DE69717632T2

DE69717632T2 - Vorrichtung und verfahren zur echtzeitmessung der zellularen reaktion

Info

Publication number: DE69717632T2
Application number: DE69717632T
Authority: DE
Inventors: Alex Okun; Ilya Okun
Original assignee: Axiom Biotechnologies Inc
Current assignee: Caliper Life Sciences Inc
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2003-10-02
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: JP3847791B2; US5804436A; EP0916094B1; US5919646A; CA2261740A1; DE69717632D1; ATE229182T1; WO1998005959A1; US6379917B1; EP0916094A1; AU4050597A; JP2001501298A; US6096509A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Vorrichtung zum Screening (Auswahlprüfung) und zum pharmakologi¬ schen Profilieren von Substanzen, die eine physiologische Zellreaktion modulieren. Die Erfindung betrifft auch Einrichtungen zur schnellen Bewertung der Eigenschaften von Substanzen, die die Aktivitäten der Zelloberflächenrezeptoren und Ionenkanäle modulieren. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zur Ermittlung, Beurteilung und Kennzeichnung der Fähigkeit und Potenz von Substanzen, als Agonisten oder Antagonisten gegen Rezeptoren und Ionenkanäle zu wirken, die sich an einer Zellenoberflächenmembran befinden.
Biologische Zellen enthalten Rezeptormoleküle, die an ihrer äußeren Membran angeordnet sind. Die Funktion dieser Rezeptoren besteht darin, die Zellenumgebung zu "erfassen" und die Zelle mit einem Eingabesignal über Änderungen der Umgebung zu versorgen. In eukaryotischen Organismen besteht eine solche Zellumgebung aus dem Nachbarzellen, und die Funktion des Rezeptors besteht darin, es den Zellen zu ermöglichen, miteinander direkt (parakrines Regulationssystem) oder indirekt (endokrines Regulationssystem) zu kommunizieren und dabei eine harmonisierte Reaktion eines Gewebes, eines Organs oder eines ganzen Organismus zu erreichen. In prokaryotischen Zellen stellen die an der Oberfläche befindlichen Rezeptoren ein Mittel zur Ermittlung der extrazellulären Umgebung dar.
Nach dem Empfang eines solchen Signals, wie beispielsweise Neurotransmitter, Hormone, chemische Attraktantien und Repellantien, senden die an der Oberfläche befindlichen Rezeptoren diese Information über die extrazelluläre Umgebung auf spezifischen intrazellulären Wege in die Zelle, so daß die Zelle spezifisch reagiert, um sich an diese Änderungen anzupassen. Wenn eine veränderte Zufuhr der externen Signalmoleküle oder eine veränderte Aktivität der Zelloberflächenmoleküle vorliegt, wäre die Zellreaktion unnormal und würde eine Fehlfunktion eines Gewebes oder eines Organs bewirken.
In eukaryotischen Zellen bestimmen Rezeptormoleküle die selektive Reaktion der Zelle. Jeder Rezeptortyp kann nur mit einer spezifischen Gruppe von Ligandenmolekülen zusammenwirken. Beispielweise wirken adrenerge Rezeptoren mit Adrenalin und Noradrenalin zusammen, cholinerge Rezeptoren wirken mit Acethylcholin, serotoninerge Rezeptoren wirken mit 5-Hydroxytriptamin zusammen, dopaminerge mit DOPA zusammen usw. Die Zellen, die aus den verschiedenen Geweben abgeleitet sind, exprimieren ausnahmslos spezifische Gruppen von Geweberezeptoren. Verschiedene Rezeptortypen sind mit verschiedenen Signalübermittlungswegen verbunden. Beispielsweise aktiviert ein cholinerger Nikotinrezeptor nach Bindung eines Acetylcholinmoleküls direkt einen Natriumkanal (Claudio et al., 1987). G- Protein-gekoppelte Rezeptoren aktivieren Enzyme zweiter Messenger-Wege, z. B. Adenylatcyclase oder Phospholipase C mit nachfolgender Aktivierung von cAMP- oder Phosphoinositidkaskaden (Divecha und Itvine, 1995). Rezeptortyrosinkinasen aktivieren eine Kaskade von MEK/MAPK-Kinasen, die zur Zelldifferenzierung und -vermehrung führen (Marshall, 1995 und Herskowitz, 1995). Zytokinrezeptoren aktivieren eine JAK/STAT-Kaskade, die wiederum andere Wege regulieren sowie Gentranskription aktivieren kann (Hill und Treismann, 1995).
Neben den Rezeptoren befinden sich auf der Zelloberflächenmembran Ionenpumpen, Ionentransporter und Ionenkanäle. Diese Molekülanordnungen arbeiten gemeinsam daran, eine intrazelluläre Ionenhomeostase zu erhalten. Irgendwelche Änderungen der Aktivität dieser Systeme würden eine Verschiebung der intrazellulären Konzentrationen der Ionen und folglich der Zellstoffwechselreaktion bewirken.
Ionenpumpen sind aktiv, um Transmembranionengradienten zu erhalten, die als Energiequelle ATP verwenden. Beispiele für Ionenpumpen sind: Na&spplus;/K&spplus;-ATPase, die den Transmembrangradienten von Natrium- und Kaliumionen erhält, Ca²&spplus;-ATPase, die den Transmembrangradient von Calciumionen erhält, und H&spplus;- ATPase, die den Transmembrangradienten von Protonen erhält.
Ionentransporter verbrauchen elektrochemische Transmembrangradientenenergie einer Ionenspezies, um Gradienten anderer Ionen-Gegenstücke beizubehalten. Beispielweise verwendet der NA&spplus;/Ca²&spplus;-Tauscher das chemische Potential des Natriumgradienten, das nach innen gerichtet ist, um Calciumionen gegen deren chemisches Potential zu pumpen.
Ionenkanäle ermöglichen es bei Aktivierung, daß sich Ionen entsprechend ihrem elektrochemischen Potential durch die Zellmembran bewegen. Es gibt zwei Haupttypen von Ionenkanälen: spannungsbetriebene und ligandengesteuerte. Spannungsbetriebene Kanäle werden bei Änderungen des elektrischen Transmembranpotentials aktiviert und gehen dabei in den offenen Zustand. Natriumkanäle im Neuronalaxon oder Calciumkanäle des L-Typs in neuromuskulären Verbindungen sind ein Beispiel für diese Kanalart. Ligandengesteuerte Kanäle werden aktiviert und gehen dabei nach Bindung eines bestimmten Liganden mit dem Chemorezeptorteil ihrer Moleküle in den offenen Zustand. Das klassische Beispiel für ligandengesteuerte Kanäle ist ein cholinerger Nikotinrezeptor, der gleichzeitig der Natriumkanal ist.
Es gibt zahlreiche Verfahren zur Ermittlung der Ligand/Rezeptor-Wechselwirkung. Die herkömmlichsten Verfahren sind Verfahren, bei denen die Affinität eines Rezeptors zu einer in Betracht kommenden Substanz in Radioligandenbindungsanalysen gemessen wird. In diesen Analysen mißt man die spezifische Bindung eines radioaktiv markierten Referenz- Ligandenmoleküls bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein verschiedener Konzentrationen der in Betracht kommenden Substanz. Der charakteristische Inhibitionsparameter der spezifischen Bindung des radioaktiv markierten Referenz-Liganden mit der in Betracht kommenden Substanz IC&sub5;&sub0; wird als Maß für die Affinität des Rezeptors zu dieser Substanz genommen (Weiland & Molinoff, 1981 und Swillens et al., 1995). Jüngste Entwicklungen in der Mikrochipsensortechnologie haben es ermöglicht, direkte Wechselwirkungen eines Rezeptormoleküls mit einer in Betracht kommenden Substanz in Echtzeit zu messen. Das Verfahren ermöglicht die Bestimmung sowohl der Assoziations- als auch der Dissoziationsratenkonstanten mit nachfolgender Berechnung des Affinitätsparameters (F_gerstam et al., 1992). Obwohl diese Verfahren sehr genau und bequem sind, ermöglichen sie es nicht, zwischen Agonisten- und Antagonistenaktivität der Substanz zu unterscheiden.
Der Typ der biologischen Aktivität der Substanzen, Agonist oder Antagonist, kann in den auf Zellen beruhenden Analysen bestimmt werden. In den Verfahren, die in Harpold und Brust, 1995 beschrieben sind, werden Zellen, die mit einem Rezeptorgen- und einem Reportergenkonstrukt cotransfiziert sind, verwendet, um ein Mittel zur Identifikation von pharmazeutischen Agonisten- und Antagonistenpotentialsubstanzen bereitzustellen. Diese Verfahren sind unbequem, da sie sehr aufwendige Manipulationen mit Gentransfektionsprozeduren erfordern, sind sehr zeitaufwendig und verwenden künstlich modifizierte Zellen. Um nachzuweisen, daß die agonistische Wirkung einer bestimmten Substanz mit der Simulation eines transfizierten Rezeptors verbunden ist, müssen außerdem auch noch verschiedene Kontrollexperimente mit einer Positiv- und Negativkontrollzellinien durchgeführt werden.
In sehr engem Zusammenhang mit dem Verfahren der Erfindung sind die Verfahren, die in Parce et al., 1994 beschrieben sind. Diese bekannten Verfahren verwenden natürliche Zellen und beruhen auf der Registrierung der natürlichen Zellreaktionen, z. B. der Stoffwechselsäuerungsrate, auf die biologisch aktiven Substanzen. Der Nachteil des Standes der Technik ist eine niedrige Durchsatzgeschwindigkeit, wobei jeder Meßpunkt etwa 3 min dauert. Ein weiterer Nachteil des Standes der Technik ist die Verwendung von Zellen, die auf der Innenfläche der Mikroflußmeßkammer immobilisiert sind. Dies führt dazu, daß getrennte Siliziumsensoren oder Abdeckungen verwendet werden müssen, wobei die Zellen bei jedem Konzentrationspunkt des Agonisten oder Antagonisten an ihnen haften, und zwar für die Rezeptoren, die nach der Bindung an das Agonistenmolekül einer Desensibilisierung unterzogen werden. Dies führt zu einer hohen Variabilität der Versuchsergebnisse.
Ionisiertes Calcium dient im Gegensatz zu anderen intrazellulären Ionenereignissen, z. B. Änderungen der intrazellulären Konzentration von Protonen, Natrium, Magnesium oder Kalium, als das am meisten verbreitete Element auf verschiedenen Signalübermittlungswegen der Zellen, die von Bakterien bis zu spezialisierten Neuronen reichen (Clapham, 1995). Es gibt zwei Hauptpools, die Signalübermittlungswege in der Zelle mit den Calciumionen versorgen, der extrazelluläre Raum und das endoplasmatische Retikulum. Es gibt verschiedene Mechanismen zum Eintritt kleiner Calcium-Stöße in das Zytosol zwecks Signalübermittlung.
Sowohl erregbare als auch nichterregbare Zellen haben auf ihrer Plasmamembran vorwiegend zwei Rezeptorklassen, G- protein-gekoppelte Serpentina-Rezeptoren (GPCSR) und Rezeptortyrosinkinasen (RTK), die den Calciumeintritt in Zellzytoplasma steuern. Sowohl GPCSR- als auch RTK-Rezeptoren aktivieren Phospholipase C, um Phosphatidylinositol in Inositol(1,4,5)¬ triphosphat (InsP&sub3;) und Diacylglycerol umzuwandeln. InsP&sub3; wirkt als intrazellulärer zweiter Messenger und aktiviert einen spezialisierten Rezeptor, der die endoplasmatische retikuläre Membran überspannt. Die Aktivierung dieses Rezeptors löst die Herauslösung von Calciumionen aus dem endoplasmatischen Retikulum aus (Berridge, 1993). Die Calciumionen können auch aus einer extrazellulären Umgebung über spezialisierte spannungsunabhängige, Ca²&spplus;-seleketive Kanäle in das Zytoplasma von erregbaren und nichterregbaren Zellen eindringen, die durch spezifische Liganden ausgelöst werden. In nichterregbaren Zellen verbessert eine Hyperpolarisation der Plasmazellmembran auch das Eindringen von Calciumionen über passive Transmembrandiffusion entlang dem elektrischen Potential. Beispielweise bringt die Öffnung von Kaliumkanälen das Membranpotential auf negativere Werte in der Zelle, wobei das Eindringen von Ca²&spplus; durch die Plasmamembran erleichtert wird. Erregbare Zellen enthalten spannungsabhängige Ca²&spplus;-Kanäle auf ihrer Plasmamembran, die sich bei Membrandepolarisation für eine kurze Zeitperiode öffnen und ein Einströmen von Ca²&spplus; aus externen Medien in das Zytoplasma ermöglichen. Die endoplasmatische Retikulummembran sowie die Plasmamembran von erregbaren Zellen enthalten InsP&sub3;-Rezeptoren und Ca²&spplus;-sensible Ryanodinrezeptoren (RyR), die Ca²&spplus; aus intrazellulären Speichern bei durch Membranrezeptorwirkung ausgelöster Phospholipase-C-Aktivierung bzw. ein depolarisationsinduziertes kurzen Eindringstoßes von Ca²&spplus; in das Zellzytoplasma aus extrazellulären Medien lösen.
Es ist allgemein anerkannt, daß G-protein-gekoppelte Serpentinrezeptoren eine Ca²&spplus;-Mobilisierung durch die Aktivierung von Phospholipase Cβ auslösen (Sternweis und Smrcka, 1992, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird), wogegen Tyrosinkinaserezeptoren Phospholipase Cγ mit nachfolgender intrazellulärer Ca²&spplus;-Mobilisation aktivieren (Berridge & Irvine, 1989).
Es gibt viele Plasmamembran-G-Protein-gekoppelte Serpentinrezeptoren, Tyrosinkinasewachstumsfaktorrezeptoren und spannungs- und ligandenregulierte Kanäle, von denen bekannt ist, daß sie intrazelluläre Ca²&spplus;-Mobilisierung auslösen.
Ca²&spplus; spielt eine wesentliche Rolle in vielen Funktionsprozessen einer Zelle. Beispielweise beeinflußt Ca²&spplus; den Zellzyklus (Means, 1994) und aktiviert spezifische Transkriptionsfaktoren (Sheng et al., 1991). Eine große Anzahl von Rezepto¬ ren und Ionenkanälen verwenden das Ca²&spplus;-Signal, um Ereignisse auszulösen, die so grundlegend sind wie Zellmobilität, Konzentration, Sekretion, Teilung usw.
Die Zunahme der Zytosol- und folglich der Kernkonzentration des Ca²&spplus; kann auch ein zelltodförderndes Signal sein. Eine längere Zunahme von freiem Ca²&spplus; aktiviert beispielweise den Abbauprozeß beim programmierten Zelltod, die Apoptose, aktiviert Nukleasen, die DNA abspalten und Zellchromatin abbauen, fördert die DNA-Aufschließung durch direkte Stimulation von Endonukleasen oder indirekt durch Aktivierung von Ca²&spplus;- abhängigen Proteasen, Phosphatasen und Phospholipasen, was zu einem Verlust an Kromatinstrukturintegrität führt (Nicotera et al., 1994).
Durch die Entwicklung von intrazellulären fluoreszierenden Calciumindikatoren (Grynkiewicz et al., 1985) konnte die intrazelluläre Konzentration von freiem Calcium direkt in der lebenden Zelle gemessen werden. Somit stellt die Möglichkeit, Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration zu registrieren, das Mittel zum Überwachen von Auswirkungen verschiedener Substanzen dar, die bei der Behandlung verschiedener Krankheiten geeignet sind, deren Wirkung man für ein Ergebnis einer Wechselwirkung mit Membranrezeptoren und Ionenkanälen hält.
WO 93/13 423 offenbart automatisierte Meßvorrichtungen und Verfahren für automatisierte Medikamentenscreening- (Medikamentenauswahlprüf-)Verfahren. Die Vorrichtung ist geeignet, schnelle oder vorübergehende Ereignisse, z. B. Zellrezeptoren- und/oder Ionenkanalaktivität auszulösen und zu messen. Die Vorrichtung ist geeignet, eine oder mehrere Proben, die in einem Mehrlochbehälter enthalten sind, mit vorbestimmten Positionen auszurichten, die Reaktion durch Zugabe von Reagenzien auszulösen und ein resultierendes Attribut für eine Zeitperiode zu messen. Die Vorrichtung ist geeignet, Daten, die dem gemessenen Attribut entsprechen, vor, während und nach Auslösung der Reaktion kontinuierlich zu messen, so daß ein Zeitverlauf des schnellen oder vorübergehenden Ereignisses bestimmt werden kann. Nachdem die Reaktion(en) in einer oder mehreren Löchern des Mehrlochbehälters beendet ist/sind, kann die Vorrichtung eine oder mehrere verschiedene zu analysierende Löcher mit der vorbestimmten Position ausrichten und den Zyklus wiederholen, bis eine vorbestimmte Anzahl von Löchern analysiert ist. Automatisierte Medikamentenscreeningverfahren, die die Vorrichtung verwenden, werden auch zum Screening von Substanzen bereitgestellt, die zelluläre Ionenkanal- oder Rezeptoraktivität aktivieren, inhibieren oder potenzieren. Die Analysen sind auf einem Fluoreszensindikator beruhende Analysen, die lebende Zellen verwenden, die in ihrem Zytoplasma effektive Meßstärken eines Fluoreszenzindikators enthalten, der für Veränderungen der Ionenkonzentration verantwortlich ist. Die Aktivierung der Ionenkanäle oder Rezeptoren wird in der automatischen Meßvorrichtung ausgelöst, indem ein Reagens, das ein bekannter oder mutmaßlicher Aktivator der in Betracht kommenden Ionenkanäle oder Rezeptoren ist, in eine oder mehrere vorbestimmte, Zellen enthaltende Löcher injiziert wird. Die resultierende Aktivität der Ionenkanäle oder Rezeptoren, die Änderungen der Ionenkonzentration des Zytoplasmas bewirken, wird durch Messung der Fluoreszenzintensitätsänderungen des Indikators als Reaktion auf eine Erregungswellenlänge bestimmt.
WO 90/04 645 betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Ermittlung der Wirkungen von zellbeeinflussenden Agenzien auf lebende Zellen. Die Verfahrensschritte schließen die Bereitstellung von lebenden Zellen ein, die in einer Mikrostromkammer festgehalten werden. Die Mikrostromkammer ist entweder für einen kontinuierlichen oder intermittierenden Strom von Lösungen oder Suspensionen in engem Kontakt mit den Zellen geeignet. Die Lösungen und Suspensionen, die ein zellbeeinflussendes Mittel enthalten, werden dann in engen Kontakt mit den Zellen gebracht, und es wird zumindest eine Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels auf die Zellen durch eine entsprechende Ermittlungseinrichtung gemessen, die mit der Mikrostromkammer operativ verbunden ist.
US-A-4 343 782 offenbart ein Verfahren zur Bioanalyse, das auf der Ermittlung von Änderungen des Membranpotentials einzelner Zellen beruht. Eine Zellsuspension wird mit einer Lösung einer Substanz inkubiert, die in der Lage ist, die Physiologie mindestens einer Teilpopulation der Zellen in der Suspension zu beeinflussen. Während oder nach der Inkubation erfolgt eine Messung, die das Membranpotential der einzelnen Zellen darstellt. Der Vergleich dieser Messungen mit Referenzmessungen liefert Information über: (1) die Lebensfähigkeit der Zellen oder einer Untergruppe von ihnen nach Einwirkung von toxischen Substanzen; (2) das Vorhandensein und die Konzentration von Faktoren oder Liganden in der Lösung, die sich spezifisch an Zellmembranrezeptoren binden; (3) das Vorhandensein von Zellen in der Suspension, die für Faktoren empfindlich ist, von denen bekannt ist, daß sie in der Lösung vorhanden sind; (4) die kumulative Wirkung mehrerer Faktoren in der Lösung auf die Zellen oder eine Teilpopulation von ihnen; und (5) Vergleiche zwischen den Wirkungen mehrerer chemisch unterschiedlicher Faktoren auf die Zellen. Das bevorzugte Verfahren zur Messung des Membranpotentials weist die Schritte auf: Inkubieren der Zellen mit einem membrandurchlässigen, fluoreszierenden, ionischen Farbstoff, der auf gegenüberliegenden Seiten der Zellmembran als Funktion des Membranpotentials verteilt wird, und anschließendes Analysieren der intrazellulären Farbstoffkonzentration durch fotometrische Messungen in einem Durchflußzytometer.
Mit dem Aufkommen von kombinatorischen Chemiemethoden zur Identifizierung von pharmakologisch nützlichen Substanzen wird zunehmend deutlich, daß eine Notwendigkeit für Verfahren und Vorrichtungen besteht, die geeignet sind, automatisierte Kennzeichnung von pharmakologischen Profilen und von entsprechenden Potenzen der Substanzen in synthetisierten kombinatorischen Bibliotheken durchzuführen. Dies würde das schnelle Screening einer großen Anzahl von Substanzen in der kombinatorischen Bibliothek, die Identifikation dieser Substanzen, die biologische Aktivität haben, und die Kennzeichnung dieser Substanzen in bezug auf Potenz, Affinität und Selektivität ermöglichen.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zum Screening und zur quantitativen Kennzeichnung von potentiell pharmakologisch effektiven Substanzen bereitzustellen, die spezifisch mit der Aktivität der Zellmembranrezeptoren, mit Ionenpumpen und Ionenkanälen unter Verwendung von lebenden Zellen zusammenwirken und diese modulieren.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die in der Lage sind, eine Affinität der aktiven Substanzen zu den Bindungsstellen der Zelle zu kennzeichnen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die zwischen agonistischen und antagonistischen Aktivitäten der Substanzen unterscheiden.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die den Charakter des Rezeptor-, Ionenkanal- oder Ionenpumpengebildes zu bestimmen, das gegen aktive Substanzen sensibel ist, die während des Screeningablaufs entdeckt werden.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die Zellrezeptormuster für bestimmtes Zellquellengewebe zu kennzeichnen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, jedes der oben genannten Verfahren mit jedem Element aus einer Serie von Zelltypen durchzuführen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, das Muster von Zelloberflächenrezeptoren zu bestimmen, die in einem oder mehreren Zelltypen exprimiert werden.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, zu bestätigen, daß die Prüfsubstanz die Aktivität eines bestimmten Rezeptors beeinflußt.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Aktivität eines gegebenen Rezeptors in einer Vielzahl verschiedener Zelltypen zu bestimmen, in denen er exprimiert wird.
Es ist eine spezifische Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Erfüllung der oben beschriebenen Aufgaben bereitzustellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Erfüllung jeder der oben genannten Aufgaben für jedes Element aus der Serie von Zelltypen bereitzustellen.
Zumindest einige dieser und weitere Aufgaben werden durch die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung gelöst, die hier offenbart und in den Ansprüchen wiedergegben ist.
Die vorliegende Erfindung ist auf die oben beschriebenen und andere Erfordernisse gerichtet, indem ein Verfahren und entsprechende Vorrichtungen bereitgestellt werden, die die automatisierte Kennzeichnung pharmakologischer Profile und entsprechender Potenzen von Substanzen in synthetisierten kombinatorischen Bibliotheken ermöglicht. Dadurch kann ein schnelles Screening großer Mengen von Substanzen in der kombinatorischen Bibliothek, die Identifikation dieser Substanzen, die biologische Aktivität haben, und die Kennzeichnung dieser Substanzen in bezug auf Potenz, Affinität und Selektivität ermöglicht werden.
Eine Vielfalt von Wirkungen, die durch die zu screenenden Substanzen bewirkt werden, können erfindungsgemäß nachgewiesen und quantitativ gekennzeichnet werden. Vorzugsweise sind diese Wirkungen folgende, ohne darauf beschränkt zu sein: Änderungen der intrazellulären Konzentration von ionisiertem Calcium, cAMP oder pH, Transmembranpotential oder andere physiologische und biochemische Charakteristika von lebenden Zellen, die mit einer Vielfalt von herkömmlichen Mitteln gemessen werden können, beispielweise unter Verwendung von fluoreszierenden, lumineszierenden und farbentwickelnden Farbstoffen.
Die Erfindung schließt auch folgende Verfahren ein: Screening-Verfahren für agonistische und antagonistische Aktivitäten von Medikamenten, Verfahren zur Kennzeichnung ihrer Potenzprofile, Verfähren zur Identifikation der Rezeptorexpressionsmuster der Zellmembran ("Rezeptorfingerabdruck") und Verfahren zur Bestimmung der Toxizitätsprofile für die Substanzen. In diesen Verfahren wird ein ständiger Strom von Zellen mit Strömen der Substanz und einer Standardsubstanz gemischt. Die Wirkungen der Substanz allein und gemischt mit Standardsubstanzen werden gemessen und stellen das Mittel zur pharmakologische Profilierung der Substanz, zum Medikamentenscreening und zur Zellenrezeptormusterkennzeichnung dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die zu screenenden Substanzen und die Standardagonisten- und Standardantagonistensubstanzen in einem 96-Löcher- Plattenformat oder einer anderen regelmäßigen zweidimensionalen Anordnungen, z. B. in einem 48- oder 24-Löcher-Plattenformat oder einer Anordnung von Prüfröhrchen, organisiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die nichthaftenden Zellen in einer Suspension von frei strömenden Zellen gezüchtet, indem sie in einem geeigneten Zellenkultivierungssystem gezüchtet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die natürlich haftenden Zellen, die für ihr Wachstum ein Anhaften an einer Oberfläche erfordern, in dem entsprechenden Zellenkultivierungssystem gezüchtet, das kommerziell vertriebene kugelförmige Mikroperlen enthält, an denen die Zellen während des Wachstums haften.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die natürlich haftenden Zellen, die für ihr Wachstum ein Anhaften an einer Oberfläche erfordern, in den Zellkulturkolben gezüchtet, mit anschließendem Ablösen der Zellen vom Kolbenboden mit einem entsprechenden Lösungsreagenz.
Erfindungsgemäß können entweder eukaryotische oder prokaryotische Zellen verwendet werden. Die Zellen können mit einem Gencode transfiziert werden, um einen in Betracht kommenden Rezeptor, z. B. einen Orphan-Rezeptor, zu exprimieren. Zusätzlich kann eine Vielfalt von Substanzen mit biologisch relevanter Aktivität verwendet werden, einschließlich der folgenden, ohne darauf beschränkt zu sein: Neurotransmitter, Hormone, Toxine, Rezeptoraktivatoren und -inhibitoren, Ionenkanäle und Ionenpumpenmodulatoren, Irritanzien und/oder Medikamente.
Die Zellen, die entsprechend den oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen gezüchtet werden, werden für Messungen von Konzentrationen des intrazellulären Calcium mit einem entsprechenden fluoreszierenden Farbstoff, z. B. mit FURA- 2AM, oder für Messungen des intrazellulären pH mit BCECF-AM gemischt und unter den entsprechenden Bedingungen inkubiert, damit der Farbstoff in die Zelle eindringen kann. Die mit einem Farbstoff versehenen Zellen werden der Vorrichtung zugeführt. In der Vorrichtung werden die Zellen nacheinander mit einer Lösung der zu prüfenden Substanzen vermischt.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit biologischer Aktivität, mit den Schritten: (a) Vereinigen einer homogenen Suspension lebender Zellen mit einer Prüfsubstanz mit einer unbekannten Wirkung, um eine Prüfmischung zu bilden; (b) Leiten der Prüfmischung durch eine Nachweiszone; und (c) Messen der Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Prüfsubstanz, während die. Prüfmischung durch die Nachweiszone strömt. Das Verfahren weist häufig die zusätzlichen Schritte auf: (d) Vereinigen einer homogenen Suspension der Zellen mit einer Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Zellreaktion der Zellen, um eine Standardmischung zu bilden; (e) Leiten der Standardmischung durch die Nachweiszone; und (f) Messen der Zellreaktion der Zellen auf die Standardsubstanz. In einer Ausführungsform werden die Standardsubstanz und die Prüfsubstanz gleichzeitig mit den Zellen in den Vereinigungsschritten vermischt, und im Meßschritt wird die bekannte Wirkung oder eine Änderung der bekannten Wirkung ermittelt. Die Standardsubstanz kann ein Agonist oder ein Antagonist der Zellreaktion sein. In einem Betriebsmodus gilt: Die Schritte (a) und (d) werden gleichzeitig durchgeführt; die Schritte (b) und (e) werden gleichzeitig durchgeführt; und die Schritte (c) und (f) werden gleichzeitig unter Verwendung einer einzigen Suspension der Zellen durchgeführt. In einem anderen Betriebsmodus werden die Schritte (a), (b) und (c) zuerst durchgeführt, und dann werden (d), (e) und (f) durchgeführt; wobei die Prüfsubstanz zusammen mit der Standardsubstanz im Schritt (d) hinzugesetzt wird. Wenn die Zellreaktion im Schritt (c) nachgewiesen wird, um anzuzeigen, daß die Prüfsubstanz aktiv ist, um die Reaktion zu erzeugen, und die Standardsubstanz ein Antagonist ist, dann zeigt eine Abnahme der Zellreaktion vom Schritt (c) zum Schritt (f) an, daß die Prüfsubstanz ein Agonist der bekannten Wirkung ist. Wenn die Zellreaktion im Schritt (c) nicht nachgewiesen wird, was anzeigt, daß die Prüfsubstanz nicht aktiv ist, um die Reaktion zu erzeugen, und die Standardsubstanz ein Agonist ist, dann zeigt eine Änderung der bekannten Wirkung, die im Schritt (f) nachgewiesen wird, an, daß die Prüfsubstanz ein Antagonist der bekannten Wirkung ist. Vorzugweise wird das Verfahren automatisch unter der Steuerung eines programmierbaren Computers mit einer Vielzahl von Prüfsubstanzen und einer Vielzahl von Standardsubstanzen durchgeführt, und es wird eine aufeinanderfolgende Serie von Antagonisten als die Standardsubstanz im Schritt (d) automatisch zugesetzt, wenn die Zellreaktion im Schritt (c) nachgewiesen wird, um anzuzeigen, daß die Prüfsub¬ stanz aktiv ist, um die Zellreaktion zu erzeugen, wodurch eine Abnahme der Zellreaktion, die im Schritt (f) nachgewiesen wird, anzeigt, daß die Prüfsubstanz ein Agonist einer bekannten Wirkung ist; und eine Serie von Agonisten wird als die Standardsubstanz im Schritt (d) automatisch zugesetzt, wenn die Zellreaktion im Schritt (c) nicht nachgewiesen wird, wodurch eine Änderung der bekannten Wirkung, die im Schritt (f) nachgewiesen wird, anzeigt, daß die Prüfsubstanz ein Antagonist der bekannten Wirkung ist.
Wenn in einer Ausführungsform der Erfindung der Schritt (f) anzeigt, daß die Substanz ein Agonist der bekannten Wirkung ist, dann weist das Verfahren den Schritt auf: automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Agonistenaktivität der Prüfsubstanz durch Wiederholung der Schritte (a), (b) und (c) und (d), (e) und (f), während die Konzentration der Prüfsubstanz und der Standardsubstanz geändert wird und resultierende Änderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden; und wenn der Schritt (f) anzeigt, daß die Substanz ein Antagonist ist, dann weist das Verfahren den Schritt auf: automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Inhibition der Zellreaktion bei Vorhandensein der agonistischen Standardsubstanz durch Wiederholung der Schritte (d), (e) und (f), während die Konzentration der Prüfsubstanz und der Standardsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden. Als Wahlmöglichkeit weist das Verfahren, wenn der Schritt (f) anzeigt, daß die Substanz ein Antagonist ist, auch den folgenden Schritt auf: (g) automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktionsaktivierung durch Wiederholung der Schritte (d), (e) und (f) für eine Nullkonzentration der Prüfsubstanz, während die Konzentration der Standardsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden, und anschließendes Wiederholen dieses Schrittes (g) für verschiedene Konzentrationen der Prüfsubstanz. Das Verfahren kann, wenn der Schritt (f) anzeigt, daß die Substanz ein Agonist ist, ferner den Schritt aufweisen: (h) automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktionsaktivierung durch Wiederholung der Schritte (d), (e) und (f) für eine Nullkonzentration der Standardsubstanz, während die Konzentration der Prüfsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden, und anschließendes Wiederholen dieses Schrittes (h) für verschiedene Konzentrationen der Substanz. Die Änderungen der Konzentration der Prüfsubstanz und/oder der Standardsubstanz kann kontinuierlich oder schrittweise erfolgen. Ein bevorzugter Schritt weist den Schritt auf: grafisches Anzeigen der aufgezeichneten Veränderungen der Zellreaktion.
Die Zellreaktion kann jede gewünschte Zellreaktion sein, die gemessen oder nachgewiesen werden kann, während die Zellen in der Suspension an einem Detektor vorbeiströmen. Sie kann nachgewiesen werden, indem die Zellen selbst oder das Medium, in dem die Zellen suspendiert sind, analysiert werden. Zellreaktionen können beispielweise anhand einer Veränderung der intrazellulären Ionenkonzentration, z. B. Calcium, Magnesium, Proton, Natrium oder Kalium, gemessen werden. In einer Ausführungsform wird das Ion unter Verwendung eines intrazellulären Farbstoffs nachgewiesen, z. B. eines sichtbaren und/oder fluoreszierenden Farbstoffs.
In einer weiteren Ausführungsform weist ein Verfahren die Schritte auf: (a) Vereinigen einer homogenen Suspension lebender Zellen mit einer Prüfsubstanz mit einer unbekannten zellulären Wirkung, um eine Prüfmischung zu bilden, (b) Leiten der Prüfmischung durch eine Nachweiszone; (c) Messen einer Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Prüfsubstanz, während die Prüfmischung durch die Nachweiszone strömt; und Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit jedem Zelltyp einer Serie von zu prüfenden Zelltypen, um die Wirkung der Prüfsubstanz auf jeden Zelltyp der Serie von Zelltypen zu messen. In dieser Ausführungsform kann das Verfahren ferner die Schritte aufweisen: Vereinigen einer homogenen Suspension jedes der Zelltypen in der Serie von Zelltypen mit einer Standardsub¬ stanz mit einer bekannten Wirkung auf die Zellreaktion der Zellen, um eine Serie von Standardmischungen zu bilden; Leiten der Serie von Standardmischungen durch die Nachweiszone; und Messen der Zellreaktion jedes der Zelltypen der Standardsubstanz. Die Standardsubstanz kann ein Agonist oder ein Antagonist der Zellreaktion sein.
Die Erfindung weist auch eine Vorrichtung zum automatischen Messen der Wirkung einer Vielzahl von Prüfsubstanzen auf lebende Zellen auf, mit: einem Prüfsubstanzsampler zum sequentiellen Bereitstellen von Proben mehrerer Prüfsubstanzen; einer Zellsuspensionszuführung zur Bereitstellung einer homogenen Suspension lebender Zellen; einer Mischzone, die mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Aufnehmen der Proben der Prüfsubstanzen aus dem Prüfsubstanzsampler und zum Aufnehmen der Suspension lebender Zellen aus der Zellsuspensionszuführung und Mischen jeder Prüfsubstanz mit der Suspension lebender Zellen; und einem Detektor, der mit der Mischzone gekoppelt ist, zum Messen der Zellreaktion der suspendierten Zellen auf jede Prüfsubstanz. Die Vorrichtung kann zusätzlich einen Standardsubstanzsampler aufweisen, der mit der Mischzone gekoppelt ist, zum Bereitstellen einer Probe einer Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Zellreaktion der suspendierten Zellen, wobei die Mischzone die Probe der Standardsubstanz aus dem Standardsubstanzsampler empfängt und die Standardsubstanz mit den suspendierten Zellen mischt und der Detektor die Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Standardsubstanz mißt. In einer Ausführungsform mischt die Mischzone gleichzeitig die Prüfsubstanz und die Standardsubstanz mit den suspendierten Zellen, und der Detektor ermittelt die bekannte Wirkung oder eine Veränderung der bekannten Wirkung. Die Vorrichtung kann auch aufweisen: ein erstes Gradientengerät, das mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum automatischen Regulieren des Konzentrationsgrades der Prüfsubstanz, die vom Prüfsubstanzsampler zur Mischzone weitergeleitet wird, und ein zweites Gradientengerät, das mit dem Standardsubstanzsampler gekoppelt ist, zum automatischen Regulieren des Konzentrationsgrades der Standardsubstanz, die vom Standardsubstanzsampler zur Mischzone weitergeleitet wird. Die Vorrichtung kann ferner ein Umschaltventil aufweisen, das an einem Eingang des Umschaltventils mit dem ersten und dem zweiten Gradientengerät gekoppelt ist und an einem Ausgang des Umschaltventils mit det Mischzone gekoppelt ist, zum selektiven Umschalten des Stroms einer Konzentration der Prüfsubstanz oder einer Konzentration der Standardsubstanz oder beider zur Mischzone, wobei die Prüfsubstanz und/oder die Standardsubstanz dann mit der Suspension von Zellen vermischt wird. Zusätzlich kann die Vorrichtung eine Kalibriereinheit aufweisen, die mit dem Umschaltventil gekoppelt ist, wobei das Umschaltventil auch den Strom einer Kalibrierlösung selektiv umschaltet, die von der Kalibriereinheit in die Mischzone geleitet wird, wobei die Kalibrierlösung mit der Suspension von Zellen vermischt wird.
Die Reaktionszeit der Zellen mit den verschiedenen Prüf- und Standardsubstanzen kann unter Verwendung verschiedener Längen von reaktionsfördernden Leitungen gesteuert werden, die mit dem Ausgang der Mischzone gekoppelt sind, zum Aufnehmen einer Mischung der Zellsuspension, die entweder mit der Prüfsubstanz, der Standardsubstanz oder der Kalibrierlösung vermischt ist, und zum Bereitstellen eines Stromwegs für die Mischung, so daß ausreichend Zeit vorhanden ist, daß die Suspensionszellen mit der Prüfsubstanz, der Standardsubstanz oder der Kalibrierlösung reagieren können, wobei die reaktionsfördernden Leitungen ferner mit dem Eingang des Detektors gekoppelt sind, der die Mischung aus den reaktionsfördernden Leitungen aufnimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Detektor Veränderungen der intrazellulären Ionenkonzentration nach. Bevorzugte Ionen sind oben beschrieben.
Die Vorrichtung kann zusätzlich aufweisen: eine Steuereinrichtung, die mit dem ersten und dem zweiten Gradientengerät, dem Prüfsubstanzsampler, den Standardsubstanzsampler und dem Umschaltventil gekoppelt ist, zum Steuern ihres Betriebs; und einen Computer, der mit der Steuereinrichtung gekoppelt ist, zum Senden von Befehlssignalen an die Steuereinrichtung entsprechend einem Softwareprogramm, das vom Computer implementiert wird, wobei der Computer auch mit dem Detektor gekoppelt ist, um Zellreaktionsmeßsignale zum und vom Detektor zu senden und zu empfangen. Um eine Vorrichtung weiter zu automatisieren, kann der Prüfsubstanzsampler ein automatisierter Samplerroboter sein, der in der Lage ist, eine vorgegebene Prüfsubstanz aus einer Bibliothek von Prüfsubstanzen zu wählen. Eine Steuereinrichtung kann mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt sein, zum Steuern des Betriebs des Prüfsubstanzsamplers unter Verwendung des Computers, der mit der Steuereinrichtung gekoppelt ist, zum Senden von Befehlssignalen an die Steuereinrichtung entsprechend einem Softwareprogramm, das vom Computer implementiert wird, wodurch die Auswahl und das Abrufen von Prüfsubstanzen durch den Prüfsubstanzsampler aus der Prüfsubstanzbibliothek gesteuert wird.
Die Vorrichtung kann den Strom durch die verschiedenen Elemente entweder unter positivem oder negativem Druck lenken.
Eine Ausführungsform weist somit eine Gradientenpumpe mit einem Eingang und einem Ausgang auf, die mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Regulieren des Konzentrationsgrades der Prüfsubstanz, die vom Prüfsubstanzsampler zur Mischzone weitergeleitet wird, wobei der Prüfsubstanzsampler aufweist: eine erste Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Prüfsubstanz; eine zweite Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung; und wobei die Gradientenpumpe mit der ersten und zweiten Ansaugdüse gekoppelt ist und vorgegebene Konzentrationen der Prüfsubstanz aufnimmt, indem die Menge der Prüfsubstanz und der Pufferlösung reguliert wird, die von der ersten bzw. zweiten Ansaugdüse aufgenommen wird, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Prüfsubstanz ist. Diese Ausführungsform kann auch einen Standardsubstanzsampler zur Lieferung einer Probe einer Standardsubstanz an die Mischzone aufweisen. Der Standardsubstanzsampler ist vorzugsweise ein automatisierter Samplerroboter, der in der Lage ist, eine vorgegebene. Standardsubstanz aus einer Bibliothek von Standardsubstanzen auszuwählen. Die Vorrichtung kann auch eine zweite Gradientenpumpe mit einem Eingang und einem Ausgang aufweisen, die mit dem Standardsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Regulieren des Konzentrationsgrades der Standardsubstanz, die vom Standardsubstanzsampler an die Mischzone geliefert wird, wobei der Standardsubstanzsampler aufweist: eine dritte Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Standardsubstanz; eine vierte Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung; und wobei die zweite Gradientenpumpe mit der dritten und vierten Ansaugdüse gekoppelt ist und vorgegebene Konzentrationen der Standardsubstanz aufnimmt, indem die Menge der Standardsubstanz und der Pufferlösung, die von der dritten bzw. vierten Ansaugdüse aufgenommen wird, reguliert wird, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Standardsubstanz ist. Die Vorrichtung kann ferner eine zweite Mischzone aufweisen, die mit den Ausgängen der ersten und zweiten Gradientenpumpe gekoppelt ist, zum Aufnehmen und Mischen der vorgegebenen Konzentrationen der vorgegebenen Prüfsubstanz und der vorgegebenen Standardsubstanz, so daß das Ergebnis der zweiten Mischzone an die erste Mischzone geliefert wird. Ein weiteres Element, das vorhanden sein kann, ist eine Kalibriereinheit zur Bereitstellung einer Kalibrierlösung; und ein Umschaltventil, das aufweist: einen ersten Eingang, der mit der zweiten Mischzone gekoppelt ist, einen zweiten Eingang, der mit der Kalibriereinheit gekoppelt ist, und einen Ausgang, der mit der ersten Mischzone gekoppelt ist, zum Umschalten entweder zwischen dem Strom einer Substanzmischung aus der zweiten Mischzone oder der Kalibrierlösung aus der Kalibriereinheit und zum anschließenden Liefern des Stroms an die erste Mischzone, wobei er mit der Zellsuspension vermischt werden kann. Vorzugsweise weist die Kalibriereinheit auf: eine Kalibriermaximumlösung, die für eine maximale Zellreaktion sorgt, wenn sie mit der Zellsuspension vermischt wird, eine Kalibrierminimumlösung, die für eine minimale Zellreaktion sorgt, wenn sie mit der Zellsuspension vermischt wird, ein Umsteuerventil mit einem ersten Eingang, der mit der Kalibriermaximumlösung gekoppelt ist, und mit einem zweiten Eingang, der mit der Kalibrierminimumlösung gekoppelt ist, zum Umschalten des Stroms entweder der Kalibriermaximumlösung oder der Kalibrierminimumlösung; und eine Pumpe, die mit dem Ausgang des Umsteuerventils und einem Eingang des Umschaltventils gekoppelt ist, zum Pumpen entweder der Kalibriermaximumlösung oder der Kalibrierminimumlösung vom Umsteuerventil in das Umschaltventil. Die Positivdruckversion der Vorrichtung kann auch eine zweite Pumpe aufweisen, die mit einem Eingang der ersten Mischzone gekoppelt ist, zum Pumpen der Suspension von Zellen aus der Zellsuspensionszuführung in die erste Mischzone. Reaktionsfördernde Leitungen mit einem Eingang, der mit einem Ausgang der ersten Mischzone gekoppelt ist, und einem Ausgang, der mit einem Eingang des Detektors gekoppelt ist, zum Bereitstellen eines Stromwegs und einer Reaktionszeitverzögerung für eine Mischung, die aus der ersten Mischzone aufgenommen wird und zum Liefern der Mischung an den Detektor, können auch vorhanden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie oben ausgeführt, kann die Vorrichtung aufweisen: eine Steuereinrichtung, die mit der ersten und zweiten Gradientenpumpe gekoppelt ist, den Prüfsubstanzsampler, den Standardsubstanzsampler und das Umschaltventil, die erste und zweite Mischzone, die erste und zweite Pumpe und das Umsteuerventil, zur Steuerung ihres Betriebs; und einen Computer, der mit der Steuereinrichtung gekoppelt ist, zum Senden von Befehlssignalen an die Steuereinrichtung entsprechend einem Softwareprogramm, das vom Computer implementiert wird, wobei der Computer auch mit dem Detektor gekoppelt ist, um Zellreaktionsmeßsignale zum und vom Detektor zu senden und zu empfangen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch mit negativem Druck arbeiten, indem verwendet wird: eine Pumpe, die mit dem Ausgang des Detektors gekoppelt ist, zur Lieferung eines negativen Drucks an die Vorrichtung, ein Dosierventil, das mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zur Regulierung des Konzentrationsgrades der Prüfsubstanz, die vom Prüfsubstanzsampler zur Mischzone weitergeleitet wird, wobei der Prüfsubstanzsampler ferner eine erste Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Prüfsubstanz, eine zweite Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung aufweist; und das Dosierventil vorgegebene Konzentrationen der Prüfsubstanz aufnimmt, indem die Menge der Prüfsubstanz und der Pufferlösung, die von der ersten bzw. zweiten Ansaugdüse aufgenommen wird, reguliert wird, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Prüfsubstanz ist. Die Negativdruckvorrichtung kann auch einen automatisierten Standardsubstanzsampler aufweisen, der in der Lage ist, eine vorgegebene Standardsubstanz aus einer Bibliothek von Standardsubstanzen auszuwählen, wobei der Standardsubstanzsampler aufweist: eine dritte Ansaugdüse zum Aufnehmen einer vorgegebenen Standardsubstanz und eine vierte Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung; und ein zweites Dosierventil, das mit der dritten und vierten Ansaugdüse gekoppelt ist, zum Aufnehmen von vorgegebenen Konzentrationen der Standardsubstanz, indem die Menge der Standardsubstanz und der Pufferlösung, die von der dritten bzw. vierten Ansaugdüse aufgenommen wird, reguliert wird, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Standardsubstanz ist. In einer Version weist die Vorrichtung auf: ein erstes Ansaugventil, das mit dem Ausgang des ersten Dosierventils verbunden ist, zum Aufnehmen der vorgegebenen Konzentration der Prüfsubstanz und zum Liefern der Prüfsubstanz an die Mischzone und ein zweites Ansaugventil, das mit dem Ausgang des zweiten Dosierventils gekoppelt ist, zum Aufnehmen der vorgegebenen Konzentration der Standardsubstanz und zum Liefern der Standardsubstanz an die Mischzone. Eine Kalibriereinheit kann vorhanden sein, wie oben beschrieben, wie auch reaktionsfördernde Leitungen, Roboterzuführung und Computersteuerung. Die Zellsuspensionszuführung kann aufweisen: ein. Zellsuspensionsreservoir, ein Pufferreservoir, ein drittes Umsteuerventil mit einem ersten Eingang, der mit dem Zellsuspensionsreservoir gekoppelt ist, und einem zweiten Eingang, der mit dem Pufferreservoir gekoppelt ist, zum Regulieren der Konzentration der Zellsuspension, wobei der Puffer ein Verdünnungsmittel der Zellsuspension ist, und ein viertes Ansaugventil, das mit dem Ausgang des dritten Umsteuerventils gekoppelt ist, zum Aufnehmen der Zellsuspensionsmischung vom dritten Umsteuerventil und zum Liefern dieser Mischung an die zweite Mischzone. In einer Ausführungsform weist die Vorrichtung ferner mehrere Zellsuspensionsreservoire auf.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Kennzeichnung der Rezeptoren, die in einer Zelle vorhanden sind, mit den Schritten: (a) Vereinigen einer Suspension von Zellen mit einem Prüfmittel, von dem bekannt ist, daß es die Aktivität eines bestimmten Rezeptors beeinflußt, um eine Prüfmischung zu bilden; (b) Leiten der Prüfmischung durch eine Nachweiszone; (c) Messen einer Zellreaktion der Suspension lebender Zellen auf das Prüfmittel, während die Prüfmischung durch die Nachweiszone strömt, wobei eine Reaktion auf das Prüfmittel anzeigt, daß die Zelle einen Rezeptor exprimiert, von dem bekannt ist, daß er auf das Prüfmittel reagiert; und (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit einer Serie von Prüfmitteln, bis die Wirkungen jedes Prüfmittels gemessen worden sind. Das Prüfmittel kann ein Agonist, ein Antagonist oder eine Mischung aus einem Antagonisten und einem Agonisten sein. In einer Ausführungsform weist das Verfahren ferner auf: Wiederholen der Schritte (a) bis (d) mit einer Serie verschiedener Zelltypen, um die Rezeptoren zu bestimmen, die durch jeden Zelltyp exprimiert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestätigung, daß eine Prüfsubstanz eine Wirkung auf die Aktivität eines Rezeptors hat, mit den Schritten: Inkontaktbringen eines Negativkontrollzelltyps, ohne den Rezeptor, mit dem Prüfmittel, um eine Negativkontrollmischung zu bilden; Leiten der Negativkontrollmischung durch die Nachweiszone; Messen der Zellreaktion der Suspension lebender Zellen auf die Prüfsubstanz, während die Negativkontrollmischung durch die Nachweiszone strömt; Inkontaktbringen von Zellen des gleichen Zelltyps wie der Negativkontrolltyp, die konstruiert und induziert worden sind, um den Rezeptor mit dem Prüfmittel zu exprimieren, um eine Prüfmischung zu bilden; Leiten der Prüfmischung durch die Nachweiszone; Messen der Zellreaktion der Zellen in der Prüfmischung auf das Prüfmittel, wobei eine Differenz der gemessenen Reaktion der Zellen in der Prüfmischung relativ zu der gemessenen Reaktion der Negativkontrollzellen anzeigt, daß das Prüfmittel eine Wirkung auf die Aktivität des Rezeptors hat. Das Prüfmittel kann ein Agonist, eine Antagonist oder eine Mischung aus einem Agonisten und einem Antagonisten sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines oder mehrerer Rezeptoren in einer Serie von Zelltypen mit den Schritten: Vereinigen einer Suspension lebender Zellen, die ein Element der Serie von Zelltypen aufweist, mit einem Prüfmittel, von dem bekannt ist, daß es die Aktivität eines bestimmten Rezeptors beeinflußt, um eine Prüfmischung zu bilden; (b) Leiten der Prüfmischung durch eine Nachweiszone; (c) Messen der Zellreaktion der Suspension lebender Zellen auf das Prüfmittel; (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit jedem Element der Serie von Zelltypen, bis die Wirkung des Prüfmittels in jedem Zelltyp der Serie gemessen worden ist. Das Prüfmittel kann ein bekannter Rezeptoragonist, ein bekannter Rezeptorantagonist, eine Mischung aus einem bekannten Agonisten und einem bekannten Antagonisten, eine Substanz, deren Aktivität unbekannt ist, oder eine Mischung aus einer Substanz, deren Aktivität unbekannt ist, und eine Substanz sein, die ein bekannter Agonist oder ein bekannter Antagonist ist.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsform der Erfindung werden nachstehend ausführlicher in Verbindung mit den Zeichnungen und der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Die bevorzugten Ausführungsformen schränken den Schutzbereich oder den Charakter der Erfindung nicht ein.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Blockschaltbild einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung.
Fig. 2 ist ein Blockschaltbild eines Positivdruck- Fluidsystems, das in einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung verwendet werden kann.
Fig. 3 ist ein Blockschaltbild einer Ausführungsform eines bevorzugten Systems, das in einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung verwendet werden kann.
Fig. 4 stellt ein vereinfachter Algorithmus eines Screeningmodus dar, der in einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung verwendet werden kann.
Fig. 5 stellt einen vereinfachten Algorithmus für einen Potenzmodus dar, der in einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung verwendet werden kann.
Fig. 6 ist ein Flußdiagramm eines bevorzugten Füllmodusbetriebs, der mit einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung implementiert werden kann. Fig. 6 stellt die Kombination von Fig. 6a bis d dar.
Fig. 7 ist ein Flußdiagramm eines bevorzugten Screeningmodusablaufs, der mit einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung implementiert werden kann. Fig. 7 stellt die Kombination von Fig. 7a bis g dar.
Fig. 8 ist ein Flußdiagramm eines bevorzugten Potenzmodusbetriebs, der mit einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung implementiert werden kann. Fig. 8 stellt die Kombination von Fig. 8a bis e dar.
Fig. 9 stellt Versuchsergebnisse einer von det ET-1- Dosis abhängigen Ca²&spplus;-Mobilisierung bei Vorhandensein von BQ- 123 dar.
Fig. 10 stellt eine halblogarithmische Transformation der Daten in Fig. 9 dar.
Fig. 11 stellt die Versuchsergebnisse einer von der dosisabhängigen Inhibition der durch ET-1 induzierten Ca²&spplus;- Mobilisierung in den TE-671-Zellen mit BQ-123 dar.
Fig. 12 stellt die Versuchsergebnisse einer von der ET- 1-Dosis abhängigen Ca²&spplus;-Mobilisierung in TE-671-Zellen mit anschließender Inhibition mit BQ-123 dar.
Fig. 13 stellt einen vereinfachten Algorithmus für einen Zellenabbildungsmodus dar, der in einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung verwendet werden kann.
Fig. 14 stellt einen vereinfachten Algorithmus für eine Funktionskennzeichnung eines Orphan-Rezeptormodus dar, der in einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung verwendet werden kann.
Fig. 15 stellt ein Flußdiagramm eines bevorzugten Zellenabbildungsmodusbetriebs dar, der mit einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung implementiert werden kann. Fig. 15 stellt die Kombination von Fig. 15a bis f dar.
Fig. 16 stellt ein Flußdiagramm eines bevorzugten Orphan-Rezeptorbestimmungsmodusablaufs dar, der mit einer erfindungsgemäßen kombinatorischen Screeningvorrichtung implementiert werden kann. Fig. 16 stellt die Kombination von Fig. 16a bis g dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung stellt eine kontinuierliche Echtzeitüberwachung und Ermittlung der physiologischen und pharmakologischen Wirkung einer Prüfsubstanz auf eine Serie von Zelltypen oder einen einzelnen Zelltyp dar. In ihrer einfachsten Ausführungsform weist die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Inkontaktbringen einer einzelnen Zellsuspension oder einer Serie von Zellsuspensionen, von denen jede einen einzelnen Zelltyp enthält, der in der Serie der zu prüfenden Zelltypen enthalten ist, mit einer vorbestimmten Konzentration von mindestens einer potentiell aktiven Substanz, vorzugsweise mit vorbestimmten Konzentrationen von mindestens zwei aktiven Substanzen. Dann werden intrazelluläre Veränderungen, die als Reaktion auf den Kontakt zwischen den Zellen und den aktiven Substanzen auftreten, kontinuierlich gemessen, während die Suspensionen, die den zu prüfenden Zelltyp oder ein Element der Serie von zu prüfenden Zelltypen und die Prüfsubstanzen enthält, durch einen Detektor strömen.
Man geht davon aus, daß die vorliegende Erfindung beim Hochleistungsscreening ihren größten Wert hat, z. B. beim Screening einer großen Anzahl von Kandidatensubstanzen zur Aktivierung gegen einen oder mehrere Zelltypen. Sie ist beispielsweise von besonderem Wert beim Screening von Bibliotheken synthetischer und natürlicher Produkte zur Ermittlung aktiver Substanzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden eine Prüfsubstanz, eine Standardsubstanz und eine Zellsuspension, die den zu prüfenden Zelltyp oder ein Element der Serie von zu prüfenden Zelltypen enthält, kontinuierlich miteinander vermischt und nach einer Inkubationsperiode an einem Detektor vorbeigeführt, der die Konzentration in den Zellen oder im intrazellulären Medium des mindestens einen Analyts mißt. In einer Ausführungsform wird die Konzentration der Prüfsubstanz und/oder der Standardsubstanz über die Zeit geändert, um Dosen-Reaktionskurven als Ausgangssignal des Detektors zu erzeugen.
Es wird bevorzugt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung unter Steuerung eines Computers oder einer anderen programmierbaren Steuereinrichtung arbeitet. Die Steuereinrichtung kann die Ergebnisse jedes Schritts des Ablaufs kontinuierlich überwachen und kann das Prüfparadigma als Reaktion auf die Ergebnisse automatisch ändern.
Die Inkubationsperiode nach dem Mischen der Substanz oder Substanzen und der Zellen kann vorteilhaft gesteuert werden, indem die Mischung über eine Länge einer Rohrleitung geführt wird, die die Mischzone mit dem Detektor verbindet. Die Inkubationsperiode wird somit von der Durchflußrate und der Länge der Röhre bestimmt. Inkubationsperioden können in Abhängigkeit von dem bestimmten Analyt und von der resultierenden Reaktionszeit um mehrere Größenordnungen variieren. Beispielweise könnte die Inkubationsperiode nur 1 s oder einen Bruchteil einer Sekunde bei schnellen oder kurzlebigen physiologischen Reaktionen oder wenige Minuten oder auch Stunden betragen.
Der Analyt kann jeder Analyt sein, der ohne weiteres durch Detektoren und/oder Detektor/Chemie-Kombinationen nachweisbar ist. Somit sind verschiedene Ionen- oder Elektrolytkonzentrationen, kolorimetrische Veränderungen, optische Dichteänderungen, Fluoreszenz, Lumineszenz, pH, Gaserzeugung und dgl. ohne weiteres zur Verwendung bei dem Verfahren und in der Vorrichtung verwendbar.
Beim Nachweisen von Ionen- oder Elektrolytänderungen werden kalorimetrische oder fluoreszierende Farbstoffe in einer besonders bevorzugten Ausführungsform verwendet. Beispielweise ist ein Calciumion durch Sonden nachweisbar, z. B. durch Fura-2, Indo-1, Fura Red oder Quin-2, Natriumionen durch SBFL, Protonionen durch BCECF, SNAFL, DM-NERF, Magnesiumionen durch Mag-Fura-2 oder Mag-Fura-5, Chloridionen durch SPO, SPA oder MOAE. Alle diese Farbstoffe werden beispielweise von Molecular Probes, Inc., Oregon vertrieben.
Fig. 1 stellt eine schematische Konfiguration einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dar. Die bevorzugte Ausführungsform besteht aus einem Prüfsubstanzsampler 101 zum Aufnehmen und Halten einer Probe einer zu prüfenden Substanz; einem Standardsampler 103 zum Aufnehmen und Halten einer Probe einer Standardlösung (z. B. einer Pufferlösung und/oder eines bekannten Agonisten oder Antagonisten), die mit der zu prüfenden Substanz zu vermischen ist, einem Konzentrationsgradientengerät 105, das mit dem Substanzsampler 101 verbunden ist, zum Steuern des Durchflußvolumens der zu prüfenden Substanz; einem Konzentrationsgradientengerät 107, das mit dem Standardsampler 103 verbunden ist, zum Steuern des Durchflußvolumens der Standardlösung; einem Umschaltventil 111 zum Aufnehmen einer Sub¬ stanz/Standardlösungsmischung oder einer Kalibrierlösung und zum Leiten derselben zur Mischzone 112 zum Vermischen einer dieser Lösungen mit Zellsuspensionen, die einen zu prüfenden Zelltyp oder ein Element einer Serie von zu prüfenden Zelltypen enthalten; mindestens einem Zellsuspensionsreservoir 113 (und wenn eine Serie von Zelltypen zu prüfen ist, mit mehreren Zellsuspensionsreservoiren, von denen jedes eine Zellsuspension eines der Zelltypen in der zu prüfenden Serie enthält); einer Kalibriereinheit 117 zum Liefern von Kalibrierlösungen an das Umschaltventil 111, so daß die Kalibrierlösungen mit der Zellsuspension in vorbestimmten Verhältnissen gemischt werden können; einer reaktionsfördernden Leitungseinheit 115 zum Aufnehmen der Zellsuspensionen, die entweder mit der Substanz/Standardlösungsmischung oder der Kalibrierlösung vermischt sind, und zum Weiterleiten dieser Mischung zum Detektor 119; und einem Abfluß 121 zum Aufnehmen und Ablassen der Mischung aus dem Detektor 119, nachdem die Zellreaktion vom Detektor 119 nachgewiesen und gemessen worden ist. Die Steuereinrichtung 109 ist mit dem Prüfsubstanzsampler 101, dem Standardsampler 103, den Gradientengeräten 105 und 107 und dem Umschaltventil 111 gekoppelt. Die Steuereinrichtung steuert die oben genannten Vorrichtungen, indem Befehlssignale von einem Computer 123 empfangen werden, der wiederum Signale entsprechend einem Softwareprogramm 125 erzeugt, sendet und empfängt. Die Mischzone 112 kann eine Kammer, eine Röhre, eine Serie von Prallplatten oder jede andere Struktur aufweisen, in der eine Vermischung erfolgen kann.
Nachdem eine Substanz und/oder ein Standard mit Zellen in einer Mischzone 112 vermischt worden ist, die ohne weiteres im Handel erhältlich ist und die in der bevorzugten Ausführungsform der statische Mischer 125-1345 (Bio Rad) ist, wird diese Mischung dann über reaktionsfördernde Leitungen 115 weitergegeben, so daß sie gründlicher gemischt und mit ausreichender Zeit bereitgestellt werden kann, damit die Reagenzien gründlich miteinander reagieren können. Der Detektor 119 ist mit der reaktionsfördernden Leitungseinheit 115 verbunden und nimmt die Zell-/Substanz-/Standardmischung aus den reaktionsfördernden Leitungen 115 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist jeder der Sampler 101 und 103 eine Nippdüse auf, die in einer Ampulle positioniert sein kann, die eine jeweilige Substanz oder Standardlösung enthält. Diese Sampler sind dem Fachmann bekannt und sind handelsübliche Produkte, z. B. A/S 300 Autosampler, Katalognummer 15006330, Scientific Measurement Systems, Inc., Colorado. Zur Handhabung mehrerer Proben kann eine herkömmliche automatisierte oder Roboterausrüstung (nicht dargestellt) verwendet werden, um die Vorrichtung mit den Proben zu versorgen. Banken mit verschiedenen Proben, die im 48- oder 96- Löcher-Plattenformat angeordnet sind, können leicht von einem solchen automatisierten Samplergerät bedient werden.
Die Gradientengeräte 105 und 107 sind ebenfalls handelsübliche Geräte, z. B. die Gradientenpumpe GP40 (Dionex). Je nach Wirkungsweise können die entsprechenden Konzentrationsgradientengeräte 105 und 107 entweder diskrete Konzentrationen oder kontinuierliche Gradienten von Konzentrationen der zu prüfenden Substanz oder der Standardsubstanz (Agonist oder Antagonist) herstellen, indem sie mit Pufferlösung verdünnt werden. Wenn beispielweise eine kontinuierliche Kurve der Zellreaktion gegen Substanzkonzentration bei Vorhandensein einer Standardsubstanz gewünscht wird, weist der Computer 123 die Steuereinheit 109 an, die Gradientengeräte 105 und 107 so zu steuern, daß kontinuierliche Gradienten einer jeweiligen Substanz und einer vorbestimmten konstanten Konzentration einer Standardlösung an das Umschaltventil 111 übergeben werden. Wenn als Alternative eine kontinuierliche Kurve der Zellreaktion gegen Standardlösungskonzentration bei Vorhandensein einer Substanz gewünscht wird, weist der Computer 123 die Steuereinheit 109 an, die Gradientengeräte 105 und 107 so zu steuern, daß kontinuierliche Gradienten der jeweiligen Standardlösung und einer vorbestimmten konstanten Konzentration der jeweiligen Substanz an das Umschaltventil 111 übergeben werden.
Die Kalibriereinheit 117, die mit dem Umschaltventil 111 verbunden ist, liefert Kalibrierlösungen, die benötigt werden, um das Ausgangssignal, MAX und MIN, der Vorrichtung zu kalibrieren. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht diese Kalibriereinheit aus einem Umsteuerventil, das eine handelsübliche Vorrichtung ist, z. B. Umsteuerventil SV3-2 (Bio- Rad). Das Umsteuerventil wechselt zwischen der Zufuhr von zwei Kalibrierlösungen zum Umschaltventil 111. Das Umschaltventil 111 vereinigt die Abflüsse aus den Gradientengeräten 105 und 107 oder als Alternative aus der Kalibriereinheit 117 mit dem Zellenstrom aus einem Zellsuspensionsreservoir 113 (oder aus einem der mehreren Zellsuspensionsreservoire 113, von denen jedes einen Zelltyp in einer Serie von zu prüfenden Zelltypen enthält) und leitet den gemischten Strom in eine der reaktionsfördernden Leitungen 115. Das Umschaltventil 111 ist ein Umschaltventil, das in der Industrie allgemein bekannt ist und in einer bevorzugten Ausführungsform das Dreiwege-Mikroventil 4-8-900 ist, das von General Valve Corp. hergestellt wird. Das/die Zellsuspensionsreservoir(e) 113 sind auch Reservoire, die dem Fachmann bekannt sind und in einer bevorzugten Ausführungsform ein normales Becherglas. Die Zellen werden bis zur Einleitung in das Gerät durch einfaches langsames Scherrühren in Suspension gehalten.
Die reaktionsfördernden Leitungen 115 sind normalerweise Röhren, die aus einem nichtkorrodierenden Material bestehen und einen vorgegebenen Durchmesser haben, durch den die oben erwähnte Mischung aus Zellsuspension, Substanz und Standardlösung strömen kann. Beispielweise kann Polyethylen-, Polypropylen- oder Polytetrafluorethylenrohr verwendet werden. Röhren, an denen Zellen und andere Reagenzien nicht haften, werden besonders bevorzugt. Der Durchmesser der Röhren kann gewählt werden. Kapillarröhren mit einem Innendurchmesser von etwa 0,2 bis 2 mm sind besonders vorteilhaft, da sie die Verwendung sehr kleiner Probengrößen ermöglichen.
Diese Röhren sind normalerweise in einer gewundenen Konfiguration angeordnet, so daß die Mischung, während sie durch sie strömt, gründlich bewegt und vermischt wird. Obwohl die Mischung vor Einleitung in die Röhren gut gemischt wird, läßt eine spiralförmige oder gewickelte Konfiguration lange Röhrenlängen in einem kompakten Bereich zu. Diese reaktionsfördernden Leitungen 115 sind handelsüblich und können in einer Ausführungsform aus Teflonrohr sein.
Die Mischung aus einer Zellsuspension, die einen zu prüfenden Zelltyp oder einen Zelltyp enthält, der eine Serie von zu prüfenden Zelltypen aufweist, und aus Substanz/Standardlösung, die auch als "Reaktionssuspension" bezeichnet wird, tritt in die Durchflußküvette oder andere Nachweiszone des Detektors mit einer Zeitverzögerung oder nach einer Inkubationsperiode ein, die von der Länge der reaktionsfördernden Leitung 115 bestimmt wird. Wenn die Reaktionssuspension den Detektor 119 erreicht, kann der Detektor 119 die Zellsuspensionsreaktion auf die vorgegebene Konzentration der Prüfsubstanz messen. In einer bevorzugten Ausführungsform mißt der Detektor 119 ein Fluoreszenzsignal von dem calciumempfindlichen Farbstoff FURA 2, dessen Spektralcharakteristik von einer Konzentration des intrazellulären ionisierten Calcium abhängt, um den Zellaktivitätsgrad zu bestimmen. Um diese Messung durchzuführen, bestrahlt der Detektor 119 alternierend die Reaktionssuspension, die durch die optische Durchflußküvette strömt, mit Licht der Wellenlänge 340 und 380 nm und mißt die Fluoreszenzintensität bei 540 nm. Das Verhältnis (R) zwischen den Fluoreszenzintensitäten, die mit 540 nm bei Erregung mit 340 bzw. 380 nm registriert werden, wird an den Computer 123 übertragen. Der Computer 123 berechnet die Konzentration des intrazellulären ionisierten Calciums nach der folgenden Gleichung, die dem Fachmann bekannt ist:
[Ca2+] = Kd(R - Rmin)/Rmax - R)(If/Ib)
wobei Kd die Dissoziationskonstante des Calcium/FURA-2- Komplexes ist und Rmin und Rmax die Verhältnisse sind, die bei Vorhandensein der Kalibrierlösungen MIN bzw. MAX ermittelt werden, und If und Ib Fluoreszenzintensitäten sind, die mit 540 nm bei Erregung mit 380 nm bei Vorhandensein von Kalibrierlösungen MIN bzw. MAX gemessen werden. Ein Computer 123, der mit dem Detektor 119 verbunden ist, bestimmt dessen Betrieb. Der Computer 123 ist auch mit der Steuereinrichtung 109 verbunden oder Teil dieser Steuereinrichtung, die das erste und zweite Gradientengerät 105 und 107, das Umschaltventil 111 sowie den Prüfsubstanzsampler 101 und den Standardsampler 103 entsprechend einer Software 125 steuert, die im Computer 123 implementiert wird. Der Detektor 119 ist in der Lage, das bestimmte gewünschte Signal zu messen, ganz gleich, welchen Ursprung es hat. Ein optischer Detektor 119 kann ein Spektralphotometer, Spektralfluorometer oder ein Luminometer sein, von denen jedes eine Durchflußküvette hat. Diese Geräte sind dem Fachmann bekannt und handelsüblich. Beispielweise kann eine erfindungsgemäße Ausführung der Vorrichtung ein Lumineszenz- Spektralfluorometer AMINCO-Bowman, Serie 2 (Fa-256, Spectronic Instruments, Inc.) verwenden. Wenn der Detektor eine direkte Ionenmeßvorrichtung ist, kann er beispielsweise einen pH- Sensor oder eine ionenselektive Elektrode aufweisen. Natrium-, Calcium- und Kaliumdetektoren sind Beispiele für solche Vorrichtungen. Detektoren dieses Typs sind handelsüblich. Alle Vorrichtungen können mittels eines Computers 123 während des Datenerfassungsablaufs gesteuert werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist in zwei verschiedenen spezifischen Ausführungsformen denkbar. Ein Positivdrucksystem kann mit Kolbenpumpen oder anderen geeigneten Pumpen bereitgestellt werden, die Reagenzien unter positiven Druck zuführen. Als Alternative kann ein Negativdrucksystem mit einer peristaltischen Pumpe oder einer anderen geeigneten Pumpe bereitgestellt werden, die Reagenzien durch das System zieht. Das Negativdrucksystem ist die einfachste Ausführungsform, da eine große Anzahl von Bezugsquellen von einer einzigen nachgeschalteten Pumpe betrieben werden können.
Fig. 2 stellt eine schematische Konfiguration einer Ausführungsform eines Positivdruckfluidsystems dar. In einer bevorzugten Ausführungsform arbeitet dieses System automatisch unter der Steuerung einer programmierbaren Steuereinrichtung, wie unten ausführlich beschrieben wird. Die Ausführungsform weist auf: einen Autosampler 201, der eine oder mehrere zu prüfende Substanzen 203 und eine Pufferlösung 205 enthält, die mit der Substanz 203 gemischt werden kann, um verschiedene Konzentrationen der Substanz 203 bereitzustellen; Ansaugdüsen oder Öffnungen 207 und 209 zum Aufnehmen einer Substanz bzw. einer Pufferlösung und zum Abgeben derselben an eine Gradientenpumpe 211, die den Konzentrationsgrad und den Zufluß einer Prüfsubstanz 203 in eine Mischzone 227 steuert; einen Autosampler 213, der eine oder mehrere Standardlösungen (d. h. Antagonisten 215 und/oder Agonisten 217) und eine Pufferlösung 219 enthält, die mit der Standardlösung 215 oder 217 vermischt werden kann, um verschiedene Konzentrationen der Standardlösung bereitzustellen. Ansaugdüsen oder Einlaßöffnungen 221 und 223 zum Aufnehmen einer Standardlösung bzw. einer Pufferlösung und zum Übergeben derselben an eine Gradientenpumpe 225, die den Konzentrationsgrad und den Zufluß einer Standardlösung (Agonist oder Antagonist) in die Mischzone 227 steuert. Jede gonist oder Antagonist) in die Mischzone 227 steuert. Jede der Gradientenpumpen 211 bzw. 225 kann vorteilhafterweise zwei Einlaßrohrleitungen und eine Auslaßrohrleitung haben, wobei die Auslaßrohre über die Mischzone 227 miteinander verbunden sind. Eine Steuereinrichtung (109 in Fig. 1), die nicht in Fig. 2 gezeigt ist, steuert den Betrieb der Autosampler 201 und 213 und der Gradientenpumpen 211 und 225, indem sie Fernsteuersignale liefert, um den Pumpbetrieb zu starten/stoppen. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Gradientenpumpe 211 und 225 Pumpen folgenden Typs sein: Gradientenpumpe GP 40, hergestellt von Dionex.
Die Mischzone 227 nimmt die Substanzlösung, die durch die Gradientenpumpe 211 strömt, und wahlweise eine Standardlösung auf, die durch die Gradientenpumpe 225 strömt, und vermischt die Substanz- und die Standardlösung miteinander. Ein Umsteuerventil 235 wechselt zwischen der Zufuhr der Kalibrierlösung für maximale Reaktion 233 oder der Kalibrierlösung für minimale Reaktion 237. Das Umsteuerventil 235 weist vorzugsweise zwei Einlaßröhren, eine Röhre für jede der beiden verschiedenen Kalibrierlösungen 233, 237, und eine Auslaßröhre auf, die mit einer Pumpe 231 verbunden ist. Das Umsteuerventil 235 ist dem Fachmann bekannt und kann durch das Umsteuerventil SC-3 (BioRad) implementiert werden. Die Steuereinrichtung (109 in Fig. 1), die in Fig. 2 nicht gezeigt ist, sendet Signale an das Umsteuerventil 235, das Einlaßöffnungen umschaltet, um eine Kalibrierlösung 233 oder eine andere 237 mit dem Einlaß der Pumpe 231 zu verbinden. Die Pumpe 231 zur Zuführung von Kalibrierlösungen zum Fluidsystem ist auch in Fig. 2 gezeigt. Die Pumpe 231 nimmt entweder die Kalibrierlösung für maximale Antwort 233 oder die Kalibrierlösung für minimale Antwort 237 vom Umsteuerventil 235 auf und pumpt dann die aufgenommene Kalibrierlösung zum Umschaltventil 229. Die Auslaßröhre der Pumpe 231 ist mit einem Einlaß des Umschaltventils 229 verbunden. Die Pumpe 231 ist vorteilhafterweise eine normale Kolbenpumpe, die dem Fachmann bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pumpe 231 eine Pumpe mit sanftem Anlauf der Serie 1350 (BioRad). Das Umschaltventil 229 wechselt zwischen der Zufuhr der Substanz/Standardmischung und einer der Kalibrierlösungen in die Mischzone 239. Eine Pumpe 241 liefert Zellen aus einem Zellsuspensionsreservoir 243, das einen zu prüfenden Zelltyp enthält (oder aus einem der mehreren Zellsuspensionsreservoire 243, die jeweils aus einem Zelltyp bestehen, der in einer Serie von zu prüfenden Zelltypen enthalten ist), in die Mischzone 239. Die Pumpe 241 nimmt Zellen aus dem Zellsuspensionsreservoir 243 aus einer Einlaßröhre auf und pumpt die aufgenommenen Zellen durch eine Auslaßröhre zum Einlaß der Mischzone 239. Die Substanz/Standardlösungen oder die Kalibrierlösungen kommen durch einen anderen Einlaß der Mischzone 239. Beide Mischzonen 227 und 239 sind dem Fachmann bekannt und können in einer bevorzugten Ausführungsform durch den statischen Mischer 125-1345 (BioRad) implementiert werden. Die Pumpe 241 kann eine normale Kolbenpumpe sein, die dem Fachmann bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pumpe 241 eine Pumpe mit sanftem Anlauf der Serie 1350 (BioRad). Die Mischung aus Zellen und Substanz/Standardlösung oder Zellen und einer Kalibrierlösung wird dann aus der Mischzone 239 in reaktionsfördernde Leitungen 245 geleitet. Die Länge dieser Leitungen bestimmt in Verbindung mit der Durchflußmenge die Inkubationsperiode, d. h. die Zeit, die vergeht von dem Punkt, wo die Zellen mit der Substanz/Standardmischung oder der Kalibriermischung gemischt werden, bis zu dem Punkt, wo sie den Detektor 247 erreichen. Der Detektor 247 mißt dann den Grad der Zellreaktion infolge der Substanz/Standardmischung oder der Kalibrierlösung. Nachdem die Zellreaktion vom Detektor 247 gemessen worden ist, wird die Mischung dann über den Abfluß 249 aus dem Detektor abgelassen.
Fig. 3 stellt eine schematische Konfiguration einer bevorzugten Ausführungsform des Negativdruckfluidsystems dar. Wie in Fig. 3 gezeigt, weist eine bevorzugte Ausführungsform auf: einen Autosampler 301, der einen oder mehrere Substanzen (Ni) 303 und eine Pufferlösung 305 enthält, wobei der Autosampler 301 ferner zwei Ansaugdüsen oder Einlaßöffnungen 307 und 309 aufweist, zum Aufnehmen der Substanz (Ni) 303 bzw. der Pufferlösung 305; ein Dosierventil 311 zum Aufbereiten von Lösungen der Substanz 303 mit der Pufferlösung 305 in vorbestimmten oder vorgegebenen Verhältnissen und zum Abgeben dieser Mischung an ein Füllventil 313; einen Autosampler 315, der Standardantagonisten (Mj) 317, Agonisten (Lk) 319 und Pufferlösung 305 enthält, wobei der Autosampler 315 ferner aufweist: zwei Ansaugdüsen 323 und 325 zum Aufnehmen der Standard- bzw. der Pufferlösung; ein Dosierventil 327 zum Aufbereiten von Verdünnungen der Standardsubstanz 317 oder 319 mit Pufferlösung 305 in vorbestimmten oder vorgegebenen Verhältnissen und zum Abgeben dieser Mischung an ein Füllventil 329. Die Dosierventile 311 und 327 können Ventile sein, die dem Fachmann bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Ventile 311 und 327 Miniaturmagnetventile der Serie 4 (4-8-900 General Valve Corp.), die in einem Dosierfrequenzmodus arbeiten. Ebenso können die Füllventile 313 und 329 jedes (normalerweise geöffnete) Ventil sein, das dem Fachmann bekannt ist, und in einer bevorzugten Ausführungsform sind es Miniaturmagnetventile der Serie 4 (4-39-900), hergestellt von General Valve Corp.
Eine Mischzone 331 mischt eine Substanzlösung, die vom Füllventil 313 aufgenommen wird, und eine Standardlösung, die vom Füllventil 329 aufgenommen wird. Die erste Mischzone 331, wie im Zusammenhang mit der anderen Mischzone hier beschrieben, kann aufweisen: einen einfachen "Y"-Verbinder; eine Kammer mit einem Durchmesser, der das Mehrfache der Röhren beträgt; eine Länge der Röhren; eine gewundene, mit Prallplatten versehene Kammer; eine Kammer, die einen mechanischen Drehmischer enthält; oder irgend eine andere geeignete Struktur. Normalerweise arbeitet das Verfahren mit sehr kleinen Mengen Flüssigkeit (ein Durchlauf mit einem Gradienten der vollen Konzentration kann beispielweise mit einer Probe von nur 0,3 ml erfolgen). Somit sind die zu mischenden Volumen klein, und die Mischzone sollte ein kleines Innenvolumen und eine hohe Mischeffizienz haben. Diese Typen von Mischern sind dem Fachmann bekannt, und in einer bevorzugten Ausführungsform kann er implementiert werden mit dem Mikromischer von Visco Jet® (Nr. TCMA0120113T), hergestellt von The Lee Company.
Ein Umsteuerventil 335 wechselt zwischen der Zufuhr einer Kalibrierlösung für Maximalreaktion 337 oder einer Kalibrierlösung für Minimalreaktion 339. Das Umsteuerventil 335 weist zwei Einlaßröhren zum Aufnehmen der beiden verschiedenen Kalibrierlösungen und eine Auslaßröhre auf, die mit einem weiteren Umsteuerventil 333 verbunden ist. Das Umsteuerventil 333 kann zwei Einlaßröhren haben, eine zum Aufnehmen der Substanz/Standardlösungsmischung und die andere zum Aufnehmen einer der Kalibrierlösungen 337 oder 339. Das Umsteuerventil 333 wechselt dann zwischen der Zufuhr der Substanz/Standardlösungsmischung oder einer der Kalibrierlösungen durch eine Auslaßröhre zum Füllventil 341, das das aufgenommene Fluid an eine Mischzone 343 liefert. Ein drittes Umsteuerventil 347 wechselt zwischen der Zufuhr von Zellen aus einem Zellsuspensionsreservoir 349, das einen zu prüfenden Zelltyp enthält, (oder von einer der mehreren Zellsuspensionsreservoire, die jeweils einen Zelltyp enthalten, der in einer Serie von zu prüfenden Zelltypen enthalten ist) oder der Pufferlösung 305 durch eine Auslaßröhre 346 zu einem Füllventil 345, das dann entweder die Zellen oder Pufferlösung an die Mischzone 343 abgibt, wo sie mit entweder einer Substanz/Standardlösungsmischung oder einer der Kalibrierlösungen gemischt werden, die vom Füllventil 341 aufgenommen werden. Die Umsteuerventile 333, 335 und 347 können jeder Ventiltyp sein, der dem Fachmann bekannt ist, z. B. das Umsteuerventil SV-3 (BioRad). Diese Mischung wird dann reaktionsfördernden Leitungen 353 übergeben, die die Zeit bestimmen, die vergeht von dem Punkt, wo die Zellen mit der Substanz/Standardlösungsmischung oder einer der Kalibrierlösungen vermischt werden, bis zu dem Punkt, wo die Mischung die Detektorküvette 355 erreicht. Wie oben beschrieben, können die reaktionsfördernden Leitungen 353 und der Detektor 355 von jedem Typ sein, der dem Fachmann bekannt ist.
Eine peristaltische Pumpe 357, die als Negativdruckpumpe verwendet wird, kann vorteilhafterweise den notwendigen Druck liefern, der erforderlich, ist, damit die verschiedenen Lösungen und Mischungen, die oben beschrieben sind, durch die verschiedenen Ventile (311, 327, 329, 333, 335, 341, 345 und 347), Mischzonen (331 und 343), reaktionsfördernden Leitungen 353, den Detektor 355 und schließlich zum Abfluß 359 strömen können. Geeignete peristaltische Pumpen 357 sind in der Industrie bekannt und können in einer bevorzugten Ausführungsform durch eine Econo-Pumpe EP-1 (BioRad) implementiert werden. Die Pumpen, Ventile, Detektoren und andere aktive Komponenten des Systems stehen vorzugsweise unter automatischer Steuerung durch eine programmierbare Steuereinrichtung, wie nachstehend ausführlich beschrieben wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat zwei primäre Betriebsmodi, einen Screeningmodus und einen Potenzmodus.
Fig. 4 zeigt einen Algorithmus, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, um eine Zellreaktion während des Screeningmodus nachzuweisen. Zuerst wird eine Zell/Substanzmischung an einen Detektor übergeben (Schritt 401). Als nächstes bestimmt die Vorrichtung, ob die Substanz bei Kontakt mit den Zellen eine Zellreaktion auslöst (Schritt 403). Es gibt zwei Möglichkeiten: entweder die Substanz ruft keine Reaktion hervor (Nein) oder sie ruft die Zellreaktion hervor (Ja). Die Zellreaktion wird bestimmt, indem das Signal vom Detektor für den bestimmten nachzuweisenden Analyt überwacht wird. Das Steuersystem führt zunächst eine Kalibrierung durch, um eine Basislinie und eine Maximalreaktion festzulegen, und jedes Signal vom Detektor, das zwischen diesen Werten liegt, gilt als positive Reaktion.
Wenn die Substanz keine Zellreaktion bewirkt (Nein), wie vom Überwachungsteil der Vorrichtung gemessen, werden die Zellen nacheinander und automatisch mit einer Mischung aus der Substanz und den Standardsubstanzen aus einer vorbestimmten Gruppe von Agonistenlösungen in Kontakt gebracht (Schritt 407). Jede Lösung in der Gruppe enthält einen oder mehrere Bestandteile, die bei Abwesenheit: der Prüfsubstanz eine Zellreaktion auslösen, z. B. durch die Stimulation eines bekannten Zellrezeptor-, Ionenpumpen- oder Ionenkanalmoleküls. Als nächstes wird bestimmt, ob die Zellreaktion, die normalerweise mit einem bestimmten Agonisten ausgelöst wird, durch die bestimmte Substanz unterdrückt wird (Schritt 411). Die Vorrichtung wiederholt immer wieder eine Vermischung verschiedener Standardagonistensubstanzen mit der Substanz, bis sie nachweist, daß die Zellreaktion, die mit einem bestimmten Standardagonisten ausgelöst wird, bei Vorhandensein der Substanz unterdrückt wird, oder bis alle Agonisten, die für die Maschine verfügbar sind, geprüft worden sind. Wenn im Schritt 411 bestimmt wird, daß eine Zellreaktion, die normalerweise mit einem bestimmten Agonisten ausgelöst wird, durch die bestimmte Substanz unterdrückt wird (Ja), wird diese Substanz als Antagonist für den Rezeptor Ri kategorisiert (Schritt 415). Nachdem dies geschehen ist, wird das Instrument auf den Potenzbetriebsmodus umgeschaltet, wenn es von der Software angewiesen wird, die den Betrieb der Vorrichtung verwaltet (Schritt 417).
Wenn der Kontakt der Zellen mit der Substanz die Zellreaktion auslöst (Ja), wie vom Überwachungsteil der Vorrichtung gemessen, werden die Zellen automatisch in Kontakt gebracht mit aufeinanderfolgenden Mischungen der Substanz und der Standardsubstanz aus einer vorbestimmten Gruppe von Antagonistenlösungen (Schritt 405), Jede Lösung in der Antagonistengruppe enthält einen oder mehrere Bestandteile, die die Zellreaktion blockieren, die von mindestens einem bekannten Agonisten durch die Stimulation eines bekannten Zellrezeptor-, Ionenpumpen- oder Ionenkanalmoleküls ausgelöst wird. Als nächstes wird bestimmt, ob die Zellreaktion, die mit der Substanz ausgelöst wird, bei Vorhandensein eines bestimmten Standardantagonisten unterdrückt wird (Schritt 409). Die Vorrichtung wiederholt immer wieder eine Vermischung verschiedener Standardantagonistensubstanzen mit der Substanz, bis sie nachweist, daß die Zellreaktion, die mit der Substanz ausgelöst wird, bei Vorhandensein eines bestimmten Standardantagonisten unterdrückt wird, oder bis alle Antagonisten geprüft worden sind. Wenn im Schritt 409 bestimmt wird, daß eine Zellreaktion, die mit der Substanz ausgelöst wird, durch den bestimmten Antagonisten unterdrückt wird (Ja), wird diese Substanz als Agonist für den Rezeptor Ri gekennzeichnet (Schritt 413). Wenn dies geschehen ist, wird das Instrument auf den Pontenzbetriebsmodus umgeschaltet, wenn es von der Software angewiesen wird, die den Betrieb der Vorrichtung verwaltet (Schritt 417).
Unter Verwendung bekannter Gruppen von Standardagonisten- und Antagonistensubstanzen für verschiedene Rezeptoren ist es möglich, die Substanzen gegen verschiedene Rezeptortypen und Untertypen nach Spezifik und Selektivität zu screenen. Wenn eine Serie von Zelltypen geprüft werden soll, kann der Ablauf für jeden der Zelltypen, die in der Serie von zu prüfenden Zelltypen enthalten sind, wiederholt werden, um die Aktivitäten der Substanzen in einer Anzahl von Zelltypen zu bewerten.
Beispielweise können für den Endothelinrezeptor, dessen Stimulation durch eine Zunahme der intrazellulären Konzentration des ionisierten Calciums angezeigt wird, die folgenden rezeptoruntertypspezifischen Antagonisten verwendet werden: BQ-123, BQ-788, BQ-153, BQ-485, BMS-182874 PD 151, 242, und es können die folgenden rezeptoruntertypspezifischen Agonisten verwendet werden: Endothelin-1, Endothelin-2 und Endothelin-3, Sarafotoxin S6c, IRL 1620, BQ-3020.
Für Calciumkanäle gibt es Gruppen von kanaltypspezifischen Agonisten und Antagonisten, die in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet werden können. Agonisten von intrazellulären Calciumkanälen sind beispielweise folgende: Ins (1,4,5)P&sub3;, Ryanodin, Caffein, Heparin, Perchlorat, und ihre Antagonisten sind: Decavanadte, Rutheniumrot und hohe Konzentrationen von Ryanodin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Screeningmodus zur Kennzeichnung des Zellrezeptormusters verwendet, das normalerweise als "Rezeptorfingerabdruck" bezeichnet wird. Gemäß dieser Ausführungsform werden ein zu prüfender Zelltyp oder eine Serie von Zelltypen gegen Standardsubstanzen aus einer vorbestimmten Gruppe von Agonistenlösungen gescreent. Jede Lösung in der Gruppe enthält einen oder mehrere Bestandteile, die eine Zellreaktion durch die Stimulation eines bekannten Zellrezeptors auslösen. Auf diese Weise können die Muster der Rezeptorexpression in zwei oder mehr Zelltypen bewertet werden. Wenn ein oder mehrere Zelltypen auf die bestimmte Agonistensubstanz reagieren, schaltet das Instrument auf den Potenzbetriebsmodus um, wenn es von der Software angewiesen wird, die die Funktion der Vorrichtung verwaltet.
Fig. 5 zeigt einen Algorithmus, der erfindungsgemäß im bevorzugten Potenzmodus verwendet werden kann. Der erste Schritt im Potenzmodus besteht darin, zu bestimmen, ob eine bestimmte Substanz als Agonist oder Antagonist kategorisiert worden ist (Schritt 501). Die Vorrichtung stellt dann entweder kontinuierliche Konzentrationsgradienten der Standardsubstanz oder der zu prüfenden Substanz her.
Wenn die Substanz während des Screeningmodus als Agonist für einen oder mehrere zu prüfende Zelltypen kategorisiert worden ist, mißt und registriert die Vorrichtung die Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktion der reagierenden Zellen (Schritt 503). Während des Schrittes 503 erzeugt die Vorrichtung kontinuierliche experimentelle Aktivierungskurven für die Aktivierungssubstanz. Aus diesen Kurven kann man die Potenz der Substanz beispielsweise in bezug auf EC&sub5;&sub0; (die effektive Konzentration eines Aktivators, der 50% der maximalen Stimulationsreaktion der Zellen bewirkt) berechnen (Schritt 505). Die Berechnung kann unter Verwendung bekannter Kurvenanpassungssoftware erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann diese Software durch die grafische Software PRISM implementiert werden, die von GraphPad, Inc. hergestellt wird.
Wenn während des Screeningmodus bestimmt wird, daß die Substanz ein Antagonist für einen oder mehrere zu prüfende Zelltypen ist, mißt und registriert die Vorrichtung die Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktionsinhibition in diesen Zelltypen bei Vorhandensein eines Standardagonisten (Schritt 507). Während des Schrittes 507 erzeugt die Vorrichtung kontinuierliche experimentelle Inhibitionskurven für die Antagonistensubstanz, die bei konstanten Konzentrationen der Standardagonistensubstanz entnommen wird. Aus diesen Kurven kann man die Potenz der Substanz in bezug beispielweise auf IC&sub5;&sub0; (die effektive Konzentration eines Blockers, der 50% der maximalen Inhibitionsreaktion der Zellen bewirkt) berechnen (Schritt 509). Die Berechnung der IC&sub5;&sub0;-Werte kann auch in einer bevorzugten Ausführungsform mit dem Softwarepaket PRISM implementiert werden.
Wenn bestimmt wird, daß die Substanz ein Antagonist für einen oder mehrere zu prüfende Zelltypen ist, mißt und registriert die Vorrichtung auch die Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktion in diesen Zelltypen auf eine Standardagonistensubstanz bei Vorhandensein verschiedener Konzentrationen der Antagonistensubstanz (Schritt 511). Während des Schrittes 511 erzeugt die Vorrichtung eine Serie von kontinuierlichen experimentellen Aktivierungskurven für die Standardagonistensubstanz, die bei verschiedenen diskreten Konzentrationen der Antagonistensubstanz entnommen wird. Die Vorrichtung berechnet dann die Affinität und die Potenz der Substanz beispielweise in bezug auf pA&sub2;-Werte und bestimmt, ob der Antagonist kompetitiv oder nichtkompetitiv ist (Schritt 513). Der pA&sub2;-Wert ist proportional einem negativen Logarithmus der Bindungskonstante eines Liganden/Rezeptorkomplexes und ist ein Maß für die Affinität des Liganden zum Rezeptor: je größer der pA&sub2;-Wert ist, um so höher ist die Affinität der Substanz zum Rezeptor. Praktisch kann der pA&sub2;-Wert aus der Verschiebung der Aktivierungskurven bei Vorhandensein verschiedener Konzentrationen der Antagonistensubstanz berechnet und mit der folgenden Formel implementiert werden:
PA&sub2; - log(R - 1) - logB
wobei R ein Verhältnis zwischen gleichmächtigen Konzentrationen der Standardagonistensubstanz, die sowohl bei Vorhandensein einer diskreten Konzentration (B) der Agonistensubstanz als auch ohne den Agonisten gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform können die gleichmächtigen Konzentrationen der Standardagonistensubstanz aus den Aktivierungskurven der PRISM-Software ermittelt werden. Mit den oben genannten Gruppen von experimentellen Kurven kann man die Potenz und das pharmakologische Profil für die zu untersuchende Substanz nach den Analysen von Cheng-Prusoff (Cheng und Prusoff, 1973, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird), Gaddum (Gaddum, 1957, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) oder Schild (Arunlakshana und Schild, 1959, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) bewerten.
Eine ausführliche Beschreibung des Betriebs des Negativdruckfluidsystems in Fig. 3 wird nachstehend gegeben.
Der Ablauf beginnt, wenn der Computer einen Bediener auffordert, einen Betriebsmodus aus einer Auswahl von drei Modi zu wählen: Systemfüllmodus, Screeningmodus und Potenzprofiliermodus. In dem gegenwärtig bevorzugten Ablauf auf höchstem Niveau besteht die erste Wahl darin, das System zu füllen. Mit Bezug auf Fig. 3 wird der Bediener vor Beginn des Füllprozesses aufgefordert, die Düsen der Einlaßöffnungen 309, 325 und 351 in einem Reservoir 305, das mit einer Pufferlösung gefüllt ist, die Düsen der Einlaßöffnungen 336 und 338 in den Reservoiren 337 bzw. 339, die mit entsprechenden Kalibrierlösungen gefüllt sind, und die Düse der Einlaßöffnung 348 in einem der Zellsuspensionsreservoire 349, die mit zu prüfenden Zelltypen gefüllt sind, zu plazieren.
Ein kontinuierliches Flußdiagramm eines bevorzugten Systemfüllablaufs ist in Fig. 6a bis 6d für das bevorzugte Negativdruckfluidsystem gezeigt, das in Fig. 3 dargestellt ist. Mit Bezug auf Fig. 6a beginnt das Systemfüllprogramm mit einem Startzustand 600 und tritt in den Zustand 602 ein, wo es alle Parameter auf ihre Anfangswerte setzt. Diese Anfangsparameter sind u. a. die interne Initialisierung der Softwarevariablen und Subroutinen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Wenn die Anfangsparameter bestimmt sind, positionieren die Autosampler 301 und 302 (Fig. 3) ihre entsprechenden Ansaugdüsen 307 und 323 in der "Null"-Position (Schritt 604). Jeder Autosampler enthält in seiner "Null"-Position ein Reservoir 305, das mit einer Waschpufferlösung gefüllt ist. Während des Schrittes 604 wird die Stromversorgung ausgeschaltet, die Strom an die Dosierventile 311 und 327 (Fig. 3), an die Umsteuerventile 333, 335 und 347 (Fig. 3) und an die Füllventile 313, 329, 341 und 345 (Fig. 3) liefert. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Füllventile 313, 329, 342 und 345 in einem stromlosen Zustand (ausgeschaltet) normalerweise geöffnet; die Dosierventile 311 und 327 verbinden im stromlosen Zustand (ausgeschaltet) ihre Auslässe 312 und 328 mit jeweiligen "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnungen 309 und 325; und in einem stromlosen Zustand (ausgeschaltet) verbindet das Umsteuerventil 335 seinen gemeinsamen Auslaß 334 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 336, das Umsteuerventil 333 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 342 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 332, und das Umsteuerventil 347 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 346 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 348.
Nachdem das System initialisiert worden ist, wird die peristaltische Pumpe 357 gestartet (Schritt 606), und die Füllventile 313 und 345 werden eingeschaltet (Schritt 608). Im eingeschalteten Zustand sind die Füllventile 313 und 345 geschlossen. Dadurch wird der Pufferlösungsstrom durch die Röhre 325, die Auslaßröhre 328 des Dosierventils, das Füllventil 329, die Mischzone 331, die Einlaßröhre 332 und die Auslaßröhre 342 des Umsteuerventils, das Füllventil 341, die Mischzone 343, eine reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und dann in den Abflußbehälter 359 befördert.
Wiederum mit Bezug auf Fig. 1 implementiert der Computer 123 einen Softwarecode 125, um Steuersignale an eine Steuereinrichtung 109 zu übergeben, die die verschiedenen Ventile, Kammern usw. des Systems steuert. Dieses Steuersignal wird verzögert, um ausreichend Zeit zu gewinnen, damit die Flüssigkeit die Fluidleitungen füllen kann (Schritt 610). Als nächstes wird das Dosierventil 327 eingeschaltet (Schritt 612). Während das Dosierventil 327 im eingeschalteten Zustand ist, strömt die Pufferlösung, die sich in der "Null"-Position des Autosamplers 315 befindet, durch die Röhre 323, die Auslaßröhre 328 des Dosierventils 327, das Füllventil 329, die Mischzone 331, die Einlaßröhre 332 und die Auslaßröhre 342 des Umsteuerventils 333, das Ansaugventil 341, die Mischzone 343, eine reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und dann in einen Abflußbehälter 359.
Nachdem das Dosierventil 327 eingeschaltet worden ist, wird das Steuersignal wiederum verzögert (Schritt 613), um die Zeit zu gewinnen, die notwendig ist, damit die Pufferlösung das Fluidsystem füllen kann. Nach der Verzögerung im Schritt 613 versetzt das Steuersignal das Dosierventil 327 in seine Aus-Stellung (Schritt 614), schaltet (öffnet) das Füllventil 313 aus (Schritt 616) und schaltet (schließt) das Füllventil 329 ein (Schritt 618). Dadurch werden die Fluidleitungen 309, 312, 332, 342, das Füllventil 341, die Mischzone 343, die reaktionsfördernde Leitung 353, der Detektor 355 und die Pumpe 357 gefüllt, und zwar während einer Verzögerung (Schritt 619), die notwendig ist, damit die Leitungen mit Pufferlösung 305 gefüllt werden können.
Als nächstes wird das Dosierventil 311 (Schritt 620) für eine Zeitdauer eingeschaltet, die vom Schritt 621 gesteuert wird. Während dieser Verzögerungsperiode werden die gleichen Fluidleitungen mit Pufferlösung gespeist, die sich in der "Null"-Position des Autosamplers 301 befindet und durch die Düse 307 kommt.
Nach der Verzögerungsperiode (Schritt 621) schaltet das Steuersignal gleichzeitig das Dosierventil 311 (Schritt 622) und das Füllventil 329 (Schritt 624) aus und das Umsteuerventil 335 und das Umsteuerventil 222 ein (Schritt 626). Während einer Verzögerungsperiode, die im Schritt 627 bestimmt wird, wird der Flüssigkeitsstrom aus der Einlaßröhre 338 und der Auslaßröhre 334 des Umsteuerventils 335 durch die Einlaßröhre 340 und die Auslaßröhre 342 des Umsteuerventils 333 über das Füllventil 341, die Mischzone 343 und weiter über die reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und dann zum Abflußbehälter 359 geleitet. Dann schaltet das Steuersignal das Umsteuerventil 335 aus (Schritt 628), wodurch die gleichen Fluidleitungen von der Einlaßröhre 336 gespeist werden können. Die Länge der Zeit, die erforderlich ist, ist eine Funktion der Länge der dazugehörigen, verschiedenen Leitungen und Fluiddurchflußrate des Systems, die für jedes bestimmte System ohne weiteres bestimmt werden kann.
Nach der im Schritt 629 bewirkten Verzögerung schaltet das Steuersignal das Umsteuerventil 333 aus (Schritt 630) und schaltet (öffnet) das Füllventil 345 aus (Schritt 632) und schaltet (schließt) das Füllventil 341 ein (Schritt 634). Unter diesen Bedingungen wird der Flüssigkeitsstrom aus der Einlaßröhre 348 zur. Auslaßröhre 346 des Umsteuerventils 347, durch das Füllventil 345, die Mischzone 343, die reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und dann zum Abflußbehälter 359 geleitet. Die Zeit, die erforderlich ist, damit der oben genannte Flüssigkeitsstrom eintreten kann, wird von einer Verzögerungsperiode im Schritt 635 bestimmt. Nach dieser Verzögerung schaltet das Steuersignal das Umsteuerventil 347 ein (Schritt 636), wodurch die gleichen Fluidleitungen mit der Pufferlösung 305, die aus der Röhre 351 kommt, während der Verzögerungsperiode gefüllt werden können, die im Schritt 637 bewirkt wird.
Nach der im Schritt 637 bewirkten Verzögerung schaltet (öffnet) das Steuersignal das Füllventil 341 aus (Schritt 638) und schaltet das Umsteuerventil 347 aus (Schritt 640). Das Steuersignal schaltet dann die Pumpe 357 aus (Schritt 642). Schließlich beendet das Füllprogramm den Systemfüllmodus, und alle Komponenten des Fluidsystems sind mit Flüssigkeiten gefüllt (Schritt 643).
Der Zustand der Ventile in jedem Schritt des Programms ist in Fig. 6d dargestellt. Die Füllventile 345, 341, 313 und 329 sind normalerweise geöffnete Zweiwegeventile. Die Umsteuerventile 335, 333 und 347 sind Dreiwegeventile mit einer gemeinsamen Auslaßöffnung und einer normalerweise geöffneten und einer normalerweise geschlossenen Einlaßöffnung. Die Dosierventile 311 und 327 sind auch Dreiwegeventile wie die Umsteuerventile 335, 333 und 347. Die Symbole "-" und "+" zeigen den ausgeschalteten und eingeschalteten Zustand der Ventile an. Der Zustand der Ventile nach Beendigung des Füllmodus ist der gleiche wie der Anfangszustand.
Nachdem das Füllen des Systems erfolgt ist, wird der Bediener aufgefordert, entweder den Screening- oder Potenzprofiliermodus zu starten. Wenn der Screeningmodus gewählt wird, wird der Bediener aufgefordert, anzugeben, wie viele Substanzen in der Gruppe von zu prüfenden Substanzen Nmax und wie viele Antagonistenlösungen Mmax und Agonistenlösungen Lmax in den jeweiligen Gruppen der Standardsubstanzen vorhanden sind. Wenn der Potenzprofiliermodus gewählt ist, wird der Bediener aufgefordert, anzugeben, welche Substanzen in einer Gruppe ge¬ messen werden sollen.
Ein kontinuierliches Flußdiagramm des gegenwärtig bevorzugten Screeningmodus beim Negativdruckfluidsystem in Fig. 3 ist in Fig. 7a bis 7g gezeigt.
Das Screeningprogramm beginnt mit einem Startzustand 700 und tritt in einen Zustand 702 ein, wo es alle Parameter auf ihre Anfangswerte setzt. Diese Anfangsparameter sind u. a. die interne Initialisierung der Softwarevariablen und der Subroutinen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Wenn die Anfangsparameter bestimmt sind, positionieren die Autosampler 301 und 315 (Fig. 3) die Ansaugdüsen 307 und 323 in der entsprechenden "Null"-Position, die von einem Waschpufferlösungsreservoir 305 eingenommen wird (Schritt 704), und schaltet die Dosierventile 311 und 327, die Umsteuerventile 333, 335 und 347, die Füllventile 313, 329, 341 und 345 aus (Schritt 706). In einem ausgeschalteten Zustand sind die Füllventile 313, 329, 341 und 345 normalerweise geöffnet, die Dosierventile 311 und 327 verbinden jeweils ihre Auslässe 312 und 328 mit entsprechenden "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnungen 309 und 325, das Umsteuerventil 335 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 334 mit einer "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 336, das Umsteuerventil 333 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 342 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 332, und das Umsteuerventil 347 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 346 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 348.
Nachdem das System initialisiert worden ist, wird die Pumpe 357 gestartet (Schritt 708). Dadurch wird die Waschpufferlösung aus den auf "Null" positionierten Reservoiren beider Autosampler 301 und 315 befördert, um durch die Düsen 309 und 325 und die Auslaßöffnungen 312 und 328 der Dosierventile 311 bzw. 327, die Füllventile 313 und 329, die Mischzone 331, die Einlaßöffnung 332 und die Auslaßöffnung 342 des Umsteuerventils 333, das Füllventil 341, die Mischzone 343, eine reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und dann in den Abflußbehälter 359 zu strömen. In der Mischzone 343 wird dieser Strom mit Zellsuspensionen, die einen zu prüfenden Zelltyp enthalten, aus dem/den Zellsuspensionsreservoir(en) 349 vermischt, wobei dieser Strom aus der Einlaßröhre 348 und einer Auslaßöffnung 346 des Umsteuerventils 347 durch das Füllventil 345 kommt. Somit ist der Gesamtstrom, der durch die Mischzone 343 strömt, die Summe aller drei Ströme, von denen jeweils einer aus den Dosierventilen 311 und 327 und einer aus dem Umsteuerventil 347 kommt. Während dieses Schrittes liefern beide Dosierventile Waschpufferlösung 305 aus den Reservoiren, die sich in der "Null"-Position jedes Autosamplers befinden, so daß die endgültige Mischung aus einem Teil Zellsuspension und zwei Teilen Waschpufferlösung 305 besteht.
Nach der im Schritt 709 bewirkten Verzögerung, die notwendig ist, damit der Strom der Mischung aus der Zellsuspension, die den zu prüfenden Zelltyp enthält (oder ein Element aus der Serie der zu prüfenden Zelltypen), und der Waschpufferlösung 305 stabilisiert werden kann, registriert der Detektor 355 ein Basissignal, das von den Zellen allein erzeugt wird, BS (Schritt 710). Nachdem das BS-Signal registriert ist, wird es als Referenz gespeichert (Schritt 712), und der Computer 123 (Fig. 1) löst einen Inkrementzähler N aus (Schritt 714).
Der numerische Inhalt des Inkrementzählers N wird immer dann um eins erhöht, wenn er ausgelöst wird, wobei die Position der Düse der Einlaßöffnung 307 des Autosamplers 301 bestimmt wird, der die Gruppen von zu prüfenden Substanzen 303 wählt. Als nächstes wird der numerische Inhalt Ni des Inkrementzählers mit einer eingegebenen maximalen Anzahl von zu prüfenden Substanzen Nmax geprüft (Schritt 716). Wenn Ni nicht größer ist als Nmax, positioniert der Autosampler 301 die Düse 307 im Substanzreservoir, das sich in der Position Ni eines Gestells von Substanzen 303 befindet. Als nächstes wird das Dosierventil 311 eingeschaltet, um seine "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 307 zur gemeinsamen Auslaßöffnung 312 zu öffnen (Schritt 720). Während des Schrittes 720 besteht der vereinigte Strom in der Mischzone 343 und danach im Detektor 355 aus einem Teil Pufferlösung 305, die durch eine Düse 325 des Dosierventils 327 kommt, einem Teil zu prüfende Substanz 303, die aus der Düse 307 des Dosierventils 311 kommt, und einem Teil Zellsuspension, die einen zu prüfenden Zelltyp enthält, der aus der Einlaßröhre 348 kommt, die zur Auslaßöffnung 346 des Umsteuerventils 347 "normalerweise geöffnet" ist. Nach einer im Schritt 721 bewirkten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Mischprozeß stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 ein Signal SNi, das von den Zellen bei Vorhandensein der gegebenen Substanz Ni erzeugt wird (Schritt 722). Nachdem das SNi-Signal registriert ist, wird sein Wert als Referenzwert gespeichert (Schritt 723). Der Wert des SNi- Signals wird dann mit dem Wert des Referenzbasissignals BS verglichen (Schritt 724). Wenn das SNi-Signal größer ist als das BS-Signal, "markiert" der Computer 123 (Fig. 1) die entsprechende Substanz "positiv" (Schritt 725), was bedeutet, daß die Substanz das Zellsignal stimuliert. Wenn SNi größer ist als BS, steuert der Computer 123 eine Gruppe von Antagonisten und berechnet entsprechende Koordinaten zur Positionierung der Düse 323 des Autosamplers 315 über den Antagonisten enthaltenden Reservoiren, die sich im Gestell 317 befinden. Wenn SNi kleiner ist als BS, "markiert" der Computer 123 die entsprechende Substanz "negativ" (Schritt 726). In diesem Fall steuert der Computer 123 eine Gruppe von Agonisten und berechnet entsprechende Koordinaten zur Positionierung der Düse 323 des Autosamplers 315 über den Agonisten enthaltenden Reservoiren, die sich im Gestell 319 befinden.
Immer wenn die Bedingung "SNi > BS" erfüllt ist, läuft das Programm durch die Schleife K-O des Inkrementzählers M (Schritt 730). Der Inkrementzähler M erhöht die Anzahl immer dann um eins, wenn er ausgelöst wird, und bestimmt dadurch die aufeinanderfolgenden Positionen der Düse 323 des Autosamplers 315, die die Gruppe der Standardantagonisten bedienen, die sich im Gestell 317 befinden. Als nächstes prüft der Computer 123, ob der numerische Inhalt des Inkrementzählers (Mj) die maximale Anzahl der zu prüfenden Standardsubstanzen (Mmax) überschreitet, die vom Bediener eingegeben sind (Schritt 732).
Wenn Mj kleiner oder gleich Mmax ist, positioniert der Autosampler die Düse 323 im Standardantagonistenreservoir, das sich im Gestell 317 befindet, entsprechend dem numerischen Inhalt des Inkrementzählers Mj (Schritt 734). Als nächstes wird das Dosierventil 327 umgeschaltet, um seine "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 323 mit der Auslaßöffnung 328 zu verbinden (Schritt 736). Während des Schrittes 736 besteht der vereinigte Strom in der Mischzone 343, in den reaktionsfördernden Leitungen 353 und im Detektor 355 aus einem Teil Standardantagonist, der aus dem Dosierventil 327 kommt, einem Teil zu prüfende Substanz, die aus dem Dosierventil 311 kommt, und einem Teil Zellsubstanz, die einen zu prüfenden Zelltyp enthält, der aus dem Umsteuerventil 347 kommt.
Als nächstes registriert und speichert der Detektor 355 (Schritt 738) für einen weiteren Vergleich ein Signal SNiMj, das durch eine gegebene Substanz Ni bei Vorhandensein eines gegebenen Standardantagonisten Mj erzeugt wird. Dann werden beide Dosierventile 311 und 327 ausgeschaltet (Schritt 740). Dadurch werden die Einlaßöffnungen 307 und 323 geschlossen und die Einlaßöffnungen 309 und 325 zu den entsprechenden Ausla¬ ßöffnungen 312 und 328 geöffnet. Der Autosampler 315 positioniert dann die Düse 323 in der "Null"-Position, die vom Waschpufferlösungsreservoir 305 eingenommen wird. Das Dosierventil 327 wird dann wieder eingeschaltet, um seine "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 323 zur Auslaßöffnung 328 zu öffnen (Schritt 744), und der Inhalt der Düse 323 wird ausgespült (Schritt 746). Als nächstes wird das Dosierventil 327 ausgeschaltet, um die Einlaßöffnung 323 zu schließen und die "normalerweise geöffnete" Einlaßöffnung 325 zu öffnen. Während dieses Ablaufs werden die Fluidleitungen mit Pufferlösung gespült, die aus der Düse 325 des Autosamplers 315 kommt.
Als nächstes vergleicht der Computer 123 (Fig. 1) das Signal SNi, das bei Vorhandensein einer Substanz Ni allein gemessen wird, mit dem Signal SNiMj, das bei Vorhandensein einer Substanz Ni und eines Standardantagonisten Mj gemessen wird (Schritt 750). Wenn das Signal bei Vorhandensein eines Standardantagonisten Mj kleiner ist als das Signal, das von einer Substanz Ni allein erzeugt wird, nämlich wenn SNiMj < SNi, dann wird sowohl die Substanz Ni als auch der Standardantagonist Mj "positiv" markiert (Schritt 751). Wenn beide Signale einander gleich sind, dann wird die Substanz Ni "positiv" markiert, und der Standardantagonist Mj wird "negativ" markiert (Schritt 752). Nachdem die Daten markiert sind, werden die Daten, die die ID-Nummer der Substanz Ni mit ihrem Flag- (Markierungs-)Wert und die ID-Nummer des Standardantagonisten Mj mit seinem Flag-Wert enthalten, in eine Datenbank übergeben (Schritt 753). Nachdem die Daten gespeichert worden sind, springt das Programm zurück, um den Inkrementzähler M auszulösen (Schritt 730), um seinen Zählwert um eins zu erhöhen, und der Schritt 754 wird wiederholt, bis der Zustand 732 erreicht ist.
Wenn die Bedingung, die im Entscheidungsschritt 732 bestimmt wird, erfüllt ist, das heißt, wenn die Substanz gegen alle Standardantagonisten in einer gegebenen Gruppe geprüft worden ist, setzt das Programm den Inhalt des Inkrementzählers M auf null zurück (Schritt 755), und der Autosampler 301 und der Autosampler 315 positionieren ihre jeweiligen Düsen 307 und 323 in der "Null"-Position, wo sich die Reservoire mit einer Waschpufferlösung 305 befinden (Schritt 756). Als nächstes werden beide Dosierventile 311 und 327 eingeschaltet (Schritt 758). Dadurch werden die "normalerweise geschlossenen" Einlaßöffnungen 307 und 323 zu den entsprechenden Auslaßöffnungen 312 und 328 geöffnet. Während dieser Waschverzögerungsperiode, die im Schritt 760 bestimmt wird, werden der Inhalt der Düse 312 und der Düse 328 mit Pufferlösung 305 ausgespült. Nachdem der Schritt 760 beendet ist, werden beide Dosierventile 311 und 327 ausgeschaltet (Schritt 762). Nach der Waschverzögerungsperiode (Schritt 760) springt das Programm zurück zum Inkrementzähler N, dessen Inhalt durch das Auslösungssignals Str vom Computer 123 (Fig. 1) um eins inkrementiert wird (Schritt 714). Dann wird der numerische Inhalt Ni des Zählers N mit der maximalen Anzahl Nmax der zu prüfenden Substanzen verglichen. Wenn Ni größer ist als Nmax, wird der Inhalt des Inkrementzählers N auf null gesetzt (Schritt 717), und der Screeningmodus wird beendet (Schritt 719). Ansonsten wird der Schritt 715 mit der nächsten Substanz wiederholt.
Wenn die Bedingung des Entscheidungsprozesses 724 SNi > BS nicht erfüllt ist, wird die Substanz Ni als "negativ" markiert (Schritt 726), und der Inkrementzähler L wird ausgelöst (Schritt 764). Der Inkrementzähler L wird immer dann um eins erhöht (Schritt 764), wenn er ausgelöst wird, und bestimmt somit die aufeinanderfolgenden Positionen der Düse 323 des Autosamplers 315 relativ zu der Gruppe der Standardantagonisten, die sich im Gestell 319 befinden. Als nächstes wird der numerische Inhalt Lk des Inkrementzählers L mit der maximalen Anzahl Lmax der zu verwendenden Standardantagonisten verglichen (Schritt 766).
Wenn Lk kleiner oder gleich Lmax ist, positioniert der Autosampler 315 die Düse 323 im Standardantagonistenreservoir im Gestell 319, was dem numerischen Inhalt Lk des Inkrementzählers L entspricht. Als nächstes wird das Dosierventil 327 eingeschaltet, um seine "normalerweise geöffnete" Einlaßöffnung 323 zur Auslaßöffnung 328 zu öffnen, und das Dosierventil 311 wird ausgeschaltet, um seine Einlaßöffnung 307 zu schließen und seine Einlaßöffnung 309 zur Auslaßöffnung 312 zu öffnen (Schritt 770). Während des Schrittes 770 besteht der vereinigte Fluß, der durch die Mischzone 343, die reaktionsfördernden Leitungen 353 und den Detektor 355 kommt, aus einem Teil Standardagonist 319, der aus der Einlaßöffnung 323 des Dosierventils 327 kommt, einem Teil Pufferlösung 305, die aus der Einlaßöffnung 309 des Dosierventils 311 kommt, und einem Teil Zellsuspension, die einen zu prüfenden Zelltyp enthält, der aus dem Umsteuerventil 347 kommt.
Nach einer im Schritt 772 bewirkten Verzögerungsperiode, die notwendig ist, damit sich der Mischprozeß stabilisieren kann, wird ein Signal SLk, das von einem gegebenen Standardagonisten Lk erzeugt wird, registriert und gespeichert (Schritt 774). Als nächstes wird das Dosierventil 311 eingeschaltet, um seine "normalerweise geöffnete" Einlaßöffnung 307 zur Auslaßöffnung 312 zu öffnen (Schritt 776). Eine Verzögerungsperiode, die notwendig ist, damit sich der Mischprozeß stabilisieren kann, wird im Schritt 778 bewirkt, woraufhin ein Signal SLkNi durch einen gegebenen Standardagonisten Lk bei Vorhandensein einer gegebenen Substanz Ni stimuliert, registriert und gespeichert wird (Schritt 780).
Nachdem das Signal SLkNi registriert ist (Schritt 780), werden beide Dosierventile 311 und 327 ausgeschaltet, um ihre jeweiligen "normalerweise geschlossenen" Einlaßöffnungen 307 und 323 zu schließen und ihre Einlaßöffnungen 309 und 325 zu den entsprechenden Auslaßöffnungen 312 und 328 zu öffnen (Schritt 782). Als nächstes positioniert der Autosampler 315 die Düse der Einlaßöffnung 323 in seiner "Null"-Position, was dem Waschpufferlösungsreservoir 305 entspricht (Schritt 784). Dann wird das Dosierventil 327 eingeschaltet (Schritt 785). Dadurch wird die "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 323 zur Auslaßöffnung 328 geöffnet, und nach einer im Schritt 786 bewirkten, bestimmten Verzögerung, die zum Ausspülen des Inhalts der Düse 323 notwendig ist, wird das Dosierventil 327 ausgeschaltet (Schritt 787), und die beiden Signale SLkNi und SLk werden verglichen (Schritt 788).
Wenn SLkNi kleiner ist als SLk, dann wird der entsprechende Standardagonist Lk "positiv" markiert (Schritt 790). Wenn beide Signale einander gleich sind, dann wird der Standardagonist Lk "negativ" markiert (Schritt 792). Nachdem die Daten markiert sind, werden die Daten, die die ID-Nummer der Substanz Ni mit ihrem Flag-Wert und die ID-Nummer des Standardagonisten Lk mit seinem Flag-Wert enthalten, in eine Datenbank übertragen (Schritt 794). Nachdem die Daten gespeichert sind, löst das Programm den Inkrementzähler L aus (Schritt 764), um seinen Zählwert um eins zu erhöhen, und der Schritt 796 wird wiederholt, bis die Bedingung 766 erfüllt ist.
Wenn die Bedingung, die im Schritt 766 bestimmt wird, erfüllt ist, d. h. wenn die Substanz gegen alle Standardagonisten in einer gegebenen Gruppe geprüft worden ist, wird der Inhalt des Inkrementzählers L auf null zurückgesetzt (Schritt 755), und beide Autosampler 301 und 315 positionieren ihre jeweiligen Düsen 307 und 323 in der "Null"-Position, wo sich die Reservoire mit Waschpufferlösung 305 befinden (Schritt 756). Das System schaltet dann das Dosierventil 311 und das Dosierventil 327 ein, um die "normalerweise geschlossenen" Einlaßöffnungen 307 und 323 zu den entsprechenden Auslaßöffnungen 312 bzw. 328 zu öffnen (Schritt 758). Während der im Schritt 760 bewirkten Waschperiode wird der Inhalt der beiden Düsen 307 und 323 mit der Pufferlösung 305 ausgespült. Als nächstes werden die beiden Dosierventile 311 und 327 ausgeschaltet (Schritt 762), und der Inkrementzähler N wird um eins inkrementiert (Schritt 714). Als nächstes wird ein neu ausgelöster numerischer Inhalt Ni des Inkrementzählers N mit der maximalen Anzahl Nmax der zu prüfenden Substanzen verglichen (Schritt 716). Wenn Ni größer ist als Nmax, wird der Zähler N im Schritt 717 auf null gesetzt, und der Screeningmodus wird beendet (Schritt 719). Andernfalls wird der gesamte Zyklus mit einer nachfolgenden Substanz wiederholt.
Nachdem der Screeningmodus beendet worden ist (Schritt 719), wird der Bediener vom Computer aufgefordert, entweder den Potenzprofiliermodus zu wählen oder den Screeningmodus mit einer neuen Gruppe von Substanzen zu wiederholen.
Ein kontinuierliches Flußdiagramm des gegenwärtig bevorzugten Potenzprofiliermodus mit dem Negativdruckfluidsystem in Fig. 3 ist in Fig. 8a bis 8e dargestellt.
Das Potenzprofilierprogramm beginnt mit einem Startzustand 800 und tritt in den Zustand 802 ein, wo es alle Inkrementzähler L, M und N auf null und alle Parameter auf ihre Anfangswerte setzt. Diese Anfangsparameter sind u. a. die interne Initialisierung der Hardware- und Softwarevariablen und Subroutinen, ohne darauf beschränkt zu sein. Als nächstes wird der Inkrementzähler N gestartet (Schritt 804), und sein numerischer Inhalt Ni wird mit der maximalen Anzahl Nmax der Standardsubstanzen verglichen, die vom Bediener vor dem Starten des Programms eingegeben werden (Schritt 806). Wenn Ni größer ist als Nmax, wird der Inkrementzähler N auf null gesetzt (Schritt 808), und das Programm wird beendet (Schritt 810). Andernfalls geht das Programm weiter, indem die Pumpe 357 eingeschaltet wird (Schritt 816). An dieser Stelle sind die Düsen 307 und 323 der Autosampler 301 und 315 entsprechend der Anfangsparametereinstellung im Schritt 802 in "Null"-Position, die Dosierventile 311 und 327, die Füllventile 313, 329, 341 und 345 und die Umsteuerventile 335, 333 und 347 sind ausgeschaltet. Während des Schrittes 816 besteht der vereinigte Strom, der durch die Mischzone 343, die reaktionsfördernden Leitungen 353 und den Detektor 355 kommt, aus einem Teil Pufferlösung 305, der aus der Einlaßöffnung 309 des Dosierventils 311 kommt, einem Teil Pufferlösung 305, die aus der Einlaßöffnung 325 des Dosierventils 327 kommt, und einem Teil Zellsuspension, die aus dem Umsteuerventil 347 kommt. Als nächstes wird das Umsteuerventil 333 eingeschaltet (Schritt 820), wobei die "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 340 zur Auslaßöffnung 342 geöffnet wird. Während dieses Ablaufs strömt die Kalibriermaximumlösung 337, die die maximale Reaktion bestimmt, durch die Röhre 336, die mit der Auslaßröhre 334 des Umsteuerventils 335 verbunden ist, durch die Einlaßöffnung 340 des Umsteuerventils 333, durch das Füllventil 341 und dann in die Mischzone 343, wo sie mit Zellen vermischt wird, die aus der Zellsuspension kommen, und zwar durch die Einlaßröhre 348 und die Auslaßröhre 346 des Umsteuerventlis 347 und dann durch das Füllventil 345 in die Mischzone 343. Die Zellkalibriermaximummischung strömt dann in die reaktionsfördernden Leitungen 353 und dann zum Detektor 355. Als nächstes wird das Maximumsignal gemessen und registriert (Schritt 824). Das Umsteuerventil 335 wird dann eingeschaltet (Schritt 832), das die "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 338 zur Auslaßöffnung 334 öffnet, damit eine Kalibrierminimumlösung 339 durch das Umsteuerventil 333, das Füllventil 341 und in die Mischzone 343 strömen kann, wo sie mit Zellen vermischt wird, die aus der Zellsuspension kommen, und zwar durch die Einlaßröhre 348 und die Auslaßröhre 346 des Umsteuerventils 347 und dann durch das Füllventil 345 in die Mischzone 343. Die Zellen/Kalibrierminimummischung strömt dann in die reaktionsfördernden Leitungen 353 und dann zum Detektor 355. Das Minimumreaktionssignal wird dann gemessen und registriert (Schritt 836). Als nächstes werden beide Umsteuerventile 335 und 333 ausgeschaltet (Schritt 844). Während des Schrittes 844 besteht der vereinigte Strom, der durch die Mischzone 343, die reaktionsfördernden Leitungen 353 und den Detektor 355 kommt, aus einem Teil Pufferlösung 305, der aus der Einlaßöffnung 309 des Dosierventils 311 kommt, einem Teil Pufferlösung 305, die aus der Einlaßöffnung 325 des Dosierventils 327 kommt, und einem Teil Zellsuspension, die aus dem Umsteuerventil 347 kommt. Dies ist notwendig, um die Reste der Kalibrierlösung aus den Fluidleitungen auszuspülen. Als nächstes wird der "Flag"- (Markierungs-)Wert der Substanz Ni geprüft (Schritt 812).
Wenn der "Flag"-Wert der Substanz Ni "positiv" ist, dann geht das System über zum Schritt 850, andernfalls geht es über zum Schritt 876. Wenn der "Flag"-Wert der Substanz Ni "positiv" ist, positioniert der Autosampler 301 die Düse 307 in einem Reservoir, das der Substanz Ni entspricht und das sich im Gestell 303 befindet (Schritt 850). Als nächstes wird das Dosierventil 311 in einem Gradientenmodus betrieben (Schritt 852). Im Gradientenmodus vereinigt das Dosierventil 311 Ströme aus zwei Einlaßöffnungen 307 und 309, so daß das Verhältnis zwischen einem Substanzstrom Ni und einer Pufferlösung in einer Auslaßöffnung 312 sich im Takt ändert, um eine diskontinuierliche Änderung der Substanzkonzentration zu erzeugen. Während sich die Konzentration im Takt ändert, reagieren die frischen Teile der Zellen, die aus der Zellsuspension in die Mischzone 313 kommen, zu jeder gegebenen Zeit mit den anderen Konzentrationen der Substanz Ni. Die resultierende Dosisreaktionsabhängigkeit des Signals wird im Schritt 854 mit der nachfolgenden Berechnung der Aktivierungsparameter für die Substanz Ni im Schritt 856 registriert, und dann werden die Daten in einer Datenbank gespeichert (Schritt 858).
Als nächstes wird ein Inkrementzähler der Standardantagonisten M gestartet (Schritt 860), und der numerische Inhalt Mj des Zählers M wird mit dem Maximalwert Mmax verglichen, der vom Bediener eingegeben wird (Schritt 861). Wenn der numerische Wert Mj nicht größer ist als Mmax, dann wird der "Flag"- Wert der Standardlösung Mj geprüft (Schritt 862). Wenn der "Flag"-Wert der Standardlösung Mj nicht "positiv" ist, wird der Inkrementzähler M um eins erhöht (Schritt 860), und die Schritte, die dem Schritt 860 folgen, werden wiederholt, wie oben beschrieben. Wenn der "Flag"-Wert der Standardlösung Mj "positiv" ist, positioniert der Autosampler 315 die Düse 323 in dem Reservoir, das dem Standardantagonisten Mj entspricht und das sich im Gestell 317 befindet (Schritt 864). Nachdem die Düse 323 in die Standardlösung eingetaucht worden ist, wird das Dosierventil 311 eingeschaltet (Schritt 866). Wenn das Dosierventil 311 eingeschaltet ist, öffnet es seine "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 307, die im Schritt 850 in ein Reservoir eingetaucht ist, das der Substanz Ni entspricht, so daß die Substanz Ni durch das Fluidsystem strömt und ein Signal erzeugt, wenn sie mit den Zellen vermischt wird, die durch die Einlaßröhre 348 und die Auslaßröhre des Umsteuerventils 347, das Füllventil 345 in die Mischzone 343 und weiter in die reaktionsfördernde Leitung 353 und zum Detektor 355 kommen. Als nächstes wird das Dosierventil 327 in einem Konzentrationsgradientenmodus betrieben (Schritt 868). Im Gradientenmodus vereinigt das Dosierventil 327 Ströme, die aus den beiden Einlaßöffnungen 323 und 325 kommen, in der Auslaßöffnung 328, so daß sich das Verhältnis zwischen einem Standardantagonistenstrom Mj und einem Pufferlösungsstrom im Takt ändert, um eine diskontinuierliche Änderung der Standardantagonistenkonzentration zu erzeugen. Während sich die Konzentration im Takt ändert, strömen die frischen Teile der Zellen aus der Zellsuspension in die Mischzone 343 und reagieren mit der Mischung, die aus der Substanz Ni mit konstanter Konzentration und dem Standardantagonisten Mj mit der Konzentration besteht, die zu jeder gegebenen Zeit anders ist. Die resultierende Dosisreaktionsinhibition des durch die Substanz Ni stimulierten Signals durch den Standardantagonisten Mj wird im Schritt 870 registriert, mit der nachfolgenden Berechnung des Inhibitionsparameters für den Standardantagonisten Mj in einem Schritt 872, und die Daten werden in einer Datenbank gespeichert (Schritt 874).
Nachdem die Kurve im Schritt 870 registriert ist, werden die Dosierventile 311 und 327 geschlossen (Schritt 871), und das Programm geht weiter mit dem Schritt 860, wo der Inkrementzähler M um eins inkrementiert wird, und das Programm kehrt zum Schritt 861 zurück, wo Mj mit Mmax verglichen wird.
Wenn alle Standardantagonisten Mj gezählt und diejenigen mit "positiven Flags (Kennzeichen)" gemessen sind, wird der numerische Wert Mj größer als Mmax, und der Entscheidungsprozeß im Schritt 861 kehrt zum Schritt 804 zurück, wo der Inkrementzähler N seinen numerischen Wert um eins erhöht. Der Wert Ni wird dann mit Nmax, der maximalen Anzahl der zu prüfenden Substanzen, verglichen (Schritt 806). Wenn Ni größer ist als Nmax, wird der Inkrementzähler N auf null zurückgesetzt (Schritt 808), und das Programm endet (Schritt 810). Wenn mehrere Zelltypen zu bewerten sind, kann dieser Ablauf für jeden der Zelltypen der Serie von zu prüfenden Zelltypen wiederholt werden.
Wenn im Schritt 812 der Flag-Wert der Substanz Ni als "negativ" bestimmt wird, wird ein Inkrementzähler L aktualisiert, der die Standardsubstanzen Lk in einer Gruppe von Agonisten zählt, die sich im Gestell 319 befinden (Schritt 876). Als nächstes wird der numerische Wert Lk mit der Maximalzahl Lmax der Standardagonisten verglichen, die vom Bediener eingegeben wird (Schritt 877).
Solange bis der numerische Wert Lk des Zählers L größer ist als der Wert Lmax, geht das Programm über zum Schritt 878, wo der "Flag"-Wert der Standardsubstanz Lk geprüft wird. Wenn der Flag-Wert nicht positiv ist, kehrt das Programm zum Schritt 876 zurück. Wenn der Flag-Wert der Standardsubstanz Lk positiv ist, positioniert der Autosampler 301 seine Düse 307 in einem entsprechenden Reservoir, das die Substanz Ni enthält und das sich im Gestell 303 befindet (Schritt 880), und der Autosampler 315 positioniert seine Düse 323 in einem entsprechenden Reservoir, das den Standardagonisten Lk enthält und das sich im Gestell 319 befindet (Schritt 881).
Als nächstes wird der Konzentrationsgradientenmodus des Dosierventils 327 aktiviert (Schritt 882), und eine Dosisreaktionsstimulation des Signals mit dem Standardagonisten Lk wird dann registriert (Schritt 884). Im Gradientenmodus vereinigt das Dosierventil 327 die Ströme, die aus den beiden Einlaßöffnungen 323 und 325 kommen, in der Auslaßöffnung 328, so daß sich das Verhältnis zwischen dem Standardagonistenstrom Lk und einem Pufferlösungsstrom im Takt ändert, um einen Konzentrationsgradienten des Standardagonisten zu erzeugen. Während der Gradient im Takt erzeugt wird, strömen frische Zellen aus der Zellsuspension durch die "normalerweise geöffnete" Einlaßröhre 348 und die Auslaßöffnung 346 des Umsteuerventils 347, das "normalerweise geöffnete" Füllventil 345 in die Mischzone 343 und reagieren diskontinuierlich mit dem Standardagonisten Lk bei der sich diskontinuierlich ändernden Konzentration der Standardlösung. Wenn die Dosisabhängigkeit der Signalstimulation durch den Standardagonisten Lk registriert wird (Schritt 884), werden die Aktivierungsparameter berechnet (Schritt 892) und dann in einer Datenbank gespeichert (Schritt 894).
Nachdem der Gradientenmodus des Dosierventils 327 beendet ist, verbleibt das Ventil entweder bei dem Verhältnis, das am Ende des Gradientenmodus erreicht wird, oder bei einem vorbestimmten Verhältnis, das die konstante Konzentration des Standardantagonisten Lk bestimmt, die in den weiteren Schritten verwendet wird. Als nächstes wird der Konzentrationsgradientenmodus des Dosierventils 311 aktiviert (Schritt 886). Eine Dosisreaktionsinhibition des durch den Standardagonisten Lk stimulierten Signals durch die Substanz Ni wird dann registriert (Schritt 888), mit einer nachfolgenden Berechnung der Inhibitionsparameter im Schritt 896. Diese Daten werden dann in einer Datenbank gespeichert (Schritt 894). Wenn die Registrierung der Konzentrationsabhängigkeit beendet ist, werden beide Dosierventile 311 und 327 ausgeschaltet (Schritt 890), um ihre Einlaßöffnungen 307 und 323 zu schließen und um ihre "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnungen 309 und 325 zu öffnen. Während dieses Ablaufs werden die Fluidleitungen mit Pufferlösung 305 gespült, die aus den Düsen 309 und 325 der Autosampler 301 und 315 durch die Auslaßöffnungen 312 und 328 der Dosierventile 311 und 327, die Füllventile 313 und 329, die Mischzone 331, die "normalerweise geöffnete" Einlaßöffnung 332 und die Auslaßöffnung 342 des Umsteuerventils 333, das "normalerweise geöffnete" Einlaßventil 341, die Mischzone 343, die reaktionsfördernde Leitung 353 und den Detektor 355 kommt. Als nächstes kehrt das Programm zum Schritt 876 zurück, wo der oben beschriebene Zyklus wiederholt wird, bis alle Standardagonisten gezählt und diejenigen mit einem positiven Flag gemessen sind und der numerische Wert Lk des Inkrementzählers größer wird als der Wert Lmax, wobei dann das Programm zum Schritt 804 zurückkehrt.
Wenn alle Substanzen Ni gezählt (Schritt 804) und geprüft sind, wird die Anzahl Ni größer als der Wert Nmax, und der Inkrementzähler N wird auf null zurückgesetzt (Schritt 808), und das Programm endet (Schritt 810).
Zellen zur Verwendung in der Vorrichtung können wegen des Vorhandenseins bestimmter bekannter Rezeptoren oder wegen deren Fähigkeit, vorbestimmte Zellreaktionen auf bestimmte Stimuli hervorzurufen, gewählt werden. Eine große Anzahl solcher Zellen sind bekannt. Um beispielsweise die Wirkung von Substanzen auf die Calciummobilisierung zu messen, die durch verschiedene Typen von Rezeptoren bewirkt wird, wird man möglicherweise folgende Zellen verwenden wollen: Jurkat-T-Zellen, Blutplättchen, Nabelschnurvene, Endothelzellen oder Lungenfibroblasten vom chinesischen Hamster für Thrombinrezeptoren; zerebelläre Purkinje-Zellen, kortikale Astrozyten und kortikale Gliazellen für AMPA-Rezeptoren; Hippokampus-Nervenzellen für NMDA-Rezeptoren; P-12-Zellen für purinerge Rezeptoren; Oligodendrozyten für von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptoren, menschliche Neuroblastomzellen und Hypophysenzellen für Neuropeptid-Y-Rezeptoren und Proteintyrosinkinase- und Proteintyrosinphosphataserezeptoren; menschliche Medulloblastomzellen für Endothelrezeptoren; neutrophile Leukozyten für TNFa-Rezeptoren; NG108-15-Zellen für Opioid, Bradykainin und ATP; Synovialfibroblasten für Plasminogenrezeptoren usw. Wenn jemand eine intrazelluläre Ionenkonzentration messen will, kann er beispielweise die Zellen mit einem Farbstoff oder mit einem anderen nachweisbaren Material mit einer Empfindlichkeit für eine Konzentration dieses besonderen Ions präinkubieren. (Ein tatsächliches Arbeitsbeispiel, das die Aufbereitung von Zellen für den Nachweis von Calciumionen darstellt, ist im Beispiel 1 ausgeführt.)
Wenn man als Alternative das Muster der natürlichen Expression der Rezeptoren bestimmen will, die für den Ca²&spplus;- Signalisierungsweg verantwortlich sind, dann kann man die Zellen von besonderem Interesse verwenden und dann mit einer Gruppe von Agonisten verwenden, von denen bekannt ist, daß sie ihre Aktivität durch Ca²&spplus;-Mobilisierung ausüben, um die Zellen danach zu kennzeichnen, welcher Typ der Rezeptoren in diesen bestimmten Zellen exprimiert wird. Diese Gruppe von Agonisten kann bestehen aus: Acethylcholin, Adrenalin, Noradrenalin, 5- Hydroxitriptamin, DOPA, NMDA, AMPA, Angiotensin II, Bradykinin, Bombesin, Opioid, Endothelin-1, Neuropeptide Y, TNF, PDGF, FGF usw.
Die folgenden Beispiele stellen spezifische, nichteinschränkende Experimente und substanzprofilierende Vorgänge gemäß der Erfindung dar.

Beispiel 1

TE-671-Zellen, menschliches Medulloblastom (ATCC CRL 8805) exprimiert naturgemäß einen Endothelin-Untertyp-A- Rezeptor ETAR. Dieser Rezeptor gehört zur Familie der sieben transmembranüberspannenden G-protein-gekoppelten Rezeptoren und aktiviert bekanntlich die Calciummobilisierung im Zellzytoplasma nach Bindung seines spezifischen agonistischen Endothelin-1, eines 21-Aminosäurepeptids. Um die Affinität des Agonisten für den Rezeptor zu kennzeichnen, wird nach herkömmlichen Methoden die physiologische Reaktion der Zelle bei Vorhandensein verschiedener Konzentrationen des Agonisten oder Antagonisten gemessen (Sakamoto, A. et al., 1994, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Fig. 9 stellt eine Messung der Aktivierung der intrazellulären Calciummobilisierung (Ca²&spplus;, gemessen in nanomolarer Konzentration) als Funktion der Konzentration von Endothelin-1 (ET-1, gemessen in picomolarer Konzentration) unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Die Vorrichtung war eine computergesteuerte Negativdruckeinheit, wie oben beschrieben. Dieser Ablauf wurde bei Vorhandensein verschiedener Konzentrationen von ETAR- spezifischen kompetitiven Antagonisten BQ-123 durchgeführt (dargestellt in nanomolarer Konzentration).
TE-671-Zellen wurden zur Verwendung im erfindungsgemäßen Zellphysiometer aufbereitet, indem sie in einem T75- Röhrchen bis zur Konfluenz gezüchtet wurden. Das Wachstumsmedium wurde abgegossen, und die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Dulbecco-Kochsalzlösung (DPBS) gewaschen und mit frischer DBPS ergänzt, die 2 pH FURA-2AM enthielt und ohne weiteres in das Zellenzytoplasma eindrang und dort mit unspezifischen Esterasen hydrolisiert wurde, um FURA 2 zu bilden, einen Farbstoff, der für die ionisierte Form von Calcium empfindlich ist. Nach einer Inkubation von 30 min wurden die Zellen mit dem gleichen Volumen an frischer DPBS ergänzt und für weitere 30 min inkubiert. Die Zellen, die jetzt mit dem Farbstoff belastet waren, wurden mit 0,05%-iger Trypsin-EDTA- Lösung vom Kolbenboden gelöst. Die Zellen wurden dann zweimal mit DPBS, die 0,1% Sojabohnen-Trypsininhibitor enthielt, gewaschen und wurden erneut in einem calciumfreien, magnesiumfreien und phenolrotfreien modifizierten Dulbecco-Eagle-Medium (DMEM) suspendiert.
Kurz gesagt, wurde mit Bezug auf Fig. 3 nach Kalibrierung mit Minimum- und Maximum-Standardlösungen (339, 337) ET- 1-Lösung, eine agonistische Prüfsubstanz, mit DPBS- Pufferlösung durch das Dosierventil 311 in einem sich kontinuierlich ändernden Verhältnis vermischt und durch das Dosierventil 311, die Mischzone 331, das Umsteuerventil 333 und das Füllventil 341 in die Mischzone 343 geleitet, wo es mit einer Suspension aus TE-671-Zellen vermischt wurde, um eine endgültige Konzentration der Zellen von 4 · 10&sup5; Zellen/ml bereitzustellen. Gleichzeitig wurde BQ-123 als Standardantagonistenlösung mit einer vorbestimmten Konzentration, die durch Vermischen von BQ-123 mit DPBS im Dosierventil 327 hergestellt wurde, auch in die Mischzone 331 geleitet, und zwar in einem Verhältnis von 1 : 1 mit der ET-1-Lösung. In der Mischzone 343 wird der gemischte Strom aus BQ-123 mit konstanter Konzentration und ET-1 mit einer zeitlich sich kontinuierlichen ändernden Konzentration mit Zellen in einem Verhältnis von 2 : 1 vermischt. Dies ergibt eine dreifache endgültige Verdünnung für jede Komponente des Stroms, der durch die Mischzone 343 und schließlich durch den Detektor 355 strömt. Das Dosierventil 327 wurde für den ersten, zweiten und dritten Durchlauf so programmiert, daß eine endgültige BQ-123-Konzentration von null, 10 nM bzw. 40 nM entstand. Das Dosierventil 311 wurde so vorprogrammiert, daß in jedem Durchlauf eine endgültige Konzentration von ET-1 von 0 bis 100 pM entstand. Änderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration in den TE-671- Zellen, die durch den Detektor 355 strömten, wurden in Echtzeit als Funktion der ET-1-Konzentration unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs FURA-2 gemessen, wie oben beschrieben.
Die Durchflußrate und die Länge der reaktionsfördernden Leitung wurden so gewählt, daß das Zeitintervall vom Mischpunkt der Zellen mit der Substanz bis zum Signalermittlungspunkt in der Durchflußküvette 40 s betrug. Die Zeit, die erforderlich ist, damit ein vollständiger Konzentrationsgradientendurchlauf die Kurven in Fig. 9 erzeugt, ist erfindungsgemäß 5 min. Im Gegensatz dazu dauert es bei einer herkömmlichen Analyse unter Verwendung der Phosphatidylinositol-Umsatzrate als Indikator von ETAR-Stimulation mehrere Stunden, um nur einige wenige Konzentrationspunkte auf der Reaktionskurve zu erhalten, und es würde unmäßig lange dauern, um eine vollständige Kurve zu erzeugen, wie in Fig. 9 gezeigt.
Fig. 10 ist eine logarithmische Transformation der Daten in Fig. 9, die vom Fachmann verwendet wird, um die maximale Zellreaktion bei Vorhandensein eines Antagonisten sowie den EC&sub5;&sub0;-Wert für den Antagonisten und den pA&sub2;-Wert für den Antagonisten zu berechnen. Der EC&sub5;&sub0;-Wert, der aus der Aktivierungskurve ohne BQ-123 berechnet wird, entspricht 10 pM, und man kann sehen, daß die Aktivierungskurven in Fig. 10 bei Vorhandensein von BQ-123, das bekanntlich für den kompetitiven Inhibitionstyp charakteristisch ist, nach rechts parallel verschoben sind. Der mittlere pA&sub2;-Wert, der aus den beiden verschiedenen Konzentrationen von BQ-123 berechnet wird, beträgt 7,96. Dies entspricht einer Inhibitionskonstante k&sub1; für BQ-123 von 11 nM. Die EG&sub5;&sub0;- und pA&sub2;-Werte sind in genauer Übereinstimmung mit den Literaturdaten (Masaki Ihara et al., 1992, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird).

Beispiel 2

Fig. 11 zeigt die Inhibition der ET-1-induzierten intrazellulären Calciummobilisierung mit BQ-123 in TE-671- Zellen. Die gleiche Zellphysiometervorrichtung und Zellaufbereitungsprozedur wie im Beispiel 1 wurde auch hier verwendet.
In diesem Experiment wurde ET-1 mit einer konstanten Konzentration aus der "Standard"-Nippdüse der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingeleitet, und BQ-123 wurde durch die "Substanz"-Düse der Vorrichtung eingeleitet. In diesem Beispiel, wie im Beispiel 1, war der Konzentrationsdurchlauf 5 min. und die Reaktionszeit (vom Mischen bis zum Nachweis) war 40 s.
Kurz gesagt, wurde mit Bezug auf Fig. 3 nach der Kalibrierung mit den Minimum- und Maximum-Standardlösungen (337, 339) die ET-1-Lösung, eine Agonistenstandardlösung, mit einer vorbestimmten Konzentration, die im Dosierventil 327 durch Mischen mit DPBS-Pufferlösung hergestellt wurde, durch das Füllventil 329, die Mischzone 331, das Umsteuerventil 333 und das Füllventil 341 und dann in die Mischzone 343 geleitet, wo sie mit einer Suspension aus TE-671-Zellen vermischt wurde, um eine endgültige Konzentration von Zellen von 4 · 10&sup5; Zellen/ml bereitzustellen. Gleichzeitig wurde DPB in einem volumetrischen Verhältnis von 1 : 1 zur ET-1-Lösung durch die Einlaßöffnung 309 und die Auslaßöffnung 312 des Dosierventlis 311, das Füllventils 313 in die Mischzone 331 und weiter durch das Fluidsystem zum Detektor 355 geleitet. Nachdem sich die intrazelluläre Calciumkonzentration bei Vorhandensein des Standardagonisten stabilisiert hatte, wurde BQ-123 als antagonistische Prüfsubstanz von der Einlaßöffnung 307 des Dosierventils 311 anstelle von DPBS in die Mischzone 331 mit sich kontinuierlich ändernden Konzentrationen, die durch Mischen von BQ-123 mit DPBS im Dosierventil 311 hergestellt wurden, in einem volumetrischen Verhältnis von 1 : 1 mit der ET-1-Lösung durch das System geleitet. In der Mischzone 343 wurde der gemischte Strom aus ET-1 mit konstanter Konzentration und BQ-123 mit einer sich zeitlich kontinuierlich ändernden Konzentration mit Zellen in einem Verhältnis von 2 : 1 vermischt. Dies ergibt eine dreifache endgültige Verdünnung für jede Komponente des Stroms, der durch die Mischzone 343 und schließlich durch den Detektor 355 strömt. Das Dosierventil 327 wurde so vorprogrammiert, daß eine endgültige Konzentration von ET-1 von 40 pM am Detektor entstand. Das Dosierventil 311 wurde so vorprogrammiert, daß eine endgültige Konzentration von BQ-123 von 0 bis 300 nM entstand. Änderungen der zellulären Calciumionenkonzentration in den TE-671-Zellen, die durch den Detektor 355 strömen, wurden in Echtzeit als Funktion von BQ-123- Konzentration unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs FURA-2 gemessen, wie oben beschrieben.

Beispiel 3

Fig. 12 zeigt die Versuchsausführung des "Null- Verfahrens" (Lazareno & Birdsall, 1993). Dieses Beispiel verwendet das gleiche Instrument und die gleichen Reagenzien wie in den Beispielen 1 und 2.
In diesem Beispiel wird ein erster Konzentrationsgradient von ET-1, der aus der "Standard"-Düse 323 der erfindungsgemäßen Vorrichtung kommt, mit Pufferlösung hergestellt, die aus der "Substanz"-Düse kommt. Wenn die endgültige ET-1- Konzentration den Wert 40 pM erreicht hat, hält das Gradientengerät 1 die ET-1-Konzentration konstant, und das Gradientengerät 2 beginnt, die Konzentration von BQ-123 zu erhöhen, das aus der "Substanz"-Düse kommt. Man kann den Agonistengradienten auf einen Antagonisten mit irgendeiner vorbestimmten Konzentration des Agonisten umschalten.

Beispiel 4

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können verwendet werden, um das Muster von Zelloberflächenrezeptoren zu bestimmen, die in einem oder mehreren Zelltypen wie folgt exprimiert werden. Jeder der verschiedenen zu prüfenden Zelltypen wird in ein Reservoir aus der Vielzahl von Zellsuspensionsreservoiren eingebracht, oder wenn ein einzelner Zelltyp geprüft werden soll, kann eine Vorrichtung mit einem einzigen Zellsuspensionsreservoir verwendet werden, um die Zellen aufzunehmen. Die Wirkungen des einen oder der mehreren Prüfmittel, von denen bekannt ist, daß sie die Aktivität von bestimmten Rezeptoren beeinflussen, werden gemessen, indem die Zellsuspensionen mit Prüfmitteln vereinigt werden, um eine Prüfmischung zu bilden, die Prüfmischung durch eine Nachweiszone geleitet wird und die Zellreaktion unter Verwendung der oben beschriebenen Prozeduren gemessen wird. Vorzugsweise weisen die Prüfmittel einen oder mehrere Rezeptoragonisten auf. In bestimmten Ausführungsformen kann das Prüfmittel jedoch ein Antagonist oder eine Mischung aus einem Agonisten und einem Antagonisten sein (Ilja, bitte bestätige diesen Satz).
Die Zellreaktion kann eine Aktivierung der Zellaktivität sein, wenn das Prüfmittel ein Rezeptoragonist ist. Wenn als Alternative das Prüfmittel ein Antagonist ist, kann die Zellreaktion die Inhibition der Zellaktivität sein. Wenn das Prüfmittel eine Kombination aus einem Agonisten und einem Antagonisten ist, kann die Zellreaktion ebenso eine Reduktion oder ein Ausbleiben der Aktivität sein, die normalerweise als Reaktion auf den Agonisten aufgrund des Vorhandenseins des Antagonisten erreicht wird. Wenn das Prüfmittel eine Prüfsubstanz ist, würde die Zellreaktion die Reaktion sein, die man erwartungsgemäß bei diesem Mittel beobachtet.
Wenn eine Zellreaktion bei einem Agonisten, Antagonisten, einer Agonisten/Antagonistenmischung oder einem Prüfmittel beobachtet wird, von denen bekannt ist, daß sie mit einem bestimmten Rezeptor zusammenwirken, weist der zu bewertende Zelltyp diesen Rezeptor auf. Durch Prüfung der Wirkung verschiedener Agonisten, Antagonisten, Agonisten/Antagonistenmischungen oder Prüfsubstanzen auf die Zellphysiologie, kann das Spektrum der Rezeptoren bei den zu bewertenden Zellen bestimmt werden. Wenn mehrere Zelltypen zu prüfen sind, wird der Ablauf für jeden der Zelltypen in einer Serie wiederholt, um das Spektrum der Rezeptoren zu bestimmen, die in jedem Zelltyp vorhanden sind. Um die Analyse von mehreren Zelltypen zu erleichtern, kann jeder der Zelltypen in einem aus der Vielzahl von Zellsuspensionsreservoiren in den Vorrichtungen plaziert werden, die oben beschrieben sind.

Beispiel 5

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können verwendet werden, um zu bestätigen, daß das Prüfmittel die Aktivität eines bestimmten Rezeptors beeinflußt, nämlich wie folgt. Das Prüfmittel kann ein Agonist, ein Antagonist oder eine Mischung aus einem Agonisten und einem Antagonisten sein. Das Prüfmittel kann ein Mittel, von dem bekannt ist, daß es die Aktivität des Rezeptors beeinflußt, oder ein Mittel sein, dessen Wirkung auf den Rezeptor unbekannt ist. Ein Zelltyp, der keinen Rezeptor hat, dient als eine Negativkontrolle und wird in einem der Zellsuspensionsreservoire plaziert. Eine Zelle des gleichen Zelltyps wie die Negativkontrolle, die konstruiert und induziert worden ist, um den Rezeptor zu exprimieren, wird in einem anderen Zellsuspensionsreservoir plaziert. Die Wirkungen des einen oder der mehreren Prüfmittel wird in jedem dieser Zelltypen bewertet, indem die Zellen mit dem Prüfmittel in Kontakt gebracht werden, um eine Negativkontrollmischung und ein Prüfgemisch zu bilden, die Negativkontrollmischung und die Prüfmischung durch eine Nachweiszone geleitet werden und die Zellreaktionen der negativen Kontrollzellen und der konstruierten und induzierten Zellen gemessen werden. Eine Differenz in der Reaktion der konstruierten und induzierten Zellen relativ zu der Reaktion der Negativkontrollzellen zeigt an, daß das Prüfmittel eine Wirkung auf die Aktivität des Rezeptors hat.
Die Negativkontrollzelle wird von den Mitarbeitern der Industrie normalerweise als "Wirtszelle" und die konstruierte Zelle als die "transfizierte Zelle" bezeichnet. Um konstruierte Zellen zu erhalten, kann das Gen, das den Rezeptor codiert, in eine Zelle des gleichen Typs wie die Negativkontrollzelle unter Verwendung von Techniken induziert werden, z. B. durch Transformation, calciumphosphatvermittelte Transfektion, Elektroporation, Virusinfektion, Transposition oder andere Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Die Expression des Rezeptorgens kann durch eine Vielzahl verschiedener Vektoren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Als Alternative können die Zellen induziert werden, um den Rezeptor durch Behandlung mit chemischen Mitteln oder bioaktiven Mitteln zu exprimieren, z. B. mit Wachstumsfaktoren, Zytokinese, Zelldifferenzierungsfaktoren oder andere Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind.

Beispiel 6

Die Aktivität eines bestimmten Rezeptors kann auch durch die Charakteristik des bestimmten Zelltyps, in dem er exprimiert wird, beeinflußt werden. Somit kann der gleiche Rezeptor Variationen der Aktivität zwischen verschiedenen Zelltypen aufweisen. Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um solche zelltypenabhängigen Differenzen der Rezeptoraktivität zu bewerten. Jeder der zu bewertenden Zelltypen wird in einem Zellsuspensionsreservoir plaziert, und die Wirkungen eines oder mehrerer Prüfmittel auf die Aktivität eines oder mehrerer Rezeptoren an den Zellen werden bestimmt, indem die Zellen mit einem oder mehreren Prüfmitteln in Kontakt gebracht werden, um Prüfmischungen zu bilden, die Prüfmischungen durch eine Nachweiszone geleitet werden und die Zellreaktion der Zellen gemessen wird, während die Prüfmischung durch die Nachweiszone strömt. Die Prüfmittel können bekannte Rezeptoragonisten, bekannte Antagonisten, Mischungen aus bekannten Agonisten und bekannten Antagonisten oder Substanzen sein, deren Aktivität unbekannt ist, wie oben beschrieben. Dieser Ablauf erfolgt für jeden der zu prüfenden Zelltypen, um den Charakter und die Stärke der Zellreaktion in jedem Zelltyp zu bestimmen. Um die Analyse mehrerer Zelltypen zu erleichtern, kann jeder der Zelltypen in einem aus der Vielzahl von Zellsuspensionsreservoiren in den oben beschriebenen Vorrichtungen plaziert werden.
Fig. 13 zeigt einen Algorithmus, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, um eine Zellabbildung und einen Zellrezeptor-"Fingerabdruck" durchzuführen. Zuerst werden die Zellen mit dem Standardagonisten vermischt (Schritt 1301), und die Mischung wird an einen Detektor übergeben (Schritt 1302). Als nächstes bestimmt die Vorrichtung, ob dieser Standardagonist bei Kontakt mit den Zellen eine Zellreaktion auslöst (Schritt 1303). Es gibt zwei Möglichkeiten: Entweder der Standardagonist erzeugt keine Reaktion (Nein), oder er bewirkt eine Zellreaktion (Ja). Die Zellreaktion wird bestimmt, indem das Signal vom Detektor für den zu bewertenden bestimmten Standardagonisten überwacht wird. Das Steuerungssystem kalibriert sich zuerst, um eine Basislinie und eine Maximalreaktion festzulegen, und jedes Signal vom Detektor, das zwischen diesen Werten liegt, gilt als positive Reaktion.
Wenn der Standardagonist keine Zellreaktion bewirkt (Nein), wie vom Überwachungsteil der Vorrichtung gemessen, inkrementiert das System einen Agonistenzähler (Schritt 1309), der anzeigt, daß der nächste Standardagonist in einer vorgegebenen Gruppe von Agonisten mit einer bestimmten Zellinie geprüft wird. Das System bestimmt dann, ob alle verfügbaren Agonisten geprüft worden sind (Schritt 1305). Wenn alle Standardagonisten mit einer bestimmten Zellinie geprüft worden sind, werden frische Zellen aus der ursprünglichen Zellinie dem System zugeführt (Schritt 1306). Diese neuen Zellen werden automatisch mit dem nächsten Standardagonisten aus der vorbestimmten Gruppe von Agonistenlösungen in Kontakt gebracht (Schritt 1301). Jede Agonistenlösung in der Gruppe enthält einen oder mehrere Bestandteile, von denen bekannt ist, daß sie durch die Stimulation eines bekannten Zellrezeptor-, Ionenpumpen- oder Ionenkanalmoleküls eine Zellreaktion auslösen. Die Vorrichtung wiederholt immer wieder eine Vermischung verschiedener Standardagonistensubstanzen mit Zellen, bis sie nachweist, daß die Zellreaktion mit einem bestimmten Standardagonisten ausgelöst wird oder bis alle für die Maschine verfügbaren Agonisten geprüft worden sind.
Wenn im Schritt 1303 bestimmt wird, daß ein bestimmter Agonist eine Zellreaktion auslöst, wird der Ablauf auf den Po¬ tenzmodus umgeschaltet (Schritt 1303), in dem die Zellreaktion bei verschiedenen Konzentrationsstufen des Standardagonisten aufgezeichnet wird. Nachdem der Schritt 1303 beendet worden ist, zeichnet der Ablauf die Potenzparameter oder das Profil auf, das die Stärke der Zellreaktion darstellt, die in einer gegebenen Zellinie bei verschiedenen Konzentrationsstufen des Standardagonisten erzeugt wird (Schritt 1307). Der Ablauf bestimmt dann wiederum, ob alle verfügbaren Standardagonisten geprüft worden sind (Schritt 1304). Wenn alle verfügbaren Agonisten geprüft worden sind (Ja), bestimmt das System dann, ob die verfügbaren Zellinien alle geprüft worden sind (Schritt 1308). Wenn die Antwort auf diese Frage Ja ist, ist der Ablauf beendet (Schritt 1312).
Wenn im Schritt 1308 bestimmt wird, daß nicht alle verfügbaren Zellinien geprüft worden sind, wird ein Zellenzähler inkrementiert (Schritt 1310), was anzeigt, daß die nächste Zellinie in einer vorgegebenen Gruppe von Zellinien geprüft wird. Als nächstes wird der Standardagonistenzähler zurückgesetzt (Schritt 1310), was anzeigt, daß die neue Zellinie mit allen verfügbaren Standardagonisten geprüft wird, angefangen mit einem ersten gewählten Agonisten in der vorgegebenen Gruppe von Standardagonisten. Zellen aus der neuen Zellinie werden dann dem System zugeführt (Schritt 1311) und danach mit dem vorgegebenen Agonisten vermischt (Schritt 1301). Die oben genannten Ablaufschritte 1301 bis 1311 werden dann wiederholt. In einer Ausführungsform wiederholt die Vorrichtung eine Vermischung verschiedener Standardagonistensubstanzen mit den Zellen, bis sie nachweist, daß alle Agonisten, die für die Vorrichtung verfügbar sind, mit allen Zellinien, die für die Vorrichtungen verfügbar sind, geprüft worden sind.
Fig. 14 zeigt einen Algorithmus, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, um eine transfizierte Rezeptorkennzeichnung insbesondere eines Orphan-Rezeptors durchzuführen. Zunächst liefert im Schritt 1401 eine Vorrichtung Zellen, die mit einem Gen transfiziert sind, das einen bekannten Orphan- Rezeptor erzeugt, und mischt diese mit einem Standardagonisten (Schritt 1402). Die Mischung wird an einen Detektor geliefert (Schritt 1403). Als nächstes bestimmt die Vorrichtung, ob dieser Standardagonist bei Kontakt mit den Zellen eine Zellreaktion auslöst (Schritt 1404). Es gibt zwei Möglichkeiten: Entweder der Standardagonist erzeugt keine Reaktion (Nein), oder er bewirkt die Zellreaktion (Ja). Die Zellreaktion wird bestimmt, indem das Signal vom Detektor für den bestimmten zu bewertenden Standardagonisten überwacht wird. Das Steuerungssystem kalibriert sich zunächst, um eine Basislinie und eine Maximalreaktion festzulegen, und jedes Signal vom Detektor, das zwischen diesen Werten liegt, gilt als eine positive Reaktion.
Wenn der Standardagonist keine Zellreaktion bewirkt (Nein), wie vom Überwachungsteil der Vorrichtung gemessen, inkrementiert das System einen Standardagonistenzähler (Schritt 1405), was anzeigt, daß der nächste Standardagonist in einer vorgegebenen Gruppe von Standardagonisten mit der transfizierten Zelle geprüft wird. Das System bestimmt dann, ob alle verfügbaren Standardagonisten mit der transfizierten Zelle geprüft worden sind (Schritt 1406). Wenn nicht, kehrt der Ablauf zurück zum Schritt 1401, wo frische Zellen aus der gleichen transfizierten Zellinie automatisch mit dem nächsten Standardagonisten aus der vorbestimmten Gruppe von Agonistenlösungen in Kontakt gebracht werden (Schritt 1402). Jede Standardagonistenlösung in der Gruppe enthält einen oder mehrere Bestandteile, von denen bekannt ist, daß sie eine Zellreaktion durch die Stimulation eines bekannten Zellrezeptor-, Ionenpumpen-, oder Ionenkanalmoleküls auslösen. Die Vorrichtung wiederholt immer wieder eine Vermischung verschiedener Standardagonistensubstanzen mit transfizierten Zellen, bis sie nachweist, daß die Zellreaktion mit einem bestimmten Standardagonisten ausgelöst wird oder bis alle Agonisten, die für die Maschine verfügbar sind, geprüft worden sind.
Wenn im Schritt 1404 bestimmt wird, daß der Kontakt der transfizierten Zellen mit den Standardagonisten die Zellreaktion auslöst (Ja), wie vom Überwachungsteil der Vorrichtung gemessen, dann liefert der Ablauf Wirtszellen (Schritt 1407), die mit dem gleichen Standardagonisten zu vermischen sind (Schritt 1408). Diese Mischung wird dann an den Detektor geliefert (Schritt 1409), zum Messen der durch den Standardagonisten erzeugten Zellreaktion auf die Wirtszellen. Als nächstes bestimmt das System, ob der Standardagonist eine Zellreaktion in den Wirtszellen erzeugt (Schritt 1410). Wenn eine Zellreaktion nachgewiesen wird (Ja), inkrementiert das System den Standardagonistenzähler (Schritt 1405), woraufhin das System bestimmt, ob alle verfügbaren Agonisten geprüft worden sind (Schritt 1410). Wenn alle verfügbaren Agonisten geprüft worden sind, ist der Ablauf beendet (Schritt 1412). Wenn nicht alle verfügbaren Standardagonisten geprüft worden sind, kehrt der Ablauf zurück zum Schritt 1401, wo frische transfizierte Zellen geliefert werden, um mit dem nächsten Standardagonisten in der Gruppe von Standardagonisten vermischt zu werden (Schritt 1402), und die oben beschriebenen Ablaufschritte werden wiederholt.
Wenn im Schritt 1410 keine Zellreaktion durch den Standardagonisten in der Wirtszelle erzeugt wird, hat der Ablauf eine Differenz zwischen der Wirtszelle und der transfizierten Zelle nachgewiesen. An diesem Punkt ist der Ablauf beendet (Schritt 1412). In einer Ausführungsform wiederholt die Vorrichtung immer wieder eine Vermischung verschiedener Standardagonistensubstanzen mit den Zellen, bis sie nachweist, daß ein bestimmter Agonist eine Reaktion in den Zellen stimuliert, die mit einem Orphan-Rezeptor transfiziert sind, und stimuliert keine Reaktion auf Wirtszellen, oder bis alle Standardlösungen, die für die Maschine verfügbar sind, geprüft worden sind.
Ein kontinuierliches Flußdiagramm der gegenwärtig bevorzugten Zellabbildungs- und Zellrezeptor-"Fingerabdruck"- Modus beim Negativdruckfluidsystem in Fig. 3 ist in Fig. 15a bis 15f gezeigt. Um diesen Modus zu praktizieren, wird das Umsteuerventil 347 durch ein Mehrkanal-Umsteuerventil 347 ersetzt, wodurch mehrere Reservoire, jeweils mit einer anderen Zellsuspension, mit einem gemeinsamen Auslaß 346 getrennt verbunden werden können, so daß, wenn das Experiment mit einer bestimmten Zellinie beendet ist, das Ventil 347 auf ein nächstes Zellreservoir umgeschaltet wird.
Das Screeningprogramm startet mit einem Zustand 1500 und tritt in den Zustand 1502 ein, wo es alle Parameter auf ihre Anfangswerte setzt. Diese Anfangsparameter sind u. a. Nullsetzung des Zählers, die interne Initialisierung der Softwarevariablen und Subroutinen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Wenn die Anfangsparameter gesetzt sind, fordert die Software einen Bediener auf, Werte für eine Maximalzahl von Standardagonisten Lmax und eine Maximalzahl von Zellinien Cmax einzugeben, die im Experiment zu verwenden sind (Schritt 1503). Die Autosampler 301 und 315 (Fig. 3) positionieren die Ansaugdüsen 307 und 323 in den entsprechenden "Null"- Positionen, die von einem Waschpufferlösungsreservoir belegt sind (Schritt 1504), und schalten die Dosierventile 311 und 327, die Umsteuerventil 333, 335 und 347 sowie die Füllventile 313, 329, 341 und 345 aus (Schritt 1506). In einem ausgeschalteten Zustand sind die Füllventile 313, 329, 341 und 345 normalerweise geöffnet, die Dosierventile 311 und 327 verbinden jeweils ihre Auslässe 312 und 328 mit entsprechenden "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnungen 309 und 325, das Umsteuerventil 335 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 334 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 336, das Umsteuerventil 333 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 342 mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 332, und das Mehrkanal- Umsteuerventil 347 verbindet seinen gemeinsamen Auslaß 346 mit der ersten Einlaßöffnung 348, die mit dem Reservoir verbunden ist, das die erste zu prüfende Zellsuspension enthält.
Nachdem das System initialisiert worden ist, wird die Pumpe 357 gestartet (Schritt 1508). Dadurch wird die Waschpufferlösung aus den auf "Null" positionierten Reservoiren beider Autosampler 301 und 315 befördert, um jeweils durch die Düsen 309 und 325 und die Auslaßöffnungen 312 und 328 der Dosierventile 311 und 327, durch die Füllventile 313 und 329, die Mischzone 331, die Einlaßöffnung 332 und die Auslaßöffnung 342 des Umsteuerventils 333, das Füllventil 341, die Mischzone 343, eine reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und dann in den Abflußbehälter 359 zu strömen.
In der Mischzone 343 wird dieser Strom mit der Zellsuspension 349 vermischt, die aus der Einlaßröhre 348, die mit der ersten Zellinie verbunden ist, und aus einer Auslaßöffnung 346 des Mehrkanal-Umsteuerventils 347 durch das Füllventil 345 kommt. Somit ist der Gesamtstrom, der durch die Mischzone 343 strömt, eine Summe aus drei Strömen, einem ersten Strom, der aus dem Dosierventil 311 kommt, einem zweiten Strom, der aus dem Ventil 327 kommt, und einem dritten Strom, der aus dem Mehrkanal- Umsteuerventil 347 kommt. Während dieses Schrittes liefern beide Dosierventile Waschpufferlösung 305 aus den Reservoiren, die sich in der "Null"-Position jedes Autosamplers befinden, so daß der endgültige Strom der Mischung aus einem Teil Zellsuspension 349 und zwei Teilen Waschpufferlösung 305 besteht.
Nach einer im Schritt 1509 bestimmten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Strom der Mischung aus Zellsuspension 349 und Waschpufferlösung 305 stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 ein Basissignal, das von den Zellen allein erzeugt wird (Schritt 1510). Nachdem das Basissignal registriert ist, wird es als Referenzsignal BSi gespeichert (Schritt 1512), und der Computer 123 (Fig. 1) inkrementiert den Zähler L (Schritt 1514).
Der numerische Inhalt des Inkrementzählers L wird immer dann um eins erhöht, wenn er ausgelöst wird. Der numerische Wert des Zählers bestimmt die Position der Düse der Einlaßöff¬ nung 323 des Autosamplers 315, der die Gruppen der zu prüfenden Standardagonisten 319 wählt. Als nächstes wird im Schritt 1516 der numerische Inhalt Lk des Inkrementzählers L mit dem vorher eingegebenen Wert (Schritt 1503) der maximalen Anzahl der zu prüfenden Standardagonisten Lmax verglichen.
Wenn Lk nicht größer ist als Lmax, positioniert der Autosampler 315 die Düse 323 im Standardagonistenreservoir, das sich in der Position Lk des Gestells der Standardagonisten 319 befindet (Schritt 1518). Als nächstes wird das Dosierventil 327 eingeschaltet, um seine "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 323 zu der gemeinsamen Auslaßöffnung 328 zu öffnen (Schritt 1520). Während des Schrittes 1520 besteht der vereinigte Strom in der Mischzone 343 und danach im Detektor 355 aus einem Teil Pufferlösung 305, die durch die Düse 309 des Dosierventils 311 kommt, einem Teil zu prüfender Standardagonist 319, der aus der Düse 323 des Dosierventils 327 kommt, und einem Teil bestimmte Zellsuspension 349, die aus einem aus der Vielzahl von Zellreservoiren durch die Einlaßröhre 348 zur Auslaßöffnung 346 des Mehrkanal-Umsteuerventils 347 kommt. Nach einer im Schritt 1521 bewirkten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Mischprozeß stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 ein durch Standardagonisten induziertes Signal SLk, das bei Vorhandensein des gegebenen Standardagonisten Lk durch gegebene Zellen erzeugt wird (Schritt 1522). Nachdem das Signal SLk registriert ist, wird sein Wert als Wert SLk gespeichert (Schritt 1523), und die Vorrichtung geht über zum Schritt 1530, wo das Dosierventil 327 ausgeschaltet wird, wobei die normalerweise geöffnete Einlaßöffnung 325 mit Pufferlösung 305 verbunden wird. Im Schritt 1532 bringt der Autosampler 315 seine Düse 323 in eine "Null"- Position, die mit dem Reservoir belegt ist, das mit Waschpufferlösung gefüllt ist. Das Dosierventil 327 wird eingeschaltet (Schritt 1534), wobei die normalerweise geschlossene Einlaßöffnung 323 mit der Auslaßöffnung 328 verbunden wird. Die Verzögerung, die im Schritt 1536 bestimmt wird, ermöglicht es, daß der Stromweg, der aus der Einlaßöffnung 323, der Auslaßöffnung 328 des Dosierventils 327, dem Füllventil 329, der Mischzone 331, der Einlaßöffnung 332 und der Auslaßöffnung 342 des Umsteuerventils 333, dem Füllventil 341, der Mischzone 343, den reaktionsfördernden Leitungen 353 und dem Detektor 355 besteht, von den Resten der vorherigen Substanz gereinigt wird. Nach der Verzögerung wird das Dosierventil 327 im Schritt 1538 ausgeschaltet, wobei das System in den ursprünglichen Zustand versetzt wird.
Als nächstes wird der Wert des durch Standardagonisten induzierten Signals SLk mit dem Wert des Referenzbasissignals BSi verglichen (Schritt 1544). Wenn das SLk-Signal größer ist als das SBi-Signal, "markiert" der Computer 123 (Fig. 1) den entsprechenden Standardagonisten "positiv" (Schritt 1540), was bedeutet, daß die bestimmten Zellen einen Rezeptor exprimieren, der durch den bestimmten Agonisten stimuliert wird. Wenn SLk nicht größer ist als BSi, "markiert" der Computer 123 den entsprechenden Standardagonisten "negativ" (Schritt 1542), was bedeutet, daß die bestimmten Zellen keinen Rezeptor enthalten, der durch den bestimmten Agonisten stimuliert werden kann.
Immer wenn die Bedingung "SLk > BSi" erfüllt ist, durchläuft das Programm die Schleife K-O, die den Gradientenmodus auslöst. Im Gradientenmodus wird im Schritt 1550 der Autosampler 315 in eine Position versetzt, die dem Wert Lk entspricht, der im Schritt 1514 bestimmt wird. Danach wird das Dosierventil 327 eingeschaltet, um im Gradientenmodus zu arbeiten (Schritt 1552). Im Schritt 1554 wird die Dosisreaktionskurve für das vom Standardagonisten stimulierte Signal registriert. Der Schritt 1556 berechnet einen Potenzparameter, der als eine spezifische Konzentration des Agonisten bestimmt werden könnte, der eine spezifischen Stärke eines Signals bewirkt. Die Daten werden im Schritt 1558 gespeichert.
Nachdem die Daten gespeichert sind, wird das Dosierventil 327 ausgeschaltet (Schritt 1560), der Autosampler 315 wird in eine "Null"-Position gebracht (Schritt 1562), das Dosierventil 327 wird eingeschaltet (Schritt 1564), und nach einer Waschverzögerungsperiode, die im Schritt 1566 bestimmt wird, wird das Ventil 327 wieder ausgeschaltet (Schritt 1568). Nachdem der Schritt 1568 durchgeführt worden ist, kehrt der Ablauf über die Verbindungslinie O wieder zurück zum Inkrementzähler L (Schritt 1514);
Wenn im Schritt 1544 das Signal SLk nicht größer ist als BSi, dann markiert der Schritt 1542 den Standardagonisten "negativ", was bedeutet, daß die bestimmten Zellen keinen bestimmten exprimierten Rezeptor haben, und der Programmablauf kehrt über die Verbindungslinie M zurück zum Schritt 1514.
Wenn im Schritt 1516 (Fig. 15b) Lk größer ist als Lmax, was anzeigt, daß alle Agonisten geprüft worden sind, geht der Ablauf über die Verbindungslinie N zum Schritt 1570, wo ein Computer 123 einen Zellenzähler C inkrementiert. Der numerische Wert des Zählers wird verglichen (Schritt 1572) mit einer maximalen Anzahl der im Schritt 1503 eingegebenen Zellen. Wenn der Zählerwert Ci nicht größer ist als Cmax, dann wird die Steuereinrichtung L im Schritt 1574 auf null gesetzt, das Mehrkanal-Umsteuerventil 347 wird auf die nächste Position umgeschaltet, wobei ein neues Zellreservoir mit dem Ausgang 346 verbunden wird, und der Ablauf kehrt über die Verbindungslinie P zurück zum Schritt 1509 (Fig. 15a). Wenn im Schritt 1572 der Wert Ci größer ist als Cmax, dann geht der Ablauf über zum Schritt 1578, wo der Autosampler 315 in seine "Null"-Position gebracht wird, und das Dosierventil 327 wird eingeschaltet (Schritt 1580). Nach einer Waschverzögerung, die im Schritt 1582 bestimmt wird, wird das Ventil 327 ausgeschaltet (Schritt 1584), und die Pumpe 357 wird ausgeschaltet (Schritt 1586), und das gesamte Programm wird im Schritt 1588 beendet.
Ein kontinuierliches Flußdiagramm des gegenwärtig bevorzugten Orphan-Rezeptornachweismodus mit dem Negativdruckfluidsystem in Fig. 3 ist in Fig. 16a bis 16g gezeigt. Um diesen Modus zu praktizieren, wird das Umsteuerventil 347 durch ein Mehrkanal-Umsteuerventil 347 ersetzt, wodurch mindestens zwei Reservoire 349, die Wirtszellen, natürliche oder transfizierte mit einem leeren Vektor, und Zellen, die mit dem in Betracht kommenden Orphan-Rezeptor transfiziert sind, enthalten, um mit dem gemeinsamen Auslaß 346 getrennt verbunden werden zu können.
Das Programm beginnt mit einem Startzustand 1600 und tritt in den Zustand 1602 ein, wo es alle Parameter auf ihre Anfangswerte setzt. Diese Anfangsparameter sind u. a. die interne Initialisierung der Softwarevariablen und der Subroutinen, ohne darauf beschränkt zu sein. Dann fordert das Programm einen Bediener auf, die maximale Anzahl der zu prüfenden Agonisten einzugeben (Schritt 1603).
Wenn die Anfangsparameter gesetzt sind, bringen die Autosampler 301 und 315 (Fig. 3) ihre Ansaugdüsen 307 und 323 in die entsprechenden "Null"-Positionen, die von einem Waschpufferlösungsreservoir 305 belegt sind (Schritt 1604). Die Dosierventile 311 und 327, die Umsteuerventile 333, 335 und 347, die Füllventile 313, 329, 341 und 345 werden ausgeschaltet (Schritt 1606). In diesem ausgeschalteten Zustand sind die Füllventile 313, 329, 341 und 345 normalerweise geöffnet, die Auslässe 312 und 328 der Dosierventile 311 und 327 sind jeweils mit entsprechenden "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnungen 309 und 325 verbunden, der Auslaß 334 des Umsteuerventils 335 ist mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 336 verbunden, der gemeinsame Auslaß 342 des Umsteuerventlis 333 ist mit der "normalerweise geöffneten" Einlaßöffnung 332 verbunden.
Nachdem das System initialisiert worden ist, wird das Umsteuerventil 347 so eingestellt, daß sein gemeinsamer Auslaß 346 mit dem Reservoir verbunden ist, das die Wirtszellen enthält, Position 1 (Schritt 1608). Die Pumpe 357 wird gestartet, um Flüssigkeit zu pumpen (Schritt 1610). Dadurch wird die Waschpufferlösung aus den auf "Null" positionierten Reservoiren beider Autosampler 301 und 315 jeweils durch die Düsen 309 und 325 und die Auslaßöffnungen 312 und 328 der Dosierventile 311 und 327, die Füllventile 313 und 329, die Mischzone 331, die Einlaßöffnung 332 und die Auslaßöffnung 342 des Umsteuer¬ ventils 333, das Füllventil 341, die Mischzone 343, die reaktionsfördernde Leitung 353, den Detektor 355, die Pumpe 357 und in einen Abflußbehälter 359 befördert. In der Mischzone 343 wird dieser Strom mit der Wirtszellensuspension vermischt, die aus der Einlaßröhre 348 und einer Auslaßöffnung 346 des Mehrkanal-Umsteuerventils 347 durch das Füllventil 345 kommt. Somit ist der Gesamtstrom, der durch die Mischzone 343 strömt, die Summe von drei Strömen, nämlich einem ersten Strom, der aus dem Dosierventil 311 kommt, einem zweiten Strom, der aus dem Dosierventil 327 kommt, und einem dritten Strom, der aus dem Mehrkanal-Umsteuerventil 347 kommt. Während dieses Schritts liefern beide Dosierventile Waschpufferlösung 305 aus den Reservoiren, die sich in der "Null"-Position jedes Autosamplers befinden, so daß die endgültige Mischung aus einem Teil Wirtszellensuspension und zwei Teilen Waschpufferlösung besteht.
Nach einer im Schritt 1612 bestimmten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Strom der Mischung aus Zellsuspension und Waschpufferlösung stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 ein Basissignal, das von den Wirtszellen erzeugt wird (Schritt 1614). Nachdem das Basissignal registriert ist, wird es als Referenzsignal (BS)HC gespeichert (Schritt 1616). Im Schritt 1620 wird das Mehrkanal-Umsteuerventil 347 auf die Position 2 umgeschaltet, um den Auslaß 346 mit der Suspension der transfizierten Zellen zu versorgen. Nach einer im Schritt 1622 bestimmten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Strom der Mischung aus neuer Zellsuspension und Waschpufferlösung stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 ein zweites Basissignal, das von den transfizierten Zellen erzeugt wird (Schritt 1624). Nachdem das Basissignal registriert ist, wird es als Referenzsignal (BS)TC gespeichert (Schritt 1626), und die Pumpe wird ausgeschaltet (Schritt 1628). Der Computer 123 (Fig. 1) löst den Inkrementzähler L aus (Schritt 1630).
Der numerische Inhalt des Inkrementzählers L wird immer dann um eins erhöht, wenn er ausgelöst wird, wobei die Position der Düse der Einlaßöffnung 323 des Autosamplers 315 bestimmt wird, der die Gruppen von zu prüfenden Agonisten 319 wählt. Als nächstes wird der numerische Inhalt Lk des Inkrementzählers L mit der maximalen Anzahl von zu prüfenden Standardagonisten Lmax verglichen (Schritt 1632).
Wenn Lk nicht größer ist als Lmax, positioniert der Autosampler 315 die Düse 323 im Agonistenreservoir, das sich im Gestell 319 in der Position befindet, die vom numerischen Wert Lk bestimmt wird (Schritt 1634). Die Pumpe 357 wird im Schritt 1636 eingeschaltet, und das Dosierventil 327 wird eingeschaltet, um seine "normalerweise geschlossene" Einlaßöffnung 323 zur gemeinsamen Auslaßöffnung 328 zu öffnen (Schritt 1638), so daß der bestimmte Agonist durch das Füllventil 329, die Misch¬ zone 331, die Einlaßöffnung 332 und die Auslaßöffnung 342 des Umsteuerventils 333, das Füllventil 341, die Mischzone 343 strömt, wo er mit der Suspension von transfizierten Zellen vermischt wird, die aus der Auslaßöffnung 346 des Mehrkanal- Umsteuerventils 347 und des Füllventils 345 kommt. Nach dem Vermischen mit den transfizierten Zellen in der Mischzone 343 geht der Flüssigkeitsstrom durch die reaktionsfördernden Leitungen 353 in den Detektor 355 und weiter in das Abflußreservoir 359. Nach einer im Schritt 1640 bestimmten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Mischprozeß stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 ein vom Agonisten induziertes Signal (SLk)TC, das von dem bestimmten, mit dem Orphan- Rezeptor transfizierten Zellen bei Vorhandensein des gegebenen Agonisten Lk erzeugt wird (Schritt 1642). Nachdem das Signal registriert ist, wird sein Wert (SLk)TC im Schritt 1643 gespeichert, und die Vorrichtung geht über zum Schritt 1644, wo das Dosierventil 327 ausgeschaltet wird, wobei die normalerweise geöffnete Einlaßöffnung 325 mit Pufferlösung 305 zur Auslaßöffnung 328 geöffnet wird. Im Schritt 1646 bringt der Autosampler 315 seine Düse 323 in "Null"-Position, die von dem Reservoir belegt ist, das mit Waschpufferlösung gefüllt ist. Das Dosierventil 327 wird wieder eingeschaltet (Schritt 1648), wobei der Einlaß 323 mit dem Auslaß 328 verbunden wird. Eine im Schritt 1650 bestimmte Verzögerung ermöglicht es, daß der Stromweg, der aus der Einlaßöffnung 323 und der Auslaßöffnung 328 des Dosierventils 327, dem Füllventil 329, der Mischzone 331, der Einlaßöffnung 332 und der Auslaßöffnung 342 des Umsteuerventils 333, dem Füllventil 341, der Mischzone 343, den reaktionsfördernden Leitungen 353 und dem Detektor 355 besteht, von den Resten des Agonisten gereinigt werden kann. Nach der Verzögerung (Schritt 1650) wird das Dosierventil 327 ausgeschaltet im Schritt 1652, und die Pumpe 357 wird im Schritt 1654 ausgeschaltet, wobei das System in seinen ursprünglichen Zustand versetzt wird.
Als nächstes wird der Wert des registrierten Signals für transfizierte Zellen (SLk)TC mit dem Wert des entsprechenden Referenzbasissignals (BS)TC verglichen (Schritt 1658). Wenn das durch den Agonisten induzierte Signal (SLk)TC nicht größer ist als der Basiswert (BS)TC, "markiert" der Computer 123 (Fig. 1) den entsprechenden Agonisten Lk "negativ" (Schritt 1660), was bedeutet, daß die Zelle keinen Rezeptor enthält, der durch dem bestimmten Agonisten stimuliert werden kann, und der Ablauf führt über die Linie M zurück zum Inkrementzähler L (Schritt 1630). Wenn das Signal (SLk)TC größer ist als das Signal (BS)TC, "markiert" der Computer 123 den entsprechenden Agonisten "positivTC" (Schritt 1656), was bedeutet, daß die transfizierten Zellen einen Rezeptor exprimieren, der durch den bestimmten Agonisten stimuliert werden kann.
Die nächste Aufgabe ist es, zu bestimmen, ob die Wirtszellen auch diesen Rezeptor exprimieren, um sie vom Orphan- Rezeptor zu unterscheiden, der nur in transfizierten Zellen exprimiert werden sollte. Um dies durchzuführen, tritt der Programmfluß, nachdem der Standardagonisten Lk im Schutt 1656 positiv markiert worden ist, in die Schleife K-O ein, wo im Schritt 1662 der Autosampler 315 seine Düse 323 in die Position bringt, die dem Wert entspricht, der im Zähler L ermittelt wird, nämlich Lk. Im Schritt 1664 wird das Umsteuerventil 347 in die Stellung 1 umgeschaltet, wodurch das Wirtszellensuspensionsreservoir 349 über den gemeinsamen Ausgang 346 durch die Einlaßöffnung 348 des Mehrkanal-Umsteuerventils 347 und durch das Füllventil 345 mit der Mischzone 343 verbunden wird. Die Schritte 1666 und 1668 schalten das Ventil 327 bzw. die Pumpe 357 ein, wobei die Pufferlösung 305, die vom Einlaß 309 des Autosamplers 301 kommt, und der Standardagonist Lk, der vom Einlaß 323 und der Auslaßöffnung 328 des Dosierventils 327 kommt, in der Mischzone 331 zusammengebracht werden, wobei diese Lösung anschließend mit den Wirtszellen in der Mischzone 343 vermischt wird. Nach einer im Schritt 1670 bestimmten Verzögerung, die notwendig ist, damit sich der Strom der Mischung aus den Zellen und dem Agonisten stabilisieren kann, registriert der Detektor 355 das vom Agonisten induzierte Signal in den Wirtszellen (SLk)TC (Schritt 1672).
Nachdem das Signal registriert worden ist, wird es (Schritt 1674) mit dem entsprechenden Basissignal (BS)HC verglichen, das im Schritt 1614 gemessen wird. In Abhängigkeit von den Ergebnissen des Vergleichs wird der Agonist Lk entweder "positivTC/positivHC" (Schritt 1678) oder "positivTC/negativHC" markiert (Schritt 1678). In beiden Fällen werden die Daten im Schritt 1680 zur weiteren Bewertung durch den Forscher gespeichert.
Nachdem die Daten gespeichert sind, wird das Mehrkanal- Umsteuerventil 347 im Schritt 1682 in die Stellung 2 umgeschaltet, das Dosierventil 327 wird ausgeschaltet (Schritt 1684), der Autosampler 315 wird in die "Null"-Position gebracht (Schritt 1686), das Dosierventil 327 wird eingeschaltet (Schritt 1688) und nach einer im Schritt 1690 bestimmten Waschverzögerung wieder ausgeschaltet (Schritt 1692), und die Pumpe 357 wird ausgeschaltet (Schritt 1694). Nachdem der Schritt 1694 durchgeführt worden ist, geht der Ablauf über die Verbindungslinie O zurück zum Inkrementzähler L (Schritt 1630).
Wenn im Schritt 1632 (Fig. 16c) Lk größer ist als Lmax, dann geht der Ablauf weiter mit dem Schritt 1700 (Fig. 16 g), wo der Zähler L auf null gesetzt wird. Als nächstes wird der Autosampler 315 im Schritt 1702 in die Null-Position gebracht, das Dosierventil 327 wird im Schritt 1704 eingeschaltet, und nach einer im Schritt 1706 bestimmten Waschverzögerung werden das Dosierventil 327 und die Pumpe 357 in den Schritten 1708 bzw. 1710 ausgeschaltet, woraufhin das Programm im Schritt 1712 endet.
Obwohl die Erfindung ausführlich mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben worden ist, versteht es sich, daß Variationen und Modifikationen, die dem Fachmann verständlich sind, dennoch im Erfindungsgedanken und im Schutzbereich der Erfindung liegen. Weitere Ausführungsformen, die hier nicht im einzelnen beschrieben sind, können ebenfalls im Erfindungsgedanken und im Schutzbereich der Erfindung liegen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt ist.

Claims

1. Automatisiertes Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit biologischer Aktivität, mit den Schritten:

(a) Vereinigen, in einer Mischkammer, einer homogenen Suspension lebender Zellen mit einer Prüfsubstanz mit einer unbekannten Zellwirkung, um eine Prüfmischung zu bilden;

(b) Bewirken, daß die Prüfmischung durch eine Leitungsführung von der Mischkammer zu einer Nachweiszone strömt;

(c) Leiten der Prüfmischung entlang eines kontinuierlichen Stromwegs durch die Nachweiszone; und

(d) Messen einer Zellreaktion der lebenden Zellen auf die Prüfsubstanz, während die Prüfmischung kontinuierlich durch die Nachweiszone strömt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit den Schritten:

(e) Vereinigen einer homogenen Suspension der Zellen mit einer Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Zellreaktion der Zellen, um eine Standardmischung zu bilden;

(f) Leiten der Standardmischung durch die Leitungsführung von der Mischkammer zur Nachweiszone;

(g) Leiten der Standardmischung durch die Nachweiszone; und

(h) Messen der Zellreaktion der Zellen auf die Standardsubstanz.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Standardsubstanz und die Prüfsubstanz in den Vereinigungsschritten mit den Zellen gleichzeitig vermischt werden und der Meßschritt die bekannte Wirkung oder eine Änderung der bekannten Wirkung nachweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Schritte (a) und (e) gleichzeitig durchgeführt werden; die Schritte (c) und (g) gleichzeitig durchgeführt werden; und die Schritte (d) und (h) gleichzeitig durchgeführt werden unter Verwendung einer einzigen Suspension der Zellen.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Schritte (a), (b) , und (c) und (d) zuerst durchgeführt werden und dann die Schritte (e), (f), (g) und (h) durchgeführt werden, wobei die Prüfsubstanz zusammen mit der Standardsubstanz im Schritt (e) hinzugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellreaktion im Schritt (d) nachgewiesen wird, was anzeigt, daß die Prüfsubstanz die Reaktion bewirkt, und wobei die Standardsubstanz ein Antagonist ist, wodurch eine Abnahme der Zellreaktion vom Schritt (d) bis zum Schritt (h) anzeigt, daß die Prüfsubstanz ein Agonist der bekannten Wirkung ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellreaktion im Schritt (d) nicht nachgewiesen wird, was anzeigt, daß die Prüfsubstanz die Reaktion nicht bewirkt, und wobei die Stan¬ dardsubstanz ein Agonist ist, wodurch eine Änderung der bekannten Wirkung, die im Schritt (h) nachgewiesen wird, anzeigt, daß die Prüfsubstanz ein Antagonist der bekannten Wirkung ist.

8. Verfahren nach Anspruch 5, das unter der Steuerung eines programmierbaren Computers mit mehreren Prüfsubstanzen und mehreren Standardsubstanzen automatisch durchgeführt wird;

wobei eine aufeinanderfolgende Serie von Antagonisten als die Standardsubstanz im Schritt (e) automatisch hinzugesetzt wird, wenn die Zellreaktion im Schritt (d) nachgewiesen wird, was anzeigt, daß die Prüfsubstanz die Zellreaktion hervorruft, wodurch eine Abnahme der im Schritt (h) nachgewiesenen Zellreaktion anzeigt, daß die Prüfsubstanz ein Agonist der bekannten Wirkung ist; und

wobei eine Serie von Agonisten als die Standardsubstanz im Schritt (e) automatisch hinzugesetzt wird, wenn die Zellreaktion im Schritt (d) nicht nachgewiesen wird, wodurch eine im Schritt (h) nachgewiesene Änderung der bekannten Wirkung anzeigt, daß die Prüfsubstanz ein Antagonist der bekannten Wirkung ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, ferner mit den Schritten:

wenn der Schritt (h) anzeigt, daß die Substanz ein Agonist der bekannten Wirkung ist, anschließendes automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Agonistenaktivität der Prüfsubstanz durch Wiederholung der Schritte (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) und (h), während die Konzentration der Prüfsubstanz und der Standardsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden; und

wenn der Schritt (h) anzeigt, daß die Substanz ein Antagonist ist, anschließendes automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Verhinderung der Zellreaktion bei Vorhandensein der agonistischen Standardsubstanz durch Wiederholung der Schritte (e), (f), (g) und (h), während die Konzentration der Prüfsubstanz und der Standardsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, ferner mit dem Schritt, wenn der Schritt (h) anzeigt, daß die Substanz ein Antagonist ist, nämlich:

(i) automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktionsaktivierung durch Wiederholung der Schritte (e), (f), (g) und (h) bei einer Null-Konzentration der Prüfsubstanz, während die Konzentration der Standardsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden, und anschließendes Wiederholen dieses Schritts (i) bei verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanz.

11. Verfahren nach Anspruch 9, ferner mit dem Schritt, wenn der Schritt (h) anzeigt, daß die Substanz ein Agonist ist, nämlich:

(j) automatisches Bestimmen der Konzentrationsabhängigkeit der Zellreaktionsaktivierung durch Wiederholung der Schritte (e), (f), (g) und (h) bei einer Null-Konzentration der Standardsubstanz, während die Konzentration der Prüfsubstanz geändert wird und die resultierenden Veränderungen der Zellreaktion aufgezeichnet werden, und anschließendes Wiederholen dieses Schritts (j) bei verschiedenen Konzentrationen der Substanz.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Änderung der Konzentration der Standardsubstanz und/oder der Prüfsubstanz kontinuierlich oder schrittweise erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 9, ferner mit dem Schritt: graphisches Anzeigen der aufgezeichneten Veränderungen der Zellreaktion.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellreaktion eine Veränderung der intrazellulären Ionenkonzentration ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Ion ein Calcium-, Magnesium-, Proton-, Natrium- oder Kaliumion ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Ion unter Verwendung eines intrazellulären Farbstoffs nachgewiesen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Farbstoff fluoreszierend ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit dem Schritt: Wiederholen der Schritte (a) bis (d) mit jedem der Zelltypen in einer Serie von zu prüfenden Zelltypen, bis die Wirkung der Prüfsubstanz in jedem Zelltyp der Serie von Zelltypen gemessen worden ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, ferner mit den Schritten:

Vereinigen einer homogenen Suspension jedes der Zelltypen in der Serie von Zelltypen mit einer Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Zellreaktion der Zellen, um eine Serie von Standardmischungen zu bilden;

Leiten der Serie von Standardmischungen durch die Leitungsführung von der Mischkammer zur Nachweiszone;

Leiten der Serie von Standardmischungen durch die Nachweiszone; und

Messen der Zellreaktion jedes der Zelltypen auf die Standardsubstanz.

20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Standardsubstanz und die Prüfsubstanz mit den Zellen in den Vereinigungsschritten gleichzeitig vermischt werden und der Meßschritt die bekannte Wirkung oder eine Änderung der bekannten Wirkung nachweist.

21. Verfahren nach Anspruch 3 oder 20, wobei die Standardsubstanz ein Antagonist oder ein Agonist der Zellreaktion ist.

22. Vorrichtung zur automatischen Messung der Wirkung mehrerer Prüfsubstanzen auf lebende Zellen, mit:

einem Prüfsubstanzsampler zum sequentiellen Bereitstellen von Proben mehrerer Prüfsubstanzen;

einer Zellsuspensionszuführung zur Bereitstellung einer Suspension lebender Zellen;

einer Mischzone, die mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Aufnehmen der Proben der Prüfsubstanzen aus dem Prüfsubstanzsampler, zum Aufnehmen der Suspension lebender Zellen aus der Zellsuspensionszuführung und Mischen jeder Prüfsubstanz mit der Suspension lebender Zellen, um eine entsprechende Prüflösung für jede Prüfsubstanz bereitzustellen;

einem Detektor, der mit der Mischzone gekoppelt ist, zum Aufnehmen jeder entsprechenden Prüflösung und zum Messen der Zellreaktion der suspendierten Zellen bei jeder Prüflösung; und

einer Leitungsführung, die einen Stromkanal zwischen der Mischkammer und dem Detektor herstellt, so daß jede Prüflösung kontinuierlich von der Mischkammer zum Detektor strömt.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, ferner mit einem Standardsubstanzsampler, der mit der Mischzone gekoppelt ist, zum Bereitstellen einer Probe einer Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Zellreaktion der suspendierten Zellen, wobei die Mischzone die Probe der Standardsubstanz aus dem Standardsubstanzsampler aufnimmt und die Standardsubstanz mit den suspendierten Zellen vermischt und der Detektor die Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Standardsubstanz mißt.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, ferner mit:

einem ersten Gradientengerät, das mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum automatischen Regulieren des Konzentrationsgrades der Prüfsubstanz, die von dem Prüfsubstanzsampler zu der Mischzone übertragen wird; und

einem zweiten Gradientengerät, das mit dem Standardsubstanzsampler gekoppelt ist, zum automatischen Regulieren des Konzentrationsgrades der Standardsubstanz, die von dem Standardsubstanzsampler zu der Mischzone übertragen wird.

25. Vorrichtung nach Anspruch 24, ferner mit einem Umschaltventil, das an einem Eingang des Umschaltventils mit dem ersten und zweiten Gradientengerät gekoppelt ist und an einem Ausgang des Umschaltventils mit der Mischzone gekoppelt ist, zum selektiven Umschalten des Stroms einer Konzentration der Prüfsubstanz oder einer Konzentration der Standardsubstanz oder beider zu der Mischzone, wobei die Prüfsubstanz und/oder die Standardsubstanz dann mit der Suspension von Zellen vermischt wird.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, ferner mit einer Kalibriereinheit, die mit dem Umschaltventil gekoppelt ist, wobei das Umschaltventil auch den Strom einer Kalibrierlösung, die von der Kalibriereinheit bereitgestellt wird, in die Mischzone selektiv umschaltet, wo die Kalibrierlösung mit der Suspension von Zellen vermischt wird.

27. Vorrichtung nach Anspruch 26, wobei die Leitungsführung reaktionsfördernde Leitungen aufweist, die mit dem Ausgang der Mischzone gekoppelt sind, zum Aufnehmen einer Mischung der Zellsuspension, die entweder mit der Prüfsubstanz, der Standardsubstanz oder der Kalibrierlösung vermischt ist, und Bereitstellen eines Stromwegs für die Mischung, so daß so viel Zeit vorhanden ist, daß die Suspensionszellen mit der Prüfsubstanz, der Standardsubstanz oder der Kalibrierlösung reagieren können, wobei die reaktionsfördernden Leitungen ferner mit dem Eingang des Detektors gekoppelt sind, der die Mischung aus den reaktionsfördernden Leitungen aufnimmt.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, ferner mit:

einer Steuereinrichtung, die mit dem ersten und zweiten Gradientengerät, dem Prüfsubstanzsampler, dem Standardsubstanzsampler und dem Umschaltventil gekoppelt ist, zum Steuern ihres Betriebs; und

einem Computer, der mit der Steuereinrichtung gekoppelt ist, zum Senden von Befehlssignalen an die Steuereinrichtung entsprechend einem Softwareprogramm, das vom Computer implementiert wird, wobei der Computer auch mit dem Detektor gekoppelt ist, um Zellenreaktionsmeßsignale zum und vom Detektor zu senden und zu empfangen.

29. Vorrichtung nach Anspruch 22, wobei der Prüfsubstanzsampler ein automatisierter Robotersampler ist, der eine vorgegebene Prüfsubstanz aus einer Bibliothek von Prüfsubstanzen auswählen kann.

30. Vorrichtung nach Anspruch 29, ferner mit:

einer Steuereinrichtung, die mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Steuern des Betriebs des Prüfsubstanzsamplers; und

einem Computer, der mit der Steuereinrichtung gekoppelt ist, zum Senden von Befehlssignalen an die Steuereinrichtung entsprechend einem Softwareprogramm, das vom Computer implementiert wird, wodurch die Auswahl und der Abruf der Prüfsubstanzen durch den Prüfsubstanzsampler aus der Prüfsubstanzbibliothek gesteuert wird.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, ferner mit einer Gradientenpumpe mit einem Eingang und einem Ausgang, die mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Regulieren des Konzentrationsgrades der Prüfsubstanz, die von dem Prüfsubstanzsampler zu der Mischzone übertragen wird, wobei:

der Prüfsubstanzsampler aufweist:

eine erste Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Prüfsubstanz;

eine zweite Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung; und

wobei die Gradientenpumpe mit der ersten und zweiten Ansaugdüse gekoppelt ist und vorgegebene Konzentrationen der Prüfsubstanz aufnimmt, indem die Mengen der Prüfsubstanz und der Pufferlösung, die von der ersten bzw. zweiten Ansaugdüse aufgenommen werden, reguliert werden, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Prüfsubstanz ist.

32. Vorrichtung nach Anspruch 31, ferner mit einem Standardsubstanzsampler zum Liefern einer Probe einer Standardsubstanz an die Mischzone.

33. Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei der Standardsubstanzsampler ein automatisierter Robotersampler ist, der eine vorgegebene Standardsubstanz aus einer Bibliothek von Standardsubstanzen auswählen kann.

34. Vorrichtung nach Anspruch 33, ferner mit einer zweiten Gradientenpumpe mit einem Eingang und einem Ausgang, die mit dem Standardsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Regulieren des Konzentrationsgrades der Standardsubstanz, die von dem Standardsubstanzsampler an die Mischzone geliefert wird, wobei:

der Standardsubstanzsampler aufweist:

eine dritte Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Standardsubstanz;

eine vierte Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung; und

wobei die zweite Gradientenpumpe mit der dritten und vierten Ansaugdüse gekoppelt ist und vorgegebene Konzentrationen der Standardsubstanz aufnimmt, indem die Mengen der Standardsubstanz und der Pufferlösung, die von der dritten bzw. vierten Ansaugdüse aufgenommen werden, reguliert werden, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Standardsubstanz ist.

35. Vorrichtung nach Anspruch 34, ferner mit einer zweiten Mischzone, die mit den Ausgängen der ersten und zweiten Gradientenpumpe gekoppelt ist, zum Aufnehmen und Mischen der vorgegebenen Konzentrationen der vorgegebenen Prüfsubstanz und der vorgegebenen Standardsubstanz, so daß die Ausgabe der zweiten Mischzone an die erste Mischzone geliefert wird.

36. Vorrichtung nach Anspruch 35, ferner mit:

einer Kalibriereinheit zum Bereitstellen einer Kalibrierlösung; und

einem Umschaltventil, dessen erster Eingang mit der zweiten Mischzone gekoppelt ist, dessen zweiter Eingang mit der Kalibriereinheit gekoppelt ist und dessen Ausgang mit der ersten Mischzone gekoppelt ist, zum Umschalten zwischen dem Strom entweder einer Substanzmischung aus der zweiten Mischzone oder der Kalibrierlösung aus der Kalibriereinheit und zum anschließenden Liefern des Stroms an die erste Mischzone, wobei er mit der Zellsuspension vermischt wird.

37. Vorrichtung nach Anspruch 36, wobei die Kalibriereinheit aufweist:

eine Kalibriermaximumlösung, die für eine maximale Zellreaktion sorgt, wenn sie mit der Zellsuspension vermischt wird;

eine Kalibrierminimumlösung, die für eine minimale Zellreaktion sorgt, wenn sie mit der Zellsuspension vermischt wird;

ein Umsteuerventil, dessen erster Eingang mit der Kalibriermaximumlösung gekoppelt ist und dessen zweiter Eingang mit der Kalibrierminimumlösung gekoppelt ist, zum Umschalten zwischen dem Strom entweder der Kalibriermaximumlösung oder der Kalibrierminimumlösung; und

eine Pumpe, die mit dem Ausgang des Umsteuerventils und einem Eingang des Umschaltventils gekoppelt ist, zum Pumpen entweder der Kalibriermaximumlösung oder der Kalibrierminimumlösung vom Umsteuerventil in das Umschaltventil.

38. Vorrichtung nach Anspruch 37, ferner mit einer zweiten Pumpe, die mit einem Eingang der ersten Mischzone gekoppelt ist, zum Pumpen der Suspension von Zellen von dem Zellensuspensionseingang in die erste Mischzone.

39. Vorrichtung nach Anspruch 38, wobei die Leitungsführung eine reaktionsfördernde Leitung aufweist, deren Eingang mit einem Ausgang der ersten Mischzone gekoppelt ist und deren Ausgang mit einem Eingang des Detektors gekoppelt ist, zum Bereitstellen eines Stromwegs und einer Reaktionszeitverzögerung für eine Mischung, die von der ersten Mischzone kommend aufgenommen wird, und zum Liefern der Mischung an den Detektor.

40. Vorrichtung nach Anspruch 39, ferner mit:

einer Steuereinrichtung, die mit der ersten und zweiten Gradientenpumpe, dem Prüfsubstanzsampler, dem Standardsubstanzsampler und dem Umschaltventil, der ersten und zweiten Mischzone, der ersten und zweiten Pumpe und dem Umsteuerventil gekoppelt ist, zum Steuern ihres Betriebs, und

41. Vorrichtung nach Anspruch 29, ferner mit:

einer Pumpe, die mit dem Ausgang des Detektors gekoppelt ist, zum Liefern eines negativen Drucks an die Vorrichtung;

einem Dosierventil, das mit dem Prüfsubstanzsampler gekoppelt ist, zum Regulieren des Konzentrationsgrades der Prüfsubstanz, die von dem Prüfsubstanzsampler zu der Mischzone übertragen wird, wobei der Prüfsubstanzsampler ferner aufweist:

eine erste Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Prüfsubstanz;

eine zweite Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung; und

wobei das Dosierventil vorgegebene Konzentrationen der Prüfsubstanz aufnimmt, indem die Menge der Prüfsubstanz und der Pufferlösung, die von der ersten bzw. zweiten Ansaugdüse aufgenommen wird, reguliert wird, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Prüfsubstanz ist.

42. Vorrichtung nach Anspruch 41, ferner mit:

einem automatisierten Standardsubstanzsampler, der eine vorgegebene Standardsubstanz aus einer Bibliothek von Standardsubstanzen auswählen kann, wobei der Standardsubstanzsampler eine dritte Ansaugdüse zum Aufnehmen der vorgegebenen Standardsubstanz und eine vierte Ansaugdüse zum Aufnehmen einer Pufferlösung aufweist; und

einem zweiten Dosierventil, das mit der dritten und vierten Ansaugdüse gekoppelt ist, zum Aufnehmen vorgegebener Konzentrationen der Standardsubstanz, indem die Menge der Standardsubstanz und der Pufferlösung, die von der dritten bzw. vierten Ansaugdüse aufgenommen wird, reguliert wird, wobei die Pufferlösung ein Verdünnungsmittel der Standardsubstanz ist.

43. Vorrichtung nach Anspruch 42, ferner mit:

einem ersten Ansaugventil, das mit dem Ausgang des ersten Dosierventils gekoppelt ist, zum Aufnehmen der vorgegebenen Konzentration der Prüfsubstanz und zum Liefern der Prüfsubstanz an die Mischzone;

einem zweiten Ansaugventil, das mit dem Ausgang des zweiten Dosierventils gekoppelt ist, zum Aufnehmen der vorgegebenen Konzentration der. Standardsubstanz und Liefern der Standardsubstanz an die Mischzone.

44. Vorrichtung nach Anspruch 43, ferner mit:

einer Kalibriereinheit mit einer Kalibriermaximumlösung, die für eine maximale Zellreaktion sorgt, wenn sie mit der Zellsuspension vermischt wird, und mit einer Kalibrierminimumlösung, die für eine minimale Zellreaktion sorgt, wenn sie mit der Zellsuspension vermischt wird;

einem ersten Umsteuerventil, dessen erster Eingang mit der Kalibriermaximumlösung gekoppelt ist und dessen zweiter Eingang mit der Kalibrierminimumlösung gekoppelt ist, zum Umschalten zwischen dem Strom entweder der Kalibriermaximumlösung oder der Kalibrierminimumlösung;

einem zweiten Umsteuerventil, dessen erster Eingang mit dem Ausgang der Mischzone gekoppelt ist und dessen zweiter Eingang mit dem Ausgang des ersten Umsteuerventils gekoppelt ist, zum Umschalten zwischen dem Strom entweder der Kalibrierlösung vom ersten Umsteuerventil oder einer Mischung aus der Mischzone;

einem dritten Ansaugventil, das mit dem Ausgang des zweiten Umsteuerventils gekoppelt ist, zum Aufnehmen einer Mischung vom zweiten Umsteuerventil; und

einer zweiten Mischzone, die mit dem Ausgang des dritten Ansaugventils gekoppelt ist, zum Mischen einer Mischung, die vom dritten Ansaugventil bereitgestellt wird, mit der Zellsuspension, wobei der Zellsuspensionseingang und der Detektor mit der zweiten Mischzone anstelle der ersten Mischzone gekoppelt sind.

45. Vorrichtung nach Anspruch 44, wobei die Leitungs¬ führung eine reaktionsfördernde Leitung aufweist, deren Eingang mit dem Ausgang der zweiten Mischzone gekoppelt ist und deren Ausgang mit einem Eingang des Detektors gekoppelt ist, zum Bereitstellen eines Stromwegs und einer Reaktionszeitverzögerung für eine Mischung, die von der zweiten Mischzone kommend aufgenommen wird, bevor die Mischung den Detektor erreicht.

46. Vorrichtung nach Anspruch 45, wobei der Zellsuspensionseingang aufweist:

ein Zellsuspensionsreservoir;

ein Pufferreservoir;

ein drittes Umsteuerventil, dessen erster Eingang mit dem Zellsuspensionsreservoir gekoppelt ist und dessen zweiter Eingang mit dem Pufferreservoir gekoppelt ist, zum Regulieren der Konzentration der Zellsuspension, wobei der Puffer ein Verdünnungsmittel der Zellsuspension ist; und

ein viertes Ansaugventil, das mit dem Ausgang des dritten Umsteuerventils gekoppelt ist, zum Aufnehmen der Zellsuspensionsmischung vom dritten Umsteuerventil und zum Liefern dieser Mischung an die zweite Mischzone.

47. Vorrichtung nach Anspruch 27, 40 oder 46, wobei der Detektor Veränderungen der intrazellulären Ionenkonzentration nachweist.

48. Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei das Ion ein Calcium-, Magnesium-, Proton-, Natrium- oder Kaliumion ist.

49. Vorrichtung nach Anspruch 47, wobei der Detektor Veränderungen der intrazellulären Ionenkonzentration unter Verwendung eines intrazellulären Farbstoffs nachweist.

50. Vorrichtung nach Anspruch 49, wobei der Farbstoff fluoreszierend ist.

51. Vorrichtung nach Anspruch 46, ferner mit mehreren Zellsuspensionsreservoiren.

52. Automatisiertes Verfahren zur Kennzeichnung der Rezeptoren, die in einer Zelle vorhanden sind, mit den Schritten:

(a) Vereinigen, in einer Mischkammer, einer Suspension von Zellen mit einem Prüfmittel, von dem bekannt ist, daß es die Aktivität eines bestimmten Rezeptors beeinflußt, um eine Prüfmischung zu bilden;

(c) Leiten der Prüfmischung entlang eines kontinuierlichen Stromwegs durch die Nachweiszone;

(d) Messen einer Zellreaktion der Zellen auf das Prüfmittel, während die Prüfmischung kontinuierlich durch die Nachweiszone strömt, wobei eine Reaktion auf das Prüfmittel anzeigt, daß die Zelle einen Rezeptor exprimiert, von dem bekannt ist, daß er auf das Prüfmittel reagiert; und

(e) Wiederholen der Schritte (a) bis (d) mit einer Serie von Prüfmitteln, bis die Wirkungen jedes Prüfmittels gemessen worden sind.

53. Verfahren nach Anspruch 52, ferner mit dem Schritt: Wiederholung der Schritte (a) bis (e) mit einer Serie verschiedener Zelltypen, um die Rezeptoren zu bestimmen, die durch jeden Zelltyp exprimiert werden.

54. Automatisiertes Verfahren zur Bestätigung, daß eine Prüfsubstanz eine Wirkung auf die Aktivität eines Rezeptors hat, mit den Schritten:

Vereinigen, in einer Mischkammer, eines negativen Kontrollzelltyps, dem der Rezeptor fehlt, mit der Prüfsubstanz, um eine negative Kontrollmischung zu bilden;

Bewirken, daß die negative Kontrollmischung durch eine Leitungsführung von der Mischkammer zu einer Nachweiszone strömt;

Leiten der negativen Kontrollmischung durch die Nachweiszone;

Messen der Zellreaktion der negativen Kontrollmischung auf die Prüfsubstanz, während die negative Kontrollmischung durch die Nachweiszone strömt;

Vereinigen, in der Mischkammer, von Zellen des gleichen Zelltyps wie die negative Kontrollzelle, die konstruiert oder stimuliert worden sind, um den Rezeptor zu exprimieren, mit der Prüfsubstanz, um eine Prüfmischung zu bilden;

Bewirken, daß die Prüfmischung durch die Leitungsführung von der Mischkammer zu der Nachweiszone strömt;

Leiten der Prüfmischung entlang eines kontinuierlichen Stromwegs durch die Nachweiszone;

Messen der Zellreaktion der Zellen in der Prüfmischung auf die Prüfsubstanz, während die Prüfmischung kontinuierlich durch die Nachweiszone strömt; und

Vergleichen der gemessenen Reaktion der Zellen in der Prüfmischung relativ zu der gemessenen Reaktion der negativen Kontrollzellen, wobei eine Differenz anzeigt, daß die Prüfsubstanz eine Wirkung auf die Aktivität des Rezeptors hat.

55. Verfahren nach Anspruch 52 oder 54, wobei das Prüfmittel einen Agonisten, einen Antagonisten oder eine Mischung aus einem Agonisten und einem Antagonisten aufweist.

56. Automatisiertes Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines oder mehrerer Rezeptoren in einer Serie von Zelltypen, mit den Schritten:

(a) Vereinigen, in einer Mischkammer, einer Suspension lebender Zellen, die einen Bestandteil der Serie von Zelltypen umfasst, mit einem Prüfmittel, von dem bekannt ist, daß es die Aktivität eines bestimmten Rezeptors beeinflußt, um eine Prüfmischung zu bilden;

(d) Messen der Zellreaktion der Suspension lebender Zellen auf das Prüfmittel, während die Prüfmischung kontinuierlich durch die Nachweiszone strömt; und

(e) Wiederholen der Schritte (a) bis (d) mit jedem Bestandteil der Serie von Zelltypen, bis die Wirkung des Prüfmittels in jedem Zelltyp der Serie gemessen worden ist.

57. Verfahren nach Anspruch 56, wobei das Prüfmittel einen bekannten Rezeptoragonist, -antagonist oder eine Mischung daraus aufweist.

58. Verfahren nach Anspruch 57, wobei das Prüfmittel eine Substanz aufweist, dessen Aktivität unbekannt ist oder das Prüfmittel eine Mischung aus einer Substanz, deren Aktivität unbekannt ist, und einer Substanz aufweist, die ein bekannter Agonist oder ein bekannter Antagonist ist.

59. Vorrichtung zum Messen der Wirkung einer Prüfsubstanz auf lebende Zellen, mit:

einem Prüfsubstanzreservoir;

einem Zellsuspensionsreservoir, das eine Suspension lebender Zellen bereitstellt;

einem ersten Kanal, der mit dem Prüfsubstanzreservoir gekoppelt ist und durch den die Prüfsubstanz strömen kann;

einem zweiten Kanal, der mit dem Zellsuspensionsreservoir gekoppelt ist und durch den die Suspension lebender Zellen strömen kann;

einer Mischzone, die mit dem ersten und zweiten Kanal gekoppelt ist, so daß die Prüfsubstanz und die Zellsuspension in die Mischzone strömen können, um eine gewünschte Mischung der Prüfsubstanz und der Zellsuspension in der Mischzone bereitzustellen;

einem Fluidstromweg, durch den die Mischung aus der Mischzone kontinuierlich strömen kann; und

einem Detektor, der mit dem Fluidstromweg gekoppelt ist und der eine Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Prüfsubstanz mißt, wobei die gewünschte Mischung der Prüfsubstanz und der Zellsuspension kontinuierlich entlang des Fluidstromwegs aus der Mischkammer zum Detektor strömt.

60. Vorrichtung nach Anspruch 59, ferner mit:

einem Verdünnungsreservoir zum Bereitstellen eines Verdünnungsmittels der Prüfsubstanz;

einem dritten Kanal, der mit dem Verdünnungsreservoir gekoppelt ist und durch den das Verdünnungsmittel strömen kann; und

wobei die Mischzone mit dem dritten Kanal gekoppelt ist, um das Verdünnungsmittel aufzunehmen, um eine gewünschte Konzentration der Prüfsubstanz bereitzustellen.

61. Vorrichtung nach Anspruch 60, ferner mit:

einem Standardsubstanzreservoir, das eine Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Suspension von Zellen bereitstellt; und

einem vierten Kanal, der mit dem Standardsubstanzreservoir gekoppelt ist und durch den die Standardsubstanz strömen kann, wobei die Mischkammer mit dem vierten Kanal gekoppelt ist, die Standardsubstanz von dem vierten Kanal aufnimmt und die Standardsubstanz mit der Suspension von Zellen vermischt; und

wobei der Detektor eine Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Standardsubstanz mißt.

62. Vorrichtung nach Anspruch 61, ferner mit einer Steuereinrichtung, die mit dem ersten, zweiten, dritten und vierten Kanal gekoppelt ist und die einen Strom der Prüfsubstanz, der Pufferlösung, der Zellsuspension und der Standardsubstanz durch den ersten, zweiten, dritten bzw. vierten Kanal automatisch steuert.

63. Vorrichtung nach Anspruch 59, ferner mit einer Steuereinrichtung, die mit dem ersten Kanal gekoppelt ist und die den Strom der Prüfsubstanz durch den ersten Kanal automatisch steuert.

64. Vorrichtung zum Messen der Wirkung einer Prüfsubstanz auf lebende Zellen, mit:

einem Prüfsubstanzreservoir;

einem ersten Gradientengerät, das mit dem Prüfsubstanzreservoir gekoppelt ist, zum automatischen Regulieren des Konzentrationsgrades einer Prüfsubstanz, die von dem Prüfsubstanzreservoir zu der Mischkammer übertragen wird;

einem Zellsuspensionsreservoir;

einer Mischkammer, die mit dem ersten Gradientengerät und dem Zellsuspensionsreservoir gekoppelt ist und die die Prüfsubstanz und eine Suspension lebender Zellen aus dem Zellsuspensionsreservoir aufnimmt und die Prüfsubstanz mit der Suspension lebender Zellen vermischt; und

einem Detektor, der mit der Mischkammer gekoppelt ist, zum kontinuierlichen Messen einer Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Prüfsubstanz.

65. Vorrichtung nach Anspruch 64, ferner mit einem Standardsubstanzreservoir, das eine Standardsubstanz mit einer bekannten Wirkung auf die Suspension von Zellen bereitstellt, wobei die Mischkammer mit dem Standardsubstanzreservoir gekoppelt ist, die Standardsubstanz aufnimmt und die Standardsubstanz mit der Suspension von Zellen vermischt und wobei der Detektor eine Zellreaktion der suspendierten Zellen auf die Standardsubstanz mißt.

66. Vorrichtung nach Anspruch 23, 61 oder 65, wobei die Mischkammer oder -zone die Prüfsubstanz und die Standardsubstanz mit den suspendierten Zellen gleichzeitig vermischt und der Detektor die bekannte Wirkung oder eine Änderung der bekannten Wirkung nachweist.

67. Vorrichtung nach Anspruch 65, ferner mit einem zweiten Gradientengerät, das mit dem Standardsubstanzreservoir gekoppelt ist, zum automatischen Regulieren des Konzentrationsgrades der Standardsubstanz, die aus der Suspension von Zellen zu der Mischkammer übertragen wird.

68. Vorrichtung nach Anspruch 67, ferner mit einer Steuereinrichtung, die mit dem ersten und zweiten Gradientengerät gekoppelt ist, zum automatischen Steuern eines Stroms der Prüfsubstanz und zum automatischen Steuern eines Stroms der Standardsubstanz in die Mischkammer.

69. Vorrichtung nach Anspruch 64, ferner mit einer Steuereinrichtung, die mit dem ersten Gradientengerät gekoppelt ist, zum automatischen Steuern eines Stroms der Prüfsubstanz in die Mischkammer.