DE4433261B4

DE4433261B4 - Neues Verfahren zur funktionellen Charakterisierung von Ionenkanälen sowie der funktionellen Identifizierung von Modulatoren solcher Membranproteine

Info

Publication number: DE4433261B4
Application number: DE19944433261
Authority: DE
Inventors: Georg C. Dr. Terstappen; Thomas Dr. Krahn
Original assignee: Georg C. Dr. Terstappen
Current assignee: TERSTAPPEN, GEORG C., DR., SONA, IT
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1994-09-19
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2014-09-20
Also published as: DE4433261A1

Abstract

Verfahren zur funktionellen Charakterisierung von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro-Zellsystem zur Durchführung eines Flux-Assays mit nicht-radioaktiven, einwertigen Kationen als Tracer für das entsprechende Kation des Zellsystems beladen wird und die Verteilung dieser Kationen zwischen intrazellulärem und extrazellulärem Raum mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur funktionellen Charakterisierung von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren sowie der funktionellen Identifizierung von Modulatoren solcher Membranproteine mittels Atomabsorptionsspektroskopie.

Es ist bekannt, daß sich einwertige Kationen, wie beispielsweise Rb⁺, in zellulären Systemen ähnlich verhalten wie K⁺. Insbesondere ist die Ionen-Leitfähigkeit für Rb⁺ in Kaliumkanälen ähnlich der des K⁺ selbst [vgl. Hille, B., "Ionic Channels of Excitable Membranes", Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA (1992)]. Demgemäß lassen sich Ionen wie Rb⁺, die nicht natürlicherweise in Zellen vorliegen, als Tracer für K⁺ verwenden.

Syme P.D. et al. [J. Hypertens. 8, 1161-1166 (1990)] beschreiben eine in vivo-Analyse der Aktivität des Na⁺,K⁺-ATPase-Transporters, wobei Ratten RbCl intraperitoneal durch eine Injektion verabreicht wurde und sodann die Rubidiumkonzentration in Plasma und Erythrozyten mittels Flammen-Atomabsorptionsspektroskopie gemessen wurde.

Wegman E.A. et al. [Pflügers Arch. 417, 562-570 (1991)] beschreiben eine Untersuchung von Kalium-Kanälen, wobei Kationen mittels elektrophysiologischer Verfahren (Patch-clamp-Technik) gemessen wurden.

Tas P.W. et al. [Neurosci. Lett. 94, 279-284 (1988)] beschreiben eine Untersuchung des ⁸⁶Rb⁺-Influx und Efflux über Ca²⁺-aktivierte Kalium-Kanäle mit C6-Gliomzellen aus Ratten.

Im Hinblick auf die Untersuchung des Einflusses von Kaliumkanal-Modulatoren haben sich bislang zwei Methoden durchgesetzt; zum einen die Elektrophysiologie und zum anderen der sog. ⁸⁶Rb-Flux-Assay [vgl. Weir, S.W. and Weston, A.H., Br. J. Pharmacol, 88, 121-128 (1986)]. Für die Etablierung einer funktionellen Screeningmethode, die einen hohen Probendurchsatz erlaubt, ist die Elektrophysiologie prinzipiell ungeeignet. Der ⁸⁶Rb-Flux-Assay ist aufgrund der starken Strahlung dieses Isotops (β_max = 1,77 MeV; γ_max = 1,08 MeV) ebenfalls nicht für hohe Probendurchsätze geeignet, da aufwendige Abschirmungsmaßnahmen erforderlich sind, die einen routinemäßigen Umgang kompliziert und damit zeitintensiv machen. Darüber hinaus ist ⁸⁶Rb teuer und nicht in größeren Mengen einsetzbar.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur funktionellen Charakterisierung von Ionenkanälen, mit dem eine funktionelle Identifizierung von Modulatoren solcher Membranproteine möglich ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein nicht-radioaktives, einwertiges Kation, insbesondere nicht-radioaktives Rb⁺, als Tracer für das entsprechende Kation eines Zellsystems eingesetzt, und dessen Verteilung zwischen intrazellulärem und extrazellulärem Raum mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt wird. Die zu analysierende Probe wird dabei in die Flamme eines Atomabsorptionsspektrometers eingesprüht und dabei atomisiert. Die im Grundzustand vorliegenden Atome absorbieren dabei Licht bei der für jedes Element charakteristischen Wellenlänge. Diese spezifische Lichtabsorption ist der Menge der Atome (im Grundzustand) proportional und läßt sich entsprechend dem "Lambert-Beer"-Gesetz zur Quantifizierung des Elements heranziehen.

Überraschenderweise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren erstmalig die nicht-radioaktive Identifizierung von Ionenkanal-Modulatoren auf hochsensitive Weise und gleichzeitig mit einem extrem hohen und schnellen Durchsatz. Darüberhinaus eröffnet dieses Verfahren erstmalig die gesamte Untersuchungsbandbreite von Kationenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren.

Im Gegensatz zu dem oben aufgeführten Stand der Technik zeichnet sich dieses Verfahren durch überraschend viele Vorteile aus. Da die Nachweisgrenze für die einwertigen Tracer-Kationen, insbesondere Rb⁺, mittels Atomabsorptionsspektroskopie im oberen nano-molaren (ppb)-Konzentrationsbereich liegt, ist eine hohe Sensitivität für die Analysen von Ionenflüssen, insbesondere der Rb⁺-Ionenflüsse, über Zellmembranen vorhanden, wobei gleichzeitig eine Störung durch zelluläre Komponenten ausgeschlossen werden kann. Die nichtradioaktive Kationenbestimmung mittels der Atomabsorptionsspektroskopie ermöglicht eine einfache und ohne Sicherheitsvorkehrungen erschwerte Durchführung. Die vollständige Automatisierung, verbunden mit der extrem kurzen Zeit für eine Probenbestimmung, erlaubt erstmalig einen sehr hohen Durchsatz, ohne daß die Sensitivität verloren geht.

Als Tracer-Kationen eignen sich einwertige Kationen, wie beispielsweise Rb⁺ oder Tl⁺; bevorzugt ist Rb⁺.

Spezifische oder unspezifische Kationenkanäle und/oder damit assoziierte Rezeptoren stehen im Rahmen der Erfindung für alle Arten von Kaliumkanälen, wie beispielsweise native oder rekombinante, spannungs- und/oder calciumabhängige Kaliumkanäle oder P2-purinerge Rezeptoren oder unspezifische Kationenkanäle, wie beispielsweise nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren, oder Glutamat-Rezeptoren oder rekombinante Zellinien, die Kationenkanäle exprimieren wie z.B. RCK 1 und RCK 4 und deren jeweiligen Subtypen, wie beispielsweise der SK_Ca-Kaliumkanal.

Bevorzugt geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur funktionellen Identifizierung und Charakterisierung jedweder Kaliumkanal-Modulatoren, Modulatoren unspezifischer Kationenkanäle und für den SK_Ca-Kaliumkanal.

Besonders bevorzugt geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur funktionellen Identifizierung und Charakterisierung von calciumabhängigen, Kaliumkanal-Modulatoren und dem SK_Ca-Kaliumkanal.

Der oben aufgeführte nichtradioaktive Tracer, vorzugsweise Rb⁺, wird im allgemeinen in einer physiologischen Konzentration von 5,4 mmol/l eingesetzt.

Im allgemeinen werden die Analysen in Form einer Dreifachbestimmung innerhalb von ≤ 60 sec durchgeführt.

Das Verfahren wird in Abhängigkeit von den oben aufgeführten Kanälen im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0–37°C, vorzugsweise 4°C bis Raumtemperatur durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auf hochsensitive und nichtradioaktive Weise, verbunden mit einem extrem hohen Durchsatz, eine funktionelle Charakterisierung von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren sowie eine funktionelle Identifizierung von Modulatoren solcher Membranproteine, wobei diese Modulatoren wertvolle Arzneimittel für die unterschiedlichsten medizinischpharmakologischen Indikationsgebiete, insbesondere für coronare Herzerkrankungen und Erkrankungen des Zentralen Nervensystems, darstellen.

Experimenteller Teil
Im folgenden sind die für die sog. PC12-Zellinie [vgl. Greene, L. and Tischler, A: Proc. Natl. Acad. Sci., USA 73, 2424-2426 (1976)] optimierten Versuchsbedingungen wiedergegeben. Im Rahmen dieser Optimierung wurden u.a. die Beladungsdauer, die Rb-Konzentration während der Beladung, die Zellzahl, die Beschichtung der Mikrotiterplatten, die Temperatur, die Zeit der Efflux-Stimulation sowie die Anzahl der benötigten Waschschritte untersucht. Die Abk. "mM" und "μm" stehen für die Einheiten mmol/l bzw. μmol/l.
Adhärent wachsende tierische Zellen werden in Laminin-beschichteten 24-well Mikrotiterplatten ausgesät und bei 37°C/10% CO₂ für 48 h unter Standard-Medienbedingungen kultiviert (DMEM, 10% FCS, 5% HS, 1% Glutamin (200 mM), 1% Pen-Strep). Die Zellzahl nach der Inkubation liegt bei ca. 0.8–1,5 × 10⁵ Zellen/well. Anschließend wird das Kulturmedium abgenommen und durch kaliumfreien Puffer A (150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0,8 mM NaH₂PO₄, 5 mM Glucose, 25 mM HEPES pH 7,4) ersetzt, dem 5,4 mM RbCl zugesetzt wird. Die Zellen werden dann für weitere 4 h inkubiert wie oben beschrieben.
Nach dieser Beladungsphase wird überschüssiges RbCl durch dreimaliges Waschen mit je 1,0 ml Puffer A (incl. 5,4 mM KCl) entfernt. Anschließend werden die Zellen dann mit je 0,5 ml Puffer A (für den Basalwert) bzw. Puffer A incl. verschiedener Zusätzen für genau 10 Min. inkubiert. Die Überstände werden sodann vorsichtig abgenommen und bei –20°C aufbewahrt. Die zurückbleibenden Zellen werden anschließend mit je 0,5 ml 1% Triton X-100 für 30 Min. unter starkem Schütteln lysiert und danach ebenfalls bis zur Rb-Analyse eingefroren.
Rb-Analytik mittels AAS
Die jeweiligen Zellüberstände sowie die Zellysate werden nach dem Auftauen zunächst 1:25 bzw. 1:10 in Ionisationspuffer (0,1% CsCl/1% HCl) verdünnt. Anschließend werden die Rubidiumgehalte in den jeweiligen Proben mittels AAS bestimmt (UNICAM 939AA), wobei jede Einzelprobe dreifach gemessen wird und Standard-Eichgeraden für die Berechnung zugrunde gelegt werden (1).
Die Meßwellenlänge für Rb liegt bei 780,0 nm. Der prozentuale Rb⁺-Efflux aus den Zellen wird anschließend aus dem Verhältnis des im Überstand gemessenen Rubidiums zum insgesamt aufgenommenen Rubidium (= Summe Rb im Zellysat und im Überstand) für jede Einzelprobe berechnet.
Ergebnisse:
Das Prinzip des Rb-Flux-Assay beruht darauf, daß Rb⁺ sich in zellulären Systemen ähnlich verhält wie K⁺. Insbesondere ist die Leitfähigkeit für Rb⁺ in Kaliumkanälen ähnlich der des K⁺ selbst [vgl. Hille, B. "Ionic Channels of Excitable Membranes", Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA (1992)]. Demgemäß läßt sich Rb⁺, das nicht natürlicherweise in Zellen vorliegt, als Tracer für K⁺ verwenden. Während der Beladungsphase wird daher zunächst intrazelluläres K⁺ gegen Rb⁺ ausgetauscht. Die Rb⁺-Aufnahme erfolgt dabei zum größten Teil über die zelluläre Na/K-ATPase. Eine Beladung mit Rb⁺ in Anwesenheit von Quabain, einem selektiven Inhibitor der Na/K-ATPase führte bei PC12-Zellen nämlich zu einer nur ca. 30%igen Rb⁺-Aufnahme im Vergleich zur nichtbehandelten Kontrolle.
Anschließend werden die so beladenen Zellen dann für die Efflux-Experimente eingesetzt. Der physiologische Puffer A wird dabei zur Bestimmung der basalen unspezifischen Efflux-Rate verwendet, die – je nach Versuchsbedingungen – zwischen 15 und 30% liegt.
Die Stimulation zur Öffnung von Calcium-abhängigen Kaliumkanälen wird in der PC12-Zelle durch Depolarisation mit 50 mM KCl erreicht. Diese führt zunächst zur Öffnung von spannungsabhängigen Calciumkanälen (L-Typ), wodurch die intrazelluläre Calciumkonzentration ansteigt (2). Diese Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration ist dann der Auslöser für die Öffnung der Calcium-abhängigen Kaliumkanäle, in deren Folge es dann zu einem Rb⁺-Efflux kommt. Der auf diese Weise zu erzielende Efflux beträgt ca. 50–60% (3) und liegt in der Regel ca. zwei- bis dreifach über dem basalen, unstimmulierten Efflux. Die absolut gemessenen Rubidiumkonzentrationen liegen dabei im unteren μmolaren Bereich (μg Rb/l).
Der vorgeschlagene Mechanismus für die Stimulierung Calcium-abhängiger Kaliumkanäle in PC12-Zellen konnte dadurch verifiziert werden, daß Antagonisten der L-Typ Calciumkanäle wie Nifedipin und Nimodipin (vgl. Drugs of the future Vol. 9, No. 3, 1984, S. 169) indirekt auch den resultierenden Rb⁺-Efflux hemmen. Gleichzeitig bewirkt der Calciumkanal-Agonist 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-[2-(trifluormethyl)phenyl]-3-pyridin-carbonsäuremethylester (D) eine deutliche Steigerung des Rb⁺-Efflux (3).
Außerdem führte ein Depolarisierung (50 mM KCl) in Abwesenheit von extrazellulärem Calcium zu einem deutlich verringerten Rb⁺-Efflux im Vergleich zur nicht depolarisierten Calcium-freien Kontrolle.
Die weitere Spezifizierung dieses Calcium-abhängigen Kaliumkanals in PC12-Zellen erfolgte u.a. anhand der Wirkung verschiedener Peptidtoxine. Charybdotoxin, ein relativ spezifischer Blocker des sog. BK_Ca-Kaliumkanals [vgl. Miller, C., Moczydlowski, E., Latorre, R. and Phillips, M. Nature 313, 316-318 (1985)] hatte nahezu keinen Effekt auf den Rb⁺-Efflux. Das gleiche gilt für Iberiotoxin, das ebenfalls derartige Kanäle blockiert (4).
Das aus Bienengift isolierte Peptid Apamin hingegen, ein spezifischer Blocker des sog. SK_Ca-Kaliumkanals [vgl. Lazdunski, M., Cell Calcium 4, 421-428 (1983)] führt zu einer ca. 50%igen Blockierung des Rb⁺-Efflux. Einen nahezu vergleichbaren inhibitorischen Effekt zeigte auch das Skorpiontoxin Leiurotoxin 1, das ebenfalls für den SK_Ca-Kanal spezifisch ist [vgl. Chicci, G.G., Gimenez-Gallego, G., Ber, E. Garcia, M.L, Winquist, R. and Cascieri, M.A., J. Biol. Chem. 263, 10192-10197 (1988)]. Ein mittlerweile für Hepatozyen beschriebener, nichtpeptidischer Blocker eines Apamin-sensitiven Kaliumkanals, Dequaliniumchlorid [vgl. Castle, N.A., Haylett, D.G., Morgan, J.M. and Jenkinson, D.W., Eur. J. Pharmacol. 236, 201-207 (1993)], hatte auch bei PC12-Zellen einen konzentrationsabhängigen, blockierenden Effekt auf den Rb⁺-Efflux (5). Dies unterstreicht, daß der Rb⁺-Efflux (nach Depolarisation) entsprechend dem oben postulierten Mechanismus zu einem großen Teil auf den SK_Ca-Kanal zurückzuführen ist. Weiterhin sind aber auch andere, z.B. spannungsabhängige Kaliumkanäle am Rb⁺-Efflux mitbeteiligt, da mit Apamin auch in höheren Konzentra tionen keine vollständige Blockierung des Rb⁺-Efflux erzielt werden konnte (5).
Die hier beschriebene PC12-Zellinie verfügt über eine Reihe weitere interessanter Rezeptoren und Kanalproteine, wie mittels der Rb-AAS-Methode festgestellt werden konnte. So führt die Stimulation mit ATP über den sog. P2-purinergen Rezeptor zur Öffnung unspezifischer Kationenkanäle, die ebenfalls Rb⁺-Leitfähigkeit zeigen. Dieser Effekt ist durch Suramin (Germanin) vollständig blockierbar (6).
Weiterhin ist auch mit Nikotin und Acetylcholin ein Rb⁺-Efflux induzierbar, der mit Antagonisten nikotinischer Acetylcholin-Rezeptoren blockierbar ist. Dieser Rezeptor steht ebenfalls mit mehr oder weniger unspezifischen Kationenkanälen in Zusammenhang (7).
Die universelle Anwendbarkeit der Rb-AAS-Methode konnte dadurch gezeigt werden, daß auch andere Zellsysteme, die Kaliumkanäle aufweisen, einen deutlich meßbaren Rb⁺-Efflux nach geeigneter Stimulation zeigten (8).
Darüber hinaus konnten auch rekombinante Zellsysteme, die mit Kaliumkanälen stabil transfiziert wurden, mit diesem neuentwickelten Assay eindeutig untersucht werden (9).
1: Standard-Eichgerade für Rb. Die angegebenen Werte stellen die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen dar. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 1,3.
2: Fura-2-Messung zur Bestimmung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt der Depolarisation durch Zugabe von 50 mM KCl.
3: Einfluß von Calciumkanal-Modulatoren auf den Ca²⁺-induzierten Rb⁺-Efflux. Die Depolarisation mit 50 mM KCl führt zum Ca²⁺-Einstrom, in dessen Folge Ca²⁺-abhängige Kaliumkanäle aktiviert werden. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 3,3.
4: Einfluß der Skorpiontoxine Iberiotoxin und Charybdotoxin auf den Rb⁺-Efflux, stimuliert mit 50 mM KCl. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 3,1.
5: Einfluß von Dequaliniumchlorid (DqCl), Leiurotoxin 1 (LTX) und Apamin auf den Rb⁺-Efflux, stimuliert mit 50 mM KCl. Alle untersuchten Substanzen hatten dabei keinen Einfluß auf den Ca²⁺-Einstrom (gezeigt über Fura-2-Messungen). Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 2,9.
6: Einfluß von Suramin (= Germanin) auf den Rb⁺-Efflux, stimuliert mit 100 μM ATP. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 2,0.
7: Rb⁺-Efflux nach Stimulierung mit Nikotin und Acetylcholin (Ach). Bei Tubocurarin handelt es sich um einen spezifischen Blocker des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 3,7.
8: Rb⁺-Efflux nach Stimulation mit verschiedenen KCl-Konzentrationen bei der GH3-Zellinie (etabliert aus Hypophysen- Tumorgewebe der Ratte) [vgl. Lang, D.G. and Ritchie, A.K., Eur. J. Physiol. 410, 614-622 (1987)]. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 1,1 .
9: Rb⁺-Efflux, stimuliert durch Depolarisation mit 50 mM KCl RCK 1 und RCK 4 bezeichnen zwei rekombinante Zellinien, die mit spannungsabhhängigen Kaliumkanälen stabil transfiziert sind [vgl. Pongs, O., Phys. Rev. 72, 69-88 (1992)]. Bei der zugrunde liegenden Zellinie 293 handelt es sich um eine humane embryonale Nierenzelline. Die relativen Standardabweichungen waren in allen Fällen ≤ 2,4.

Claims

Verfahren zur funktionellen Charakterisierung von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro-Zellsystem zur Durchführung eines Flux-Assays mit nicht-radioaktiven, einwertigen Kationen als Tracer für das entsprechende Kation des Zellsystems beladen wird und die Verteilung dieser Kationen zwischen intrazellulärem und extrazellulärem Raum mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt wird.
Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkung besagter Modulatoren gemäß dem Verfahren nach dem Anspruch 1 bestimmt wird.
Testsystem zur funktionellen Charakterisierung von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, dass ein in vitro-Zellsystem zur Durchführung eines Flux-Assays mit nicht-radioaktiven, einwertigen Kationen als Tracer für das entsprechende Kation des Zellsystems beladen wird und die Verteilung dieser Kationen zwischen intrazellulärem und extrazellulärem Raum mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt wird.
Testsystem zur Identifizierung von Modulatoren von Ionenkanälen und/oder damit assoziierter Rezeptoren, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkung besagter Modulatoren gemäß dem Verfahren nach dem Anspruch 1 bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, oder Testsystem nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-radioaktiven, einwertigen Kationen nicht-radioaktive Rb-Kationen sind.