DE69722214T2

DE69722214T2 - Salze von anionischen komplexen ru(iii), als antimetastatische und antineoplastische mittel

Info

Publication number: DE69722214T2
Application number: DE69722214T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Mestroni; Enzo Alessio; Gianni Sava
Original assignee: Sigea SRL
Current assignee: Sigea SRL
Priority date: 1996-07-02
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: EP0915895A1; US6221905B1; AU3439497A; ITMI961359A1; EP0915895B1; AU716220B2; ES2198580T3; DE69722214D1; JP4042919B2; JP2000514424A; WO1998000431A1; AR007690A1; CA2259478C; ITMI961359A0; ATE240963T1; CA2259478A1; IT1284101B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Salze von anionischen Komplexen von Ru(III) mit Ammoniumkationen, die insbesondere als antimetastatische und antineoplastische Mittel geeignet sind.
Stand der Technik
Die Entdeckung der antineoplastischen Eigenschaften von Cisplatin (cis-Diamino-dichlorplatin(II)), das bis jetzt weit verbreitet sowohl als Antitumormono- und Polychemotherapie verwendet wurde, hat das Interesse an einer Untersuchung der Antitumoraktivität der metalloorganischen Komplexe geweckt. Wie bei vielen Antitumormitteln ist die Spezifität der Wirkung von Cisplatin auf Neoplasmen gerichtet, die spezifische Gebiete befallen (Hoden, Eierstöcke, Blase, Kopf-Nacken), während andere Tumorarten, wie z. B. die in der Lunge und der Brust lokalisierten und der kolon-reaktale Tumor, gegenüber der Behandlung mit diesem Arzneimittel fast unempfindlich sind (C. F. J. Barnard et al., Chemistry in Britain, 1001-1004, 1986).
Auf diese Weise richtet sich die Forschung auf dem Gebiet der Koordinationskomplexe auf die Entwicklung neuer Arzneimittel, enthaltend Pt und/oder andere Übergangselemente, die sowohl die Vergrößerung des Verwendungsspektrums als auch das Erreichen von Toxizitätniveaus ermöglichen, die niedriger sind als die der Antitumormittel, die auf dem Gebiet der Technik bekannt sind.
Die Möglichkeit der Verwendung von Ruthenium als Antitumormittel als Alternative zu Platin wurde für Komplexe von Ru(II) untersucht, z. B. cis-Ru(II)-tetrakisdimethylsulfoxid (T. Giraldi et al., Cancer Res., 37, 2662, 1977) und in letzter Zeit für neutrale Komplex von Ru(III), wie z. B. fac-[RuCl₃(NH₃)₃] (M. J. Clarke, Metal Ions in Biological Systems, 11(5), 231-281, 1980, Helmut Sigel Hrsg.).
Weiterhin wurden mehrere anionische Komplex von Ru(III) mit 5-gliedrigen Heterocyclen hergestellt, insbesondere Imidazolium-bis-imidazoltetrachlor-ruthenat(III)) (B. K. Keppler et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 111: 166-168, 1986).
Kürzlich wurden einige Ru(III)-Komplexe mit DMSO entwickelt; insbesondere beschreibt die WO 90/13553 einige Ru(III)-Komplexe mit der Formel (i): [Ru(R_xR_ySO)(Cl₃)AB] (i) worin R_xR_ySO ein Sulfoxid, vorzugsweise Dimethylsulfoxid ist, A ist ein Sulfoxid oder ein Chlorid und B ist ein Stickstoffligand, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniak, primären, sekundären und tertiären Aminen und Heterocyclen, enthaltend Stickstoffatome.
Diese Komplex, die als antineoplastische Mittel verwendet werden können, sind neutral, wenn A ein Sulfoxid ist, während sie eine negative Ladung besitzen, wenn A ein Chlorid ist; in dem letzteren Fall werden die anionischen Komplex in Form der korrespondierenden Salze mit Alkali- und Erdalkalikationen und vorzugsweise Natrium isoliert.
Trotz ihrer antimetastatischen Aktivität zeigen die oben erwähnten Komplexe einige ernsthafte Nachteile, die ihre Verabreichung und Formulierung in adäquaten therapeutischen Zusammensetzungen extrem schwierig machen. Tatsächlich enthielten diese anionischen Komplexe, wenn sie in Form von Natriumsalzen isoliert wurden, immer zwei Lösungsmittelmoleküle der Kristallisation und konnten nicht in reiner Form isoliert werden, d. h. ohne diese Kristallisationsmoleküle.
Insbesondere ist [trans-RuCl₄(DMSO)Im]Na 2DMSO korrespondierend zu Formel (i), worin R_x= R_y= Methyl, A = Cl, B = Imidazol und worin die negative Ladung durch Na⁺ neutralisiert wurde, in der Lage gute antineoplastische und antimetastatische Aktivitäten bei Tumormodellen bei Mäusen auszuüben. Weiterhin wurde dieses Salz durch eine gute Wasserlöslichkeit charakterisiert, das eine einfachere Verabreichung ermöglicht.
Jedoch kann diese Verbindung nur mit zwei DMSO-Solvatationsmolekülen isoliert werden, wie in den Beispielen bewiesen, dargestellt in der oben erwähnten internationalen Patentanmeldung (insbesondere in den Beispielen 3, 4, 8 und 10), die die Verbindungsstabilität reduzieren.
Weiterhin kann eine qualitative Variation der Kristallisationsmoleküle, die DMSO, Aceton und Wasser sein können und gewöhnlich zwei Dimethylsulfoxid-Moleküle (DMSO) (E. Alessio et al. Inorganica Chimica Acta, 203 (1993); 205-217) beobachtet werden.
Die Tatsache, daß die Kristallisationsmoleküle auf eine Weise variieren, die kaum von einer Präparation zur nächsten steuerbar ist, führt zu Problemen einer Ungewißheit im Hinblick auf die Strukturanalyse, die Molekulargewichtsbestimmung und die Elementaranalyse. Daher können Probleme in bezug auf die Reinheit der Verbindung und ihre darauffolgende Formulierung auftreten. Tatsächlich legt die niedrige strukturelle Reproduzierbarkeit dieser Verbindungen nahe, daß nicht immer dieselbe Menge Ruthenium zu der verabreichten Dosierung korrespondiert. Auf diese Weise reduzieren nicht konstante Dosierungen und therapeutische Aktivitäten, die nicht einfach vorhergesagt werden können, das pharmakologische Interesse an diesen Verbindungen.
Ein weiterer Nachteil der oben erwähnten Verbindung liegt an der pharmakologisch negativen Wirkung, die von DMSO bewirkt wird, eingeführt in den Organismus in äquimolaren oder doppelten Quantitäten im Hinblick auf den Rutheniumkomplex und die differenzierenden Eigenschaften, wie berichtet von Klaas Kramer et al. (Gen. Pharmac., Bd. 26, Nr. 6, S. 1403-1497, 1995).
Schließlich zerfallen die oben erwähnten Salze, da sie Solvatationsmoleküle enthalten, schnell, wenn sie Luft bei Raumtemperatur ausgesetzt werden und stellen dabei ein braune halbfeste Substanz bereit.
Zusammenfassung
Die Anmelderin hat nun überraschend neue Salze von Ru(III) anionischen Komplexen mit Ammoniumkationen gefunden, die bemerkenswerte antimetastatische und antineoplastische Aktivitäten ausüben. Diese Salze korrespondieren zur Formel (I):
worin R₁, R₂ und R₃ gleich oder verschieden voneinander sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C_1-6-Alkyl, geradkettigem oder verzweigtem, gesättigtem oder ungesättigtem C_3-7-Cycloalkyl, Phenyl und Aryl;
oder NR₁R₂R₃ ist ein 5- bis 7-gliedriger, gesättigter oder ungesättigter, stickstoffhaltiger Heterocyclus, gegebenenfalls enthaltend ein oder mehrere O-, S- und/oder N-Atome, das Stickstoffatom ist gegebenenfalls substituiert mit einem C_1-4-Alkyl-, Aryl- oder Benzylrest, der stickstoffhaltige Heterocyclus ist gegebenenfalls kondensiert mit einer Benzogruppe und/oder substituiert mit C_1-4-Alkyl-, C_1-4-Alkoxyl-, C_1-4-Alkylthio-, Aryl- oder Benzylgruppen;
R₄ und R₅ sind gleich oder verschieden voneinander und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus H, C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, Phenyl und Aryl, oder R₄ und R₅ bilden zusammen mit dem S-Atom einen 4- bis 7-gliedrigen Heterocyclus.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung der obigen Salze (2), das die Synthese von [trans-RuCl₄(R₄R₅SO)₂][(R₄R₅SO)₂H] (II) umfaßt, worin R₄ und R₅ die obigen Bedeutungen aufweisen, die durch Behandlung von RuCl₃ mit R₄-SO-R₅ in Gegenwart von HCl erhalten werden und die darauffolgende Umsetzung des Komplexes (II) mit einer stickstoffhaltigen Verbindung der Formel NR₁R₂R₃ in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutischen Zusammensetzungen, enthaltend therapeutische wirksame Mengen von mindestens einem der obigen Salze der Formel (I) in Kombination mit den geeigneten Exzipientien und/oder Verdünnungsmitteln und ihre Verwendung als antineoplastische und/oder antimetastatische Mittel.
Beschreibung der Figuren
Figur A1 bzw. Figur A2 zeigt die externe Bindegewebskapsel (connective capsule) und einen nekrotischen Bereich des Tumorgewebes von Kontrollmäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind.
Figur B1 bzw. B2 zeigt die externe Bindegewebskapsel und einen nekrotischen Bereich des Tumorgewebes bei Mäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind nach Behandlung mit [trans-RuCl₄(DMSO)Im]Na 2DMSO wie beschrieben in der oben erwähnten WO 90/13553.
Schließlich zeigen die C1- und C2-Figuren die externe Bindegewebskapsel und einen nekrotischen Bereich von Tumorgewebe von Mäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind nach Behandlung mit dem Salz [trans-RuC1₄(DMSO)(Im)] [ImH] (Beispiel 2) der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser im Verlauf der folgenden detaillierten Beschreibung illustriert.
Bei den oben erwähnten Salzen der Formel (2) stellt das Stickstoffatom der Stickstoff-Verbindung der Formel NR₁R₂R₃ sein langes Paar bei der Bildung der Koordinationsbindung mit dem Ru(III)-atom bereit.
Spezifischer ausgedrückt ist bei den Salzen der Erfindung R₁ vorzugsweise derselbe Rest wie R₂ und R₃ und sie sind H oder Ethyl.
Wenn NR₁R₂R₃ eine 5-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus ist, ist er gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol, N-Methylimidazol, Pyrazol und Oxazol; besonders bevorzugt ist dieser stickstoffhaltige Heterocyclus Imidazol.
Wenn NR₁R₂R₃ ein 6-gliedriger Heterocyclus ist, ist er vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyridin, Pyrazin, 3,5-Lutidin und 4-Methylpyridin.
Wenn NR₁R₂R₃ ein 7-gliedriger Heterocyclus ist, ist er gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Azepin, Diazepin und Oxazepin.
Wenn der Heterocyclus schließlich mit einer Benzogruppe kondensiert ist, ist er vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Indazol, Isochinolin, Benzimidazol und 1,5,6-Trimethylbenzimidazol.
Bei den Salzen der Erfindung der Formel (I) ist der R₄-SO-R₅ Sulfoxid-Ligand vorzugsweise Dimethylsulfoxid (R₄= R₅= Methyl), Diethylsulfoxid (R₄= R₅= Ethyl) oder Tetramethylensulfoxid (zusammen mit dem S-Atom bilden R⁴ und R₅ einen 5-gliedrigen Ring).
Diese Salze können unerwarteterweise eine Antitumor- und insbesondere antimetastatische Aktivität ausüben, die deutlich höher liegt als diejenige der korrespondierenden Natriumsalze, wenn äquimolare Dosen und gleiche Behandlungsmuster angewandt werden.
Weiterhin werden die Salze der Formel (I) im Hinblick auf die im Stand der Technik beschriebenen günstiger angesehen, da sie an Luft unbegrenzt stabil sind, während die korrespondierenden Natriumsalze, die extrem hygroskop sind, einfach einer Hydrolyse unterliegen. Zusätzlich zeigen die Salze der Erfindung im Hinblick auf die bekannten Komplexe keine pharmakologischen Nachteile die aufgrund der Gegenwart von DMSO Kristallisationsmoleküle entstehen.
Da die Salze der Formel (I) keine Kristallisationsmoleküle aufweisen, haben sie konstante MW-Werte wie auch reproduzierbare analytische Ergebnisse. Dies ermöglicht Formulierungen, die definierte Mengen der aktiven Verbindung und ständig konstante Dosierungen enthalten.
Die Salze der Ru(III)-Komplexe der Formel (I) werden durch ein neues, insbesondere einfaches und günstiges Verfahren erhalten, das die folgenden Schritte umfaßt:

1) Umsetzung von RuCl₃ mit R₄-SO-R₅ in Gegenwart von HCl, um einen Komplex der Formel (II) zu erzeugen
worin R₄ und R₅ die oben berichteten Bedeutungen aufweisen.

In diesem Umsetzungsschritt sind R₄ und R₅ vorzugsweise Methyl, d. h. RuCl₃ durchläuft eine Umsetzung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) um [(Me₂SO)₂H] [trans-RuCl₄(Me₂SO)₂] zu erzeugen.
Gemäß einem bevorzugten Herstellungsweg wird RuCl₃ zunächst in einem erwärmten organischen Lösungsmittel gelöst, vorzugsweise Ethanol oder Methanol; R₄-SO-R₅ und konzentrierte Salzsäure werden der Lösung, die auf diesen Weg erhalten wurde, zugefügt und auf eine Temperatur im Bereich von vorzugsweise 60 bis 90°C erwärmt, noch bevorzugter auf eine Temperatur von ungefähr 80°C.

2) Der im Schritt (1) erhaltene Komplex (II) wird bei Raumtemperatur mit einer NR₁R₂R₃-stickstoffhaltigen Verbindung in einem molaren Verhältnis von 1 : 2 bis 1 : 6 in ein oder mehreren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton und Dichlormethan zur Bereitstellung der Salze der Formel (I) gemäß dem hiernach aufgeführten Schema umgesetzt.
worin R₁-R₅ die vorher definierten Bedeutungen aufweisen.

In dem Schritt (2) reagiert das Intermediat (II) mit der NR₁R₂R₃-stickstoffhaltigen Verbindung indem es zum Ersatz von einer der zwei axialen Sulfoxid-Gruppen und zu einer Protonierung eines Moleküls der Stickstoffverbindung und zur schließlichen Freisetzung der zwei Sulfoxid-Kristallisationsmoleküle führt. So werden die Komplexe (I) in sehr hohen Erträgen erhalten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der obigen Salze (I) bei der Behandlung von Neoplasmen verschiedener Natur und der Verhinderung der Bildung von Metastasen. Die obigen Neoplasmen sind vorzugsweise feste sich reproduzierende Tumoren, wie z. B. das Karzinom des Gastrointestinaltrakts, das Brustkarzinom, Lungentumoren, metastatische Karzinome und die Lungenmetastasen von metastatischen Tumoren.
Die Salze der Erfindung können in günstiger Weise durch parenterale, orale, topische oder transdermale Verabreichung gegeben werden.
Bei dieser parenteralen Verabreichung werden die intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen und subkutanen Wege bevorzugt.
Die Dosierung dieser Salze variiert je nach Verabreichungsweg und Art der Verabreichung wie auch der Schwere der Neoplasmen; weiterhin variiert sie im Hinblick auf Alter, Körpergewicht und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten.
Die therapeutisch effektive Dosierung dieser Salze, die in einfacher oder multipler Dosierungsform verabreicht werden sollen, liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 300 mg/kg/Tag und noch bevorzugter bei 10-200 mg/kg/Tag, wenn die Salze parenteral verabreicht werden, während oral die Dosierungen 3- bis 10-fach höher liegen als der oben erwähnte Bereich. weiterhin können die obigen Salze (I) in günstiger Weise in experimentellen Protokollen einer Polychemotherapie in Kombination mit anderen Antitumormitteln von allgemeiner klinischer Verwendung bei den oben beschriebenen pathologischen Zuständen verwendet werden, wie z. B. mit Cisplatin, 5-Fluoruracil, Vinblastin, Cyclophosphamid, Bleomycin, Anthracyclin und Taxol.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktive Verbindung eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem Salz der Formel (I) in Kombination mit geeigneten Exzipientien und/oder Verdünnungsmitteln enthalten.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form von Lösungen oder Suspensionen, sowohl in wäßrigen als auch in nicht-wäßrigen Medien, die für die intravenöse Injektion, Infusion und intramuskuläre oder subkutane Injektion besonders geeignet sind, hergestellt werden. Diese Lösungen können vor ihrer Verwendung durch Löslichmachen oder Suspendieren der lyophilisierten Verbindungen der Erfindung in geeigneten Lösungsmitteln hergestellt werden.
Feste oder halbfeste Zusammensetzungen in Form von Inserts, Gels oder Salben für die topische, dermale oder transdermale Verabreichung oder in Form von Pulvern, Pillen, Tabletten oder Kapseln sind ebenfalls indiziert. Weiterhin können die Salze der Erfindung in Form einer einer gesteuerten Freisetzung unterliegenden Zusammensetzung, die im Stand der Technik bekannt sind, verabreicht werden.
Die obigen Zusammensetzungen können einfach gemäß dem auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele werden angegeben um die Erfindung zu illustrieren ohne sie zu begrenzen:
Experimenteller Teil
Beispiel 1:
Herstellung eines [trans-RuCl₄(Me₂SO)₂][(Me₂SO)₂]-Komplexes, korrespondierend zu Formel (II) worin R₄= R₅= Methyl
1 g RuCl₃ 3 H₂O (0,0038 mol) wurde in 30 ml Ethanol suspendiert und durchlief eine Erwärmung im Rückfluß für 3 Stunden um eine dunkelgrüne Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde auf Papier filtriert um mögliche Spuren von ungelöstem Feststoff zu entfernen; sie wurde dann unter Verwendung eines Rotationsevaporators auf 1/10 des ursprünglichen Volumens konzentriert; dafür wurden 1 ml wäßriger konzentrierter HCl, 37% und 2 ml DMSO zugefügt und diese auf diesem Weg erhaltene Mischung wurde bei einer Temperatur von 80°C für ca. 15 Minuten gehalten bis eine kräftig orange Lösung erhalten wurde.
Nach Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur und Zugabe von 10 ml Aceton wurde das Produkt nach dem Absetzen von der Lösung in Form von rotorangen Kristallen abgetrennt. Die Bildung dieser Kristalle wurde durch die Zugabe von einigen Tropfen Ethylether beschleunigt. Die Kristalle wurden dann auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Aceton (20 ml) gewaschen, dann mit Ethylether (10 ml) und schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. 1,5 g des Endprodukts mit einem Ertrag von 72% wurden erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften von [trans-RuCl₄(Me₂SO)₂][(Me₂SO)₂H] sind die folgenden:

– Physikalischer Zustand: ein rotoranger kristalliner Feststoff
– Rohformel: C₈H₂₅Cl₄O₄RuS₄
– Molekulargewicht: 556,40
– Elementaranalyse: experimentell: C = 17,33, H = 4,61, Cl = 25,2, S = 23,2 theoretisch: C = 17,27, H = 4,53, Cl = 25,48, 5 = 23,04

Weiterhin stimmten die IR- und UV-Spektren und die Bestimmung der Struktur durch Röntgenstrahlen mit der von E. Alessio et al. (oben erwähnte Referenz) überein.
Beispiel 2
Herstellung von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] korrespondierend zur Formel (I), worin NR₁R₂R₃ Imidazol (Im) und R₄= R₅= Methyl ist.
1,0 g (0,0018 mol) des [trans-RuCl₄(Me₂SO)₂][(Me₂SO)₂H]-Komplexes, hergestellt wie beschrieben in Beispiel Nr. 1 wurde in Aceton (20 ml) bei Raumtemperatur suspendiert. Nach Zugabe von 0,49 g (0,0072 mol) Imidazol wurde die Mischung unter Rühren 4 Stunden gehalten; während dieser Zeit veränderte sich die Farbe des Präzipitats langsam von orange zu ziegelrot. Nach Sammlung auf einem Filter und Waschen mit Aceton (10 ml) und danach mit Ethylether (10 ml) wurde das Produkt im Vakuum bei Raumtemperatur oder in einem Ofen bei 60°C für einige Stunden getrocknet. Daraufhin wurden 0,75 g des Endprodukts mit einem Ertrag von 92 $ erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] sind die folgenden:

– Physikalischer Zustand: ein ziegelroter kristalliner Feststoff
– Rohformel: C₈H₁₅Cl₄O₄RuS₄
– Molekulargewicht: 458,17
– Elementaranalyse: experimentell: C = 20,8, H = 3,30, N = 12,2 theoretisch: C = 20,7, H = 3,30, N = 12,23
– ¹H-NMR-Spektrum in D₂O (ppm νs DSS): – 15,2 (sehr breit, DMSO), –3,53 (breit, H2 Im), 7,48 (s, H3 und 4H ImH⁺), 8,70 (1, H2 ImH⁺);
– IR-Spektrum (gewählte Frequenzen, Nujol, cm–1): ν_NH 3150 (sehr breit, mittel), ν_SO 1159 (sehr stark), νRu-S 421 (mittel), νRu-Cl 342 (stark).

Beispiel 3
Herstellung von [trans-RuC1₄(DMSO) (1-Me-Im)][1-Me-ImH] korrespondierend zu Formel (I), worin NR₁R₂R₃ 1-Methyl-imidazol und R₄= R₅= Methyl ist.
1,0 g (0,0018 mol) von [trans-RuCl₄(Me₂SO)₂]((Me₂SO)₂H]-Komplex, hergestellt wie beschrieben in Beispiel Nr: 1 wurde mit 0,59 g (0,0072 mol) 1-Methylimidazol wie beschrieben in Beispiel Nr. 2 behandelt und 0,8 g des Endprodukts wurden mit einem Ertrag von 93% erhalten.
Die pysikochemischen Eigenschaften von [trans-RuCl₄(DMSO)(1-Me-Im)]-[1-Me-ImH] sind die folgenden:

– Physikalischer Zustand: ein ziegelroter kristalliner Feststoff
– Rohformel: C₁₀H₁₉N₄Cl₄ORuS
– Molekulargewicht: 486,23
– Elementaranalyse: experimentell: C = 24,8, H = 3,83, N = 11,4 theoretisch: C = 24,7, H = 3,94, N = 11,52
– ¹H-NMR-Spektrum in D₂O (ppm vs DSS): – 15,7 (sehr breit, DMSO), –3,76 (breit, H2 1-Me-Im), –0,95 (breit, Mel, 1-Me-Im), 3,95 (3, Mel, 1-Me-ImH⁺), 7,45 (2, H3 und H4 1-Me-ImH+), 8,68 (1, H2, 1-Me-ImH+);
– IR-Spektrum (gewählte Frequenzen, Nujol, cm–1): νNH 3150 (sehr breit, mittel), νSO 1093 (sehr stark), νRu-S 424 (mittel), νRu-Cl 326 (stark).

Beispiel 4
Herstellung von [trans-RuCl₄(DMSO)(Py)][PyH] korrespondierend zu Formel (2), worin NR₁R₂R₃ Pyridin und R₄= R₅= Methyl ist
1,0 g (0,0018 mol) von [trans-RuCl₄(Me₂So)₂][(Me₂SO)₂H]-Komplex, hergestellt wie beschrieben in Beispiel Nr. 1 wurde mit 0,57 g (0,0072 mol) Pyridin wie beschrieben in Beispiel Nr. 2 behandelt und 0,8 g des Endprodukts wurden mit einem Ertrag von 94% erhalten.
Die pysikochemischen Eigenschaften von [trans-RuCl₄(DMSO)(Py)][PyH] sind die folgenden:

– Physikalischer Zustand: ein dunkelgelber mikrokristalliner Feststoff
– Rohformel: C₁₂H₁₇N₂Cl₄ORuS
– Molekulargewicht: 480,22
– Elementaranalyse: experimentell: C = 31,8, H = 3,77, N = 5,43 theoretisch: C = 30,01, H = 3,57, N = 5,83
– ¹H-NMR-Spektrum in D₂O (ppm vs DSS): – 14,5 (sehr breit, DMSO), –2,90 (breit, Py), 8,10,8,65,8,82 (PyH⁺);
–IR-Spektrum (gewählte Frequenzen, Nujol, cm–1): νNH 3150 (sehr breit, mittel), νSO 1074 (sehr stark), νRu-S 432 (mittel), νRu-Cl 344 (stark).

Beispiel 5
Herstellung von [trans-RuCl₄(DMSO)(NH₃)][NH₄] korrespondierend zur Formel (I), worin NR₁R₂R₃ NH₃ und R₄= R₅= Methyl ist
1,0 g (0,0018 mol) des [trans-RuCl₄(Me₂So)₂][(Me₂So)₂H]-Komplex, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1, wurden in CH₂Cl₂ (20 ml) bei Raumtemperatur nach Erzeugung eines Vakuums durch eine Wasserpumpe suspendiert, gasförmiger NH₃ wurde eingeblasen und das auf diesem Weg erhaltene System wurde unter Rühren 4 Stunden bei Raumtemperatur unter einer Ammoniakatmosphäre gehalten; während dieser Zeit verwandelte sich die Farbe des Präzipitats graduell von orange zu dunkelrot.
Das auf einem Filter gesammelte und mit kaltem CH₂Cl₂ und dann mit Ethylether (10 ml) gewaschene Produkt wurde dann unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Die physikochemischen Eigenschaften von [trans-RuCl₄(DMSO) (NH₃)][NH₄] sind die folgenden:

– Physikalischer Zustand: ein ziegelroter mikrokristalliner Feststoff
– Rohformel: C₂H₁₃N₂Cl₄ORuS
– Molekulargewicht: 356,08
– Elementaranalyse: experimentell: C = 6,75, H = 3,44, N = 7,63 theoretisch: C = 6,75, H = 3,68, N = 7,87
– IR-Spektrum (gewählte Frequenzen, Nujol, cm–1): νNH 3304, 3174 (mittel), νSO 1069 (sehr stark), νRu-N 458 (schwach), νRu-S 431 (mittel), νRu-Cl 344, 321 (stark).

Beispiel 6
Herstellung von [trans-RuCl₄(DMSO)(Pyr)][PyrH] korrespondierend zur Formel (I), worin NR₁R₂R₃ Pyrazin (Pyr) und R₄ = R₅= Methyl ist
1,0 g (0,0018 mol) von [trans-RuCl₄(Me₂SO)₂][(Me₂SO)₂H]-Komplex, hergestellt wie beschrieben in Beispiel Nr. 1 wurde mit 0,43 g (0,0053 mol) Pyrazin wie beschrieben in Beispiel Nr. 2 behandelt und 0,5 g des Endprodukts wurden mit einem Ertrag von 57% erhalten.
Die pysikochemischen Eigenschaften von [trans-RuCl₄(DMSO) (Pyr)]/[PyrH] sind die folgenden:

– Physikalischer Zustand: ein dunkelgelber kristalliner Feststoff
– Rohformel: C₁₀H₁₅N₄Cl₄ORuS
– Molekulargewicht: 482,20
– Elementaranalyse: experimentell: C = 24,7, H = 3,07, N = 11,1 theoretisch: C = 24,9, H = 3,13, N = 11,6
– ¹H-NMR-Spektrum in D₂O (ppm vs DSS): – 13,8 (breit, DMSO), –7,5 (sehr breit, H2, 6 Pyr), –2,1 (breit, H3,5 Pyr), 8,69 (Pyr)
– IR-Spektrum (gewählte Frequenzen, Nujol, cm–1) : νPyrazin 1605 (mittel), νSO 1076 (sehr stark), νPyrazin 807 (stark), νprotoniertes Pyrazin 773 (stark), νRu-S 435 (mittel), νRu-Cl 351,326 (stark).
– UV/VIS in Wasser (nm, ε (mol^–1, cm^–1): 400 (4200), 469 (490).

Biologische Aktivität
i) in vivo-Aktivitätstests der Salze (I) gemäß der vorliegenden Erfindung auf Mäuse, die von einem Lewis-Lungenkarzinom befallen sind.
Beispiel (I)-A
Material und Methoden
Drei Gruppen, jeweils bestehend aus 10 weiblichen BD2F1-Mäusen mit 21 ± 1 g, erhalten von Charles River (Calco, Como, Italien) wurden durch eine intramuskuläre Injektion mit 106 Lewis-Lungenkarzinomzellen, suspendiert in 0,05 ml Dulbeccos gepufferter calcium- und magnesiumfreier Lösung (PBS) unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze inokuliert.
Die Tumorlinie wurde von der Tumor Repository Bank, NCI, NIH, Bethesda (USA) erhalten und in flüssigem Stickstoff erhalten.
Fünf Tage nach der obigen Inokulation, entsprach das durchschnittliche Gewicht des Tumors 0,4 ± 0,01 g. Vom 5. bis zum 11. Tag wurden die drei Mausgruppen intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg des Körpergewichts/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 44 mg [trans-RuCl₄(DMSO) (Im)]Na 2DMSO wie beschrieben in der obigen WO 90/13553;
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 35 mg [trans-RuCl₄(DMSO) (Im)][ImH] (Beispiel 2);
12 Tage nach der Inokulation wurde der primäre Tumor chirurgisch entfernt.
21 Tage nach der Inokulation wurden die Mäuse durch Zervikal-Luxation geopfert und die Lungenmetastasen wurden gezählt. Die Lungen wurden direkt nach dem Tod der Mäuse abduziert und in einzelne Lobuli unterteilt, die dann darauffolgend durch Verwendung eines Stereoskopmikroskops mit geringer Vergrößerung, das mit einem Raster auf dem Augenstück ausgerüstet war, überprüft wurden, was den Nachweis von a und b orthogonalen Achsen (wobei a ≤ b) ermöglichte.
Die Lungenmetastasen wurden dann nach ihren Dimensionen klassifiziert und das Gewicht der Metastasen für jedes Tier wurde dann als Summe der Gewichts für jede einzelne Metastase berechnet, wobei jede einzelne als fest durch die Formel (π/6)a²× b betrachtet wurde. Die erhaltenen experimentellen Daten wurden dann mit dem Student-Newmann-Keuls-Statistiktest verarbeitet.
Die erhaltenen Ergebnisse werden hiernach in Tabelle 1 angegeben, wobei die Anzahl der Metastasen und ihr Gewicht in beiden Gruppen von behandelten Mäusen (2) und (3) im Hinblick auf die Kontrollgruppe (1) angegeben werden. Die Figuren werden als ± S. E. der einzelnen Werte, die für jede Gruppe erhalten wurden, angegeben. Tabelle 1: Antitumor- und antimetastatische Aktivität auf Mäuse, die von einem Lewis-Lungenkarzinom befallen sind von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] gemäß Beispiel 2 (35 mg/kg/Tag) im Hinblick auf [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)]Na 2DMSO (44 mg/kg/Tag)
Die oben dargestellten Figuren zeigen die Tatsache, daß die Behandlung mit [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] gemäß der vorliegenden Erfindung zu einer Reduktion sowohl des Gewichts als auch der Anzahl der Metastasen führt, die höher ist als diejenige, die mit der auf dem Fachgebiet bekannten Referenzverbindung erhalten wird.
Die prozentuale Reduktion der Anzahl der Metastasen und ihres Gewichts wird hiernach in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Prozentuale Reduktion der Anzahl der Metastasen und ihres Gewichts bei Mäusen, die von einem Lewis-Lungenkarzinom befallen sind und die mit den Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt wurden
Die für die Verbindung der Erfindung im Hinblick auf die Referenzverbindung, wobei diese im Stand der Technik bekannt war, erhaltenen Vorteile, werden sogar noch deutlicher durch die oben berichteten Zahlen ausgedrückt.
Nach den obigen Behandlungen wurden die Lungenmetastasen, isoliert aus den Gruppen (1) und (3) der Mäuse gezählt und in drei Gruppen je nach Durchmesserdimensionen (d) unterteilt: Metastasen mit einem Durchmesser d < 1 mm (klein), Metastasen mit einem Durchmesser im Bereich von 1 mm bis 2 mm (mittel) und schließlich Metastasen mit einem Durchmesser von d > 2 mm (groß). Die erhaltenen Ergebnisse werden hiernach in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3: Verteilung gemäß den Durchmesserdimensionen (d) von Lungenmetastasen bei Mäusen, die von einem Lewis-Lungenkarzinom befallen sind, behandelt mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung
Diese Zahlen zeigen die Tatsache, daß metastatische Noduli von mittlerer und großer Dimension in der Gruppe der behandelten Tiere kaum vorliegen (Noduli mit mittleren Dimensionen) oder gar nicht vorliegen (Noduli mit großer Dimension) im Hinblick auf die Kontrollen.
Beispiel (i)-B
Material und Methoden
Drei Gruppen, jeweils bestehend aus 10 weiblichen BD2F1-Mäusen mit 21 ± 1 g, erhalten von Charles River (Calco, Como, Italien) wurden durch intramuskuläre Injektion mit 10⁶ Lewis-Lungenkarzinomzellen, suspendiert in 0,05 ml einer Dulbeccos gepufferten calcium- und magnesiumfreien Lösung (PBS) unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze inokuliert.
Die Tumorlinie wurde der Tumor Respository Bank, NCI, NIH, Bethesda USA erhalten und in flüssigem Stickstoff aufrechterhalten.
5 Tage nach der obigen Inokulation wurde das mittlere Gewicht des Tumors als bei 0,4 ± 0,01 g liegend bestimmt. Vom 12. bis 17. Tag wurden die drei Mausgruppen intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 2 mg Cisplatin;
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 35 mg [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] (Beispiel 2).
11 Tage nach der Inokulation wurde der Primärtumor chirurgisch entfernt.
25 Tage nach der Inokulation wurden die Mäuse durch zervikale Luxation geopfert und die Lungenmetastasen wurden gezählt. Die Lungen wurden direkt nach dem Tod der Mäuse abduziert und in einzelne Lobuli unterteilt, die dann darauffolgend durch Verwendung eines Stereomikroskops mit geringer Vergrößerung, ausgerüstet mit einem Raster auf dem Augenstück überprüft wurden, was den Nachweis von a und b orthogonalen Achsen (worin a < b) ermöglichte.
Die Lungenmetastasen wurden dann nach ihren Dimensionen klassifiziert und das Gewicht der Metastasen für jedes Tier wurde dann als Summe der Gewichts für jede einzelne Metastase berechnet, wobei jede einzelne als fest durch die Formel (n/6)a² × b betrachtet wurde. Die erhaltenen experimentellen Daten wurden dann mit dem Student-Newmann-Keuls-Statistiktest verarbeitet.
Die erhaltenen Ergebnisse werden hiernach in Tabelle 4 angegeben, wobei die Anzahl der Metastasen und ihr Gewicht in beiden Gruppen von behandelten Mäusen (2) und (3) im Hinblick auf die Kontrollgruppe (1) angegeben werden. Die Figuren werden als ± S. E. der einzelnen Werte, die für jede Gruppe erhalten wurden, angegeben. Tabelle 4: Antimetastatische Aktivität auf Mäuse, befallen von einem Lewis-Lugenkarzinom von [traps-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] gemäß Beispiel 2 (35 mg/kg/Tag) im Hinblick auf Cisplatin (2 mg/kg/Tag)
Die oben dargestellten Figuren zeigen die Tatsache, daß die Behandlung mit [traps-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] gemäß der vorliegenden Erfindung zu einer Reduktion sowohl des Gewichts als auch der Anzahl der Metastasen führt, die höher ist als diejenige, die mit der auf dem Fachgebiet bekannten Referenzverbindung erhalten wird.
ii) in vivo-Aktivitätstest der Verbindungen der Erfindung bei Mäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind
Beispiel (ii)-A
Material und Methoden
3 Gruppen aus 7 weiblichen CBA-Mäusen mit 23 ± 2 g, erhalten von einer Kolonie, gezüchtet gemäß den Verfahren für Geschwistertiere. Die ursprünglich von Chester Beatthy Institute of London erhaltene Kolonie wurde darauffolgend durch serielle Verkupplungen zwischen Geschwistern (Bruder und Schwester) in einem Verhältnis von 1.1 zu 1.4 erhalten. Die Verkupplungen fanden zum Höhepunkt der sexuellen Reife der geborenen Tier_e, ⁱn der 5. Woche statt. Untergewichtige Tiere oder solche mit eindeutigen organischen Anomalien wurden nicht verwendet. Die drei Gruppen wurden du_rch intramuskuläre Injektion mit 10⁶ Lungenkarzinomzellen, suspendiert in 0,05 ml einer Dulbeccos-gepufferten calcium- und magnesiumfreien physiologischen Lösung (PBS) unter Verwendung einer sterilen Spritze inokuliert.
Die Tumorlinie wurde von dem Rudjer Boskovic Institute erhalten und in flüssigem Stickstoff aufrechterhalten.
13 Tage nach der Inokulation betrug das durchschnittliche Tumorgewicht 1,2 ± 0,2 g. Von Tag 13 bis 18 wurden die drei Mausgruppen intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 44 mg [trans-RuCl₄(DMSO) (Im)]Na 2DMSO, wie beschrieben in der oben erwähnten WO 90/13553;
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 35 mg [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)] [ImH] (Beispiel 2).
19 Tage nach der Inokulation wurde der Primärtumor chirurgisch entfernt.
27 Tage nach der Inokulation wurden die Mäuse durch Zervikal-Luxation geopfert und die Lungenmetastasen wurden dann wie in Test (i) beschrieben gezählt.
Die erhaltenen experimentellen Zahlen wurden dann gemäß dem Student-Newmann-Keuls-Statistiktest verarbeitet.
Um die Aktivität der Salze der Erfindung zu bewerten wurde der Primärturmor chirurgisch aus den Mäusen der drei obigen Gruppen entfernt und seziert. Ein Tumor für jede Gruppe wurde auf statistische Weise gewählt und 10 Sektionen/Tumor wurden auf diese Weise erhalten, um die gesamte neoplastische Masse zu bewerten. Die Tumorstücke wurden in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit dem Cajal-Gallego-Farbstoff zum Nachweis der Epithelialzellen, der Bindematrix und der Gegenwart von Erythrozyten angefärbt. Die Infiltration wurde durch Beobachtung der Degranulierung der Polymorphonukleären (PMN) wie auch der Gegenwart von apoptotischen Körpern bewertet.
Ergebnisse:
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt, worin die Anzahl der Metastasen und ihr Gewicht, wie erhalten in den Gruppen (2) und (3) im Hinblick auf die Kontrollgruppe (1) dargestellt sind. Die Zahlen sind als Durchschnitt ± S. E. der für jede Gruppe erhaltenen einzelnen Werte ausgedrückt. Tabelle 5: Antitumor- und antimetastatische Aktivität von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)) [ImH) in Beispiel 2 (35 mg/kg/Tag) im Hinblick auf [trans-RuCl₄(DMSO) (Im))Na 2DMSO (44 mg/kg/Tag) auf Mäuse, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind
Die Prozentzahl der Reduktion der Anzahl der Metastasen und ihres Gewichts, erhalten mit der Verbindung der Erfindung und mit dem auf dem Gebiet bekannten Natriumsalz im Hinblick auf die Kontrolle sind hiernach in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6: Prozentuale Reduktion der Anzahl der Metastasen und ihres Gewichts, erhalten durch die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung
Die die Wirkung der Salze der Erfindung betreffenden Ergebnisse sind hiernach in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7: Wirkungen der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf den Primärtumor
Aus den oben angegebenen Zahlen ist es möglich nachzuweisen, daß die [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH]-Verbindung im Hinblick auf die [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)]Na 2DMSO-Referenzverbindung, 44 mg/kg/Tag deutliche histologische Veränderungen erzeugt. Insbesondere weist der mit dem Salz gemäß der vorliegenden Erfindung behandelte Tumor breite hämorrhagische und nekrotische Bereiche auf, kombiniert mit neutrophilen Leukozyten, eine saubere Degranulierung der Polymorphonukleären (PMN) in Gegenwart einer großen Anzahl apoptopischer Körper und eine Verdickung der Bindegewebskapsel, die den Tumor umgibt.
Diese Ergebnisse ergeben sich sogar noch deutlicher aus den Zahlen, bei denen die äußere Bindegewebskapsel mit einem Buchstaben C versehen ist (Figur A1, B1 und C1), während der nekrotische Bereich mit dem Buchstaben N versehen ist (Figur A2, B2 und C2).
Ohne den Wirkungsmechanismus, mit dem die Salze gemäß der vorliegenden Erfindung ihre pharmakologischen Wirkungen ausüben zu begrenzen, tragen die obigen Beobachtungen dazu bei, die antimetastatische Wirkung der obigen Salze als Ergebnis einer Verhinderung eines Tumorzellverteilens aus dem primären Tumor zumindest teilweise zu erklären.
Beispiel (ii)-B
Materialien und Methoden
Zwei Gruppen von 12 und eine Gruppe von 14 (Kontrolle) weiblichen CBA-Mäusen mit 22 g, erhalten aus einer Kolonie, gezüchtet gemäß den Verfahren für Geschwistertiere, wurde mit 106 Zellen eines MCa Brustkarzinoms wie in Test (ii)-A berichtet inokuliert.
Vom 9. bis 14. Tag nach Inokulation wurden die drei Mausgruppen täglich intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 35 mg [trans-RuCl₄(DMSO) (Im)][ImH] (Beispiel 2);
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 27 mg [trans-RuCl₄(DMSO)(NH₃)] NH₄ (Beispiel 5).
An Tag 27 nach der Inokulation wurden die Ratten durch Zervixluxation geopfert und Lungenmetastasen wurden dann wie beschrieben in Test (i) gezählt.
Die erhaltenen experimentellen Zahlen wurden gemäß dem Student-Newmann-Keuls-Statistiktest verarbeitet.
Um die Aktivität die erfindungsgemäßen Salze auf den Primärtumor zu bewerten wurde das mittlere Gewicht des Primärtumors zu Beginn und zum Ende der obigen Behandlung bewertet.
Ergebnisse:
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt, wobei die Anzahl der Metastasen und ihr Gewicht, wie erhalten in den Gruppen (2) und (3) im Hinblick auf die Kontrollgruppe (1) dargestellt ist. Die Figuren werden als Mittel ± S. E. der für jede Gruppe erhaltenen Einzelwerte ausgedrückt. Tabelle 8: Antitumor- und antimetastatische Aktivität von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)] [ImH] in Beispiel 2 (35 mg/kg/Tag) im Hinblick auf [trans-RuCl₄(DMSO) (NH₃)] NH₄ in Beispiel 5 (27 mg/kg/Tag) auf Mäuse, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind
Die Reduktionsprozentzahl der Anzahl der Metastasen und ihres Gewichts, erhalten mit der Verbindung der Erfindung und mit dem auf dem Gebiet bekannten Natriumsalz im Hinblick auf die Kontrolle werden hiernach in Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9: Prozentuale Reduktion der Anzahl der Metastasen und ihres Gewichts, erhalten durch die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung
Die die Wirkungen der Salze der Erfindung auf das Wachstum des Primärtumors betreffenden Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben, wobei das Gewicht des Primärtumors zu Beginn und zum Ende der Behandlung mit den Salzen der Erfindung wie auch das korrespondierende prozentuale Wachstum angegeben sind. Tabelle 10: Wirkung, die von den Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf das Wachstum von primären Tumoren bei Mäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind, ausgeübt wird
Aus den oben angegebenen Zahlen läßt sich ableiten, daß die Reduktion des Wachstums des Primärtumors bei den mit den Salzen gemäß der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppen, normalisiert durch die Kontrollen 59,9% für [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] trägt, während sie 44,5% für [trans-RuCl₄(DMSO)(NH3)] NH4 beträgt.
Beispiel (ii)-C
Materialien und Methoden
Zwei Gruppen von 7 und eine Gruppe von 9 (Kontrolle) weiblicher CBA-Mäuse mit 22 g, erhalten aus einer Kolonie, gezüchtet gemäß dem Verfahren für Geschwistertiere, wurden durch intramuskuläre Injektion mit 106 Zellen eines MCa-Brustkarzinoms inokuliert, wie angegeben in Test (ii )-A.
Vom 9. bis 14. Tag wurden drei Mausgruppen täglich intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 44 mg [trans-RuCl₄(DMSO)(NH3)] Na 2DMSO wie beschrieben in der oben zitierten internationalen Patentanmeldung WO 90/13553;
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 27 mg [trans-RuCl₄(DMSO)(NH3)] NH4 (Beispiel 5).
Um die Aktivität die Salze der Erfindung auf den Primärtumor zu bewerten wurden das mittlere Gewicht des Primärtumors zu Beginn und zum Ende der Behandlung mit den Salzen der Erfindung wie auch die prozentuale Variation des Wachstums bewertet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind hiernach in Tabelle 11 dargestellt, die das Gewicht des Primärtumors zu Beginn und zum Ende der Behandlung wie auch die prozentuelle Variation des Wachstums angibt. Tabelle 11: Wirkung, die von den Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf das Wachstum von primären Tumoren bei Mäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind, ausgeübt wird
Aus den oben angegebenen Zahlen ergibt sich deutlich, daß das reduzierte Wachstum des Primärtumors in den mit den Salzen der Ru(III)-Komplexe behandelten Gruppen, normalisiert durch die Kontrollen 18,7% für [trans-RuCl₄(DMSO)(NH₃)]Na 2DMSO beträgt, während es 32,8% für [trans-RuCl₄(DMSO)(NH₃)]NH₄ beträgt. Diese Figuren zeigen, daß [trans-RuCl₄(DMSO)(NH₃) NH₄ gemäß der vorliegenden Erfindung Antitumorwirkungen auf das Wachstum des Primärtumors ausüben kann, die deutlich höher als die der bekannten Verbindungen im Stand der Technik sind.
Beispiel (ii)-D
Material und Methoden
Drei Gruppen mit 7 weiblichen CBA-Mäusen mit 23 ± 2 g, erhalten aus einer Kolonie, gezüchtet gemäß den Verfahren für Geschwistertieren. Die ursprünglich erhaltene Kolonie vom Chester Beatthy Institute of London wurde darauffolgend durch serielle Verkupplungen zwischen Geschwistern (Bruder und Schwester) in einem Verhältnis von 1 : 1 zu 1 : 4 aufrecherhalten. Die Verkupplungen fanden zum Höhepunkt der sexuellen Reife der geborenen Tiere, in der 5. Woche statt. Untergewichtige Tiere oder solche mit eindeutigen organischen Anomalien wurden nicht verwandt. Die drei Gruppen wurden durch intramuskuläre Injektion mit 106 MCa Brustkarzinomzellen, suspendiert in 0,05 ml einer Dulbeccos gepufferten calcium- und magnesiumfreien physiologischen Lösung (PBS) unter Verwendung einer sterilen Spritze inokuliert.
Die Tumorlinie wurde von dem Rudjer Boskovic Institute in Zagabria erhalten und in flüssigem Stickstoff aufrechterhalten.
13 Tage nach der Inokulation wurde der Primärtumor chirurgisch entfernt.
Von Tag 14 bis 19 wurden die drei Mausgruppen intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 2 mg Cisplatin;
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 35 mg [trans-RuCl₄(DMSO) (Im)][ImH] (Beispiel 2). Tabelle 12: Vergleich der antimetastatischen Wirkung von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] gemäß Beispiel 2 (35 mg/kg/Tag) mit Cisplatin (2 mg/kg/Tag) bei Mäusen, die von einem MCa-Brustkarzinom befallen sind
Beispiel (ii)-E
in vivo-Aktivitätstest der Salze (I) gemäß der vorliegenden Erfindung auf Mäuse, die von einem TS/A-Brustadenokarzinom befallen sind
Materialien und Verfahren
Drei Gruppen, jeweils bestehend aus 10 weiblichen BALBc-Mäusen mit 21 ± 1 g, erhalten von Harlan Nossan (Italien) wurden durch intramuskuläre Injektion mit 10⁵ TS/a Brustadenokarzinomzellen, suspendiert in 0,05 ml einer Dulbeccos gepufferten calcium- und magnesiumfreien Lösung (PBS) unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze inokuliert.
Die Tumorlinie wurde von dem Istituto Immunogenetica (Univ. Turin, Italien) erhalten und in flüssigem Stickstoff aufrechterhalten.
Vom 13. bis zum 18. Tag wurden die drei Mausgruppen intraperitoneal wie folgt behandelt:
Gruppe 1 – Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung;
Gruppe 2 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 2 mg Cisplatin
Gruppe 3 – 10 ml/kg Körpergewicht/Tag einer sterilen und pyrogenfreien physiologischen Lösung, enthaltend 35 mg [trans-RuCl₄(DMSO) (Im)][ImH] (Beispiel 2).
19 Tage nach der Inokulation wurde der Primärtumor chirurgisch entfernt.
33 Tage nach der Inokulation wurden die Mäuse durch zervikale Luxation geopfert und die Lungenmetastasen wurden gezählt. Die Lungen wurden direkt nach dem Tod der Mäuse abduziert und in einzelne Lobuli unterteilt, die dann darauffolgend durch Verwendung eines Stereoskopmikroskops mit niedriger Vergrößerung, ausgerüstet mit einem Raster auf dem Augenstück, überprüft wurden, was den Nachweis von a und b orthogonalen Achsen (worin a ≤ b) ermöglichte.
Die Lungenmetastasen wurden dann gemäß ihren Dimensionen klassifiziert und das Gewicht der Metastasen für jedes Tier wurde als Summe des Gewichts der jeweiligen einzelnen Metastasen berechnet, wobei jede als fest durch die Formel (n/6)a²× b betrachtet wurde. Die erhaltenen experimentellen Daten wurden dann mit dem Student-Newmann-Keuls-Statistiktest verarbeitet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 13 hiernach angegeben, wobei die Zahl der Metastasen und ihr Gewicht in beiden Gruppen von behandelten Mäusen (2) und (3) im Hinblick auf die Kontrollgruppe (1) angegeben werden. Die Zahlen werden als Durchschnitt ± S. E. der für jede Gruppe erhaltenen einzelnen Werte angegeben. Tabelle 13: Antimetastatische Aktivität auf Mäuse, befallen von einem TS/A Lungenadenokarzinom von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] gemäß Beispiel 2 (35 mg/kg/Tag) im Hinblick auf Cisplatin (2 mg/kg/Tag)
Die für den Vergleich der Wirkungen von [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)][ImH] und Cisplatin auf feste metastasierende Tumoren gewählten Dosierungen sind vergleichbar darin, daß sie maximal tolerierte Dosierungen mit der angenommenen Behandlung (1 Injektion pro Tag für 6 konsekutive Tage) darstellen.
Der Vergleich der Wirkungen der Verbindung der Erfindung und Cisplatin auf den Verlust einer Körpergewichtszunahme während der Behandlung zeigt, daß die Ruthenium-Verbindung (% Verlust der Körpergewichtszunahme gegenüber der Kontrolle = +1 (Lewislungenkarzinom), –6 (Mca-Brustkarzinom)) immer weniger toxisch ist als Cisplatin (% des Verlusts der Körpergewichtszunahme gegenüber der Kontrolle = –11). Der Vergleich des Milzgewichts der behandelten Tiere (% Verlust Milzgewicht gegenüber Kontrolle = –11) zeigt ebenfalls daß die Medikamentenbehandlung mit der Verbindung der Erfindung sehr viel besser toleriert wird als die der Cisplatin-Tiere (% Verlust Milzgewicht gegenüber Kontrolle = –52).
Im Hinblick auf die Tumormetastasen ist die Verbindung der Erfindung so wirksam (Mca-Brustkarzinom) oder sogar wirksamer (Lewis-Lungenkarzinom und TS/A-Adenokarzinom) als Cisplatin: Sie reduziert die Anzahl der Lungenmetastasen sowohl, wenn sie in einem Frühzustand des Tumorwachstums gegeben wird, d. h. vor der chirurgischen Ablation (TS/A-Adenokarzinom) als auch wenn sie Mäusen mit Lungenmetastasen in fortgeschrittenem Wachstumszustand verabreicht wird, d. h. nach der chirurgischen Ablation des Primärtumors (Lewis-Lungenkarzinom) und die Reduktion der Lungenmetastasen stimmt mit einer signifikanten Verlängerung der postchirurgischen Lebenszeiterwartung der behandelten Mäuse (Mca-Brustkarzinom) überein.
Die oben dargestellten in vivo experimentellen Modelle betreffen die Behandlung mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung von zwei festen streuenden Tumoren bei Nagern in einem fortgeschrittenen Wachstumszustand. Eine statistisch signifikante und deutliche Reduktion sowohl des Wachstums des primären Tumors als auch der Bildung von Lungenmetastasen wird beobachtet. Diese Reduktion, die sich sowohl aus Modell (i) des Lewis-Lungenkarzinoms als auch Modell (ii) des MCa-Brustkarzinoms nachweisen läßt ist einer verstärkten Inhibition des Wachstums von Lungenmetastasen zuzuschreiben. Tatsächlich ist die Gegenwart von mittleren/großen Dimensionen in Gruppen von behandelten Tieren im Vergleich mit den Kontrollen deutlich niedriger oder sogar abwesend in dem Fall, in dem die großen Noduli betroffen sind.
Insbesondere sind bei einem Gesamtvergleich der Daten im Hinblick auf eine effektive Reduktion der Metastasen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung überraschend aktiver als die Referenzverbindungen, die auf dem Gebiet bekannt sind, sowohl für die Behandlung des Lewis-Lungenkarzinoms als auch deutlicher und statistisch signifikanter für die Behandlung des MCa-Brustkarzinoms.

Claims

Salz eines anionischen Komplexes von Ru(III) mit einem Ammoniumkation der Formel (I):
worin R₁, R₂ und R₃ gleich oder verschieden voneinander sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C_1-6-Alkyl, geradkettigem oder verzweigtem, gesättigtem oder ungesättigtem C_3-7-Cycloalkyl, Phenyl und Aryl; oder NR₁R₂R₃ ist ein 5- bis 7-gliedriger, gesättigter oder ungesättigter, stickstoffhaltiger Heterocyclus, gegebenenfalls enthaltend ein oder mehrere O-, S- und/oder N-Atome, das Stickstoffatom ist gegebenenfalls substituiert mit einem C_l-4-Alkyl-, Aryl- oder Benzylrest, der stickstoffhaltige Heterocyclus ist gegebenenfalls kondensiert mit einer Benzogruppe und/oder substituiert mit C_1-4-Alkyl-, C_1-4-Alkoxyl-, C_1-4-Alkylthio-, Aryl- oder Benzylgruppen; R₄ und R₅ sind gleich oder verschieden voneinander und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus H, C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, Phenyl und Aryl, oder R₄ und R₅ bilden zusammen mit dem S-Atom einen 4- bis 7-gliedrigen Heterocyclus.
Salz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁, R₂ und R₃ H oder Ethyl sind.
Salz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass NR₁R₂R₃ ein 5-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol, N-Methyl-imidazol, Pyrazol und Oxazol.
Salz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass NR₁R₂R₃ ein 6-gliedriger Heterocyclus ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyridin, Pyrazin, 3,5-Lutidin und 4-Methylpyridin.
Salz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass NR₁R₂R₃ ein stickstoffhaltiger Heterocyclus ist, kondensiert mit einer Benzogruppe, ausgewählt aus Indazol, Isochinolin, Benzimidazol und 1,5,6-Trimethylbenzimidazol.
Salz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass R₄-SO-R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dimethylsulfoxid, Diethylsulfoxid und Tetramethylensulfoxid.
Salz gemäss Ansprüchen 1, 3 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass NR₁R₂R₃ Imidazol ist und R₄-SO-R₅ Dimethylsulfoxid ist.
Salz gemäss Ansprüchen 1, 2 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass NR₁R₂R₃ NH₃ ist und R₄-SO-R₅ Dimethylsulfoxid ist.
Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Formel (I) gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die folgenden Reaktionsschritte: (1) RuCl₃ wird mit R₄-SO-R₅ in Anwesenheit von HCl umgesetzt, um den Komplex der Formel (II) zu erhalten:
worin R₄ und R₅ die gleichen Bedeutungen wie oben haben, (2) der in Schritt (1) erhaltene Komplex (II) wird bei Raumtemperatur mit einer stickstoffhaltigen Verbindung NR₁R₂R₃ in ein oder mehreren organischen Lösungsmitteln umgesetzt, um das Salz der Formel (I) zu erhalten.
Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass R₄ und R₅ Methyl oder Ethyl sind.
Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (1) RuCl₃ in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird und die so erhaltene Lösung mit R₄-SO-R₅ und konzentrierter HCl bei einer Temperatur im Bereich von 60 bis 90°C umgesetzt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass RuCl₃ in Ethanol oder Methanol gelöst wird und die erhaltene Lösung mit R₄-SO-R₅ und konzentrierter HCl bei einer Temperatur von etwa 80°C umgesetzt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) der Komplex (II) und die stickstoffhaltige Verbindung NR₁R₂R₃ in molaren Verhältnissen im Bereich von 1 : 2 bis 1 : 6 umgesetzt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) die organischen Lösungsmittel Aceton oder Dichlormethan sind.
Verwendung mindestens eines Salzes der Formel (I) gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments mit antimetastatischer und/oder antineoplastischer Wirkung.
Verwendung gemäss Anspruch 15, wobei das Medikament zur Behandlung von soliden Tumoren, die Metastasen bilden, ist.
Verwendung gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die soliden Tumore ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Karzinomen des Gastrointestinaltrakts, Brustkarzinomen, Lungentumoren, metastasierenden Karzinomen und Lungenmetastasen von metastasierenden Tumoren.
Verwendung gemäss Anspruch 15, wobei das Medikament zur Verabreichung des Salzes in einer Menge von 0,1 bis 300 mg/kg/Tag geeignet ist.
Verwendung gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur parenteralen, oralen, topischen oder transdermalen Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als Wirkstoff eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines der Salze der Formel (I), definiert gemäss Ansprüchen 1 bis 8, in Kombination mit geeigneten Exzipienten und Verdünnern.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Lösung oder Suspension ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form eines Gels, einer Salbe, eines Pulvers, einer Pille, einer Tablette, einer Kapsel oder eines Inserts ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Salze der Formel (I) mit ein oder mehreren Antitumor-Arzneimitteln kombiniert werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Antitumor-Arzneimittel ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Cisplatin, 5,5-Fluoruracil, Vinblastin, Cyclophosphamid, Bleomycin, Anthracyclin und Taxol.