ES2269098T3 - Glicosil transferasas de campilobacter para la biosintesis de gangliosidos e imitaciones de gangliosidos. - Google Patents
Glicosil transferasas de campilobacter para la biosintesis de gangliosidos e imitaciones de gangliosidos. Download PDFInfo
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Abstract
Una molécula aislada o recombinante de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que tiene la actividad de aciltransferasa para la biosíntesis del lípido A, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1; b) un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1; c) un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptidocontiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1 sobre una región de al menos 100 aminoácidos de longitud; d) un polipéptido que tiene la actividad de la a1, 4-GalNAc transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 77% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud.
Description
Glicosil transferasas de campilobácter para la
biosíntesis de gangliósidos e imitaciones de gangliósidos.
Esta invención pertenece al campo de la síntesis
enzimática de oligosacáridos, que incluye a los gangliósidos y a las
imitaciones de los gangliósidos.
Los gangliósidos son una clase de glicolípidos
que se encuentran a menudo en las membranas celulares, y que
consisten de tres elementos. Uno o más residuos de ácido salicílico
que están unidos a un oligosacárido o a una fracción del núcleo de
un carbohidrato, que a su vez está unida a una estructura lipídica
hidrófoba (ceramida) que generalmente está embebida en la membrana
celular. La fracción de ceramida incluye a la porción base de una
cadena larga (LCB) y a una porción de ácido graso (FA). Los
gangliósidos, así como otros glicolípidos y sus estructuras en
general, son discutidas en, por ejemplo, Lehninger,
Biochemistry (Worth Publishers, 1981) páginas
287-295 y Devlin, Textbook of Biochemistry
(Wiley-Liss, 1992). Los gangliósidos se clasifican
de acuerdo al número de monosacáridos en la fracción del
carbohidrato, así como el número y ubicación de los grupos de ácido
siálico presentes en la fracción del carbohidrato. A los
monosialogangliósidos se los designa como "GM", a los
disialogangliósidos se los designa como "GD", a los
trisialogangliósidos como "GT", y a los tetrasialogangliósidos
se los designa como "GQ". Los gangliósidos pueden ser
clasificados además dependiendo de la posición o posiciones del
residuo del ácido siálico o los residuos enlazados. Otra
clasificación se basa el número de sacáridos presentes en el núcleo
oligosacárido, con el subíndice "1" que designa a un
gangliósido que tiene cuatro residuos sacáridos
(Gal-Gal-NAc-Gal-Glc-Ceramida),
y los subíndices "2", "3" y "4" que representan a los
gangliósidos trisacáridos
(Gal-NAc-Gal-Glc-Ceramida),
disacáridos (Gal-Glc-Ceramida) y
monosacáridos (Gal-Ceramida), respectivamente.
Los gangliósidos son más abundantes en el
cerebro, particularmente en los terminales nerviosos. Se cree que
están presentes en los sitios receptores para los neurotransmisores,
que incluyen acetilcolina, y pueden actuar también como receptores
específicos para otras macromoléculas biológicas, que incluyen
interferón, hormonas, virus, toxinas bacteriales, y similares. Los
gangliósidos han sido utilizados para el tratamiento de desordenes
del sistema nervioso, que incluyen ataques de isquemia cerebral.
Ver, por ejemplo, Mahadnik y colaboradores (1988) Drug
Development Res. 15: 337-360; las patentes
estadounidenses Nos. 4.710.490 y 4.347.244; Horowitz (1988) Adv.
Exp. Med. And Biol. 174: 593-600; Karpiatz y
colaboradores (1984) Adv. Exp. Med. and Biol. 174:
489-497. Ciertos gangliósidos son encontrados sobre
la superficie de células hematopoyéticas humanas (Hildebrand y
colaboradores (1972), Biochim. Biophys. Acta 260:
272-278; Macher y colaboradores (1981) J. Biol.
Chem. 256: 1968-1974; Dacremont y colaboradores,
Biochim. Biophys. Acta 424: 315-322; Klock y
colaboradores (1981), Blood Cells 7: 247) que pueden jugar un
papel en la diferenciación granulocítica terminal de estas células.
Nojiri y colaboradores (1988) J. Biol. Chem. 263:
7443-7446. Estos gangliósidos, mencionados como la
serie "neolacto", tienen estructuras oligosacáridas de núcleo
neutro que tienen la fórmula
[Gal\beta-(1,4)GlcNAc\beta(1,3)]_{n}Gal\beta(1,4)Glc,
donde n = 1-4. Incluidos dentro de estos
gangliósidos de la serie neolacto están 3'-nLM_{1}
(NeuAc\alpha(2,3)Gal\beta(1,4)GlcNAc\beta(1,3)Gal\beta(1,4)-Glc\beta(1,1)-Ceramida)
y 6'-nLM_{1}
(Neu-Ac\alpha(2,6)Gal\beta
(1,4)GlcNAc\beta(1,3)Gal\beta(1,4)-Glc\beta(1,1)-Ceramida).
Las "imitaciones" de gangliósido se asocian
con algunos organismos patógenos. Por ejemplo, los oligosacáridos de
núcleos de bajo peso molecular LPS de las cepas O:19 de
Campylobacter jejuni demostraron exhibir mimetismo molecular
de gangliósidos. Desde finales de los 1970, Campylobacter jejuni ha
sido reconocido como una causa importante de gastroenteritis aguda
en humanos (Skirrow (1977) Brit. Med. J. 2:
9-11). Los estudios epidemiológicos han mostrado que
las infecciones con Campylobacter son más comunes en los países
desarrollados que las infecciones con Salmonella y que también son
una causa importante de enfermedades diarreicas en los países en
desarrollo (Nachamkin y colaboradores (1992), Campylobacter
jejuni: Current Status and Future Trends. American Society for
Microbiology, Washington, DC.). Además de causar gastroenteritis
aguda, las infecciones con C. jejuni han sido implicadas
como un antecedente frecuente para el desarrollo del síndrome de
Guillain-Barré, una forma de neuropatía que es la
causa más común de parálisis generalizada (Ropper (1992) N. Engl.
J. Med. 326: 1130-1136). El serotipo más común
de C. jejuni asociado con el síndrome de
Guillain-Barré es el O:19 (Kuroki (1993), Ann.
Neurol. 33: 243-247) y esto empujó el estudio
detallado de la estructura del lipopolisacárido (LPS) de las cepas
que pertenecen a este serotipo (Aspinall y colaboradores (1994a),
Infect. Immun. 62: 2122-2125; Aspinall y
colaboradores (1994b), Biochemistry 33:
241-249; y Aspinall y colaboradores (1994c)
Biochemistry 33: 250-255).
Las fracciones terminales de oligosacárido
idénticas a aquellas de los glicósidos GD1a, GD3, GM1 y GT1a han
sido encontradas en diferentes cepas O:19 de C. jejuni.
OH4384 de C. jejuni pertenece al serotipo O:19 y fue aislado
de un paciente que desarrollo el síndrome
Guillain-Barré seguido de un ataque de diarrea
(Aspinall y colaboradores (1994a), supra.). Mostró poseer un
LPS del núcleo exterior que imita al gangliósido trisialilado GT1a.
El mimetismo molecular de las estructuras huésped por las porciones
de sacárido de LPS se considera que es un factor de virulencia de
diferentes patógenos de la mucosa que usarían esta estrategia para
evadir la respuesta inmunológica (Moran y colaboradores (1996a)
FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16: 105-115;
Moran y colaboradores (1996b) J. Endotoxin Res. 3:
521-531).
Consecuentemente, la identificación de los genes
involucrados en la síntesis de LPS y el estudio de su regulación son
de considerable interés para una mejor comprensión de los mecanismos
de la patogénesis utilizados por estas bacterias. Además, el uso de
gangliósidos como reactivos terapéuticos, así como el estudio de la
función de los gangliósidos, se facilitarían por medio de métodos
convenientes y eficientes de sintetizar a los gangliósidos deseados
y a las imitaciones de los gangliósidos. Se ha descrito una
aproximación química y enzimática combinada para la síntesis de
3'-nLM_{1} y de 6'-nLM (Gaudini y
Paulson (1994), J. Am. Chem. Soc. 116:
1149-1159). Sin embargo, los métodos enzimáticos
anteriormente disponibles para la síntesis de gangliósidos, sufre
de dificultades en la producción eficiente de enzimas en cantidades
suficientes, a un costo suficientemente bajo, para la síntesis
práctica de gangliósidos a gran escala. Por lo tanto, existe la
necesidad de nuevas enzimas involucradas en la síntesis de
gangliósidos que sea flexible para la producción a gran escala.
Existe también la necesidad de métodos más eficientes para la
síntesis de gangliósidos. La presente invención cumple con estas y
otras necesidades.
Las Figuras 1A-1C muestran las
estructuras del núcleo exterior del lipooligosacárido (LOS) de las
cepas O:19 de C. jejouni. Estas estructuras fueron descritas
por Aspinall y colaboradores (1994), Biochemistry 33,
241-249, y las porciones que muestran similitud con
la porción de oligosacárido de los gangliósidos está delimitada por
cajones. Figura 1A: El LOS de la serocepa O:19 de C. jejuni
(ATCC #43446) tiene similitud estructural con la porción de
oligosacárido del gangliósido GD1a. Figura 1B: El LOS de la cepa
O:19 OH4384 de C. jejuni tiene similitud estructural con la
porción de oligosacárido del gangliósido GT1a. Figura 1C: El LOS de
OH4382 de C. jejuni tiene similitud estructural con la
porción de oligosacárido del gangliósido GD3.
Figuras 2A-2B muestra la
organización genética del locus cst-I de
OH4384 y la comparición de los loci para la biosíntesis del LOS de
OH4384 y NCTC 11168. La distancia entre las marcas en la escala es
de 1 kb. La Figura 2A muestra una representación esquemática del
locus cst-I de OH4384, con base en la
secuencia de nucleótidos que está disponible en el GenBank
(#AF130466). El gen parcial prfB es algo similar a un factor de
liberación de la cadena peptídica (GenBank #AE000537) de
Helicobacter pylori, mientras que el gen cysD y el gen
parcial cysN son similares a los genes de E. coli que
codifican a las subunidades de sulfato adenililtransferasa (GenBank
#AE000358). La Figura 2B muestra una representación esquemática del
locus para la biosíntesis del LOS de OH4384, que se basa en la
secuencia de nucleótidos del GenBank (#AF130984). La secuencia de
nucleótidos del locus para la biosíntesis del LOS de OH4384 es
idéntica a aquella de OH4384 excepto por el gen cgtA, que
está perdiendo una "A" (ver el texto y el GenBank #AF167345).
La secuencia del locus para la biosíntesis del LOS NCTC 11168 está
disponible en el Centro Sanger
(URL:http//www.sanger.ac.uk/Projects/C jejuni/). Los genes
homólogos correspondientes tienen el mismo número con una migración
"a" para los genes OH4384 y una migración "b" para los
genes NCTC 11168. Un gen único para la cepa OH4384 se muestra en
color negro y los genes únicos para NCTC 11168 se muestran en color
gris. Los #5a y #10a del ORF de OH4384 se encuentran como un ORF
de fusión en la estructura (#5b/10b) en NCTC 11168 y se denotan con
un (*). Las funciones propuestas para cada ORF se encuentran en la
Tabla 4.
La Figura 3 muestra una alineación de las
secuencias de aminoácidos deducidas para las sialiltransferasas. El
gen cst-I de H4384 (primeros 300 residuos),
el gen cst-II de OH4384 (idéntico al
cst-II de OH4382), el gen
cst-II de O:19 (serocepa) (GenBank
#AF167344), el gen cst-II de NCTC 11168 y un
ORF putativo de H. influenzae (GenBank #U32720) fueron
alineados utilizando el programa de alineación Clusta1X (Thompson y
colaboradores (1997), Nucleic Acids Res. 25,
4876-82). El sombreado fue producido por medio del
programa GenDoc (Nicholas, K. B., y Nicholas, H. B. (1997) URL:
http://www.cris.com/\simketchup/gendoc.shtml).
La Figura 4 muestra un esquema para la síntesis
enzimática de las imitaciones del gangliósido utilizando las
glicosiltransferasas de C. jejuni de OH4384. Partiendo de una
molécula aceptora sintética, se sintetizó una serie de imitaciones
del gangliósido con una
\alpha-2,3-sialiltransferasa
(Cst-I), una
\beta-1,4-N-acetilgalactosaminiltransferasa
(CgtA), una
\beta-1,3-galactosiltransferasa
(CgtB), y una
\alpha-2,3/\alpha-2,8-sialiltransferasa
bifuncional (Cst-II) recombinantes utilizando las
secuencias mostradas. Todos los productos fueron analizados por
medio de espectrometría de masas y las masas monoisotópicas
observadas (mostradas entre paréntesis) estaban todas dentro del
0.02% de las masas teóricas. Las imitaciones GM3, GD3, GM2 y GM1a
fueron analizadas también por medio de espectroscopia de RMN (ver
Tabla 4).
La presente invención provee enzimas
glicosiltransferasas de procariotas y ácidos nucleicos que codifican
las enzimas. En una modalidad, la invención provee moléculas de
ácido nucleico aisladas y/o recombinantes que incluyen una secuencia
de polinucleótidos que codifica a un polipéptido seleccionado del
grupo que consiste de:
- (a)
- un polipéptido que tiene la actividad de acetiltransferasa para la biosíntesis del lípido A, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- (b)
- un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- (c)
- un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1 sobre una región de al menos 100 aminoácidos de longitud;
- (d)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,4-GalNAc transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 77% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- (e)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,3-Galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de la Galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- (f)
- un polipéptido que tiene ya sea la actividad de la \alpha2,3-sialiltransferasa o tanto a la actividad de la \alpha2,3-sialiltransferasa como de la \alpha2,8-sialiltransferasa, en donde el polipéptido de la Galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 66% idéntica sobre una región de al menos 60 aminoácidos de longitud hasta una secuencia de aminoácidos como la expuesta en una o más de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10;
- (g)
- un polipéptido que tiene la actividad de la ácido siálico sintasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- (h)
- un polipéptido que tiene la actividad de biosíntesis del ácido siálico, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 8021-9076 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- (i)
- un polipéptido que tiene la actividad del ácido siálico-CMP sintetasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9076-9738 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- (j)
- un polipéptido que tiene la actividad de la acetiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9729-10559 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y
- (k)
- un polipéptido que tiene la actividad de la glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por medio de un complemento inverso de los nucleótidos 10557-11366 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1.
En las modalidades actualmente preferidas, la
invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que incluye
una secuencia de polinucleótidos que codifica a uno o más de los
polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de: a) un
polipéptido de la sialiltransferasa que tiene tanto la actividad de
la \alpha2,3 sialiltransferasa como la actividad de la \alpha2,8
sialiltransferasa, en donde el polipéptido de la sialiltransferasa
tiene una secuencia de aminoácidos aproximadamente al menos 76%
idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ
ID NO: 3 sobre una región aproximadamente de al menos 60 aminoácidos
de longitud; b) un polipéptido de la GalNAc transferasa que tiene
una actividad de la \beta1,4-GalNAc transferasa,
en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia
de aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en SEQ ID NO: 13 sobre una
región aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud; y c)
un polipéptido de la galactosiltransferasa que tiene la actividad de
la \beta1,3 galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de la
galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es
aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos
como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 sobre una región
aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud.
La invención también provee casetes de expresión
y vectores de expresión en los cuales un ácido nucleico de la
galactosiltransferasa de la invención se enlaza operativamente a un
promotor y a otras secuencias de control que facilitan la expresión
de las glicosiltransferasas en una célula huésped deseada. También
se proveen células huésped recombinantes que expresan a las
glicosiltransferasas de la invención.
La invención también provee polipéptidos
producidos en forma aislada y/o en forma recombinante, seleccionados
del grupo que consiste de:
- a)
- un polipéptido que tiene la actividad de la acetiltransferasa para la biosíntesis del lípido A, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- b)
- un polipéptido que tiene la actividad de la glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- c)
- un polipéptido que tiene la actividad de la glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1 sobre una región aproximadamente de al menos 100 aminoácidos de longitud;
- d)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,4-GalNAc transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 77% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre una región aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- e)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,3-galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de la galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17 sobre una región aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- f)
- un polipéptido que tiene ya sea la actividad de la \alpha2,3-sialiltransferasa o, tanto la actividad de la \alpha2,3-sialiltransferasa como de la \alpha2,8-sialiltransferasa, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 66% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10 sobre una región de al menos 60 aminoácidos de longitud;
- g)
- un polipéptido que tiene la actividad de la ácido siálico sintasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- h)
- un polipéptido que tiene la actividad de biosíntesis del ácido siálico, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 8021-9076 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- i)
- un polipéptido que tiene la actividad de la ácido siálico-CPM sintetasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9076-9738 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- j)
- un polipéptido que tiene la actividad de la acetiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9729-10559 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y
- k)
- un polipéptido que tiene la actividad de la glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por medio de un complemento inverso de los nucleótidos 10557-11366 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1.
En las modalidades preferidas actualmente, la
invención provee polipéptidos de glicosiltransferasa que incluyen:
a) un polipéptido de sialiltransferasa que tiene tanto la actividad
de la \alpha2,3-sialiltransferasa como la
actividad de la \alpha2,8-sialiltransferasa, en
donde el polipéptido de la sialiltransferasa tiene una secuencia de
aminoácidos que es aproximadamente al menos 76% idéntica a una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3 sobre
una región de al menos 60 aminoácidos de longitud; b) un polipéptido
de la GalNAc transferasa que tiene la actividad de la
\beta1,4-GalNAc transferasa, en donde el
polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de
aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre
una región aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud; y
c) un polipéptido de la galactosiltransferasa que tiene la actividad
de la \beta1,3- galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de
la galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es
aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos
como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 o en la SEQ ID NO: 17 sobre una
región aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud.
La invención también provee mezclas de reacción
para la síntesis de un oligosacárido sialilado. Las mezclas de
reacción incluyen a un polipéptido de sialiltransferasa que tiene
tanto la actividad de la
\alpha2,3-sialiltransferasa como la actividad de
la \alpha2,8-sialiltransferasa. También están
presentes en las mezclas de reacción una fracción aceptora
galactosilada y un azúcar de sialilo-nucleótido. La
sialiltransferasa transfiere un primer residuo de ácido siálico del
azúcar de sialilo-nucleótido (por ejemplo, CMP-ácido
siálico) a la fracción aceptora galactosilada en un enlace
\alpha2,3, y se añade además un segundo residuo de ácido siálico
al primer residuo de ácido siálico en un enlace \alpha2,8.
En otra modalidad, la invención provee métodos
para sintetizar un oligosacárido sialilado. Estos métodos involucran
la incubación de una mezcla de reacción que incluye al polipéptido
de la sialiltransferasa que tiene tanto la actividad de la
\alpha2,3 sialiltransferasa como la actividad de la \alpha2,8
sialiltransferasa, una fracción aceptora galactosilada, y un azúcar
de sialilo-nucleótido, bajo condiciones adecuadas en
donde el polipéptido de la sialiltransferasa transfiere un primer
residuo de ácido siálico del azúcar de
sialilo-nucleótido a la fracción aceptora
galactosilada en un enlace \alpha2,3, y además transfiere un
segundo residuo de ácido siálico al primer residuo de ácido siálico
en un enlace \alpha2,8.
Las glicosiltransferasas, las mezclas de
reacción, y los métodos de la invención son útiles para transferir
un monosacárido desde un sustrato donante hasta una molécula
aceptora. La adición generalmente tiene lugar en el extremo no
reductor de un oligosacárido o fracción de carbohidrato sobre una
biomolécula. Las biomoléculas como se las define aquí incluyen, pero
no se limitan a, moléculas biológicamente significativas tales
carbohidratos, proteínas (por ejemplo, glicoproteínas), y lípidos
(por ejemplo, glicolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y
gangliósidos).
Las siguientes abreviaturas son utilizadas
aquí:
Ara = arabinosil,
Fru = fructosil;
Fuc = fucosil;
Gal = galactosil;
GalNAc =
N-acetilgalactosaminil;
Glc = glucosil;
GlcNAc =
N-acetilglucosaminil;
Man = manosil; y
NeuAc = sialil
(N-acetilneuraminil).
El término "ácido siálico" se refiere a
cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve
carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es el
ácido N-acetilneuramínico (ácido
2-ceto-5-acetamindo-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico
(a menudo abreviado como Neu5Ac, NeuAc, o NANA). Un segundo miembro
de la familia es el ácido N-glicolilneuramínico
(Neu5Gc o NeuGc), en el cual el grupo N-acetilo de
NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido
siálico es el ácido
2-ceto-3-desoxi-nonulosónico
(KDN) (Nadano y colaboradores (1986) J. Biol. Chem. 261:
11550-11557; Kanamori y colaboradores (1990), J.
Biol. Chem. 265: 21811-21819. También están
incluidos ácidos siálicos 9-sustituidos tales como
un
9-O-C_{1}-C_{6}
acil-Neu5Ac como
9-O-lactil-Neu5Ac o
9-O-acetil-Neu5Ac,
9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac
y
9-azido-9-deoxi-Neu5Ac.
Para una revisión de la familia del ácido siálico, ver, por ejemplo,
Varki (1992) Glycobiology 2: 25-40; Sialic
Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed.
(Springer-Verlag, New York (1992); Schauer,
Methods in Enzymology, 50: 64-89 (1987), y
Schaur, Advances in Carbohydrate Chemistry and
Biochemistry, 40: 131-234. La síntesis y el uso
de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de
sialilación se describen en la solicitud internacional WO 92/16640,
publicada en octubre 1 de 1992.
Los sustratos donantes para glicosiltransferasas
son azúcares nucleótidos activados. Tales azúcares activados
consisten generalmente de difosfatos de uridina y de guanina, y los
derivados del monofosfato de cistidina de los azúcares en los cuales
el nucleósido difosfato o monofosfato sirven como un grupo saliente.
Los sistemas bacteriales, de plantas y de hongos pueden utilizar
algunas veces a otros azúcares nucleótidos activados.
Se considera que los oligosacáridos tienen un
extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea que el sacárido en
el extremo reductor sea en realidad un azúcar reductor o no. De
acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos son
descritos aquí con el extremo no reductor a la izquierda y el
extremo reductor a la derecha.
Todos los oligosacáridos descritos aquí son
descritos con el nombre o abreviatura para el sacárido no reductor
(por ejemplo, Gal), seguido por la configuración del enlace
glicosídico (\alpha o \beta), del enlace anular, la posición del
anillo del sacárido reductor involucrado en el enlace, y luego el
nombre o abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlcNAc). El
enlazamiento entre dos azúcares se pude expresar, por ejemplo, como
2,3, 2\rightarrow3, ó (2,3). Cada sacárido es una piranosa o
furanosa.
El término "ácido nucleico" se refiere a un
polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido ya sea en forma de
cadena sencilla o doble, y a menos que se lo limite de otra manera,
abarca a los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que
hibridan a ácidos nucleicos en forma similar a los nucleótidos de
ocurrencia natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia
particular de ácido nucleico incluye a la secuencia complementaria
de la misma.
El término "operativamente enlazado" se
refiere al enlazamiento funcional entre una secuencia de control
para la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor,
secuencia de señal, u ordenación de los sitios de enlazamiento del
factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico,
en donde la secuencia de control de la expresión afecta a la
transcripción y/o la traducción del ácido nucleico correspondiente a
la segunda secuencia.
Un "polinucleótido heterólogo" o un
"ácido nucleico heterólogo", como se lo utiliza aquí, es uno
que se origina a partir de una fuente externa a la célula huésped
particular, o, si es de la misma fuente, se modifica a partir de su
forma original. Por lo tanto, un gen heterólogo de la
glicosiltransferasa en una célula huésped incluye a un gen de la
glicosiltransferasa que es endógeno a la célula huésped particular
pero que ha sido modificado. La modificación de la secuencia
heteróloga puede ocurrir, por ejemplo, por medio del tratamiento del
ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN
que sea capaz de ser operativamente enlazado a un promotor. Técnicas
tales como la mutagénesis dirigida al sitio también son útiles para
la modificación de una secuencia heteróloga.
El término "recombinante" cuando se lo
utiliza con referencia a una célula indica que la célula replica un
ácido nucleico heterólogo, o expresa a un péptido o a una proteína
codificada por un ácido heterólogo. Las células recombinantes pueden
contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no
recombinante) de la célula. Las células recombinantes también
incluyen a aquellas que contienen genes que se encuentran en la
forma nativa de la célula, pero que se modifican y se introducen
dentro de la célula a través de medios artificiales. El término
abarca también a las células que contienen un ácido nucleico
endógeno a la célula que ha sido modificado sin remover al ácido
nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen a aquellas
obtenidas por medio del reemplazo del gen, de la mutación específica
del sitio, y de técnicas relacionadas conocidas por aquellos
capacitados en el arte.
Un "ácido nucleico recombinante" es un
ácido nucleico que está en una forma que está alterada a partir de
su estado natural. Por ejemplo, el término "ácido nucleico
recombinante" incluye una región de codificación que está
operativamente enlazada a un promotor y/o a otra región de control
de la expresión, señal de procesamiento, otra región de
codificación, y similares, a las cuales el ácido nucleico no está
enlazado en su forma de ocurrencia natural. Un "ácido nucleico
recombinante" también incluye, por ejemplo, una región de
codificación u otro ácido nucleico en el cual uno o más nucleótidos
han sido sustituidos, suprimidos, insertados, comparados con el
correspondiente ácido nucleico de ocurrencia natural. Las
modificaciones incluyen a aquellos introducidos por medio de una
manipulación in vitro, modificación in vivo, métodos
de síntesis, y similares.
Un "polipéptido producido en forma
recombinante" es un polipéptido que es codificado por un ácido
nucleico heterólogo y/o recombinante. Por ejemplo, un polipéptido
que se expresa a partir de un ácido nucleico que codifica a la
glicosiltransferasa del C. jejouni que se introduce en E.
coli es un "polipéptido producido en forma recombinante".
Una proteína expresada a partir de un ácido nucleico que está
operativamente enlazado a un promotor no nativo, es un ejemplo de un
"polipéptido producido en forma recombinante". Los polipéptidos
de la invención producidos en forma recombinante, pueden ser
utilizados para sintetizar a los gangliósidos y a otros
polisacáridos en su forma no purificada (por ejemplo, como un lisado
celular o una célula intacta), o después de ser parcial o
completamente purificada.
Un "casete de expresión recombinante" o
simplemente un "casete de expresión" es una construcción de
ácido nucleico generado en forma recombinante o sintética, con los
elementos del ácido nucleico que son capaces de afectar la expresión
de un gen estructural en huéspedes compatibles con tales secuencias.
Los casetes de expresión incluyen al menos promotores y
opcionalmente, señales de terminación de la transcripción.
Típicamente, el casete de expresión recombinante incluye al ácido
nucleico que va a ser transferido (por ejemplo, un ácido nucleico
que codifica a un polipéptido deseado), y a un promotor. Los
factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión,
pueden también ser utilizados como se describe aquí. Por ejemplo, un
casete de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos
que codifican a una secuencia de señal que dirige la secreción de
una proteína expresada a partir de la célula huésped. Las señales de
terminación de la transcripción, las reforzadoras, y otras
secuencias de ácido nucleico que influencian a la expresión génica,
también pueden ser incluidas en un casete de expresión.
Una "subsecuencia" se refiere a una
secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que contienen una parte
de una secuencia más larga de ácidos nucleicos o aminoácidos (por
ejemplo, un polipéptido), respectivamente.
El término "aislado" es para referirse al
material que está sustancial o esencialmente libre de los
componentes que normalmente acompañan al material tal como se
encuentra en su estado nativo. Típicamente, las proteínas aisladas o
los ácidos nucleicos de la invención son aproximadamente al menos
80% puros, usualmente aproximadamente al menos 90%, y
preferiblemente aproximadamente al menos 95% puros. La pureza o la
homogeneidad se pueden indicar por medio de un cierto número de
formas bien conocidas en el estado del arte, tales como la
electroforesis en gel de agarosa o en gel de poliacrilamida de una
muestra de proteína o de ácido nucleico, seguida de la visualización
por medio de coloración. Para ciertos propósitos se necesitará alta
resolución y HPLC o un medio similar para la purificación
utilizada. Una enzima "aislada", por ejemplo, es una que está
sustancial o esencialmente libre de componentes que interfieran con
la actividad de la enzima. Un "ácido nucleico aislado" incluye,
por ejemplo, a una que no está presente en el cromosoma de la célula
en la cual el ácido nucleico ocurre en forma natural.
Los términos "idéntico" o porcentaje de
"identidad", en el contexto de dos o más ácidos secuencias de
ácido nucleico o de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias
o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje
especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que son
iguales, cuando se las compara y alinea para máxima correspondencia,
cuando se las mide utilizando una de los siguientes algoritmos de
comparación de secuencias, o por medio de inspección visual.
La frase "sustancialmente idénticos", en el
contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o
más secuencias o subsecuencias que tiene al menos 60%,
preferiblemente 80%, más preferiblemente 90-95% de
identidad del residuos de aminoácido o de nucleótido, cuando se los
compara y alinea para máxima correspondencia, cuando se las mide
utilizando una de los siguientes algoritmos de comparación de
secuencias, o por medio de inspección visual. Preferiblemente, la
identidad sustancial existe sobre una región de las secuencias que
es aproximadamente al menos de 50 residuos de longitud, más
preferiblemente sobre una región aproximadamente de al menos 100
residuos, y lo más preferiblemente, las secuencias son
sustancialmente idénticas sobre una región aproximadamente de al
menos 150 residuos. En la modalidad más preferida, las secuencias
son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las regiones de
codificación.
Para la comparación de secuencias, una secuencia
típicamente actúa como una secuencia de referencia, con la cual se
comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de
comparación de secuencia, se colocan en un computador las secuencias
de prueba y de referencia, se designan las coordenadas de la
subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del
programa del algoritmo de la secuencia. El algoritmo de comparación
de la secuencia calcula entonces el porcentaje de identidad de la
secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba, con
relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros
designados del programa.
La alineación óptima de las secuencias para
comparación se puede realizar, por ejemplo, por medio del algoritmo
de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.
2:482 (1981), por medio del algoritmo de alineación de homología de
Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por
medio del método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman,
Proc. Nat'l. Acad. Sci. Estados Unidos de América 85:2444
(1988), por medio de implementaciones computarizadas de estos
algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics
Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,
WI), o por medio de inspección visual (ver generalmente, Current
Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y colaboradores, eds.,
Current Protocols, una sociedad mixta entre Greene Publishing
Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995)
(Ausubel)).
Ejemplos de algoritmos que son adecuados para
determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y la similitud
de la secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se
describen en Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol.
215: 403-410 y en Altschuel y colaboradores (1977)
Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402,
respectivamente. El software para realizar los análisis con los
algoritmos BLAST está públicamente disponible a través del National
Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Por ejemplo, la comparación puede ser realizada utilizando un
algoritmo versión 2.0 de BLASTN con una longitud de palabra (W) de
11, G=5, E=2, q=-2, y r = 1, y una comparación de ambas cadenas.
Para las secuencias de los aminoácidos, puede utilizarse el
algoritmo versión 2.0 de BLASTP, con los valores por defecto de
longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1, y una matriz de
sustitución BLOSUM62. (ver, Henikoff & Henikoff, Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos de América 89:10915 (1989)).
Además de calcular el porcentaje de identidad de
secuencia, el algoritmo BLAST también efectúa un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo,
Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. Estados Unidos
de América 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la
similitud suministrada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de
la suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la
probabilidad por medio de la cual ocurriría azar una correspondencia
entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo,
un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia
si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del
ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es
aproximadamente menor que 0,1, más preferiblemente aproximadamente
menor que 0,01, y más preferiblemente aproximadamente menor que
0,001.
La frase "hibridar específicamente con", se
refiere al enlazamiento, duplicación, o hibridación de una molécula
únicamente con una secuencia particular de nucleótidos bajo
condiciones rigurosas cuando aquella secuencia está presente en una
mezcla compleja (por ejemplo, celular total) de ADN o ARN. El
término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones
bajo las cuales una sonda hibridará hasta su subsecuencia objetivo,
pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas son
dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias
diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a más
altas temperaturas. Generalmente, las condiciones rigurosas se
seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC menores que el punto
térmico de fusión (Tm) para una secuencia específica con una fuerza
iónica y de pH definidas. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza
iónica definida, pH, y concentración de ácido nucleico) a las cuales
50% de las sondas complementarias a la secuencia objetivo, hibridan
a la secuencia objetivo en el equilibrio. (ya que las secuencias
objetivo están presentes generalmente en exceso, en el Tm, 50% de
las sondas son ocupadas en el equilibrio). Típicamente, las
condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración
de sal es aproximadamente menor que 1,0 M de iones de Na,
típicamente aproximadamente desde 0,01 hasta 1,0 M de concentración
(o de otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es al menos
aproximadamente de 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50
nucleótidos) y aproximadamente al menos 60ºC para las sondas largas
(por ejemplo, mayores a 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas
pueden logarse también con la adición de agentes desestabilizantes
tales como la formamida.
Una indicación adicional de que dos secuencias
de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es
que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es
inmunológicamente reactivo en forma cruzada con el polipéptido
codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más
adelante. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente
sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo,
donde los dos péptidos difieren solamente en las sustituciones
conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido
nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas
hibridan cada una a la otra bajo condiciones rigurosas, como se
describe más adelante.
Las frases "se enlaza específicamente a una
proteína" o "es específicamente inmunoreactivo con", cuando
hace referencia a un anticuerpo se refiere a una reacción de
enlazamiento que es determinativa de la presencia de la proteína en
presencia de una población heterogénea de proteínas y de otros
biológicos. Por lo tanto, bajo las condiciones designadas del
inmunoensayo, los anticuerpos especificados se enlazan
preferencialmente a una proteína particular y no se enlazan en una
cantidad significativa de otras proteínas presentes en la muestra.
El enlazamiento específico a una proteína bajo tales condiciones
requiere de un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por
una proteína en particular. Pueden utilizarse una variedad de
formatos para el inmunoensayo para seleccionar anticuerpos
específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por
ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se utilizan
rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales
específicamente inmunoreactivos con una proteína. Ver, Harlow y Lane
(1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Publications, New York, para una descripción de los formatos del
inmunoensayo y de las condiciones que pueden ser utilizadas para
determinar la inmunoreactividad específica.
Las "variaciones conservadoramente
modificadas" de una secuencia particular de polinucleótido, se
refieren a aquellos polinucleótidos que codifican secuencias
idénticas, o esencialmente idénticas de aminoácidos, o en donde el
polinucleótido no codifica una secuencia de aminoácidos, para
secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del
código genético, un gran número de ácidos nucleicos esencialmente
idénticos codifican a cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los
codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG codifican todos al aminoácido
arginina. Por lo tanto, en cada posición en donde una arginina es
especificada por un codón, el codón puede ser alterado por
cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar al
polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son
"variaciones silenciosas", que son una especie de
"variaciones conservadoramente modificadas". Cada secuencia de
polinucleótidos descrita aquí que codifica a un polipéptido, también
describe a cada posible variación silenciosa, excepto en donde se
señaló de otra manera. Alguien experto reconocerá que cada codón en
un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón
para la metionina) puede ser modificado para producir una molécula
funcionalmente idéntica por medio de técnicas estándar. Por lo
tanto, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que
codifica a un polipéptido, está implícita en cada secuencia
descrita.
Además, alguien experto reconocerá que las
sustituciones individuales, supresiones o adiciones que alteren,
añadan o supriman un único aminoácido o un pequeño porcentaje de
aminoácidos (típicamente menos del 5%, más típicamente menos del 1%)
en una secuencia codificada son "variaciones conservadoramente
modificadas" donde las alteraciones resultan en la sustitución de
un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de
sustitución conservadora que proveen aminoácidos de funcionalidad
similar son bien conocidas en el estado de la técnica. Alguien
experto apreciará que muchas variaciones conservadoras de las
proteínas de fusión y del ácido nucleico que codifica a las
proteínas de fusión dan productos esencialmente idénticos. Por
ejemplo, debido a la degeneración del código genético, las
"sustituciones silenciosas" (esto es, sustituciones de una
secuencia de ácido nucleico que no resultan en una alteración en un
polipéptido codificado) son una característica implícita de cada
secuencia de ácido nucleico que codifica a un aminoácido. Como se
describe aquí, las secuencias se optimizan preferiblemente por la
expresión en una célula huésped particular utilizada para producir
las enzimas (por ejemplo, de levadura, humana, y similares). En
forma similar, las "sustituciones conservadoras de
aminoácidos", en uno o en unos pocos aminoácidos en una secuencia
de aminoácidos, que son sustituidas con diferentes aminoácidos con
propiedades muy similares (ver, la sección de definiciones,
supra), son también fácilmente identificadas por ser muy
similares a una secuencia particular de aminoácidos, o a una
secuencia particular de ácido nucleico que codifica a un aminoácido.
Tales variaciones sustituidas en forma conservadora de cualquier
secuencia particular son una característica de la presente
invención. Ver también, Creighton (1984) Proteins, W.H.
Freeman and Company. Además, las sustituciones individuales,
supresiones o adiciones que alteren, añadan o supriman un único
aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en una secuencia
codificada, son también "variaciones modificadas en forma
conservadora".
La presente invención provee nuevas enzimas
glicosiltransferasas, así como otras enzimas que están involucradas
en la síntesis de oligosacáridos catalizada por enzimas. Las
glicosiltransferasas de la invención incluyen sialiltransferasas,
que incluyen a una sialiltransferasa bifuncional que tiene tanto la
actividad de la \alpha2,3 sialiltransfersa como la actividad de la
\alpha2,8 sialiltransfersa. También se proveen las
\beta1,3-galactosiltransferasas, las
\beta1,4-GalNAc transferasas, las ácido siálico
sintasas, las ácido siálico-CPM sintetizas, las
acetiltransferasas, y otras glicosiltransferasas. Las enzimas de la
invención son enzimas procariotas, que incluyen a aquellas
involucradas en la biosíntesis de lipooligosacáridos (LOS) en
diferentes cepas de Campilobacter jejuni. La invención
también provee ácidos nucleicos que codifican a estas enzimas, así
como a los casetes de expresión y los vectores de expresión para uso
en la expresión de las glicosiltransferasas. En modalidades
adicionales, la invención provee mezclas de reacción y métodos en
los cuales una o más de las enzimas se utilizan para sintetizar un
oligosacárido.
Las glicosiltransferasas de la invención son
útiles para diferentes propósitos. Por ejemplo, las
glicosiltransferasas son útiles como herramientas para la síntesis
quimioenzimática de los oligosacáridos, incluidos gangliósidos y
otros oligosacáridos que tienen actividad biológica. Las
glicosiltransferasas de la invención, y los ácidos nucleicos que
codifican a las glicosiltransferasas, son también útiles para los
estudios de los mecanismos de la patogénesis de organismos que
sintetizan imitaciones de gangliósidos, tales como C.
jejouni. Los ácidos nucleicos pueden ser utilizados como
sondas, por ejemplo, para estudiar la expresión de los genes
involucrados en la síntesis de imitaciones de gangliósidos. Los
anticuerpos surgidos contra las glicosiltransferasas son también
útiles para el análisis de los patrones de expresión de estos genes
que están involucrados en la patogénesis. Los ácidos nucleicos son
también útiles para diseñar a los oligonucleótidos antisentido para
inhibir la expresión de las enzimas Campilobacter que están
involucradas en la biosíntesis de imitaciones de gangliósidos que
pueden enmascarar a los patógenos del sistema inmunológico del
huésped.
Las glicosiltransferasas de la invención proveen
varias ventajas sobre las glicosiltransferasas previamente
disponibles. Las glicosiltransferasas bacteriales tales como
aquellas de la invención pueden catalizar la formación de
oligosacáridos que son idénticos a las correspondientes estructuras
de los mamíferos. Además, las enzimas bacteriales son más fáciles y
menos costosas para producir en cantidad, comparadas con las
glicosiltransferasas de mamífero. Por lo tanto, las
glicosiltransferasas bacteriales tal como aquellas de la presente
invención son reemplazos atractivos para las glicosiltransferasas de
mamífero, que pueden ser difíciles de obtener en grandes cantidades.
Que las glicosiltransferasas de la invención sean de origen
bacterial facilita la expresión de grandes cantidades de las enzimas
que utilizan sistemas de expresión de procariotas relativamente
baratos. Típicamente, los sistemas de procariotas para la expresión
de productos polipéptidos involucran costos mucho menores que la
expresión de los polipéptidos en sistemas de cultivo celular de
mamífero.
Además, las nuevas sialiltransferasas
bifuncionales de la invención simplifican la síntesis enzimática de
moléculas biológicamente importantes, tales como gangliósidos, que
tienen un ácido siálico unido por medio de un enlazamiento
\alpha2,8 a un segundo ácido siálico, que está a su vez
\alpha2,3-enlazado a un aceptor galactosilado.
Mientras que los métodos previos para la síntesis de estas
estructuras requieren de dos sialiltransferasas separadas, solamente
se requiere una sialiltransferasa cuando se usa la sialiltransferasa
bifuncional de la presente invención. Esto evita los costos
asociados con la obtención de una segunda enzima, y puede reducir
también el número de etapas involucradas en la síntesis de estos
compuestos.
La presente invención provee los polipéptidos de
la glicosiltransferasa de procariotas, así como otras enzimas que
están involucradas en la síntesis de oligosacáridos catalizada por
la glicosiltransferasa, incluidos los gangliósidos y las imitaciones
de gangliósidos. En las modalidades actualmente preferidas, los
polipéptidos incluyen a aquellos que son codificados por marcos de
lectura abierta dentro del locus lipopolisacárido (LOS) de las
especies Campilobacter (Figura 1). Incluidas dentro de las
enzimas de la invención están las glicosiltransferasas, tales como
las sialiltransferasas (incluida una sialiltransferasa bifuncional),
las \beta1,4-GalNAc transferasas, y las
\beta1,3-galactosiltransferasas, entre otras
enzimas como las descritas aquí. También se proveen enzimas
accesorias tales como, por ejemplo, la ácido
siálico-CMP sintetasa, la ácido siálico sintasa, la
acetiltransferasa, una acetiltransferasa que está involucrada en la
biosíntesis de lípido A, y una enzima involucrada en la biosíntesis
de ácido siálico.
Las glicosiltransferasas y los polipéptidos
accesorios de la invención se pueden purificar a partir de fuentes
naturales, por ejemplo, procariotas tales como las especies
Campylobacter. En las modalidades actualmente preferidas, las
glicosiltransferasas se obtienen a partir de C. jejuni, en
particular a partir del serotipo O:19 de C. jejuni, incluidas
las cepas OH4384 y OH4382. También se proveen glicosiltransferasas y
enzimas accesorias obtenidas a partir de los serotipos 0:10, 0:41, y
0:2 de C. jejuni. Los métodos por medio de los cuales los
polipéptidos de la glicosiltransferasa pueden ser purificados
incluyen a os métodos estándar de purificación de proteína que
incluyen, por ejemplo, precipitación en sulfato de amonio, columnas
de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y
similares (ver, generalmente, R. Scopes, Protein
Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)
Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to
Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)).
En las modalidades actualmente preferidas, la
glicosiltransferasa y los polipéptidos accesorios de la enzima de la
invención, se obtienen por medio de expresión recombinante
utilizando a los ácidos nucleicos que codifican a la
glicosiltransferasa y a la enzima accesoria descritos aquí. Los
vectores de expresión y los métodos para producir a la
glicosiltransferasa son descritos en detalle más adelante.
En algunas modalidades, los polipéptidos de la
glicosiltransferasa se aislan de su medio natural, ya sea que se
hayan producido o purificado en forma recombinante a partir de sus
células naturales. Se prefieren las composiciones sustancialmente
puras aproximadamente de al menos 90 a 95% de homogeneidad para
algunas aplicaciones, y lo más preferido, de 98 a 99% o más de
homogeneidad. Una vez purificados, o hasta homogeneidad según se
desee, se pueden utilizar entonces los polipéptidos (por ejemplo,
como inmunógenos para la producción de anticuerpos, o para la
síntesis de oligosacáridos, u otros usos como los descritos aquí, o
evidentes para aquellos expertos en el arte). Las
glicosiltransferasas no necesitan, sin embargo, estar aún
parcialmente purificadas para utilizarlas para la síntesis de una
estructura deseada de un sacárido. Por ejemplo, la invención provee
enzimas producidas en forma recombinante que se expresan en una
célula huésped heteróloga y/o a partir de un ácido nucleico
recombínate. Tales enzimas de la invención pueden ser utilizadas
cuando están presentes en un lisado celular o en una célula intacta,
así como en forma purificada.
En algunas modalidades, la invención provee
polipéptidos de la sialiltransferasa. Las sialiltransferasas tiene
una actividad de \alpha2,3-sialiltransferasa, y en
algunos casos también tienen una actividad de
\alpha2,8-sialiltransferasa. Estas
sialiltransferasas bifuncionales, cuando son colocadas en una mezcla
de reacción con un aceptor sacárido adecuado (por ejemplo, un
sacárido que tiene una galactosa terminal) y un donante de ácido
siálico (por ejemplo, CMP-ácido siálico) pueden catalizar la
transferencia de un primer ácido siálico desde el donante hasta el
aceptor en un enlace \alpha2,3. La sialiltransferasa cataliza
entonces la trasferencia de un segundo ácido siálico desde el
donante de ácido siálico hasta el primer residuo de ácido siálico en
un enlace \alpha2,8. Este tipo de estructura
Sia\alpha2,8-Sia\alpha2,3-Gal es
a menudo encontrada en gangliósidos, incluidos GD3 y GT1 como se
muestra en la Figura 4.
Ejemplos de sialiltransferasas bifuncionales de
la invención son aquellas que se encuentran en las especies
Campylobacter, tal como C. jejuni. Una
sialiltransferasa bifuncional de la invención, preferida
actualmente, es aquella del serotipo O:19 de C. jejuni. Un
ejemplo de una sialiltransferasa bifuncional es aquella de la cepa
OH4384 de C. jejuni; esta sialiltransferasa tiene una
secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 3. Otras
sialiltransferasas bifuncionales de la invención tiene generalmente
una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 76%
idéntica a la secuencia de aminoácidos de la sialiltransferasa
bifuncional de OH4384 de C. jejuni sobre una región
aproximadamente de al menos 60 aminoácidos de longitud. Más
preferiblemente, las sialiltransferasas de la invención son
aproximadamente al menos 85% idénticas a la secuencia de aminoácidos
de la sialiltransferasa de OH4384, y aún más preferiblemente
aproximadamente al menos 95% de identidad con la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 3, sobre una región de aproximadamente 60
aminoácidos de longitud. En las modalidades actualmente preferidas,
la región de porcentaje de identidad se extiende sobre una región
más larga que una de 60 aminoácidos. Por ejemplo, en modalidades más
preferidas, la región de similitud se extiende sobre una región
aproximadamente de al menos 100 aminoácidos de longitud, más
preferiblemente una región aproximadamente de al menos 150
aminoácidos de longitud, y lo más preferible sobre la longitud total
de la sialiltransferasa. Por lo tanto las sialiltransferasas
bifuncionales de la invención incluyen polipéptidos que tienen
cualquiera de los dos o ambas de las actividades de \alpha2,3- y
\alpha2,8-sialiltransferasa, y son aproximadamente
al menos 65% idénticas, más preferiblemente aproximadamente 70%
idénticas, más preferiblemente aproximadamente al menos 80%
idénticas, y lo más preferible aproximadamente al menos 90%
idénticas a la secuencia de aminoácidos de la sialiltransferasa
Cstll de OH4384 de C. jejuni (SEQ ID NO: 3) sobre una región
del polipéptido que se requiere para retener las respectivas
actividades de la sialiltransferasa. En algunas modalidades, las
sialiltransferasas bifuncionales de la invención son idénticas a la
sialiltransferasa Cstll de OH4384 de C. jejuni sobre la
longitud total de la sialiltransferasa.
La invención también provee sialiltransferasas
que tienen actividad de la \alpha2,3 sialiltransferasa, pero poca
o ninguna actividad de la \alpha2,8 sialiltransferasa. Por
ejemplo, la sialiltransferasa Cstll de la serocepa O:19 de C.
jejuni (SEQ ID NO: 9) difiere de aquella de la cepa OH4384 por
ocho aminoácidos, pero sin embargo carece sustancialmente de la
actividad de la \alpha2,8 sialiltransferasa (Figura 3). La
correspondiente sialiltransferasa de la cepa NCTC 11168 del serotipo
0:2 (SEQ ID NO: 10) es 52% idéntica a aquella de OH4384, y también
tiene poca o ninguna actividad de la \alpha2,8 sialiltransferasa.
También se proveen las sialiltransferasas que son sustancialmente
idénticas a la sialiltransferasa Cstll de la cepa 0:10 de C.
jejuni (SEQ ID NO: 5) y de la cepa a0:41 (SEQ ID NO: 7). Las
sialiltransferasas de la invención incluyen a aquellas que son
aproximadamente al menos 65% idénticas, más preferiblemente
aproximadamente al menos 70% idénticas, más preferiblemente
aproximadamente al menos 80% idénticas, y lo más preferible
aproximadamente al menos 90% idénticas a las secuencias de
aminoácidos de la 0:10 de C. jejuni (SEQ ID NO: 5), 0:41 (SEQ
ID NO:7), la serocepa O:19 (SEQ ID NO: 9), o la cepa NCTC 11168 del
serotipo 0:2 (SEQ ID NO: 10). Las sialiltransferasas de la
invención, en algunas modalidades, tienen una secuencia de
aminoácidos que es idéntica a aquella de las serocepas 0:10, 0:41,
O:19 o las sepas de C. jejuni NCTC 11168.
El porcentaje de las identidades se puede
determinar por medio de inspección, por ejemplo, o se puede
determinar utilizando un algoritmo de alineación tal como el
algoritmo BLASTP versión 2.0 usando los parámetros por defecto,
tales como longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1, y una matriz de
sustitución BLOSUM62.
Las sialiltransferasas de la invención pueden
identificarse, no solamente por medio de la comparación de la
secuencia, sino también por medio de la preparación de anticuerpos
contra la sialiltransferasa bifuncional OH4384 de C. jejuni,
u otras sialiltransferasas proveídas aquí, y que determinan si los
anticuerpos son específicamente inmunoreactivos con una
sialiltransferasa de interés. Para obtener una sialiltransferasa
bifuncional en particular, se puede identificar un organismo que
probablemente produzca una sialiltransferasa bifuncional
determinando si el organismo muestra ambos enlaces \alpha2,3 y
\alpha 2,8 del ácido siálico sobre sus superficies celulares.
Alternativamente, o adicionalmente, se puede hacer simplemente
ensayos con la enzima de una sialiltransferasa aislada para
determinar si ambas actividades de la sialiltransferasa están
presentes.
La invención también provee los polipéptidos de
\beta1,4-GalNAc transferasa (por ejemplo, CgtA).
Las \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención,
cuando se colocan en una mezcla de reacción, catalizan la
transferencia de un residuo GalNAc desde un donante (por ejemplo,
UDP-GalNAc) hasta un sacárido aceptor adecuado
(típicamente un sacárido que tenga un residuo terminal de
galactosa). La estructura resultante
GalNAc\beta1,4-Gal, a menudo se la encuentra en
gangliósidos y en otros esfingoides, entre muchos otros compuestos
sacáridos. Por ejemplo, la transferasa CgtA puede catalizar la
conversión del gangliósido GM3 a GM2, (Figura 4).
Ejemplos de las
\beta1,4-GalNAc transferasas de la invención son
aquellas que son producidas por medio de a especie
Campylobacter, tal como C. jejuni. Un ejemplo de un
polipéptido de \beta1,4-GalNAc transferasa es
aquel de la cepa OH4384 de C. jejuni, que tiene una secuencia
de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 13. Las
\beta1,4-GalNAc transferasas de la invención
generalmente incluyen una secuencia de aminoácidos que es
aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos
como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre una región de
aproximadamente al menos 50 aminoácidos de longitud. Más
preferiblemente, las \beta1,4-GalNAc transferasas
de la invención son aproximadamente al menos 85% idénticas a esta
secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente aproximadamente
al menos 95% idénticas a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID
NO: 13, sobre una región de aproximadamente al menos 50 aminoácidos
de longitud. En las modalidades actualmente preferidas, la región
del porcentaje de identidad se extienden sobre una región mayor a
los 50 aminoácidos, más preferiblemente sobre una región de
aproximadamente al menos 100 aminoácidos, y lo más preferible, sobre
la longitud total de la GalNAc transferasa. Por lo tanto, las
\beta1,4-GalNAc transferasas de la invención
incluyen a los polipéptidos que tienen actividad de
\beta1,4-GalNAc transferasa y son aproximadamente
al menos 65% idénticas, más preferiblemente aproximadamente al
menos 70% idénticas, más preferiblemente aproximadamente al menos
80% idénticas, y lo más preferible aproximadamente al menos 90%
idénticas a la secuencia de aminoácidos de las
\beta1,4-GalNAc transferasas de OH4384 de C.
jejuni (SEQ ID NO: 13) sobre una región del polipéptido que se
requiere que retenga la actividad de la
\beta1,4-GalNAc transferasa. En algunas
modalidades, las \beta1,4-GalNAc transferasas de
la invención son idénticas a la \beta1,4-GalNAc
transferasa de OH4384 de C. jejuni sobre la longitud total de
la \beta1,4-GalNAc transferasa.
Nuevamente, el porcentaje de las identidades se
puede determinar por medio de inspección, por ejemplo, o se puede
determinar utilizando un algoritmo de alineación tal como el
algoritmo BLASTP versión 2.0 con una longitud de palabra (W) de 3,
G=1, E=1, y una matriz de sustitución BLOSUM62.
También se puede identificar a las
\beta1,4-GalNAc transferasas de la invención por
medio de inmunoreactividad. Por ejemplo, se pueden prepara
anticuerpos contra la \beta1,4-GalNAc transferasa
de OH4384 de C. jejuni de la SEQ ID NO: 13 y determinar si
los anticuerpos son específicamente inmunoreactivos con una
\beta1,4-GalNAc transferasa de interés.
La invención también provee
\beta1,3-galactosiltransferasa (CgtB). Cuando se
las coloca en un medio de reacción adecuado, las
\beta1,3-galactosiltransferasas de la invención
catalizan la transferencia de un residuo de galactosa desde un
donante (por ejemplo, UDP-Gal) hasta un aceptor
sacárido adecuado (por ejemplo, sacáridos que tienen un residuo
GalNAc terminal). Entre las reacciones catalizadas por las
\beta1,3-galactosiltransferasas esta la
transferencia de un residuo de galactosa hasta la fracción de
oligosacárido de GM2 para formar a la fracción del oligosacárido
GM1a.
Ejemplos de las
\beta1,3-galactosiltransferasas de la invención
son aquellas producidas por la especie Campylobacter, tal
como C. jejuni. Por ejemplo, una
\beta1,3-galactosiltransferasa de la invención es
aquella de la cepa OH4384 de C. jejuni, que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 15.
Otro ejemplo de una
\beta1,3-galactosiltransferasa de la invención es
aquella de la cepa NCTC 11168 del serotipo 0:2 de C. jejuni.
La secuencia de aminoácidos de esta galactosiltransferasa está
expuesta en la SEQ ID NO: 17. Esta galactosiltransferasa se expresa
bien en E. coli, por ejemplo y exhibe una alta cantidad de
actividad soluble. Además, a diferencia de CgtB de OH4384, que puede
añadir más de una galactosa si una mezcla de reacción contiene un
exceso de donante y se incuba por una periodo de tiempo
suficientemente largo, la \beta1,3-galactosa de
NCTC 11168 no tiene una cantidad significativa de actividad de
poligalactosiltransferasa. Para algunas aplicaciones, la actividad
de la poligalactosiltransferasa de la enzima OH4384 es deseable,
pero en otras solicitudes tales como la síntesis de imitaciones de
GM1, es deseable la adición solamente de una galactosa terminal.
Las
\beta1,3-galactosiltransferasas de la invención
generalmente tienen una secuencia de aminoácidos que es
aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos
de la CgtB de OH4384 o NCTC 11168 como se expone en la SEQ ID NO: 15
y en la SEQ ID NO: 17, respectivamente, sobre una región
aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud. Más
preferiblemente, las
\beta1,3-galactosiltransferasas de la invención
son aproximadamente al menos 85% idénticas a cualquiera de estas
secuencias de aminoácidos, y aún más preferiblemente
aproximadamente al menos 95% idénticas a las secuencias de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17, sobre una región
de aproximadamente al menos 50 aminoácidos de longitud. En las
modalidades actualmente preferidas, la región de porcentaje de
identidad se extienden sobre una región más larga que 50
aminoácidos, más preferiblemente sobre una región de aproximadamente
al menos 100 aminoácidos, y lo más preferible, sobre la longitud
total de la galactosiltransferasa. Por lo tanto, la
\beta1,3-galactosiltransferasa de la invención
incluye a los polipéptidos que tienen actividad de
\beta1,3-galactosiltransferasa y son
aproximadamente al menos 65% idénticas, más preferiblemente
aproximadamente al menos 70% idénticas, más preferiblemente
aproximadamente al menos 80% idénticas, y lo más preferible
aproximadamente al menos 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos
de la \beta1,3-galactosiltransferasa de OH4384 de
C. jejuni (SEQ ID NO: 15) o la galactosiltransferasa de NCTC
11168 (SEQ ID NO: 17) sobre una región del polipéptido que se
requiere para retener la actividad de la
\beta1,3-galactosiltransferasa. En algunas
modalidades, la \beta1,3-galactosiltransferasa de
la invención es idéntica a la
\beta1,3-galactosiltransferasa de OH 4384 o NCTC
11168 de C. jejuni sobre la longitud completa de la
\beta1,3-galactosiltransferasa.
El porcentaje de las identidades se puede
determinar por medio de inspección, por ejemplo, o se puede
determinar utilizando un algoritmo de alineación tal como el
algoritmo BLASTP versión 2.0 con un largo de palabra (W) de 3, G=11,
E=1, y una matriz de sustitución BLOSUM62.
La
\beta1,3-galactosiltransferasa de la invención se
puede obtener a partir de la respectiva especie de
Campylobacter, o se puede producir en forma recombinante. Se
pueden identificar las galactosiltransferasas por medio de ensayos
de actividad enzimática, por ejemplo, o por medio de la detección de
la inmunoreactividad específica con anticuerpos surgidos contra la
\beta1,3-galactosiltransferasa de OH4384 de C.
jejuni que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta
en la SEQ ID NO: 15 o la
\beta1,3-galactosiltransferasa de NCTC 11168 de
C. jejuni como la expuesta en la SEQ ID NO: 17.
La presente invención también provee enzimas
adicionales que están involucradas en la biosíntesis de
oligosacáridos tales como aquellos encontrados sobre
lipooligosacáridos bacteriales. Por ejemplo, se proveen las enzimas
involucradas en la síntesis de CMP-ácido siálico, el donante para
las sialiltransferasas. Una ácido siálico sintasa es codificada por
medio de un marco de lectura abierta (ORF) 8a de la cepa OH4384 de
C. jejuni (SEQ ID NO: 21) y por medio de un marco de lectura
abierta 8b de la cepa NCTC 11168 (ver, Tabla 3). Otra enzima
involucrada en la síntesis de ácido siálico es codificada por ORF 9a
de OH4384 (SEQ ID NO: 22) y 9b de NCTC 11168. Una ácido
siálico-CMP sintetasa es codificada por ORF 10a (SEQ
ID NO: 23) y 10b de OH4384 y NCTC 11168,
respectiva-
mente.
mente.
La invención también provee una aciltransferasa
que esta involucrada en la biosíntesis del lípido A. Esta enzima es
codificada por medio de un marco de lectura abierta 2a de la cepa
OH4384 de C. jejuni (SEQ ID NO: 18) y por medio de un marco
de lectura abierta 2B de la cepa NCTC 11168. También se provee una
acetiltransferasa; esta enzima es codificada por una ORF 11a de la
cepa OH4384 (SEQ ID NO: 24); no se encuentra un homólogo en el
locus de la biosíntesis del LOS de la cepa NCTC 11168.
También se proveen tres glicosiltransferasas
adicionales. Estas enzimas son codificadas por las ORF 3a (SEQ ID
NO: 19), 4a (SEQ ID NO: 20), y 12a (SEQ ID NO: 25) de la cepa OH4384
y las ORF 3b, 4b y 12b de la cepa NCTC 11168.
La invención incluye, por cada una de estas
enzimas, polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que
es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de
aminoácidos como la expuesta aquí sobre una región aproximadamente
de al menos 50 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, las
enzimas de la invención son aproximadamente al menos 85% idéntica a
la respectiva secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente
aproximadamente al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos,
sobre una región de aproximadamente al menos 50 aminoácidos de
longitud. En las modalidades actualmente preferidas la región de
porcentaje de identidad se extiende sobre una región más larga que
50 aminoácidos, más preferiblemente sobre una región de
aproximadamente al menos 100 aminoácidos, y lo más preferible sobre
la longitud completa de la enzima. Por lo tanto, las enzimas de la
invención incluyen polipéptidos que tienen la actividad respectiva y
son aproximadamente al menos 65% idénticas, más preferiblemente
aproximadamente al menos 70% idénticas, más preferiblemente
aproximadamente al menos 80% idénticas, y lo más preferible
aproximadamente al menos 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos
de la enzima correspondiente como la expuesta aquí sobre una región
del polipéptido que es requerida para retener la respectiva
actividad enzimática. En algunas modalidades, las enzimas de la
invención son idénticas a las enzimas correspondientes de OH4384 de
C. jejuni sobre la longitud completa de la enzima.
La presente invención también provee ácidos
nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican a las
glicosiltransferasas y a otras enzimas de la invención. Los ácidos
nucleicos de la invención que codifican a la glicosiltransferasa son
útiles para diferentes propósitos, incluida la expresión
recombinante de los polipéptidos correspondientes de la
glicosiltransferasa, y como sondas para identificar a los ácidos
nucleicos que codifican a otras glicosiltransferasas, y para
estudiar la regulación y la expresión de las enzimas.
Los ácidos nucleicos de la invención incluyen a
aquellos que codifican a una enzima glicosiltransferasa completa tal
como los descritos anteriormente, así como a aquellos que codifican
a una subsecuencia de un polipéptido de la glicosiltransferasa. Por
ejemplo, la invención incluye ácidos nucleicos que codifican a un
polipéptido que no es de la longitud completa de la enzima, pero sin
embargo tiene actividad de glicosiltransferasa. Las secuencias de
nucleótidos del locus de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni
es suministrada aquí como la SEQ ID NO: 1, y se identifican los
respectivos marcos de lectura. También se proveen las secuencias
adicionales de nucleótidos, como se discute más adelante. La
invención incluye no solamente ácidos nucleicos que incluyen a las
secuencias de nucleótidos como las expuestas aquí, sino también a
los ácidos nucleicos que son sustancialmente idénticos a, o
sustancialmente complementarios a, las modalidades ejemplificadas.
Por ejemplo, la invención incluye ácidos nucleicos que incluyen a
una secuencia de nucleótidos que es aproximadamente al menos 70%
idéntica a una que es expuesta aquí, más preferiblemente al menos
75%, aún más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al
menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90%, y aún más
preferiblemente aproximadamente al menos 95% idéntica a una
secuencia ejemplificada de nucleótidos. La región de identidad se
extiende sobre aproximadamente al menos 50 nucleótidos, más
preferiblemente sobre aproximadamente al menos 100 nucleótidos, aún
más preferiblemente sobre aproximadamente al menos 500 nucleótidos.
La región de un porcentaje de identidad especificado, en algunas
modalidades, abarca a la región de codificación de una porción
suficiente de la enzima codificada para retener la respectiva
actividad enzimática. El porcentaje de identidad especificado, en
las modalidades preferidas, se extiende sobre la longitud completa
de la región de codificación de la enzima.
Los ácidos nucleicos de la invención que
codifican a las glicosiltransferasas se pueden obtener utilizando
métodos que son conocidos por aquellos expertos en el arte. Los
ácidos nucleicos adecuados (por ejemplo, ADNc, genómico, o
subsecuencias (sondas)) pueden ser clonados, o amplificados por
medio de métodos in vitro tales como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), los
sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), el
sistema de replicación de secuencia autosostenida (SSR). Se conocen
una gran variedad de metodologías de clonación y amplificación in
vitro por parte de personas capacitadas. Ejemplos de estas
técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a las personas
capacitadas a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran
en Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques,
Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA
(Berger); Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning -
A Laboratory Manual (segunda edición) Vol.
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(Ausubel); Cashion y colaboradores, patente estadounidense número
5.017.478; y Carr, patente europea No. 0.246.864. Ejemplos de
técnicas suficientes para dirigir a las persona entrenadas a través
de los métodos de amplificación in vitro se encuentran en
Berger, Sambrook, y Ausubel, así como también en Mullis y
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Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis y
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(1989) Gene 4: 560; y Barringer y colaboradores (1990)
Gene 89: 117. Los métodos mejorados de clonación de los
ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen en
Wallace y colaboradores, patente estadounidense No. 5.426.039.
Los ácidos nucleicos de la invención que
codifican a los polipéptidos de la glicosiltransferasa, o a las
subsecuencias de estos ácidos nucleicos, se pueden preparar por
medio de cualquier método adecuado como se describió anteriormente,
incluida, por ejemplo, la clonación y restricción de las secuencias
apropiadas. Como ejemplo, se puede obtener un ácido nucleico que
codifique a una glicosiltransferasa de la invención por medio de
métodos rutinarios de clonación. Una secuencia conocida de
nucleótidos de un gen que codifica a la glicosiltransferasa de
interés, tal como se describe aquí, pude ser utilizada para proveer
sondas que específicamente hibriden a un gen que codifique a una
enzima adecuada en una muestra genómica de ADN, o a un ARNm en una
muestra de ARN total (por ejemplo, en una transferencia de Southern
o de Northern). Preferiblemente, las muestras se obtienen a partir
de organismos procariotas, tales como la especie
Campylobacter. Ejemplos de la especie Campylobacter de
particular interés incluyen a C. jejuni. Muchas cepas O:19 de
C. jejuni sintetizan imitaciones de gangliósidos y son útiles
como fuente de la glicosiltransferasa de la invención.
Una vez que se identifica al ácido nucleico de
la glicosiltransferasa objetivo, se puede aislar de acuerdo a
métodos estándar conocidos por aquellos capacitados en el arte (ver,
por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold
Spring Harbor Laboratory; Berger and Kimmel (1987) Methods in
Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning
Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.; o Ausubel y
colaboradores (1987) Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Publishing and Wiley-Interscience, New
York).
Un ácido nucleico que codifique a una
glicosiltransferasa de la invención también puede ser clonado para
detectar su producto expresado por medio de ensayos basados en las
propiedades físicas, químicas o inmunológicas. Por ejemplo, se puede
identificar a un ácido nucleico que codifica a la sialiltransferasa
bifuncional clonada por medio de la capacidad de un polipéptido
codificado por el ácido nucleico para catalizar el acoplamiento de
un ácido siálico en un enlace \alpha2,3 a un aceptor
galactosilado, seguido por el acoplamiento de un segundo residuo de
ácido siálico al primer ácido siálico en un enlace \alpha2,8. En
forma similar, se puede identificar un ácido nucleico clonado que
codifique a una \beta1,4-GalNAc transferasa o a
una \beta1,3-galactosiltransferasa por medio de la
capacidad del polipéptido codificado para catalizar la transferencia
de un residuo GalNAc de UDP-GalNAc, o un residuo de
galactosa de UDP-Gal, respectivamente, a un aceptor
adecuado. Las condiciones adecuadas del ensayo son conocidas en el
arte, e incluyen a aquellas que se describen en los Ejemplos. Otras
propiedades físicas de un polipéptido expresado a partir de un ácido
nucleico particular pueden ser comparadas con las propiedades de los
polipéptidos conocidos de la glicosiltransferasa de la invención,
tales como aquellas descritas aquí, para proveer otro método de
identificación de ácidos nucleicos que codifican a las
glicosiltransferasas de la invención. Alternativamente, un gen
putativo de una glicosiltransferasa puede ser mutado, y su papel
como glicosiltransferasa establecido por medio de la detección de
una variación en la habilidad para producir al respectivo
glicoconjugado.
En otras modalidades, los ácidos nucleicos que
codifican a la glicosiltransferasa se pueden clonar utilizando
métodos de amplificación de ADN tales como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia de
ácido nucleico o la subsecuencia es amplificada por medio de PCR,
preferiblemente utilizando un iniciador sentido que contiene un
sitio de restricción (por ejemplo, Xbal) y un iniciador
antisentido que contiene otros sitio de restricción (por ejemplo,
HindIII). Esto producirá un ácido nucleico que codifica a la
secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la glicosiltransferasa
deseada y que tiene sitios de restricción terminales. Este ácido
nucleico puede entonces ser fácilmente ligado dentro de un vector
que contiene un ácido nucleico que codifica a la segunda molécula y
que tiene los sitios apropiados de restricción correspondientes. Los
iniciadores apropiados para PCR pueden ser determinados por alguien
capacitado en la técnica utilizando la información de la secuencia
proveida aquí. Sitios de restricción apropiados también pueden ser
añadidos al ácido nucleico que codifica a la glicosiltransferasa de
la invención, o subsecuencia de aminoácidos, por medio de
mutagénesis dirigida al sitio. El plásmido que contiene la secuencia
o subsecuencia de nucleótidos que codifican a la glicosiltransferasa
se escinde con la endonucleasa de restricción apropiada y luego se
liga dentro de un vector apropiado para amplificación y/o expresión
de acuerdo a métodos estándar.
Ejemplos de iniciadores adecuados apropiados
para la amplificación de los ácidos nucleicos de la invención que
codifican a la glicosiltransferasa son mostrados en la Tabla 2;
algunos de los pares de iniciadores son diseñados para proveer un
sitio de restricción 5' Ndel y un sitio 3' Sall sobre
el fragmento amplificado. El plásmido que contiene la secuencia o la
subsecuencia que codifica a la enzima se escinde con la endonucleasa
apropiada de restricción y luego se liga dentro de un vector
apropiado para la amplificación y/o la expresión de acuerdo a
métodos estándar.
Como una alternativa para clonar a un ácido
nucleico que codifica a la glicosiltransferasa, se puede sintetizar
químicamente un ácido nucleico apropiado a partir de una secuencia
conocida que codifica a una glicosiltransferasa de la invención. Los
métodos directos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el
método del fosfodiéster de Narang y colaboradores (1979) Meth.
Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster
de Brown y colaboradores (1979) Meth. Enzymol. 68:
109-151; el método de la dietilfosforamidita de
Beaucage y colaboradores (1981) Tetra. Lett., 22:
1859-1862; y el método del soporte sólido de la
patente estadounidense No. 4.458.066. La síntesis química produce un
oligonucleótido de cadena sencilla. Este puede ser convertido en un
ADN de cadena doble por medio de hibridación con una secuencia
complementaria, o por medio de polimerización con una ADN polimerasa
utilizando la cadena sencilla como molde. Alguien entrenado
reconocería que mientras que la síntesis química de ADN está a
menudo limitada a las secuencias aproximadamente de 100 bases, se
pueden obtener secuencias más largas por medio de la ligación de
secuencias más cortas. Alternativamente, las subsecuencias pueden
ser clonadas y las subsecuencias apropiadas escindidas utilizando
las enzimas de restricción adecuadas. Se pueden ligar entonces los
fragmentos para producir la secuencia de ADN deseada.
En algunas modalidades, puede ser deseable
modificar los ácidos nucleicos que codifican a la enzima. Alguien
entrenado reconocerá muchas formas de generar alteraciones en una
construcción dada de ácido nucleico. Tales métodos bien conocidos
incluyen a la mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR
utilizando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que
contienen al ácido nucleico para los agentes mutagénicos o de
radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por
ejemplo, en conjunto con la ligación y/o la clonación para generar
ácidos nucleicos grandes) y otras técnicas bien conocidas. Ver, por
ejemplo, Gilman y Smith (1979) Gene 8:81-97,
Roberts y colaboradores (1987) Nature 328:
731-734.
En una modalidad preferida actual, los ácidos
nucleicos recombinantes presentes en las células de la invención son
modificados para proveer codones preferidos que mejoran la
traducción del ácido nucleico en un organismo seleccionado (por
ejemplo, los codones preferidos de E. coli se sustituyen
dentro de un ácido nucleico de codificación para la expresión en
E. coli).
La presente invención incluye ácidos nucleicos
que son aislados (esto es, no en su ubicación cromosómica nativa)
y/o son recombinantes (esto es, modificados a partir de su forma
original, presente en un organismo no nativo, etc.).
La invención provee ácidos nucleicos que
codifican sialiltransferasas tales como aquellas descritas
anteriormente. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos de la
invención codifican a los polipéptidos de la sialiltransferasa
bifuncional que tienen tanto una actividad de la \alpha2,3
sialiltransferasa como una actividad de la \alpha2,8
sialiltransferasa. Estos ácidos nucleicos de la sialiltransferasa
codifican a un polipéptido de la sialiltransferasa que tiene una
secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 76%
idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ
ID NO: 3 sobre una región aproximadamente de al menos 60 aminoácidos
de longitud. Más preferiblemente, las sialiltransferasas codificadas
por los ácidos nucleicos de la invención son aproximadamente al
menos 85% idénticas a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
3, y aún más preferiblemente aproximadamente al menos 95% idénticas
a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, sobre una región
de al menos 60 aminoácidos de longitud. En las modalidades
actualmente preferidas, la región del porcentaje de identidad se
extiende sobre una región mayor a 60 aminoácidos, más
preferiblemente sobre una región aproximadamente de al menos 100
aminoácidos, y lo más preferible sobre la longitud completa de la
sialiltransferasa. En la modalidad actualmente preferida, los ácidos
nucleicos que codifican a la sialiltransferasa de la invención
codifican a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID NO: 3.
Un ejemplo de un ácido nucleico de la invención
es una forma aislada y/o recombinante de un ácido nucleico que
codifica a la sialiltransferasa bifuncional de OH4384 de C.
jejuni. La secuencia de nucleótidos de este ácido nucleico se
muestra en la SEQ ID NO: 2. Las secuencias del polinucleótido de la
invención que codifica a la sialiltransferasa son típicamente
aproximadamente al menos 75% idénticas a la secuencia de ácido
nucleico de la SEQ ID NO: 2 sobre una región aproximadamente de al
menos 50 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los ácidos
nucleicos de la invención que codifican a la sialiltransferasa son
aproximadamente al menos 85% idénticos a esta secuencia de
nucleótidos, y aún más preferiblemente son aproximadamente al menos
95% idénticos a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2,
sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En las
modalidades actualmente preferidas, la región de umbral del
porcentaje de identidad especificado se extiende sobre una región
mayor a 50 nucleótidos, más preferiblemente sobre una región
aproximadamente de al menos 100 nucleótidos, y más preferiblemente
sobre la longitud completa de la región para la codificación de la
sialiltransferasa. Por lo tanto, la invención provee ácidos
nucleicos que codifican a la sialiltransferasa bifuncional que son
sustancialmente idénticos a aquellos cstll de OH4384 de la
cepa de C. jejuni como se expone en la SEQ ID NO: 2 o la cepa
0:10 (SEQ ID NO: 4).
Otros ácidos nucleicos de la invención que
codifican a la sialiltransferasa codifican sialiltransferasas que
tienen actividad \alpha2,3 sialiltransferasa pero carecen de la
actividad sustancial de \alpha2,8 sialiltransferasa. Por ejemplo,
los ácidos nucleicos que codifican a una \alpha2,3
sialiltransferasa Cstll de la serocepa O:19 de C.
jejuni (SEQ ID NO: 8) y NCTC 11168, son proveídos por la
invención; estas enzimas tienen poca o ninguna actividad de la
\alpha2,8-sialiltransferasa (Tabla 6).
Para identificar los ácidos nucleicos de la
invención, se puede utilizar inspección visual, o se puede utilizar
un algoritmo adecuado de alineación. Un método alternativo por medio
del cual se puede identificar a un ácido nucleico de la invención
que codifica a la sialiltransferasa bifuncional, es por medio de
hibridación, bajo condiciones rigurosas, del ácido nucleico de
interés hasta un ácido nucleico que incluye una secuencia de
polinucleótidos de una sialiltransferasa como la expuesta aquí.
La invención también provee ácidos nucleicos que
incluyen secuencias de polinucleótidos que codifican a un
polipéptido de la GalNAc transferasa que tiene una actividad de
\beta1,4-GalNAc transferasa. Las secuencias de
polinucleótidos que codifican a un polipéptido de la GalNAc
transferasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es
aproximadamente al menos 70% idéntica a la
\beta1,4-GalNAc transferasa de OH4384 de C.
jejuni, que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta
en la SEQ ID NO: 13, sobre una región aproximadamente de al menos 50
aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, el polipéptido de la
GalNAc transferasa codificado por los ácidos nucleicos de la
invención es aproximadamente al menos 80% idéntico a esta secuencia
de aminoácidos, y aún más preferiblemente aproximadamente al menos
90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, sobre
una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En las
modalidades actualmente preferidas, la región de porcentaje de
identidad se extiende sobre una región mayor a 50 aminoácidos, más
preferiblemente sobre una región de aproximadamente al menos 100
aminoácidos, y lo más preferible, sobre la longitud total del
polipéptido de la GalNAc transferasa. En una modalidad actualmente
preferida, los ácidos nucleicos de la invención que codifican al
polipéptido de la GalNAc transferasa, codifican a un polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO:
13. Para identificar a los ácidos nucleicos de la invención, se
puede utilizar inspección visual, o se puede utilizar un algoritmo
de alineación apropiado.
Un ejemplo de un ácido nucleico de la invención
que codifica a la GalNAc transferasa es una forma aislada y/o
recombinante del ácido nucleico que codifica a la GalNAc
transferasa de OH4384 de C. jejuni. Este ácido nucleico tiene
una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 12.
Las secuencias de los polinucleótidos de la invención que codifican
a la GalNAc transferasa son típicamente aproximadamente al menos 75%
idénticos a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 12 sobre
una región de aproximadamente al menos 50 nucleótidos de longitud.
Más preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención que
codifican a la GalNAc transferasa son aproximadamente al menos 85%
idénticos a esta secuencia de nucleótidos, y aún más preferiblemente
aproximadamente al menos 95% idénticos a la secuencia del nucleótido
de la SEQ ID NO: 12, sobre una región de al menos 50 aminoácidos de
longitud. En las modalidades actualmente preferidas, la región de
porcentaje de identidad se extiende sobre una región mayor a 50
nucleótidos, más preferiblemente sobre una región de aproximadamente
al menos 100 nucleótidos, y lo más preferible, sobre la longitud
total de la región que codifica a la GalNAc transferasa.
Para identificar a los ácidos nucleicos de la
invención, se puede utilizar inspección visual, o se puede utilizar
un algoritmo adecuado de alineación. Un método alternativo por medio
del cual se puede identificar a un ácido nucleico de la invención
que codifica a una GalNAc transferasa, es por medio de hibridación,
bajo condiciones rigurosas, del ácido nucleico de interés hasta un
ácido nucleico que incluye una secuencia de polinucleótidos de la
SEQ ID NO: 12.
La invención también provee ácidos nucleicos que
incluyen a las secuencias de polinucleótidos que codifican a un
polipéptido que tiene actividad de
\beta1,3-galactosiltransferasa (CgtB). Los
polipéptidos de la \beta1,3-galactosiltransferasa
codificados por estos ácidos nucleicos de la invención incluyen
preferiblemente una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente
al menos 75% idéntica a una P
1,3-galactosiltransferasa de la cepa OH4384 de
C. jejuni como la expuesta en la SEQ ID NO: 15, o como
aquella de una \beta1,3-galactosiltransferasa de
la cepa NCTC 11168 como la expuesta en la SEQ ID NO: 17, sobre una
región aproximadamente de al menos 50 aminoácidos de longitud. Más
preferiblemente, los polipéptidos de la galactosiltransferasa
codificados por estos ácidos nucleicos de la invención son
aproximadamente al menos 85% idénticos a esta secuencia de
aminoácidos, y aún más preferiblemente son aproximadamente al menos
95% idénticos a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o la
SEQ ID NO: 17, sobre una región de al menos 50 aminoácidos de
longitud. En las modalidades actualmente preferidas, la región de
porcentaje de identidad se extiende sobre una región mayor a 50
aminoácidos, más preferiblemente sobre una región de
aproximadamente al menos 100 aminoácidos, y lo más preferible, sobre
la longitud total de la región que codifica al polipéptido de la
galactosiltransferasa.
Un ejemplo de un ácido nucleico de la invención
que codifica a una \beta1,3-galactosiltransferasa
es una forma aislada y/o recombinante del ácido nucleico que
codifica a la \beta1,3-galactosiltransferasa de
OH4384 de C. jejuni. Este ácido nucleico incluye una
secuencia de nucleótidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 14. Otro
ácido nucleico que codifica a la
\beta1,3-galactosiltransferasa adecuada, incluye
una secuencia de nucleótidos de una cepa NCTC 11168 de C.
jejuni, para la cual la secuencia de nucleótidos se muestra en
la SEQ ID NO: 16. Las secuencias de polinucleótidos de la invención
que codifican a la \beta1,3-galactosiltransferasa
son típicamente aproximadamente al menos 75% idénticas a la
secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 14 o a aquella de la
SEQ ID NO: 16 sobre una región de aproximadamente al menos 50
nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los ácidos nucleicos
de la invención que codifican a la
\beta1,3-galactosiltransferasa son aproximadamente
al menos 85% idénticos a al menos una de estas secuencias de
nucleótidos, y aún más preferiblemente, aproximadamente al menos 95%
idénticos a las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 14 y/o
de la SEQ ID NO: 16, sobre una región de al menos 50 aminoácidos de
longitud. En las modalidades actualmente preferidas, la región de
porcentaje de identidad se extiende sobre una región mayor a 50
nucleótidos, más preferiblemente sobre una región aproximadamente de
al menos 100 nucleótidos, y lo más preferible sobre la longitud
total de la región de codificación de la
\beta1,3-galactosiltrans-
ferasa.
ferasa.
Para identificar a los ácidos nucleicos de la
invención, se puede utilizar inspección visual, o se puede utilizar
un algoritmo adecuado de alineación. Un método alternativo por medio
del cual se puede identificar a un ácido nucleico de la invención
que codifica al polipéptido de la galactosiltransferasa, es por
medio de hibridación, bajo condiciones rigurosas, del ácido nucleico
de interés hasta un ácido nucleico que incluye una secuencia de
polinucleótidos de la SEQ ID NO: 14 o de la SEQ ID NO: 16.
También se proveen los ácidos nucleicos que
codifican a otras enzimas que están involucradas en la ruta
biosintética de LOS de procariotas tales como Campylobacter.
Estos ácidos nucleicos codifican enzimas tales como, por ejemplo, la
ácido siálico sintasa, que es codificada por medio de un marco de
lectura abierta (ORF) 8a de la cepa OH4384 de C. jejuni y por
medio de un marco de lectura abierta 8b de la cepa NCTC 11168 (ver,
Tabla 3), otra enzima involucrada en la síntesis de ácido siálico
que es codificada por ORF 9a de OH4384 y 9b de NCTC 11168, y una
ácido siálico-CMP sintetasa que es codificada por
ORF 10a y 10b de OH4384 y NCTC 11168, respectivamente.
La invención también provee ácidos nucleicos que
codifican a una aciltransferasa que esta involucrada en la
biosíntesis del lípido A. Esta enzima es codificada por medio de un
marco de lectura abierta 2a de la cepa OH4384 de C. jejuni y
por medio de un marco de lectura abierta 2B de la cepa NCTC 11168.
Los ácidos nucleicos que codifican a una acetiltransferasa también
son proveídos; esta enzima es codificada por medio de ORF 11a de la
cepa OH4384; no se encuentra un homólogo en el locus de la
biosíntesis del LOS de la cepa NCTC 11168.
También se proveen ácidos nucleicos que
codifican a tres glicosiltransferasas adicionales. Estas enzimas son
codificadas por las ORF 3a, 4a, y 12a de la cepa OH4384 y las ORF
3b, 4b y 12b de la cepa NH 11168 (Figura 1).
La presente invención también provee casetes de
expresión, vectores de expresión, y células huésped recombinantes
que pueden ser usadas para producir las glicosiltransferasas y otras
enzimas de la invención. Un casete de expresión típico contiene un
promotor operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifica a
la glicosiltransferasa o a otras enzimas de interés. Los casetes de
expresión están típicamente incluidos sobre los vectores de
expresión que son introducidos en células huésped adecuadas,
preferiblemente células huésped procariotas. Más de un polipéptido
de la glicosiltransferasa se puede expresar en una célula huésped
sencilla colocando múltiples casetes de transcripción en un vector
de expresión sencillo, por medio de la construcción de un gen que
codifique a una proteína de fusión que consiste de más de una
glicosiltransferasa, o por medio de la utilización de diferentes
vectores de expresión para cada glicosiltransferasa.
En una modalidad preferida, los casetes de
expresión son útiles para la expresión de las glicosiltransferasas
en células huésped procariotas. Las secuencias procariotas de
control comúnmente utilizadas, que son definidas aquí para incluir
promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con
un operador, junto con las secuencias del sitio de enlazamiento para
el ribosoma, incluyen a promotores comúnmente utilizados tales como
los sistemas promotores beta-lactamasa
(penicilinasa) y lactosa (lac) (Change y colaboradores,
Nature (1977) 198: 1056), al sistema promotor triptófano
(trp) (Goeddel y colaboradores, Nucleic Acids Res. (1980) 8:
4057), al promotor tac (DeBoer, y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos de América (1983)
80:21-25); y al promotor P_{L} derivado de lambda
y al sitio de enlazamiento del ribosoma en el gen N (Shimatake y
colaboradores, Nature (1981) 292: 128). El sistema promotor
particular no es crítico para la invención, y puede utilizarse
cualquier promotor disponible que funcione en procariotas.
Cualquiera de los dos promotores, constitutivo o
regulado, puede ser utilizado en la presente invención. Los
promotores regulados pueden ser convenientes debido a que las
células huésped pueden ser cultivadas hasta altas densidades antes
de que sea inducida la expresión de los polipéptidos de la
glicosiltransferasa. El alto nivel de expresión de las proteínas
heterólogas muestra crecimiento celular en algunas situaciones. Los
promotores regulados especialmente adecuados para ser usados en
E. coli incluyen al promotor bacteriófago lambda P_{L}, al
promotor híbrido trp-lac (Amann y
colaboradores, Gene (1983) 25: 167; de Boer y colaboradores,
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América (1983) 80:
21, y al promotor bacteriófago T7 (Studier y colaboradores, J.
Mol. Biol. (1986); Tabor y colaboradores, (1985). Estos
promotores y su uso son discutidos en Sambrook y colaboradores,
supra. Un promotor regulable actualmente preferido es el
promotor dual tac-gal, que se describe en
PCT/US97/20528 (Publicación Internacional No. WO 9820111).
Para la expresión de los polipéptidos de la
glicosiltransferasa en células procariotas diferentes a las de E.
coli, se requiere a un promotor que funcione en la especie
procariota particular. Tales promotores pueden obtenerse a partir de
genes que hayan sido clonados a partir de la especie, o pueden
utilizarse promotores heterólogos. Por ejemplo, un promotor híbrido
trp-lac funciona en Bacillus junto con
E. coli. Los promotores adecuados para ser usados en células
huésped eucariotas son bien conocidos por aquellos capacitados en la
técnica.
Un sitio de enlazamiento del ribosoma (RBS) se
incluye convenientemente en los casetes de expresión de la invención
que están encaminados al uso en células huésped procariotas. Un RBS
en E. coli, por ejemplo, consiste de una secuencia de
nucleótidos de 3-9 nucleótidos de longitud
localizada e los nucleótidos 3-11 secuencia arriba
del codón de iniciación (Shine y Dalgarno, Nature (1975) 254:
34; Steitz, In Biological regulation and development: Gene
expression (ed. R.F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum
Publishing, NY).
El acoplamiento para traducción puede ser
utilizado para reforzar la expresión. La estrategia utiliza un marco
de lectura abierto corto secuencia arriba derivado de un gen
altamente expresado nativo para el sistema de traducción, que se
coloca secuencia abajo del promotor, y un sitio de enlazamiento del
ribosoma seguido después de unos pocos codones de aminoácido por un
codón de terminación. Justo antes del codón de terminación está un
segundo sitio de enlazamiento del ribosoma, y después del codón de
terminación está un codón de inicio para la iniciación de la
traducción. El sistema disuelve a la estructura secundaria en el
ARN, permitiendo la eficiente iniciación de la traducción. Ver,
Squires y colaboradores (1988) J. Biol. Chem. 263:
16297-16302.
Los polipéptidos de la glicosiltransferasa de la
invención se pueden expresar intracelularmente, o pueden secretados
de la célula. La expresión intracelular a menudo resulta en altos
rendimientos. Si es necesario, la cantidad de polipéptidos solubles
activos de glicosiltransferasa se pueden incrementar por medio de
procedimientos de replicación (ver, por ejemplo, Sambrook y
colaboradores, supra.; Marston y colaboradores, Biol
Technology (1984) 2: 800; Schoner y colaboradores, Biol
Technology (1985) 3: 151). En las modalidades en las cuales los
polipéptidos de la glicosiltransferasa son secretados de la célula,
ya sea dentro del periplasma o dentro del medio extracelular, la
secuencia de polinucleótidos que codifica a la glicosiltransferasa
se enlaza a una secuencia de polinucleótidos que codifica a una
secuencia escindible del péptido señal. La secuencia señal dirige la
transposición del polipéptido de la glicosiltransferasa a través de
la membrana celular (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores,
supra.; Oka y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci.
Estados Unidos de América (1985) 82: 7212; Talmadge y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de
América (1980) 77: 3988; Takahara y colaboradores, J. Biol.
Chem. (1985) 260:
2670).
2670).
Los polipéptidos de la glicosiltransferasa de la
invención pueden ser producidos también como proteínas de fusión.
Esta aproximación a menudo resulta en altos rendimientos, debido a
que las secuencias normales de control procariótico dirigen la
transcripción y la traducción. En E. coli, las fusiones
lacZ son utilizadas a menudo para expresar proteínas
heterólogas. Los vectores adecuados están fácilmente disponibles,
tales como las series pUR, pEX y pMR100 (ver, por ejemplo, Sambrook
y colaboradores, supra). Para ciertas aplicaciones, puede ser
deseable escindir a los aminoácidos que no son de la
glicosiltransferasa a partir de la proteína de fusión después de
purificación. Esto puede ser logrado por medio de cualquiera de los
diferentes métodos conocidos en el arte, incluida la escisión por
medio de bromuro de cianógeno, una proteasa, o por medio del Factor
X_{a} (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra.;
Itakura y colaboradores, Science (1977) 198: 1056; Goeddel y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de
América (1979) 76: 106; Nagai y colaboradores, Nature (1984) 309:
810; Sung y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos de América (1986) 83: 561). Los sitios de escisión pueden ser
modificados por medio de ingeniería genética dentro del gen por la
proteína de fusión en el punto deseado de escisión.
Un sistema adecuado para obtener proteínas
recombinantes a partir de E. coli que mantenga la integridad
de sus N-terminales ha sido descrito por Miller y
colaboradores, Biotechnology 7:698-704
(1989). En este sistema, se produce el gen de interés como una
fusión C-terminal a los primeros 76 residuos del gen
de la ubiquitina de la levadura que contiene un sitio de escisión
por la peptidasa. La escisión en la unión de las dos fracciones
resulta en la producción de una proteína que tiene un residuo
N-terminal auténtico intacto.
Las glicosiltransferasas de la invención se
pueden expresar en una variedad de células huésped, incluida E.
coli, otros huéspedes bacteriales, levadura, y diferentes
células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS,
CHO y HeLa y las líneas celulares de mieloma. Los ejemplos de
bacterias útiles incluyen, pero no se limitan a, Escherichia,
Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas,
Klebsielia, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia,
Vitreoscilla, y Paracoccus. El ácido nucleico que
codifica a la glicosiltransferasa recombinante se enlaza
operativamente a las secuencias de control de expresión apropiadas
para cada huésped. Para E. coli, esta incluye a un promotor
tal como T7, trp o a los promotores lambda, a un sitio de
enlazamiento de ribosoma y, preferiblemente, una señal de
terminación de la transcripción. Para las células eucariotas, las
secuencias de control incluirán a un promotor y preferiblemente a un
reforzador derivado de los genes de la inmunoglobina, SV40,
citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación, y puede
incluir un donante de empalme y secuencias aceptoras.
Los vectores de expresión de la invención pueden
ser transferidos dentro de células huésped escogidas por medio de
métodos bien conocidos tales como la transformación por medio de
cloruro de calcio para E. coli y el tratamiento con fosfato
de calcio o la electroporación para las células de mamíferos. Las
células transformadas por lo plásmidos se pueden seleccionar por
medio de la resistencia a los antibióticos conferida por los genes
contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp,
gpt, neo y hyp.
Una vez expresados, los polipéptidos
recombinantes de la glicosiltransferasa pueden ser purificados de
acuerdo a procedimientos estándar del estado del arte, incluida la
precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad,
cromatografía en columna, electroforesis sobre gel y similares (ver,
generalmente, R. Scopes, Protein Purification,
Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods
in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification,
Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Se prefieren sustancialmente a
las composiciones puras de aproximadamente al menos 90 a 95% de
homogeneidad, y de 98 a 99% o más de homogeneidad. Una vez
purificadas, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, se
pueden utilizar entonces los polipéptidos (por ejemplo, como
inmunógenos para la producción de anticuerpos). Las
glicosiltransferasas se pueden utilizar también en un estado no
purificado o semipurificado. Por ejemplo, una célula huésped que
expresa a la glicosiltransferasa, puede ser utilizada directamente
en una reacción de la glicosiltransferasa, ya sea con o sin procesar
tal como de permeabilización u otras rupturas celulares.
Alguien experimentado en la técnica reconocería
que pueden hacerse modificaciones alas proteínas de la
glicosiltransferasa sin disminuir su actividad biológica. Se pueden
hacer algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión,
o incorporación de la molécula objetivo dentro de una proteína de
fusión. Tales modificaciones sn bien conocidas por aquellos expertos
en el arte, e incluyen, por ejemplo, la adición de metionina al
aminoterminal para proveer un sitio de iniciación, o aminoácidos
adicionales (por ejemplo, poli His) colocados sobre cualquier
terminal para crear sitios de restricción convenientemente ubicados
o codones de terminación o secuencias de purificación.
La invención provee mezclas de reacción y
métodos en los cuales las glicosiltransferasas de la invención son
utilizadas para preparar a los oligosacáridos deseados (que están
compuestos de dos o más sacáridos). Las reacciones de la
glicosiltransferasa de la invención tienen lugar en un medio de
reacción que contiene al menos una glicosiltransferasa, un sustrato
donante, un azúcar aceptor y típicamente, un catión metálico
divalente soluble. Los métodos se apoyan en el uso de la
glicosiltransferasa para catalizar la adición de un sacárido a un
sustrato (también llamado un "aceptor") sacárido. Se conocen un
cierto número de métodos para utilizar a las glicosiltransferasas
para sintetizar a las estructuras oligosacáridas deseadas. Los
ejemplo de métodos son descritos, por ejemplo en, WO 96/32491, Ito y
colaboradores (1993) Pure Appl. Chem. 65:753, y en las
patentes estadounidenses Nos. 5.352.670, 5.374.541, y 5.545.553.
Por ejemplo, la invención provee métodos para
añadir ácido siálico en un enlace \alpha2,3 a un residuo de
galactosa, poniendo en contacto una mezcla de reacción que contiene
a un ácido siálico activado (por ejemplo, CMP-NeuAc,
CMP-NeuGc, y similares) a una fracción aceptora que
incluye a un residuo de galactosa terminal en presencia de una
sialiltransferasa bifuncional de la invención. En las modalidades
actualmente preferidas, los métodos también resultan en la adición
de un segundo residuo de ácido siálico que se enlaza al primer ácido
siálico por medio de un enlace \alpha2,8. El producto de este
método es
Sia\alpha2,8-Sia\alpha2,3-Gal-.
Los ejemplo de los aceptores adecuados incluyen una Gal terminal que
se enlaza a GlcNAc o a Glc por medio de un enlace \beta1,4, y una
Gal terminal que está \beta1,3 enlazada o bien a GlcNAc o GalNAc.
El residuo terminal al cual se une el ácido siálico, puede unirse
por si mismo a, por ejemplo, H, un sacárido, oligosacárido, o a un
grupo aglicón que tiene al menos un átomo carbohidrato. En algunas
modalidades, el residuo aceptor es una porción de un oligosacárido
que está unido a una proteína, a un lípido, o a un proteoglicano,
por ejemplo.
En algunas modalidades, la invención provee
mezclas de reacción y métodos para la síntesis de gangliósidos,
lisogangliósidos, imitaciones de gangliósidos, imitaciones de
lisogangliósidos, o las porciones de carbohidrato de estas
moléculas. Estos métodos y mezclas de reacción típicamente incluyen
como la fracción aceptora galactosilada a un compuesto que tiene una
fórmula seleccionada del grupo que consiste de
Gal4Glc-R^{1} y
Gal3GalNAc-R^{2}; en donde R^{1} se selecciona
del grupo que consiste de ceramida o de otros glicolípidos, R^{2}
se selecciona del grupo que consiste de Gal4GlcCer,
(Neu5Ac3)Gal4GlcCer, y (Neu5Ac8Neu5c3)Gal4GlcCer. Por
ejemplo, para la síntesis del gangliósido se puede seleccionar al
aceptor galactosilado del grupo que consiste de Gal4GlcCer,
Gal3GalNAc4(Neu5Ac3)Gal4GlcCer, y
Gal3GalNAc4(Neu5Ac8Neu5c3) Gal4GlcCer.
Los métodos y las mezclas de reacción de la
invención son útiles para producir cualquiera entre un gran número
de gangliósidos, lisogangliósidos, y estructuras relacionadas.
Muchos gangliósidos de interés son descritos en Oettgen, H.F., ed.,
Gangliosides and Cáncer, VCH, Alemania, 1989, páginas
10-15, y las referencias citadas allí. Los
gangliósidos de interés particular incluyen, por ejemplo, a aquellos
encontrados en el cerebro así como a otras fuentes que se en listan
en la Tabla 1.
Las sialiltransferasas bifuncionales de la
invención son particularmente útiles para la síntesis de los
gangliósidos GD1a, GD1b, GT1a, GT1b, GT1c y GQ1b, o las porciones de
carbohidratos de estos gangliósidos, por ejemplo. Las estructuras de
estos gangliósidos, que son mostradas en la tabla 1, requieren tanto
de la actividad de \alpha2,3-sialiltransferasa
como de \alpha2,8-sialiltransferasa. Una ventaja
suministrada por los métodos y las mezclas de reacción de la
invención es que ambas actividades están presentes en un polipéptido
único.
Las glicosiltransferasas de la invención pueden
ser utilizadas en combinación con glicosiltransferasas adicionales y
con otras enzimas. Por ejemplo, se puede utilizar una combinación de
sialiltransferasa y galactosiltransferasas. En algunas modalidades
de la invención, el aceptor galactosilado que es utilizado por la
sialiltransferasa bifuncional, se forma poniendo en contacto a un
aceptor adecuado con UDP-Gal y una
galactosiltransferasa. El polipéptido de la galacto-
siltransferasa, que puede ser uno como el descrito aquí, transfiere el residuo de Gal desde el UDP-Gal hasta el aceptor.
siltransferasa, que puede ser uno como el descrito aquí, transfiere el residuo de Gal desde el UDP-Gal hasta el aceptor.
En forma similar, se pueden utilizar las
\beta1,4-GalNAc transferasas de la invención para
sintetizar a un aceptor para la galactosiltransferasa. Por ejemplo,
el aceptor sacárido para la galactosiltransferasa puede formarse
poniendo en contacto a un aceptor para una GalNAc transferasa con
UDP-GalNAc y un polipéptido de la GalNAc
transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa
transfiere el residuo GalNAc desde la UDP-GalNAc
hasta el aceptor para la GalNAc transferasa.
En este grupo de modalidades, las enzimas y los
sustratos se pueden combinar en una mezcla de reacción inicial, o se
pueden añadir las enzimas y los reactivos para un segundo ciclo de
la glicosiltransferasa al medio de reacción una vez que el primer
ciclo de la glicosiltransferasa casi se ha completado. Por medio de
la conducción de dos ciclos de la glicosiltransferasa en secuencia
en un vaso sencillo, se mejoran los rendimientos totales sobre
posprocedimientos en los cuales se aisla una especie intermedia.
Además, se reduce la limpieza y la disposición de los solventes
extra y de los subproductos.
Los productos producidos por los procesos
anteriores pueden ser utilizados sin purificación. Sin embargo,
usualmente se prefiere recuperar el producto. Se pueden utilizar
técnicas estándar conocidas para la recuperación de los sacáridos
glicosilados tales como cromatografía en capa delgada o en capa
gruesa, o cromatografía de intercambio iónico. Se prefiere el uso de
filtración por membrana, más preferiblemente utilizando una membrana
osmótica inversa, o una o más técnicas cromatográficas en columna
para la recuperación.
Los compuestos oligosacáridos que se elaboran
utilizando las glicosiltransferasas y los métodos de la invención,
pueden ser utilizados en una variedad de aplicaciones, por ejemplo,
como antígenos, reactivos de diagnostico, o como productos
terapéuticos. Por lo tanto, la presente invención también provee
composiciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas en el
tratamiento de una variedad de condiciones. Las composiciones
farmacéuticas contienen oligosacáridos elaborados de acuerdo con los
métodos descritos anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
son adecuadas para ser utilizadas en una variedad de sistemas para
la liberación de una droga. Las formulaciones adecuadas para ser
usadas en la presente invención se encuentran en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia,
PA, 17ava edición, (1985). Para una breve revisión de los métodos de
la liberación de la droga, ver, Langer, Science 249:
1527-1533 (1990).
Las composiciones farmacéuticas están
encaminadas para administración parenteral, intranasal, tópica, oral
o local, tal como por medio de un aerosol o en forma transdérmica,
para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Comúnmente, las
composiciones farmacéuticas se administran en forma parenteral, por
ejemplo, en forma intravenosa. Por lo tanto la invención provee
composiciones para administración parenteral que comprenden al
compuesto disuelto o suspendido en un vehículo aceptable,
preferiblemente un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua
amortiguada, suero fisiológico, PBS y similares. Las composiciones
pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables
según se requiera para las condiciones fisiológicas aproximadas,
tales como los agentes para el ajuste del pH y amortiguadores,
agentes para el ajuste de tonicidad, agentes de humectación,
detergentes y similares.
Estas composiciones pueden ser esterilizadas por
medio de técnicas convencionales de esterilización, o pueden
esterilizarse por medio de filtración. Las soluciones acuosas
resultantes pueden ser empacadas para utilizarlas como tal, o
liofilizadas, siendo la preparación del liofilizado combinada con un
vehículo acuoso estéril antes de su administración. El pH de las
preparaciones estará típicamente entre 3 y 11, más preferiblemente
desde 5 hasta 9 y o más preferible entre 7 y 8.
En algunas modalidades, los oligosacáridos de la
invención pueden ser incorporados en liposomas formados a partir de
lípidos estándar que se forman en la vesícula. Se encuentran
disponibles una variedad de métodos para prepara liposomas, como se
describe en, por ejemplo, Szoka y colaboradores, Ann. Rev.
Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), las patentes estadounidenses Nos.
4.235.871, 4.501.728 y 4.837.028. El direccionamiento de los
liposomas utilizando una variedad de agentes para direccionamiento
(por ejemplo, los sialil galactósidos de la invención) es bien
conocido en el estado del arte (ver, por ejemplo, las patentes
estadounidenses Nos. 4.957.773 y 4.603.044).
Las composiciones que contienen a los
oligosacáridos pueden ser administradas para tratamientos
profilácticos y/o terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas,
las composiciones se administran a un paciente que ya sufra de una
enfermedad, como se describió anteriormente, en una cantidad
suficiente para curar o al menos parcialmente interrumpir los
síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad
adecuada para lograrlo es definida como una "dosis
terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este
uso dependerán de la severidad de la enfermedad y del peso y estado
general del paciente, pero generalmente el rango desde
aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 40 g de oligosacárido
por día por 70 kg del paciente, con dosis desde aproximadamente 5 mg
hasta aproximadamente 20 g de los compuestos por día, son los más
comúnmente utilizados.
Las administraciones únicas o múltiples de las
composiciones pueden ser realizadas con niveles de dosis y un patrón
seleccionado por el médico tratante. En cualquier caso, las
formulaciones farmacéuticas deben proveer una cantidad de los
oligosacáridos de esta invención, suficiente para tratar
efectivamente al paciente.
Los oligosacáridos pueden también encontrar uso
como reactivos para diagnóstico. Por ejemplo, los compuestos
marcados pueden ser utilizados para localizar áreas de inflamación o
la metástasis de un tumor en un paciente que se sospecha que tiene
una inflamación. Para este uso, los compuestos pueden ser marcados
con radioisótopos adecuados, por ejemplo, ^{121}I, ^{14}C, o
tritio.
Los oligosacáridos de la invención pueden ser
utilizados como un inmunógeno para la producción de anticuerpos
monoclonales o policlonales específicamente reactivos con los
compuestos de la invención. Pueden utilizarse en la presente
invención una multitud de técnicas disponibles para aquellos
entrenados en el arte, para la producción y manipulación de
diferentes moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos pueden ser
producidos por medio de una variedad de formas bien conocidas por
aquellos experimentados en la técnica.
La producción de anticuerpos monoclonales no
humanos, por ejemplo, de murino, lagomorfo, equino, etc., es bien
conocida y puede logarse, por ejemplo, por medio de inmunización del
animal con una preparación que contiene al oligosacárido de la
invención. Las células que producen anticuerpos, obtenidas a partir
de los animales inmunizados se inmortalizan y se evalúan, o se
evalúan primero para la producción del anticuerpo deseado y luego se
inmortalizan. Para una discusión de los procedimientos generales
para la producción de anticuerpo monoclonal, ver, Harlow y Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Publications, N.Y. (1988).
El siguiente ejemplo se ofrece como ilustración,
pero no para limitar a la presente invención.
Este Ejemplo describe el uso de dos estrategias
para la clonación de cuatro genes responsables por la biosíntesis
del GT1, una imitación gangliósida en el LOS de un patógeno
bacterial, OH4384 de Campylobacter jejuni, que ha sido
asociado con el síndrome de Guillain-Barré (Aspinall
y colaboradores (1994) Infect. Immun.
62:2122-2125). Aspinal y colaboradores ((1994)
Biochemistry 33:241-249) mostraron que esta
cepa tiene un LPS de núcleo exterior que imita al gangliósido
trisialilado GT1a. Primero clonamos a un gen que codifica a una
\alpha-2,3-sialiltranferasa
(cst-l) utilizando una estrategia para
evolución de la actividad. Utilizamos luego información de la
secuencia de nucleótidos en bruto a partir de la secuencia
recientemente completada de NCTC 11168 de C. jejuni para
amplificar una región involucrada en la biosíntesis de LOS a partir
de OH4384 de C. jejuni. Utilizando los iniciadores que están
localizados en las heptosiltransferasas I y II, se amplificó el
locus para la biosíntesis del LOS de 11,47 kb de OH4384 de C.
jejuni. La secuenciación reveló que el locus codifica 13
marcos de lectura abierta (ORF) parciales o completos, mientras que
el locus correspondiente en NCTC 11168 de C. jejuni abarca
13,49 kb y contiene 15 ORF, indicando una organización diferente
entre estas dos cepas.
Los genes potenciales de la glicosiltransferasa
fueron clonados individualmente, expresados en Escherichia
coli y examinados utilizando oligosacáridos fluorescentes
sintéticos como aceptores. Identificamos a los genes que codifican a
una
\beta-1,4-N-acetilgalactosaminiltransferasa
(cgtA), a una
\beta-1,3-galactosiltransferasa
(cgtB) y a una sialiltransferasa bifuncional
(cst-II) que transfiere el ácido siálico a
O-3 de galactosa y a O-8 de un ácido
siálico que está \alpha-2,3 enlazado a una
galactosa. La especificidad del enlace de cada glicosiltransferasa
identificada fue confirmada por medio de un análisis con RMN a 600
MHz en cantidades de nanomol de los compuestos modelo sintetizados
in vitro. Utilizando una nano sonda de RMN de banda ancha de
gradiente inverso, se podría tener información de la secuencia por
medio de la detección de las correlaciones ^{3}J(C, H) a
través del enlace glicosídico. El papel de cgtA y de
cst-II en la síntesis de la imitación de GT1a
en OH4384 de C. jejuni fue confirmado comparando sus
secuencias y actividad con los correspondientes homólogos en dos
cepas relacionadas de C. jejuni que expresan imitaciones más
cortas de gangliósidos en sus LOS. Por lo tanto, estas tres enzimas
pueden ser utilizadas para sintetizar una imitación de GT1a
partiendo de la lactosa.
Las abreviaturas utilizadas son: CE,
electroforesis capilar; CMP-Neu5Ac, citidina
monofosfato-ácido N-acetilneuráminico; COSY,
espectroscopia de correlación; FCHASE, ácido
6-(5-fluoresceín-carboxamido)-hexanóico
succimidil éster; GBS, síndrome Guillain-Barré;
HMBC, coherencia heteronuclear de enlace múltiple; HSQC, coherencia
heteronuclear de cuanto único; LIF, fluorescencia láser inducida;
LOS, lipooligosacárido; NOE, efecto nuclear de Overhauser; NOESY,
espectroscopia NOE; TOCSY, espectroscopia de correlación total.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron las siguientes cepas C.
jejuni en este estudio: serostaina O:19 (ATCC #43446); serotipo
O:19 (las cepas OH4382 y OH4384 fueron obtenidas con el Laboratory
Centre for Disease Control (Health Canada, Winnipeg, Manitoba)); y
el serotipo O:2 (NCTC #11168). La cepa DH5\alpha de Escherichia
coli fue utilizada para la biblioteca de HindIII mientras
que E. coli AD202 (CGSG #7297) fue utilizada para expresar a
las diferentes glicosiltransferasas clonadas.
El aislamiento del ADN genómico de las cepas de
C. jejuni fue realizado utilizando Qiagen
Genomic-tip 500/G (Qiagen Inc., Valencia, CA) como
se describió previamente (Gilbert y colaboradores (1996) J. Biol.
Chem. 271: 28271-28276). El aislamiento del AND
del plásmido, las digestiones con la enzima de restricción, la
purificación de los fragmentos de AND para clonación, las ligaciones
y las transformaciones fueron realizadas como lo recomendó el
proveedor de la enzima, o el fabricante del kit utilizado para el
procedimiento particular. Las largas reacciones por PCR (> 3 kb)
fueron llevadas a cabo utilizando el sistema PCR de molde largo
Expand^{TM} como lo describió el fabricante (Boehringer Mannheim,
Montreal). Las reacciones por PCR para amplificar a los ORF
específicos fueron llevadas a cabo utilizando la Pwo ADN polimerasa
como lo describe el fabricante (Boehringer Mannheim, Montreal). Las
enzimas de modificación y de restricción del ADN fueron adquiridas a
New England Biolabs Ltd. (Mississauga, ON). La secuenciación del ADN
fue llevada a cabo utilizando un secuenciador automático de ADN de
Applied Biosystems (Montreal) modelo 370A y el kit cíclico de
secuenciación del fabricante.
\newpage
La biblioteca genómica fue preparada utilizando
una digestión parcial con HindIII del ADN cromosomal de
OH4384 de C. jejuni. La digestión parcial fue purificada
sobre una columna QIAquick (QIAGEN Inc.) y lo ligado con pBluescript
SK- digerido con HindIII. La cepa DH5\alpha de E.
coli fue electroporada con la mezcla de ligación, y las células
fueron sembradas sobre placas en un medio LB con 150 \mug/mL de
ampicilina, IPTG 0,05 mM y 100 \mug/mL de X-Gal
(5-Bromo-4-cloro-indolil-\beta-D-galactopiranósido).
Las colonias blancas fueron recolectadas en 100 pozos y
resuspendidas en 1 mL de medio con 15% de glicerol. Se utilizaron
veinte \muL de cada pozo para inocular 1,5 mL de medio LB
suplementado con 150 \mug/mL de ampicilina. Después de 2 h de
crecimiento a 37ºC, se añadió IPTG hasta 1 mM y los cultivos
crecieron durante otras 4.5 h. Las células fueron recuperadas por
centrifugación, resuspendidas en 0,5 mL de Mops 50 mM (pH 7,
MgCl_{2} 10 mM) y sonicadas durante 1 min. Los extractos fueron
evaluados por la actividad de la sialiltransferasa como se describe
más adelante, excepto porque el período de incubación y la
temperatura fueron de 18 h y 32ºC, respectivamente. Los pozos
positivos fueron sembrados sobre placas para colonias sencillas, y
se escogieron 200 colonias y se analizó la actividad en 10 pozos.
Finalmente, las colonias de los pozos positivos fueron analizadas
individualmente lo cual condujo al aislamiento de dos clones
positivos, pCJH9 (inserto de 5.3 kb) y pCJH101 (inserto de 3.9 kb).
Utilizando varios fragmentos subclonados e iniciadores a la medida,
se secuenciaron completamente los insertos de los dos clones sobre
ambas cepas. Los clones con fragmentos individuales HindIII fueron
también analizados por la actividad de la sialiltransferasa y del
inserto del único positivo (un fragmento de HindIII de 1,1 kb
clonado en pBluescript SK-) fue transferido a pUC118 utilizando
sitios KpnI y PstI con el propósito de obtener el
inserto en la orientación opuesta con respecto al promotor
plac.
Los iniciadores utilizados para amplificar al
locus para la biosíntesis del LPS de OH4384 de C. jejuni se
basaron en las secuencias preliminares disponibles en el sitio web
(URL: http://www.sanger.ac.uk/Projects/Cjejuni/) del grupo de
secuenciación de C. jejuni (Sanger Centre, Reino Unido) que
secuenció el genoma completo de la cepa NCTC11168. Los iniciadores
CJ-42 y CJ-43 (todas las secuencias
de los iniciadores se describen en la Tabla 2) fueron utilizados
para amplificar un locus de 11,47 kb utilizando el sistema PCR de
molde largo Expand™. El producto PCR fue purificado sobre una
columna de giro S-300 (Pharmacia Biotech) y
secuenciado completamente sobre ambas cadenas utilizando una
combinación de paseo con iniciador y subclonación de fragmentos
HindIII. Los ORF específicos fueron amplificados utilizando a
los iniciadores descritos en la Tabla 2 y la Pwo ADN polimerasa.
Los productos PCR fueron digeridos utilizando las enzimas de
restricción apropiadas (ver Tabla 2) y fueron clonados en
pCWori+.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las diferentes construcciones fueron
transferidas a la cepa AD202 de E. coli y fueron analizadas
para la expresión de la actividad de la glicosiltransferasa después
de 4 h de inducción con IPTG 1 mM. Los extractos se elaboraron por
sonicación y las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo durante
la noche a 32ºC. Los oligosacáridos marcados con FCHASE fueron
preparados como se describió previamente (Wakarchuk y colaboradores
(1996) J. Biol. Chem. 271:19166-19173). La
concentración de proteína se determinó utilizando el kit de análisis
para la proteína con el ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL).
Para todos los análisis enzimáticos se definió una unidad de
actividad como la cantidad de enzima que generó un \mumol de
producto por minuto.
El ensayo de valoración para la actividad de la
\alpha-2,3-sialiltransfersa en
reservorios de clones contenía Lac-
FCHASE 1 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Mops 50 mM pH 7, MnCl_{2} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM en un volumen final de 10 \muL. Los diferentes ORF subclonados fueron analizados por la expresión de la actividad de la glicosiltransferasa después de 4 h de inducción de los cultivos con IPTG 1 mM. Los extractos se elaboraron por sonicación y las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo durante la noche a 32ºC.
FCHASE 1 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Mops 50 mM pH 7, MnCl_{2} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM en un volumen final de 10 \muL. Los diferentes ORF subclonados fueron analizados por la expresión de la actividad de la glicosiltransferasa después de 4 h de inducción de los cultivos con IPTG 1 mM. Los extractos se elaboraron por sonicación y las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo durante la noche a 32ºC.
La
\beta-1,3-galactosiltransferasa
fue ensayada utilizando GM2-FCHASE 0,2 mM,
UDP-Gal 1 mM, Mes 50 mM pH 6, MnCl_{2} 10 mM y DTT
1 mM. La \beta-1,4-GalNAc
transferasa fue ensayada utilizando GM3-FCHASE 0,5
mM, UDP-GalNAc 1 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MnCl_{2}
10 mM. La
\alpha-2,3-sialiltransferasa fue
ensayada utilizando Lac-
FCHASE 0,5 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MgCl_{2} 10 mM. La \alpha-2,8-sialiltransferasa fue ensayada utilizando GM3-FCHASE 0,5 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MnCl_{2} 10 mM.
FCHASE 0,5 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MgCl_{2} 10 mM. La \alpha-2,8-sialiltransferasa fue ensayada utilizando GM3-FCHASE 0,5 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MnCl_{2} 10 mM.
Las mezclas de reacción fueron diluidas
apropiadamente con NaOH 10 mM y se analizaron por medio de
electroforesis capilar llevada a cabo utilizando las condiciones de
separación y de detección que se describieron anteriormente (Gilbert
y colaboradores (1996) J. Biol. Chem.
271:2871-28276). Los picos de los electroferogramas
fueron analizados utilizando integración manual de los picos con el
software P/ACE Station. Para una detección rápida de la actividad
enzimática, las muestras de las mezclas de reacción de la
transferasa fueron examinadas por medio de cromatografía en capa
delgada sobre placas TLC sílice-60 (E. Merck) como
se describió previamente (Id.).
Los experimentos de RMN fueron realizados en un
espectrómetro de RMN Varían INOVA 600. la mayoría de los
experimentos fueron realizados utilizando una sonda de 5 mm de
resonancia triple con gradiente Z . Las muestras para RMN fueron
preparadas a partir de 0,3-0,5 mg
(200-500 nanomol) de
FCHASE-glicósido. Los compuestos fueron disueltos en
H_{2}O y se ajustó el pH a 7,0 con NaOH diluido. Después de
criodesecación, se disolvieron las muestras en 600 \muL de
D_{2}O. Todos los experimentos de RMN fueron llevados a cabo como
se describió previamente (Pavliak y colaboradores (1993) J. Biol.
Chem. 268: 14146-14152; Brisson y colaboradores
(1997) Biochemistry 36: 3278-3292) utilizando
técnicas estándar tales como COSY, TOCSY, NOESY,
1D-NOESY, 1D-TOCSY y HSQC. Como
referencia al desplazamiento químico de protón, se fijó en 2.225 ppm
(1H) la resonancia del metilo de la acetona interna. Como referencia
del desplazamiento químico del ^{13}C, se fijó en 31.07 ppm la
resonancia del metilo de la acetona interna con relación al dioxano
externo en 67.40 ppm. Los experimentos homonucleares estuvieron en
el orden de 5-8 horas cada uno. Los experimentos 1D
NOESY para GD3-FCHASE, [0.3 mM], con 8000 barridos y
un tiempo de mezcla de 800 ms fueron realizados para una duración de
8.5 h cada uno y procesados con un factor de ensanchamiento de línea
de 2-5 Hz. Para el 1D NOESY de las resonancias en
4.16 ppm, se utilizaron 3000 barridos. Se utilizaron los siguientes
parámetros para adquirir el espectro HSQC: una demora en la
relajación de 1,0 s, anchos espectrales en F_{2} y F_{1} de 6000
y 24147 Hz, respectivamente, tiempos de adquisición en t_{2} de
171 ms. Para la dimensión t_{1}, se adquirieron 128 puntos
complejos utilizando 256 barridos por incremento. La discriminación
de la señal en F_{1} se logró por medio del método de States. El
tiempo total de adquisición fue de 20 horas. Para
GM2-FCHASE, debido a las líneas anchas, el número de
barridos por incremento fue aumentado para que el HSQC fuera
realizado durante 64 horas. El espectro de fase sensible se obtuvo
después de llenar con ceros hasta 2048 x 2048 puntos. Se aplicaron
las funciones no desplazadas de ventana gaussiana en ambas
dimensiones. Los espectros HSQC fueron graficados con una resolución
de 23 Hz/punto en la dimensión del ^{13}C y 8 Hz/punto en la
dimensión del protón. Para la observación de los múltiples
desdoblamientos, se reprocesó la dimensión del ^{1}H con una
resolución de 2 Hz/punto utilizando predicción lineal avanzada y una
función Sinebell cuadrada desplazada \pi/4. Todos los datos de RMN
fueron adquiridos utilizando secuencias estándar de Varían
suministradas con el software VRMN 5.1 o el VRMN 6.1. Se utilizó el
mismo programa para el procesamiento.
Se utilizó una nanosonda para RMN de gradiente
inverso de banda ancha (Varían) para realizar el gradiente HMBC (Bax
y Summers (1986) J. Am. Chem. Soc. 108,
2093-2094; Parella y colaboradores (1995) J. Mag.
Reson. A 112, 241-245) experimentaron
para la muestra GD3-FCHASE. La nanosonda para RMN
que es una sonda de giro en ángulo mágico de alta resolución,
produce un espectro de alta resolución de muestras líquidas
disueltas solamente en 40 \muL (Manzi y colaboradores (1995) J.
Biol. Chem. 270, 9154-9163). La muestra
para GD3-FCHASE (masa = 1486,33 Da) se preparó por
medio de liofilización de la muestra original de 0,6 mL (200
nanomoles) y disolviéndola en 40 \muL de D_{2}O para una
concentración final de 5 mM. El pH final de la muestra no podía ser
medido.
El experimento del gradiente de HMBC fue
realizado a una velocidad de giro de 2990 Hz, 400 incrementos de
1024 puntos complejos, 128 barridos por incremento, tiempo de
adquisición de 0,21 s, ^{1}J(C, H) = 140 Hz y
^{n}J(C, H) = 8 Hz, para una duración de 18,5 h.
Todas las mediciones de masa se obtuvieron
utilizando un instrumento Elite-STR MALDITOF de
Perkin-Elmer Biosystems (Fragmingham, MA). Se
mezclaron aproximadamente dos \mug de cada oligosacárido con una
matriz que contenía una solución saturada de ácido
dihidroxibenzóico. Se adquirieron os espectros de masa positivo y
negativo, utilizando el modo reflector.
Antes de la clonación de los genes de la
glicosiltransferasa, se examinaron las células de las cepas OH4384 y
NCTC 11168 de C. jejuni por la diferente actividad
enzimática. Cuando se detectó la actividad de una enzima, se
optimizaron las condiciones del ensayo (descritas en los
Procedimientos Experimentales) para asegurar actividad máxima. El
ensayo de electroforesis capilar que se empleó fue extremadamente
sensible y permitió la detección de actividad enzimática en el rango
de \muU/ml (Gilbert y colaboradores (1996) J. Biol. Chem.
271: 28271-28276). Se examinaron tanto la cepa
secuenciada NCTC 11168 como la cepa OH4384 asociada con GBS por las
enzimas requeridas para la síntesis de la imitación del gangliósido
GT1a. Como se predijo, la cepa OH4384 poseía la actividad enzimática
requerida para la síntesis de esta estructura:
\beta-1,4-N-acetilgalactosaminiltransferasa,
\beta-1,3-galactosiltransferasa,
\alpha-2,3-sialiltransferasa y
\alpha-2,8-sialiltransferasa. El
genoma de la cepa NCTC 11168 carecía de la actividad de la
\beta-1,3-galactosiltransferasa y
de la actividad de la
\alpha-2,8-sialiltransferasa.
Una biblioteca de plásmidos elaborada a partir
de la digestión parcial no fraccionada con HindIII de ADN
cromosomal de la cepa OH4384 de C. jejuni produjo 2.600
colonias blancas que fueron recolectadas para formar 100 pozos. Se
utilizó un protocolo de evaluación "divide y vencerás" a partir
del cual se obtuvieron dos clones positivos y se designaron como
pCJH9 (un inserto de 5,3 kb, 3 sitios HindIII) y pCJH101
(inserto de 3,9 kb, 4 sitios HindIII). El análisis del marco
de lectura abierta (ORF) y las reacciones PCR con AND cromosómico de
la cepa OH4384 de C. jejuni indicó que pCJH9 contenía
insertos que no eran contiguos en el ADN cromosomal. La secuencia
corriente abajo del nucleótido #1440 en pCJH9 no fue estudiada
adicionalmente mientras que se encontró que los primeros 1439
nucleótidos estaban contenidos completamente dentro de la secuencia
de pCJH101. El análisis de ORF y las reacciones PCR con ADN
cromosómico indicó que todos los fragmentos de pCJH101 con HindIII
eran contiguos en el ADN cromosomal de OH4384 de C.
jejuni.
Cuatro ORF, dos parciales y dos completos,
fueron encontrados en la secuencia de pCJH101 (Figura 2). Los
primeros 812 nucleótidos codifican a un polipéptido que es 69%
idéntica al menos a 265 residuos de a.a. del factor de liberación
RF-2 de la cadena peptídica (gen prfB, GenBank
#AE000537) de Helicobacter pylori. La última base del codón
de detención TAA del factor de liberación de la cadena es también la
primera base del codón de inicio ATG de un marco de lectura abierta
que abarca a los nucleótidos #812 hasta #2104 en pCJH101. Este ORF
fue designado como cst-I
( C ampylobacter s ialiltransferasa
I ) y codifica a un polipéptido de 430 aminoácidos que
es homólogo con un ORF putativo de Haemophilus influenzae
(GenBank #U32720). El ORF putativo de H. influenzae codifica
a un polipéptido de 231 aminoácidos que es 39% idéntica a la región
media del polipéptido Cst I (residuos de los aminoácidos #80 a
#330). La secuencia corriente abajo de cst-I
incluye una ORF y una ORF parcial que codifica a los polipéptidos
que son homólogos (identidad > 60%) con las dos subunidades, CysD
y CysN, de la sulfato adenililtransferase de E. coli
(GenBank #AE000358).
Con el propósito de confirmar que el ORF de
cst-I codifica la actividad de la sialiltransferasa,
se lo subclonó y sobre expresó en E. coli. La enzima
expresada fue utilizada para añadir ácido siálico a
Gal-\beta-1,4-Glc-\beta-FCHASE
(Lac-FCHASE). Este producto
(GM3-FCHASE) fue analizado por medio de RMN para
confirmar la especificidad de enlazamiento a
Neu5Ac-\alpha-2,3-Gal
de Cst-I.
El análisis de los datos de la secuencia
preliminar disponibles en el sitio web del grupo de secuenciación de
NCTC 11168 de C. jejuni (Sanger Centre, Reino Unido
(http://www.sanger.ac.uk/ Projects /C_jejuni/)) reveló que
las dos heptosiltransferasas involucradas en la síntesis del núcleo
interior del LPS fueron fácilmente identificables por medio de la
homología de secuencia con otras heptosiltransferasas bacteriales.
La región entre las dos heptosiltransferasas abarca 13,49 kb en NCTC
11168 e incluye al menos siete glicosiltransferasas potenciales con
base en las búsquedas con BLAST en el GenBank. Ya que no hay una
estructura disponible para el núcleo exterior de LOS de NCTC 11168,
fue imposible sugerir funciones para los genes putativos de la
glicosiltransferasa putativa en esa cepa.
Con base en las regiones conservadas en las
secuencias de las heptosiltransferasas, se diseñaron iniciadores
(CJ-42 y CJ-43) para amplificar a la
región entre ellos. Se obtuvo un producto PCR de 13,49 kb utilizando
AND cromosomal a partir de NCTC 11168 de C. jejuni y un
producto PCR de 11,47 utilizando AND cromosomal a partir de OH4384
de C. jejuni. El tamaño del producto PCR a partir de la cepa
NCTC 11168 fue consistente con los datos del Sanger Centre. El menor
tamaño del producto PCR a partir de la cepa OH4384 indicó
heterogeneidad entre las cepas en la región entre los dos genes de
la heptosiltransferasa y sugirió que los genes para algunas de las
glicosiltransferasas específicas para la cepa OH4384 podrían estar
presentes en esa ubicación. Se secuenció al producto PCR de 11,47 kb
utilizando una combinación de un paseo con iniciador y subclonación
de fragmentos de HindIII (GenBank #AF130984). El contenido de
G/C del ADN fue del 27%, típico del ADN de Campylobacter. Los
análisis de la secuencia revelaron once ORF completos además de los
dos ORF parciales que codifican a las dos heptosiltransferasas
(Figura 2, Tabla 3). Cuando se comparan las secuencias deducidas de
los aminoácidos, se encuentra que las dos cepas comparten seis genes
que son idénticas por encima del 80% y cuatro genes que son
idénticos entre un 52% y un 68% (Tabla 3). Cuatro genes son únicos
para NCTC 11168 de C. jejuni mientras que un gene es único
para OH4384 de C. jejuni (Figura 2). Dos genes que están
presentes como ORF separados (ORF #5a y #10a) en OH4384 de C.
jejuni se encuentran en un ORF de fusión en la estructura
(#5b/10b) en la NCTC 11168 de C. jejuni.
Se elaboraron diferentes construcciones para
expresar a cada uno de los genes potenciales para la
glicosiltransferasa localizadas entre las heptosiltransferasas de
OH4384 de C. jejuni. El plásmido pCJL-09 que
contenía al ORF #5a y un cultivo de esta construcción mostraron la
actividad de la GalNAc transferasa cuando fueron ensayados
utilizando GM3-FCHASE como aceptor. La GalNAc
transferasa era específica para un aceptor sialilado ya que
Lac-FCHASE era un sustrato pobre (menos del 2% de la
actividad observada con GM3-FCHASE). El producto de
reacción obtenido a partir de GM3-FCHASE tenía la
masa correcta determinada con un espectrómetro de masas MALDITOF,
y el tiempo de elución idéntico en el ensayo CE que el del
GM2-FCHASE estándar. Considerando la estructura del
LPS del núcleo exterior de OH4384 de C. jejuni, esta GalNAc
transferasa (cgtA por C ampylobacter
g licosiltransferasa A ), tiene una
especificidad \beta-1,4 por el residuo terminal
Gal de GM3-FCHASE. La especificidad del enlazamiento
de CgtA fue confirmada por medio del análisis de RMN de
GM2-FCHASE (ver el texto más adelante, Tabla 4). El
papel in vivo de cgtA en la síntesis de una imitación
de GM2 se confirma por medio del mutante natural suprimido proveído
por la OH4382 de C. jejuni (Figura 1). Por la secuenciación
del homólogo de cgtA de OH4382 de C. jejuni se
encontró una mutación de desplazamiento en el marco (un estiramiento
de siete A's en vez de 8 A's después de la base #71) que resultaría
en la expresión de una versión truncada de cgtA (29 aa en vez
de 347 aa). La estructura del núcleo exterior del LOS de OH4382 de
C. jejuni es consistente con la ausencia de la
\beta-1,4-GlaNAc transferasa
mientras que el residuo interior de galactosa se sustituye solamente
con ácido siálico (Aspinall y colaboradores (1994)
Biochemistry 33, 241-249).
El plásmido pCJL-04 que contenía
al ORF #6a y un cultivo inducido por IPTG de esta construcción
mostraron actividad de galactosiltransferasa utilizando
GM2-FCHASE como un aceptor produciendo por lo tanto
GM1a-FCHASE. Este producto fue sensible a
\beta-1,3-galactosidasa y se
encontró que tenía la masa correcta por medio de espectrometría de
masas MALDI-TOF. Considerando la estructura del
núcleo exterior del LOS de OH4384 de C. jejuni, se sugiere
que esta galactosiltransferasa (cgtB por
C ampylobacter g licosiltransferasa
B ) tiene especificidad \beta-1,3 por
el residuo terminal GalNAc de GM2-FCHASE. La
especificidad del enlace de CgtA fue confirmada por medio de
análisis con RMN de GM1a-FCHASE (ver el texto más
abajo, Tabla 4) que fue sintetizado por medio del uso secuencial
Cst-I, CgtA y CgtB.
El plásmido pCJL-03 que incluyó
al ORF #7a y un cultivo inducido por IPTG mostraron actividad de
sialiltransferasa utilizando tanto Lac-FCHASE como
GM3-FCHASE como aceptores. Esta segunda
sialiltransferasa de OH4384 fue designada como
cst-II. Cst-II mostró ser
bi-funcional ya que podía transferir ácido siálico
\alpha-2,3 al Gal terminal de
Lac-FCHASE y también \alpha-2,8-
al ácido siálico terminal de GM3-FCHASE. El análisis
por RMN de un producto de reacción formado con
Lac-FCHASE confirmó el enlace
\alpha-2,3 del primer ácido siálico sobre la Gal,
el enlace de \alpha-2,8 del segundo ácido siálico
(ver el texto más adelante, Tabla 4).
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El papel in vivo de
cst-II de OH4384 de C. jejuni en la
síntesis de una imitación del gangliósido trisialilado GT1a es
soportado por la comparación con el homólogo de
cst-II de O:19 de C. jejuni (serocepa)
que expresa la imitación del gangliósido disialilado GD1a. Existen
24 diferencias en los nucleótidos que se traducen en 8 diferencias
en los aminoácidos entre estos dos homólogos de
cst-II (Figura 3). Cuando se expresa en E.
coli, el homólogo de cst-II de O:19 de
C. jejuni (serocepa) tiene actividad de
\alpha-2,3-sialiltransferasa pero
muy baja actividad de
\alpha-2,8-sialiltransferasa
(Tabla 5) que es consistente con la ausencia del ácido siálico
enlazado con \alpha-2,8 terminal en el núcleo
exterior de LOS (Aspinall y colaboradores (1994) Biochemistry
33, 241-249) de O:19 de C. jejuni (serocepa).
El homólogo de cst-II de NCTC 11168 de C.
jejuni expresó una actividad mucho más baja de
\alpha-2,3-sialiltransferasa que
el homólogo de O:19 (serocepa) o OH4384 y actividad no detectable
de la
\alpha-2,8-sialiltransferasa. Se
podría detectar una banda inducible de IPTG sobre un gel de
SDS-PAGE cuando cst-II de
NCTC 11168 se expresó en E. coli (no se muestran los datos).
La proteína Cst-II de NCTC 11168 comparte solamente
un 52% de identidad con los homólogos de O:19 (serocepa) o de
OH4384. No se podría determinar si las diferencias en la secuencia
podrían ser las responsables por la menor actividad expresada en
E. coli.
Aunque cst-I cartografió
por fuera al locus para la biosíntesis de LOS, es obviamente
homólogo a cst-II ya que sus primeros 300
residuos comparten 44% de identidad con Cst-II, ya
sea de OH4384 de C. jejuni o de NCTC 11168 de C.
jejuni (Figure 3). Los dos Cst-II homólogos
comparten 52% de residuos idénticos entre ellos y están ausentes los
130 aminoácidos C-terminales de
Cst-I. Una versión truncada de Cst-I
que perdió 102 aminoácidos en el C-terminal, se
encontró que era activa (no se muestran los datos) lo cual indica
que el dominio C-terminal de Cst-I
no es necesario para la actividad de la sialiltransferasa. Aunque
los 102 residuos en el C-terminal son dispensables
para la actividad enzimática in vitro, ellos pueden
interactuar con otros componentes celulares in vivo ya sea
para propósitos de regulación o para la localización apropiada de la
célula. El bajo nivel de conservación entre las sialiltransferasas
de C. jejuni es muy diferente de lo que se observó
previamente par alas
\alpha-2,3-sialiltransferasas de
N. meningitidis y N. gonorrhoeae, donde las primeras
transferasas son idénticas en más de un 90% con el nivel de
proteína entre las dos especies y entre diferentes aislados de la
misma especie (Gilbert y colaboradores, supra.).
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Con el propósito de evaluar apropiadamente la
especificidad del enlazamiento de una glicosiltransferasa
identificada, su producto fue analizado por medio de espectroscopia
de RMN. Con el propósito de reducir el tiempo necesario para la
purificación de los productos enzimáticos, se llevaron a cabo
análisis de RMN sobre cantidades en nanomol. Todos los compuestos
son solubles y producen resonancias agudas con anchos de línea de
unos pocos Hz ya que los dobletes anoméricos H-1
(J_{1,2} = 8 Hz) están bien resueltos. La única excepción es para
GM2-FCHASE que tiene líneas anchas (\sim10 Hz),
probablemente debido a agregación. Para el espectro de protón de la
solución de GD3-FCHASE 5 mM en la nanosonda de RMN,
los anchos de línea de las señales anoméricas eran del orden de 4
Hz, debido a la mayor concentración. También, se observaron picos
adicionales, probablemente debido a la degradación de la muestra con
el tiempo. También hubo algunos ligeros cambios en los
desplazamientos químicos, probablemente debido a un cambio en el pH
por la concentración de la muestra desde 0,3 mM hasta 5 mM. Los
espectros de protón fueron adquiridos a diferentes temperaturas con
el propósito de evitar el solapamiento de la resonancia de la HDO
con las resonancias anoméricas. Como se puede evaluar a partir de
los espectros de protón, todos los compuestos eran puros y las
impurezas o los productos de degradación que estaban presente no
interfirieron con los análisis por RMN que fueron realizados como se
describió previamente (Pavliak y colaboradores (1993) J. Biol.
Chem. 268, 14146-14152; Brisson y colaboradores
(1997) Biochemistry 36,
3278-3292).
Para todos los glicósidos FCHASE, las
asignaciones por ^{13}C de glicósidos similares (Sabesan y Paulson
(1986) J. Am. Chem. Soc. 108,
2068-2080; Michon y colaboradores (1987)
Biochemistry 26, 8399-8405; Sabesan y
colaboradores (1984) Can. J. Chem. 62,
1034-1045) estaban disponibles. Para los glicósidos
FCHASE, las asignaciones con ^{13}C fueron verificadas asignando
primero el espectro del protón de los experimentos estándar 2D
homonucleares, COSY, TOCSY y NOESY, y luego verificando las
asignaciones con ^{13}C a partir de un experimento de HSQC, que
detecta las correlaciones C-H. El experimento de
HSQC no detecta a los carbonos cuaternarios tipo C-1
y C-2 del ácido siálico, pero el experimento de HMBC
lo hace. Principalmente por las resonancias de Glc, los
desplazamientos químicos del protón obtenidos a partir del espectro
de HSQC difirieron de aquellos obtenidos a partir de experimentos
homonucleares debidos al calentamiento de la muestra durante el
desacoplamiento del ^{13}C. A partir de una serie de espectros de
protón adquiridos a diferentes temperaturas, se encontró que los
desplazamientos químicos del residuo de Glc eran los más sensibles a
la temperatura. En todos los compuestos, las resonancias de
H-1 y de H-2 de Glc cambiaron en
0,004 ppm/ºC, de H-1 de
Gal(1-4) en 0,002 ppm/ºC, y en menos de 0,001
ppm/ºC para el H-3 de Neu5Ac y otras resonancias
anoméricas. Para LAC-FCHASE, la resonancia de
H-6 de Glc cambió en 0,008
ppm/ºC.
ppm/ºC.
El gran coeficiente de temperatura para las
resonancias de Glc se atribuye a los desplazamientos corrientes del
anillo inducidos por el enlace al grupo aminofenilo de FCHASE. La
temperatura de la muestra durante el experimento de HSQC se midió a
partir del desplazamiento químico de las resonancias de
H-1 y de H-2 de Glc. Para
GM1a-FCHASE, la temperatura cambió desde 12ºC hasta
24ºC debido a la presencia del contraión Na^{+} en la solución y
del NaOH utilizado para ajustar el pH. Otras muestras tuvieron un
calentamiento menos severo (<5ºC). En todos los casos, los
cambios de los desplazamientos de protón con la temperatura no
causaron ningún problema en las asignaciones de las resonancias en
el espectro de HSQC. En la Tabla 4 y en la Tabla 6, todos los
desplazamientos químicos se toman del espectro de HSQC.
\newpage
El sitio de enlazamiento sobre el aglicón se
determinó principalmente a partir de una comparación de los
desplazamientos químicos del ^{13}C del producto enzimático con
aquellos del precursor para determinar los desplazamientos de
glicosilación como se hizo previamente para diez
sialiloligosacáridos (Salloway y colaboradores (1996) Infect.
Immun., 64, 2945-2949). Aquí, en vez de
comparar los espectros del ^{13}C, se comparan los espectros de
HSQC, ya que se necesitaría cien veces más material para obtener un
espectro de ^{13}C. Cuando los desplazamientos químicos del
^{13}C a partir de los espectros de HSQC del compuesto precursor
se comparan con aquellos del producto enzimático, el principal
desplazamiento campo abajo siempre ocurre en el sitio del enlace,
mientras que otros desplazamientos químicos del precursor no cambian
sustancialmente. Las diferencias en el desplazamiento químico del
protón son mucho más susceptibles a efectos conformacionales de
largo alcance, preparación de la muestra y temperatura. La identidad
del azúcar nuevo añadido puede ser rápidamente identificada a partir
de una comparación de sus desplazamientos químicos de ^{13}C que
aquella de los monosacáridos o de cualquier residuo terminal, ya que
solamente el desplazamiento químico anomérico del glicón cambia
sustancialmente por causa de la glicosidación (Sabesan y
Paulson,
supra).
supra).
El acoplamiento espín-espín con
el protón vecino (J_{HH}) obtenido a partir de los experimentos de
1D TOCSY o 1D NOESY también es útil para determinar la identidad del
azúcar. Los experimentos con el NOE se efectúan para secuenciar los
azúcares por medio de la observación de los NOE entre los protones
del glicón anomérico (H-3s para el ácido siálico) y
las resonancias del protón aglicón. El NOE más grande está
usualmente sobre el protón de enlace, pero también pueden ocurrir
otros NOE sobre las resonancias del protón aglicón que están
próximas al sitio de enlace. Aunque a 600 MHz, los NOE de muchos
tetra y pentasacáridos son positivos o muy pequeños, todos estos
compuestos dieron NOE bien negativos con un tiempo de mezcla de 800
ms, probablemente debido a la presencia de la gran fracción
FCHASE.
Para el Lac-FCHASE sintético,
las asignaciones de ^{13}C para la fracción de lactosa de
Lac-FCHASE fueron confirmadas por medio de los
métodos 2D reseñados anteriormente. Todas las resonancias del protón
de la unidad Glc fueron asignadas a partir de un experimento
1D-TOCSY sobre la resonancia de H-1
de Glc con un tiempo de mezcla de 180 ms. Un experimento
1D-TOCSY para H-1 de Gal fue
utilizado para asignar las resonancias de H-1 a
H-4 de la unidad Gal. Los restantes
H-5 y H-6 de la unidad Gal fueron
asignados entonces a partir del experimento HSQC. Los valores del
acoplamiento espín-espín vecinos (J_{HH}) para las
unidades de azúcar estuvieron de acuerdo con los datos anteriores
(Michon y colaboradores, supra). Los desplazamientos químicos
para la fracción FCHASE han sido dados anteriormente (Gilbert y
colaboradores (1996) J. Biol. Chem. 271,
28271-28276).
La determinación precisa de la masa del producto
enzimático de Cst-I de Lac-FCHASE
fue consistente con la adición de ácido siálico al aceptor
Lac-FCHASE (Figura 4). El producto fue identificado
como GM3-FCHASE ya que el espectro del protón y los
desplazamientos químicos del ^{13}C de la fracción de azúcar del
producto (Tabla 6) fueron muy similares a aquellos del oligosacárido
GM3 o la sialillactosa,
(\alphaNeuAc(2-3)\betaGal(1-4)\betaGlc;
Sabesan y Paulson, supra). Las resonancias del protón de
GM3-FCHASE fueron asignadas a partir del espectro de
la COSY, el espectro de HSQC, y la comparación del protón y los
desplazamientos químicos del ^{13}C con aquellos de
\alphaNeu5Ac(2-3)\betaGal(1-4)\betaGlcNAc-FCHASE
(Gilbert y colaboradores, supra.). Para estos dos compuestos,
el protón y los desplazamientos químicos del ^{13}C para los
residuos Neu5Ac y Gal estuvieron dentro de los errores ligados entre
sí (Id.). A partir de una comparación de los espectros de
HSQC de Lac-FCHASE y de GM3-FCHASE,
es obvio que el sitio de enlazamiento es un C-3 de
Gal debido al gran desplazamiento campo abajo de H-3
de Gal H-3 y de C-3 de Gal por causa
de la sialilación típica para los sialiloligosacáridos
(2-3) (Sabesan y Paulson, supra.). También,
como se observó antes para
\alphaNeu5Ac(2-3)\betaGal(1-4)\betaGlcNAc-FCHASE
(Gilbert y colaboradores, supra.), el NOE de
H-3ax del ácido siálico para H-3 de
Gal fue observado típicamente del enlace
\alphaNeu5Ac(2-3)Gal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La determinación precisa de la masa del producto
enzimático de Cst-II a partir de
Lac-FCHASE indicó que dos ácidos siálicos habían
sido añadidos al aceptor Lac-FCHASE (Figura 4). Las
resonancias del protón fueron asignadas a partir de COSY, ID TOCSY e
ID NOESY y la comparición de los desplazamientos químicos, con
estructuras conocidas. Las resonancias de H-1 hasta
H-6 de Glc y de H-1 hasta
H-4 de Gal fueron asignadas a partir de ID TOCSY
sobre las resonancias de H-1. Las resonancias de
Neu5Ac fueron asignadas a partir de COSY y confirmadas por medio
de ID NOESY. La ID NOESY de las resonancias de Neu5Ac de
H-8, H-9 a 4,16 ppm, fue utilizada
para localizar las resonancias de los H-9 y
H-7 (Michon y colaboradores, supra). La
aparición del singlete de la resonancia de H-7 de
Neu5Ac(2-3) que surge de las pequeñas
constantes de acoplamiento vecinas es típica del enlace
2-8 (Id.). Las otras resonancias fueron
asignadas a partir del espectro de HSQC y de las asignaciones del
^{13}C para el ácido siálico terminal (Id.). El protón y
los desplazamientos químicos del carbono ^{13}C de la unidad Gal
fueron similares a aquellos en GM3-FCHASE, indicando
la presencia del enlace
\alphaNeu5Ac(2-3)Gal. Los valores
J_{HH}, los desplazamientos químicos del ^{13}C y del protón de
los dos ácidos siálicos, fueron similares a aquellos de
\alphaNeu5Ac(2-8)Neu5Ac en el
trisacárido Neu5Ac
\alpha(2-8)-enlazado
(Salloway y colaboradores (1996) Infect. Immun. 64,
2945-2949) indicando la presencia de ese enlace. Por
lo tanto, el producto fue identificado como
GD3-FCHASE. La sialilación en C-8 de
Neu5Ac causó un desplazamiento campo abajo de 6,5 ppm en su
resonancia en C-8 desde 72,6 ppm hasta 79,1 ppm.
Los NOE entre residuos para
GD3-FCHASE también eran típicos de la secuencia
\alphaNeu5Ac(2-8)\alphaNeu5Ac(2-3)\betaGal.
Los NOE más grandes entre residuos de las dos resonancias de
H-3_{ax} en 1,7-1,8 ppm de
Neu5Ac(2-3) y de
Neu5Ac(2-8) son para las resonancias de
H-3 de Gal y de H-8 de
-8)Neu5Ac. También se observan los NOE más pequeños entre
residuos para H-4 de Gal y H-7 de
-8)Neu5Ac. También se observan los NOE sobre las resonancias
del FCHASE debido al solapamiento de una resonancia del FCHASE con
las resonancias de H-3_{ax} (Gilbert y
colaboradores, supra.). También se observan los NOE entre
residuos de H-3_{eq} desde
Neu5Ac(2-3) hasta H-3 de Gal.
También, los residuos internos confirmaron las asignaciones de los
protones. Los NOE para el enlace 2-8 son los mismos
que aquellos observados para el polisacárido -8Neu5Aca2- (Michon y
colaboradores, supra).
Los enlaces glicosídicos del ácido siálico
también podrían ser confirmados por medio del uso del experimento
HMBC que detecta las correlaciones ^{3}J (C, H) a través del
enlace glicosídico. Los resultados para ambos enlaces,
\alpha-2,3 y \alpha-2,8,
indican que las correlaciones ^{3}J(C, H) entre las dos
resonancias C-2 anoméricas de Neu5Ac y las
resonancias de H-3 de Gal, y H-8 de
-8)Neu5Ac. También se observaron las correlaciones dentro de
los residuos para las resonancias de H-3_{ax} y
H-3_{eq} de los dos residuos de Neu5Ac. También se
observa la correlación (C-1, H-2) de
Glc ya que existia un solapamiento parcial de los picos
entrecruzados en 101 ppm con los picos entrecruzados en 100,6 ppm
en el espectro de HMBC.
La determinación precisa de la masa del producto
enzimático de CgtA a partir GM3-FCHASE indicó que
una unidad de hexosa N-acetilada había sido añadida
al aceptor GM3-FCHASE (Figura 4). El producto fue
identificado como GM2-FCHASE ya que el protón
glicósido y los desplazamientos químicos del ^{13}C fueron
similares a aquellos para el oligosacárido GM2 (GM2OS) (Sabesan y
colaboradores (1984) Can. J. Chem. 62,
1034-1045). A partir del espectro de HSQC para
GM2-FCHASE, y de la integración de su espectro del
protón, existen ahora dos resonancias en 4,17 ppm y 4,18 ppm junto
con un nuevo "d1" anomérico y dos grupos NAc en 2,04 ppm. A
partir de los experimentos de TOCSY y NOESY, se asignó en forma no
ambigua la resonancia en 4,18 ppm para H-3 de Gal
debido al fuerte NOE entre H-1 y
H-3. Para la
\beta-galactopiranosa, se observan fuertes NOE
dentro de los residuos entre H-1 y
H-3 y H-1 y H-5
debido a la posición axial de los protones, y a sus cortas
distancias entre los protones (Pavliak y colaboradores (1993) J.
Biol. Chem. 268, 14146-14152; Brisson y
colaboradores (1997) Biochemistry 36,
3278-3292; Sabesan y colaboradores (1984) Can. J.
Chem. 62, 1034-1045). A partir del
espectro TOCSY y la comparación de los desplazamientos químicos de
H1 de GM2-FCHASE y de GM2OS (Sabesan y
colaboradores, supra) se asigna la resonancia en 4,17 ppm
como H-4 de Gal. En forma similar, a partir de los
espectros de TOCSY y NOESY, se asignaron H-1 hasta
H-5 de GalNAc y Glc, y H-3 hasta
H-6 de Neu5Ac. Debido a lo ancho de las líneas, no
se podía observar el patrón multiplete de las resonancias. Se
asignaron las otras resonancias a partir de la comparación con el
espectro de HSQC del precursor y las asignaciones por ^{13}C para
GM2OS (Sabesan y colaboradores, supra). Por medio de la
comparación del espectro de HSQC para los glicósidos GM3- y
GM2-FCHASE, ocurrió un desplazamiento campo abajo de
-9,9 ppm entre el precursor y el producto sobre la resonancia de
C-4 de Gal. Junto con los NOE dentro del residuo
para H-3 y H-5 de
\beta-GalNAc, se observó también el NOE entre los
residuos desde H-1 de GalNAc hasta
H-4 de Gal en 4,17 ppm, confirmando la secuencia
\betaGalNAc(1-4)Gal. Los NOE
observados fueron aquellos esperados a partir de las propiedades
conformacionales del gangliósido GM2 (Sabesan y
colaboradores,
supra).
supra).
La determinación precisa de la masa del producto
enzimático de CgtB a partir de GM2-FCHASE indicó que
se había añadido una unidad de hexosa al aceptor
GM2-FCHASE (Figura 4). El producto fue identificado
como GM1a-FCHASE ya que los desplazamientos químicos
del ^{13}C del glicósido, fueron similares a aquellos para el
oligosacárido GM1a (Id.). Las resonancias del protón fueron
asignadas a partir de COSY, 1D TOCSY y 1D NOESY. A partir de 1D
TOCSY sobre la resonancia "e1" adicional del producto, se
observaron cuatro resonancias con un patrón multiplete de
\beta-galactopiranosa. A partir de 1D TOCSY y 1D
NOESY sobre las resonancias de H-1 de \betaGalNAc,
se asignaron las resonancias de H-1 hasta
H-5. El patrón multiplete de H-1
hasta H-4 de pGalNAc era típico de la configuración
\beta-galactopiranosil, confirmando la identidad
de este azúcar para GM2-FCHASE. Era claro que por
cusa de la glilcosidación, las principales perturbaciones se
presentaron par alas resonancias de \betaGalNAc, y hubo un
desplazamiento campo abajo de -9,1 ppm entre el aceptor y el
producto sobre la resonancia de C-3 de GalNAc.
También, junto con los NOE dentro del residuo para
H-3, se observaron H-5 de Gal, un
NOE entre residuos desde H-1 de Gal hasta
H-3 de GalNAc, y uno más pequeño para
H-4 de GalNAc, confirmando la secuencia de
\betaGal(1-3)GalNAc. Los NOE
observados fueron aquellos esperados a partir de las propiedades
conformacionales del gangliósido GM1a (Sabesan y colaboradores,
supra).
Hubo alguna discrepancia con la asignación de
las resonancias de C-3 y C-4 para
\betaGal(1-4) en GM2OS y GM1OS las cuales
son contrarias a las de los datos publicados (Sabesan y
colaboradores, supra). Anteriormente, las asignaciones se
basaban en la comparación de los desplazamientos químicos del
^{13}C con compuestos conocidos. Para GM1a-FCHASE,
la asignación para H-3 de
Gal(1-4) fue confirmada por medio de la
observación de su gran acoplamiento vecinal, J_{2,3} = 10Hz,
directamente en el espectro de HSQC procesado con 2 Hz/punto en la
dimensión del protón. El multiplete de H-4 es mucho
más estrecho (< 5 Hz) debido a la posición ecuatorial de
H-4 en la galactosa (Sabesan y colaboradores,
supra.). En la Tabla 6, las asignaciones de
C-4 y C-6 de uno de los ácidos
siálicos en (-8Neu5Ac2-)_{3}, también tuvieron que ser invertidas
(Michon y colaboradores, supra) como lo confirmaron las
asignaciones de H-4 y H-6.
Los desplazamientos químicos del ^{13}C de los
glicósidos del FCHASE obtenidos a partir del espectro de HSQC
estaban perfectamente de acuerdo con aquellos de los oligosacáridos
de referencia mostrados en la Tabla 6. Se observaron diferencias por
encima de 1 ppm para algunas resonancias y estas son debidas a
diferentes aglicones en el extremo reductor. Excluyendo estas
resonancias, los promedios de las diferencias en los desplazamientos
químicos entre los glicósidos del FCHASE y sus compuestos de
referencia fueron menores a \pm 0,2 ppm. Por lo tanto, la
comparación de los desplazamientos químicos del protón, de los
valores J_{HH} y de los desplazamientos químicos del ^{13}C con
estructuras conocidas, y el uso de los NOE o de la HMBC, fueron
utilizados todos para determinar la especificidad del enlace para
diferentes glicosiltransferasas. La ventaja de utilizar el espectro
de HSQC es que la asignación del protón puede ser verificada en
forma independiente para confirmar la asignación de las resonancias
del ^{13}C de los átomos en el sitio del enlace. En términos de
sensibilidad, los NOE del protón son los más sensibles, seguidos por
los de HSQC y los de HMBC. Utilizando una nano sonda de RMN en vez
de una sonda de RMN de 5 mm sobre la misma cantidad de material,
redujo considerablemente el tiempo total de adquisición, haciendo
posible la adquisición de un experimento de HMBC durante la
noche.
Con el propósito de clonar las
glicosiltransferasas de LOS de C. jejuni, se empleó una
estrategia de evaluación similar a aquella que se utilizó
previamente para clonar a la
\alpha-2,3-sialiltransferasa de
Neisseria meningitidis (Gilbert y colaboradores,
supra). La estrategia de la evaluación de la actividad
produjo dos clones que codificaron dos versiones del mismo gen de la
\alpha-2,3-sialiltransferasa
(cst-I). El análisis de ORF sugirió que un
polipéptido en el residuo 430 es el responsable de la actividad de
la \alpha-2,3-sialiltransferasa.
Para identificar a otros genes involucrados en la biosíntesis de
LOS, se comparó un locus para la biosíntesis de LOS en la
secuencia del genoma completo de NCTC 11168 de C. jejuni con
el locus correspondiente de OH4384 de C. jejuni. Se
identificaron y analizaron los marcos completos de lectura abierta.
Varios de los marcos de lectura abierta se expresaron
individualmente en E. coli, incluidos una
\beta-1,4-N-acetilgalactosaminil-transferasa
(cgtA), una
\beta-1,3-galactosiltransferasa
(cgtB) y una sialiltransferasa bifuncional
(cst-II).
(cst-II).
La síntesis in vitro de los derivados
fluorescentes de cantidades en nanomoles de imitaciones de
gangliósidos y sus análisis por RMN confirmaron en forma inequívoca
la especificidad del enlace de las cuatro glicosiltransferasas
clonadas. Con base en estos datos, se sugiere que la ruta descrita
en la Figura 4 es la utilizada por OH4384 de C. jejuni para
sintetizar a una imitación de GT1a. Este papel para cgtA es
soportado además por el hecho de que OH4342 de C. jejuni,
que transporta una versión inactivas de este gen, no tiene
\beta-1,4-GalNAc en su núcleo
central del LOS (Figura 1). El gen cst-II de
OH4384 de C. jejuni exhibió tanto a la
\alpha-2,3- como a la
\alpha-2,8-sialiltransferasa en un
ensayo in vitro mientras que cst-II de
O:19 de C. jejuni (serocepa) mostró solamente actividad de
\alpha-2,3-sialiltransferasa
(Tabla 5). Esto es consistente con un papel para
cst-II en la adición de un ácido siálico
enlazado en posición \alpha-2,8 terminal en OH4382
y en OH4384 de C. jejuni, los cuales tienen idénticos genes
cst-II, pero no en O:19 de C. jejuni
(serocepa, ver Figura 1). Existen 8 diferencias en los aminoácidos
entre los Cst-II homólogos de O:19 de C.
jejuni (serocepa) y los de OH4382/84.
La bifuncionalidad de
cst-II puede tener un impacto sobre el éxito
de la infección de C. jejuni ya que se ha sugerido que la
expresión del epítopo dí-sialilado, puede estar involucrada en el
desarrollo de complicaciones neuropáticas tales como el síndrome de
Guillain-Barré (Salloway y colaboradores (1996)
Infect. Immun. 64, 2945-2949). Merece
observarse que su actividad bifuncional es nueva entre las
sialiltransferasas descritas hasta ahora. Sin embargo, se ha
descrito una actividad bifuncional de la glicosiltransferasa para la
ácido
3-desoxi-D-mano-octulosónico
transferasa de E. coli (Belunis, C. J., y Raetz, C. R.
(1992) J. Biol. Chem. 267:
9988-9997).
La actividad mono/bi-funcional
de cst-II y la activación/inactivación de
cgtA parecen ser dos formas de los mecanismos de variación de
fase que le permiten a C. jejuni elaborar diferentes
carbohidratos de superficie que se le presentan al huésped. Además
de aquellas pequeñas alteraciones génicas que se encuentran entre
las tres cepas O:19 (serocepa, OH4382 y OH4384), Existen
reordenamientos genéticos mayores cuando se comparan los loci entre
OH4384 y NCTC 11168 de C. jejuni (una cepa O:2). Excepto
para el gen prfB, el locus cst-I
(incluidos cysN y cysD) se encuentra solamente en
OH4384 de C. jejuni. Existen diferencias significativas en la
organización del locus para la biosíntesis del LOS entre las cepas
OH4384 y NCTC 11168. Algunos de los genes están bien conservados,
algunos de ellos están pobremente conservados mientras que los otros
son únicos para una u otra cepa. Dos genes que están presentes como
ORF separados (#5a: cgtA y #10a: NeuA) en OH4384, se encuentran como
ORF de fusión en el marco en NCTC 11168 (ORF #5b/#10b). Se detectó
actividad de
\beta-N-acetilgalactosaminiltransferasa
en esta cepa, lo que sugiere que al menos la parte cgtA de la fusión
puede ser activa.
En resumen, este Ejemplo describe la
identificación de diferentes marcos de lectura abierta que codifican
enzimas involucradas en la síntesis de lipooligosacáridos en
Campylobacter.
<110> Consejo Nacional de Investigación
del Canadá
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GLICOSIL TRANSFERASAS DE
CAMPILOBACTER PARA LA BIOSÍNTESIS DE GANGLIÓSIDOS E IMITACIONES DE
GANGLIÓSIDOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 40330-1569
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/CA00/0086
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-02-01
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/118,218
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1959-02-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter jejuni
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 876
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter jejuni
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
\newpage
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 876
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 291
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 6
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<211> 291
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<211> 876
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<212> ADN
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<213> Campylobacter jejuni
\newpage
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<211> 294
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 10
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<211> 1170
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<212> ADN
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<213> Campylobacter jejuni
\newpage
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 1044
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<212> ADN
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<213> Campylobacter jejuni
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 13
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<211> 906
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<212> ADN
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<213> Campylobacter jejuni
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<211> 301
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<212> ADN
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 16
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<211> 302
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
\newpage
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<400> 17
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<211> 295
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<211> 418
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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<211> 346
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 21
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
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<211> 352
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 22
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 23
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<211> 221
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
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<212> PRT
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<213> Campylobacter jejuni
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<400> 25
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Claims (39)
1. Una molécula aislada o recombinante de ácido
nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica
a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:
- a)
- un polipéptido que tiene la actividad de aciltransferasa para la biosíntesis del lípido A, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- b)
- un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- c)
- un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1 sobre una región de al menos 100 aminoácidos de longitud;
- d)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,4-GalNAc transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 77% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- e)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,3-Galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de la Galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- f)
- un polipéptido que tiene ya sea la actividad de la \alpha2,3-sialiltransferasa o tanto a la actividad de la \alpha2,3-sialiltransferasa como de la \alpha2,8-sialiltransferasa, en donde el polipéptido de la Galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 66% idéntica sobre una región de al menos 60 aminoácidos de longitud hasta una secuencia de aminoácidos como la expuesta en una o más de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10;
- g)
- un polipéptido que tiene la actividad de la ácido siálico sintasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- h)
- un polipéptido que tiene la actividad de biosíntesis del ácido siálico, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 8021-9076 del locus para la biosíntesis del LOS de OH4384 de la cepa de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- i)
- un polipéptido que tiene la actividad del ácido siálico-CMP sintetasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9076-9738 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- j)
- un polipéptido que tiene la actividad de la acetiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9729-10559 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y
- k)
- un polipéptido que tiene la actividad de la glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por medio de un complemento inverso de los nucleótidos 10557-11366 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1.
2. La molécula aislada o recombinante de ácido
nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico
comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica a uno o más
polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de:
- a)
- un polipéptido de sialiltransferasa que tiene tanto actividad de una \alpha2,3-sialiltransferasa como actividad de una \alpha2,8-sialiltransferasa, en donde el polipéptido de la sialiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuestas en la SEQ ID NO: 3 sobre una región de al menos 50 aminoácidos se longitud;
- b)
- un polipéptido de GalNAc transferasa que tiene actividad de \beta1,4-GalNAc transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuestas en la SEQ ID NO: 13 sobre una región de al menos 50 aminoácidos se longitud; y
- c)
- un polipéptido de galactosiltransferasa que tiene actividad de \beta1,3-galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de la galactosiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuestas en la SEQ ID NO: 15 sobre una región de al menos 50 aminoácidos se longitud.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde las comparaciones de las secuencias se
llevan a cabo utilizando un algoritmo BLASTP versión 2.0 con una
longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1, y una matriz de sustitución
BLOSUM62.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde la región extiende la longitud total de
la secuencia de aminoácidos del polipéptido.
5. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde:
- a)
- el polipéptido de la sialiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 10;
- b)
- el polipéptido de la GalNAc transferasa comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13; y
- c)
- el polipéptido de la galactosiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17.
6. La molécula de ácido nucleico como la de la
reivindicación 5, en donde:
- a)
- la secuencia del polinucleótido que codifica al polipéptido de la sialiltransferasa es al menos 75% idéntica a una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, o la SEQ ID NO: 6, sobre una región de al menos 50 nucleótidos de longitud;
- b)
- la secuencia del polinucleótido que codifica al polipéptido de la \beta 1,4-GalNAc transferasa es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 12, sobre una región aproximadamente de al menos 50 nucleótidos de longitud; y
- c)
- la secuencia del polinucleótido que codifica al polipéptido de la \beta 1,3-galactosiltransferasa es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 14 o en la SEQ ID NO: 16, sobre una región aproximadamente de al menos 50 nucleótidos de longitud.
7. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 6, en donde las comparaciones de las secuencias se
llevan a cabo utilizando un algoritmo BLASTN versión 2.0 con una
longitud de palabra (W) de 1, G=5, E=2, q=-2, y r=1.
8. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 6, en donde:
- a)
- la secuencia del polinucleótido que codifica al polipéptido de la sialiltransferasa tiene una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, o la SEQ ID NO: 6;
- b)
- la secuencia del polinucleótido que codifica al polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 12; y
- c)
- la secuencia del polinucleótido que codifica al polipéptido de la galactosiltransferasa tiene una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 14 o en la SEQ ID NO: 16.
9. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 5, en donde la sialiltransferasa es una
sialiltransferasa bifuncional que tiene tanto actividad de
\alpha2,3-sialiltransferasa como actividad de
\alpha2,8-sialiltransferasa y la secuencia del
polinucleótido que codifica al polipéptido de la sialiltransferasa
es al menos 75% idéntica a una secuencia de ácido nucleico como la
expuesta en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
10. Un casete de expresión que comprende una
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
11. Un vector de expresión que comprende al
casete de expresión de la reivindicación 10.
12. Una célula huésped que comprende al vector
de expresión de la reivindicación 11.
13. Un polipéptido aislado o producido en forma
recombinante seleccionado del grupo que consiste de:
- a)
- un polipéptido que tiene la actividad de aciltransferasa para la biosíntesis del lípido A, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- b)
- un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- c)
- un polipéptido que tiene la actividad de glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1 sobre una región de al menos 100 aminoácidos de longitud;
- d)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,4-GalNAc transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 77% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- e)
- un polipéptido que tiene la actividad de la \beta1,3-Galactosiltransferasa, en donde el polipéptido de la Galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;
- f)
- un polipéptido que tiene actividad de \alpha2,3-sialiltransferasa, en donde el polipéptido de la sialiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 66% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 10, sobre una región de al menos 60 aminoácidos de longitud;
- g)
- un polipéptido que tiene la actividad de la ácido siálico sintasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- h)
- un polipéptido que tiene actividad para la biosíntesis del ácido siálico, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 8021-9076 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- i)
- un polipéptido que tiene actividad para el ácido siálico-CMP sintetasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9076-9738 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1;
- j)
- un polipéptido que tiene actividad de la acetiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9729-10559 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y
- k)
- un polipéptido que tiene la actividad de la glicosiltransferasa, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 65% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por medio de un complemento inverso de los nucleótidos 10557-11366 del locus para la biosíntesis del LOS de la cepa OH4384 de C. jejouni como se muestra en la SEQ ID NO: 1.
14. El polipéptido aislado o producido en forma
recombinante de la reivindicación 13, en donde el polipéptido es
producido en forma recombinante y al menos parcialmente
purificado.
15. El polipéptido aislado o producido en forma
recombinante de la reivindicación 13, en donde el polipéptido se
expresa por medio de una célula huésped heteróloga.
16. El polipéptido aislado o producido en forma
recombinante de la reivindicación 15, en donde la célula huésped es
E. coli.
17. El polipéptido aislado o producido en forma
recombinante de la reivindicación 13, en donde el polipéptido es un
polipéptido del serotipo O:2 de C. jejuni.
18. El polipéptido aislado o producido en forma
recombinante de la reivindicación 13, en donde el polipéptido es un
polipéptido de la sialiltransferasa de acuerdo a g) y el polipéptido
se selecciona del grupo que consiste de:
- un polipéptido que tiene tanto actividad de \alpha2,3 sialiltransferasa como actividad de \alpha2,8 sialiltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una sialiltransferasa cstII codificada por ORF 7a del locus para la biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. Jejuni como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; un polipéptido que tiene una actividad de \alpha2,3 sialiltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una sialiltransferasa cstII del serotipo O:10 de C. jejuni como la expuesta en la SEQ ID NO: 5;
- un polipéptido que tiene actividad de \alpha2,3 sialiltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una sialiltransferasa cstII del serotipo O:41 de C. Jejuni como la expuesta en la SEQ ID NO: 7; y
- un polipéptido que tiene actividad de \alpha2,3 sialiltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una sialiltransferasa cstII del serotipo O:2 de C. Jejuni como la expuesta en la SEQ ID NO: 10.
19. El polipéptido aislado o producido en forma
recombinante de la sialiltransferasa de la reivindicación 18, en
donde el polipéptido de la sialiltransferasa tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 3,
la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, y la SEQ ID NO: 10.
20. El polipéptido de la reivindicación 13, en
donde:
- a)
- el polipéptido de la sialiltransferasa de f) tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, o la SEQ ID NO: 10;
- b)
- el polipéptido de la \beta1,4-GalNAc transferasa de d) tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13; y
- c)
- el polipéptido de la \beta1,3-galactosiltransferasa de e) tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17.
21. Una mezcla de reacción para la síntesis de
un oligosacárido sialilado, la mezcla de reacción comprendiendo un
péptido de la sialiltransferasa que tiene una secuencia de
aminoácidos que es aproximadamente al menos 75% idéntica a una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3 sobre
una región de aproximadamente al menos 50 aminoácidos de longitud,
el polipéptido de la sialiltransferasa teniendo tanto actividad de
la \alpha2,3 sialiltransferasa como actividad de la \alpha2,8
sialiltransferasa; una fracción aceptora galactosilada; y un azúcar
sialil-nucleó-
tido
tido
en donde la sialiltransferasa transfiere un
primer residuo de ácido siálico desde el azúcar
sialil-nucleótido hasta la fracción aceptora
galactosilada en un enlace \alpha2,3, y además transfiere un
segundo residuo de ácido siálico hasta el primer residuo de ácido
siálico en un enlace \alpha2,8.
22. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el azúcar sialil-nucleótido es ácido
siálico-CMP.
23. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el polipéptido de la sialiltransferasa tiene una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.
24. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el aceptor galactosilado comprende a un compuesto que
tiene la fórmula Gal\beta1,4-R o
Gal\beta1,3-R, en donde R se selecciona del grupo
que consiste de H, un sacárido, un oligosacárido, o un grupo aglicón
que tiene al menos un átomo de carbohidrato.
25. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el aceptor galactosilado se une a una proteína,
lípido, o proteoglicano.
26. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el oligosacárido sialilado es un gangliósido, una
imitación de gangliósido, o una porción carbohidrato de un
gangliósido.
27. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el oligosacárido sialilado es un lisogangliósido, una
imitación de lisogangliósido, o una porción carbohidrato de un
lisogangliósido.
28. La mezcla de reacción de la reivindicación
26, en donde la fracción aceptora galactosilada comprende un
compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste
de Gal4Glc-R^{1} y
Gal3GalNAc-R^{2}, en donde R^{1} se selecciona
del grupo que consiste de ceramida o de otro glicolípido, y R^{2}
se selecciona del grupo que consiste de Gal4GlcCer,
(Neu5Ac3)Gal4GlcCer, y (Neu5Ac8Neu5Ac3)Gal4GlcCer.
29. La mezcla de reacción de la reivindicación
28, en donde el aceptor galactosilado se selecciona del grupo que
consiste de Gal4GlcCer,
Gal3GalNAc4(Neu5Ac3)Gal4GlcCer, y
Gal3GalNAc4(Neu5Ac8Neu5Ac3)Gal4GlcCer.
30. La mezcla de reacción de la reivindicación
21, en donde el aceptor galactosilado se forma poniendo en contacto
un aceptor sacárido con UDP-Gal y un polipéptido de
la galactosil transferasa, en donde el polipéptido de la
galactosiltransferasa transfiere el residuo Gal desde el
UDP-Gal hasta el aceptor.
31. La mezcla de reacción de la reivindicación
30, en donde el polipéptido de la galactosiltransferasa tiene
actividad de \beta1,3-galactosiltransferasa y
tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a
una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o
en la SEQ ID NO: 17 sobre una región de al menos 50 aminoácidos de
longitud.
32. La mezcla de reacción de la reivindicación
31, en donde la galactosiltransferasa tiene una secuencia de
aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 15 o en la SEQ ID NO:
17.
33. La mezcla de reacción de la reivindicación
30, en donde el sacárido aceptor comprende un residuo GalNAc
terminal.
34. La mezcla de reacción de la reivindicación
33, en donde el sacárido aceptor para la galacitosiltransferasa se
forma poniendo en contacto un aceptor para una GalNAc transferasa
con UDP-GalNAc y un polipéptido de GalNAc
transferasa, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa
transfiere el residuo GalNAc desde el UDP-GalNAc
hasta el aceptor para la GalNAc transferasa.
35. La mezcla de reacción de la reivindicación
34, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene actividad
de \beta1,4-GalNAc transferasa y tiene una
secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13 sobre
una región de al menos 50 aminoácidos de longitud.
36. La mezcla de reacción de la reivindicación
28, en donde el polipéptido de la GalNAc transferasa tiene una
secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 13.
Un método para sintetizar un oligosacárido
sialilado, el método comprendiendo la incubación bajo condiciones
estables de una mezcla de reacción que comprende un polipéptido de
la sialiltransferasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es
al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la
expuesta en la SEQ ID NO: 3 sobre una región de al menos 50
aminoácidos de longitud, teniendo el polipéptido de la
sialiltransferasa tanto actividad de la \alpha2,3
sialiltransferasa como actividad de la \alpha2,8
sialiltransferasa, una fracción aceptora galactosilada; y un azúcar
sialil-nucleótido, en donde el polipéptido de la
sialiltransferasa transfiere un primer residuo de ácido siálico
desde el azúcar sialil-nucleótido hasta la fracción
aceptora galactosilada en un enlace \alpha2,3, y además transfiere
un segundo residuo de ácido siálico hasta el primer residuo de ácido
siálico en un enlace \alpha2,8.
37. El método de la reivindicación 37, en donde
el oligosacárido sialilado es un gangliósido.
38. El método de la reivindicación 38, en donde
el polipéptido de la sialiltransferasa tiene una secuencia de
aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.
39. El método de la reivindicación 37, en donde
el oligosacárido sialilado es un gangliósido, un lisogangliósido,
una imitación de gangliósido, o una imitación de
lisogangliósido.
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