ES2308364T3

ES2308364T3 - Glicosiltransferasas de campylobacter para la biosintesis de gangliosidos y mimeticos de gangliosido.

Info

Publication number: ES2308364T3
Application number: ES05025316T
Authority: ES
Inventors: Michel Gilbert; Warren W. Wakarchuk
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2020-02-01
Also published as: ATE329036T1; AU2274300A; JP4398502B2; EP1652927B1; AU2004203474A1; DE60028541D1; EP1652927A2; AU2004203474B2; EP1147200B1; JP4397955B2; JP2002535992A; JP2008259516A; WO2000046379A1; ATE395415T1; ES2269098T3; US6503744B1; WO2000046379A8; PT1147200E; AU2004203474B9; DE60038917D1

Abstract

Método para producir un oligosacárido que comprende un residuo de galactosa, comprendiendo el método poner en contacto un sacárido aceptor con una UDP-galactosa y un polipéptido de Beta-1,3-galactosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 75% a SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud, en el que el polipéptido de Beta-1,3-galactosiltransferasa transfiere el residuo de galactosa desde la UDP-galactosa hasta el sacárido aceptor para formar el oligosacárido que comprende un residuo de galactosa.

Description

Glicosiltransferasas de Campylobacter para la biosíntesis de gangliósidos y miméticos de gangliósido.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención pertenece al campo de la síntesis enzimática de oligosacáridos, incluyendo gangliósidos y miméticos de gangliósido.

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Antecedentes

Los gangliósidos son una clase de glicolípidos, que se encuentran a menudo en las membranas celulares, que consisten en tres elementos. Uno o más residuos de ácido siálico están unidos a un resto central de hidrato de carbono u oligosacárido, que a su vez está unido a una estructura lipídica hidrófoba (ceramida) que generalmente está incrustada en la membrana celular. El resto de ceramida incluye una parte de base de cadena larga (LCB, long chain base) y una parte de ácido graso (AG). Los gangliósidos, así como otros glicolípidos y sus estructuras en general, se tratan en, por ejemplo, Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, 1981) págs. 287-295 y Devlin, Textbook of Biochemistry (Wiley-Liss, 1992). Los gangliósidos se clasifican según el número de monosacáridos en el resto de hidrato de carbono, así como el número y la ubicación de los grupos ácido siálico presentes en el resto de hidrato de carbono. Los monosialogangliósidos se denominan "GM", los disialogangliósidos se denominan "GD", los trisialogangliósidos "GT" y los tetrasialogangliósidos se denominan "GQ". Los gangliósidos pueden clasificarse además dependiendo de la posición o las posiciones del residuo o los residuos de ácido siálico unidos. Otra clasificación se basa en el número de sacáridos presentes en el núcleo de oligosacárido, denominando el subíndice "1" un gangliósido que tienen cuatro residuos de sacárido (Gal-GalNAc-Gal-Glc-ceramida), y representando los subíndices "2", "3" y "4" gangliósidos trisacarídicos (Gal-NAc-Gal-Glc-ceramida), disacarídicos (Gal-Glc-ceramida) y monosacarídicos (Gal-ceramida), respectivamente.

La mayor abundancia de gangliósidos se encuentra en el cerebro, particularmente en las terminaciones nerviosas. Se cree que están presentes en sitios receptores para neurotransmisores, incluyendo acetilcolina, y también pueden actuar como receptores específicos para otras macromoléculas biológicas, incluyendo interferón, hormonas, virus, toxinas bacterianas y similares. Los gangliósidos se han usado para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso, incluyendo accidentes cerebrovasculares isquémicos. Véase, por ejemplo, Mahadnik et al. (1988) Drug Development Res. 15: 337-360; patentes estadounidenses números 4.710.490 y 4.347.244; Horowitz (1988) Adv. Exp. Med. and Biol. 174: 593-600; Karpiatz et al. (1984) Adv. Exp. Med. and Biol. 174: 489-497. Ciertos gangliósidos se encuentran en la superficie de las células hematopoyéticas humanas (Hildebrand et al. (1972) Biochim. Biophys. Acta 260: 272-278; Macher et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 1968-1974; Dacremont et al. Biochim. Biophys. Acta 424: 315-322; Klock et al. (1981) Blood Cells 7: 247) que pueden desempeñar un papel en la diferenciación granulocítica terminal de estas células. Nojiri et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 7443-7446. Estos gangliósidos, denominados la serie "neolacto", tienen estructuras oligosacarídicas de núcleo neutras que tienen la fórmula [Gal\beta-(1,4)GlcNAc\beta(1,3)]nGal\beta(1,4)Glc, en la que n = 1-4. Se incluyen entre estos gangliósidos de la serie neolacto 3'-nLM_{1} (NeuAc\alpha(2,3)Ga\beta(1,4)GlcNAc\beta(1,3)Gal\beta(1,4)-Glc\beta(1,1)-ceramida) y 6'-nLM_{1} (Neu-Ac\alpha(2,6)Gal\beta(1,4)GlcNAc\beta(1,3)Gal\beta(1,4)-Glc[3(1,1)-ceramida).

Los "miméticos" de gangliósido están asociados con algunos organismos patógenos. Por ejemplo, se demostró que los oligosacáridos de núcleo de LPS de bajo peso molecular de las cepas O:19 de Campylobacter jejuni muestran mimetismo molecular de gangliósidos. Desde finales de los años 70, se ha reconocido Campylobacter jejuni como una causa importante de gastroenteritis aguda en seres humanos (Skirrow (1977) Brit. Med J. 2: 9-11). Estudios epidemiológicos han demostrado que las infecciones por Campylobacter son más comunes en países desarrollados que las infecciones por Salmonella y son también una causa importante de enfermedades diarreicas en países en desarrollo (Nachamkin et al. (1992) Campylobacter jejuni: Current Status and Future Trends. American Society for Microbiology, Washington, DC.). Además de provocar gastroenteritis aguda, la infección por C. jejuni se ha implicado como un antecedente frecuente en el desarrollo del síndrome de Guillain-Barré, una forma de neuropatía que es la causa más común de parálisis generalizada (Ropper (1992) N. Engl. J. Med 326: 1130-1136). El serotipo de C. jejuni más común asociado con el síndrome de Guillain-Barré es O:19 (Kuroki (1993) Ann. Neurol. 33: 243-247) y esto dio lugar a un estudio detallado de la estructura del lipopolisacárido (LPS) de las cepas que pertenecen a este serotipo (Aspinall et al. (1994a) Infect. Immun. 62: 2122-2125; Aspinall et al. (1994b) Biochemistry 33: 241-249; y Aspinall et al. (1994c) Biochemistry 33: 250-255).

Se han encontrado restos de oligosacárido terminales idénticos a los de los gangliósidos GD1a, GD3, GM1 y GT1a en diversas cepas O:19 de C. jejuni. OH4384 de C. jejuni pertenece al serotipo O:19 y se aisló a partir de un paciente que desarrolló el síndrome de Guillain-Barré tras un ataque de diarrea (Aspinall et al. (1994a), citado anteriormente). Se demostró que tenía un LPS de núcleo externo que imitaba el gangliósido trisialilado GT1a. El mimetismo molecular de las estructuras huésped por la parte sacarídica de un LPS se considera un factor de virulencia de diversos patógenos mucosos que usarían esta estrategia para eludir la respuesta inmunitaria (Moran et al. (1996a) FEMS Immunol. Med Microbiol. 16: 105-115; Moran et al. (1996b) J. Endotoxin Res. 3: 521-531).

En consecuencia, la identificación de los genes implicados en la síntesis de LPS y el estudio de su regulación es de interés considerable para un mejor entendimiento de los mecanismos de patogénesis usados por estas bacterias. Además, el uso de gangliósidos como reactivos terapéuticos, así como el estudio de la función de los gangliósidos, se facilitaría por métodos convenientes y eficaces de síntesis de gangliósidos y miméticos de gangliósido deseados. Se ha descrito un enfoque enzimático y químico combinado a la síntesis de 3'-nLM_{1} y 6'-nLM_{1} (Gaudino y Paulson (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 1149-1150). Sin embargo, los métodos enzimáticos disponibles previamente para la síntesis de gangliósidos tienen dificultades para producir eficazmente enzimas en cantidades suficientes, con un coste suficientemente bajo, para la síntesis práctica de gangliósidos a gran escala. Por tanto, existe la necesidad de nuevas enzimas implicadas en la síntesis de gangliósidos que sean susceptibles de producción a gran escala. Existe también la necesidad de métodos más eficaces para sintetizar gangliósidos. La presente invención satisface estas y otras necesidades. Infection and Immunity, vol. 66, nº 8, agosto de 1998, páginas 3649-3655, describe lipopolisacáridos de cepas O:41 de Campylobacter jejuni asociadas con el síndrome de Guillain-Barré.

Las figuras 1A-1C muestran estructuras de núcleo externo de lipooligosacárido (LOS) de cepas O:19 de C. jejuni. Estas estructuras se describieron por Aspinall et al. (1994) Biochemistry 33, 241-249, y las partes que muestran similitud con la parte de oligosacárido de gangliósidos se delimitan mediante casillas. Figura 1A: El LOS de la cepa serológica O:19 de C. jejuni (nº ATCC 43446) tiene similitud estructural con la parte de oligosacárido del gangliósido GD1a. Figura 1B: El LOS de la cepa O:19 de C. jejuni (OH4384) tiene similitud estructural con la parte de oligosacárido del gangliósido GT1 a. Figura 1C: El LOS de OH4382 de C. jejuni tiene similitud estructural con la parte de oligosacárido del gangliósido GD3.

Las figuras 2A-2B muestran la organización genética del locus cst-I de OH4384 y la comparación de los loci de biosíntesis de LOS de OH4384 y NCTC 11168. La distancia entre las marcas de escala es de 1 kb. La figura 2A muestra una representación esquemática del locus cst-I de OH4384, basado en la secuencia de nucleótidos que está disponible de GenBank (nº AF130466). El gen prfB parcial es algo similar a un factor de liberación de cadena peptídico (GenBank nº AE000537) de Helicobacter pylori, mientras que el gen cysD y el gen cysN parcial son similares a genes de E. coli que codifican para subunidades de sulfato adenililtransferasa (GenBank nº AE000358). La figura 2B muestra una representación esquemática del locus de biosíntesis de LOS de OH4384, que se basa en la secuencia de nucleótidos de GenBank (nº AF130984). La secuencia de nucleótidos del locus de biosíntesis de LOS de OH4382 es idéntica a la de OH4384 excepto por el gen cgtA, que carece de una "A" (véase texto y GenBank nº AF167345). La secuencia del locus de biosíntesis de LOS de NCTC 11168 está disponible del Sanger Centre (URL:http//www.sanger.ac.uk/Projects/C jejuni/). Los genes homólogos correspondientes tienen el mismo número con una marca "a" para los genes de OH4384 y una marca "b" para los genes de NCTC 11168. Un gen único para la cepa OH4384 se muestra en negro y los genes únicos para NCTC 11168 se muestran en gris. Los ORF de OH4384 nº 5a y nº 10a se encuentran como un ORF de fusión en marco (nº 5b/10b) en NCTC 11168 y se designan con un asterisco (*). Las funciones propuestas para cada ORF se encuentran en la tabla 4.

La figura 3 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas para las sialiltransferasas. El gen cst-I de OH4384 (Cst-I, SEQ ID NO: 34, primeros 322 residuos), el gen cst-II de OH4384; (OH4384; SEQ ID NO: 3; idéntico a cst-II de OH4382), el gen cst-II de O:19 (cepa serológica) (O:9; SEQ ID NO: 9 GenBank nº AF167344), el gen cst-II de NCTC 11168 (11168; SEQ ID NO:10) y un ORF supuesto de H. influenzae (Hi_ORF; SEQ ID NO:35 GenBank nº U32720) se alinearon usando el programa de alineación ClustalX (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 4876-82). Se produjo el sombreado mediante el programa GeneDoc (Nicholas, K. B., y Nicholas, H. B. (1997) URL: http://www.cris.com/\simketchup/genedoc.shtml).

La figura 4 muestra un esquema para la síntesis esquemática de miméticos de gangliósido usando glicosiltransferasas de OH4384 de C. jejuni. Partiendo de una molécula aceptora sintética, se sintetizó una serie de miméticos de gangliósido con \alpha-2,3-sialiltransferasa recombinante (Cst-I), \beta-1,4-N-acetilgalactosaminiltransferasa (CgtA), \beta-1,3-galactosiltransferasa (CgtB) y una \alpha-2,3/\alpha-2,8-sialiltransferasa bifuncional (Cst-II) usando las secuencias mostradas. Se analizaron todos los productos mediante espectrometría de masas y las masas monoisotópicas observadas (mostradas entre paréntesis) estaban todas dentro del 0,02% de las masas teóricas. También se analizaron los miméticos de GM3, GD3, GM2 y GM1a mediante espectroscopía de RMN (véase la tabla 4).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona enzimas glicosiltransferasa procariotas y ácidos nucleicos que codifican para las enzimas. En una realización, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas y/o recombinantes que incluyen una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a): un polipéptido que tiene actividad aciltransferasa de biosíntesis de lípido A, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 70% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

b): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 70% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

c): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 50% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud;

d): un polipéptido que tiene actividad \beta-1,4-GalNAc transferasa, en el que el polipéptido de GaINAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 77% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud;

e): un polipéptido que tiene actividad \beta-1,3-galactosiltransferasa, en el que el polipéptido de galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud;

f): un polipéptido que tiene o bien actividad \alpha-2,3 sialiltransferasa o bien tanto actividad \alpha-2,3- como \alpha-2,8 sialiltransferasa, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 66% a lo largo de una región de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una o más de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10;

g): un polipéptido que tiene actividad ácido siálico sintasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 70% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

h): un polipéptido que tiene actividad de biosíntesis de ácido siálico, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 70% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 8021-9076 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

i): un polipéptido que tiene actividad CMP-ácido siálico sintetasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 65% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9076-9738 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

j): un polipéptido que tiene actividad acetiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 65% a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9729-10559 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1; y

k): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 65% a una secuencia de aminoácidos codificada por un complemento inverso de los nucleótidos 10557-11366 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1.

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En realizaciones actualmente preferidas, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que incluye una secuencia polinucleotídica que codifica para uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en: a) un polipéptido de sialiltransferasa que tienen tanto una actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa como una actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa, en el que el polipéptido de sialiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 76% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud; b) un polipéptido de GaINAc transferasa que tiene una actividad \beta-1,4-GalNAc transferasa, en el que el polipéptido de GaINAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; y c) un polipéptido de galactosiltransferasa que tiene actividad \beta-1,3-galactosiltransferasa, en el que el polipéptido de galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 15 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

También se proporcionan mediante la invención casetes de expresión y vectores de expresión en los que un ácido nucleico de glicosiltransferasa de la invención está operativamente ligado a un promotor y otras secuencias de control que facilitan la expresión de las glicosiltransferasas en una célula huésped deseada. También se proporcionan células huésped recombinantes que expresan las glicosiltransferasas de la invención.

La invención también proporciona polipéptidos aislados y/o producidos de manera recombinante seleccionados del grupo que consiste en:

d): un polipéptido que tiene actividad \beta-1,4-GalNAc transferasa, en el que el polipéptido de GalNAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 77% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud;

f): un polipéptido que tiene o bien actividad \alpha-2,3 sialiltransferasa o bien ambas actividades \alpha-2,3 y \alpha-2,8 sialiltransferasa, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 66% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud;

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En realizaciones preferidas en el presente documento, la invención proporciona polipéptidos de glicosiltransferasa que incluyen: a) un polipéptido de sialiltransferasa que tienen tanto una actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa como una actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa, en el que el polipéptido de sialiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 76% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud; b) un polipéptido de GaINAc transferasa que tiene una actividad \beta-1,4-GaINAc transferasa, en el que el polipéptido de GaINAc transferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; y c) un polipéptido de galactosiltransferasa que tiene actividad \beta-1,3-galactosiltransferasa, en el que el polipéptido de galactosiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

La invención proporciona también mezclas de reacción para la síntesis de un oligosacárido sialilado. Las mezclas de reacción incluyen un polipéptido de sialiltransferasa que tienen tanto una actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa como una actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa. También están presentes en las mezclas de reacción un resto aceptor galactosilado y un azúcar de sialil-nucleótido. La sialiltransferasa transfiere un primer residuo de ácido siálico desde el azúcar de sialil-nucleótido (por ejemplo, CMP-ácido siálico) hasta el resto aceptor galactosilado en un enlace \alpha-2,3, y añade además un segundo residuo de ácido siálico al primer residuo de ácido siálico en un enlace \alpha-2,8.

En otra realización, la invención proporciona métodos para sintetizar un oligosacárido sialilado. Estos métodos implican incubar una mezcla de reacción que incluye un polipéptido de sialiltransferasa que tiene tanto una actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa como una actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa, un resto aceptor galactosilado y un azúcar de sialil-nucleótido, en condiciones adecuadas en las que el polipéptido de sialiltransferasa transfiere un primer residuo de ácido siálico desde el azúcar de sialil-nucleótido hasta el resto aceptor galactosilado en un enlace \alpha-2,3, y transfiere además un segundo residuo de ácido siálico al primer residuo de ácido siálico en un enlace \alpha-2,8.

Descripción detallada Definiciones

Las glicosiltransferasas, las mezclas de reacción y los métodos de la invención son útiles para transferir un monosacárido desde un sustrato donador hasta una molécula aceptora. La adición tiene lugar generalmente en el extremo no reductor de un resto de hidrato de carbono u oligosacárido en una biomolécula. Las biomoléculas tal como se definen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, moléculas biológicamente significativas tales como hidratos de carbono, proteínas (por ejemplo, glicoproteínas) y lípidos (por ejemplo, glicolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y gangliósidos).

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Las siguientes abreviaturas se usan en el presente documento:

Ara: = arabinosilo;

Fru: = fructosilo;

Fuc: = fucosilo;

Gal: = galactosilo;

GalNAc: = N-acetilgalactosaminilo;

Glc: = glucosilo;

GlcNAc: = N-acetilglucosaminilo;

Man: = manosilo; y

NeuAc: = sialil(N-acetilneuraminilo).

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La expresión "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es el ácido N-acetilneuramínico (2-ceto-5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico (abreviado a menudo como Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc o NeuGc), en el que el grupo N-acetilo de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819). También se incluyen los ácidos siálicos 9-sustituidos tales como un 9-O-C_{1}-C_{6}-acil-Neu5Ac como 9-O-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico, véase, por ejemplo, Varki (1992) Glycobiology 2: 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nueva York (1992); Schauer, Methods in Enzymology, 50: 64-89 (1987), y Schaur, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 40: 131-234. La síntesis y el uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se dan a conocer en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992.

Los sustratos donadores para glicosiltransferasas son azúcares de nucleótido activados. Tales azúcares activados consisten generalmente en difosfatos de uridina y guanosina, y derivados de monofosfato de citidina de los azúcares en los que el monofosfato o difosfato de nucleósido sirve como grupo saliente. Los sistemas bacterianos, vegetales y fúngicos pueden usar en ocasiones otros azúcares de nucleótido activados.

Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea el sacárido en el extremo reductor de hecho un azúcar reductor o no. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se ilustran en el presente documento con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha.

Todos los oligosacáridos descritos en el presente documento se describen con el nombre o la abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo, Gal), seguido por la configuración del enlace glicosídico (\alpha o \beta), el enlace de anillo, la posición en el anillo del sacárido reductor implicado en el enlace y entonces el nombre o la abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlcNAc). El enlace entre dos azúcares puede expresarse, por ejemplo, como 2,3, 2\rightarrow3 o (2,3). Cada sacárido es una piranosa o furanosa.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en o bien una forma monocatenaria o bien bicatenaria, y a menos que se limite de otra manera, abarca los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de manera similar a nucleótidos que se producen de manera natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácidos nucleicos particular incluye la secuencia complementaria de la misma.

La expresión "ligado operativamente" se refiere un ligamiento funcional entre un secuencia de control de la expresión de ácidos nucleicos (tal como un promotor, una secuencia señal o una red de sitios de unión a factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en la que la secuencia de control de la expresión afecta a la transcripción y/o traducción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Un "polinucleótido heterólogo" o un "ácido nucleico heterólogo", tal como se usan en el presente documento, es una que se origina de una fuente distinta a la célula huésped particular, o, si es de la misma fuente, está modificada con respecto a su forma original. Por tanto, un gen de glicosiltransferasa heterólogo en una célula huésped incluye un gen de glicosiltransferasa que es endógeno a la célula huésped particular pero se ha modificado. La modificación de la secuencia heteróloga puede producirse, por ejemplo, tratando el ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que puede ligarse operativamente a un promotor. Técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio son también útiles para modificar una secuencia heteróloga.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia a una célula indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o una proteína codificado por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también incluyen aquellas que contienen genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, pero se modifican y vuelven a introducirse en la célula por medios artificiales. El término también abarca células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado sin extraer el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen las obtenidas mediante sustitución génica, mutación de sitio específico y técnicas relacionadas conocidas por los expertos en la técnica.

Un "ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico que está en una forma que está alterada con respecto a su estado natural. Por ejemplo, la expresión "ácido nucleico recombinante" incluye una región codificante que está ligada operativamente a un promotor y/u otra región de control de la expresión, señal de procesamiento, otra región codificante y similares, a los que el ácido nucleico no está ligado en su forma que se produce de manera natural. Un "ácido nucleico recombinante" incluye también, por ejemplo, una región codificante u otro ácido nucleico en el que uno o más nucleótidos se han sustituido, delecionado, insertado, en comparación con el correspondiente ácido nucleico que se produce de manera natural. Las modificaciones incluyen las introducidas mediante manipulación in vitro, modificación in vivo, métodos de síntesis y similares.

Un "polipéptido producido de manera recombinante" es un polipéptido que se codifica por un ácido nucleico recombinante y/o heterólogo. Por ejemplo, un polipéptido que se expresa a partir de un ácido nucleico que codifica para glicosiltransferasa de C. jejuni que se introduce en E. coli es un "polipéptido producido de manera recombinante". Una proteína expresada a partir de un ácido nucleico que está ligado operativamente a un promotor no nativo es un ejemplo de un "polipéptido producido de manera recombinante". Los polipéptidos producidos de manera recombinante de la invención pueden usarse para sintetizar gangliósidos y otros oligosacáridos en su forma no purificada (por ejemplo, como lisado celular o célula intacta) o tras purificarse completa o parcialmente.

Un "casete de expresión recombinante" o simplemente un "casete de expresión" es un constructo de ácido nucleico, generado de manera recombinante o sintética, con elementos de ácido nucleico que pueden afectar a la expresión de un gen estructural en huéspedes compatibles con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos promotores y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. Normalmente, el casete de expresión recombinante incluye un ácido nucleico que va a transcribirse (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido deseado) y un promotor. También pueden usarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un casete de expresión puede incluir también secuencias de nucleótidos que codifican para una secuencia señal que dirige la secreción de una proteína expresada a partir de la célula huésped. Las señales de terminación de la transcripción, los potenciadores y otras secuencias de ácido nucleico que influyen en la expresión génica pueden incluirse también en un casete de expresión.

Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprende una parte de una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos más larga (por ejemplo, polipéptido) respectivamente.

El término "aislado" pretende hacer referencia al material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que acompañan normalmente al material tal como se encuentra en su estado nativo. Normalmente, los ácidos nucleicos o proteínas aislados de la invención son al menos puros en aproximadamente un 80%, habitualmente al menos puros en aproximadamente un 90% y preferiblemente al menos en aproximadamente un 95%. La pureza u homogeneidad puede indicarse mediante varios medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa de una muestra de ácido nucleico o proteína, seguido por la visualización tras tinción. Para ciertos fines se necesitará alta resolución y se utilizará HPLC o un medio similar para la purificación. Una enzima "aislada", por ejemplo, es una que está sustancial o esencialmente libre de componentes que interfieren con la actividad de la enzima. Un "ácido nucleico aislado" incluye, por ejemplo, uno que no esté presente en el cromosoma de la célula en la que se produce el ácido nucleico de manera natural.

Los términos "idéntico" o "identidad" en porcentaje, en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas o de ácidos nucleicos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.

La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos una identidad del 60%, preferiblemente del 80%, lo más preferiblemente del 90-95% de residuos de aminoácido o nucleótido, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial existe a lo largo de una región de las secuencias que es al menos aproximadamente de 50 residuos de longitud, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 residuos y lo más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 residuos. En una realización preferida de la mayor manera, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de las regiones codificantes.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces la identidad de secuencia en porcentaje para la(s) secuencia(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (véase en general, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1995 suplemento) (Ausubel)).

Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar la identidad de secuencia en porcentaje y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. Un software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Por ejemplo, las comparaciones pueden realizarse usando un algoritmo BLASTN versión 2.0 con una longitud de palabra (W) de 11, G=5, E=2, q= -2 y r = 1, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, puede usarse el algoritmo BLASTP versión 2.0, con los valores por defecto de longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1 y una matriz de sustitución BLOSUM62. (Véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Además de calcular la identidad de secuencia en porcentaje, el algoritmo BLAST puede realizar también un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se produciría al azar una correspondencia entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

La frase "que se hibrida específicamente con", se refiere a la unión, duplexación o hibridación de una molécula sólo con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en un ARN o ADN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total). La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridarán específicamente a mayores temperaturas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm.) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la que el 50% de las sondas complementarias a la secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio. (Dado que las secuencias diana están presentes generalmente en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración salina es inferior a aproximadamente 1,0 M de iones Na, normalmente una concentración de aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de iones Na (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente de 30ºC para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente de 60ºC para las sondas largas (por ejemplo, mayores que 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.

Otra indicación de que dos polipéptidos o secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente de manera cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe más adelante. Por tanto, un polipéptido es de manera normal sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibriden entre sí en condiciones rigurosas, tal como se describe más adelante.

Las frases "se une específicamente a una proteína" o "inmunorreactivo específicamente con", cuando se refieren a un anticuerpo se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Por tanto, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen preferentemente a una proteína particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a una proteína en tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos inmunorreactivos específicamente con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan de manera rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos específicamente con una proteína. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de condiciones y formatos de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.

Las "variaciones modificadas de manera conservativa" de una secuencia de polinucleótidos particular se refiere a aquellos polinucleótidos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el polinucleótido no codifica para una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican para cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG codifican todos para el aminoácido arginina. Por tanto, en cada posición en la que se especifique una arginina mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de "variaciones modificadas de manera conservativa". Cada secuencia polinucleotídica descrita en el presente documento que codifica para un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible, excepto cuando se indique lo contrario. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el único codón para metionina) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas convencionales. En consecuencia, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Además, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos del 5%, de manera más normal menos del 1%) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de manera conservativa" cuando las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. Un experto apreciará que muchas variaciones conservativas de las proteínas de fusión y los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de fusión dan esencialmente productos idénticos. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, las sustituciones de una secuencia de ácido nucleico que no da como resultado una alteración en un polipéptido codificado) son una características implícita de cada secuencia de ácido nucleico que codifica para un aminoácido. Tal como se describe en el presente documento, las secuencias se optimizan preferiblemente para su expresión en una célula huésped particular usada para producir las enzimas (por ejemplo, de levaduras, humana y similar). De manera similar, las "sustituciones de aminoácidos conservativas", en uno o unos pocos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos se sustituyen por diferentes aminoácidos con propiedades sumamente similares (véase, la sección de definiciones, citada anteriormente), también pueden identificarse fácilmente como sumamente similares a una secuencia de aminoácidos particular o a una secuencia de ácido nucleico particular que codifica para un aminoácido. Tales variaciones sustituidas de manera conservativa de cualquier secuencia particular son una característica de la presente invención. Véase también Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Además, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son también "variaciones modificadas de manera conservativa".

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Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención proporciona enzimas glicosiltransferasa novedosas, así como otras enzimas que están implicadas en la síntesis de oligosacáridos catalizada por enzimas. Las glicosiltransferasas de la invención incluyen sialiltransferasas, incluyendo una sialiltransferasa bifuncional que tiene actividad sialiltransferasa tanto \alpha,2,3 y como \alpha2,8. También se \beta1,3-galactosiltransferasas, \beta1,4-GalNAc transferasas, ácido siálico sintasas, CMP-ácido siálico sintetasas, acetiltransferasas y otras glicosiltransferasas. Las enzimas de la invención son enzimas procariotas, incluyen las implicadas en la biosíntesis de lipooligosacáridos (LOS) en diversas cepas de Campylobacter jejuni. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican para estas enzimas, así como casetes de expresión y vectores de expresión para su uso en la expresión de glicosiltransferasas. En realizaciones adicionales, la invención proporciona métodos y mezclas de reacción en los que se usa una o más de las enzimas para sintetizar un oligosacárido.

Las glicosiltransferasas de la invención son útiles para varios fines. Por ejemplo, las glicosiltransferasas son útiles como herramientas para las síntesis quimioenzimáticas de oligosacáridos, incluyendo gangliósidos y otros oligosacáridos que tienen actividad biológica. Las glicosiltransferasas de la invención y los ácidos nucleicos que codifican para las glicosiltransferasas, también son útiles para estudios de los mecanismos de patogénesis de organismos que sintetizan miméticos de gangliósido, tales como C. jejuni. Los ácidos nucleicos pueden usarse como sondas, por ejemplo, para estudiar la expresión de los genes implicados en la síntesis de miméticos de gangliósido. Los anticuerpos producidos contra las glicosiltransferasas también son útiles para analizar los patrones de expresión de estos genes que están implicados en la patogénesis. Los ácidos nucleicos también son útiles para diseñar oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión de las enzimas de Campylobacter que están implicadas en la biosíntesis de miméticos de gangliósido que pueden enmascarar los patógenos del sistema inmunitario del huésped.

Las glicosiltransferasas de la invención proporcionan varias ventajas sobre las glicosiltransferasas disponibles anteriormente. Las glicosiltransferasas bacterianes tales como las de la invención pueden catalizar la formación de oligosacáridos que son idénticos a las estructuras de mamíferos correspondientes. Además, las enzimas bacterianas son más fáciles y menos costosas de producir en cantidad, en comparación con glicosiltransferasas de mamíferos. Por tanto, las glicosiltransferasas tales como las de la presente invención son sustitutos atractivos para las glicosiltransferasas de mamíferos, que pueden ser difíciles de obtener en grandes cantidades. Que las glicosiltransferasas de la invención sean de origen bacteriano facilita la expresión de grandes cantidades de las enzimas usando sistemas de expresión procariotas relativamente económicos. Normalmente, los sistemas procariotas para la expresión de productos polipeptídicos implica un coste mucho más bajo que la expresión de los polipéptidos en sistemas de cultivo de células de mamíferos.

Además, las sialiltransferasas bifuncionales novedosas de la invención simplifican la síntesis enzimática de moléculas biológicamente importantes, tales como gangliósidos, que tienen un ácido siálico unido por un enlace \alpha2,8 a un segundo ácido siálico, que a su vez está unido en \alpha2,3 a un aceptor galatosilado. Mientras que los métodos previos para sintetizar estas estructuras requerían dos sialiltransferasas separadas, sólo se requiere una sialiltransferasa cuando se usa la sialiltransferasa bifuncional de la presente invención. Esto evita los costes asociados con la obtención de una segunda enzima y también puede reducir el número de etapas implicadas en la síntesis de estos compuestos.

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A. Glicosiltransferasas y enzimas asociadas

La presente invención proporciona polipéptidos de glicosiltransferasa procariotas, así como otras enzimas que están implicadas en la síntesis de oligosacáridos catalizada por glicotransferasas, incluyendo gangliósidos y miméticos de gangliósido. En realizaciones preferidas en el presente documento, los polipéptidos incluyen aquellos que están codificados por marcos de lectura abiertos dentro del locus del lipooligosacárido (LOS) de especies de Campylobacter (figura 1). Se incluyen entre las enzimas de la invención glicosiltransferasas, tales como sialiltransferasas (incluyendo una sialiltransferasa bifuncional), \beta1,4-GalNAc transferasas y \beta1,3-galactosiltransferasas, entre otras enzimas tal como se describe en el presente documento. También se proporcionan enzimas accesorias tales como, por ejemplo, CMP-ácido siálico sintetasa, ácido siálico sintasa, acetiltransferasa y aciltransferasa que está implicada en la biosíntesis del lípido A, y una enzima implicada en la biosíntesis de ácido siálico.

Las glicosiltransferasas y polipéptidos accesorios de la invención pueden purificarse de fuentes naturales, por ejemplo procariotas tales como especies de Campylobacter. En realizaciones preferidas en el presente documento, las glicosiltransferasas se obtienen de C. jejuni, en particular de C. jejuni serotipo O:19, incluyendo las cepas OH4384 y OH4382. También se proporcionan glicosiltransferasas y enzimas accesorias obtenidas de los serotipos O:10, O:41 y O:2 de C.jejuni. Los métodos mediante los que pueden purificarse los polipéptidos de glicosiltransferasa incluyen métodos de purificación de proteínas que incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)).

En realizaciones preferidas en el presente documento, las glicosiltransferasas y los polipéptidos de enzimas accesorias de la invención se obtienen mediante expresión recombinante usando los ácidos nucleicos que codifican para las glicosiltransferasas y enzimas accesorias descritas en el presente documento. Se describen en detalle a continuación vectores de expresión y métodos para producir las glicosiltransferasas.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de glicosiltransferasas se aíslan a partir de su medio natural, ya se produzcan de manera recombinante o se purifiquen a partir de sus células naturales. Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 al 95% de homogeneidad para algunas aplicaciones, y lo más preferido es del 98 al 99% o más de homogeneidad. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden usarse entonces (por ejemplo, como inmunógenos para la producción de anticuerpos o para la síntesis de oligosacáridos, u otros usos tal como se describe en el presente documento o evidentes para los expertos en la técnica). Sin embargo, las glicosiltransferasas no necesitan estar incluso parcialmente purificadas para su uso para sintetizar una estructura de sacárido deseada. Por ejemplo, la invención proporciona enzimas producidas de manera recombinante que se expresan en una célula huésped heteróloga y/o a partir de un ácido nucleico recombinante. Tales enzimas de la invención pueden usarse cuando están presentes en un lisado celular o una célula intacta, así como en forma purificada.

1. Sialiltransferasas

En algunas realizaciones, la invención proporciona polipéptidos de sialiltransferasas. Las sialiltransferasas tienen una actividad \alpha2,3-sialiltransferasa, y en algunos casos tienen también una actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa. Estas sialiltransferasas bifuncionales, cuando se ponen en una mezcla de reacción con un aceptor de sacárido adecuado (por ejemplo, un sacárido que tiene una galactosa terminal) y un donador de ácido siálico (por ejemplo, CMP-ácido siálico), pueden catalizar la transferencia de un primer ácido siálico desde el donador hasta el aceptor en un enlace \alpha2,3. La sialiltransferasa cataliza entonces la transferencia de un segundo ácido siálico desde un donador de ácido siálico hasta el primer residuo de ácido siálico en un enlace \alpha2,8. Este tipo de estructura Sia\alpha2,8-Sia\alpha2,3-Gal se encuentra a menudo en gangliósidos, incluyendo GD3 y GT1a tal como se muestra en la figura 4.

Ejemplos de sialiltransferasas bifuncionales de la invención son aquellas que se encuentran en especies de Campylobacter, tales como C. jejuni. Una sialiltransferasa bifuncional preferida en el presente documento de la invención es la de C. jejuni serotipo O:19. Un ejemplo de una sialiltransferasa bifuncional es la de la cepa OH 4384 de C. jejuni; esta sialiltransferasa tiene un secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 3. Otras sialiltransferasas bifuncionales de la invención tienen generalmente una secuencia de aminoácidos que es al menos el 76% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la sialiltransferasa bifuncional de C.jejuni OH4384 a lo largo de una región de al menos 60 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, las sialiltransferasas de la invención son al menos idénticas en aproximadamente un 85% a la secuencia de aminoácidos de la sialiltransferasa de OH4384, y todavía más preferiblemente al menos idénticas en un 95% de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, a lo largo de una región de al menos 60 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 60 aminoácidos. Por ejemplo, en realizaciones más preferidas, la región de similitud se extiende a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente una región de al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la sialiltransferasa. En consecuencia, las sialiltransferasas bifuncionales de la invención incluyen polipéptidos que tienen cualquiera o tanto actividad \alpha2,3 como \alpha2,8 sialiltransferasa y son al menos idénticas en aproximadamente un 65%, más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 80%, y lo más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 90% a la secuencia de aminoácidos de la sialiltransferasa CstII de C. jejuni OH 4384 (SEQ ID NO: 3) a lo largo de una región del polipéptido que se requiere para conservar las respectivas actividades sialiltransferasa. En algunas realizaciones, las sialiltransferasas bifuncionales de la invención son idénticas a la sialiltransferasa CstII de C. jejuni OH 4384 a lo largo de la longitud total de la sialiltransferasa.

La invención también proporciona sialiltransferasas que tienen actividad \alpha2,3 sialiltransferasa, pero poca o nada de actividad \alpha2,8 sialiltransferasa. Por ejemplo, la sialiltransferasa CstII de la cepa serológica O:19 de C. jejuni (SEQ ID NO: 9) difiere de la cepa OH 4384 en ocho aminoácidos, pero no obstante carece sustancialmente de actividad \alpha2,8 sialiltransferasa (figura 3). La sialiltransferasa correspondiente de la cepa NCTC 11168 de serotipo O:2 (SEQ ID NO: 10) es idéntica en un 52% a la de OH4384, y también tiene poca o nada de actividad \alpha2,8-sialiltransferasa. También se proporcionan sialiltransferasas que son sustancialmente idénticas a la sialiltransferasa CstII de la cepa O:10 (SEQ ID NO: 5) y O:41 (SEQ ID NO: 7) de C. jejuni. Las sialiltransferasas de la invención incluyen aquellas que son al menos idénticas en aproximadamente un 65%, más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 80% y lo más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 90% a las secuencias de aminoácidos de la cepa serológica O:10 (SEQ ID NO: 5), O:41 (SEQ ID NO: 7), O:19 (SEQ ID NO: 9), o la cepa NCTC 11168 serotipo O:2 (SEQ ID NO: 10) de C. jejuni. Las sialiltransferasas de la invención, en algunas realizaciones, tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la de las cepas serológicas O:10, O:41, O:19 o cepas NCTC 11168 de C. jejuni.

Las identidades en porcentaje pueden determinarse mediante inspección, por ejemplo, o pueden determinarse usando un algoritmo de alineación tal como el algoritmo BLASTP versión 2.0 usando los parámetros por defecto, tales como una longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1, y una matriz de sustitución BLOSUM62.

Las sialiltransferasas de la invención pueden identificarse no sólo mediante comparación de secuencias, sino también preparando anticuerpos contra la sialiltransferasa bifuncional de C. jejuni OH4384, u otras sialiltransferasas proporcionadas en el presente documento, y determinando si los anticuerpos son específicamente inmunoreactivos con una sialiltransferasa de interés. Para obtener una sialiltransferasa bifuncional en particular, se puede identificar un organismo que es probable que produzca una sialiltransferasa bifuncional determinando si el organismo presenta enlaces de ácido siálico tanto \alpha2,3 como \alpha2,8 sobre sus superficies celulares. Alternativamente o además, se pueden realizar simplemente ensayos enzimáticos de una sialiltransferasa aislada para determinar si están presentes ambas actividades sialiltransferasa.

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2.\beta1,4-GalNAc transferasa

La invención también proporciona polipéptidos de \beta1,4-GalNAc transferasa (por ejemplo, CgtA). Las \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención, cuando se ponen en una mezcla de reacción, catalizan la transferencia de un residuo de GalNAc desde un donador (por ejemplo, UDPGalNAc) hasta un sacárido aceptor adecuado (normalmente un sacárido que tiene un residuo de galactosa terminal). La estructura resultante, GalNAc\beta1,4-Gal-, se encuentra a menudo en gangliósidos y otros esfingoides, entre muchos otros compuestos de sacárido. Por ejemplo, la transferasa CgtA puede catalizar la conversión del gangliósido GM3 en GM2 (figura 4).

Ejemplos de las \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención son aquellas que se producen por especies de Campylobacter, tales como C. jejuni. Un ejemplo de un polipéptido de \beta-1,4-GalNAc-transferasa es el de la cepa OH4384 de C. jejuni, que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 13. Las \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención incluyen generalmente una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, las \beta1,4-GaINAc transferasas de la invención son al menos idénticas en aproximadamente un 85% a esta secuencia de aminoácidos, y todavía más preferiblemente son al menos idénticas en aproximadamente un 95% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, a lo largo de una región de 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de la identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 aminoácidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la GalNAc transferasa. En consecuencia, las \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención incluyen polipéptidos que tienen actividad \beta1,4-GalNAc transferasa y son al menos idénticos en aproximadamente un 65%, más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 80% y lo más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 90% a la secuencia de aminoácidos de las \beta1,4-GalNAc transferasas de C.jejuni OH 4384 (SEQ ID NO: 13) a lo largo de una región del polipéptido que se requiere para conservar la actividad \beta1,4-GalNAc transferasa. En algunas realizaciones, las \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención son idénticas a la \beta1,4-GalNAc transferasa de C. jejuni OH 4384 a lo largo de la longitud completa de la \beta1,4-GalNAc transferasa.

De nuevo, pueden determinarse las identidades en porcentaje mediante inspección, por ejemplo, o pueden determinarse usando un algoritmo de alineación como el algoritmo BLASTP versión 2.0 con una longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1 y una matriz de sustitución BLOSUM62.

También se pueden identificar \beta1,4-GalNAc transferasas de la invención mediante inmunoreactividad. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos contra la \beta1,4-GalNAc transferasa de C.jejuni OH4384 de SEQ ID NO: 13 y determinar si los anticuerpos son específicamente inmunorreactivos con una \beta1,4-GalNAc transferasa de interés.

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3.\beta1,3-Galactosiltransferasas

También se proporcionan por la invención \beta1,3-galactosiltransferasas (CgtB). Cuando se ponen en un medio de reacción adecuado, las \beta1,3-galactosiltransferasas de la invención catalizan la transferencia de un residuo de galactosa desde un donador (por ejemplo, UDP-Gal) hasta un aceptor de sacárido adecuado (por ejemplo, sacáridos que tienen un residuo de GaINAc terminal). Entre las reacciones catalizadas por las \beta1,3-galactosiltransferasas está la transferencia de un residuo de galactosa hasta el resto de oligosacárido de GM2 para formar el resto de oligosacárido de GM1a.

Ejemplos de las \beta1,3-galactosiltransferasas de la invención son las producidas por especies de Campylobacter, tales como C. jejuni. Por ejemplo, una \beta1,3-galactosiltransferasa de la invención es la de la cepa OH4384 de C.jejuni, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 15.

Otro ejemplo de una \beta1,3-galactosiltransferasa de la invención es la de la cepa NCTC 11168 serotipo O:2 de C.jejuni. La secuencia de aminoácidos de esta galactosiltransferasa se expone en SEQ ID NO: 17. Esta galactosiltransferasa se expresa bien en E. coli, por ejemplo, y muestra una alta cantidad de actividad soluble. Además, a diferencia de CgtB de OH4384, que puede añadir más de una galactosa, si una mezcla de reacción contiene un exceso de donador y se incuba durante un periodo de tiempo suficientemente largo, la \beta1,3-galactosa de NCTC 11168 no tiene una cantidad significativa de actividad poligalactosiltransferasa. Para algunas aplicaciones, es deseable la actividad poligalactosiltransferasa de la enzima de OH4384, pero en otras aplicaciones tales como la síntesis de miméticos de GM1, es deseable la adición de sólo una galactosa terminal.

Las \beta1,3-galactosiltransferasas de la invención tienen generalmente una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos de la CgtB de OH 4384 o NCTC 11168 tal como se expone en SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17, respectivamente, a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, las \beta1,3-galactosiltransferasas de la invención son al menos idénticas en aproximadamente un 85% a cualquiera de estas secuencias de aminoácidos, y todavía más preferiblemente son al menos idénticas en aproximadamente un 95% a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 aminoácidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos, y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la galactosiltransferasa. En consecuencia, las \beta1,3-galactosiltransferasas de la invención incluyen polipéptidos que tienen actividad \beta1,3-galactosiltransferasa y son al menos idénticos en aproximadamente un 65%, más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 80% y lo más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 90% a la secuencia de aminoácidos de la \beta1,3-galactosiltransferasa de C. jejuni OH4384 (SEQ ID NO: 15) o la galactosiltransferasa de NCTC 11168 (SEQ ID NO: 17) a lo largo de una región del polipéptido que se requiere para conservar la actividad \beta1,3-galactosiltransferasa. En algunas realizaciones, la \beta1,3-galactosiltransferasa de la invención es idéntica a la \beta1,3-galactosiltransferasa de C. jejuni OH 4384 o NCTC 11168 a lo largo de la longitud completa de la \beta1,3-galactosiltransferasa.

Las identidades en porcentaje pueden determinarse mediante inspección, por ejemplo, o pueden determinarse usando un algoritmo de alineación tal como el algoritmo BLASTP versión 2.0 con una longitud de palabra (W) de 3, G=11, E=1 y una matriz de sustitución BLOSUM62.

Las \beta1,3-galactosiltransferasas de la invención pueden obtenerse de las especies de Campylobacter respectivas, o pueden producirse de manera recombinante. Se pueden identificar las glicosiltransferasas mediante ensayos de la actividad enzimática, por ejemplo, o detectando la inmunorreactividad específica con anticuerpos producidos contra la \beta1,3-galactosiltransferasa de C. jejuni OH4384 que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 15 o la \beta1,3 galactosiltransferasa de C. jejuni NCTC 11168 tal como se expone en SEQ ID NO: 17.

4. Enzimas adicionales implicadas en la ruta biosintética de LOS

La presente invención también proporciona enzimas adicionales que están implicadas en la biosíntesis de oligosacáridos tales como los encontrados en lipooligosacáridos bacterianos. Por ejemplo, se proporcionan enzimas implicadas en la síntesis de CMP-ácido siálico, el donador para las sialiltransferasas. Se codifica una ácido siálico sintasa mediante el marco de lectura abierto (ORF) 8a de la cepa OH 4384 de C. jejuni (SEQ ID NO: 21) y mediante el marco de lectura abierto 8b de la cepa NCTC 11168 (véase la tabla 3). Otra enzima implicada en la síntesis de ácido siálico se codifica por el ORF 9a de OH 4384 (SEQ ID NO: 22) y 9b de NCTC 11168. Se codifica una CMP-ácido siálico sintetasa por el ORF 10a (SEQ ID NO: 23) y 10b de OH 4384 y NCTC 11168, respectivamente.

La invención también proporciona una aciltransferasa que está implicada en la biosíntesis de lípido A. Esta enzima está codificada por el marco de lectura abierto 2a de la cepa OH4384 de C. jejuni (SEQ ID NO: 18) y mediante el marco de lectura abierto 2B de la cepa NCTC 11168. También se proporciona una acetiltransferasa; esta enzima está codificada por el ORF 11a de la cepa OH 4384 (SEQ ID NO: 24); no se encuentra homología en el locus de biosíntesis de LOS de la cepa NCTC 11168.

También se proporcionan tres glicosiltransferasas adicionales. Estas enzimas están codificadas por los ORF 3a (SEQ ID NO: 19), 4a (SEQID NO: 20) y 12a (SEQID NO: 25) de la cepa OH4384 y ORF 3b, 4b y 12b de la cepa NCTC11168.

La invención incluye, para cada una de estas enzimas, polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en el presente documento a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, las enzimas de la invención son al menos idénticas en aproximadamente un 85% a la secuencia de aminoácidos respectiva, y todavía más preferiblemente son al menos idénticas en aproximadamente un 95% a la secuencia de aminoácidos, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 aminoácidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la enzima. En consecuencia, las enzimas de la invención incluyen polipéptidos que tienen la actividad respectiva y son al menos idénticos en aproximadamente un 65%, más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 80% y lo más preferiblemente al menos idénticos en aproximadamente un 90% a la secuencia de aminoácidos de la enzima correspondiente tal como se expone en el presente documento a lo largo de una región del polipéptido que se requiere para conservar la actividad enzimática respectiva. En algunas realizaciones, las enzimas de la invención son idénticas a las enzimas de C. jejuni OH 4384 correspondientes a lo largo de la longitud completa de la enzima.

B. Ácidos nucleicos que codifican para glicosiltransferasas y enzimas relacionadas

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican para las glicosiltransferasas y otras enzimas de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican para glicosiltransferasas de la invención son útiles para varios fines, incluyendo la expresión recombinante de los polipéptidos de glicosiltransferasas correspondientes, y como sondas para identificar ácidos nucleicos que codifican para otras glicosiltransferasas y para estudiar la regulación y expresión de las enzimas.

Los ácidos nucleicos de la invención incluyen aquellos que codifican para la enzima glicosiltransferasa completa tales como los descritos anteriormente, así como aquellos que codifican para una subsecuencia de un polipéptido de glicosiltransferasa. Por ejemplo, la invención incluye ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que no es una enzima glicosiltransferasa de longitud completa, pero no obstante tiene actividad glicosiltransferasa. Las secuencias de nucleótidos del locus LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 1, y se identifican los marcos de lectura respectivos. También se proporcionan secuencias de nucleótidos adicionales, tal como se trata a continuación. La invención incluye no sólo ácidos nucleicos que incluyen las secuencias de nucleótidos tal como se exponen en el presente documento, sino también ácidos nucleicos que son sustancialmente idénticos a, o sustancialmente complementarios a las realizaciones puestas como ejemplo. Por ejemplo, la invención incluye ácidos nucleicos que incluyen una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica en un 70% a una que se expone en el presente documento, más preferiblemente al menos idéntica en un 75%, todavía más preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 85%, todavía más preferiblemente a menos en un 90% e incluso más preferiblemente al menos en aproximadamente un 95%, a una secuencia de nucleótidos puesta como ejemplo. La región de identidad en porcentaje especificada, en algunas realizaciones, abarca la región codificante de una parte suficiente de la enzima codificada que conserva la actividad enzimática respectiva. La identidad en porcentaje especificada, en realizaciones preferidas, se extiende a lo largo de la longitud completa de la región codificante de la enzima.

Los ácidos nucleicos que codifican las glicosiltransferasas de la invención pueden obtenerse usando métodos que conocen los expertos en la técnica. Pueden clonarse ácidos nucleicos adecuados (por ejemplo, ADNc, genómico o subsecuencias (sondas)), o amplificarse mediante métodos in vitro tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencia autosostenida (SSR). Los expertos en la técnica conocen bien una amplia variedad de metodologías de clonado y amplificación in vitro. Se encuentran ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a los expertos a través de muchos ejercicios de clonación en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de 1994) (Ausubel); Cashion et al., patente estadounidense número 5.017.478; y Carr, patente europea número 0.246.864. Se encuentran ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a expertos a través de métodos de amplificación in vitro en Berger, Sambrook y Ausubel, así como Mullis et al., (1987) patente estadounidense número 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wuand Wallace (1989) Gene 4: 560; y Barringer et al. (1990) Gene 89: 117. Se describen métodos mejorados de clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro en Wallace et al., patente estadounidense número 5.426.039.

Pueden prepararse ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de glicosiltransferasas de la invención, o subsecuencias de estos ácidos nucleicos, mediante cualquier método adecuado tal como se describió anteriormente, incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas. Como ejemplo, se puede obtener un ácido nucleico que codifica para una glicosiltransferasa de la invención mediante métodos de clonación rutinarios. Puede usarse una secuencia de nucleótidos conocida de un gen que codifica para la glicosiltransferasa de interés, tal como se describe en el presente documento, para proporcionar sondas que hibriden específicamente con un gen que codifica para una enzima adecuada en una muestra de ADN genómico, o con un ARNm en una muestra de ARN total (por ejemplo, en una transferencia de tipo Southern o Northern). Preferiblemente, las muestras se obtienen de organismos procariotas, tales como especies de Campylobacter. Los ejemplos de especies de Campylobacter de interés particular incluyen C. jejuni. Muchas cepas de O:19 de C. jejuni sintetizan miméticos de gangliósido y son útiles como fuente de las glicosiltransferasas de la invención.

Una vez que se identifica el ácido nucleico de glicosiltransferasa diana, puede aislarse según métodos convencionales conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger y Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.; o Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York).

También puede clonarse un ácido nucleico que codifica para una glicosiltransferasa detectando su producto expresado por medio de ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas. Por ejemplo, se puede identificar un ácido nucleico que codifica para una sialiltransferasa bifuncional clonada mediante la capacidad de un polipéptido codificado por el ácido nucleico para catalizar el acoplamiento de un ácido siálico en enlace \alpha2,3 con un aceptor galactosilado, seguido por el acoplamiento de una segunda estructura de ácido siálico con el primer ácido siálico en un enlace \alpha2,8. De manera similar, se puede identificar un ácido nucleico clonado que codifica para una \beta1,4-GaINAc transferasa o una \beta1,3-galactosiltransferasa mediante la capacidad del polipéptido codificado de catalizar la transferencia de un residuo de GalNAc desde UDP-GaINAc, o un residuo de galactosa desde UDP-Gal, respectivamente, hasta un aceptor adecuado. Se conocen en la técnica condiciones de ensayo adecuadas, e incluyen las que se describen en los ejemplos. Pueden compararse otras propiedades físicas de un polipéptido expresado a partir de un ácido nucleico particular con las propiedades de polipéptidos de glicosiltransferasas conocidos de la invención, tales como los descritos en el presente documento, para proporcionar otro método de identificación de ácidos nucleicos que codifican para glicosiltransferasas de la invención. Alternativamente, puede mutarse un gen de glicosiltransferasa supuesto, y se establece su papel como glicosiltransferasa detectando una variación en la capacidad de producir el glicoconjugado respectivo.

En otras realizaciones, pueden clonarse ácidos nucleicos que codifican para glicosiltransferasas usando métodos de amplificación de ADN tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Así, por ejemplo, se amplifica por PCR la secuencia o subsecuencia de ácido nucleico, preferiblemente usando un cebador sentido que contiene un sitio de restricción (por ejemplo, XbaI) y un cebador antisentido que contiene otro sitio de restricción (por ejemplo, HindIII). Esto producirá un ácido nucleico que codifica para la secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la glicosiltransferasa deseada y que tiene sitios de restricción terminales. Este ácido nucleico puede ligarse entonces fácilmente en un vector que contiene un ácido nucleico que codifica para la segunda molécula y que tiene los sitios de restricción correspondientes apropiados. El experto en la técnica puede determinar los cebadores de PCR adecuados usando la información de secuencia proporcionada en el presente documento. También pueden añadirse sitios de restricción apropiados al ácido nucleico que codifica para la glicosiltransferasa de la invención, o subsecuencia de aminoácidos, mediante mutagénesis dirigida al sitio. El plásmido que contiene la secuencia o subsecuencia de nucleótidos que codifica para la glicosiltransferasa se escinde con la endonucleasa de restricción apropiada y luego se liga en un vector apropiado para su amplificación y/o expresión según métodos convencionales.

Se muestran en la tabla 2 ejemplos de cebadores adecuados para la amplificación de los ácidos nucleicos que codifican para glicosiltransferasas de la invención; algunos de los pares de cebadores se diseñan para proporcionar un sitio de restricción NdeI en 5' y un sitio SalI en 30 sobre el fragmento amplificado. El plásmido que contiene la secuencia o subsecuencia que codifica para la enzima se escinde con la endonucleasa de restricción apropiada y luego se liga en un vector apropiado para su amplificación y/o expresión según métodos convencionales.

Como alternativa a la clonación de un ácido nucleico que codifica para una glicosiltransferasa, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico adecuado a partir de una secuencia conocida que codifica para una glicosiltransferasa de la invención. Los métodos de síntesis química directa incluyen, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método de fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; y el método de soporte sólido de la patente estadounidense número 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Éste puede convertirse en ADN bicatenario mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena única como molde. Un experto en la técnica reconocería que mientras la síntesis química de ADN se limita a menudo a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas mediante la ligación de secuencias más cortas. Alternativamente, pueden clonarse subsecuencias y escindirse las subsecuencias apropiadas usando enzimas de restricción apropiadas. Entonces, pueden ligarse los fragmentos para producir la secuencia de ADN deseada.

En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar los ácidos nucleicos que codifican para la enzima. Un experto reconocería muchas formas de generar alteraciones en un constructo de ácido nucleico dado. Tales métodos bien conocidos incluyen mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR usando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que contienen el ácido nucleico a agentes mutagénicos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por ejemplo, junto con ligación y/o clonación para generar ácidos nucleicos más largos) y otras técnicas bien conocidas. Véase, por ejemplo, Giliman y Smith (1979) Gene 8:81-97, Roberts et al. (1987) Nature 328: 731-734.

En una realización preferida en el presente documento, se modifican los ácidos nucleicos recombinantes presentes en las células de la invención para proporcionar codones preferidos que potencian la traducción del ácido nucleico en un organismo seleccionado (por ejemplo, se sustituyen codones preferidos en E. coli en un ácido nucleico codificante para su expresión en E. coli).

La presente invención incluye ácidos nucleicos que están aislados (es decir, no en su ubicación cromosómica nativa) y/o son recombinantes (es decir, modificados respecto a su forma original, presentes en un organismo no nativo, etc.).

1. Sialiltransferasas

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para sialiltransferasas tales como las descritas anteriormente. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención codifican para polipéptidos de sialiltransferasas bifuncionales que tienen tanto actividad \alpha-2,3 sialiltransferasa como actividad \alpha-2,8 sialiltransferasa. Estos ácidos nucleicos de sialiltransferasas codifican para un polipéptido de sialiltransferasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 76% a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente las sialiltransferasas codificadas por los ácidos nucleicos de la invención son al menos idénticas en aproximadamente un 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y todavía más preferiblemente al menos idénticas en aproximadamente un 95% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, a lo largo de una región de al menos 60 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 60 aminoácidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la sialiltransferasa. En una realización preferida en el presente documento, los ácidos nucleicos que codifican para sialiltransferasas de la invención codifican para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 3.

Un ejemplo de un ácido nucleico de la invención es una forma aislada y/o recombinante de un ácido nucleico que codifica para una sialiltransferasa bifuncional de C. jejuni OH4384. La secuencia de nucleótidos de este ácido nucleico se muestra en SEQ ID NO: 2. Las secuencias polinucleotídicas que codifican para sialiltransferasas de la invención son normalmente al menos idénticas en aproximadamente un 75% a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican para sialiltransferasas de la invención son al menos idénticos en aproximadamente un 85% a esta secuencia de nucleótidos y todavía más preferiblemente son al menos idénticos en aproximadamente un 95% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región del umbral de identidad en porcentaje identificada se extiende a lo largo de una región más larga de 50 nucleótidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 nucleótidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la región que codifica para la sialiltransferasa. En consecuencia, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para sialiltransferasas bifuncionales que son sustancialmente idénticos a los de cstII de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se expone en SEQ ID NO: 2 o la cepa O:10 (SEQ ID NO: 4).

Otros ácidos nucleicos que codifican para sialiltransferasas de la invención codifican para sialiltransferasas que tienen actividad \alpha2,3 sialiltransferasa pero carecen de actividad \alpha2,8 sialiltransferasa sustancial. Por ejemplo, se proporcionan mediante la invención ácidos nucleicos que codifican para una \alpha2,3 sialiltransferasa CstII de la cepa serológica O:19 (SEQ ID NO: 8) y NCTC 11168 de C. jejuni; estas enzimas tienen poca o nada de actividad \alpha2,8-sialiltransferasa (tabla 6).

Para identificar ácidos nucleicos de la invención, puede usarse la inspección visual o usarse un algoritmo de alineación adecuado. Un método alternativo mediante el que se puede identificar un ácido nucleico que codifica para una sialiltransferasa bifuncional de la invención es mediante la hibridación, en condiciones rigurosas, del ácido nucleico de interés con un ácido nucleico que incluye una secuencia polinucleotídica de una sialiltransferasa tal como se expone en el presente documento.

2.\beta1,4-GalNAc transferasas

También se proporcionan mediante la invención ácidos nucleicos que incluyen secuencias polinucleotídicas que codifican para un polipéptido de GalNAc transferasa que tiene una actividad \beta1,4-GalNAc transferasa. Las secuencias polinucleotídicas que codifican para un polipéptido de GalNAc transferasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 70% a la \beta1,4-GaINAc transferasa de C.jejuni OH4384, que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13, a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, el polipéptido de GalNAc transferasa codificado por los ácidos nucleicos de la invención es al menos idéntico en aproximadamente un 80% a esta secuencia de aminoácidos y todavía más preferiblemente al menos idéntico en aproximadamente un 90% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 aminoácidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa del polipéptido de GaINAc transferasa. En una realización preferida en el presente documento, los ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido de GalNAc transferasa de la invención codifican para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 13. Para identificar ácidos nucleicos de la invención, puede usarse inspección visual, o usarse un algoritmo de alineación adecuado.

Un ejemplo de un ácido nucleico que codifica para GalNAc transferasa de la invención es una forma aislada y/o recombinante del ácido nucleico que codifica para GalNAc transferasa de C.jejuni OH4384. Este ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 12. Las secuencias polinucleotídicas que codifican para GalNAc transferasa de la invención son normalmente al menos idénticas en aproximadamente un 75% a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican para GalNAc transferasa de la invención son al menos idénticos en aproximadamente un 85% a esta secuencia de nucleótidos y todavía más preferiblemente son al menos idénticos en aproximadamente un 95% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 nucleótidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 nucleótidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la región que codifica para GalNAc transferasa.

Para identificar ácidos nucleicos de la invención, puede usarse inspección visual o usarse un algoritmo de alineación de secuencia adecuado. Un método alternativo mediante el que puede identificarse un ácido nucleico que codifica para GalNAc transferasa de la invención es mediante la hibridación, en condiciones rigurosas, del ácido nucleico de interés con un ácido nucleico que incluya una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 12.

3.\beta1,3-Galactosiltransferasas

La invención también proporciona ácidos nucleicos que incluyen secuencias polinucleotídicas que codifican para un polipéptido que tiene actividad \beta1,3-galactosiltransferasa (CgtB). Los polipéptidos de \beta-1,3-galactosiltransferasas codificados por estos ácidos nucleicos de la invención incluyen preferiblemente una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en aproximadamente un 75% a una secuencia de aminoácidos de una \beta1,3-galactosiltransferasa de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se expone en SEQ ID NO: 15, o a la de una \beta1,3-galactosiltransferasa de la cepa NCTC 11168 tal como se expone en SEQ ID NO: 17, a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Más preferiblemente, los polipéptidos de galactosiltransferasa codificados por estos ácidos nucleicos de la invención son al menos idénticos en aproximadamente un 85% a esta secuencia de aminoácidos y todavía más preferiblemente son al menos idénticos en aproximadamente un 95% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 aminoácidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 aminoácidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la región que codifica para el polipéptido de galactosiltransferasa.

Un ejemplo de un ácido nucleico que codifica para \beta1,3-galactosiltransferasa de la invención es una forma aislada y/o recombinante del ácido nucleico que codifica para \beta1,3-galactosiltransferasa de C. jejuni OH4384. Este ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 14. Otro ácido nucleico adecuado que codifica para \beta1,3-galactosiltransferasa incluye una secuencia de nucleótidos de una cepa NCTC 11168 de C. jejuni, para la que se muestra la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO: 16. Las secuencias polinucleotídicas que codifican para \beta1,3-galactosiltransferasa de la invención son normalmente al menos idénticas en aproximadamente un 75% a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14 o a la de SEQ ID NO: 16 a lo largo de una región de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican para \beta1,3-galactosiltransferasa de la invención son al menos idénticos en aproximadamente un 85% a al menos una de estas secuencias de nucleótidos y todavía más preferiblemente son al menos idénticos en aproximadamente un 95% a las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 16, a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas en el presente documento, la región de identidad en porcentaje se extiende a lo largo de una región más larga de 50 nucleótidos, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 nucleótidos y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la región que codifica para \beta1,3-galactosiltransferasa.

Para identificar ácidos nucleicos de la invención, puede usarse inspección visual, o puede usarse un algoritmo de alineación adecuado. Un método alternativo mediante el que puede identificarse un ácido nucleico que codifica para polipéptido de galactosiltransferasa de la invención es mediante la hibridación, en condiciones rigurosas, del ácido nucleico de interés con un ácido nucleico que incluye una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.

4. Enzimas adicionales implicadas en la ruta biosíntética de LOS

También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para otras enzimas que están implicadas en la ruta biosintética de LOS de procariotas tales como Campylobacter. Estos ácidos nucleicos codifican para enzimas tales como, por ejemplo, ácido siálico sintasa, que se codifica mediante el marco de lectura abierto (ORF) 8a de la cepa OH 4384 de C. jejuni y mediante el marco de lectura abierto 8b de la cepa NCTC 11168 (véase la tabla 3), otra enzima implicada en la síntesis de ácido siálico, que se codifica mediante el ORF 9a de OH 4384 y 9b de NCTC 11168, y una CMP-ácido siálico sintetasa que se codifica mediante el ORF 10a y 10b de OH 4384 y NCTC 11168, respectivamente.

La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican para una aciltransferasa que está implicada en la biosíntesis de lípido A. Esta enzima se codifica mediante el marco de lectura abierto 2a de la cepa OH4384 de C. jejuni y mediante el marco de lectura abierto 2B de la cepa NCTC 11168. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para una acetiltransferasa; esta enzima se codifica mediante el ORF 11a de la cepa OH 4384; no se encuentra homología en el locus de biosíntesis de LOS de la cepa NCTC 11168.

También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para tres glicosiltransferasas adicionales. Estas enzimas se codifican mediante los ORF 3a, 4a y 12a de la cepa OH 4384 y los ORF 3b, 4b y 12b de la cepa NH 11168 (figura 1).

C. Casetes de expresión y expresión de las glicosiltransferasas

La presente invención también proporciona casetes de expresión, vectores de expresión y células huésped recombinantes que pueden usarse para producir las glicosiltransferasas y otras enzimas de la invención. Un casete de expresión típico contiene un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica para la glicosiltransferasa u otra enzima de interés. Los casetes de expresión se incluyen normalmente en vectores de expresión que se introducen en células huésped adecuadas, preferiblemente células huésped procariotas. Puede expresarse más de un polipéptido de glicosiltransferasa en una única célula huésped poniendo múltiples casetes transcripcionales en un único vector de expresión, construyendo un gen que codifica para una proteína de fusión que consiste en más de una glicosiltransferasa o utilizando diferentes vectores de expresión para cada glicosiltransferasa.

En una realización preferida, los casetes de expresión son útiles para la expresión de las glicosiltransferasas en células huésped procariotas. Las secuencias control procariotas usadas comúnmente, que se define en el presente documento que incluyen promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitios de unión a ribosomas, incluyen tales promotores comúnmente usados como los sistemas de promotor de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Change et al., Nature (1977) 198: 1056), el sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057), el promotor tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25); y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de unión a ribosomas del gen N (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). El sistema de promotor particular no es crítico para la invención, puede usarse cualquier promotor disponible que funcione en procariotas.

En la presente invención, pueden usarse promotores o bien constitutivos o bien regulados. Los promotores regulados pueden ser ventajosos porque las células pueden hacerse crecer hasta altas densidades antes de inducir la expresión de los polipéptidos de glicosiltransferasa. Un alto nivel de expresión de proteínas heterólogas ralentiza el crecimiento celular en algunas situaciones. Los promotores regulados especialmente adecuados para su uso en E. coli incluyen el promotor P_{L} del bacteriófago lambda, el promotor trp-lac híbrido (Amann et al., Gene (1983) 25: 167; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21 y el promotor del bacteriófago T7 (Studier et al., J. Mol. Biol. (1986); Tabor et al., (1985). Estos promotores y su uso se tratan en Sambrook et al., citado anteriormente. Un promotor regulable preferido en el presente documento es el promotor tac-gal doble, que se describe en el documento PCT/US97/20528 (publicación internacional número WO 9820111).

Para la expresión de polipéptidos de galactosiltransferasa en células procarióticas distintas de E. coli, se requiere un promotor que funcione en las especies procariotas particulares. Tales promotores pueden obtenerse de genes que se han clonado a partir de las especies, o pueden usarse promotores heterólogos. Por ejemplo un promotor trp-lac híbrido funciona en Bacillus además de en E. coli. Los expertos en la técnica conocen bien promotores adecuados para su uso en células huésped eucariotas.

Se incluye convenientemente un sitio de unión a ribosomas (RBS) en los casetes de expresión de la invención que se destinan para su uso en células huésped procariotas. Un RBS en E. coli, por ejemplo, consiste en una secuencia de nucleótidos de 3-9 nucleótidos de longitud ubicada 3-11 nucleótidos en sentido 5' del codón de iniciación (Shine y Dalgarno, Nature (1975) 254: 34; Steitz, en Biological regulation and development: Gene expression (ed. R.F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, NY).

Puede usarse el acoplamiento traduccional para potenciar la expresión. La estrategia usa un marco de lectura abierto corto en sentido 5' derivado de un gen sumamente expresado nativo para el sistema traduccional, que se pone en sentido 3' del promotor, y un sitio de unión a ribosomas seguido tras unos pocos codones de aminoácidos por un codón de terminación. Justo antes del codón de terminación está un segundo sitio de unión a ribosomas, y siguiendo al codón de terminación está un codón de inicio para la iniciación de la traducción. El sistema disuelve la estructura secundaria del ARN, permitiendo la iniciación eficaz de la traducción. Véase Squires et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 16297-16302.

Los polipéptidos de glicosiltransferasas de la invención pueden expresarse intracelularmente, o puede secretarse de la célula. La expresión intracelular a menudo da como resultado altos rendimientos. Si es necesario, puede aumentarse la cantidad de polipéptidos de glicosiltransferasas activos, solubles realizando procedimientos de remodelación (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Marston et al., Bio/Technology (1984) 2: 800; Schoner et al., Bio/Technology (1985) 3: 151). En realizaciones en las que los polipéptidos de glicosiltransferasas se secretan de la célula, o bien en el periplasma o bien en el medio extracelular, la secuencia polinucleotídica que codifica para la glicosiltransferasa está unida a una secuencia polinucleotídica que codifica para una secuencia de péptido señal escindible. La secuencia señal dirige la translocación del polipéptido de glicosiltransferasa a través de la membrana celular. Un ejemplo de un vector adecuado para su uso en E. coli que contiene una unidad de promotor-secuencia señal es pTA1529, que tiene el promotor phoA de E. coli y una secuencia señal (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Oka et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1985) 82: 7212; Talmadge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 3988; Takahara et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2670).

Los polipéptidos de glicosiltransferasas de la invención también pueden producirse como proteínas de fusión. Este enfoque a menudo da como resultado altos rendimientos, porque secuencias control procariotas normales dirigen la transcripción y traducción. En E. coli, se usan a menudo fusiones lacZ para expresar proteínas heterólogas. Están fácilmente disponibles vectores adecuados, tales como las series pUR, pEX, y pMR100 (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente). Para ciertas aplicaciones, puede ser deseable escindir los aminoácidos que no son de la glicosiltransferasa de la proteína de fusión tras la purificación. Esto puede lograrse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo escisión mediante bromuro de cianógeno, una proteasa o mediante el factor X_{a} (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Itakura et al., Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 106; Nagai et al., Nature (1984) 309: 810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 561). Pueden modificarse por ingeniería genética los sitios de escisión en el gen para la proteína de fusión en el punto deseado de escisión.

Se ha descrito un sistema adecuado para obtener proteínas recombinantes a partir de E. coli que mantiene la integridad de sus extremos N-terminales por Miller et al. Biotechnology 7:698-704 (1989). En este sistema, se produce el gen de interés como una fusión C-terminal a los primeros 76 residuos del gen de la ubiquitina de levaduras que contiene un sitio de escisión de peptidasa. La escisión en la unión de los dos restos da como resultado la producción de una proteína que tiene un residuo N-terminal auténtico intacto.

Las glicosiltransferasas de la invención pueden expresarse en una variedad de células huésped, incluyendo E. coli, otros huéspedes bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares de mieloma. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen, pero no se limitan a, Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsielia, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus. El ácido nucleico que codifica para la glicosiltransferasa recombinante está ligado operativamente a secuencias control de la expresión apropiadas para cada huésped. Para E. coli esto incluye un promotor tal como los promotores T7, trp o lambda, un sitio de unión a ribosomas y preferiblemente una señal de terminación de la transcripción. Para células eucariotas, las secuencias control incluirán un promotor y preferiblemente un potenciador derivado de genes de inmunoglobulinas, SV40, citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación, y puede incluir secuencias donadoras y aceptoras de corte y empalme.

Los vectores de expresión de la invención pueden transferirse en la célula huésped elegida mediante métodos bien conocidos tales como transformación con cloruro de calcio para E. coli y tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para células de mamíferos. Pueden seleccionarse las células transformadas por los plásmidos mediante la resistencia a antibióticos conferida por genes contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg.

Una vez expresados, los polipéptidos de glicosiltransferasas recombinantes pueden purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 al 95% de homogeneidad, y las más preferidas son del 98 al 99% o más de homogeneidad. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden usarse entonces (por ejemplo, como inmunógenos para la producción de anticuerpos). Las glicosiltransferasas también pueden usarse en un estado no purificado o semipurificado. Por ejemplo, puede usarse una célula huésped que exprese la glicosiltransferasa directamente en una reacción de glicosiltransferasa, o bien con o bien sin procesamiento tal como permeabilización u otra alteración celular.

Un experto reconocerá que pueden hacerse modificaciones en las proteínas glicosiltransferasas sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden hacerse para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula diana en una proteína de fusión. Tales modificaciones las conocen bien los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) puestos en cualquier extremo terminal para crear sitios de restricción o codones de terminación o secuencias de purificación convenientemente ubicados.

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D. Métodos y mezclas de reacción para la síntesis de oligosacáridos

La invención proporciona métodos y mezclas de reacción en los que las glicosiltransferasas de la invención se usan para preparar oligosacáridos deseados (que se componen de dos o más sacáridos). Las reacciones de glicosiltransferasas de la invención tienen lugar en un medio de reacción que comprende al menos una glicosiltransferasa, un sustrato donador, un azúcar aceptor y normalmente un catión metálico divalente soluble. Los métodos se basan en el uso de la glicosiltransferasa para catalizar la adición de un sacárido a un sacárido sustrato (también denominado "aceptor"). Se conocen varios métodos de uso de glicosiltransferasas para sintetizar estructuras de oligosacáridos deseados. Se describen métodos a modo de ejemplo, por ejemplo, en el documento WO 96/32491, Ito et al. (1993) Pure Appl. Chem. 65:753, y las patentes estadounidenses 5.352.670, 5.374.541 y 5.545.553.

Por ejemplo, la invención proporciona métodos para añadir ácido siálico en un enlace \alpha2,3 a un residuo de galactosa, poniendo en contacto una mezcla de reacción que comprende un ácido siálico activado (por ejemplo, CMP-NeuAc, CMP-NeuGc y similares) con un resto aceptor que incluye un residuo de galactosa terminal en presencia de una sialiltransferasa bifuncional de la invención. En realizaciones preferidas en el presente documento, los métodos también dan como resultado la adición de un segundo residuo de ácido siálico que se une al primer ácido siálico mediante un enlace \alpha2,8. El producto de este método es Sia\alpha2,8-Sia\alpha2,3-Gal-. Los ejemplos de aceptores adecuados incluyen una Gal terminal que está unida a GlcNAc o Glc mediante un enlace \beta1,4, y una Gal terminal que está unida en \beta1,3 o bien a GlcNAc o bien a GalNAc. El residuo terminal al que se une el ácido siálico puede estar unido por sí mismo a, por ejemplo, H, un sacárido, oligosacárido o un grupo aglicona que tiene al menos un átomo de hidrato de carbono. En algunas realizaciones, el residuo aceptor es una parte de un oligosacárido que está unido a una proteína, lípido o proteoglicano, por ejemplo.

En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos y mezclas de reacción para la síntesis de gangliósidos, lisogangliósidos, miméticos de gangliósido, miméticos de lisogangliósido o las partes de hidratos de carbono de estas moléculas. Estos métodos y mezclas de reacción incluyen normalmente como resto aceptor galactosilado un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en Gal4Glc-R^{1} y Gal3GalNAc-R^{2}; en el que R^{1} se selecciona del grupo que consiste en ceramida u otro glicolípido, R^{2} se selecciona del grupo que consiste en Gal4GlcCer, (Neu5Ac3)Gal4GlcCer y (Neu5Ac8Neu5c3)Gal4GlcCer. Por ejemplo, para la síntesis de gangliósidos, el aceptor galactosilado puede seleccionarse del grupo que consiste en Gal4GlcCer, Gal3GalNAc4(Neu5Ac3)Gal4GlcCer y Gal3GalNAc4(Neu5Ac8Neu5c3)Gal4GlcCer.

Los métodos y mezclas de reacción de la invención son útiles para producir cualquiera de un gran número de gangliósidos, lisogangliósidos y estructuras relacionadas. Se describen muchos gangliósidos de interés en Oettgen, H.F., ed., Gangliosides and Cancer, VCH, Alemania, 1989, págs. 10-15, y referencias citadas en el mismo. Los gangliósidos de particular interés incluyen, por ejemplo, los encontrados en el cerebro así como otras fuentes que se enumeran en la tabla 1.

TABLA 1 Abreviaturas y fórmulas de gangliósidos

1

Las sialiltransferasas bifuncionales de la invención son particularmente útiles para sintetizar los gangliósidos GD1a, GD1b, GT1a, GT1b, GT1c y GQ1b, o las partes de hidrato de carbono de estos gangliósidos, por ejemplo. Las estructuras de estos gangliósidos, que se muestran en la tabla 1, requieren actividad sialiltransferasa tanto \alpha2,3 como \alpha2,8. Una ventaja proporcionada por los métodos y mezclas de reacción de la invención es que ambas actividades están presentes en un único polipéptido.

Las glicosiltransferasas de la invención pueden usarse en combinación con glicosiltransferasas adicionales y otras enzimas. Por ejemplo, puede usarse una combinación de sialiltransferasa y galactosiltransferasas. En algunas realizaciones de la invención, el aceptor galactosilado que se utiliza por la sialiltransferasa bifuncional se forma poniendo en contacto un aceptor adecuado con UDP-Gal y una galactosiltransferasa. El polipéptido de galactosiltransferasa, que puede ser uno que se describe en el presente documento, transfiere el residuo de Gal desde la UDP-Gal hasta el aceptor.

De manera similar, pueden usarse las \beta1,4-GaINAc transferasas de la invención para sintetizar un aceptor para la galactosiltransferasa. Por ejemplo, el sacárido aceptor para la galactosiltransferasa puede formarse poniendo en contacto un aceptor para una GalNAc transferasa con UDP-GalNAc y un polipéptido de GalNAc transferasa, en el que el polipéptido de GalNAc transferasa transfiere el residuo de GalNAc desde el UDP-GalNAc hasta el aceptor para la GalNAc transferasa.

En este grupo de realizaciones, las enzimas y sustratos pueden combinarse en una mezcla de reacción inicial, o las enzimas y reactivos para un segundo ciclo de glicosiltransferasa pueden añadirse al medio de reacción una vez que el primer ciclo de glicosiltransferasa se ha acercado a su finalización. Mediante la realización de dos ciclos de glicosiltransferasa en secuencia en un único recipiente, se mejoran los rendimiento globales con respecto a procedimientos en los se aísla una especie intermedia. Además, se reducen las operaciones de limpieza y la eliminación de desechos de subproductos y disolventes extra.

Los productos producidos mediante los procedimientos anteriores pueden usarse sin purificación. Sin embargo, habitualmente se prefiere recuperar el producto. Se usan técnicas convencionales, bien conocidas para la recuperación de sacáridos glicosilados tales como cromatografía en capa fina o gruesa, o cromatografía de intercambio iónico. Se prefiere usar filtración con membrana, más preferiblemente utilizando una membrana osmótica inversa, o una o más técnicas cromatográficas en columna para la recuperación.

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E. Usos de glicoconjugados producidos usando glicosiltransferasas y métodos de la invención

Los compuestos de oligosacáridos que se preparan usando las glicosiltransferasas y métodos de la invención pueden usarse en una variedad de aplicaciones, por ejemplo como antígenos, reactivos de diagnóstico o como productos terapéuticos. Por tanto, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que pueden usarse en el tratamiento de una variedad de estados. Las composiciones farmacéuticas están compuestas por oligosacáridos preparados según los métodos descritos anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos. Se encuentran formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA, 17ª ed. (1985). Para una breve revisión de métodos para administrar fármacos, véase, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).

Las composiciones farmacéuticas están destinadas a administración parenteral, intranasal, tópica, oral o local, tal como mediante aerosol o por vía transdérmica, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Comúnmente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa. Por tanto, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden el compuesto disuelto o suspendido en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de tamponamiento y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares.

Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales, o pueden esterilizarse por filtración. Las disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal como están, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de su administración. El pH de las preparaciones estará normalmente entre 3 y 11, más preferiblemente desde 5 hasta 9 y lo más preferiblemente entre 7 y 8.

En algunas realizaciones, los oligosacáridos de la invención pueden incorporarse en liposomas formados a partir de lípidos que forman vesículas convencionales. Están disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas, según se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), patentes estadounidenses números 4.235.871, 4.501.728 y 4.837.028. Se conoce bien en la técnica el direccionamiento de liposomas usando una variedad de agentes de direccionamiento (por ejemplo, los sialilgalactósidos de la invención) (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.957.773 y 4.603.044).

Las composiciones que contienen los oligosacáridos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, tal como se describió anteriormente, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y el peso y estado general del paciente, pero generalmente oscilarán desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 40 g de oligosacárido por día para un paciente de 70 kg, usándose más comúnmente dosificaciones de desde aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 20 g de los compuestos por día.

Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones seleccionándose los niveles y el patrón de dosis por el médico encargado. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de los oligosacáridos de esta invención suficientes para tratar eficazmente al paciente.

Los oligosacáridos también pueden encontrar un uso como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, pueden usarse compuestos marcados para localizar zonas de inflamación o metástasis tumoral en un paciente que se sospecha que tiene una inflamación. Para este uso, los compuestos pueden marcarse con radioisótopos adecuados, por ejemplo, ^{125}I, ^{14}C o tritio.

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El oligosacárido de la invención puede usarse como inmunógeno para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales específicamente reactivos con los compuestos de la invención. Puede usarse la multitud de técnicas disponibles para los expertos en la técnica para la producción y manipulación de diversas moléculas de inmunoglobulina en la presente invención. Pueden producirse anticuerpos mediante una variedad de medios bien conocidos por los expertos en la técnica.

La producción de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murinos, de lagomorfos, equinos, etc., se conoce bien y puede lograrse, por ejemplo, inmunizando el animal con una preparación que contiene el oligosacárido de la invención. Se inmortalizan y seleccionan células productoras de anticuerpos obtenidas a partir de los animales inmunizados, o se seleccionan en primer lugar para detectar la producción del anticuerpo deseado y luego se inmortalizan. Para una discusión de procedimientos generales de producción de anticuerpos monoclonales, véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988).

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Ejemplo

Se ofrece el siguiente ejemplo para ilustrar, pero no para limitar la presente invención.

Este ejemplo describe el uso de dos estrategias para la clonación de cuatro genes responsables de la biosíntesis del mimético del gangliósido GT1a en el LOS de un patógeno bacteriano, OH4384 de Campylobacter jejuni, que se ha asociado con el síndrome de Guillain-Barré (Aspinall et al. (1994) Infect. Immun. 62: 2122-2125). Aspinal et al. ((1994) Biochemistry 33: 241-249) demostraron que esta cepa tiene un LPS de núcleo externo que imita al gangliósido trisialidado GT1a. En primer lugar, se clonó un gen que codifica para una \alpha-2,3-sialiltransferasa (cst-I) usando una estrategia de selección de actividad. Luego se usó una información de secuencia de nucleótidos sin procesar a partir de la secuencia de NCTC 11168 de C. jejuni completada recientemente para amplificar una región implicada en la biosíntesis de LOS a partir de OH4384 de C. jejuni. Usando cebadores que están localizados en las heptosiltransferasas I y II, se amplificó el locus de biosíntesis de LOS de 11,47 kb de OH4384 de C. jejuni. La secuenciación reveló que el locus codifica para 13 marcos de lectura abiertos (ORF) parciales o completos, mientras que el locus correspondiente en NCTC 11168 de C. jejuni abarca 13,49 kb y contiene 15 ORF, lo que indica un organización diferente entre estas dos cepas.

Se clonaron los genes de glicosiltransferasa potenciales individualmente, se expresaron en Escherichia coli y se sometieron a ensayo usando oligosacáridos fluorescentes sintéticos como aceptores. Se identificaron los gentes que codifican para una \beta-1,4-N-acetilgalactosaminiltransferasa (cgtA), una \beta-1,3-galactosiltransferasa (cgtB) y una sialiltransferasa bifuncional (cst-II) que transfiere ácido siálico a O-3 de galactosa y a O-8 de un ácido siálico que está unido en \alpha-2,3- a una galactosa. La especificidad de enlace de cada glicosiltransferasa identificada se confirmó mediante análisis de RMN a 600 MHz en cantidades nanomolares de compuestos modelo sintetizados in vitro. Usando una sonda de nano-RMN de banda ancha de gradiente inverso, pudo obtenerse la información de la secuencia mediante detección de correlaciones ^{3}J(C, H) a lo largo del enlace glicosídico. Se confirmó el papel de cgtA y cst-II en la síntesis del mimético de GT1a en OH4384 de C. jejuni mediante la comparación de su secuencia y su actividad con homólogos correspondientes en dos cepas de C. jejuni relacionadas que expresan miméticos de gangliósido más cortos en sus LOS. Por tanto, estas tres enzimas pueden usarse para sintetizar un mimético de GT1a partiendo de lactosa.

Las abreviaturas usadas son: CE, electroforesis capilar; CMP-Neu5Ac, citidina monofosfato -ácido N-acetilneuramínico; COSY, espectroscopia de correlación; FCHASE, éster succimidílico del ácido 6-(5-fluorescein-carboxamido)-hexanoico; GBS, síndrome de Guillain-Barré; HMBC, coherencia de enlace múltiple heteronuclear; HSQC, coherencia cuántica simple heteronuclear; LIF, fluorescencia inducidas por láser; LOS, lipooligosacárido; LPS, lipopolisacárido; NOE, efecto nuclear Overhauser; NOESY, espectroscopía NOE; TOCSY, espectroscopia de correlación total.

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Procedimientos experimentales Cepas Bacterianas

En este estudio se usaron las siguientes cepas de C. jejuni: cepa serológica O:19 (ATCC nº 43446); serotipo O:19 (las cepas OH4382 y OH4384 se obtuvieron del Laboratory Centre for Disease Control (Health Canadá, Winnipeg, Manitoba)); y serotipo O:2 (NCTC nº 11168). Se usó DH5\alpha de Escherichia coli para la biblioteca de HindIII mientras que se usó AD202 de E. coli (CGSG nº 7297) para expresar las diferentes glicosiltranferasas clonadas.

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Métodos básicos de ADN recombinante

El aislamiento del ADN genómico a partir de cepas de C. jejuni se realizó usando Qiagen Genomic-tip 500/G (Qiagen Inc., Valencia, CA) tal como se describió anteriormente (Gilbert et al. (1996) J. BioL Chem. 271: 28271-28276). El aislamiento de ADN de plásmido, las digestiones con enzimas de restricción, la purificación de fragmentos de ADN para clonación, los ligamientos y las transformaciones se realizaron tal como recomienda el proveedor de la enzima, o el fabricante del kit usado para el procedimiento particular. Se realizaron reacciones de PCR largas (> 3 kb) usando el sistema de PCR de molde largo Expand^{TM} tal como describe el fabricante (Boehringer Mannheim, Montreal). Se realizaron reacciones de PCR para amplificar los ORF específicos usando la ADN polimerasa Pwo tal como describe el fabricante (Boehringer Mannheim, Montreal). Se adquirieron las enzimas de restricción y de modificación del ADN de New England Biolabs Ltd. (Mississauga, ON). Se realizó la secuenciación del ADN usando un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems (Montreal) modelo 370A y el kit de secuenciación cíclico del fabricante.

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Selección de actividad para sialiltransferasa de C. jejuni

Se preparó la biblioteca genómica usando un digesto parcial por HindIII del ADN cromosómico de OH4384 de C. jejuni. Se purificó el digesto parcial sobre una columna QIAquick (QIAGEN Inc.) y se ligó con pBluescript SK- digerido con HindIII. Se sometió a electroporaciónDH5\alpha de E. coli con la mezcla de ligamiento y se sembraron en placa las células en medio LB con ampicilina 150 \mug/ml, IPTG 0,05 mM y X-Gal 100 \mug/ml (5-bromo-4-cloro-indolil-\beta-D-galactopiranósido). Se recogieron colonias blancas en grupos de 100 y se resuspendieron en 1 ml de medio con glicerol al 15%. Se usaron veinte \mul de cada grupo para inocular 1,5 ml de medio LB complementado con ampicilina 150 \mug/ml. Tras 2 h de crecimiento a 37ºC, se añadió IPTG hasta 1 mM y se hicieron crecer los cultivos durante otras 4,5 h. Se recogieron las células mediante centrifugación, se resuspendieron en 0,5 ml de Mops 50 mM (pH 7, MgCl_{2} 10 mM) y se sonicó durante 1 min. Se sometieron a ensayo los extractos para determinar la actividad sialiltransferasa tal como se describe más adelante excepto que el tiempo y la temperatura de incubación fueron de 18 h y 32ºC, respectivamente. Se sembraron en placa los grupos positivos para obtener colonias individuales, y se recogieron 200 colonias y se sometieron a prueba para determinar la actividad en grupos de 10. Finalmente se sometieron a prueba las colonias de los grupos positivos individualmente lo que llevó al aislamiento de dos clones positivos, pCJH9 (inserto de 5,3 kb) y pCJH101 (inserto de 3,9 kb). Usando varios fragmentos subclonados y cebadores adaptados, se secuenciaron completamente los insertos de los dos clones en ambas hebras. También se sometieron a prueba los clones con fragmentos de HindIII individuales para determinar la actividad de sialiltransferasa y el inserto del único positivo (un fragmento de 1,1 kb de HindIII clonado en pbluescript SK-) se transfirió a pUC118 usando sitios KpnI y PstI con el fin de obtener el inserto en la orientación opuesta con respecto al promotor plac.

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Clonación y secuenciación del locus de biosíntesis de LPS

Los cebadores usados para amplificar el locus de biosíntesis de LPS de OH4384 de C. jejuni se basaron en las secuencias preliminares disponibles del sitio web (URL: http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_jejuni/) del grupo de secuenciación de C. jejuni (Sanger Centre, UK) que secuenció el genoma competo de la cepa NCTC 11168. Los cebadores CJ-42 y CJ-43 (todas las secuencias de cebadores se describen en la tabla 2) se usaron para amplificar un locus de 11,47 kb usando el sistema de PCR de molde largo Expand^{TM}. Se purificó el producto de PCR en una columna de centrifugación S-300 (Pharmacia Biotech) y se secuenció completamente en ambas hebras usando una combinación de paseo con cebador y subclonación de fragmentos de HindIII. Se amplificaron los ORF específicos usando los cebadores descritos en la tabla 2 y la ADN polimerasa Pwo. Se digirieron los productos de PCR usando las enzimas de restricción apropiadas (véase la tabla 2) y se clonaron en pCWori+.

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TABLA 2 Cebadores usados para la amplificación de los marcos de lectura abiertos

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Expresión en E. coli y ensayos de glicosiltransferasa

Se transfirieron los diversos constructos a AD202 de E. coli y se sometieron a prueba para determinar la expresión de las actividades de glicosiltransferasa tras un inducción de 4 h con IPTG 1 mM. Se prepararon los extractos mediante sonicación y se llevaron a cabo las reacciones enzimáticas durante la noche a 32ºC. Se prepararon oligosacáridos marcados con FCHASE tal como se describió anteriormente (Wakarchuk et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 19166-19173). Se determinó la concentración de proteínas usando el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL). Para todos los ensayos enzimáticos se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima que generó un \mumol de producto por minuto.

El ensayo de selección para la actividad de \alpha-2,3-sialiltransferasa en grupos de clones contenía Lac-FCHASE 1 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Mops 50 mM pH 7, MnCl_{2} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM en un volumen final de 10 \mul. Los diversos ORF subclonados se sometieron a prueba para determinar la expresión de las actividades de glicosiltransferasa tras una inducción de 4 h de los cultivos con IPTG 1 mM. Se prepararon los extractos mediante sonicación y se llevaron a cabo las reacciones enzimáticas durante la noche a 32ºC.

Se sometió a ensayo la \beta-1,3-galactosiltransferasa usando GM2-FCHASE 0,2 mM, UDP-Gal 1 mM, Mes 50 mM pH 6, MnCl_{2} 10 mM y DTT 1 mM. Se sometió a ensayo la \beta-1,4-GalNAc transferasa usando GM3-FCHASE 0,5 mM, UDPGalNAc 1 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MnCl_{2} 10 mM. Se sometió a ensayo la \alpha-2,3-sialiltransferasa usando Lac-FCHASE 0,5 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MgCl_{2} 10 mM. Se sometió a ensayo la \alpha-2,8-sialiltransferasa usando GM3-FCHASE 0,5 mM, CMP-Neu5Ac 0,2 mM, Hepes 50 mM pH 7 y MnCl_{2} 10 mM.

Se diluyeron las mezclas de reacción apropiadamente con NaOH 10 mM y se analizaron mediante electroforesis capilar realizada usando las condiciones separación y detección tal como se describió anteriormente (Gilbert et al. (1996) J. BioL Chem. 271, 28271-28276). Se analizaron los picos de los electroferogramas usando integración de pico manual con el software P/ACE Station. Para la detección rápida de actividad de enzima, se examinaron muestras de las mezclas de reacción de transferasa mediante cromatografía en capa fina sobre placas de CCF de sílice-60 (E. Merck) tal como se describió anteriormente (Id.).

Espectroscopia de RMN

Se realizaron los experimentos de RMN en un espectrómetro de RMN Varian INOVA 600. La mayoría de los experimentos se realizó usando una sonda de resonancia triple de gradiente Z de 5 mm Z. Se prepararon muestras de RMN de 0,3-0,5 mg (200-500 nanomoles) de FCHASE-glucósido. Se disolvieron los compuestos en H_{2}O y se ajustó el pH a 7,0 con NaOH diluido. Tras liofilizar se disolvieron las muestras en 600 \mul de D_{2}O. Todos los experimentos de RMN se realizaron tal como se describió anteriormente (Pavliak et al. (1993) J. BioL Chem. 268: 14146-14152; Brisson et al. (1997) Biochemistry 36: 3278-3292) usando técnicas convencionales tales como COSY, TOCSY, NOESY, 1D-NOESY, 1D-TOCSY y HSQC. Para la referencia de desplazamiento químico de protón, se fijó la resonancia de metilo de acetona interna a 2,225 ppm (^{1}H). Para la referencia de desplazamiento químico deC, se fijó la resonancia de metilo de acetona interna a 31,07 ppm con relación al dioxano externo a 67,40 ppm. Los experimentos homonucleares fueron del orden de 5-8 horas cada uno. Se realizaron experimentos de NOESY 1D para GD3-FCHASE, [0,3 mM], con 8000 barridos y un tiempo de mezclado de 800 ms durante una duración de 8,5 h cada uno y de procesaron con un factor de ensanchamiento de línea de 2-5 Hz. Para la NOESY 1D de las resonancias a 4,16 ppm, se usaron 3000 barridos. Se usaron los siguientes parámetros para adquirir el espectro HSQC: retardo de relajación de 1,0 s, anchos espectrales en F_{2} y F_{1} de 6000 y 24147 Hz, respectivamente, tiempos de adquisición en t_{2} de 171 ms. Para la dimensión t_{1}, se adquirieron 128 puntos complejos usando 256 barridos por incremento. Se logró la discriminación de signo en F_{1} mediante el método de States. El tiempo de adquisición total fue de 20 horas. Para GM2-FCHASE, debido a las líneas anchas, el número de barridos por incremento se aumentó de modo que la HSQC se realizó durante 64 horas. Se obtuvo el espectro de fase sensible tras carga cero hasta 2048 x 2048 puntos. Se aplicaron funciones de ventana de Gauss no desplazadas en ambas dimensiones. Se trazaron los espectros de HSQC a una resolución de 23 Hz/punto en la dimensión de ^{13}C y de 8 Hz/punto en la dimensión de protón. Para la observación de los desdoblamientos en multipletes, se procesó otra vez la dimensión de ^{1}H a una resolución de 2 Hz/punto usando predicción linear hacia delante y una función de campana de seno al cuadrado desplazada \pi/4. Se adquirieron todos los datos de RMN usando secuencias convencionales de Varian proporcionadas con el software VNMR 5.1 o VNMR 6.1. Se usó el mismo programa para el procesamiento.

Se usó una sonda de nano-RMN de banda ancha de gradiente inverso (Varian) para realizar el experimento de NBC de gradiente (Bax y Summers (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 2093-2094; Parella et al. (1995) J. Mag. Reson. A 112, 241-245) para la muestra de GD3-FCHASE. La sonda de nano-RMN que es una sonda de rotación en ángulo mágico de alta resolución produce espectros de alta resolución de muestras liquidas disueltas en solamente 40 \mul (Manzi et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 9154-9163). Se preparó la muestra de GD3-FCHASE (masa = 1486,33 Da) liofilizando la muestra original de 0,6 ml (200 nanomoles) y disolviendo en 40 \mul de D_{2}O para una concentración final de 5 mM. El pH final de la muestra no pudo medirse.

El experimento de HMBC de gradiente se realizó a una velocidad de rotación de 2990 Hz, 400 incrementos de 1024 puntos complejos, 128 barridos por incremento, tiempo de adquisición de 0,21 s, ^{1}J (C, H) = 140 Hz y ^{n}J (C, H) = 8 Hz, para una duración de 18,5 h.

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Espectrometría de masas

Se obtuvieron todas la mediciones de masas usando un instrumento de Perkin-Elmer Biosystems (Fragmingham, MA) Elite-STRMALDITOF. Aproximadamente dos \mug de cada oligosacárido se mezcló con una matriz que contenía una solución saturada de ácido dihidroxibenzoico. Se adquirieron los espectros de masa positivo y negativo usando el modo reflector.

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Resultados Detección de actividades de glicosiltransferasa en cepas de C. jejuni

Antes de la clonación de los genes de glicosiltransferasa, se examinaron las células de OH4384 y NCTC 11168 de C. jejuni para diversas actividades enzimáticas. Cuando se detectó una actividad de enzima, se optimizaron las condiciones de ensayo (descritas en los Procedimientos Experimentales) para garantizar la actividad máxima. El ensayo de electroforesis capilar empleado fue extremadamente sensible y permitió la detección de la actividad enzimática en el intervalo de \muU/ml (Gilbert et al. (1996) J Biol. Chem. 271: 28271-28276). Se examinaron tanto la cepa secuenciada NCTC 11168 como la cepa asociada con GBS OH4384 para las enzimas requeridas para la síntesis de mimético de gangliósido GT1a. Tal como se había predicho, la cepa OH4384 tenía las actividades enzimáticas requeridas para la síntesis de esta estructura: \beta-1,4-N-acetilgalactosaminiltransferasa, \beta-1,3-galactosiltransferasa, \alpha-2,3-sialiltransferasa y \alpha-2,8-sialiltransferasa. El genoma de la cepa, NCTC 11168 no tenía las actividades \beta-1,3-galactosiltransferasa y \alpha-2,8-sialiltransferasa.

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Clonación de una \alpha-2,3-sialiltransferasa (cst-1) usando una estrategia de selección de actividad

Un biblioteca de plásmidos preparada a partir de una digestión parcial con HindIII no fraccionada del ADN cromosómico de OH4384 de C. jejuni dio 2.600 colonias blancas que se recogieron para formar grupos de 100. Se usó un protocolo de selección "divide y vencerás" a partir del cual de obtuvieron dos clones positivos y se denominaron pCJH9 (inserto de 5,3 kb, 3 sitiosde HindIII) y pCJH101 (inserto de 3,9 kb, 4 sitios de HindIII). El análisis de marco de lectura abierto (ORF) y la reacciones de PCR con ADN cromosómico de OH4384 de C. jejuni indicaron que pCJH9 contenía insertos que no eran contiguos en el ADN cromosómico. La secuencia en el sentido de 3' del nucleótido nº 1440 en pCJH9 no se estudió adicionalmente mientras que se encontraron que los primeros 1439 nucleótidos estaban completamente contenidos dentro de la secuencia de pCJH101. El análisis de ORF y las reacciones de PCR con ADN cromosómico indicaron que todos los fragmentos de HindIII de pCJH101 eran contiguos en el ADN cromosómico deOH4384 de C. jejuni.

Se encontraron cuatro ORF, dos parciales y dos completos, en la secuencia de pCJH101 (figura 2). Los primeros 812 nucleótidos codifican para un polipéptido que es idéntico en el 69% a los últimos 265 residuos de aa del factor de liberación de cadena peptídica RF-2 (gen prfB, GenBank, nºAE000537) de Helicobacter pylori. La última base del codón de terminación del factor de liberación de cadena también es la primera base del codón de iniciación ATG de un marco de lectura abierto que abarca los nucleótidos nº 812 a nº 2104 en pCJH101. Se designó este ORF cst-I ( Campylobacter sialiltransferasa I) y codifica para un polipéptido de 430 aminoácidos que es homólogo con un supuesto ORF de Haemophilus influenzae (GenBank, nº U32720). El supuesto ORF de H. influenzae codifica para un polipéptido de 231 aminoácidos que es idéntico en el 39% a la región central del polipéptido Cst I (residuos de aminoácidos nº 80 a nº 330). La secuencia en el sentido 3' de cst-I incluye un ORF y un ORF parcial que codifica para polipéptidos que son homólogos (> 60 % idéntico) con las dos subunidades, CysD y CysN, de la sulfato adenililtransferasa de E. coli (GenBank, nº AE000358).

Con el fin de confirmar que el ORF cst-I codifica para la actividad sialiltransferasa, se subclonó y se sobreexpresó en E. coli. Se usó la enzima expresada para añadir ácido siálico a Gal-\beta-1,4-Glc-\beta-FCHASE (Lac-FCHASE). Se analizó este producto (GM3-FCHASE) mediante RMN para confirmar la especificidad de enlace a Neu5Ac-\alpha-2,3-Gal de Cst-I.

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Secuenciación del locus de biosíntesis de LOS de OH4384 de C. jejuni

El análisis de los datos de secuencia preliminares disponibles en el sito web del grupo de secuenciación de NCTC 11168 de C. jejuni (Centro Sanger, RU (http://www.sanger.ac.uk/ Projects /C_jejuni/)) reveló que las dos heptosiltransferasas implicadas en la síntesis del núcleo interno del LPS eran fácilmente identificables mediante homología de secuencia con otras heptosiltransferasas bacterianas. La región entre las dos heptosiltransferasas abarca 13,49 kb en NCTC 11168 e incluye al menos siete posibles glicosiltranferasas basándose en búsquedas BLAST en GenBank. Dado que no se dispone de una estructura para el núcleo externo de LOS de NCTC 11168, fue imposible sugerir funciones para los supuestos genes de glicosiltransferasa en esa cepa.

Basándose en las regiones conservadas en las secuencias de heptosiltransferasas, se diseñaron cebadores (CJ-42 y CJ-43) para amplificar la región entre ellas. Se obtuvo un producto de PCR de 13,49 kb usando ADN cromosómico de NCTC 11168 de C. jejuni y un producto de PCR de 11,47 kb usando ADN cromosómico de OH4384 de C. jejuni. El tamaño del producto de PCR de la cepa NCTC 11168 concordó con los datos del Centro Sanger. El menor tamaño del producto de PCR de la cepa OH4384 indicó heterogeneidad entre las cepas en la región entre los dos genes de heptosiltransferasa y sugirió que los genes para algunas de las glicosiltranferasas específicas para la cepa OH4384 podrían estar presentes en esa localización. Se secuenció el producto de PCR de 11,47 kb usando una combinación de paseo con cebador y subclonación de fragmentos HindIII (GenBank, nº AF 130984). El contenido en G/C del ADN fue del 27%, típico de ADN de Campylobacter. El análisis de la secuencia reveló once ORF completos además de los dos ORF parciales que codifican para las dos heptosiltransferasas (figura 2, tabla 3). Cuando se compararon las secuencias de aminoácidos deducidas, se encontró que las dos cepas comparten seis genes que son idénticos en más del 80% y cuatro genes que son idénticos entre el 52 y el 68% (tabla 3). Cuatro genes son únicos para NCTC 11168 de C. jejuni mientras que un gen es único para OH4384 de C. jejuni (figura 2). Dos genes que están presentes como ORF separados (ORF nº 5a y nº 10a) en OH4384 de C. jejuni se encuentran en un ORF de fusión en marco (nº 5b/10b) en NCTC 11168 de C. jejuni.

TABLA 3

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Identificación de glicosiltranferasas de núcleo externo

Se prepararon varios constructos para expresar cada uno de los posibles genes de glicosiltransferasa ubicados entre las dos heptosiltransferasas de OH4384 de C. jejuni. El plásmido pCJL-09 contenía el ORF nº 5a y un cultivo de este constructo mostró actividad GalNAc transferasa cuando se sometió a ensayo usando GM3-FCHASE como aceptor. La GalNAc transferasa era específica para un aceptor sialilado dado que Lac-FCHASE fue un sustrato pobre (inferior al 2% de la actividad observada con GM3-FCHASE). El producto de reacción obtenido de GM3-FCHASE tenía la masa correcta tal como se determinó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, y el tiempo de elución idéntico en el tiempo en el ensayo CE tal como la GM2-FCHASE convencional. Considerando la estructura de la LPS de núcleo externo de OH4384 de C. jejuni, esta GalNAc transferasa (cgtA para Camplyobacter glicosiltransferasa A), tiene un especificidad \beta-1,4 para el residuo Gal terminal de GM3-FCHASE. La especificidad de enlace de CgtA se confirmó mediante el análisis de RMN de GM2-FCHASE (véase el texto a continuación, tabla 4). El papel in vivo de cgtA en la síntesis de un mimético de GM2 se confirma mediante el mutante de desactivación natural proporcionado por OH4382 de C. jejuni (figura 1). Con la secuenciación del homólogo cgtA de OH4382 de C. jejuni se encontró que una mutación de desplazamiento de marco (un tramo de siete A en vez de 8 A después de la base nº 71) que daría como resultado la expresión de una versión de cgtA truncada (29 aa en vez de 347 aa). La estructura de núcleo externo de LOS de OH4382 de C. jejuni concuerda con la ausencia de \beta-1,4-GlaNAc transferasa como el residuo de galactosa interno que se sustituye por ácido siálico solamente (Aspinall et al. (1994) Biochemistry 33, 241-249).

El plásmido pCJL-04 contenía el ORF nº 6a y un cultivo inducido con IPTG de este constructo mostró actividad galactosiltransferasa usando GM2-FCHASE como aceptor produciendo de este modo GM1a-FCHASE. Este producto era sensible a \beta-1,3-galactosidasa y se encontró que tiene la masa correcta mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Considerando la estructura del núcleo externo de LOS de OH4384 de C. jejuni, se sugiere que esta galactosiltransferasa (cgtB para Campylobacter glicosiltransferasa B) tiene especificidad \beta-1,3 para el residuo GalNAc terminal de GM2-FCHASE. La especificidad de enlace de CgtA se confirmó mediante el análisis de RMN de GM1a-FCHASE (véase el texto a continuación, tabla 4) que se sintetizó usando de modo secuencial Cst-I, CgtA y CgtB.

El plásmido pCJL-03 incluía el ORF nº 7a y un cultivo inducido con IPTG mostró actividad sialiltransferasa usando tanto Lac-FCHASE como GM3-FCHASE como aceptores. Esta segunda sialiltransferasa de OH4384 se designó cst-II. Cst-II mostró ser bifuncional dado que podía transferir ácido siálico \alpha-2,3 a la Gal terminal de Lac-FCHASE y también \alpha-2,8 al ácido siálico terminal de GM3-FCHASE. El análisis de RMN de un producto de reacción formado con Lac-FCHASE confirmó el enlace \alpha-2,3 del primer ácido siálico en la Gal, y el enlace \alpha-2,8 del segundo ácido siálico (véase el texto a continuación, tabla 4).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Desplazamientos químicos de RMN de protón^{a} para los derivados fluorescentes de los miméticos de gangliósido sintetizados usando las glicosiltranferasas clonadas

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Comparación de las sialiltransferasas

El papel in vivo de cst-II de OH4384 de C. jejuni en la síntesis de un mimético de gangliósido GT1a trisialilado está apoyado por la comparación con la cst-II homóloga de O:19 de C. jejuni (cepa serológica) que expresa el mimético de gangliósido GD1a disialilado. Hay 24 diferencias de nucleótidos que se traducen en 8 diferencias de aminoácido entre estas dos cst-II homólogas (figura 3). Cuando se expresa en E. coli, la cst-II homóloga de O:19 de C. jejuni (cepa serológica) tiene actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa pero actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa muy baja (tabla 5) lo que es consecuente con la ausencia de ácido siálico unido en \alpha-2,8- terminal en el núcleo externo de LOS (Aspinall et al. (1994) Biochemistry 33, 241-249) de O:19 de C. jejuni (cepa serológica). La cst-II homóloga de NCTC11168 de C. jejuni expresó una actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa mucho más baja que los homólogos de O:19 (cepa serológica) u OH4384 y actividad \alpha-2,8-sialiltransferasa no detectable. Se pudo detectar una banda inducible por IPTG sobre un gel de SDS-PAGE cuando se expresó cst-II de NCTC 11168 en E. coli (datos no mostrados). La proteína Cst-II de NCTC 11168 comparte solamente un 52% de identidad con los homólogos de O:19 (cepa serológica) u OH4384. No se pudo determinar si las diferencias de secuencia podrían ser responsables de la baja actividad expresada en E. coli.

Aunque se mapeó cst-I externamente al locus de biosíntesis de LOS, es obviamente homóloga a cst-II dado que sus primeros 300 residuos comparten un 44% de identidad con Cst-II de o bien OH4384 de C. jejuni o bien NCTC 11168 de C. jejuni (figura 3). Las dos Cst-II homólogas comparten un 52% de residuos idénticos entre sí y carecen de 130 aminoácidos C-terminales de Cst-I. Se encontró que una versión truncada de Cst-I que carecía de 102 aminoácidos en el extremo C-terminal era activa (datos no mostrados), lo que indica que el dominio C-terminal de Cst-I no es necesario para la actividad sialiltransferasa. Aunque los 102 residuos en el extremo C-terminal son prescindibles para la actividad enzimática in vitro, pueden interaccionar con otros componentes celulares in vivo o bien para fines regulatorios o bien para la ubicación celular apropiada. El bajo nivel de conservación entre las sialiltransferasas de C. jejuni es muy diferente del que se observó previamente para las \alpha-2,3-sialiltransferasas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae, en las que las lst transferasas son más del 90% idénticas en el nivel de proteína entre la dos especies y entre diferentes aislados de la misma especie (Gilbert et al., citado anteriormente).

TABLA 5 Comparación de la actividad de las sialiltransferasas de C. jejuni. Se expresaron las diversas sialiltransferasas en E. coli como proteínas de fusión con la proteína de unión a maltosa en el vector pCWori+ (Wakarchuk et al. (1994) Proteína. Sci. 3, 467-475). Se sometieron a ensayo los extractos sonicados usando 500 \muM de o bien Lac-FCHASE o bien GM3-FCHASE.

9

Análisis de RMN sobre cantidades nanomolares de los compuestos modelo sintetizados

Con el fin de evaluar apropiadamente la especificidad de enlace de una glicosiltransferasa identificada, se analizó su producto mediante espectroscopia de RMN. Con el fin de reducir el tiempo necesario para la purificación de los productos enzimáticos, se realizó el análisis de RMN sobre cantidades nanomolares. Todos los compuestos son solubles y dan resonancias agudas con anchuras de línea de unos pocos Hz dado que los dobletes anoméricos H-1 (J_{1,2} = 8 Hz) está bien resueltos. La única excepción es para GM2-FCHASE que tiene líneas amplias (\sim 10 Hz), probablemente debido a agregación. Para el espectro de protón de la solución de GD3-FCHASE 5 mM en la sonda nano-RMN, las anchuras de línea de las señales anoéricas fueron del orden de 4 Hz, debido al aumento de concentración. Además, se observaron picos adicionales, probablemente debido a degradación de la muestra con el tiempo. También hubo algunos ligeros cambios de desplazamiento químico, probablemente debido a un cambio en el pH tras concentrar la muestra desde 0,3 mM hasta 5 mM. Se obtuvieron los espectros de protón a diversas temperaturas con el fin de evitar el solapamiento de la resonancia HDO con las resonancias anoméricas. Tal como puede evaluarse a partir de los espectros de protón, todos los compuestos eran puros y las impurezas o productos de degradación que estaban presentes no interfirieron en el análisis de RMN que se realizó tal como se describió anteriormente (Pavliak et al. (1993) J. BioL Chem. 268, 14146-14152; Brisson et al. (1997) Biochemistry 36, 3278-3292).

Para todos los glucósidos FCHASE, estaban disponibles las asignaciones de ^{13}C de glucósidos similares (Sabesan y Paulson (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 2068-2080; Michon et al. (1987) Biochemistry 26, 8399-8405; Sabesan et al. (1984) Can. J. Chem. 62, 1034-1045). Para los glucósidos FCHASE, se verificaron las asignaciones de ^{13}C asignando en primer lugar el espectro de protón a partir de experimentos 2D homonucleares convencionales, COSY, TOCSY y NOESY, y luego verificando las asignaciones de ^{13}C a partir de un experimento HSQC, que detecta las correlaciones C-H. El experimento HSQC no detecta carbonos cuaternarios como C-1 y C-2 de ácido siálico, pero el experimento HMBC si. Principalmente para las resonancias de Glc, los desplazamientos químicos de protón obtenidos a partir de espectros HSQC diferían de los obtenidos a partir de experimentos homonucleares debido al calentamiento de la muestra durante el desacoplamiento deC. A partir de una serie de espectro de protón obtenido a temperaturas diferentes, se encontró que los desplazamientos químicos del residuo Glc eran los más sensibles a la temperatura. En todos los compuestos, las resonancias de H-1 y H-2 de Glc cambiaron en 0,004 ppm/ºC, las de H-1 de Gal(1-4) en 0,002 ppm/ºC, y en menos de 0,001 ppm/ºC para las de H-3 de Neu5Ac y otras resonancias anoméricas. Para LAC-FCHASE, la resonancia de H-6 de Glc cambió en 0,008 ppm/ºC.

Se atribuye el coeficiente de temperatura grande para las resonancias de Glc a desplazamientos de anillo corrientes inducidos por el enlace al grupo aminofenilo de FCHASE. Se midió la temperatura de la muestra durante el experimento HSQC a partir del desplazamiento químico de las resonancias de H-1 y H-2 de Glc. Para GMIa-FCHASE, la temperatura cambió desde 12ºC hasta 24ºC debido a presencia del contraión Na+ en la solución y se usó NaOH para ajustar el pH. Otras muestras tuvieron calentamientos menos severos (< 5ºC). En todos los caso, los cambios de desplazamientos químicos de protón con la temperatura no provocaron ningún problema en las asignaciones de las resonancias en el espectro HSQC. En la tabla 4 y la tabla 6, todos los desplazamientos químicos se toman a partir de los espectros HSQC.

El sitio de enlace en el aglicón se determinó principalmente a partir de una comparación de los desplazamientos químicos de ^{13}C del producto enzimático con los del precursor para determinar los desplazamientos de glucosidación tal como se hizo anteriormente para diez sialiloligosacáridos (Salloway et al. (1996) Infect. Immun. 64, 2945-2949). En el presente documento, en vez de comparar los espectros de ^{13}C, se comparan los espectros HSQC, dado que se necesitaría cien veces más material para obtener un espectro de ^{13}C. Cuando se comparan los desplazamientos químicos de ^{13}C a partir de los espectros HSQC del compuesto precursor con los del producto enzimático, el desplazamiento a campo bajo principal se produce siempre en el sitio de enlace mientras que otros desplazamientos químicos del precursor no cambian sustancialmente. Las diferencias de desplazamiento químico de protón son mucho más susceptibles a efectos conformacionales de larga distancia, preparación de la muestra y temperatura. Puede identificarse rápidamente la identidad del nuevo azúcar añadido a partir de una comparación de sus desplazamientos químicos de ^{13}C con los de monosacáridos o cualquier residuo terminal, dado que solamente el desplazamiento químico anomérico del glicón cambia sustancialmente tras la glucosidación (Sabesan y Paulson, citado anteriormente).

También se usa el acoplamiento spin-spin de protón vecinal (J_{HH}) obtenido a partir de experimentos ID TOCSY o ID NOESY para determinar la identidad del azúcar. Se hacen experimentos NOE para secuenciar los azúcares mediante la observación de los NOE entre los protones de glicón anoméricos (H-3 para ácido siálico) y las resonancias de protón de aglicón. El NOE más largo está normalmente en el protón de enlace pero también pueden producirse otros NOE en resonancias de protón de aglicón que están próximas al sitio de enlace. Aunque a 600 MHz los NOE de muchos tetra y pentasacáridos son positivos o muy pequeños, todos estos compuestos dieron buenos NOE negativos con un tiempo de mezclado de 800 ms, probablemente debido a la presencia del resto de FCHASE grande.

Para la Lac-FCHASE sintética, se confirmaron las asignaciones de ^{13}C para el resto de lactosa de Lac-FCHASE mediante los métodos 2D explicados anteriormente. Se asignaron todas las resonancias de protón de la unidad de Glc a partir de un experimento 1D-TOCSY en la resonancia de H-1 de Glc con un tiempo de mezclado de 180 ms. Se usó un experimento 1D-TOCSY para H-1 de Gal para asignar las resonancias de H-1 a H-4 de la unidad de Gal. Los H-5 y H-6 restantes de la unidad de Gal se asignaron entonces a partir de un experimento HSQC. Los valores de acoplamiento spin-spin vecinal (J_{HH}) para las unidades de azúcar estaban de acuerdo con los datos anteriores (Michon et al., citado anteriormente). Los desplazamientos químicos para el resto de FCHASE se han facilitado anteriormente (Gilbert et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28271-28276).

La determinación masa precisa del producto enzimático de Cst-I de Lac-FCHASE era consecuente con la adición de ácido siálico al aceptor Lac-FCHASE (figura 4). Se identificó el producto como GM3-FCHASE dado que el espectro de protón y los desplazamientos químicos de ^{13}C del resto de azúcar del producto (tabla 6) fueron bastante similares a aquellos para la sialillactosa u oligosacárido GM3 (\alphaNeu5Ac(2-3)\betaGal(1-4)\betaGlc; Sabesan y Paulson, citado anteriormente). Se asignaron las resonancias de protón de GM3-FCHASE a partir del espectro COSY, el espectro HSQC y la comparación de los desplazamientos químicos de ^{13}C y protón con los de \alphaNeu5Ac(2-3)\betaGal(1-4)\betaGlcNAc-FCHASE (Gilbert et al., citado anteriormente). Para estos dos compuestos, los desplazamientos químicos de ^{13}C y protón para los residuos Neu5Ac y Gal estaban dentro de las bandas de error entre sí (Id.). A partir de una comparación de los espectros HSQC de Lac-FCHASE y GM3-FCHASE, es obvio que el sitio de enlace está en el C-3 de Gal debido al desplazamiento a campo bajo grande para H-3 de Gal y C-3 de Gal tras la sialilación típica para (2-3) sialiloligosacáridos (Sabesan y Paulson, citado anteriormente). Además, tal como se observó anteriormente para \alphaNeu5Ac(2-3)\betaGa1(1-4)\betaGlcNAc-FCHASE (Gilbert et al., citado anteriormente), se observó el NOE desde H-3_{ax} de ácido siálico hasta H-3 de Gal, típico del enlace \alphaNeu5Ac(2-3)Gal.

TABLA 6 Comparación de los desplazamientos químicos de ^{15}C para los glucósidos^{a} FCHASE con los observados para lactosa^{b} (Sabesan y Paulson, citado anteriormente), oligosacáridos^{b} de gangliósido (Id, Sabesan et al. (1984) Can. J. Chem. 62, 1034-1045) y (-8NeuAc2-)_{3} (Michon et al. (1987) Biochemistry 26, 8399-8405). Los desplazamientos químicos en los sitios glicosidación están subrayados

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La determinación precisa de la masa del producto enzimático de Cst-II de Lac-FCHASE indicó que se han añadido dos ácido siálicos al aceptor Lac-FCHASE (figura 4). Se asignaron las resonancias de protón a partir de COSY, 1D-TOCSY y 1D-NOESY y la comparación de desplazamientos químicos con estructuras conocidas. Se asignaron las resonancias de H-1 a H-6 de Glc y de H-1 a H-4 de Gal a partir de 1D-TOCSY en las resonancias de H-1. Se asignaron las resonancias de Neu5Ac a partir de COSY y confirmaron mediante 1D-NOESY. Se usó el 1D-NOESY de las resonancias de Neu5Ac H-8, H-9 a 4,16 ppm para localizar las resonancias de los H-9 y H-7 (Michon et al, citado anteriormente). El aspecto de singlete de la resonancia de H-7 de Neu5Ac (2-3) que aparece a partir de constantes de acoplamiento vecinales pequeñas es típico del enlace 2-8 (íd.). Se asignaron las otras resonancias a partir del espectro HSQC y las asignaciones de ^{13}C para ácido siálico terminal (íd.). Los desplazamientos químicos de protón y carbono ^{13}C de la unidad Gal fueron similar a los de GM3-FCHASE, indicando la presencia del enlace \alphaNeu5Ac(2-3)Gal. Los valores de J_{HH}, desplazamientos químicos de protón y ^{13}C de los dos ácido siálicos fueron similares a los de \alphaNeu5Ac(2-8)Neu5Ac en el trisacárido Neu5Ac unido con \alpha(2-8) (Salloway et al. (1996) Infect. Immun. 64, 2945-2949) indicando la presencia de este enlace. Por tanto, se identificó el producto como GD3-FCHASE. La sialilación en C-8 de Neu5Ac produjo un desplazamiento a campo bajo de - 6,5 ppm en sus resonancia de C-8 desde 72,6 ppm hasta 79,1 ppm.

Los NOE interresiduo para GD3-FCHASE también fueron típicos de la secuencia \alphaNeu5Ac(2-8)\alphaNeu5Ac(2-3)\betaGal. Los mayores NOE ente residuos de las dos resonancias de H-3_{ax} a 1,7 - 1,8 ppm de NeuSAc(2-3) y Neu5Ac(2-8) son para las resonancias de H-3 de Gal y H-8 de -8)Neu5Ac. También se observaron los menores NOE interresiduo para H-4 de Gal y H-7 de -8)Neu5Ac. También se observaron los NOE en resonancias de FCHASE debido al solapamiento de una resonancia de FCHASE con las resonancias de H-3_{ax} (Gilbert et al., citado anteriormente). También se observó el NOE interresiduo de H-3_{eq} de NeuSAc(2-3) para H-3 de Gal. Además, los intra-residuos confirmaron las asignaciones de protón. Los NOE para el enlace 2-8 son los mismos que los observados para el polisacárido -8Neu5Aca2- (Michon et al., citado anteriormente).

También pudieron confirmarse los enlaces glicosídicos de ácido siálico mediante el uso del experimento HMBC que detecta correlaciones ^{3}J (C, H) a través del enlace glicosídico. Los resultados tanto para los enlaces \alpha-2,3 como \alpha-2,8 indican que las correlaciones ^{3}J(C, H) entre las dos resonancias de C-2 anoméricos de Neu5Ac y resonancias de H-8 de Gal y H-3 de -8)Neu5Ac. También se observaron las correlaciones intra-residuo para las resonancias de H-3_{ax} y H-3_{eq} de los dos residuos Neu5Ac. También se observó la correlación (C-1, H-2) de Glc dado que hubo solapamiento parcial de los picos cruzados a 101 ppm con los picos cruzados a 100,6 ppm en el espectro HMBC.

La determinación precisa de la masa del producto enzimático de CgtA de GM3-FCHASE indicó que se ha añadido una unidad de hexosa N-acetilada al aceptor GM3-FCHASE (figura 4). Se identificó el producto como GM2-FCHASE dado que los desplazamientos químicos de protón y ^{13}C del glicósido fueron similares a los del oligosacárido GM2 (GM2OS) (Sabesan et al. (1984) Can. J. Chem. 62, 1034-1045). A partir del espectro HSQC para GM2-FCHASE y la integración de su espectro de protón, hay ahora dos resonancias a 4,17 ppm y 4,18 ppm junto con un "d1" anomérico nuevo y dos grupos NAc a 2,04 ppm. A partir de los experimentos TOCSY y NOESY, la resonancia a 4,18 ppm se asignó inequívocamente al H-3 de Gal debido a un NOE fuerte entre H-1 y H-3. Para \beta-galactopiranosa, se observaron NOE intra-residuo fuertes entre H-1 y H-3 y H-1 y H-5 debido a la posición axial de los protones y sus cortas distancias entre protones (Pavliak et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14146-14152; Brisson et al. (1997) Biochemistry 36, 3278-3292; Sabesan et al. (1984) Can. J. Chem. 62, 1034-1045). A partir del espectro TOCSY y la comparación de los desplazamientos químicos de H 1 de GM2-FCHASE y GM20S (Sabesan et al., citado anteriormente) la resonancia a 4,17 ppm se asigna como H-4 de Gal. De manera similar, a partir de los espectros TOCSY y NOESY, se asignaron los H-1 a H-5 de GalNAc y Glc, y los H-3 a H-6 de NeuSAc. Debido a las líneas anchas, no pudo observarse el patrón de multiplete de las resonancias. Se asignaron las otras resonancias a partir de la comparación con el espectro HSQC del precursor y las asignaciones de ^{13}C para GM2OS (Sabesan et al., citado anteriormente). Comparando los espectros HSQC para los glucósidos GM3- y GM2-FCHASE, se produjo un desplazamiento a campo bajo de -9,9 ppm entre el precursor y el producto en la resonancia de C-4 de Gal. Junto con los NOE intra-residuo para H-3 y H-5 de \betaGalNAc, también se observó el NOE interresiduo de H-1 de GaINAc para H-4 de Gal a 4,17 ppm confirmando la secuencia de \betaGalNAc(1-4)Gal. Los NOE observados fueron los esperados a partir de las propiedades conformacionales del gangliósido GM2 (Sabesan et al., citado anteriormente).

La determinación precisa de la masa del producto enzimático de CgtB de GM2-FCHASE indicó que se ha añadido una unidad de hexosa al aceptor GM2-FCHASE (figura 4). Se identificó el producto como GM1a-FCHASE dado que los desplazamientos químicos de ^{13}C del glicósido fueron similares a los del oligosacárido GM1a (íd.). Se asignaron las resonancias de protón a partir de COSY, 1D-TOCSY y 1D-NOESY. A partir de un 1D-TOCSY en la resonancia "e1" adicional del producto, se observaron cuatro resonancias con un patrón de multiplete típico de \beta-galactopiranosa. A partir de un 1D-TOCSY y 1D-NOESY con las resonancias de H-1 de \betaGalNAc, se asignaron las resonancias de H-1 a H-5. El patrón de multiplete de H-1 a H-4 de \betaGalNAc fue típico de la configuración de \beta-galactopiranosilo, confirmando la identidad de este azúcar para GM2-FCHASE. Quedó claro que en la glicosidación, las principales perturbaciones se produjeron para las resonancias de \betaGalNAc, y hubo un desplazamiento a campo bajo de -9,1 ppm entre el aceptor y el producto en la resonancia de C-3 de GaINAc. Además, junto con los NOE intra-residuo para H-3, H-5 de Gal, se observaron un NOE interresiduo de H-1 de Gal a H-3 de GalNAc y uno menor para H-4 de GalNAc, confirmando la secuencia de \betaGal(1-3)GalNAc. Los NOE observados fueron los esperados a partir de las propiedades conformacionales del gangliósido GM1a (Sabesan et al., citado anteriormente).

Hubo cierta discrepancia con la asignación de las resonancias de C-3 y C-4 de \betaGal(1-4) en GM20S y GM10S que se revertieron a partir los datos publicados (Sabesan et al., citado anteriormente). Anteriormente, las asignaciones se basaban en la comparación de desplazamientos químicos de ^{13}C con compuestos conocidos. Para GM1a-FCHASE, la asignación para H-3 de Gal(1-4) se confirmó observando su gran acoplamiento vecinal, J_{2,3} = 10 Hz, directamente en el espectro HSQC procesado con 2 Hz/punto en la dimensión de protón. El multiplete de H-4 es mucho más estrecho (< 5 Hz) debido a la posición ecuatorial de H-4 en la galactosa (Sabesan et al., citado anteriormente). En la tabla 6, las asignaciones de C-4 y C-6 de uno de los ácidos siálicos en (-8Neu5Ac2-)_{3} también tuvo que revertirse (Michon et al., citado anteriormente) tal como se confirmó a partir de las asignaciones de H-4 y H-6.

Los desplazamientos químicos de ^{13}C de los glucósidos FCHASE obtenidos a partir de los espectros HSQC estaban en buena concordancia con los de los oligosacáridos de referencia mostrados en la tabla 6. Se observaron diferencias de más de 1 ppm para algunas resonancias y éstas se deben a diferentes aglicones en el extremo reductor. Excluyendo estas resonancias, los promedios de las diferencias en los desplazamientos químicos entre los glucósidos FCHASE y su compuesto de referencia fueron inferiores a \pm 0,2 ppm. Por tanto, la comparación de desplazamientos químicos de protón, valores de J_{HH} y desplazamientos químicos de ^{13}C con estructuras conocidas, y el uso de NOE o HMBC se usaron todos para determinar la especificidad de enlace para diversas glicosiltranferasas. La ventaja de usar espectros HSQC es que la asignación de protones puede verificarse de modo independiente para confirmar la asignación de las resonancias de ^{13}C de los átomos en el sitio del enlace. En cuanto a la sensibilidad, los NOE de protón son los más sensibles, seguido por los HSQC luego los HMBC. Usando una nanosonda de RMN en vez de una sonda de RMN de 5 mm con la misma cantidad de material redujo considerablemente el tiempo de adquisición total, haciendo posible la obtención de un experimento HMBC durante la noche.

Discusión

Con el fin de clonar las LOS glicosiltransferasas de C. jejuni, se empleó una estrategia de selección de actividad similar a la que se usó previamente para clonar la \alpha-2,3-sialiltransferasa de Neisseria meningitidis (Gilbert et al., citado anteriormente). La estrategia de selección de actividad proporcionó dos clones que codificaban para dos versiones del mismo gen de \alpha-2,3-sialiltransferasa (cst-I). El análisis del ORF sugería que un polipéptido de 430 residuos es responsable de la actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa. Para identificar otros genes implicados en la biosíntesis de LOS, se comparó un locus de biosíntesis de LOS en la secuencia del genoma completo de NCTC 11168 de C. jejuni con el locus correspondiente de OH4384 de C. jejuni. Se identificaron y analizaron los marcos de lectura abiertos completos. Varios de los marcos de lectura abiertos se expresaron individualmente en E. coli, incluyendo una \beta-1,4-N-acetilgalactosaminil-transferasa (cgtA), una \beta-1,3-galactosiltransferasa (cgtB) y una sialiltransferasa bifuncional (cst-II).

La síntesis in vitro de derivados fluorescentes de cantidades nanomolares de miméticos de gangliósido y su análisis por RMN confirmaron inequívocamente la especificidad de enlace de las cuatro glicosiltransferasas clonadas. Basándose en estos datos, se sugiere que la ruta descrita en la figura 4 se usa por OH4384 de C. jejuni para sintetizar un mimético de GT1 a. Este papel para cgtA está apoyado adicionalmente por el hecho de que OH4342 de C. jejuni, que porta una versión inactiva de este gen, no tiene \beta-1,4-GalNAc en su núcleo externo de LOS (figura 1). El gen cst-II de OH4384 de C. jejuni mostraba tanto \alpha-2,3- como \alpha-2,8-sialiltransferasa en un ensayo in vitro mientras que cst-II de O:19 (cepa serológica) de C. jejuni mostraba sólo actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa (tabla 5). Esto está de acuerdo con un papel para cst-II en la adición de un ácido siálico unido en \alpha-2,8 terminal en OH4382 y OH4384 de C. jejuni, que tienen ambos genes cst-II idénticos, pero no en O:19 (cepa serológica, véase la figura 1) de C. jejuni. Hay 8 diferencias de aminoácidos entre los homólogos de Cst-II de O:19 (cepa serológica) y OH4382/84 de C. jejuni.

La bifuncionalidad de cst-II puede tener un impacto en el resultado de la infección por C. jejuni ya que se ha sugerido que la expresión del epítopo disialilado terminal puede estar implicada en el desarrollo de complicaciones neuropáticas tales como el síndrome de Guillain-Barré (Salloway et al. (1996) Infect. Immun. 64, 2945-2949). También merece la pena mencionar que su actividad bifuncional es novedosa entre las sialiltransferasas descritas hasta el momento. Sin embargo, se ha descrito una actividad glicosiltransferasa bifuncional para la ácido 3-desoxi-D-mano-octulosónico transferasa de E. coli (Belunis, C. J., y Raetz, C. R. (1992) J. Biol. Chem. 267, 9988-9997).

La actividad mono/bifuncional de cst-II y la activación/inactivación de cgtA parecen ser dos formas de mecanismos de variación de fase que permiten a C. jejuni preparar diferentes hidratos de carbono superficiales que se presentan al huésped. Además de aquellas alteraciones génicas pequeñas que se encuentran entre las tres cepas O:19 (cepa serológica, OH4382 y OH4384), hay transposiciones genéticas importantes cuando se comparan los loci entre OH4384 y NCTC 11168 de C. jejuni (una cepa O:2). Excepto para el gen prfB, el locus cst-I (incluyendo cysN y cysD) se encuentra sólo en OH4384 de C. jejuni. Hay diferencias significativas en la organización del locus de biosíntesis de LOS entre las cepas OH4384 y NCTC 11168. Algunos de los genes se conservan bien, algunos se conservan mal mientras que otros son únicos para una cepa o para la otra. Dos genes que están presentes como ORF separados (nº 5a: cgtA y nº 10a: NeuA) en OH4384 se encuentran como un ORF de fusión en marco en NCTC 11168 (ORF nº 5b/nº 10b). Se detectó actividad \beta-N-acetilgalactosaminiltransferasa en esta cepa, lo que sugiere que al menos la parte cgtA de la fusión puede ser activa.

En resumen, este ejemplo describe la identificación de varios marcos de lectura abiertos que codifican para enzimas implicadas en la síntesis de lipooligosacáridos en Campylobacter.

<110> National Research Council of Canada

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<120> GLICOSILTRANSFERASAS DE CAMPYLOBACTER PARA LA BIOSÍNTESIS DE GANGLIÓSIDOS Y MIMÉTICOS DE GANGLIÓSIDO

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<130> 40330-1569

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<140> Documento PCT/CAOO/0086

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<141> 01/02/2000

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<150> Documento US 60/119.218

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<151> 01/02/1999

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<160> 25

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 11474

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<212> ADN

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<213> Campylobacter jejuni

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 876

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<212> ADN

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<213> Campylobacter jejuni

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<400> 2

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17

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<210> 3

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<211> 291

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<212> PRT

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<213> Campylobacter jejuni

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<400> 3

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18

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<210> 4

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<211> 876

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<212> ADN

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<213> Campylobacter jejuni

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<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1044

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 906

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 912

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

38

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 389

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

51

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Gilbert, Michel

\hskip1cmWakarchuk, Warren W.

\hskip1cmNational Research Council of Canada

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 019633-0001400PC

\vskip0.400000\baselineskip

<140> Documento WO PCT/CAOO/00086

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 01/02/2000

\vskip0.400000\baselineskip

<150> Documento US 60/118.213

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 01/02/1999

\vskip0.400000\baselineskip

<150> Documento US 09/495.406

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 31/01/2000

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11474

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Producto de PCR de 11,5 kb de OH4384 de C. jejuni que incluye el locus de biosíntesis de LOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

58

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(876)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sialiltransferasa II de Campylobacter (cstII) alfa-2,3/alfa-2,8-sialiltransferasa bifuncional de la cepa OH4384 de C. jejuni (ORF 7a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(876)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sialiltransferasa II de Campylobacter (cstII) alfa-2,3/alfa-2,8-sialiltransferasa bifuncional del serotipo O:10 de C. jejuni (ORF 7a del locus de biosíntesis de LOS)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(876)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Alfa-2,3/alfa-2,8-sialiltransferasa II de Campylobacter (cstII) del serotipo O:41 de C. jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(876)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Alfa-2,3/alfa-2,8-sialiltransferasa II de Campylobacter (cstII) de O:19 de C. jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Alfa-2,3/alfa-2,8-sialiltransferasa II de Campylobacter (CstII) de la cepa NCTC 11168 de C. jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glicosiltransferasa de la cepa OH4384 de C. jejuni (ORF 4a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1044

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1044)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Beta-1,4-N-acetilgalactosaminil (GalNAc) transferasa de la cepa OH4384 de C. jejuni (ORF 5a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 906

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(906)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Beta-1,3-galactosiltransferasa de la cepa OH4384 de C. jejuni (ORF 6a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 912

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(912)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glicosiltransferasa B de Campylobacter (cgtB) beta-1,3-galactosiltransferasa del serotipo O:2 de C. jejuni (cepa NCTC 11168)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aciltransferasa de biosíntesis de lípido A de OH4384 de C. jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glicosiltransferasa de OH4384 de C. jejuni (ORF3a del locus de biosíntesis de LOS)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 389

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glicosiltransferasa de OH4384 de C. jejuni (ORF 4a del locus de biosíntesis de LOS)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ácido siálico sintasa de OH4384 de C. jejuni (ORF 8a del locus de biosíntesis de LOS)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enzima implicada en la biosíntesis de ácido siálico de OH4384 de C. jejuni (ORF 9a del locus de biosíntesis de LOS)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CMP-ácido siálico sintetasa de OH4384 de C. jejuni (ORF 10a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Acetiltransferasa de OH4384 de C. jejuni (ORF 11a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glicosiltransferasa de OH4384 de C. jejuni (ORF 12a del locus de biosíntesis de LOS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ42 en heptosiltransferasa-II usado para amplificar el locus de biosíntesis de núcleo de LPS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ43 en heptosiltransferasa-I usado para amplificar el locus de biosíntesis de núcleo de LPS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ-106 en 3' usado para amplificar y clonar el ORF 5a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ-157 en 5' usado para amplificar y clonar el ORF 5a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ-105 en 3' usado para amplificar y clonar el ORF 6a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ-133 en 5' usado para amplificar y clonar el ORF 6a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ-131 en 5' usado para amplificar y clonar el ORF 7a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador CJ-132 en 3' usado para amplificar y clonar el ORF 7a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Campylobacter jejuni

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Alfa-2,3-sialiltransferasa I de Campylobacter (cstI) de OH4384 de C. jejuni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Haemophilus influenzae

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ORF supuesto de GenBank nº U32720

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

111

112

Claims

1. Método para producir un oligosacárido que comprende un residuo de galactosa, comprendiendo el método poner en contacto un sacárido aceptor con una UDP-galactosa y un polipéptido de \beta-1,3-galactosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 75% a SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud, en el que el polipéptido de \beta-1,3-galactosiltransferasa transfiere el residuo de galactosa desde la UDP-galactosa hasta el sacárido aceptor para formar el oligosacárido que comprende un residuo de galactosa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 80% a SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17.

4. Método para producir un oligosacárido que comprende un residuo de GalNAc, comprendiendo el método poner en contacto un sacárido aceptor con un UDP-GalNAc y un polipéptido de \beta-1,4-GalNAc transferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 77% a SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud, en el que el polipéptido de \beta-1,4-GalNAc transferasa transfiere el residuo de GalNAc desde el UDP-GalNAc hasta el sacárido aceptor para formar el oligosacárido que comprende un residuo de GalNAc.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 80% a SEQ ID NO: 13.

6. Método según la reivindicación 4, en el que la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 13.

7. Método para producir un oligosacárido que comprende un residuo de ácido siálico, comprendiendo el método poner en contacto un sacárido aceptor con un donador de ácido siálico y un polipéptido de sialiltransferasa con actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa, en el que el polipéptido de sialiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 66% a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud, en el que el polipéptido de sialiltransferasa transfiere el residuo de ácido siálico desde el donador de ácido siálico hasta el sacárido aceptor para formar el oligosacárido que comprende un residuo de ácido siálico.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 80% a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10.

9. Método según la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10.

10. Método según la reivindicación 1, 4 o 7, en el que el oligosacárido es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un gangliósido, un lisogangliósido, un mimético de gangliósido, un mimético de lisogangliósido y partes de hidrato de carbono de estas moléculas.

11. Método según la reivindicación 1, 4 o 7, en el que el oligosacárido está unido a un miembro seleccionado del grupo que consiste en una proteína, una glicoproteína, un lípido o un proteoglicano.

12. Molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a): un polipéptido que tiene actividad aciltransferasa de biosíntesis de lípido A, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 70%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 350-1234 (ORF 2a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

b): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 70%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1234-2487 (ORF 3a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

c): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 50%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 a lo largo de una región de al menos 100 aminoácidos de longitud;

d): un polipéptido que tiene actividad \beta-1,4-GalNAc transferasa, en el que el polipéptido de GalNAc transferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 77%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;

e): un polipéptido que tiene actividad \beta-1,3-galactosiltransferasa, en el que el polipéptido de galactosiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 75%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;

f): un polipéptido que tiene actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa, en el que el polipéptido de sialiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 66%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a lo largo de una región de al menos 60 aminoácidos de longitud a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una o más de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 10;

g): un polipéptido que tiene actividad ácido siálico sintasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 70%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO:1;

h): un polipéptido que tiene actividad de biosíntesis de ácido siálico, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 70%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 8021-9076 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

i): un polipéptido que tiene actividad CMP-ácido siálico sintetasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 65%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9076-9738 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;

j): un polipéptido que tiene actividad acetiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 65%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 9729-10559 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1; y

k): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 65%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por un complemento inverso de los nucleótidos 10557-11366 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1.

13. Polipéptido aislado o producido de manera recombinante seleccionado del grupo que consiste en:

c): un polipéptido que tiene actividad glicosiltransferasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 70%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2786-3952 (ORF 4a) del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 a lo largo de una región de al menos 100 aminoácidos de longitud;

d): un polipéptido que tiene actividad \beta-1,4-GaINAc transferasa, en el que el polipéptido de GaINAc transferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 77%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;

e): un polipéptido que tiene un polipéptido de \beta-1,3-galactosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 75%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 a lo largo de una región de al menos 50 aminoácidos de longitud;

f): un polipéptido que tiene actividad \alpha-2,3-sialiltransferasa, en el que el polipéptido de sialiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 66%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 10 a lo largo de una región de al menos 60 aminoácidos de longitud;

g): un polipéptido que tiene actividad ácido siálico sintasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 70%, preferiblemente al menos en un 80%, más preferiblemente al menos en un 90%, lo más preferiblemente al menos en un 95%, a una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 6924-7961 del locus de biosíntesis de LOS de la cepa OH4384 de C. jejuni tal como se muestra en SEQ ID NO: 1;