto tipo de acontecimiento de transposición, aunque no se tienen pruebas de elementos de inserción o secuencias similares a transposones que flanqueen el gen. El análisis de la secuencia y las comparaciones de bases de datos demostraron que este gen es distinto tanto a la familia de \alpha-2,3-sialiltransferasa de mamíferos como a la familia de \alpha-2,3-sialiltransferasa bacteriana, y las ácido 3-desoxi-\alpha-mano-octulosónico transferasas bacterianas que transfieren un azúcar relacionado también desde un donante de CMP. Sin embargo, se demostró que el producto del gen lst era similar al producto del gen lsg-02 de H. influenzae. Aunque se ha demostrado que lsy-ORF2 participa en la biosíntesis de LOS, puede no codificar para una \alpha-2,3-sialiltransferasa, ya que se notificó que participaba en la expresión de un epítopo de Gal-GlcNAc LOS (McLaughlin, R., et al., (1992) J. Bacteriol. 174, 6455-6459). Para la clonación del gen de N. gonorrhoeae se usó la cepa F62, ya que se ha demostrado que es común a ambas especies (Jennings, M.P., et al. (1995) Mol. Microbial. 18, 729-740). Un examen del gen derivado de N. gonorrhoeae F62 sólo muestra un pequeño número de diferencias, lo que es similar a otras comparaciones de genes de biosíntesis de LOS procedentes de N. meningitidis y N. gonorrhoeae (Jennings, M.P., et al. (1995) Mol. Microbial. 18, 729-740).

La proteína codificada por el gen lst parece tener un péptido señal no escindible y programas de predicción asistidos por ordenador indican que la sialiltransferasa es una proteína integral de la membrana interna. Los artículos originales que describen la actividad sialiltransferasa tanto de N. meningitidis como de N. gonorrhoeae indican que ST podría ser una proteína externa de membrana, partiendo de la base de que la actividad enzimática se extrae de las células completas mediante una extracción con Triton X-100 (Mandrell, R.E., et al. (1993) Microb. Pathog. 14, 315-327; Mandrell, R.E. et al. (1993) Microb. Pathog. 14, 315-327). Se ha observado que la actividad de los extractos de N. meningitidis muestran asociación de la actividad con la fracción de membrana, pero que en E. coli, la actividad parece ser en su mayoría soluble.

El hecho de que este gen funcione en la sialización de LOS se deduce de un examen de N. meningitidis M982B L7, que parece ser un mutante de sialiltransferasa natural. El gen de la sialiltransferasa derivado de esta cepa L7 contiene una mutación de desplazamiento del marco de lectura en el nucleótido 454, lo que la hace inactiva en el plásmido recombinante que lo lleva, lo que está de acuerdo con la observación de que la actividad sialiltransferasa no puede detectarse en las células M982b. Esta cepa produce la misma lacto-N-neotetraosa que las cepas L3, pero no sializa su LOS. La especificidad por el aceptor para la enzima L3 con aceptores sintéticos muestra una fuerte preferencia por la N-acetil-lactosamina sobre la lactosa o la galactosa. Además, el producto de la reacción que usa enzima de N. meningitidis y aceptor FCHASE-LacNAc se determinó inequívocamente por RMN que era FCHASE-\alpha-2,3-sialil-acetil-lactosamina.

El nivel de expresión del gen recombinante es 50 - 100 U por litro de cultivo, basándose en ensayos con el aceptor FCHASE-LacNac.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe experimentos que investigaron adicionalmente la estructura y la especificidad de \alpha-2,3-sialiltransferasa recombinante de Neisseria meningitidis.

Procedimiento experimental

Métodos básicos de ADN recombinante - El aislamiento del ADN del plásmido, las digestiones con enzimas de restricción, la purificación de fragmentos de ADN para clonación, los ligamientos y las transformaciones se realizaron según lo recomendado por el proveedor de la enzima o por el fabricante del kit usado para el procedimiento particular. Se realizó PCR con polimerasa Pwo tal como describe el fabricante (Boehringer Mannheim, Laval, Que.). Las enzimas de restricción y de modificación del ADN se compraron de New England Biolabs LTD., Mississauga, Ont.

Análisis de proteínas - La concentración de proteínas se determinó usando el kit de ensayo de proteínas del ácido bicinconínico de Pierce (Rockford, IL). Los análisis de SDS-PAGE y Western blotting de las proteínas transferidas a membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno) se realizaron tal como se describió anteriormente, excepto en que el anticuerpo primario fue un anticuerpo anti-His_{6} de Invitrogen (San Diego, CA).

Construcción de expresión en plásmidos - El gen completo de \alpha-2,3-sialiltransferasa procedente de N. meningitidis, así como 0,57 kb de la secuencia aguas arriba, se amplificaron usando el cebador "inverso" M13 habitual como el cebador en 3' y SIALM-17R como el cebador en 5' (63 monómeros: 5'-CCTAG- GTCGAC TCATTAGTGGT
GATGGTGGTGATGATTTTTATCGTCAAATGTCAAAATCGGG-3'; el sitio SalI se muestra en cursiva y negrita; la secuencia que codifica para la cola de His_{6} está subrayada) y pNST-01 como la plantilla. El plásmido pNST-18 se construyó mediante la digestión del producto de la PCR con EcoRI y SalI y clonándolo en una versión modificada de pCWori+ (16), en el que se había eliminado el fragmento génico lacZ\alpha.

Producción y purificación de la \alpha-2,3-sialiltransferasa - Se utilizó un cultivo de E. coli BMH71-18 /pNST-18 para inocular un cultivo de 1 L que contenía medio de cultivo Luria broth (10 g de triptona, 5 g de NaCl y 10 g de extracto de levadura por litro) con 150 mg/L de ampicilina. El cultivo de 1 L se dejó crecer durante la noche a 37ºC y se utilizó para inocular 20 L de medio de cultivo Terrific broth (16 g de triptona, 24 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, fosfato potásico 10 mM pH 7,4 y 0,8% de glicerol por litro) que contenía 150 mg/L de ampicilina. El cultivo de 21 L se dejó crecer a 30ºC en un fermentador de 28 L New Brunswick Scientific (Edison, NJ) hasta que A_{500} = 0,55 y después se indujo con IPTG 0,5 mM. Las células se recogieron tras 17 horas, se concentraron por ultrafiltración, se lavaron con NaCl al 0,85% y se centrifugaron. La pasta de células (12 g en peso húmedo) se resuspendieron en 60 mL de Tris 20 mM pH 8 y los extractos celulares se prepararon usando un disruptor celular Avestin C5 Emulsiflex (Avestin, Ottawa, Ont.) Se añadió un cóctel inhibidor de proteasa (Complete^{MR} de Boehringer Mannheim) al extracto, que se centrifugó dos veces a 20.000 x g (r_{max}) durante 30 min. El sobrenadante se centrifugó 1 h a 205.800 x g (r_{max}) y el sedimento se resuspendió en HEPES 10 mM pH 7, NaCl 0,5 M y Triton X-100 al 0,2%. El sedimento resuspendido se agitó durante 2 h a 4ºC y se volvió a centrifugar 1 h a 205.800 x g. El sobrenadante se aplicó a dos columnas de 5 mL HiTrap Chelating (Pharmacia Biotech) cargadas con Ni^{2+}, siendo la carga máxima 25 mg de proteína total en cada serie. Las columnas se revelaron con gradiente de imidazol 60 - 800 mM en HEPES 10 mM (pH 7) que contenía NaCl 0,5 M y Triton X-100 al 0,2%.

Análisis de la secuencia primaria de la \alpha-2,3-sialiltransferasa - La \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada, 500 Lg, se disolvió en guanidinio-HCl 6 M, Tris 100 mM pH 8,3, se redujo con DTT (ditiotreitol) (5 equiv./mol de tiol proteico) y se S-carboximetiló con ácido yodoacético (10 equiv./mol de tiol proteico). La mezcla de reacción se dializó entonces extensamente frente a agua. La secuenciación automatizada de aminoácidos en fase gaseosa se realizó en un sistema de secuenciación de proteínas de Applied Biosystems (Foster City, CA) que incorporaba un secuenciador en fase gaseosa modelo 470A equipado con un analizador on line modelo 120A PTH bajo el control de un módulo de análisis de los datos y de control modelo 900A. Para la escisión mediante CNBr, se disolvieron 100 \mug de \alpha-2,3-sialiltransferasa S-carboximetilada en 500 \muL de ácido fórmico al 88% (v/v) seguido por la adición de 50 \mug de CNBr. El vial de reacción se purgó con argón, se selló y se incubó en la oscuridad durante 24 h. Para la digestión con tripsina, se disolvieron 100 \mug de \alpha-2,3-sialiltransferasa S-carboximetilada en bicarbonato amónico 50 mM, pH 8,0. Se añadió tripsina de calidad de secuenciación (Boerhringer Mannheim) en una razón 1 : 100 (p/p), y la mezcla se incubó durante 3 h a 37ºC, tras lo que se repitió la adición de tripsina y la incubación. Los productos de escisión de CNBr y tripsínicos liofilizados se disolvieron en 50 \muL de ácido trifluoroacético al 0,1% y se fraccionaron en una columna de HPLC Synchropak de 1 mm x 10 cm RP-8 (Keystone Scientific Inc., Bellefonte, PA) usando un gradiente de acetonitrilo del 0 - 90% en ácido trifluoroacético al 0,05% (v/v). El análisis de las masas se realizó por infusión directa del efluente de HPLC en un espectrómetro de masas cuadrupolar triple mediante electronebulización VG Quattro de Fisons Instruments (Manchester, R.U.) con un intervalo de masas de 3500 uma/e.

Medición de la actividad sialiltransferasa y estudio de los aceptores oligosacáridos - Se prepararon oligosacáridos marcados con FCHASE tal como se describió anteriormente, mientras que los oligosacáridos marcados con APTS se prepararon mediante aminación reductiva de sacáridos reductores según el método descrito por Guttman et al. (Anal. Biochem 233:234 (1996)). El aceptor Gal-\beta-APTS se derivó del marcado de lactosa; el aceptor Gal-\alpha-APTS se derivó del marcado de melibiosa; el aceptor N-acetil-lactosamina (LacNAc) se sintetizó mediante marcado con APTS de quitobiosa, seguido por modificación enzimática con \beta-galactosil transferasa bovina para producir el resto de LacNAc; el aceptor Gal-\alpha-1,4-Gal-\beta se sintetizó enzimáticamente a partir de \beta-Gal-APTS con la \alpha-1,4-galactosiltransferasa de N. meningitidis. Todos los productos de la aminación reductiva se purificaron por cromatografía de permeación en gel en columna Toyopearl HW4OF (Sigma-Aldrich) de 1,5 cm x 15 cm, usando agua como eluyente. Debe mencionarse que todas estas moléculas tienen el anillo del azúcar reductor terminal abierto en el proceso de marcado. Los APTS-sacáridos se cuantificaron midiendo la A_{455}, y usando un coeficiente de extinción de 17160 M^{-1}.cm^{-1}. Los oligosacáridos marcados con TMR se prepararon tal como describe Zhao et al. (1994) Glycobiology 4:239-242. Para los aceptores marcados con TMR se usó un coeficiente de extinción de 80.000 M^{-1}.cm^{-1} para la cuantificación. La actividad sialiltransferasa se midió rutinariamente usando FCHASE-N-acetil-lactosamina 0,5 mM como aceptor y las condiciones del ensayo tal como se describió anteriormente. Para la medición de los valores de K_{m}, y k_{cat}, los ensayos se realizaron con sacáridos marcados con APTS a temperatura ambiente. Los ensayos se monitorizaron de manera que para todas las concentraciones de aceptor, no se produjera más de un 10% de conversión a producto. Los intervalos de concentraciones de aceptor y donante se determinaron empíricamente, después se utilizó un intervalo que abarcara de 0,2K_{m} hasta 5K_{m}, para obtener los valores. Los datos se examinaron usando el paquete de software Grafit^{MR} 3.0 (Erithacus Software, Londres, R.U.).

Las mezclas de reacción de los aceptores marcados con FCHASE y APTS se analizaron mediante electroforesis capilar realizada con un modelo P/ACE 5510 de Beckman Instruments (Fullerton, CA) equipado con un detector de fluorescencia inducido por láser de ión argón de 3 mW, \lambda de excitación = 488 nm, \lambda de emisión = 520 nm. El capilar fue sílice sin recubrir de 75 \mu x 57 cm, con el detector a 50 cm. El capilar se acondicionó antes de cada serie lavando con NaOH 0,2 M durante 2 minutos, agua durante 2 min y, o bien tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,4 o bien tetraborato de sodio pH 9,3 durante 2 min. Las muestras se introdujeron mediante inyección a presión durante 2 - 5 segundos y la separación se realizó a 18 kV, 75 \muA. La integración de los picos se realizó con el software Beckman PACE-Station (versión 1).

Las mezclas de reacción de los aceptores marcados con TMR se analizaron mediante cromatografía en capa fina sobre placas de CCF de sílice 60 (Merck) usando isopropanol / 1-butanol / HCl 0,1 M (2:1:1) como disolvente para el revelado y una lámpara UV de 365 nm para la detección de los productos.

Sialización de FCHASE-tio-N-acetil-lactosamina con ácido N-acetil-, N-propionil- y N-glucolil-neuramínico - Las mezclas de reacción de 50 \muL incluyeron 0,8 mM de aceptor, y 2 mM de Neu5Ac, Neu5Gc o Neu5Pr, en Tris 100 mM pH 7,5, DTT 0,2 mM, MgCl_{2} 10 mM, CTP mM con 50 mU de pirofosfatasa inorgánica (Sigma), 47 mU de CMP-Neu5Ac sintetasa y 5 mU de \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada. Las mezclas de reacción se incubaron a 32ºC durante 90 min y la formación del producto fue seguida por análisis de CCF. Las masas de los productos sializados se midieron en el modo de ion negativo de un espectrómetro de masas cuadrupolar triple VG Quattro (Fisons Instruments).

Síntesis preparativa de Neu5Ac-\alpha-(2\rightarrow3)-Gal-\alpha-(1\rightarrow4)-Gal-\beta-FCHASE - Una mezcla de reacción de 1,2 mL compuesta de FCHASE-Lac 1,48 mM, UDP-Gal 2,0 mM, en HEPES 50 mM pH 7,4, MnCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM y 3 U (1 mg) de \alpha-1,4-galactosiltransferasa de N. meningitidis se incubó a temperatura ambiente durante 80 min, momento en el que la reacción apareció completa mediante CCF (Wakarchuk, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:19166-19173). La mezcla de reacción se diluyó entonces con agua hasta 20 ml y se desaló con cromatografía en fase inversa SepPak C-18. El producto se eluyó en acetonitrilo al 50% y se evaporó hasta la sequedad. La reacción de \alpha-2,3-sialiltransferasa se llevó a cabo en 1 ml de FCHASE-Lac-Gal 2,4 mM, CTP 5 mM, Neu5Ac 5 mM, en Tris-HCl 100 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 10 mM, DTT 0,2 mM y Triton X-100 al 0,1%, con 0,5 U de \alpha-2,3-sialiltransferasa (extracto Triton X-100 de preparación de membrana de E. coli) y 2,5 U de CMP-Neu5Ac sintetasa. Esta reacción se realizó a temperatura ambiente y se dejó continuar durante 2 h, momento en el que la reacción se centrifugó para eliminar un precipitado, y se añadieron otros 0,5 U de \alpha-2,3-sialiltransferasa y la reacción se dejó durante la noche. El producto se aisló de nuevo mediante cromatografía SepPak y se purificó mediante CCF preparativa, tal como se describió anteriormente (Wakarchuck, W.W. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:19166-19173). El material se intercambió en D_{2}O y se examinó mediante espectroscopia de RMN para el análisis estructural.

Los datos de RMN se recogieron en un espectrómetro Bruker AMX 500 usando software Bruker habitual, tal como se describió anteriormente (Wakarchuk, W.W. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:19166-19173). Una parte de la muestra de RMN se usó para análisis de metilación. El material liofilizado se metiló con yodometano en dimetilsulfóxido que contenía una exceso de metilsuccinil-metanuro de potasio, tal como se describió anteriormente (20), mientras que la etapa de hidrólisis empleó ácido trifuoroacético 2 M.

Resultados

Producción y purificación de la \alpha-2,3-sialiltransferasa - La \alpha-2,3-sialiltransferasa de N. meningitidis se sobreexpresó en E. coli usando un constructo (pNST-18) que incluía 0,57 kb de la secuencia aguas arriba original, el gen estructural completo de una secuencia en 5' que codifica para una cola de His_{6}. La eliminación de la secuencia aguas arriba de 0,57 kb redujo la producción de la \alpha-2,3-sialiltransferasa en al menos el 90% (datos no mostrados) y, en consecuencia, esta secuencia se incluyó para la sobreexpresión, aunque los motivos de este efecto no se han investigado. Un cultivo de 21 L de E. coli BMH71-18 dio una producción de 750 U/L tras 17 h de inducción con IPTG. Cuando los homogenizados celulares se fraccionaron en una secuencia de centrifugaciones de 20.000 x g y 205.800 x g, el 45% de la actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa se encontró en el sedimento de 20.000 x g, el 50% de la actividad se encontró en el sedimento de 205.800 x g y menos del 5% de la actividad se encontró en el sobrenadante de 205.800 x g. El análisis mediante SDS-PAGE (figura 1) seguido por detección con un anticuerpo anti-His_{6}, confirmaron que la \alpha-2,3-sialiltransferasa estaba asociada con las membranas (sedimento de 205.800 x g) en lugar de con la fracción soluble del extracto (sobrenadante de 205.800 x g).

Usando tampones que contenían Triton X-100 al 0,2%, se pudo extraer el 60 - 70% de la actividad asociada con las membranas. El análisis mediante SDS-PAGE seguido por densitometría de barrido del gel teñido con Coomassie indicó que la \alpha-2,3-sialiltransferasa representaba el 35% de la proteína total presente en el extracto de Triton X-100 (figura 1). A partir de esto, se calculó que la cantidad total de \alpha-2,3-sialiltransferasa en el extracto de un cultivo de 1 L era de \sim 250 mg. El extracto de Triton X-100 se aplicó a una columna de IMAC (cromatografía de afinidad por metales inmovilizados) y la \alpha-2,3-sialiltransferasa se eluyó en las fracciones que contenían imidazol entre 400 y 550 mM. La \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada tenía una actividad específica de 1,44 U/mg y el rendimiento en la purificación fue del 1,1% (tabla 1).

El análisis mediante SDS-PAGE de la \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada mostró dos bandas con masa molecular aparente de 41 kDa y 83 kDa, respectivamente. Dado que la secuencia de aminoácidos deducida predice una masa de 43,4 kDa, se supone que la banda de 41 kDa es una forma monomérica de la \alpha-2,3-sialiltransferasa, mientras que la forma de 83 kDa sería una forma dimérica. La densitometría de barrido del gel indicó que la forma monomérica y la forma dimérica representaban el 90% y el 10%, respectivamente, de la proteína purificada total. Ambas bandas se detectaron mediante el anticuerpo anti-His_{6} y ambas fueron activas cuando se cortaron partes no teñidas correspondientes del gel y se renaturalizaron en tampón que contenía Triton X-100 al 0,2% y DTT 0,2 mM. En algunas de las preparaciones también hubo una banda delgada de material de alto peso molecular que apenas entró en el gel y que también reaccionó con el anticuerpo anti-His_{6}.

Análisis de la secuencia primaria de la \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada - La secuencia observada estaba de acuerdo con la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ. ID. Número 2, GenBank U60660). La secuenciación de aminoácidos también indicó que la mayor parte de la \alpha-2,3-sialiltransferasa recombinante tenía un extremo N-terminal procesado como la secuencia principal que comenzaba con el segundo residuo (Gly), mientras que una secuencia menos abundante (pero definida) comenzaba con el residuo Met en el extremo N-terminal.

La \alpha-2,3-sialiltransferasa reducida y S-carboximetilada también se escindió usando CNBr (escisión de enlaces peptídicos adyacentes a Met) y tripsina (escisión de enlaces peptídicos adyacentes a Lys y Arg). Los péptidos se analizaron mediante CL-ESI-EM (cromatografía de líquidos - electronebulización - espectroscopia de masas) y las masas observadas se compararon con las masas de una lista generada por ordenador de todos los péptidos posibles obtenidos mediante escisión con CNBr o tripsina. Los péptidos observados suponían el 95% de la secuencia de aminoácidos deducida e incluían los péptidos N-terminal y C-terminal (CB3 y CB14).

Propiedades enzimáticas - Mediante el uso de aceptores marcados con APTS o FCHASE-LacNAc (figura 2) se observó un pH óptimo de 6 para la \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada. La actividad se estimulaba el triple por la presencia de MgCl_{2} 20 mM y el cuádruple por la presencia de MnCl_{2} 20 mM, aunque estos metales no fueron factores esenciales, puesto que la enzima todavía era activa en presencia de EDTA 5 mM. Aunque MnCl_{2} proporcionó el mejor efecto estimulador en un ensayo a corto plazo (5 min), la \alpha-2,3-sialiltransferasa precipitó en su presencia durante incubaciones a largo plazo (> 30 min). En consecuencia, se prefirió MgCl_{2} para la síntesis preparativa. El DTT no tuvo efecto sobre la actividad cuando se ensayó en el intervalo de 1 - 20 mM. Los nucleótidos CMP y CDP fueron inhibitorios; una concentración de 1 mM de CMP produjo una inhibición del 80% en un ensayo habitual, y la CDP produjo una inhibición del 40% a la misma concentración.

Sialización de FCHASE-N-acetil-lactosamina con ácido N-acetil-, N-propionil- y N-glucolil-neuramínico - La capacidad de la \alpha-2,3-sialiltransferasa para usar donantes distintos a CMP-Neu5Ac se probó usando reacciones acopladas con CMP-Neu5Ac sintetasa de N. meningitidis para activar Neu5Gc o Neu5Pr en presencia de CTP. Una reacción control con Neu5Ac dio la conversión completa del aceptor (FCHASE-LacNAc) en 60 min, mientras que la reacción con Neu5Pr tardó 90 min en alcanzar la finalización. La reacción con Neu5Gc alcanzó una conversión superior al 90% tras 120 min de incubación. Los productos se analizaron mediante espectrometría de masas y las masas observadas estuvieron dentro del 0,1% de las masas esperadas, lo que confirma que en cada caso, el aceptor se ha sializado con el análogo de ácido siálico esperado (Neu5Ac, Neu5Gc o Neu5Pr).

Estudio de los aceptores oligosacáridos para la \alpha-2,3-sialiltransferasa - La especificidad por el aceptor de la \alpha-2,3-sialiltransferasa se estudió primero cualitativamente usando varios oligosacáridos marcados con fluoróforo que contenían un residuo de Gal terminal (tabla II). El estudio de oligosacáridos marcados con FCHASE indicó que la \alpha-2,3-sialiltransferasa puede usar Gal unido tanto en \alpha como en \beta como aceptor. El Gal podía ser un glucoconjugado monosacárido, pero la enzima también usará el Gal-\alpha cuando se una a Gal-\beta(1\rightarrow4)-Glc-\beta como en el antígeno P^{K} y el Gal-\beta cuando se una a Glc o GlcNAc.

El hecho de que el ácido siálico fuera \alpha-(2\rightarrow3) para el Gal-\alpha cuando se usó FCHASE-P^{K} como el aceptor se confirmó mediante análisis de metilación y a partir de una asignación detallada de los espectros de RMN del producto de una síntesis preparativa de este compuesto. La hidrólisis ácida de una muestra permetilada de producto sializado dio aproximadamente una cantidad molar igual de 2,4,6-tri-O-metil-Gal:2,3,6-tri-O-metil-Gal y 2,3,6-tri-O-metil-Glc. Esto indicó que el resto de oligosacárido contenía residuos de Gal unidos en 3, de Gal unidos en 4 y de Glc unidos en 4. La asignación completa de los espectros de RMN del producto sializado se logró mediante experimentos de correlación de desplazamiento químico ^{1}H-^{1}H y ^{1}H-^{13}C (tabla III). Los datos de desplazamiento químico concuerdan con la estructura propuesta (Masoud, H. et al. (1997) Biochemistry 36:2091-2103; los valores de desplazamiento a campo bajo para las resonancias de C-3 y H-3 de Gal-\alpha en comparación con los análogos no sustituidos [^{1}H: aproximadamente 0,2 ppm, ^{13}C: aproximadamente 2,8 ppm, (Masoud, H. et al. (1997) Biochemistry 36:2091-2103)] que son indicativos de la unión Neu5Ac-\alpha-(2-3)-Gal-\alpha, fueron indicativos además de la aparición de un NOE entre los protones H-3 de Neu5Ac y los residuos Gal-\alpha.

El estudio de los oligosacáridos marcados con TMR demostró que la \alpha-2,3-sialiltransferasa puede usar un Gal terminal que se une, o bien mediante \beta-(1\rightarrow3) o \beta-(1\rightarrow4) a GlcNAc, siempre que GlcNAc no esté sustituido con fucosa (por ejemplo, Lewis X). La \alpha-2,3-sialiltransferasa también toleró azufre como átomo de unión, ya que se observó formación de producto con Gal-\beta-tio-FCHASE y Gal-\beta-(1\rightarrow4)-GlcNAc-\beta-tio-FCHASE.

Determinación de las constantes cinéticas - Se encontró una K_{m} aparente de 20 \muM para el donante CMP-Neu5Ac usando como aceptor, o bien LacNAc-APTS (a 0,8 mM) o lacto-N-neotetraosa-APTS (a 0,2 mM). No se observó inhibición de sustrato significativa cuando la enzima se ensayó con hasta CMP-Neu5Ac 1 mM. Mediante el uso de una concentración de CMP-Neu5Ac de 200 \muM, se determinaron las constantes cinéticas para varios oligosacáridos marcados con APTS (tabla IV). La \alpha-2,3-sialiltransferasa mostró actividad comparable hacia los dos aceptores monosacáridos (Gal unido en \alpha y en \beta). Se observó una disminución de 5,5 veces en la K_{cat}/K_{m} aparente cuando el Gal terminal estaba unido en \alpha-(1\rightarrow4) a Gal-\beta-(1\rightarrow4)-Glc-\beta. Por otra parte, la K_{cat}/K_{m} aparente hacia el Gal-\beta terminal aumentó 5 veces cuando se unió en \beta-(1\rightarrow4) a GlcNAc(LacNAc) y en 10 veces cuando el aceptor fue lacto-N-neotetraosa. Sin embargo, la K_{cat}/K_{m} aparente con Gal unido en \beta-(1\rightarrow3) en la lacto-N-tetraosa fue comparable a los aceptores monosacáridos y, en consecuencia, fue 10 veces inferior que el Gal unido en \beta-(1\rightarrow4) en la lacto-N-neotetraosa.

Discusión

Los exámenes de la especificidad por el aceptor de varias \alpha-2,3-sialiltransferasas de mamífero han demostrado que son específicas para el azúcar terminal, el azúcar contiguo al Gal terminal y la unión entre estos dos azúcares (Kitagawa, H. et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:375-382). Se determinó la afinidad de la enzima bacteriana por varios aceptores para comparar sus propiedades con las de sus equivalentes en mamíferos, y para evaluar su idoneidad para su uso en la síntesis quimio-enzimática. Los parámetros cinéticos enzimáticos se midieron con sacáridos marcados con APTS que tenían la ventaja de ser más solubles que los sacáridos marcados con FCHASE y que todavía eran adecuados para el ensayo ultrasensible que usa electroforesis capilar y detección de fluorescencia inducida por láser. Se observó que la enzima bacteriana estaba influida por las uniones al penúltimo azúcar, pero que modificaría un Gal terminal que estuviera unido en \alpha, o bien a Gal o a aglucona. El número de recambio y la constante de especificidad de tales aceptores (tabla IV) demuestran que se usan razonablemente bien.

Los valores de K_{m} y k_{cat} aparentes para los otros aceptores indicaron que la \alpha-2,3-sialiltransferasa tenía actividad que concordaba con qué oligosacáridos están presentes como aceptores en el LOS original de inmunotipo L3. Por tanto, tal como podría predecirse, la lacto-N-neotetraosa mostró la k_{cat}/K_{m} más alta, mientras que el disacárido LacNAc fue casi tan específico. La \alpha-2,3-sialiltransferasa también puede unirse a lacto-N-tetraosa, pero como el Gal terminal se une en \beta-(1\rightarrow3), la actividad es 10 veces inferior que con la lacto-N-neotetraosa. Las \alpha-2,3-sialiltransferasas de mamífero también pueden usar Gal unido en \beta-(1\rightarrow3) y \beta-(1\rightarrow4), pero algunas tienen preferencia por Gal-\beta-(1\rightarrow3), mientras que otras tienen preferencia por Gal-\beta-(1\rightarrow4) y una razón de actividades similar a la observada con la enzima bacteriana (Kitagawa, H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:1394-1401).

Se ha demostrado que algunas sialil-transferasas de mamífero pueden usar análogos diferentes de los donantes de ácido siálico y esta propiedad puede usarse para sintetizar oligosacáridos sializados con actividad biológica modificada (Higa, H.H. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:8838-8849; Zou, W. et al. (1996) Carbohydr. Res. 296:209-228). Usando reacciones acopladas con CMP-Neu5Ac sintetasa de N. meningitidis, se encontró que la \alpha-2,3-sialiltransferasa de N. meningitidis podía usar donantes alternativos, tales como Neu5Pr y Neu5Gc, aunque a tasas inferiores que con Neu5Ac.

El estudio cualitativo de los oligosacáridos aceptores demostró que la \alpha-2,3-sialiltransferasa de N. meningitidis tolerará azufre como átomo de unión, tanto en el caso de un aceptor monosacárido (\beta-Gal-tio-FCHASE) como en el caso de un disacárido (Gal-\beta-(1\rightarrow4)-GlcNAc-\beta-tio-FCHASE). Esta propiedad será útil para sintetizar oligosacáridos activados para usarse como donantes en las síntesis químicas (Rademann, J. et al. (1996), Tetrahedron Lett. 37:3989-3990).

La \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada requirió la presencia de Triton X-100 para mantenerse en disolución y tenía una tendencia a precipitar cuando se concentraba por encima de 1 mg/mL (de 1 a 2 U/mL) por ultrafiltración. Los intentos para separar la forma dimérica de la forma monomérica mediante filtración en gel fracasaron, puesto que ambas formas eluían en un único pico muy ancho, mientras que el rendimiento general fue muy bajo. Se sabe que la \alpha-2,3-sialiltransferasa purificada tiende a formar agregados y pueden perderse fácilmente mediante absorción no específica, incluso en presencia de detergente. De hecho, la \alpha-2,3-sialiltransferasa de Neisseria nunca se ha purificado de una fuente natural y el bajo rendimiento de purificación obtenido a partir de un sistema de sobreexpresión sugiere por qué la purificación de esta enzima a partir de una fuente natural es muy difícil. La localización exacta (membrana interna o externa) no se ha determinado experimentalmente, pero no hay duda de que la \alpha-2,3-sialiltransferasa está asociada a las membranas, tanto en Neisseria como cuando se sobreexpresa en E. coli.

Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto habitual en la técnica y están englobadas por las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento se incorporan aquí como referencia para todos los efectos.

TABLA I

1

TABLA II

2

3

	a = unión de aminohexiltio a FCHASE
	b = unión de fenilamino a FCHASE
	c = unión de hidracinocarboniloctil (Lemieux) a TMR

TABLA III

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{140mm}  ^{a} Los desplazamientos químicos
de primer orden medidos a 37ºC en D _{2} O tienen como referencia la
resonancia de metilo de la acetona (2,225 ppm para   ^{1} H y 31,07
ppm para  ^{13} C). Para cada residuo de azúcar se registran los 
datos de  ^{1} H en la columna de la izquierda y los datos de
 ^{13} C en la  columna de la derecha. Dentro del error
experimental, los datos de  desplazamiento químico para el resto de
amida del ácido 
fenilamino-(6-5-(fluoresceín-carboxamido)-hexanoico
son los mismos que los  notificados anteriormente (9).
\end{minipage} \cr}

TABLA IV

5

\text{*}Este azúcar es el sitio de aminación reductiva con APTS y, por tanto, el anillo está abierto.

SEQ. ID. números 1 y 2
LOCUS	NMU60661 1116 pb ADN BCT 15-SEP-1996
DEFINICIÓN	Gen de la \alpha-2,3-sialiltransferasa de Neisseria meningitidis, completo
	cds.
ACCESO	U60661
PALABRAS CLAVE
FUENTE	Neisseria meningitidis
\hskip0,2cm ORGANISMO	Neisseria meningitidis
	Eubacteria; Proteobacteria; subdivisión beta; Neisseriaceae; Neisseria
REFERENCIA	1 (bases 1 a 1116)
\hskip0,2cm AUTORES	Gilbert, M., Watson, D.C., Cunningham, A. -M., Jennings, M.P., Young, N.M. y Wakarchuck,
	W.W.
\hskip0,2cm TÍTULO	Cloning of the lipooligosaccharide \alpha-2,3-sialyltransferase from the bacterial pathogens Neisseria
	meningitidis and Neisseria gonorrhoeae
\hskip0,2cm REVISTA	No publicado
REFERENCIA	2 (bases 1 a 1116)
\hskip0,2cm AUTORES	Gilbert, M., Michniewicz, J.J., Watson, D.C. y Wakarchuck, W.W.
\hskip0,2cm TÍTULO	Presentación directa
\hskip0,2cm REVISTA	Presentado (13-JUN-1996) Institute for Biological Sciences, National Research Council of Cana-
	da, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario K1A OR6, Canadá
CARACTERÍSTICAS	\hskip1cm Localización / Clasificadores
\hskip1,4cm fuente	\hskip1cm 1..1116
	\hskip1cm /organismo = "Neisseria meningitidis"
	\hskip1cm /cepa = "406Y, NRCC 4030"
	\hskip1cm /nota = "Tipo de cápsula: Y; tipo de lipooligosacárido: L3"
\hskip1,4cm CDS	\hskip1cm 1..1116
	\hskip1cm /nota = "La actividad del producto génico se determinó experimentalmente"
	\hskip1cm /codón_inicio = 1
	\hskip1cm /traduc_tabla = 11
	\hskip1cm /producto = "alfa-2,3-sialiltransferasa"
SEQ. ID. número 1
RECUENTO DE BASES	306 a \hskip1cm 231 c \hskip1cm 292 g \hskip1cm 287 t
ORIGEN

6

7

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SEQ. ID. número 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

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SEQ. ID. números 3 y 4
LOCUS	NGU60664 1116 pb ADN BCT 15-SEP-1996
DEFINICIÓN	Gen de la alfa-2,3-sialiltransferasa de Neisseria gonorrhoeae, completo
	cds.
ACCESO	U60664
PALABRAS CLAVE
FUENTE	Neisseria gonorrhoeae
\hskip0,2cm ORGANISMO	Neisseria gonorrhoeae
	Eubacteria; Proteobacteria; subdivisión beta; Neisseriaceae; Neisseria
REFERENCIA	1 (bases 1 a 1116)
\hskip0,2cm AUTORES	Gilbert, M., Watson, D.C., Cunningham, A. -M., Jennings, M.P., Young, N.M. y Wakarchuck,
	W.W.
\hskip0,2cm TÍTULO	Cloning of the lipooligosaccharide alpha-2,3-sialyltransferase from the bacterial pathogens
	Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae
\hskip0,2cm REVISTA	No publicado
REFERENCIA	2 (bases 1 a 1116)
\hskip0,2cm AUTORES	Gilbert, M., Michniewicz, J.J., Watson, D.C. y Wakarchuck, W.W.
\hskip0,2cm TÍTULO	Presentación directa
\hskip0,2cm REVISTA	Presentado (13-JUN-1996) Institute for Biological Sciences, National Research Council of
	Canada, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario K1A OR6, Canadá

CARACTERÍSTICAS	\hskip1cm Localización / Clasificadores
\hskip1,4cm fuente	\hskip1cm 1..1116
	\hskip1cm /organismo = "Neisseria gonorrhoeae"
	\hskip1cm /cepa = "F62"
\hskip1,4cm CDS	\hskip1cm 1..1116
	\hskip1cm /nota = "La actividad del producto génico se determinó experimentalmente"
	\hskip1cm /codón_inicio = 1
	\hskip1cm /traduc_tabla = 11
	\hskip1cm /producto = "alfa-2,3-sialiltransferasa"
SEQ. ID. número 3
RECUENTO DE BASES	299a \hskip1cm 232c \hskip1cm 301g \hskip1cm 284t
ORIGEN

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9

\newpage

SEQ. ID. número 4

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10

Claims (40)

1. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa y que hibrida con el ácido nucleico de la SEQ. ID. número 1 en una disolución que contiene ion Na^{+} 1,0 M, pH 7,0 - 8,3, a una temperatura de 60ºC.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que la secuencia polinucleotídica codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia polinucleotídica codifica para una \alpha2,3-sialiltransferasa, tal como se muestra en la SEQ. ID. número 2.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia polinucleotídica es tal como se muestra en la SEQ. ID. número 1.

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico se aísla de Neisseria meningitidis.

6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de promotor unida funcionalmente a la secuencia polinucleotídica.

7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que la secuencia polinucleotídica está unida además a una segunda secuencia polinucleotídica que codifica para un segundo polipéptido.

8. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que el promotor es activo en células eucariotas.

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que el promotor es activo en células procariotas.

10. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que el promotor es activo en E. coli.

11. Molécula aislada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa que tiene una secuencia tal como se muestra en la SEQ. ID. número 2.

12. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa y que hibrida con el ácido nucleico de la SEQ. ID. número 3 en una disolución que contiene ion Na^{+} 1,0 M, pH 7,0 - 8,3, a una temperatura de 60ºC.

13. Ácido nucleico según la reivindicación 12, en el que la secuencia polinucleotídica codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD.

14. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que la secuencia polinucleotídica codifica para una \alpha2,3-sialiltransferasa, tal como se muestra en la SEQ. ID. número 4.

15. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que la secuencia polinucleotídica es tal como se muestra en la SEQ. ID. número 3.

16. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que la molécula de ácido nucleico se aísla de Neisseria gonorrhoeae.

17. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, que comprende además una secuencia de promotor unida funcionalmente a la secuencia polinucleotídica.

18. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que la secuencia polinucleotídica está unida además a una segunda secuencia polinucleotídica que codifica para un segundo polipéptido.

19. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 17, en la que el promotor es activo en células eucariotas.

20. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 17, en la que el promotor es activo en células procariotas.

21. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 20, en la que el promotor es activo en E. coli.

22. Molécula aislada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa que tiene una secuencia tal como se muestra en la SEQ. ID. número 4.

23. Célula que comprende un cassette de expresión recombinante que contiene un promotor funcionalmente unido a una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa y que hibrida con el ácido nucleico de la SEQ. ID. número 1 o la SEQ. ID. número 3 en una disolución que contiene ion Na^{+} 1,0 M, pH 7,0 - 8,3, a una temperatura de 60ºC.

24. Célula según la reivindicación 23, en la que la célula es una célula procariota.

25. Célula según la reivindicación 23, en la que la célula es E. coli.

26. Célula según la reivindicación 23, en la que la célula es una célula eucariota.

27. Célula según la reivindicación 23, en la que la secuencia polinucleotídica es la SEQ. ID. número 1.

28. Célula según la reivindicación 23, en la que la secuencia polinucleotídica es la SEQ. ID. número 3.

29. Polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa aislado que tiene una secuencia idéntica en al menos el 80% a la SEQ. ID. número 2.

30. Polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa según la reivindicación 29 que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD.

31. Polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa según la reivindicación 29 que tiene una secuencia tal como se muestra en la SEQ. ID. número 2.

32. Polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa aislado que tiene una secuencia idéntica en al menos el 80% a la SEQ. ID. número 4.

33. Polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa según la reivindicación 32 que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD.

34. Polipéptido \alpha2,3-sialiltransferasa según la reivindicación 32 que tiene una secuencia tal como se muestra en la SEQ. ID. número 4.

35. Método de añadir un residuo de ácido siálico a una molécula aceptora que comprende un residuo de galactosa terminal, comprendiendo el método poner en contacto la molécula aceptora con una molécula de ácido siálico activado y una \alpha2,3-sialiltransferasa que tiene una secuencia idéntica en al menos el 80% a la SEQ. ID. número 2 o a la SEQ. ID. número 4.

36. Método según la reivindicación 35, en el que el residuo de galactosa terminal está unido a través de una unión \alpha a un segundo residuo en la molécula aceptora.

37. Método según la reivindicación 35, en el que el residuo de galactosa terminal está unido a través de una unión \beta a un segundo residuo en la molécula aceptora.

38. Método según la reivindicación 37, en la que la unión es una unión \beta1,4.

39. Método según la reivindicación 37, en la que la unión es una unión \beta1,3.

40. Método según la reivindicación 35, en la que el ácido siálico activado es CMP-Neu5Ac.