DE69716291T3

DE69716291T3 - Vorrichtung und verfahren zum gefrieren lebender zellen

Info

Publication number: DE69716291T3
Application number: DE69716291T
Authority: DE
Inventors: Henri Woelders
Original assignee: Core Dynamics Ltd
Current assignee: Core Dynamics Ltd
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2010-07-08
Anticipated expiration: 2017-11-27
Also published as: ES2186005T3; EP0941443B2; ES2186005T5; EP0941443B1; EP0941443A1; DE69716291T2; NL1004619C2; WO1998023907A1; AU5415698A; DE69716291D1; US6303285B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Einfrieren lebender Zellen, insbesondere von Sperma, gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1. Solche bekannten Vorrichtungen sind aus EP 0 117 037 bekannt. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Einfrieren lebender Zellen.
Eine Vorrichtung zum Einfrieren lebender Zellen, insbesondere zum Einfrieren von Sperma, wird verwendet zum Aufbewahren von Zellen in lebendem Zustand für eine spätere Verwendung. Hierzu wird eine Probe mit z. B. einer Anzahl von Spermazellen in einer flüssigen Lösung in einen Container gegeben und abgekühlt, so dass ein Gefrieren auftritt. In dieser Patentschrift werden die Vorrichtung und das Verfahren anhand von Spermaproben bzw. -beispielen beschrieben, jedoch soll die Erfindung nicht als hierauf beschränkt aufgefasst werden. Viele andere lebende Zellen können in einer ähnlichen Art oder mit ähnlichen Mitteln mit ähnlichen Vorteilen behandelt werden.
Eine bekannte Vorrichtung umfasst ein Gefäß, in das flüssiger Stickstoff gegeben werden kann zum Abkühlen des Inhalts des Gefäßes. Bei Proben mit geringem Volumen wird das Sperma in einen Strohhalm oder einen ähnlichen dünnen rohrförmigen Behälter gegeben, woraufhin eine größere Anzahl von gefüllten Behältern gleichzeitig in das Gefäß gegeben und abgekühlt werden. Wenn ein vollständiges Gefrieren des Inhalts stattgefunden hat, werden die Behälter aus dem Gefäß entfernt und bei einer Aufbewahrungstemperatur aufbewahrt, die für eine spätere Verwendung, z. B. für eine künstliche Insimenation geeignet ist.
Die Temperaturänderung, die im Gefäß und in den Behältern auftritt, wird im Wesentlichen bestimmt durch die Art und die Temperatur der Behälter, wenn sie in das Gefäß gegeben werden, die Anzahl der Behälter und die Temperatur im Gefäß, wenn die Behälter hineingegeben werden. Darüber hinaus haben Forschungen des Anmelders gezeigt, dass eine Wärmeentwicklung in den Behältern, die aus der Kristallisierung resultiert, die hierin auftritt, signifikant zu der Temperaturänderung in den Behältern beiträgt. Diese Änderung ist erwiesenermaßen sehr wichtig für das Ergebnis des Einfrierens der Probe, insbesondere für die Chancen des Überlebens und der Vitalität der Zellen, nachdem sie das Verfahren und ein nachfolgendes Auftauen durchlaufen haben. Die genannten Forschungen haben gezeigt, dass in diesem Zusammenhang insbesondere die Temperaturänderung in der Probe während des Auftretens der Kristallisation von großer Wichtigkeit ist.
Bei der bekannten Vorrichtung ist es nicht möglich, die Änderung der Temperatur in den separaten Behältern genau zu steuern. Während der Verwendung einer solchen Vorrichtung treten relativ große Unterschiede bezüglich der Temperaturänderung in verschiedenen Behältern auf, z. B. aufgrund der Position der Behälter zueinander und bezüglich des Gefäßes und aufgrund von Unterschieden hinsichtlich der Anwesenheit von Kristallisationskernen in der Probe und demgemäss Unterschieden in der Phase, in der die Kristallisation auftritt. Aufgrund der Tatsache, dass wenn eine bekannte Vorrichtung zum Einfrieren, z. B. eines Ejakulats verwendet wird, mit der eine sehr große Anzahl von Behältern befüllt werden kann, diese Einflüsse nicht entfernt oder gesteuert werden können, ist eine solche Vorrichtung ökonomisch nicht sehr vorteilhaft und wird die Verwendung einer solchen Probe negativ beeinflusst.
EP 0 117 037 offenbart eine Vorrichtung zum Einfrieren lebender Zellen, wie beispielsweise befruchteter Eizellen, Spermien und ähnlichem, umfassend eine zylindrische äußere Wand, die mit einer scheibenähnlichen Bodenplatte verbunden ist, durch welche sich Kühlkanäle erstrecken. Im Inneren ist konzentrisch mit der zylindrischen äußeren Wand eine zylindrische innere Wand vorgesehen, die gegenüber der Bodenplatte durch einen Isolationsring thermisch isoliert ist. Der untere Teil des inneren Zylinders ist aus Kupfer hergestellt und umfasst einen zweiten Kühlkanal, der um ein Heizelement gewunden ist. Zwischen der zylindrischen inneren Wand und der zylindrischen äußeren Wand erstreckt sich ein ringförmiger Raum, in den strohhalmähnliche Röhren gegeben werden können, die die einzufrierenden lebenden Zellen enthalten. Innerhalb des oberen Teils der inneren zylindrischen Wand ist ein offener Behälter vorgesehen, der flüssigen Stickstoff zum Aufbewahren der Halterungen mit gefrorenen Proben enthält. Steuermittel sind vorgesehen zum Zuführen und Abführen einer Kühlflüssigkeit, wie beispielsweise von Stickstoff, zu den jeweiligen Kühlkanälen und zum Steuern des besagten Heizelements. Temperatursensoren sind in der Bodenplatte und dem ringförmigen Aufbewahrungsraum vorgesehen. Die Aufgabe dieser bekannten Vorrichtung besteht darin, ein Verfahren gemäß der japanischen Patentanmeldung Nr. 124996/1981 des gleichen Anmelders durchzuführen, wobei in diesem Verfahren Kristallisationskerne mit einer Pufferlösung erhalten werden sollen, die beabstandet von den hierin vorhandenen lebenden Zellen ist, um einen thermischen Schock dieser lebenden Zellen zu verhindern.
Diese bekannte Vorrichtung kann nur eine begrenzte Anzahl von Behältern aufnehmen, wobei die Behälter darauf vorbereitet werden müssen, dass ein Raum in der Nähe des unteren Endes vorgesehen werden muss, der nur die Pufferlösung, jedoch keine lebenden Zellen enthält, um das Gefrieren zu initiieren. Mit einer solchen bekannten Vorrichtung ist das Einfrieren von lebenden Zellen deshalb sehr zeitaufwendig und teuer.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zum Einfrieren lebender Zellen zur Verfügung zu stellen, insbesondere von Sperma, bei der die obengenannten Nachteile der bekannten Vorrichtungen vermieden werden, während die Vorteile hiervon beibehalten werden. Hierzu ist eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet durch die Merkmale von Anspruch 1.
In dieser Patentschrift soll der Temperaturgradient als eine räumliche Änderung der Temperatur (°C/cm) interpretiert werden. Wo eine Temperaturänderung bezogen auf Zeit gemeint ist, wird diese Änderung als zeitlicher Gradient, Kühlrate, Änderung der Temperatur oder als ein ähnlich zeitbezogener Ausdruck (°C/min) beschrieben.
Durch die oder jede zu kühlende Kontaktfläche, mit deren Hilfe der oder jeder Behälter durch Ruhen hierauf gekühlt werden kann, wird der Vorteil erreicht, dass eine genaue Steuerung der Temperatur des oder jedes Behälters und demgemäss der oder jeder Probe erhalten werden kann, unabhängig von der Anzahl der zu kühlenden Behälter. Die Steuermittel stellen die Möglichkeit eines akkuraten Steuerns der Temperatur und deren Änderung während der gesamten Kühl- oder Einfrierungsstrecke zur Verfügung. Als Ergebnis der genauen Steuerung der Temperatur, insbesondere deren Änderung während des Einfrierungs weges überleben mehr Zellen das Einfrieren und das nachfolgende Auftauen, während darüber hinaus die überlebenden Zellen eine bessere Vitalität besitzen. Ein wichtiger zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass aufgrund eines größeren Prozentsatzes überlebender und vitalerer Zellen weniger Spermazellen in eine Probe gegeben werden müssen, während die gleiche Probenqualität zur Verwendung bei künstlicher Insemanitation beibehalten wird. Dies bedeutet, dass eine größere Verdünnung eines Ejakulats durchgeführt werden kann, woraus resultiert, dass mehr Behälter pro Ejakulat gefüllt werden können. Dies bedeutet, dass eine bessere ökonomische Effektivität erhalten wird und dass darüber hinaus – zumindest was die Sperma betrifft – mehr weibliche Tiere mit einem Ejakulat befruchtet werden können, was z. B. für den Besitzer oder zumindest den Halter sowohl des männlichen als auch des weiblichen Tieres Arbeitsvorteile bedeutet.
Darüber hinaus ist die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Insemination mit einer Probe von einem Ejakulat, welches in der Anfangssituation sehr wenige vitale Zellen aufweist, größer, was von wesentlicher Wichtigkeit, insbesondere in Bezug auf beispielsweise Menschen, besondere Tierarten und ähnliches ist.
Während des Abkühlens sollte die Bildung von Eis innerhalb der Zellen (intrazellulare Eisbildung) verhindert werden, insbesondere in der Nähe des Gefrierpunkts oder -weges der Lösung, da dies für die betroffenen Zellen fatal wäre. Die Wirkung der Veränderung hiervon ist ein Ausfluss von Wasser aus der Zelle, d. h. Wasser, das durch die Zellmembran in die Umgebung wegfließt. Als Konsequenz wird die Wasserkonzentration in der Zelle geringer, d. h. der Anteil von Wasser im Zellenvolumen wird weniger, so dass der Gefrierpunkt fällt.
Im Falle von übermäßig hohen Abkühlraten tritt der Ausfluss von Wasser sehr schnell auf, was wiederum schon ungünstig für die Zellen zu sein scheint. Darüber hinaus besteht eine wesentliche Chance, dass das Ausfließen von Wasser – bezogen auf die Abkühlrate – nicht schnell genug stattfindet, d. h. der Gefrierpunkt weniger schnell als die Temperatur fällt. Hieraus resultiert, dass die Temperatur weit unter den Gefrierpunkt fällt, so dass intrazellulares Eis gebildet wird.
Im Gegensatz dazu tritt im Falle von übermäßig niedrigen Kühlraten der umgekehrte Effekt auf. Die Eiskristallisation außerhalb der Zellen (interzellular) und der Austritt von Wasser aus den Zellen kann langsam vonstatten gehen, so dass diese Prozesse sich dem thermodynamischen Gleichgewicht annähern. Dieses Gleichgewicht besteht bei sehr niedrigen Wasserkonzentrationen in den Zellen. Folglich tritt eine Dehydrierung sehr schnell auf, interzellular sowie intrazellular. Die Dehydrierung und die Konzentrationen von Salz und Metabolit in den Zellen werden so hoch, dass die Zellen hierdurch beschädigt werden. Darüber hinaus werden die Zellen durch die Reduzierung des Volumens deformiert und durch das schnelle Anwachsen interzellulare Eiskristalle beschädigt. Außerdem bleiben im Falle von übermäßig niedrigen Gefrierraten die Zellen zu lang im unstabilen Zustand. Nur bei sehr niedrigen Temperaturen, z. B. unterhalb von –80°C finden keine (bio-)chemischen Reaktionen oder physikalischen Übergänge mehr statt.
Durch eine geeignete Auswahl des Temperaturprofils während des Kühlweges kann eine momentane Kühlrate in jedem Fall realisiert werden, so dass die obigen Nachteile vermieden werden. Eine solche Steuerung der Temperaturänderung wird leicht durch die Verwendung einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
Die Mittel zum Bewegen der Behälter relativ zu der oder jeder Kontaktfläche bieten den Vorteil, dass hierdurch ein (semi-)kontinuierliches Abkühlen der Behälter und der hierin angeordneten Proben erhalten werden kann, während die Kühlperiode z. B. durch die Periode der Bewegung der Behälter entlang der oder jeder Kontaktfläche bestimmt wird. Darüber hinaus verhindert dies in einer einfachen und geeigneten Weise, dass die Behälter in der Vorrichtung stecken bleiben, z. B. indem die Behälter schnell hieran festfrieren.
In einer vorteilhaften weiteren Ausführungsform ist eine Vorrichtung gemäß der Erfindung weiter gekennzeichnet durch die Merkmale von Anspruch 2.
Die Temperaturdifferenz zwischen dem Beginn und dem Ende des Bewegungsweges, bei dem der oder jeder Behälter während der Verwendung in Richtung des kühlsten Endes bewegt wird, bietet den Vorteil, dass ein graduelles Abkühlen des Behälters hierdurch erreicht werden kann. Darüber hinaus bieten die Steuermittel die Möglichkeit, durch die Steuerung des Temperaturgradienten über der oder jeder Kontaktfläche ein Temperaturprofil über den Bewegungsweg des oder jedes Containers zur Verfügung zu stellen. Zusammen mit der Steuerung der Rate des oder jedes Behälters relativ zur Vorrichtung, insbesondere relativ zu der oder jeder Kontaktfläche, kann ein optimales Einfrierprofil für die relevanten lebenden Zellen für jeden Container eingestellt werden und demgemäss für jede Probe. Es ist in dieser Beziehung offensichtlich, dass es bevorzugt ist, dass am kühlsten Ende der Vorrichtung jede Probe in einem ausreichenden Ausmaße gefroren ist.
Während des Einfrierens der lebenden Zellen zeigten die Forschungen des Anmelders, dass das Auftreten von einer Kristallisation in einer Probe einen großen Einfluss auf das Ergebnis des Gefrierverfahrens hat, insbesondere auf die Chancen des Überlebens und auf die Vitalität der Spermazellen. In diesem Zusammenhang ist es von besonderer Wichtigkeit, dass der Moment, wenn die Kristallisation beginnt, und die Änderung der Temperatur genau gesteuert werden.
Es wurde herausgefunden, dass der Moment, in dem die Kristallisation auftritt, von äußerster Wichtigkeit ist. Wenn die Kristallisation zu spät beginnt, verbleiben die Zellen – zumindest ein Teil hiervon – zu lange in einer ungünstigen unstabilen Situation zwischen 0°C und –5°C.
Um diese Nachteile zu vermeiden, ist eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet durch die Merkmale von Anspruch 3.
Während des Betriebs wird die Bewegung jedes Behälters mittels der Steuermittel in einer solchen Art und Weise gesteuert, dass das Auftreten von Kristallisation in einer Probe in einer sogenannten Kristallisationsphase zumindest im Wesentlichen stattfindet in dem Bereich der Vorrichtung, in dem eine relativ geringe Temperaturdifferenz herrscht zwischen dem Beginn und dem Ende des betreffenden Bereichs, in einem Kristallisationssektor. Die Wärme, die durch die oder jede Probe während der Kristallisationsphase abgegeben wird, stellt einen leichten Anstieg der Temperatur im fraglichen Behälter zur Verfügung, wobei die Kristallisation relativ langsam auftritt, mit Kristallen, die in einer vorteilhaften Art und Weise gebildet werden, und jeder Austausch von z. B. Ionen und Wasser zwischen den Zellen und der Umgebung findet relativ graduell statt, woraus resultiert, dass keine Schockeffekte auftreten. Zum Teil deswegen wird ein besseres Ergebnis erzielt mit einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, als wenn die bekannte Vorrichtung verwendet wird. Wenn die Kristallisation nicht initiiert wird, sollte die gesamte Probe sehr stark unterkühlt werden. Wenn die Kristallisation auftritt, wird dann ein sehr starker Anstieg der Temperatur auftreten, woraus ein Temperaturschock resultiert, während eine sofortige Kristallisation auftritt. Dies verursacht u. a. mechanische Schocks, die die Zellen beschädigen. Weiter tritt eine sofortige Änderung des osmotischen Druckes und der Ionenstärke auf und ein übermäßiger Wassertransport durch die Zellenmembran.
Wichtige Vorteile des Initiierens der Kristallisation können aus Folgendem ersehen werden.
Sobald die Kristallisation beginnt, verschiebt sich die Temperatur in den relevanten Zellen oder Teilen der Proben auf den für die relevante Lösung zutreffenden Gefrierpunkt. Solange die Kristallisation nicht zumindest im Wesentlichen vollständig erfolgt ist, kann die Temperatur im Behälter nur kaum – wenn überhaupt – anders von der Außenseite beeinflusst werden, als dadurch, dass man die Kristallisation fortführt. Bei den bekannten Verfahren und Vorrichtungen wird die Umgebungstemperatur weiter reduziert, jedes Mal – auch während des Auftretens der Kristallisation – wird das Kühlen fortgesetzt. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass die Umgebungstemperatur tatsächlich nur minimal – wenn überhaupt – während der Kristallisation absinken sollte, um eine übermäßige Temperaturdifferenz zwischen den Inhalten des Behälters und der Umgebung zu verhindern. Wenn dieser Unterschied zu groß wird, können wesentliche räumliche Unterschiede beim Voranschreiten der Kristallisation auftreten, z. B. zwischen einer Zone benachbart zu der äußeren Wand des Behälters und einer Zone im Zentrum des Behälters. Solche ungewünschten Unterschiede verursachten auch unerwünschte Unterschiede der Kühlrate. Darüber hinaus hat ein Kühlen der Umgebung, das während der Kristallisation fortgesetzt wird, eine weitere Konsequenz derart, dass wenn die Kristallisation vollständig erfolgt ist, die Temperaturdifferenz zwischen dem Behälter und der Umgebung inakzeptabel ist, wodurch das nachfolgende Abkühlen zu schnell erfolgt.
Wenn eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bietet eine Kristallisationsphase des weiteren den Vorteil, dass – wenn gewünscht – der Kühlweg vor der Kristallisationsphase und insbesondere der folgende Kühlweg auf eine Lagerungstemperatur relativ schnell erfolgt, so dass mit einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine große Anzahl von Proben schnell eingefroren werden kann.
In einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel ist eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Merkmale von Anspruch 6 gekennzeichnet.
Die Module können im Wesentlichen identisch sein, wodurch sie zu relativ niedrigen Kosten hergestellt werden können. Folglich kann eine große Zahl von Modulen zu relativ niedrigen Kosten verwendet werden. Dies bietet den Vorteil, dass während der Verwendung die Temperaturänderungen zwischen den Modulen gering sein kann, während die Module eine relativ geringe Masse benötigen und dennoch ausreichend Wärme abführen können. Beispielsweise können die Module aus Blöcken gebildet sein, die Kühlmittel umfassen und aus im Wesentlichen festem Aluminium oder ähnlichem Material hergestellt sein. In dieser Beziehung ist es bevorzugt, dass für jedes Modul separate Steuermittel zum Steuern zumindest deren Temperatur vorgesehen sind. Eine thermische Kopplung der Module stellt eine graduelle Änderung der Temperatur entlang der Oberfläche zur Verfügung, die gebildet ist von den gemeinsamen Kontaktoberflächen, und entlang der die Behälter bewegt werden.
Tatsächlich sollte eine Kontaktoberfläche einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung auch im Wesentlichen aus einem einstückigen Aufbau bestehen, z. B. aus einer Seite eines relative dicken festen Blocks aus Aluminium oder ähnlichem mit Kühlmitteln, während eine Anzahl von Kühlstationen vorgesehen ist, die mit relativ großem Abstand voneinander angeordnet sind. Die Temperaturdifferenz zwischen nachfolgenden Kühlstationen kann relativ groß sein, während darüber hinaus weniger Kühlstationen erforderlich sind, als in dem Fall eines modularen und/oder relativ dünnen Ausführungsbeispiels, das ökonomische Vorteile bieten würde. In weiteren Ausführungsbeispielen ist eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung weiter gekennzeichnet durch die Merkmale der Ansprüche 9 und 10.
Die Kühlkanäle gemäß der Erfindung ermöglichen ein besonders einfaches und ökonomisch vorteilhaftes Abkühlen der oder jeder Kontaktoberflächen, während eine präzise Positionierung und Dimensionierung der Kühlkanäle darüber hinaus eine sehr gute Verteilung der Temperatur und einen guten Temperaturgradienten über die relevante Kontaktfläche bringen kann. Die Verwendung eines Kühlmediums, das verdampft, wenn es die Kühlkanäle verlässt, und die Abführung des produzierten Dampfes durch das im Wesentlichen geschlossene Gehäuse entlang des Behälters, verhindern das Fließen von Luft in das Gehäuse und den Niederschlag von zumindest Dampf hiervon an den Behältern und/oder der Kontaktoberfläche. Eine solche Kondensation und ein nachfolgendes Gefrieren von Luft, zumindest von Dampf, beeinträchtigt einen genauen Vorschub der Behälter und darüber hinaus ist dies nachteilig von einem energetischen Standpunkt aus gesehen. Zusätzlich kann dies eine Kontamination der oder jeder Kontaktfläche bedeuten.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist eine Vorrichtung gemäß der Erfindung außerdem gekennzeichnet durch die Merkmale von Anspruch 14.
Wie oben erwähnt, ist es von großer Wichtigkeit, dass die Kristallisation im Wesentlichen während der Kristallisationsphase stattfindet, bevorzugterweise unter strikt gesteuerten Bedingungen. Der Beginn der Kristallisation ist in vielen Fällen ein Zufallsprozess, der u. a. von der Anwesenheit von Kristallisationskernbildungszentren abhängt. Die Kristallisationsinitiierungsmittel gemäß der Erfindung haben den Vorteil, dass die Kristallisation gestartet wird – unter Steuerung hierdurch – in dem Augenblick des Gefrierprozesses, der am meisten geeignet für die relevanten Zellen ist. Die Kristallisationsinitiierungsmittel sind bevorzugterweise als Mittel zum temporären und lokalen Unterkühlen eines Behälters zu Beginn der Kristallisationsphase ausgebildet.
Die Erfindung betrifft außerdem auch ein Verfahren zum Einfrieren von lebenden Zellen, gekennzeichnet durch die Merkmale von Anspruch 15.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen einer Vorrichtung und ein Verfahren gemäß der Erfindung sind in den Unteransprüchen und in der Beschreibung wiedergegeben.
Um die Erfindung zu verdeutlichen, werden beispielhafte Ausführungsformen einer Vorrichtung gemäß der Erfindung und eines Verfahrens nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben; in diesen Zeichnungen zeigen
1 eine Seitenansicht einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung;
2 eine Draufsicht auf eine Vorrichtung gemäß 1 mit einem teilweise entfernten Deckel;
3 eine Vorderansicht einer Vorrichtung gemäß 1;
4 eine schematische Darstellung eines Zeit-Temperatur-Protokolls für eine Vorrichtung gemäß den 1 bis 3;
5 eine Seitenansicht einer alternativen stationären Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung; und
6 eine schematische Darstellung eines Zeit-Temperatur-Protokolls für eine Vorrichtung gemäß 5.
Eine Vorrichtung 1 gemäß 1 bis 3 umfasst einen Block 2, der aus wärmeleitendem Material hergestellt ist, z. B. aus Aluminium oder einer Aluminiumlegierung. Der Block 2 hat eine größere Länge L relativ zu seiner Breite B, während die Dicke D relativ gering ausfällt. Die obere Seite 3 des Blocks 2 ist mit einer Serie von parallelen, sich in Längsrichtung erstreckenden Nuten 4 versehen, deren Zweck und Ausführungsform nachfolgend im Detail beschrieben wird.
Unterhalb der oberen Oberfläche erstrecken sich durch den Block 2 eine Anzahl von Kühlrohren 5 im Wesentlichen quer zu der Längsrichtung des Blocks 2 und über die Breite B hiervon. Eine Anzahl von nebeneinander angeordneten Kühlrohren 5 sind in jedem Fall mit einem Zuleitungsrohr 6 für ein Kühlmedium, z. B. für flüssigen Stickstoff, verbunden. In jedem Zuleitungsrohr ist ein Steuerventil 7 zum Dosieren der Menge des Kühlmediums, welches durch die relevanten Kühlrohre 5 fließt, angebracht. Das Steuerventil 7 wird durch einen Thermostat oder andere Arten von Temperaturmessmitteln 8 gesteuert, die in der Oberfläche 3 an der Stelle der relevanten Kühlrohre 5 vorgesehen sind. Die Kühlrohre 5, die gemeinsam von einem Zuleitungsrohr 6 versorgt werden und ein Steuerventil 7 bilden zusammen eine Kühlstation 9, in der die Temperatur auf der Basis der von den angeschlossenen Temperaturmessmitteln 8 erhaltenen Signale gesteuert wird. Im gezeigten Ausführungsbeispiel sind neun solcher Kühlstationen 9A bis 91 hintereinander vorgesehen, gesehen in Längsrichtung des Blocks 2.
Die Temperaturmessmittel 8 sind gemeinsam mittels einer zentralen Steuereinheit 10 einstellbar, wodurch die gewünschte Temperatur in jeder Kühlstation 9 in einer solchen Art und Weise eingestellt werden kann, dass ein gewünschtes Temperaturprofil über den Block 2 erhalten werden kann. Dieses Temperaturprofil wird nachfolgend näher beschrieben.
Die Vorrichtung umfasst ein Antriebsgerät 12, das eine Kette oder ein Band 14 mit Schubstangen 15 umfasst, welche sich über die Nuten 4 über die Oberseite 3 des Blocks 2 erstrecken.
Während des Betriebs liegen eine Anzahl von Behältern 16 in den Nuten 4 in einer solchen Art und Weise, dass die Behälter 16 mit einem Teil ihrer äußeren Oberflächen an der inneren Oberfläche der Nuten 4 anliegen, wie es deutlich in 3 gezeigt ist. In der gezeigten beispielhaften Ausführungsform sind die Behälter 16 durch dünnwandige Strohhalme gebildet, in die eine Probe gegeben worden ist. Jede Probe umfasst eine Anzahl von lebenden und einzufrierenden Zellen, insbesondere von Sperma, in einer Menge von Lösungsflüssigkeit. Die Strohhalme sind in Längsrichtung nebeneinander angeordnet mit einer Schubstange 15, die in jedem Fall an dem Ende der in der Bewegungsrichtung beförderten Behälter 16 anliegt. Folglich werden während des Antriebs des Antriebsgerätes 12 die Behälter 16 in Längsrichtung durch die Nuten 4 zwischen den beiden Enden des Blocks 2 bewegt, während sie sich in engem Kontakt mit der Oberfläche 3 des Blocks 2, insbesondere den Innenseiten der Nuten 4, befinden.
Über der oberen Seite 3 des Blocks 2 ist eine dünne, flexible und thermisch isolierende Folie 17, z. B. eine HDPE- oder PTFE-Folie vorgesehen. Diese Folie 17 isoliert die Behälter 16 gegenüber der Umgebung und bildet zusammen mit dem Block ein geschlossenes Gehäuse 18. Z. B. von der an dem Zuleitungsrohr 6 entfernten Seite oder durch kleine Durchgänge zu den Nuten 4 öffnen sich die Kühlkanäle 5 unterhalb der Folie 17 innerhalb des Gehäuses 18. Bei Verlassen der Kühlrohre 5 verdampft der flüssige Stickstoff und verdrängt die gesamte Luft aus dem Gehäuse 18 oder zumindest zwischen der Folie 17 und der Oberfläche 3 des Blocks 2. Dies verhindert das Auftreten von Kondensation innerhalb des Gehäuses 18, wobei die Kondensation als Folge hätte, dass die Behälter 16 nicht durch die Nuten 4 in einer regulären Art und Weise – wenn überhaupt – gedrückt werden könnten. Darüber hinaus ist Kondensation thermisch unerwünscht. In dieser Beziehung wird bevorzugt, dass das verdampfende Medium in Richtung des Zuleitungsendes 19 strömt, d. h. zum wärmsten Ende der Vorrichtung, so dass die Behälter nicht hierdurch unbeabsichtigt erwärmt werden. Darüber hinaus tendiert jede innerhalb der Vorrichtung vorhandene Luft dazu, entlang der Bewegungsrichtung der Behälter 16 zu strömen. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, den Stickstoff dazu zu bringen, im Wesentlichen in die entgegengesetzte Richtung zum Verdrängen der Luft zu strömen. Indem man verursacht, dass ein relativ kleiner Teil des Stickstoffs sich entlang der Behälter 16 bewegt, wird die zum kalten Ende der Vorrichtung benachbarte Luft ebenso verdrängt.
In der zweiten Kühlstation 9B ist eine sogenannter Kühlfinger 23 als Kristallisationsinitiierungsmittel vorgesehen. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel umfasst der Kühlfinger 23 einen rohrförmigen Abschnitt 24, der mit dem Kühlmittel-Zuleitungsrohr 6 verbunden ist. Der rohrförmige Abschnitt 24 liegt in der Oberfläche 3 des Blocks 2 in einer solchen Art und Weise, dass die Behälter 16 in Kontakt hiermit gelangen, wenn sie ihn passieren. Mittels eines Steuerventils 25 kann flüssiger Stickstoff durch den rohrförmigen Abschnitt 24 getrieben werden, wodurch der Kühlfinger 23 sofort und kurz abgekühlt werden kann, d. h. kälter als die Oberfläche 3 um den Finger 23 in der relevanten Kühlstation 9B. Der Zweck hiervon wird nachfolgend näher beschrieben.
Am Zuleitungsende 19 des Blocks 2, d. h. dem strömungsaufwärts gerichteten Ende in Förderrichtung ist eine Zufuhreinrichtung 20 angeordnet, die eine gleichmäßige Verteilung der Strohhalme 16 über der Oberfläche 3 des Blocks 2 zur Verfügung stellt und die insbesondere das Positionieren der Strohhalme 16 in den Nuten 4 zur Verfügung stellt. Eine solche Zufuhreinrichtung 20 kann in verschiedenen Arten und Weisen aufgebaut sein.
Am Entladungsende 21 des Blocks 2 ist eine Entladungseinrichtung 22 angeschlossen, die das Sortieren und das Aufbewahren der Strohhalme mit den hier in eingefrorenen Proben zur Verfügung stellt. Eine solche Entladungsvorrichtung 22 kann ebenso in verschiedenen Arten und Weisen aufgebaut sein.
Eine Vorrichtung gemäß der 1 bis 3 kann z. B. die folgenden Abmessungen haben, wobei diese Abmessungen nicht als einschränkend in irgendeiner Art und Weise gemeint sind. Der Block kann eine Länge L von 1600 mm, eine Breite B von 300 mm und eine Dicke von einigen Zentimetern aufweisen. In der Oberfläche 3 können einhundert kanalförmige Nuten 4 mit einer Breite von 3 mm vorgesehen sein. Während des Betriebs können z. B. einhundert Strohhalme Seite an Seite angeordnet sein und elf Strohhalme können hintereinander auf der Oberfläche 3 des Blocks 2 angeordnet sein.
4 zeigt schematisch eine Temperaturkurve einer Vorrichtung gemäß den 1 bis 3. Eine durchgezogene Linie T_(surf) zeigt das Temperaturprofil, das während der Verwendung an der Oberfläche 3 erhalten wurde, eine gestrichelte Linie T_(cont) zeigt das Temperaturprofil, das in einem Behälter 16 auftritt, der über die Oberfläche gelangt ist. Die untere Horizontalachse zeigt die entsprechenden Kühlstationen 9A bis 9I. Während des Betriebs werden die Container 16 über die Oberfläche 3 mit einer Geschwindigkeit von z. B. 1000 mm/min. geführt.
In einer ersten Kühlstation 9A wird eine Temperatur T₁ eingestellt, die im Durchschnitt ungefähr +5°C beträgt. Für diesen Zweck wird eine Heizspirale 26 in der ersten Kühlstation 9A vorgesehen, wobei diese Heizspirale angeschaltet werden kann, wenn der Thermostat 8 in der relevanten Kühlstation 9A eine Temperatur unter einer minimalen Grenztemperatur registriert.
In der zweiten Kühlstation 9B wird eine Temperatur T₂ eingestellt, die ungefähr –5°C beträgt. Die zweite Kühlstation 9B ist in einem Abstand von ungefähr 200 mm von dem Kühlmittel der ersten Kühlstation 9A angeordnet, so dass zwischen diesen zwei Kühlstationen 9A und 9B ein Temperaturgradient TG₁ von ungefähr 50°C/min. erhalten wird. Die zweite Kühlstation 9B weist eine Länge von ungefähr 350 mm auf und eine Temperatur, die ungefähr gleich über ihre Länge ist. Hierzu sind in der zweiten Kühlstation 9B Kühlrohre 5 unter der gesamten Oberfläche 3 mit gleichmäßigem relativ kleinem Zwischenabstand ange ordnet, im Gegensatz zu den anderen Kühlstationen 9, bei denen die Kühlrohre 5 nur unter einem Teilbereich der Oberfläche 3 angeordnet sind.
Wenn die Behälter in die zweite Kühlstation 9B gelangen, passieren sie den Kühlfinger 23. Wenn das Förderende jedes relevanten Behälters 16 ungefähr oberhalb des Kühlfingers 23 ist, wird das Steuerventil 25 kurz geöffnet und der Kühlfinger 23 wird stark unterkühlt. In 4 ist dieses starke Unterkühlen der Oberfläche 3 zu Beginn der zweiten Kühlstation 9B durch ein Gefälle T_CF der durchgezogenen Linie T_(surf) dargestellt. Als Ergebnis wird die Kristallisation in den Behältern 16 initiiert, in einem Abstand von deren Zentren, nach der – während sich die Behälter 16 durch die zweite Kühlstation 9B bewegt haben – eine vollständige Kristallisation in den Behältern 16 stattgefunden hat. Die im Wesentlichen konstante Temperatur (der minimale Temperaturgradient TG₂) in der zweiten Kühlstation 9B stellt eine Kristallisationspause zur Verfügung. In der zweiten Kühlstation 9B kann aufgrund des Verlusts der Kristallisationswärme die Temperatur in den Behältern auf ungefähr 0°C ansteigen.
Während des Betriebs wird die Umgebungstemperatur der Behälter in der zweiten Kühlstation 9B genau eingestellt in Abhängigkeit von der Art der fraglichen Zellen. Z. B. wird bei Verwendung zum Einfrieren von Rindersperma die Temperatur in der zweiten Kühlstation 9B auf ungefähr –5°C eingestellt und konstant gehalten. Diese Temperatur kann jedoch in der zweiten Kühlstation 9B auch leicht ansteigen, d. h. in der relevanten zweiten Kühlstation 9B kann ein niederer Temperaturgradient TG₂ eingestellt werden.
In dem Teil der Vorrichtung, der mit der zweiten Kühlstation 9B verbunden ist, wird ein Temperaturgradient TG₃ bevorzugterweise eingestellt, der höher ist als der in dem vorhergehenden Teil der Vorrichtung, z. B. ein Temperaturgradient oder ein Temperaturprofil, das eine Abkühlrate von 100°C/min. zur Verfügung stellt. Hierzu werden in den nachfolgenden Kühlstationen 9C bis 9I Temperaturen nach und nach eingestellt von T3 = –15°C, T4 = –25°C, T5 = –40°C, T6 = –55°C, T7 = –75°C, T8 = –95°C und T9 = –120°C. Der Abstand zwischen jeder der nachfolgenden Kühlstationen ist im Durchschnitt ungefähr 150 mm.
Die spezifische Wärme des Eises, das in den Behältern 16 gebildet ist, ist wesentlich niedriger bei niedrigen Temperaturen. Deshalb kann der Abstand zwischen zwei späteren Kühlstationen – gesehen in Bewegungsrichtung – relativ groß sein, verglichen mit dem Abstand zwischen zwei früheren Kühlstationen 9, während die Temperaturdifferenzen zwischen späteren Kühlstationen darüber hinaus größer sein können. Außerdem ist für die lebenden Zellen, insbesondere für die Spermazellen, der Temperaturgradient TG oder zumindest die aktuelle Abkühlrate bei niedrigen Temperaturen weniger kritisch für die Überlebenschancen der Zellen. Die thermische Leitung des Blocks 2 sollte so ausgewählt sein – beispielsweise durch die Wahl des Materials und durch die Abmessungen –, dass der Wärmestrom zwischen den Kühlstationen 9 wesentlich größer ist als die Menge der durch die Behälter 16 in den relevanten Kühlstationen 9 ausgegebenen Wärme. Hieraus resultiert ein ausreichend linearer Temperaturgradient in den Kühlstationen 9A und 9C bis 9I.
Die Entladevorrichtung 2 umfasst z. B. eine Anzahl von Rutschen 27, die an Sammelgefäße 29 angeschlossen sind, die in Kühlmitteln 28 angeordnet sind und in denen die Behälter sortiert und aufbewahrt werden können. Das Sortieren der Behälter kann vor dem Einfrierungsverfahren stattfinden, kann jedoch auch in der Entladevorrichtung 22 durchgeführt werden. Dies kann sowohl per Hand als auch mit mechanischen Sortiermitteln erfolgen.
In der oben beschriebenen Vorrichtung können z. B. 700 Behälter 16 dem Band pro Minute zugeführt werden, das bedeutet, dass ein Ejakulat vollständig in ungefähr drei bis vier Minuten verarbeitet werden kann.
Beginnend mit der Verwendung von identischem Material für den Block 2 sei angemerkt, dass ein dickerer Block 2 den Vorteil bieten kann, weniger Kühlstationen zu erfordern, die mit größerem Abstand voneinander angeordnet sein können und eine größere Temperaturdifferenz untereinander, z. B. von 20°C aufweisen können. Dies ist das Ergebnis des größeren Wärmestroms durch den relativ dicken Block 2. Im Gegensatz müssen bei einem dünneren Ausführungsbeispiel des Blocks 2 mehrere Kühlstationen 9 näher aneinander angeordnet werden mit relativ kleinen Temperaturdifferenzen, z. B. mit +5°C. Indem man der Vorrichtung einen modularen Aufbau gibt, d. h. durch Verwendung jeder Kühlstation 9 oder möglicherweise einer begrenzten Anzahl von Kühlstationen 9 in einem separaten Modul, während die Module gleich sind und thermisch und mechanisch aneinander gekoppelt sind, wird der Vorteil erzielt, dass eine solche Vorrichtung in ökonomischer Art und Weise hergestellt und aufgebaut werden kann. Bezüglich der Produktion, Verwendung und Wirtschaftlichkeit mag ein relativ dünner Block 2 Vorteile gegenüber einem relativ dicken Block 2 aufweisen.
Selbstverständlich ist es auch möglich, die Geschwindigkeit der Behälter 16 relativ zum Block 2 anders einzustellen, z. B. mit 500 mm/min. und ebenso mit einem kürzeren Block 2, z. B. 800 mm. Hierzu sollte eine Temperaturgradient TG von 2°C/cm eingestellt werden. Folglich würde ein relativ dünner Block 2 ausreichen.
5 zeigt eine alternative Ausführungsform einer Vorrichtung 101 gemäß der Erfindung. Identische Teile sind mit identischen Bezugszeichen versehen. 6 zeigt ein zugehöriges Steuerdiagramm. Wenn eine solche Vorrichtung verwendet wird, können Behälter 116 während des Betriebs in stationärem Zustand in einem Block 102 angeordnet werden und gekühlt werden, um die hierin eingeschlossenen Proben unter idealen Bedingungen zu kühlen.
Die Vorrichtung 101 umfasst einen Block 102, der aus wärmeleitendem Material, wie beispielsweise aus Metall und z. B. Aluminium, Kupfer oder Legierungen hiervon hergestellt ist, in dem eine Anzahl von Kühlrohren 105 vorgesehen ist. Die Kühlrohre 105 sind über eine Anzahl von Steuerventilen 107 mit einem Zulassungsrohr 106 für ein Kühlmittel verbunden, z. B. für flüssigen Stickstoff. In der Oberfläche 103 des Blocks 102 sind Thermostatmittel 108 integriert, die mit einer zentralen Steuereinheit 110 verbunden sind. Mittels einer zentralen Steuereinheit 110 können die Steuerventile 107 zum Zuführen durch die Kühlrohr 105 einer Menge eines Kühlmediums gesteuert werden, angepasst an die Temperatur der Oberfläche 103, die in diesem Moment gewünscht ist, in Abhängigkeit von der gemessenen Temperatur. Ein Kühlprotokoll CP, das in die zentrale Steuereinheit 110 eingegeben und an die zu kühlenden lebenden Zellen angepasst ist, kann hierdurch an den Block 102 und demgemäss an die hierauf angeordneten Behälter 16 transferiert werden.
In dieser Vorrichtung 101 sind die an der Oberfläche 103 angeordneten Behälter 116 ebenso, während des Betriebs mittels einer flexiblen, thermisch isolieren den Abdeckfolie 117 bedeckt, wobei die Kühlrohre 105 zwischen der Oberfläche 103 des Blocks 102 und der Folie 117 geöffnet sind. Eine Vorrichtung gemäß 5 ist insbesondere geeignet zur Verwendung mit Behältern, die eine relativ kleine Höhe verglichen mit ihrer Oberfläche aufweisen, z. B. mit Folientaschen, wie sie herkömmlich für Eber-Sperma (Sperma männlicher Schweine) verwendet werden, aber ebenso auch für Zellen in Schalen oder Hülsen bzw. Schiebern. In oder oberhalb der Oberfläche 103 ist ein Kühlfinger 123 vorgesehen, der kurz unterkühlt und mit einem Bereich der Behälter 116, die auf der Oberfläche 103 angeordnet sind, in Kontakt gebracht werden kann.
6 zeigt schematisch ein Steuerdiagramm zur Verwendung mit einer Vorrichtung 101 gemäß 5, bei der identische Teile identische Bezugszeichen aufweisen. 6 zeigt graphisch den Bezug zwischen der Temperatur der Oberfläche 103 und der Temperatur in den Behältern 116. Eine durchgezogene Linie T_(surf) zeigt das Temperaturprofil, das an der Oberfläche 103 während des Betriebs erhalten wird, und eine gestrichelte Linie T_(cont) zeigt das Temperaturprofil, das in einem Behälter 116 auftritt, der an der Oberfläche angeordnet ist. Entlang der vertikalen Achse ist die Temperatur in °C aufgetragen, entlang der horizontalen Achse ist die Zeit in Minuten aufgetragen. Die gezeigten Werte sind lediglich als Illustration gedacht und wurden ausgewählt zum Einfrieren von Eber-Sperma.
Vor dem Beginn des Einfrierweges werden die Behälter 116 auf beispielsweise 5°C abgekühlt. Als nächstes werden die Behälter 116 an der Oberfläche 103 zu einer Zeit t₁ angeordnet, während oder wonach die Oberflächentemperatur T₁ auf –5°C eingestellt wird. Die Behälter 16 und jede Probe hierin werden abgekühlt (TG₁), bis die Temperatur in den Behältern ungefähr –5°C beträgt. Dann wird der Kühlfinger 123 mit einem Bereich jedes Behälters 116 in Kontakt gebracht und unterkühlt, um die Kristallisation in den Behältern zu initiieren. Als nächstes wird die Temperatur der Oberfläche 103 bei –5°C während einer Kristallisationsphase t₂ (Temperaturänderungsgradient TG₂ = 0) gehalten, bis eine komplette Kristallisation stattgefunden hat. Hiernach wird die Temperatur der Oberfläche graduell reduziert auf –120°C, z. B. mit einer durchschnittlichen Temperaturreduzierung TG₃ von 100°C/min. bis 150°C/min. für Rinder-Sperma oder 50°C/min. für Eber-Sperma, um ein komplettes Einfrieren der Proben zu erhalten. Die Proben können dann für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden und die Temperatur der Oberfläche 103 kann wieder auf die Ausgangstemperatur T₁ von –5°C eingestellt werden.
Eine Vorrichtung gemäß der Erfindung umfasst zumindest eine Kontaktfläche, deren Temperatur mittels Kühl- und/oder Heizmitteln steuerbar ist. In diesem Zusammenhang soll eine Kontaktfläche als eine Oberfläche interpretiert werden, die dazu in der Lage ist, die Temperatur der Behälter durch direkten Kontakt zu beeinflussen. Die Temperatur der oder jeder Kontaktfläche selbst kann z. B. gesteuert werden durch Kontakt mit einem Kühlmedium, durch Konvektion oder durch Strahlung, während der oder jeder Behälter an der Kontaktfläche anliegt.
Die Erfindung ist in keinster Weise beschränkt auf die Vorrichtungen und Verfahren, die in den Ausführungsbeispielen beschrieben sind. Viele Abwandlungen sind innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche möglich.
In Abhängigkeit des Typs und der Menge der einzufrierenden Zellen, der gewünschten Genauigkeit, der gewünschten Überlebenschance, der Zusammensetzung der Flüssigkeit oder einer unterschiedlichen Art der Umgebung, in der die lebenden Zellen aufbewahrt und eingefroren werden, der gewünschten Endtemperatur und dergleichen, kann ein unterschiedliches Einfrierprotokoll ausgewählt werden. Darüber hinaus können andere Arten von Kontaktoberflächen verwendet werden, z. B. rohrförmige Führungen in einer Vorrichtung gemäß den 1 bis 3 oder rohrförmige oder schalenförmige Aufnahmeaussparungen in einer Vorrichtung gemäß der 5. Ebenso können Kombinationen solcher Oberflächen verwendet werden. Außerdem kann eine Vorrichtung aus einer Kombination einer Vorrichtung gemäß der Erfindung für den ersten, im Allgemeinen kritischsten Bereich des Einfrierweges und einer bekannten Vorrichtung für einen Bereich des Einfrierweges nach der Kristallisationsphase aufgebaut werden, d. h. des Teiles des Einfrierweges, nach dem zumindest im Wesentlichen eine vollständige Kristallisation in den Behältern stattgefunden hat. Außerdem können andere Kühlmittel und andere Behälter verwendet werden. Ebenso können verschiedene Kontaktflächen so angeordnet werden, dass sie einander gegenüber liegen, wobei die Behälter aufgenommen oder zwischen den relevanten Kontaktflächen hindurchgeführt werden können. Das Kühlprotokoll kann manuell oder (semi-)automatisch gesteuert werden.

Claims

Vorrichtung zum Einfrieren lebender Zellen, insbesondere Sperma, die in wenigstens einer Probe in wenigstens einem Behälter enthalten sind, und eine Anzahl von solchen Behältern, wobei jeder dieser Behälter Zellen aufweist, die in einer Probe enthalten sind, wobei Einrichtungen zum Kühlen der Behälter vorgesehen sind, wobei die Kühleinrichtungen (5, 6, 7) wenigstens eine kühlbare Kontaktfläche (3) aufweisen, um im Gebrauch die Behälter (16, 116) und die oder jede darin enthaltene Probe durch Anlagekontakt zu kühlen, wobei eine Steuereinrichtung (10) vorgesehen ist, um während des Kühlens die Kühlrate (TG) und die Umgebungstemperatur der Behälter (16) zu steuern, dadurch gekennzeichnet, dass Einrichtungen (12, 14, 15) vorgesehen sind, um die Behälter (16) in Bezug auf die oder jede Kontaktfläche (3) entlang Kühlwegen zu bewegen, in denen die Behälter mit unterschiedlichen Kühlraten gekühlt werden können.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinrichtung (10) derart ausgebildet ist, dass sie im Gebrauch eine Temperaturdifferenz über die oder jede Kontaktfläche (3) zwischen den in Bewegungsrichtung entgegengesetzten Enden derselben (19, 21) erzeugt und aufrechterhält, so dass im Gebrauch der oder jeder Behälter (16) in Richtung des kältesten Endes (21) bewegt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinrichtung (10) derart ausgebildet ist, dass sie im Gebrauch in einem Kristallisationssektor (9B) der Vorrichtung (1) eine relativ geringe Temperaturdifferenz, vorzugsweise beinahe 0°, über die Kontaktfläche (3) oder den Kontaktflächenbereich im Kristallisationssektor (9B) einstellt und hält, wobei die Durchschnittstemperatur im Kristallisationssektor (96) derart ist, dass eine Kristallisation in dem oder jedem Behälter (16) während des Bewegens desselben durch den Kristallisationssektor (9B) auftritt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reihe von Kontaktflächen (3) vorgesehen ist, wobei jede Kontaktfläche (3) im Gebrauch wenigstens eine Durchschnittstemperatur (T₁–T₉) aufweist, die gleich oder vorzugsweise niedriger als diejenige der ihr in Bewegungsrichtung vorangehenden Fläche ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinrichtung (10) in oder nahe bei jeder Kontaktfläche (3) wenigstens eine Temperaturmesseinrichtung (8) und eine Kühleinrichtung (5) aufweist, wobei die Kühleinrichtung (5) zum Steuern der Temperatur und vorzugsweise des Temperaturgradenten über die relevante Fläche (3) auf der Basis eines Signals steuerbar ist, das von der Temperaturmesseinrichtung (8) geliefert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (1) eine Anzahl von Modulen aufweist, wobei jedes Modul wenigstens eine Kontaktfläche (3) aufweist und die Module thermisch gekoppelt sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass die oder jede Kontaktfläche (3) eine Führungseinrichtung (4) zum gesteuerten Führen des oder jedes Behälters (16) entlang der oder jeder Kontaktfläche (3) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinrichtung (10, 110) in oder nahe bei der Kontaktfläche (3, 103) wenigstens eine Temperaturmesseinrichtung (8, 108) und eine Kühleinrichtung (5, 105) aufweist, wobei die Kühleinrichtung (5, 105) zum Steuern der Temperatur der relevanten Fläche (3, 103) auf der Basis eines Signals steuerbar ist, das von der Temperaturmesseinrichtung (8, 108) geliefert wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kühleinrichtung Kühlkanäle (5, 105) zum Durchlassen eines Kühlmediums, und eine Ventileinrichtung (7, 107) zum Regeln der Menge des Mediums aufweist, die im Gebrauch durch die Kühlkanäle (5, 105) strömt.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (1, 101) ein im wesentlichen geschlossenes Gehäuse (18, 118) aufweist, wobei der oder jeder Behälter (16, 116) in dem Gehäuse (18, 118) gekühlt wird, wobei wenigstens eine Anzahl der Kühlkanäle (5, 105) im Gehäuse (18, 118) münden, wobei das Kühlmedium ein Medium ist, das vor oder nach dem Austritt aus den Kühlkanälen (5, 105) in eine Gasphase übergeht, wobei der Aufbau derart ist, dass im Gebrauch durch das gasige Kühlmedium in dem Gehäuse (18, 118) zumindest Kondensation verhindert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Anzahl der Kühlkanäle (5, 105) sich derart öffnen, dass sich im Gebrauch das gasige Kühlmedium durch das Gehäuse (18, 118) im wesentlichen in eine Richtung bewegt, die der Bewegungsrichtung des oder jedes Behälters (16, 116) entgegengesetzt ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Abdeckeinrichtung (17, 117) vorgesehen ist, um während des Kühlens den oder jeden Behälter (16, 116) auf der oder jeder Kontaktfläche (3, 103) abgewandten Seite abzudecken, wobei die Abdeckeinrichtung (17, 117) vorzugsweise flexibel und thermisch leitfähig ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2–12, dadurch gekennzeichnet, dass mit der kältesten Seite (21) der Vorrichtung eine Einrichtung (22) zum Sortieren von Behältern, Entnehmen derselben aus der Vorrichtung und zum Lagern derselben verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kristallisationsinitiierungseinrichtung (23) vorgesehen ist.
Verfahren zum Einfrieren lebender Zellen, insbesondere Sperma, das insbesondere zur Verwendung mit einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche geeignet ist, mit den folgenden Schritten: – Anordnen einer eine Anzahl lebender Zellen enthaltenden Pro be in einem Behälter; – Plazieren des Behälters in eine Kühlvorrichtung in Kontakt mit einer Kühlfläche; – geregeltes Kühlen des Behälters durch geregeltes Kühlen der Kühlfläche, wobei: – in einem ersten Kühlweg der Behälter relativ schnell bis zum Beginn der Kristallisation im Behälter abgekühlt wird; in einem zweiten Kühlweg eine relativ langsame oder keine weitere Kühlung des Behälters erfolgt, wobei vorzugsweise die Umgebungstemperatur, insbesondere die Temperatur der Kontaktfläche, im wesentlichen konstant gehalten wird, bis die Kristallisation im Behälter im wesentlichen vollständig eingetreten ist; und – in einem dritten Kühlweg der Behälter relativ schnell auf wenigstens eine Endtemperatur gekühlt wird, bei der die Zellen im wesentlichen chemisch, biochemisch oder physikalisch stabil sind. – wonach der Behälter vorzugsweise weiter auf die Lagertemperatur der Zellen gekühlt wird; – wobei der Behälter relativ zur Kühlfläche entlang der Kühlwege bewegt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (16) entlang der Kontaktfläche (3) oder einer Anzahl von Kontaktflächen zwischen einem ersten Ende (19) mit einer relativ hohen Temperatur und einem zweiten Ende (21) mit einer relativ niedrigen Temperatur bewegt wird, wobei der Temperaturgradient (TG) entlang der oder jeder Kontaktfläche (3) gemäß einem für den relevanten Zelltyp geeigneten Kühlprotokoll (CP) genau geregelt wird.