DE69716931T2 - Oligosaccharid-synthese - Google Patents
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Description
- für Festphasen- oder Kombinationssynthese von Oligosacchariden. Die Erfindung stellt einen neuen Linker-Harz, Linker-Saccharid oder Harz-Linker- Saccharid-Komplex bereit, der es in einer Ausführungsforut einem Saccharidrest ermöglicht, an einen löslichen oder unlöslichen polymeren Träger zu binden zur Verwendung als Basis für die Festphasesynthese von Oligosacchariden. In einer zweiten Ausführungsform ermöglicht es der Komplex der Erfindung Oligosacchariden, an einen festen polymeren Träger zu binden zur Verwendung als analytisches Reagenz.
- Oligosaccharide bilden eine Hauptklasse von bioaktiven Polymeren, impliziert in biochemischen Prozessen (Lasky, 1992; Varki, 1993), so divers wie die Zelldifferenzierung, die Hormon-Zellerkennung und die Zell-Zell- Adhäsion, insbesondere die Bindung von Viren an die Wirtszelle (Gambaryan et al., 1995) und von Bakterien an die Wirtszelle (Boren et al., 1993). Die Beteiligung von Oligosacchariden an Krankheiten, wie z. B. Krebs, kardiovaskulären Störungen, mikrobiellen Infektionen, einer Transplantatabstoßung und Autoimmunstörungen liegt daher sehr nahe. Die Konjugierung von Kohlenhydraten an bioaktive Peptide erwies sich auch als stabilisierend auf Peptide gegen einen Abbau und unter besonderen Umständen erleichtert sie den Peptidtransport über biologische Barrieren (Lee 1989; Fischer 1991; Rodriguez 1989). So wird die Fähigkeit, Oligosaccharide in einfacher und effizienter Weise zu synthetisieren, nun ein sehr wichtiger Bereich innerhalb der organischen Chemie.
- Die sehr arbeitsintensiven Lösungsphase-Strategien, die bis jetzt für die Oligosaccharid-Synthesen verwendet wurden, benötigen hochspezialisiertes know how und einen hohen Grad an chemischem Wissen. Diese Situation spiegelt sich im Bereich der Peptidsynthese wieder, bis Merrifield et al. die Festphase-Peptidsynthese (SPPS) vor über 30 Jahren entwickelten (Merrifield 1963). Bei der SPPS ermöglichte die Immobilisierung einer ersten Aminosäure dar benötigten Sequenz an ein unlösliches Harz, dass große Überschüsse an Reagenzien verwendet werden konnten, um die Kopplung der zweiten Aminosäure zu ermöglichen. Alle nicht verwendeten Materialien, die am Ende des Kopplungsschritts übrig blieben, konnten dann einfach durch Waschen der Harzkügelchen entfernt werden. Diese Technologie bedeutete, dass der Chemiker jede Kopplungsreaktion fast bis zu quantitativen Erträgen treiben konnte und da die gebildeten Peptid-Intermediate immer noch an das Harz gebunden waren, war eine Reinigung nach jedem Acylierungsschritt nicht nötig. Dia SPPS ermöglicht eine Peptid- und Polypeptidsynthese, die als routinemäßiges Forschungs- und Synthesewerkzeug verwendet wird und ermöglicht außerdem groß angelegte Kombinationssynthesen von Peptiden für das Screening auf potentielle pharmazeutische Mittel.
- Über viele Jahre haben Chemiker versucht, diese Festephasenmethodik auf die Oligosaccharid-Synthese zu übertragen - mit unterschiedlichem Erfolg. Der erste Versuch wurde vor ungefähr 25 Jahren durchgeführt L Frechet und Schuerch, 1971; Frechet und Schuerch, 1972; Guthrie et al., 1971; Guthrie et al., 1973). Jedoch war das ozonvermittelte, von Schutzgruppen befreite Produkt ein aldehydsubstituiertes Glycosid. Danishefsky und Mitarbeiter beschrieben die Festphasensynthese des Lewis b Antigen (Randolph et al., 1995) und N-gebundener Glycopeptide (Roberge et al., 1995) durch anfängliche Anbindung der primären Zuckereinheit des Oligosacccharids an einen 1%igan Divinylbenzol-Styrolaopolymerträger über eine Silyletherbindung. Der harzgebundene Zuckerbestandteil war in diesem Fall ein Glykal, wobei eine Aktivierung am Harz über Epoxidierung der Doppelbindung erreicht wurde und wobei der resultierende Glykalrest als Zuckerdonator über die nukleophile Ringöffnung des Epoxids wirkte. Da für den Zuckerchemiker keine colorimetrischen Verfahren zur Verfügung stehen, um die auf - Harz-Glykosilierungen zu überwachen, ist das einzige Mittel einer Bestimmung des Fortschreitens der Reaktion die Lyse dar Oligosaccharid-Harzbindung und die darauffolgende Analyse des Spaltungsprodukts, in der Regel durch Dünnschicht- Chromatographie. Die von Tetra-n-butylammoniumfluorid vermittelten Bedingungen der Entfernung von Schutzgruppen um den Danishefsky-Silylether- Linker zu spalten, sind sowohl gefährlich als auch langsam. Dies, gekoppelt mit der Notwendigkeit für eine Aktivierung am Harz der angebundenen Glykale, führt dazu, dass die Gesamtstrategie und Methodik weit entfernt vom Ideal ist.
- Gemäß einem alternativen Ansatz beschrieben Douglas und Mitarbeiter die Synthese von D-Mannopentose unter Verwendung eines Polyethylenglykol-o- monomethylethercopolymers und eines Succinoyls oder eines α,α'-Dioxyxylyldietherlinkers (Douglas et al., 1995). Die Reaktionen wurden in Lösungsphase durchgeführt, unter Entfernung von nicht verwendeten Reaktanden durch Präzipitation des Oligosaccharid-Polymerkomplexes und darauffolgendes Waschen. In dem letzteren Beispiel wurde die Spaltung der Oligosaccharid- Polymer-Bindung durch katalytische Hydrierung bewirkt, die das Aussetzen des Konjugats zu einer Atmosphäre H&sub2; für 48 Stunden notwendig machte, um respektable Erträge zu erzielen. Dies ist wiederum deutlich zu langsam, um eine effektive Überwachung der individuellen Glycosylierungsreaktionen zu ermöglichen. Yan et al. berichteten über die sulfoxidvermittelte Glycosylierung an einem Merrifieldharz, unter Verwendung eines Thiophenollinkers für die Anbindung des primären Zuckerrestes (Yan et al., 1994). Dies Verfahren führte zur Konstruktion von (1-6)-gebundenen Oligosacchariden und war für die Synthese von sowohl α- als auch β-glycosidischen Bindungen geeignet. Die thioglycosidische Bindung an das Harz diktierte jedoch, dass ähnliche Zuckerdonatoren nicht in dieser Strategie verwandet werden können.
- Kürzlich berichteten Rademann und Schmidt über die Verwendung von Trichloracetimidat-Zuckerdonatoren an einen Harz gebundenen Zucker, angebunden über ein Alkylthiol (Rademann und Schmidt, 1996); wiederum schließt dieses Verfahren jedoch die Verwendung der weit überlegenen Thioglycosidzuckerdonatoren aus. Derweil beschrieben Adinolfi et al. die Synthese von Disacchariden unter Verwendung eines Polyethylenglycol-Polystyrolharzes, mit Verbindung das ersten Zuckers an den polymeren Träger durch eine Succinat-Abstandsgruppe (Adinolfi et al., 1996). Die von diesem Linker gezeigte Säurelabilität bedeutet jedoch, dass der primäre Zucker nicht über die glycosidische Stellung an das Harz gebunden werden kann.
- Die obigen Beispiele dienen der Illustration, dass das kritische Element bei der Festphasensynthese die Natur des Linkers zwischen festem Träger und anfänglichem Synthon ist. Der Linker muß eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber den Bedingungen von Kupplung und Entfernung von Schutzgruppen zeigen, sollte jedoch im Fall der Festphasen-Oligosaccharidsynthese schnell und effizient gespalten werden, um eine Überwachung des Fortschreitens individueller Kupplungsreaktionen zu ermöglichen. Die Spaltung sollte im Idealfall durch Verwendung eines relativ ungefährlichen chemischen Reagenzes erreicht werden können.
- Es ist daher klar, dass ein Bedarf auf dem Gebiet an einfachen, effizienten und ökonomischen Verfahren für die Festphasensynthese von Oligosacchariden besteht.
- Eine hydrazinlabile primäre Aminoschutzgruppe, N-1-(4,4-Dimethyl- 2,6-dioxocyclohexyliden)ethyl (Dde) wurde für den Schutz von Lysinseitenketten während SPPS beschrieben (Bycroft et al., 1993). Diese Gruppe wurde zur Verwendung als Carboxyschutzgruppe bei SPPS modifiziert, wenn das 2-(3-Methylbutyryl)dimedonanalog von 2-Acetyl-dimedon mit 4-Aminobenzylalkohol kondensiert wurde, um 4-[N-[1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohaxyliden)- 3-methylbutyl]-amino)benzylester (ODmab) zu ergeben (Chan et al., 1995).
- Über die beiden Schutzgruppen wurde berichtet, dass sie gegenüber den bei SPPS weit verbreitet verwendeten Bedingungen zur Entfernung von Schutzgruppen stabil waren, das heißt die Trifluoressigsäure (TFA) oder 20% Piperidin in Dimethylformamid (DMF). Der Ethylester, 4-[N-(1-(4,4-Dimethyl-2,6- dioxocyclohexyliden)ethyl)amino]benzylester (ODab) zeigte eine geringe aber signifikante Instabilität gegenüber 20% Piperidin-DMF. Sowohl Dde als auch ODmab sind an Gruppen an Aminosäuren gebunden, anstatt direkt an den Festphasenträger. Ihre Verwendung in der Festphasenoligosaccharidsynthese wurde nicht vorgeschlagen.
- Wir haben nun überraschend festgestellt, dass Schutzgruppen, die Dde und ODmab ähnlich sind, an einen polymeren Träger gekoppelt werden können, wodurch ein System für die Immobilisierung von Zuckern erzeugt wird. Hierfür haben wir N- und O-Glycoside an den festen Träger immobilisiert und synthetisierten Oligosacharide unter Verwendung verschiedener Zuckerdonatoren. Die Linker zeigen eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber den meisten Säuren und sekundären/tertiären Basen, die man in der modernen synthetischen Chemie antrifft, sind aber schnell und effizient spaltbar, entweder mit Ammoniak, Hydrazin oder primären Aminen.
- Bannwarth et al. haben unabhängig einen anderen Festphasenlinker entwickelt, um die Dde-Schutzgruppe, den sie verwendet haben um Aminosäuren und primäre Amine für Kombinationsbibliothekssynthesen zu immobilisieren (Bannwarth et al., 1996). Die Synthese dieses Linkers ist jedoch sowohl langwierig als auch ineffizient und der Linker zeigt nur eine begrenzte Stabilität gegenüber sekundären Basen, wie z. B. Piperidin. Es gab keinen Vorschlag, dass dieser Linker für die Oligosaccharidsynthese verwendet werden könnte. Die Linker, die wir entwickelt haben, zeigen eine sehr viel großere Stabilität als diejenigen von Bannwarth et al..
- Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung einen Träger für die Festphasesynthese von Oligosacchariden bereit, wobei der Träger folgendes umfasst:
- a) ein Harz,
- b) einen Linker, kovalent befestigt an dem Harz, und
- c) ein oder mehrere Saccharidgruppen, kovalent über einen Linker an dem Harz befestigt,
- wobei der Linker eine 2-substituierte 1,3-Dioxocycloalkanverbindung ist, und
- wobei der Träger die allgemeine Formel (I) aufweist:
- worin R¹ und R² dieselben oder unterschiedlich sein können und jeweils Wasserstoff oder C&sub1;&sub4;-Alkyl bedeuten;
- R' ist ein Aminozucker, ein Glycosylamin oder ein Glycosylamin eines Oligosaccharids; ein Mono- oder Oligosaccharid, gekoppelt über eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-aminogruppe; oder ein Mono- oder Oligosaccharid, gekoppelt über eine Carboxyalkyl-, substituierte Carboxyalkyl-, Carboxyaryl-, substituierte Carboxyaryl-, Carboxycycloalkyl- oder substituierte Carboxycycloalkyl-aminogruppe und
- R" ist eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-Abstandsgruppe, die direkt an einen Harzträger gekoppelt ist oder die optional an den Harzträger über eine geeignete kovalente Bindung gekoppelt sein kann, die gegenüber den Bedingungen der Oligosaccharidsynthese und -spaltung stabil ist.
- Die kovalente Bindung an das Harz kann in geeigneter Weise durch eine -CONH-, -O-, -S-, -COO-, -CH=N-, -NHCONH-, -NHCSNH oder -NHNH-Gruppierung bereitstellt werden, z. B. Abstandsgruppe-CONH-Harz, Abstandsgruppe-O-Harz, Abstandsgruppe-S-Harz, Abstandsgruppe-CO&sub2;-Harz, Abstandsgruppe-CH=N-Harz, Abstandsgruppe-NHCONH-Harz, Abstandsgruppe NHCSNH-Harz, Abstandsgruppe- NHNH-Harz. Andere mögliche kovalente Bindungsgruppen werden dem Fachmann bekannt sein.
- Vorzugsweise sind sowohl R' als auch R² Methyl.
- Vorzugsweise ist R' ein Oligosaccharid-O-CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)-NH, Monosaccharid- O-CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)-NH, Amino-Oligosaccharid-CO&sub2;cH&sub2;- (C&sub6;H&sub4;)-NH-Gruppe oder eine Aminomonosaccharid -O-CO&sub2;CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)-NH-Gruppe.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der 2-substituierte 1,3-Dioxocycloalkanlinker funktionalisiertes Dde, DDh oder ODmab. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Träger ein Harz, einen Linker und ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid, ein Aminosaccharid oder ein Amino-Oligosaccharid.
- Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen Träger für die Festphasen-Synthese bereit, umfassend ein Harz und eine Linkergruppe, wobei der Linker ein 2-substituiertes 1,3-Dioxocycloalkan der allgemeinen Formel II ist:
- worin
- X OH oder NH&sub2; ist;
- R¹ und R² können dieselben oder unterschiedlich sein und bedeuten jeweils Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl; vorzugsweise sind sowohl R¹ als auch R² Methyl; und
- R" ist ein Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-Abstandsgruppe, die direkt an einen Harzträger gekoppelt ist oder die optional an den Harzträger über eine geeignete kovalente Bindung gekoppelt sein kann, die gegenüber den Bedingungen einer Oligosaccharidsynthese und -spaltung stabil ist. Die kovalente Bindung kann in geeigneter Weise bereitgestellt werden durch eine -CONH-, -O-, -S-, -COO-, -CH=N-, -NHCONH-, -NHCSNH oder -NHNH-Gruppierung, z. B. Abstandsgruppe-CONH-Harz, Abstandsgruppe-O-Harz, Abstandsgruppe-S- Harz, Abstandsgruppe-C&sub0;&sub2;-Harz, Abstandsgruppe-CH=N-Harz; Abstandsgruppe- NHCONH-Harz, Abstandsgruppe-NHCSNH-Harz, Abstandsgruppe-NHNH-Harz. Andere mögliche kovalente Bindungsgruppen werden dem Fachmann bekannt sein.
- Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen Linker-Saccharid-Komplex bereit, umfassend eine Linkergrupge der allgemeinen Formel II wie oben definiert und eine Saccharidgruppe, wie definiert oben für R'.
- Gemäß einem vierten Aspekt stellt die Erfindung eine Linker-Verbindung bereit, die funktionelle Gruppen trägt, die geeignet sind, ein primäres Amin an ein Harz über kovalente Bindungen zu binden, die gegenüber den Bedingungen der Oligosaccharisdsynthese und Spaltung stabil sind, wobei die Verbindung die allgemeine Formel III aufweist:
- worin
- X OH oder NH&sub2; ist;
- R¹ und R² können dieselben oder unterschiedlich sein und bedeuten jeweils Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl; und
- R" ist ein Alkyl-, substituierte Alkyl -, Aryl-, substituierte Aryl-, Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-Abstandsgruppe, die eine Funktionalität trägt, die mit einem funktionalisierten Harz reagieren kann.
- Vorzugsweise ist die Linker-Verbindung 6-Hydroxyl-6-(4,4-dimethyl- 2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure oder ein Ester davon. Vorzugsweise ist der Ester ein Benzyl, Methyl oder t-Butylester.
- Für die Zwecke dieser Beschreibung bedeutet die Bezeichnung "substituiert" in den Definitionen von Substituenten innerhalb dieser Beschreibung, dass der Substituent selbst mit einer Gruppe substituiert ist, die die allgemeinen chemischen Eigenschaften des Substituenten nicht verändert. Bevorzugt für solche weitere Substituenten sind Halogen, Nitro, Amino, Hydroxyl und Thiol; bevorzugte Halogene sind Chlor und Jod. Der Fachmann wird sich im klaren darüber sein, dass andere geeignete Substituenten ähnlicher Größe und mit ähnlichen Ladungseigenschaften als Alternativen in einer gegebenen Situation verwendet werden könnten.
- Für dis Zwecke dieser Beschreibung wird eine Verbindung als "stabil gegenüber den Bedingungen der Oligosaccharidsynthese und Spaltung" angesehen, wenn es weniger als 10% Verlust der Verbindung nach einem Aussetzen bei Raumtemperatur gegenüber Ammoniak, Hydrazin oder einer primären Aminoverbindung in Wasser oder DMF gibt. Der Fachmann wird einfach in der Lage sein, zu bestimmen, ob die Stabilität einer bestimmten Verbindung adäquat ist, damit sie für die Zwecke der Erfindung geeignet ist, unter Verwendung von Bedingungen, die für seinen oder ihren bestimmten Bedarf geeignet sind.
- Die Linkerverbindung der Erfindung kann auf dem Harz synthetisiert werden oder kann in Lösung synthetisiert werden.
- Die Erfindung stellt auch Kits bereit, die für die Festphasensynthese oder die Kombinations-Synthese von Oligosacchariden geeignet sind, umfassend entweder
- a) einen Harz-Linker-Saccharid-Träger,
- b) einen Linker-Saccharidkomplex oder
- c) einen Harz-Linker-Träger
- gemäß der Erfindung wie oben beschrieben. Das Kit kann optional auch ein oder mehrere weitere Reagenzien umfassen, wie z. B. Schutzmittel, Schutzgruppen entfernende Mittel und/oder Lösungsmittel, die für die Festphasen- oder kombinatorische Synthese geeignet sind. Der Fachmann wird geeignete weitere Reagenzien kennen. Unterschiedliche Arten von Kits können dann je nach gewünschter Verwendung gewählt werden.
- Das Harz kann jedes Harz sein, das in Wasser und/oder einem organischen Lösungsmittel schwillt und das einen der folgenden Substituenten umfasst: Halogen, Hydroxy, Carboxyl, SH, NH&sub2;, Formyl, SO&sub2;NH&sub2; oder NHNH&sub2;, z. B. Methylbenzhydrylamin-(MBHA)-Harz, Amino- oder Carboxytentagelharze, 4-Sulphamylbenzyl-AM-Harz. Andere geeignete Harze werden dem Fachmann bekannt sein.
- Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Festphasensynthese von Oligosacchariden bereit, umfassend den Schritt der sequentiellen Verbindung von Mono- oder Oligosaccharidgruppen an einen Träger wie oben beschrieben. Dementsprechend können die Mono- oder Oligosaccharid-Aufbaublöcke wie oben beschrieben aussehen.
- Dieses Verfahren ist insbesondere für die kombinatorische Syntheseanwendung geeignet.
- Die Linkerverbindung kann in Lösung oder direkt auf dem Harz in schrittweiser Abfolge synthetisiert werden, vor ihrer Kupplung an die anfängliche Zuckergruppe oder das anfängliche Linker-Zucker-Konjugat kann in Lösungsphase synthetisiert werden und darauffolgend an den festen Träger gekuppelt werden, wobei die darauffolgenden Zucker sequentiell angebunden werden. Vorzugsweise werden die zweiten und alle darauffolgenden Zuckergruppen an das Oligosaccharid Ketten-Harz-Konjugat gekoppelt, nachdem der letzte Zucker in der Oligosaccharidkette teilweise von Schutzgruppen befreit wurde.
- Die Erfindung stellt dementsprechend ein Verfahren für die Synthese einer Linkergruppe gemäß der allgemeinen Formel I wie oben definiert bereit, umfassend den Schritt der C-Acylierung einer 2-substituierten 1,3- Dioxocyclohexan-Verbindung mit einer Dicarbonsäure. Vorzugsweise ist die Dicarbonsäure durch eine Esterbildung monogeschützt. Noch bevorzugter wird die Reaktion mit Carbodiimid aktiviert und durch N,N'-Dimethylaminopyridin katalysiert.
- Das Produkt der Reaktion kann optional mit 4-Aminobenzylalkohol umgesetzt werden um das 4-Aminobenzylderivat zu bilden.
- Die Erfindung stellt auch ein Syntheseverfahren eines Harz-Linkerträgers bereit, umfassend den Schritt des Schwellen eines Harzes in einem geeigneten Lösungsmittel, Behandlung des geschwollenen Harzes mit einer Dicarbonsäure und Umsetzung des so erzeugten Produkts mit einer 2-substituierten 1,3-Dioxocycloalkanverbindung. Vorzugsweise ist sowohl für die Synthese des Linkers als auch die Synthese des Harz-Linker-Trägers die 2-substituierte 1,3-Dioxocycloalkan-Verbindung 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion. Ebenfalls bevorzugt ist die Dicarbonsäure Adipinsäure.
- Die ersten Zucker, die an die Harz-Linker-Einheit gebunden werden, können ungeschützte, teilweise geschützte oder voll geschützte Glycoside, Aminoglycoside oder Ether- oder Amino gebundene Zucker sein, wobei die Kupplung über die nicht glycosidische Stellung stattfindet.
- Die Aufbaublockmono- oder Oligosaccharid-Donatoren können jeder aktivierte Zucker sein, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Orthoester, Thioorthoester, Cyanoalkylidenderivate, 1-O-Acylzucker, Aminozucker, Acetimidate, Trichloracetimidate, Thioglycoside, Aminoglycoside, Amino-Oligosaccharide, Glycosylamine von Oligosacchariden, Glycosylthiocyanate, Pentenylglycoside, Pentenoylglycoside, Isoprenylglycoside, Glykale, Tetramethylphosphordiamidate, Zuckerdiazirine, Selenoglycoside, Phosphordithioate, Glycosyl-Dialkylphosphite, Glycosylsulphoxide und Glycosylfluoride.
- Vorzugsweise ist der erste Zucker, der an das Harz gekoppelt wird, ein Aminozucker, ein Aminoglycosid oder ein Aminooligosaccharid oder ein Glycosylamin eines Oligosaccharids.
- Vorzugsweise wird eine teilweise Entfernung der Schutzgruppen am Zucker unter Verwendung von acylartigen, Trityl, benzylartigen, acetalartigen oder verschiedenen Silyl und/oder photolabilen Schutzgruppen zusätzlich zu permanenten Schutzgruppen bewirkt. Dies ermöglicht die Synthese von verzweigten Oligosacchariden unter Verwendung von zwei orthogonalen Hydroxyschutzgruppen auf einem einzigen Zuckerdonator.
- Das synthetisierte Oligosaccharid kann von dem Harz unter Verwendung von Ammoniak, Hydrazin oder einem primären Amin abgespalten werden, wie z. B. Butylamin oder Cyclohexylamin. Für die Herstellung von Aminoglycosiden wird vorzugsweise Ammoniak oder ein geeignetes primäres Amin in einem organischen Lösungsmittel verwendet. Für die Herstellung von Hydraziden wird vorzugsweise Hydrazin in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel verwendet. Für die Herstellung von Oligosacchariden wird vorzugsweise Ammoniak in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel verwendet, gefolgt von Ansäuerung. Wenn der Linker einen 4-Aminobenzyl-Bestandteil enthält, wird der erste Zucker nach Spaltung wie oben beschrieben immer noch geschützt durch die Aminobenzylgruppe freigesetzt; diese kann durch Hydrierung entfernt werden, falls gewünscht.
- Der Fachmann wird anerkennen, dass das Oligosaccharid auf dem Harz zur Verwendung als analytisches oder präparatives Reagenz zurückgehalten werden kann, z. B. in der Affinitätschromatographie oder für eine groß angelegte Affinitätstrennung.
- Detaillierte Beschreibung der Figuren.
- Fig. 1 zeigt eine allgemeine Darstellung der Strategie, die für die Festphasen-Oligosaccharidsynthese benötigt wird.
- Fig. 2 illustriert eine allgemeine Darstellung des "Teile-Kuppel-Rekombinierer"-Verfahrens der Oligosaccharid-Bibliotheksynthese unter Verwendung der Festphasenstrategie.
- Fig. 3 zeigt die Synthese des auf Dde basierenden Linkers der Erfindung, die Anbindung des primären Zuckerrestes und Kupplung des Zucker-Linker-Konjugats an einen Harzträger. Ein alternativer Ansatz, bei dem der Linker direkt auf dem Harz synthetisiert wird, ist auch dargestellt.
- Fig. 4 zeigt die Synthese des auf ODmab basierenden Linkers der Erfindung, die Anbindung des primären Zuckerrests und die Kopplung des Zucker-Linker-Konjugats an den Harzträger.
- Fig. 5 zeigt die Spaltung der Oligosaccharid-Linker-Bindung in einem an Harz gebundenen Hydrazin vermittelten Entschützungsprodukt.
- Fig. 6 zeigt eine allgemeine Darstellung der selektiven Schutzgruppen-Befreiung einer Zucker-Hydroxylgruppe und die darauffolgende Kupplung des nächsten Zuckerdonators.
- Fig. 7 zeigt die Immobilisierung eines Amino-Oligosaccharids an den Dde-derivatisierten Träger.
- Fig. 6 zeigt eine Liste aktivierter Zuckerdonatoren für die Festphasensynthese.
- Fig. 9 zeigt die Synthese eines differenziell geschützten Thioglycosids und eines teilweise geschützten Aminoglycosids.
- Fig. 10 zeigt die Trichloracetimidad-Aktivierung des 4-Aminobenzyl modifizierten Linkers.
- Fig. 11 zeigt eine Ammoniak vermittelte Spaltung des Aminoglycosids mit einer Ansäuerung nach der Spaltung um das freie Kohlehydrat zu erzeugen.
- Fig. 12 zeigt ein spezifisches Beispiel der allgemeinen Strategie für die Oligosaccharid-Synthese unter Verwendung von Thioglycosid als Zuckerdonator.
- Fig. 13 zeigt ein anderes spezifisches Beispiel der allgemeinen Strategie für die Oligosaccharid-Synthese unter Verwendung eines Thioglycosids als Zuckerdonator.
- Fig. 14 zeigt die Spaltung eines Monosaccharids, gebunden an den 4-Aminobenzyl-modifizierten Linker.
- Fig. 15 zeigt ein Beispiel eines harzgebundenen vollgeschützten Trisaccharids.
- Fig. 16 zeigt die Immobilisierung eines nicht geschützten Aminozuckers.
- Die hier verwendeten Abkürzungen sind die folgenden:
- Bn Benzyl
- Bu Butyl
- DCM Dichlormethan
- Dde N-1-(4,4-Dimethyl-2, 6-dioxocyclohexyliden)ethyl
- Ddh-OH 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)hexansäure
- DMAP N,N'-Dimethylaminopyridin
- DMF N,N'-Dimethylformamid
- DMTST Dimethyl(methylthio)sulphonium-trifluormethansulphonat
- EEDQ 1-Isobutyloxycarbonyl-2-isobutyloxy-1,2-dihydrochinolin
- EtOAc Ethylacetat
- EtOH Ethanol
- FAB-MS Schnellatombeschießungs-Massenspektrometrie
- HRMS Hochauflösungs-Massenspektrometrie
- MBHA Methylbenzhydrylaminharz
- Me Methyl
- MeOH Methanol
- NMR Kernmagnetismusresonanz
- ODmab 4-{N-(1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-3-methylbutyl]- amino)benzylalkohol
- PEG Polyethylenglykol
- TBu Tetrabutyl
- TFA Trifluoressigsäure
- THF Tetrahydrofuran
- DSC Dünnschichtchromatographie
- TNBS 2,4,6-Trinitrobenzol-sulphonsäure
- Die Erfindung basiert auf der Immobilisierung von einem auf Dde-, Ddh- oder ODmab basierenden Linker an einen Polymerträger um irgendein Saccharid oder eine Oligosaccharidgruppe anzubinden. Dies wurde durch die Kupplung von N- und O-Glykosiden an die Linker illustriert, dis für die Oligosaccharidsynthese verwendet wurden, folgend auf die Kupplung an das Harz. Die Natur dieser Linker ist derartig gewählt, dass zusätzlich zu dem Potential zur Immobilisierung von jeder Art von Zucker, jeder Zuckerdonator darauffolgend für die Oligosaccharidsynthese verwendet werden kann, was schnelle und effiziente Kupplungsverfahren ermöglicht.
- Geeignete Zuckerdonatoren beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, Orthoester, Thioorthoester, Cyanoalkylidenderivate, 1-O-Acylzucker, Acetimidate, Trichloracetimidate, Thioglycoside, Glycosylthiocyanate, Pentenylglycoside, Pentenoylglycoside, Isoprenylglycoside, Glykale, Tetramethylphosphordiamidate, Zuckerdiazirine, Selenglycoside, Phosphordithioate, Glycosyldialkylphosphite, Glycosylsulphoxide und Glycosylfluoride.
- Die Stabilität der Linker bedeutet, dass orthogonale Hydroxyschutzgruppen als Schutzgruppen für Zucker verwendet werden können. Diese Schutzgruppen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, acylartige, Trityl, benzylartige, acetalartige oder verschiedene Silyl- und photolabile Schutzgruppen.
- Die einfache Durchführung der Linkersynthese bedeutet, dass die zweite funktionelle Gruppe an dem Linker ein Halogen, Alkohol, Thiol oder sekundäres Amin sein kann, z. B.
- X = Halogen, OH, COOH, SH, NHR
- Ähnlich bedeutet die einfache Durchführung der Linkersynthese auch, dass jedes funktionalisierte Harz verwendet werden kann, um den Linker zu immobilisieren, z. B. MBHA-Harz, Amino- oder Carboxytentagelharze, 4-Sulfamylbenzoyl-AM-Harz usw.
- Die C-Acylierung von Dimedon mit z. B. einer monogeschützten Dicarbonsäure wird einfach über eine Carbodiimnid aktivierte, DMAP katalysierte Kondensation in trockenem DCM bewirkt. Die Entfernung der Esterschutzgruppe und die Kupplung des ersten Aminozuckerrests erzeugt ein Zucker-Linker-Konjugat, das einfach an einen aminofunktionalisierten Harzträger über eine Carbodümid-vermittelte Kondensation gekuppelt werden kann. Diese Reaktion kann unter Verwendung von konventionellen Amintests, wie z. B., TNBS oder Ninhydrin überwacht werden, um die quantitative Acylierung sicherzustellen. Alternativ kann der Linker direkt auf dem Harz synthetisiert werden, gefolgt von einer Einführung des ersten Zuckerrests an das Linker-Harz-Konjugat. Beide Verfahren sind in Fig. 3 dargestellt.
- Wenn eine etherartige Bindung zwischen dem primären Zuckerrest und dem Harz benötigt wird, dann ermöglicht eine Modifikation des Linkers mit 4-Aminobenzylalkohol zur Erzeugung der ODmab-artigen Einheit dieses Verfahren einer chemischen Ligierung, wie dargestellt in Fig. 4.
- Folgend auf die selektive Schutzgruppen-Entfernung einer Hydroxylgruppe wird der zweite Zuckerrest unter Verwendung von irgendeinem der oben bezeichneten Zuckerdonatoren gekuppelt, wie dargestellt in Fig. 8. Ein Teil des Harzes wird einfach unter Verwendung von entweder Ammoniak, Hydrazin oder einem primären Amin abgespalten, wie dargestellt in Fig. 5 und die Spaltungsmischung wird durch DSC analysiert um das Reaktionsfortschreiten zu überwachen. Der Abschluß der Reaktion wird durch Verschwinden des Monosaccharids angezeigt. Die sequentielle Schutzgruppen-Entfernung und Kupplung der folgenden Zuckerreste wird fortgesetzt, bis das gewünschte Oligosaccharid komplett ist, wie dargestellt in Fig. 1. Die Schutzgruppen werden dann entfernt und das Oligosaccharid wird von dem Harzträger unter Verwendung von entweder Ammoniak, Hydrazin oder einem primären Amin in einem geeigneten Lösungsmittel abgespalten.
- Das Harz-Linkersystem der Erfindung ist ideal für die Synthese von kombinatorischen Oligosaccharidbibliotheken, wie dargestellt in Fig. 2 und für die Immobilisierung von Mono- oder Oligosacchariden, wie dargestellt in Fig. 7.
- Die Erfindung wird nun im Detail durch in Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele beschrieben.
- Eine Mischung aus Galactosepentaacetat (38,00 g, 97,43 mmol), (Ethylthio)trimethylsilan (19,60 g, 146,15 mmol) und Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (23,60 g, 106,20 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (150 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (150 ml) verdünnt und mit 1 M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung (300 ml), Wasser (300 ml) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert. Der Rest wurde aus Hexan/Diisopropylether 1 : 1 (V/V) kristallisiert um Ethyl-2,3,4,6-tetra-o-acetyl-1-thio-β-D- galactopyranosid zu ergeben (34,00 g, 89%).
- Rf 0,43 (Hexan/EtOAc 1 : 1); FAB MS C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub4;O&sub9;S (392,3) m/z (%) 415 [M+Na]' (100), 393 [M+H]' (20), 331 (56).
- Eine Mischung aus Ethyl-2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (10 g, 25,51 mmol) und Natriummethoxid (200 mg, 3,7 mmol) wurde in abs. MeOH (100 ml) bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Amberlite IRA 120 (H+) Ionenaustauschharz neutralisiert und evaporiert. Der Rest wurde in der (1 : ?) Mischung aus Benzaldehyd/- Ameisensäure (21,2 ml) aufgenommen und bei Raumtemperatur 90 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether (200 ml) verdünnt und bei - 15ºC für 2 Stunden gehalten. Das gebildete Präzipitat wurde gesammelt und durch Chromatographie unter Verwendung von CHCl&sub3;/Ethanol 10 : 3 (V/V) gereinigt um Ethyl-4,6,0-Benzyliden-1-thio-B-D-galactopyranosid zu ergeben (8,1 g, 64,5%).
- Rf 0,64 (CHCl&sub3;/Ethanol 10 : 3).
- Ethyl-4,6,0-benzyliden-1-thio-β-D-galactopyranosid (6,90 g, 22,11 mmol) in 60 ml DMF wurde tröpfchenweise bei 0ºC zu einer Suspension aus Natriumhydrid 60% (2,65 g, 66,34 mmol) in 60 ml DMF zugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, dann wurde Benzylbromid (11,34 g, 66,34 mmol) tröpfchenweise bei 0ºC zugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Mischung wurde verdampft und Xylol (2 · 50 ml) wurde aus dem Rest destilliert. Der Rest wurde in Ether (300 ml) aufgenommen und mit 2 · 100 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet, verdampft und auf MeOH kristallisiert, und ergab Ethyl-2,3-di-O-benzyl-4,6-O-benzyliden-1-thio-B-D-galactopyranosid (8,90 g, 82%).
- Rf 0,51 Hexan/EtOAc 1 : 1 V/V; ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,55-7,25 (m, 15H, 15 Ar-H), 5,47 (s, 1H, CHAr), 4,88-4,75 (4d, 4H, 2 CH&sub2;Ar), 4,44 (d, 1H, H-1, J1,2 = 10,89 Hz), 4,30 (dd, 1H, H-6'), 4,16 (d, 1H, H-4), 05S (4,92,40) m/z (%) 515 (3,97 (dd, 1H, H-3), 3,88 (t, 1H, H-2), 3,60 (dd, 1H, H-6), 3,35 (d, 1H, H-5), 2,90-2,40 (m, 2H, CH&sub2;S), 1,33 (t, 3H, Me); FAB MS C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub2;O&sub5;S (492,40) m/z (%) 515 [M+Na]&spplus; (100), 493 [M+H]+ (41), 431 (53).
- Eine Mischung aus rohem Ethyl-2,3-Di-O-benzyl-4,6-O-benzyliden-1- thio-B-D-galactopyranosid (5,4 g, 10,97 mmol), Natriumcyanoborhydrid (6,89 g, 109,7 mmol) und einigen Körnchen Methyl-Orangeindikator wurden in THF (60 ml) bei 0ºC gerührt. THF, gesättigt mit Rd, wurde sehr langsam zugefügt, bis eine permanente rosa Farbe erhalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt, dann mit trockenem NH&sub3; neutralisiert und verdampft. Der Rest wurde in CHCl&sub3; (100 ml) aufgenommen, mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (50 ml) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rest wurde in MeOH (50 ml) gelöst, für 10 Minuten im Rückfluß gehalten und verdampft. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie gereinigt unter Verwendung von 1,2-Dichlorethan/Ethylacetat 10 : 0,5 als mobiler Phase um Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-1-thio-β-D-galactopyranosid zu ergeben (4,14 g, 75%).
- Rf 0,43 (1,2-Dichlorethan/EtOAc 10 : 0,5 V/V; ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,40-7,26 (m, 15H, 15 Ar-H), 4,88, 4,76, 4,37, 4,71 (4d, 4H, 2 CH&sub2;Ar), 4,57 (s, 2H, CH&sub2;Ar), 4,57 (s, 2H, CH&sub3;-Ar), 4,42 (d.1H, H-1, J1,2 = 9,64 Hz), 4,10 (m, 1H, H-4), (3,76 (dd, 1H, H-3), 3,67 (t, 1H, H-2), 3,55 (m, 2H, H-6), 2,75 (m, 2H, CH&sub2;S), 2,50 (bs, 1H, OH), 1,31 (t, 3H, CH&sub3;); FAB MS C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub4;O&sub5;S (494,61) m/z (%) 627 [M+Cs]&spplus; (70), 517 [M+Na]&spplus; (30), 495 [M+H]&spplus; (12).
- Eine Mischung aus Ethyl-2,3,6-tri-O-benzyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (4,14 g, 8,38 mmol), sym. Collidin (3,65 g, 30,16 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (60 ml) wurde bei 0ºC gerührt und Bromacetylbromid (2,53 g, 2,57 mmol)in CH&sub2;Cl&sub2; wurde über 15 Minuten tröpfchenweise zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml)verdünnt und mit 5%iger HCl-Lösung (3 · 30 ml)gewaschen sowie mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (30 ml). Die Lösung wurde über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rest wurde durch Chromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc 2 : 1 als mobiler Phase gereinigt um Ethyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-bromacetyl-1-thio-β-D- galactopyranosid zu ergeben (4,84 g, 94%).
- ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,40-7,25 (m, 15H, 15 Ar-H), 4,80-4,50 (m, 6H, 3 CH&sub2;Ar), 4,45 (d, 1H, H-1, J1,2 = 9,53 Hz), 2,73 (m, 211, CH&sub2;S), 1,30 (t, 3H, CH&sub3;); FAB MS C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub5;BrO&sub6;S (615,56) m/z (%) 638 [M+Na]&spplus; (15), 616 [M+H]&spplus; (32), 509 (80), 463 (21), 419 (18).
- 6 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosylazid 1,2,3,4,6-Penta-O- acetyl-galactopyranose (1,17 g, 3 mmol) wurden in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (15 ml) gelöst, dann wurden Trimethylsilylazid (416 mg, 3,6 mmol) und SnCl&sub4; (0,18 ml) unter Stickstoff zugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde darauffolgend mit CH&sub2;Cl&sub2; (40 ml) verdünnt, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rest wurde durch Chromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc 8 : 7 V/V als mobiler Phase gereinigt um 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosylazid zu ergeben (1,05 g, 94%).
- Rf 0,74 (Hexan/EtOAc' 8 : 7 V/V); ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 5,41 (d, 1H, H-4), 5,17 (t, 1H, H-2), 5,04 (dd, 1H, H-3), 4,60 (d, 111, H-1, J1,2 = 10.09 Hz), 4,19 (m, 2H, H-6), 4,00 (m, 1H, H-5), 2,15-1,9B (45, 12H, 4 OAc); FAB MS C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub9;N&sub3;O&sub9; (373,32)m/z (%) 396 [M+Na]&spplus; (100), 374 [M+H]&spplus; (35), 331 (23).
- Eine Mischung von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosylazid (19,35 g, 51,79 mmol) und Natriummethoxid (200 mg, 3,7 mmol) wurden in abs. MeOH (100 ml) bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Amberlite IRA 120 (H+) Ionenaustauschharz neutralisiert und verdampft. Der Rest wurde in dar Mischung aus Benzaldehyd/Ameisensäure (1 : 1) (52 ml) aufgenommen und bei Raumtemperatur 90 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und der Rest wurde in Ether (60 ml) aufgenommen und bei -15ºC für 2 Stunden gehalten. Das gebildete Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und bei Raumtemperatur getrocknet und ergab 4,6-O-Benzyliden-β-D-galactopyranosylazid (11,8 g, 78%).
- Rf 0,64 (CHCl&sub3;/Ethanol 10 : 1,5).
- 4,6-O-Benzyliden-β-D-galactopyranosylazid (11,8 g, 40,27 mmol) in 60 ml DMF wurden tröpfchenweise bei 0ºC zu einer Suspension von Natriumhydrid 60% (6,21 g, 155,38 mmol) in 60 ml DMF zugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, dann wurde Benzylbromid (26,57 g, 155,38 mmol) tröpfchenweise bei 0ºC zugefügt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde verdampft und Xylol (2 · 50 ml) wurde aus dem Rest destilliert. Der Rest wurde in Ether (500 ml) aufgenommen und mit 2 · 100 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft und ergab Methyl-2,3-di-O-benzyl-4,6-O- benzyliden-β-galactopyranosylazid als Rohrest (19,4 g).
- Eine Mischung aus rohem 2,3-Di-O-benzyl-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosylazid (9,00 g, 19,02 mmol), Natriumcyanoborhydrid (12,00 g, 190,2 mmol) und einigen Körnchen Methylorangeindikator wurden in THF (80 ml) bei 0ºC gerührt. THF, gesättigt mit HCl, wurde sehr langsam zugefügt bis eine permanente rosa Farbe erhalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt, dann mit trockenem NH&sub3; neutralisiert und verdampft. Der Rest wurde in CHCl&sub3; (100 ml) aufgenommen, mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (50 ml) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rest wurde in MeOH (50 ml) gelöst und unter Rückfluß 10 Minuten gehalten und verdampft. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie unter Verwendung von 1,2-Dichlorethan/EtOAC 10 : 0,4 als mobiler Phase gereinigt und ergab 2,3,6-Tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosylazid (6,50 g, 72%).
- Rf 0,42 (1,2-Dichlorethan/EtOAc 10 : 0,4 V/V); 1H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,40 (m, 15H, 15 Ar-H), 4,90-4,55 (m, 6H, 3 CH&sub2;Ar), 4,06 (m, ZH, H-4), (3,82-3,70 (m, 3H, H-3, H-2, H-5), 3,65 Qdd, 1H, H-6'), 3,60 (d, 1H, H-1, J1,2 = 8,64 Hz), 3,51 (dd, 1-H, H-6); FAB MS C&sub2;&sub7;H&sub2;&sub9;N&sub3;O&sub5; (475,40) m/z (%) 608 [M+Cs]&spplus; (10), 498 [M+Na]&spplus; (25), 433 (75), 341 (20).
- Eine Mischung aus 2,3, 6-Tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosylazid (3,00 g, 6,31 mmol), Propan-1,3-dithiol (3,40 g, 31,50 mmol) und Triethylamin (3,50 g, 31,5 mmol) in MeOH (31 ml) wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur 10 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und durch Chromatographie unter Verwendung von CHCl&sub3;/EtOH 10 : 0,3 V/V gereinigt um 2,3,6-Tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosylamin zu ergeben (2,66 g, 94%); Rf 0,38 (CHCl&sub3;/EtOH 10 : 0,3 V/V); FAB MS C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub1;NO&sub5; (44,33) m/z (%) 472 [M+Na]&spplus; (75) 450 [M+H]&spplus; (100).
- Eine Mischung aus Benzyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (932 mg, 2,60 mmol), 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin in CH&sub2;Cl&sub2; (2,0 ml) wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft, durch Chromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc 1 : 1 als mobiler Phase gereinigt um N-(Benzyl-6- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat-6-yl) 2,3,4,6-Tetra-Oacetyl-β-D-glucopyranosylamin zu ergeben (1,70 g, 95%);
- Rf 0,32 (Hexan/EtOAc 1 : 1 V/V); ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,37-7,26 (m, 5H, 5 Ar-H), 5,40-5,00 (m, 7H, 7 Zuckerprotonen), 3,10, 2,85 (2t, 4H, 2 CH&sub2;), 2,38 (25, 4H, Dde 2 CH&sub2;), 2,06-1,98 (45, 12H, 4 OAc), 1,80 (m, 4H, 2 CH&sub2;), 1,02, 1,00 (25, 6H, Dde 2CH&sub3;); FAB MS C&sub1;&sub5;H&sub4;&sub5;NO&sub1;&sub3; (687,23) m/z (%) 710 [M+Na]&spplus; (35), 688 [M+H]&spplus; (100), 356 (60).
- N-(Benzyl-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat-6-yl) 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin (1,27 g, 1,84 mmol) wurde über Pd/C (10%) (200 mg) in MeOH (20 ml) bei Raumtemperatur für 10 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abgefiltert und das Filtrat wurde verdampft und unter Verwendung von CHCl&sub3;/MeOH 10 : 0,5 V/V als mobiler Phase chromatographiert um N-(6-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure-6-yl) 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin zu ergeben (1,10 g, 98%).
- Rf 0,38 (CHCl&sub3;/MeOH 10 : 0,5 V/V); ¹NMR (CDCl&sub3;) δ 5,40-5,00 (m, 7H, 7 Zuckerprotonen), 3,15, 2,86 (2t, 4H, 2 CH&sub2;), 2,45 (25, 4H, Dde 2 CH&sub2;), 2,10- 1,98 (45, 12H, 4 OAc), 1,80-1,65 (m, 4H, 2 CH&sub2;), 1,02, 1,00 (25, 6H, Dde 2 CH&sub3;); FAB MS C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub9;NO&sub1;&sub3; (597,33) m/z (%) 620 [M+Na]&spplus; (55), 598 [M+H]&spplus; (100).
- Reaktion 11 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass Methyl-6-Hydroxy-6-(4,4-dimethy1-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat anstelle von Benzyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat verwendet wurde. Ertrag: 92%;
- Rf 0,28 (Hexan/EtOAc 1 : 1 V/V); FAB MS C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub1;NO&sub1;&sub3; (611,45) m/z (%) 624 [M+Na]&spplus; (100), 612 [M+H]&spplus; (34).
- Reaktion 11 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dass t-Butyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat anstelle von Benzyl-6-hydroxy-6(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat verwendet wurde. Ertrag: 96%;
- Rf 0,35 (Hexan/EtOAc 1 : 1 V/V); FAB MS C&sub1;&sub2;H&sub4;&sub7;NO&sub1;&sub3; (653,37) m/z (%) 676 [M+Na]&spplus; (80), 677 [M+H]&spplus; (100)
- 15 Benzyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexyliden)-hexanoat Zu einer gerührten Lösung aus Monobenzyladipat (2,36 g, 10 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) wurden 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion (1,4 g, 10 mmol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (2,1 g, 10,1 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (1,22 g, 10 mmol) zugefügt. Man ließ die resultierende Lösung bei Raumtemperatur 18 Stunden rühren. Die Lösung wurde gekühlt und gefiltert, um den ausgefällten N,N'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat wurde verdampft und der Rest wurde in EtOAc (50 ml) gelöst und mit 1 M KHSO&sub4; gewaschen. Der organische Extrakt wurde mit Sole (92 · 10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und verdampft um ein weiß/gelbes amorphes Pulver zu ergeben. Flash-Silikachromatographie (EtOAc/Hexan 1 : 2 V/V) ergab Benzyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (3,00 g, 84%) als weißen kristallinen Feststoff.
- ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 18,10 (s, 1H, OH), 7,30 (s, 5H, 5Ar-H), 5,06 (s, 2H, CH&sub2;Ar), 3,00 (t, 2H, CH&sub2;), 2,47 (s, 2H, Dde CH&sub2;), 1,65 (m, 4H, 2 CH&sub2;), 1,01 (s, 6H, 2 CH&sub3;); FAB MS C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub6;05 (358,18) m/z (%) 359 [M+H]&spplus; (100), 267 (40); HRMS (FAB) Ertrag: m/z 359,1858 berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub7;O&sub5;:
- (M+H), 359,1850.
- 16 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclo-hexyliden)-hexansäure Benzyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (1,50 g, 4,19 mmol) wurde über Pd/C (10%) (150 mg) in MeOH (20 ml) bei Raumtemperatur für 10 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abgefiltert und das Filtrat wurde evaporiert und ergab 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure (1,10 g, 98%);
- Rf 0,35 (Hexan/EtOAc 2 : 1 V/V); FAB MS C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub0;O&sub5; (268,12) m/z (%) 313 [M+2Na]&spplus; (34), 291 [M+Na]&spplus; (100), 269 [M+H]&spplus; (16),
- 17 Methyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexyliden)-hexanoat Reaktion 15 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dass Monomethyladipat anstelle von Monobenzyladipat verwendet wurde und ergab dann die Verbindung 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (2,39 g, 85%). Rf 0,32 (EtOAc/Hexan 1 : 2 V/V) FAB MS C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;O&sub5; (282,22) m/z (%) 305 [M+H]&spplus; (66).
- Reaktion 15 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dass Mono-t-butyladipat anstelle von Monobenzyladipat verwendet wurde und es ergab sich t-Butyl-6- hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (2,62 g, 81%). Rf 0,36 (EtOAc/Hexan 1 : 2 V/V) FAB MS C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub8;O&sub3; (324,41) m/z (%) 347[M+H]&spplus; (100), 325 [M+H]&spplus; (43), 267 (80).
- t-Butyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (100 mg, 0,30 mmol) wurde gelöst in CH&sub2;Cl&sub2;/TFA 1 : 1 Mischung (2 ml) und wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und ergab 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocycla-hexyliden)-hexansäure (0,81 g, 98%).
- Eine Mischung aus Glutarsäureanhydrid (2,28 g, 20 mmol), Dimedon (2,8 g, 20 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (3,99 g, 30 mmol) in abs. Pyridin (50 ml) wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und der Rest wurde in CHCl&sub3; (100 ml) aufgenommen, mit 5%iger HCl-Lösung (3 · 25 ml) gewaschen, mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rest wurde durch Chromatographie unter Verwendung von Ether/Essigsäure (10 ml : 1 Tropfen) als mobiler Phase gereinigt um 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure zu ergeben (2,28 g, 45%).
- Eine Mischung von 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)- hexansäure (400 mg, 1,49 mmol), 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin (259 mg, 0,74 mmol) in absolutem Ethanol wurde im Rückfluß 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und unter Verwendung von CHCl&sub3;/MeOH 10 : 0,5 V/V chromatographiert um N-(6-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure-6-yl) 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin zu ergeben (410 mg, 92%).
- Reaktion 21 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dass 2,3,6-Tri-Obenzyl-β-D-galactopyranosylamin anstelle von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosylamin verwendet wurde und es ergab sich N-(6-(4,4-Dimethyl- 2,6-dioxocyclo-hexyliden)-hexansäure-6-yl) 2,3,6-Tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosylamin (299 mg, 90%).
- Rf 0,34 (CHCl&sub3;/MeOH 10 : 0,1 V/V) FAB MS C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub3;NO, (613,41) m/z (%) 649 [M+2Na]&spplus; (34), 626 [M+Na]&spplus; (100), 614 [M+H]&spplus; (65).
- Reaktion 21 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dass 4-Aminobenzylalkohol anstelle von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin verwendet wurde und es ergab sich N-(6-(4,4-Dimethyl-2, 6-dioxocyclohexyliden)- hexansäure-6-yl) 4-Aminobenzylalkohol (259 mg, 94%).
- Rf 0,40 (EtOAc/Hexan/Essigsäure 2 : 1 : 0,1 V/V/V); FAB MS C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub7;NO&sub5; (373,43) m/z (%) 418 [M+2Na]&spplus; (24), 396 [M+Na]&spplus; (100), 374 [M+H]&spplus; (35).
- Eine Mischung aus t-Butyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (400 mg, 1,23 mmol) und 4-Aminobenzylalkohol (605 mg, 4,92 mmol) in abs. EtOH wurde im Rückfluß 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und durch Chromatographie unter Verwendung von CHCl&sub3;/MeOH 9 : 1 als mobiler Phase gereinigt um N-(t-Butyl-6-(4,4-dimethyl- 2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat-6-yl) 4-Aminobenzylalkohol zu ergeben (395 mg, 75%).
- Re 0,52 (CHCl&sub3;/MeOH 9 : 1 V/V) FAB MS C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub5;NO&sub5; (429,53) m/z (%) 452 [M+Na]&spplus; (100), 430 [M+H]&spplus; (32), 372 (64).
- Eine Mischung von N-(t-Butyl-6-(4,4-dimethyl-2, 6-dioxocyclohezyliden)-hexanoat-6-yl) 4-Aminobenzylalkohol (500 mg, 1,16 mmol) und Trichloracetonitril (503 mg, 3,49 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) wurde bei 0ºC gerührt und 1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (5 mg, 0,03 mmol) wurde zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten bei 0ºC gerührt, bei Raumtemperatur für 2 Stunden, dann verdampft. Der Rest wurde durch Chromatographie unter Verwendung von Etokc/Hexan 1 : 1 als mobiler Phase gereinigt um N-(t-Butyl-6- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat-6-yl) 4-Aminobenzyltrichloracetimidat zu ergeben (580 mg, 87%);
- Rf 0,41 (EtOAc/Hexan 1 : 1 V/V); FAB MS C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub5;C&sub1;&sub3;N&sub2;O&sub5; (573,94) m/z (%) 595 [M+Na]&spplus; (100), 753 [M+H]&spplus; (40), 515 (39), 430 (54).
- N-(t-Butyl-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat-6-yl)-4-aminobenzyltrichloracetimidat (400 mg, 0,70 mmol) wurde bei 20ºC unter Stickstoff zu einer Lösung von Benzyl-2-Acetamido-3-O-acetyl-6-O-benzyl-2-deoxyα-D-glucopyranosid (155 mg, 0,35 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (6 ml)zugefügt. Trifluormethansulfonsäure in Ether (0,1 M, 0,06 ml) wurde zugefügt und die Mischung wurde 30 Minuten bei 20ºC gerührt. Die Reaktion wurde mit 5% NaHCO&sub3;-Lösung (0,25 ml) beendet. Nach Filtration der Mischung und Verdampfung des Filtrats wurde der Rohrest durch Chromatographie unter Verwendung von EtOAc/Hexan 2 : 1 V/V als mobiler Phase gereinigt um Benzyl-2-acetamido- 3-O-acetyl-6-O-benzyl-2-deoxy-4-O-[N-(t-butyl-6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat-6-yl)-4-aminobenzyl]-α-D-glucopyranosid zu ergeben (210 mg, 71%).
- Rg 0,37 (EtOAc/Hexan 2 : 1 V/V); FAB MS C&sub4;&sub9;H&sub6;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub1; (855,01) m/z (%) 877 [M+Na]&spplus; (100), 855 [M+H]&spplus; (35), 797 (73).
- N-(t-Butyl-6-(4,4-dimethyl-2, 6-dioxocycloheryliden)-hezanoat-6-yl)-4-aminobenzyltrichloracetamid (400 mg), 0,70 xmnol) wurde bei 20ºC unter Stickstoff zu einer Lösung aus 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranose (121 mg, 0,35 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (6 ml) zugefügt. Trifluormethansulfonsäure in Ether (0,1 M, 0,06 ml) wurde zugefügt und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 20ºC gerührt. Die Reaktion wurde mit 5% NaHCO&sub3;-Lösung (0,25 ml) beendet. Nach Filtration der Mischung wurde das Filtrat verdampft. Der nicht gereinigte Rest wurde in CH&sub2;Cl&sub2;/TFA Mischung (1 : 1) (5 ml) aufgenommen, bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und verdampft. Die resultierende Säure wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gelöst, N,N'-Diisopropylcarbodiimid (128 mg, 1 mmol) wurde zugefügt und die Mischung wurde leicht mit MBHA-Harz (100 mg) (geschwollen in DMF für 20 Minuten) für 30 Minuten bewegt.
- Eine Mischung aus N-[Benzyl-(6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyalohexyliden)-hexanoat]-6-yl-4-aminobenzylalkohol (500 mg, 1,08 mmol), Methyl-2,3,4,6-tetra- O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranosid (400 mg, 1,08 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt und DMTST (835 mg, 3,24 mmol) wurde zugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (3 ml) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Der Rest wurde durch Chromatographie unter Verwendung von Hexan/- EtOAc 1 : 1 V/V als mobiler Phase gereinigt um [N-[Benzyl-6-(4,4-dimethyl- 2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat]-6-yl-4-aminobenzyl]-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid zu erhalten (610 mg, 75%).
- Rf (Hexan/EtOAc 1 : 1 V/V); FAB MS C&sub4;&sub2;H&sub5;&sub1;NO&sub1;&sub4; (793,83) m/z (%) 816 [M+Na]&spplus; (100), 794 [M+H]&spplus; (25), 702 (66).
- [N-[Benzyl-(6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat]-6-yl- 4-aminobenzyl]-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid (500 mg, 0,63 mmol) wurde über Pd/C (10%) (200 mg) in MeOH (20 ml) bei Raumtemperatur für 10 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abgefiltert und das Filtrat wurde verdampft. Der Rest wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gelöst, N,N'-Diisopropylcarbodiimid (128 mg, 1 mmol) wurde zugefügt und die Mischung wurde leicht mit MBHA-Harz (200 mg) (vorgeschwollen in DMF für 20 Minuten) für 30 Minuten bewegt.
- Eine Mischung von t-Butyl-6-hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2, 6-dioxocyclohexyliden)-hexanoat (400 mg, 1,23 mmol) und 2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosylamin (276 mg, 0,61 mmol) in abs. EtOH (10 ml) wurde im Rückfluß 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft. Der Rest wurde in CH&sub2;Cl&sub2;/TFA-Mischung (1 : 1) (10 ml) aufgenommen und bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und durch Chromatographie unter Verwendung von CHCl&sub3;/MeOH 10 : 0,1 V/V als mobile Phase gereinigt um N- (6-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure-6-yl)-2,3,6-tri-O- benzyl-β-D-galactopyranosylamin zu ergeben (280 mg, 73%).
- Rf 0,34 (CHCl&sub3;/MeOH 10 : 0,1 V/V) FAB MS C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub3;NO&sub7; (613,41) m/z (%) 649 [M+2Na]&spplus; (34), 626 [M+Na]&spplus; (100), 614 [M+2H]&spplus; (65).
- Synthese eines voll geschützten Glycosylamin - Ddh-Harz-Konjugats, wobei die Harzkupplung der letzte Schritt ist (Fig. 3)
- MBHA-Harz (Substitutionsverhältnis: 0,42 mmol/g) (200 mg), das eine Gesamtamin-Funktionalität von 0,084 mmol trug, wurde für 20 Minuten in DMF geschwollen. Das Harz wurde dann mit frischem DMF gewaschen und N-(6-(4,4- Dimethyl-2,6-dioxocyclohexlyliden)-(hexansäure-6-yl)-2,3,4,6-tetra-O- acetyl-β-D-glucopyranosylamin (200 mg, 4 Äquivalente) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid (53 ul, 4 Äquivalente) wurden in DMF (5 ml) zugefügt und das Harz wurde 30 Minuten leicht bewegt. Der TNBS-Test war leicht positiv, so wurde unter Verwendung der obigen Bedingungen eine doppelte Kupplung durchgeführt, wobei diesmal ein negatives TNBS-Testergebnis erzeugt wurde. Das Harz wurde mit DMF, Methanol und schließlich Ether gewaschen. Das Harz ließ man dann im Vakuum über KOH über Nacht trocknen.
- Benzyl-2-acetamido-3-O-acetyl-6-O-benzyl-2-deoxy-4-O-[N-(6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-hexansäure-6-yl)-4-aminobenzyl)-a-D-glucopyranosid (290 mg, 0,33 mmol) wurde gelöst in CH&sub2;Cl&sub2;/TFA-Mischung (1 : 1) und bei Raumtemperatur 1 Stunde geführt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft und das Verfahren 31 wurde verwendet um die Verbindung an das MBHA- Harz zu binden.
- MBHA-Harz (100 mg), das eine Gesamt-Amin-Funktionalität von 0,042 mmol trug, wurde in DMF 20 Minuten geschwollen. Das Harz wurde dann mit frischem DMF gewaschen und N-(6-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)- hexansäure-6-yl)-4-aminobenzylalkohol (63 mg, 4 Äquivalente) und 1-Isobutyloxycarbonyl-2-isobutyloxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ) (51 mg, 4 Äquivalente) wurden in DMF (5 ml) zugefügt und das Harz wurde 24 Stunden lang leicht bewegt. Der TNBS-Test war leicht positiv, so dass unter Verwendung der obigen Bedingungen eine Doppeltkupplung durchgeführt wurde, was dann zu einem negativen TNBS-Testergebnis führte. Das Harz wurde mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- Das Harz aus Beispiel 33 wurde mit Trichloracetonitril (50 mg, 0,33 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (1 ml) behandelt, bei 0ºC gerührt und 1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (1 mg, 0,003 mmol) wurde zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0ºC 90 Minuten gerührt, bei Raumtemperatur 2 Stunden, dann wurde das Harz abgefiltert und mit DMF gewaschen (5 · 10 ml).
- Das Harz aus Beispiel 34 wurde bei Raumtemperatur zu einer Lösung aus Benzyl-2-acetamid-3-O-acetyl-6-O-benzyl-2-deoxya-D-glucopyranosid (75 mg, 0,16 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (1 ml) zugefügt. Trifluormethansulphonsäure in Ether (0,1 M, 60 ul) wurde zugefügt und die Mischung wurde 30 Minuten gerührt. Die Reaktion wurde mit Triethylamin (120 ul) beendet und mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- MBHA-Harz (1,0 g), das eine Gesamtaminfunktionalität von 0,42 mmol trug, ließ man 20 Minuten in DMF schwellen. Das Harz wurde dann mit einer Mischung aus Adipinsäure (1,41 g, 10 mmol) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) 60 Minuten behandelt. Eine zweite Kupplung wurde in DMF durchgeführt um einen negativen Ninhydrintest zu erhalten. Das Harz wurde mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- 2u dem Harz aus Beispiel 36 wurde eine Mischung aus 5,5-Dimethyl-1,3- cyclohezcandion (280 mg, 2,0 mmcl), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (283 mg, 2,00 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (244 mg, 2,00 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) zugefügt und es wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt. Das Harz wurde mit DMF gewaschen (5 · 10 ml).
- Das Harz aus Beispiel 37 wurde mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin (712 mg, 2,00 mmol) in DMF (5 ml) bei Raumtemperatur für 2 Tage umgesetzt. Das Harz wurde mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- Das Harz aus Beispiel 37 wurde mit 2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosylamin (900 mg, 2,00 mmol) in abs. EtOH im Rückfluß 2 Stunden umgesetzt. Das Harz wurde mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- Eine Mischung des Harzes aus Beispiel 37 und 4-Aminobenzylalkohol (246 mg, 2,00 mmol) in abs. EtOH wurde im Rückfluß 2 Stunden gerührt, dann mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- Das Harz aus Beispiel 38 (10 mg) wurde mit gesättigter NH&sub3;/MeOH Lösung (0,2 ml) bei Raumtemperatur 5 Minuten behandelt. Das Harz wurde abgefiltert, das Filtrat wurde verdampft, was 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin in quantitativem Ertrag ergab.
- Spaltung eines voll geschützten Glycosylamin - Ddh-Harz-Konjugats, was zu einem voll geschützten reduzierenden Zucker führt.
- Das Harz aus Beispiel 38 (10 mg) wurde mit gesättigter NH&sub3;/MeOH-Lösung (0,2 ml) bei Raumtemperatur für 5 Minuten behandelt. Das Harz wurde abgefiltert, das Filtrat wurde verdampft. Der Rest wurde in einer Mischung aus Aceton/Wasser 1 : 1 V/V (0,2 ml) gelöst, mit Essigsäure (20 ul) angesäuert und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Lösung wurde verdampft, was 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranose in quantitativem Ertrag ergab.
- Das Harz aus Beispiel 38 wurde leicht mit Natriummethoxid (200 mg, 3,70 mmol) in abs. MeOH (5 ml) bei Raumtemperatur für 1 Stunde bewegt. Das Harz wurde mit abs. MeOH (5 · 10 ml), DMF (5 · 10 ml), Ether (5 · 10 ml) gewaschen und unter Hochvakuum 1 Stunde getrocknet, was das Harz gebundene nicht geschützte β-D-Glucopyranosylamin ergab. Eine Probe des Harzes (5 mg) wurde durch NH&sub3;/MeOH (Beispiel 41) gespalten und das resultierende Produkt wurde durch DSC und Massenspektroskopie analysiert, was eine quantitative Schutzgruppenentfernung belegte.
- Eine Mischung des Harzes aus Beispiel 43 und Ethyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1-thio-β-L-fucopyranosid (950 mg, 2 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde mit Dimethyl-(methylthio)-sulfoniumtrifluormethansulphonat (DMTST) (1,50 g, 5,81 mmol) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Das Harz wurde mit trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (5 · 10 ml) gewaschen.
- Spaltung einer Bibliothek aus Di-, Tri- und Tetrasacchariden aus dem Harz, ergebende Glycosylamin von Oligosacchariden (Fig. 12) 45 Eine Mischung aus Mono-, Di- und Tri-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-α,β-L- fucopyranosyl) (1→2), (1→3), (1→4), (1→6)-β-D-glucopyranosylamin Das Harz aus Beispiel 44 wurde mit NH&sub3;/MeOH (10 ml) für 5 Minuten behandelt. Das Harz wurde abgefiltert und das Filtrat wurde verdampft, was eine Mischung aus Disacchariden, Trisacchariden und Tetrasacchariden ergab.
- FAB MS Disaccharide C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub1;NO&sub9; (595,66), Trisaccharide C&sub6;&sub0;H&sub6;&sub9;NO&sub1;&sub3; (1012,16), Tetrasaccharide C&sub8;&sub7;H&sub9;&sub7;NO&sub1;&sub7; (1429,66) (m/z (%) 618 [Mdi+Na]&spplus; (41), 596 [Mdi+Na]&spplus; (57), 1034 [Mtrs+Na]&spplus; (56), 1012 [Mtri+Na]&spplus; (100), 1450 [Mtetra+Na]&spplus; (8), 1428 [Mtetra+Na]&spplus; (10).
- Eine Mischung des Harzes aus Beispiel 39 und Ethyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-bromacetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (1,25 g, 2 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde mit Dimethyl(methylthio)sulphonium-trifluormethansulfonat (DMTST) (1,50 g, 5,81 mmol) bei Raumtemperatur 1 Stunde behandelt. Das Harz wurde mit trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (5 · 10 ml) gewaschen.
- Das Harz aus Beispiel 46 wurde leicht mit Natriummethoxid (200 mg, 3,70 mmol) in abs. MeOH (5 ml) bei Raumtemperatur für 1 Stunde bewegt. Das Harz wurde mit abs. MeOH (5 · 10 ml), DMF (5 · 10 ml), Ether (5 · 10 ml) und unter Hochvakuum 1 Stunde getrocknet, was das harzgebundene teilweise nicht geschützte Disaccharid ergab. Eine Probe des Harzes (5 mg) wurde mit NH&sub3;/MeOH (Beispiel 41) gespalten und das resultierende Produkt wurde durch DSC und Massenspektroskopie analysiert, was die quantitative Schutzgruppenentfernung belegte.
- Spaltung eines zweiten Zucker-Glycosylamin-Ddh-Linker-Harz-Konjugats, ergebend ein Glycosylamin eines Disaccharids (Fig. 13) 48 O-(2,3,6-tri-O-benzyl-α,β-D-galactopyranosyl) (1→4)-2,3,6-Tri-Obenzyl-β-D-galactopyranosylamin
- Das Harz aus Beispiel 47 wurde mit NR3/MeOH (10 ml) 5 Minuten behandelt. Das Harz wurde abgefiltert und das Filtrat wurde verdampft, was eine anomere Mischung aus Disacchariden ergab. FAB MS C&sub5;&sub4;H&sub5;&sub9;NO&sub1;&sub0; (882,01) (m/z (%) 904 [M+Na]&spplus; (100), 880 [MeH]&spplus; (41).
- Das Harz aus Beispiel 29 wurde mit NH&sub3;/MeOH (5 ml) über Nacht behandelt. Das Harz wurde abgefiltert und das Filtrat wurde verdampft, ergebend 4-Aminobenzyl-β-D-glucopyranosid.
- R£ 0,55 (CHCl&sub3;/MeOH/H&sub2;O 10 : 4 : 0,5 V/V/V); FAB MS C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub9;NO&sub5; (269,28) m/z (%) 402 [M+Cs]+ (25), 292 [M+Na]&spplus; (50), 270 [M*H]&spplus; (18).
- 4-Aminobenzyl-β-D-glucopyranosid (110 mg, 0,40 mmol) wurde über Pd/C (10%) (50 mg) in MeOH (5 ml) bei Raumtemperatur 4 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abgefiltert und das Filtrat wurde verdampft, was D-Glucose in quantitativem Ertrag ergab.
- Das Harz aus Beispiel 37 wurde mit O-[O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl (1→4))-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl (1→4)]-2,3,6- tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosylamin (1,80 g, 2,00 mmol) in DMF (5 ml) bei Raumtemperatur 2 Tage umgesetzt. Das Harz wurde mit DMF (5 · 10 ml) gewaschen.
- Eine Mischung des Harzes aus Beispiel 37 und Glucosamin (350 mg, 2 mmol) in DMF (20 ml) wurde bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt. Das Harz wurde abgefiltert, mit DMF/H&sub2;O 4 : 1 (5 · 10 ml), DMF (Silo ml), MeOH (5 · 10 ml), Ether (5 · 10 ml) gewaschen und unter Hochvakuum über Nacht getrocknet.
- Es wird für den Fachmann auf dem Gebiet klar sein, dass obwohl die Erfindung im Detail zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, verschiedene Modifikationen und Veränderungen der Ausführungsformen und Verfahren wie hier beschrieben, durchgeführt werden können, ohne dadurch vom Umfang des erfinderischen Konzepts, das in dieser Erfindung offenbart ist, abzuweichen.
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Claims (26)
1. Träger für die Festphasensynthese von Oligosacchariden, wobei der
Träger folgendes umfasst:
(a) ein Harz,
(b) einen Linker, kovalent befestigt an dem Harz, und
(c) ein oder mehrere Saccharidgruppen, kovalent über einen Linker an
dem Harz befestigt,
wobei der Linker eine 2-substituierte 1,3-Dioxocycloalkanverbindung
ist, und
wobei der Träger die allgemeine Formel (I) aufweist:
worin R¹ und R² dieselben oder unterschiedlich sein können und
jeweils Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl bedeuten; vorzugsweise sind sowohl R¹
als auch R² Methyl;
R' ist ein Aminozucker, ein Glycosylamin oder ein Glycosylamin eines
Oligosaccharids; ein Mono- oder Oligosaccharid, gekoppelt über eine Alkyl-,
substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Cycloalkyl- oder
substituierte Cycloalkyl-aminogruppe; oder ein Mono- oder Oligosaccharid,
gekoppelt über eine Carboxyalkyl-, substituierte Carboxyalkyl-,
Carboxyaryl-, substituierte Carboxyaryl-, Carboxycycloalkyl- oder
substituierte Carboxycycloalkyl-aminogruppe und
R" ist eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-,
Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-Abstandsgruppe, die direkt an
einen Harzträger gekoppelt ist oder die optional an den Harzträger über
eine kovalente Bindung gekoppelt sein kann, die gegenüber den Bedingungen
der Oligosaccharidsynthese und -spaltung stabil ist.
2. Träger gemäss Anspruch 1, worin sowohl R¹ als auch R² Methyl sind.
3. Träger gemäss Anspruch 1 oder 2, worin R' eine
Oligosaccharid-O-CH&sub2;- (C&sub6;H&sub4;)-NH-, Monosaccharid-O-CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)NH-,
Aminooligosaccharid-CO&sub2;CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)NH- oder eine Aminomonosaccharid-CO&sub2;CH&sub2;-
(C&sub6;H&sub4;)-NH-Gruppe ist.
4. Träger gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die kovalente
Bindung an das Harz durch eine -CONH-, -O-, -S-, -COO-, -CH=N-, -NHCONH-,
- NHCSNH- oder -NHNH-Gruppierung bereitgestellt wird.
5. Träger gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Linker
funktionalisiertes Dde, Ddh oder ODMab ist.
6. Träger gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend ein Harz,
einen Linker und ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid, ein Aminosaccharid
oder ein Aminooligosaccharid.
7. Träger für die Festphasensynthese, umfassend ein Harz und einen
Linker, worin der Träger ein 2-substituiertes 1,3-Dioxocycloalkan der
allgemeinen Formel (II) ist:
worin
X OH ist;
R¹ und R² können dieselben oder unterschiedlich sein und bedeuten
jeweils Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl; und
R" ist eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-,
Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-Abstandsgruppe, die direkt an
einen Harzträger gekoppelt ist oder die optional an den Harzträger über
eine kovalente Bindung gekoppelt sein kann, die gegenüber den Bedingungen
einer Oligosaccharidsynthese und -spaltung stabil ist.
8. Träger gemäss Anspruch 7, worin sowohl R¹ als auch R² Methyl sind.
9. Träger gemäss Anspruche 7 oder Anspruch 8, worin die kovalente
Bindung an das Harz durch eine -CONH-, -O-, -S-, -COO-, -CH=N-, -NHCONH-,
-NHCSNH- oder -NHNH-Gruppierung bereitgestellt wird.
10. Linker-Saccharidkomplex, worin die Linkergruppe wie in Anspruch 1
oder Anspruch 2 definiert ist und wobei das Saccharid wie in Anspruch 1
oder Anspruch 6 definiert ist.
11. Verbindung, die funktionelle Gruppen trägt, die geeignet sind,
ein primäres Amin an ein Harz über kovalente Bindungen zu befestigen, die
stabil gegenüber den Bedingungen der Oligosaccharidsynthese und -spaltung
sind, wobei die Verbindung die allgemeine Formel (III) aufweist:
worin
X OH ist;
R¹ und R² können dieselben oder unterschiedlich sein und bedeuten
jeweils Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl; und
R" ist eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-,
Cycloalkyl- oder substituierte Cycloalkyl-Abstandsgruppe, die eine
Funktionalität trägt, die mit einem funktionalisierten Harz reagieren kann.
12. Verbindung gemäss Anspruch 11, worin sowohl R¹ als auch R² Methyl
sind.
13. Verbindung gemäss Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin die
Funktionalität an R" eine Carboxylgruppe ist.
14. Verbindung gemäss Anspruch 11, die 6-Hydroxy-6-(4,4-dimethyl-2,6-
dioxocyclohexyliden)-hexansäure oder ein Ester davon ist.
15. Verbindung gemäss Anspruch 14, worin der Ester ein Benzyl-,
Methyl- oder t-Butylester ist.
16. Träger gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Linker eine
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 11 bis 15 ist.
17. Träger gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, worin der Linker eine
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 11 bis 15 ist.
18. Linker-Saccharidkomplex gemäss Anspruch 10, worin der Linker eine
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 11 bis 15 ist.
19. Kit für die Festphasensynthese oder die kombinatorische Synthese
von Oligosacchariden, umfassend:
(a) einen Harz-Linker-Saccharidträger gemäss einem der Ansprüche 1
bis 5 oder 16,
(b) einen Linker-Saccharidkomplex gemäss Ansprüchen 10 oder 17, oder
(c) einen Harz-Linkerträger gemäss einem der Ansprüche 7 bis 17,
und gegebenenfalls ebenfalls umfassend ein oder mehrere Schutzmittel,
Schutzgruppen entfernende Mittel und/oder Lösungsmittel, die für die
Festphasen- oder kombinatorische Synthese geeignet sind.
20. Verfahren einer Festphasensynthese von Oligosacchariden,
umfassend den Schritt der sequentiellen Verbindung von Mono- oder
Oligosaccharidgruppen an einen Träger, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9
oder 16 definiert.
21. Syntheseverfahren eines Trägers gemäss der allgemeinen Formel
(I), wie in Anspruch 1 definiert, umfassend den Schritt der C-Acylierung
einer 2-substituierten 1,3-Dioxocyclohexanverbindung mit einer
Dicarbonsäure und
gegebenenfalls Umsetzung des Produkts der C-Acylierungsreaktion mit
4-Aminobenzylalkohol zur Bildung des 4-Aminobenzylderivats.
22. Verfahren gemäss Anspruch 21, worin die Dicarbonsäure durch die
Esterbildung monogeschützt ist.
23. Verfahren gemäss Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die
C-Acylierungsreaktion mit Carbodiimid aktiviert und durch
N,N'-Dimethylaminopyridin katalysiert wird.
24. Syntheseverfahren eines Harz-Linkerträgers gemäss einem der
Ansprüche 7 bis 9, umfassend den Schritt des Schwellens eines Harzes in
einem geeigneten Lösungsmittel, Behandeln des geschwollenen Harzes mit
einer Dicarbonsäure und Umsetzen des so erzeugten Produkts mit einer
2-substituierten 1,3-Dioxocycloalkanverbindung.
25. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 21 bis 24, worin die
2-substituierte 1,3-Dioxocycloalkanverbindung 5,5-Dimethyl-1,3-
cyclohexandion ist.
26. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 21 bis 25, worin die
Dicarbonsäure Adipinsäure ist.
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