ES2186005T5 - Aparato y mã‰todo para congelar cã‰lulas vivas. - Google Patents

Abstract

APARATO PARA CONGELAR CELULAS VIVAS, EN PARTICULAR ESPERMA, CELULAS QUE ESTAN INCLUIDAS EN AL MENOS UNA MUESTRA DE POR LO MENOS UN RECIPIENTE, EN DONDE SE DISPONE DE MEDIOS PARA ENFRIAR EL O LOS RECIPIENTES, EN DONDE EL MEDIO DE ENFRIAMIENTO (5, 6, 7; 105, 106, 107) COMPRENDE AL MENOS UNA SUPERFICIE DE CONTACTO (3, 103) SUSCEPTIBLE DE SER ENFRIADA, PARA ENFRIAR, DURANTE EL USO, EL O LOS RECIPIENTES (16, 116) Y LA O LAS MUESTRAS INCLUIDAS EN EL MISMO MEDIANTE CONTACTO, EN DONDE SE DISPONE DE MEDIOS DE CONTROL (10, 110) PARA CONTROLAR, DURANTE EL ENFRIAMIENTO, EL REGIMEN DE ENFRIAMIENTO (TG) Y LA TEMPERATURA AMBIENTE DE CADA RECIPIENTE (16, 116).

Description

Aparato y método para congelar células vivas.

La invención está relacionada con un aparato para la congelación de células vivas, en particular esperma, de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 1. De la solicitud EP 0 117 037 se conoce un aparato de este tipo. La invención está relacionada asimismo con un método para congelar células vivas.

Los aparatos para la congelación de células vivas, en particular para la congelación de esperma, se utilizan para almacenar células en estado vivo para usos posteriores. Con esta finalidad, una muestra compuesta por ejemplo de una cantidad de células de esperma en una solución líquida se introduce en un recipiente y se enfría hasta la congelación. En esta especificación, el aparato y el método se describirán en base a muestras de esperma sin que esto signifique, empero, que la invención está limitada a esta finalidad. Muchas otras células vivas pueden tratarse de forma similar o con medios similares para obtener las mismas ventajas.

Un aparato conocido se compone de un recipiente en el que puede introducirse nitrógeno líquido para enfriar el contenido del recipiente. En muestras de pequeño volumen, el esperma se introduce en un tubo capilar o contenedor tubular similar, relativamente fino. Acto seguido se introduce simultáneamente una gran cantidad de contenedores llenos en un recipiente y se enfrían. Una vez congelados los contenidos, los contenedores se sacan del recipiente y se guardan a temperatura de almacenaje adecuada para usos posteriores como por ejemplo inseminación
artificial.

El cambio de temperatura que tiene lugar en el recipiente y en los contenedores está determinado esencialmente por el tipo y la temperatura de los contenedores al ser introducidos en el recipiente y por el número de contenedores y la temperatura en el recipiente cuando los contenedores se introducen en el mismo. Es más, investigaciones realizadas por la solicitante han probado que la generación de calor en los contenedores como resultado de la cristalización que tiene lugar en los mismos contribuye significativamente a variar la temperatura en los contenedores. Este cambio demuestra ser especialmente importante para el resultado de la congelación de la muestra, en particular para las probabilidades de supervivencia y la vitalidad de las células después de aplicar el método y de una posterior descongelación. A este respecto, las investigaciones arriba señaladas han demostrado que en particular el cambio de temperatura en la muestra durante el proceso de cristalización es de vital importancia.

En los aparatos conocidos no es posible controlar con precisión el cambio de temperatura en los contenedores separados. Durante la utilización de aparatos de este tipo se producirán diferencias relativamente grandes en el cambio de temperatura en los diferentes contenedores a consecuencia por ejemplo de la posición relativa que ocupa cada contenedor respecto a los demás y al recipiente y de diferencias en la presencia de núcleos de cristalización en la muestra y, por tanto, diferencias en la fase en que produce la cristalización. Debido a la imposibilidad de eliminar y controlar las influencias cuando un aparato conocido se utiliza para congelar por ejemplo el producto de una eyaculación, que permite llenar muchos contenedores, los aparatos de este tipo no son muy ventajosos económicamente y menoscaban la viabilidad de cada muestra.

EP 0 177 037 revela un aparato para congelar células vivas como por ejemplo óvulos fecundados, espermatozoos y similares, compuesto de una pared exterior cilíndrica conectada a una placa base con forma de disco, a través de la cual se extienden canales de refrigeración. En el centro se ha dispuesto una pared interior, concéntrica respecto a la pared exterior cilíndrica mencionada, aislada térmicamente de la placa base referida mediante un anillo aislante. La parte inferior del cilindro interior está hecha de cobre y se compone de un segundo canal de refrigeración enrollado en espiral alrededor de un elemento calefactor. Entre la pared interior cilíndrica y la pared exterior cilíndrica queda un espacio con forma anular en el que pueden colocarse tubos capilares conteniendo las células vivas a congelar. En la parte superior de la pared cilíndrica interior se ha dispuesto un contenedor abierto lleno de nitrógeno líquido concebido para albergar los soportes con las muestras congeladas. Se han previsto medios de control para suministrar y descargar un líquido refrigerante como por ejemplo nitrógeno líquido a los canales de refrigeración específicos y para controlar el elemento calefactor arriba señalado. Asimismo existen sensores de temperatura en la placa base y el espacio de sujeción con forma anular. El objeto de este aparato conocido es ejecutar un método de acuerdo con la solicitud de patente japonesa nº 124996/1981 de la misma solicitante, método en el que los núcleos de cristalización han de producirse en una solución tampón, lejos de las células vivas contenidas en la misma, con la finalidad de evitarles los efectos de un golpe térmico.

Este aparato conocido puede contener solamente un número limitado de contenedores, que deberán prepararse de manera que, para iniciar la congelación, deberá quedar un espacio que contenga solamente solución tampón, y ninguna célula viva, cerca del extremo inferior. Con un aparato de este tipo, la congelación de células vivas será por tanto lenta y cara.

La invención tiene por objeto proporcionar un aparato para congelar células vivas, en particular esperma, en el que se eviten los inconvenientes arriba descritos para los aparatos conocidos mientras se conservan las ventajas de los mismos. Con esta finalidad se caracteriza un aparato conforme a la invención mediante lo especificado en la reivindicación 1.

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En esta especificación, el gradiente de temperatura debería interpretarse como un cambio espacial de temperatura (ºC/cm). Cuando se hable de un cambio de temperatura en el tiempo, se hará referencia al cambio como gradiente temporal, grado de refrigeración, variación de temperatura o un concepto similar relacionado con el tiempo
(ºC/min.).

La/cada cara de contacto a enfriar, mediante la que puede enfriarse el/cada contenedor por el hecho de descansar sobre la misma, permite tener la ventaja de poder controlar adecuadamente la temperatura de el/cada contenedor, según la/cada muestra, independientemente del número de contenedores a enfriar. El control representa la posibilidad de controlar con seguridad la temperatura y el cambio de la misma en todo el trayecto de refrigeración y congelación. Como resultado del control exacto de la temperatura, en particular del cambio de la misma durante el trayecto de congelación, más células sobreviven a la congelación y descongelación subsiguiente y las células supervivientes son más vitales. Una ventaja adicional relevante es que el mayor porcentaje de supervivencia y la mayor vitalidad de las células permite incluir menos células de esperma por muestra y mantener la misma calidad de muestra que para el uso en inseminaciones artificiales. Por tanto puede aumentarse el grado de dilución de un producto de eyaculación y, en consecuencia, pueden llenarse más contenedores por eyaculación. El resultado es una mayor rentabilidad y, al menos en lo que se refiere al esperma, la posibilidad añadida de fertilizar más animales hembra con el producto de una eyaculación, que trae consigo por ejemplo ventajas operativas para el propietario o, como mínimo, el tenedor del animal macho y del animal hembra.

Por otra parte aumenta la probabilidad de conseguir una inseminación artificial fructuosa con una muestra de eyaculación que desde un principio contiene muy pocas células vitales, algo de importancia crucial en particular con respecto a humanos, determinadas especies de animales y similares.

Durante el enfriamiento deberá evitarse la formación de hielo dentro de las células (formación de hielo intracelular), en especial cerca del punto o trayecto de congelación de la solución, pues es fatal para las células en cuestión. El motivo de esta prevención es un efluvio de agua de la célula, esto es, agua que sale al entorno a través de la membrana celular. Como consecuencia, baja la concentración de agua en la célula, es decir, disminuye la proporción de agua en el volumen celular y desciende el punto de congelación.

En caso de grados de enfriamiento indebidamente altos, el efluvio de agua se producirá muy rápidamente, hecho que de por sí parece desfavorable para las células. Por otra parte existe una probabilidad considerable de que el efluvio de agua no se produzca con suficiente rapidez en relación con el grado de enfriamiento, esto es, el punto de congelación bajará más lentamente que la temperatura. Como consecuencia, la temperatura bajará muy por debajo del punto de congelación y pese a todo se formará hielo intracelular.

En contraste, con grados de enfriamiento indebidamente bajos se da el efecto inverso. La cristalización del hielo fuera de las células (intercelular) y el efluvio de agua de las células pueden producirse paulatinamente de forma que estos procesos se acerquen al equilibrio termodinámico. Este equilibrio se establece con una concentración de agua muy baja dentro de las células. Por tanto, la deshidratación se producirá muy rápidamente tanto a nivel intracelular como intercelular. La deshidratación y las concentraciones de sales y metabolitos intracelulares aumentan hasta dañar las células. Es más, las células se deforman a consecuencia de la pérdida de volumen y sufren daños debido a la rápida formación de cristales de hielo intercelulares. Asimismo, en caso de un grado de congelación indebidamente lento, las células permanecen demasiado tiempo en la condición inestable. Solamente con temperaturas muy bajas, como por ejemplo -80ºC, dejarán de producirse reacciones (bio)químicas y fenómenos físicos.

Mediante una adecuada selección del perfil de temperaturas en el curso del trayecto de congelación puede realizarse en cada caso un grado de enfriamiento momentáneo que permita evitar los inconvenientes arriba descritos. Este tipo de control del cambio de temperatura se habilita fácilmente mediante el uso de un aparato conforme a la invención.

El medio para desplazar los contenedores en relación con el/cada superficie de contacto ofrece la ventaja de una refrigeración (semi)continua de los contenedores y las muestras introducidas, mientras que el periodo de enfriamiento se determina por ejemplo mediante el tiempo de desplazamiento de los contenedores a lo largo de la/cada superficie de contacto. Por otra parte, esto evita de un modo sencillo y adecuado que los contenedores se atasquen en el aparato, por ejemplo quedando pegados al mismo por congelación rápida.

En otro desarrollo ventajoso, un aparato conforme a la invención se describe asimismo mediante lo especificado en la reivindicación 2.

La diferencia de temperatura entre el inicio y el final del trayecto de desplazamiento, con el/cada contenedor desplazándose durante el servicio en dirección al extremo más frío, proporciona la ventaja de conseguir un enfriamiento gradual de los contenedores. Por otra parte, el medio de control permite establecer un perfil de temperatura que cubra el trayecto de desplazamiento de el/cada contenedor mediante el control del gradiente de temperatura en la/cada superficie de contacto. Junto con el control del grado para el/cada contenedor en relación con el aparato, en particular en relación con la/cada superficie de contacto, puede fijarse un perfil de congelación óptimo para las células vivas pertinentes de cada contenedor y, por consiguiente, para cada muestra. A este respecto, se sobreentiende la preferencia de que cada muestra se haya congelado en suficiente medida en el extremo más frío del aparato.

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En el curso de la congelación de células vivas, investigaciones de la solicitante han demostrado que el fenómeno de cristalización en una muestra influye sobremanera en el resultado del método de congelación, en particular en las probabilidades de supervivencia y la vitalidad de las células de esperma. En este sentido es especialmente importante controlar adecuadamente el instante de inicio de la cristalización y el cambio de temperatura.

Se ha comprobado que el instante en que se produce la cristalización es de crucial importancia. Si la cristalización comienza demasiado tarde, las células, o cuando menos una parte de las mismas, permanecen demasiado tiempo en una situación inestable desfavorable, entre 0 y -5ºC.

Con objeto de evitar estos inconvenientes se caracteriza un aparato conforme a la invención mediante lo especificado en la reivindicación 3.

Durante el servicio, el movimiento de cada contenedor se controla mediante el medio de control de suerte que el fenómeno de cristalización en una muestra, en lo que se conoce como fase de cristalización, tiene lugar, por lo menos de forma sustancial, en la parte del aparato en la que prevalece una diferencia de temperatura relativamente pequeña entre el inicio y el final de la parte en cuestión, un sector de cristalización. El calor emitido por la/cada muestra en la fase de cristalización provoca un ligero aumento de temperatura en el contenedor en cuestión; la cristalización se desarrolla con relativa lentitud, desarrollándose los cristales de una forma ventajosa, y todo intercambio por ejemplo de iones y agua entre las células y el entorno se produce de manera relativamente gradual sin que se den efectos de choque. En parte a consecuencia de esto, se obtienen mejores resultados con un aparato conforme a la invención que si se utiliza el aparato conocido. Si no se inicia la cristalización, la muestra entera debería superenfriarse intensamente. Si se da la cristalización, se producirá una incremento de temperatura muy fuerte que derivará en un golpe de temperatura, acompañado de una cristalización repentina. Esto causa, entre otros, choques mecánicos que pueden dañar las células. Asimismo se producirá un cambio repentino en la presión osmótica y potencial iónico y un transporte indebidamente rápido de agua a través de las membranas celulares.

Las importantes ventajas de iniciar la cristalización pueden entenderse de la forma siguiente.

En cuanto comienza la cristalización, la temperatura de las células o partes pertinentes de la muestra se desplazarán al punto de congelación correspondiente a la solución pertinente. Mientras la cristalización no se haya completado por lo menos en gran medida, difícilmente o nada puede influirse desde fuera en la temperatura del contenedor si no es manteniendo activo el proceso de cristalización. En los métodos y aparatos conocidos, la temperatura ambiente continúa reduciéndose paulatinamente también durante la cristalización y prosigue el enfriamiento. De forma sorprendente, se ha descubierto que esta temperatura ambiente debería de hecho bajar mínimamente, si es que baja, durante la cristalización para evitar diferencias de temperatura indebidas entre los contenidos de los contenedores y el entorno. Si las diferencias aumentan excesivamente, pueden darse diferencias espaciales sustanciales en el desarrollo de la cristalización, como por ejemplo entre una zona adyacente a la pared exterior del contenedor y una zona en el centro del mismo. Tales diferencias indeseadas generarán asimismo diferencias no deseadas en el grado de enfriamiento. Por otra parte, un enfriamiento del entorno que prosigue durante la cristalización tiene como consecuencia que, una vez completada la cristalización, la diferencia de temperatura entre el contenedor y el ambiente es inaceptablemente grande, acelerando excesivamente el enfriamiento subsiguiente.

Si se utiliza un aparato conforme a la invención, una fase de cristalización proporciona la ventaja de que, si se desea, el trayecto de enfriamiento que precede a la fase de cristalización, y en particular el trayecto de enfriamiento siguiente hasta una temperatura de almacenaje, puede tener lugar con relativa rapidez, de forma que con un aparato según la invención puede congelarse en poco tiempo un gran número de muestras.

En una nueva incorporación ventajosa se caracteriza un aparato según la invención mediante lo especificado en la reivindicación 6.

Los módulos pueden ser todos esencialmente idénticos, cosa que permite fabricarlos con un coste relativamente bajo. Por tanto pueden utilizarse muchos módulos con un coste relativamente bajo. Esto proporciona la ventaja de que, durante el servicio, las diferencias de temperatura entre los módulos pueden ser ligeras en tanto que los módulos pueden tener una masa relativamente pequeña y, pese a esto, desprender suficiente calor. Los módulos pueden estar constituidos por ejemplo de bloques compuestos de medios de refrigeración y fabricados en aluminio sustancialmente sólido o material similar. A este respecto, se prefiere prever para cada módulo medios de control separados para controlar por lo menos la temperatura de los mismos. El acoplamiento térmico de los módulos permite un cambio gradual de la temperatura a lo largo de la superficie formada por las superficies de contacto agrupadas y a lo largo de la cual se desplazan los contenedores.

De hecho, una superficie de contacto de un aparato conforme a la invención puede también consistir esencialmente en una construcción de una pieza, como por ejemplo un lateral formado por un bloque de aluminio sólido o similar, relativamente grueso, con un medio de refrigeración, disponiéndose varias unidades de refrigeración con una distancia de separación relativamente grande. La diferencia de temperatura entre las sucesivas unidades de refrigeración puede ser relativamente grande en tanto que, por otra parte, se requieren menos unidades de este tipo que en el caso de una ejecución modular y/o relativamente estrecha, que puede ofrecer ventajas en términos de rentabilidad.

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En una nueva elaboración se caracteriza un aparato conforme a la invención mediante las características de las reivindicaciones 9 y 10.

Los canales de refrigeración según la invención permiten un enfriamiento particularmente sencillo y económicamente ventajoso de la/cada superficie de contacto, en tanto que un posicionamiento y dimensionado preciso de los canales de refrigeración puede originar asimismo una muy buena distribución de la temperatura y un buen gradiente de temperatura en la superficie de contacto pertinente. El uso de un medio refrigerante que se evapora al salir de los canales de refrigeración y el desprendimiento del vapor generado a través del alojamiento esencialmente cerrado a lo largo de los contenedores evita la entrada de aire en el alojamiento y la precipitación por lo menos de la humedad del mismo sobre los contenedores y/o la superficie de contacto. Esta condensación y la consiguiente congelación de aire, o por lo menos humedad, impedirán la debida alimentación directa de los contenedores y, por otra parte, es un inconveniente desde el punto de vista energético. Por añadidura, puede causar la contaminación de la/cada superficie de contacto.

En una ejecución preferida se caracteriza asimismo un aparato según la invención mediante lo especificado en la reivindicación 14.

Según se describe más arriba, es de crucial importancia que la cristalización tenga lugar esencialmente en la fase de cristalización, preferentemente bajo condiciones rigurosamente controladas. El inicio de la cristalización es muchas veces un proceso probabilístico que depende, en conjunto, de la presencia de núcleos de cristalización. Los medios iniciadores de cristalización conforme a la invención tienen la ventaja de que controlan el inicio de la cristalización en el instante del proceso de congelación más adecuado para las células pertinentes. Los medios iniciadores de cristalización se concebirán preferentemente como medios para el superenfriamiento temporal y local de contenedores al inicio de la fase de cristalización.

La invención está relacionada asimismo con un método para congelar células vivas, caracterizado por lo especificado en la reivindicación 15.

En las subreivindicaciones y la especificación se representan otras conformaciones ventajosas de un aparato y un método conforme a la invención.

Para ilustrar la invención se describirán a continuación conformaciones ejemplares de un aparato y un método según la invención, haciendo referencia a los planos acompañantes. Los planos son los siguientes:

Fig. 1 es una vista lateral alzada de un aparato según la invención;

Fig. 2 es una vista en planta superior de un aparato conforme a la fig. 1, con la cubierta superior parcialmente retirada;

Fig. 3 es una vista frontal de un aparato conforme a la fig. 1;

Fig. 4 es un esquema de un protocolo tiempo/temperatura para un aparato según las fig. 1-3;

Fig. 5 es una vista lateral alzada de una ejecución fija alternativa de un aparato según la invención y

Fig. 6 es un esquema de un protocolo tiempo/temperatura para un aparato según la fig. 5.

Un aparato 1 según las figuras 1-3, compuesto de un bloque 2 fabricado con un material termoconductor como por ejemplo aluminio o una aleación de aluminio. El bloque 2 tiene una longitud L relativa al ancho B, en tanto que el grosor D es relativamente pequeño. El lado superior 3 del bloque 2 lleva una serie de acanaladuras longitudinales paralelas 4 cuyo propósito y ejecución se explica detalladamente más abajo.

A través del bloque 2, debajo de la cara superior 3, transcurren varios tubos de refrigeración 5 básicamente transversales a la dirección longitudinal del bloque 2 y a lo largo del ancho B del bloque. Varios tubos de refrigeración yuxtapuestos 5 se conectan conjuntamente a un tubo de alimentación 6 para un medio refrigerante como por ejemplo nitrógeno líquido. Incluida en cada tubo de alimentación hay una válvula de control 7 para dosificar la cantidad de medio refrigerante que pasa a través de los tubos de refrigeración 5 correspondientes. La válvula de control 7 está regulada por un termostato u otros tipos de medios de medición de temperatura 8 dispuestos en la superficie 3 a nivel de los tubos de refrigeración pertinentes 5. Los tubos de refrigeración 5 alimentados conjuntamente por un tubo de alimentación 6 y una válvula de control forman una unidad de refrigeración 9 en la que la temperatura se controla en base a señales del medio de medición de temperatura 8 asociado. En la ejecución ilustrada, nueve de estas unidades de refrigeración 9A- 9I se sitúan una detrás de otra, visto en la dirección longitudinal del bloque 2.

Los medios de medición de temperatura 8 pueden configurarse conjuntamente mediante la unidad de mando central 10, que permite fijar la temperatura elegida en cada unidad de refrigeración 9 de forma que se obtiene un perfil de temperatura a través del bloque 2. El perfil de temperatura elegido se explicará detenidamente más abajo.

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El aparato se compone de un dispositivo de accionamiento 12, compuesto de una cadena o correa 14 con varillas de empuje 15 que se extienden encima de la cara superior 3 del bloque 2 y encima de las acanaladuras 4.

Durante el servicio, varios contenedores 16 descansan en las acanaladuras 4 de forma que una parte de la superficie exterior de los contenedores 16 se apoya contra la superficie interior de las acanaladuras 4, según muestra claramente la figura 3. En la ejecución ejemplar mostrada, los contenedores 16 están formados por capilares de pared delgada en los que se ha incluido una muestra. Cada muestra se compone de muchas células vivas a congelar, en particular esperma, en una cantidad de líquido disolvente. Los capilares están yuxtapuestos en dirección longitudinal, con las correspondientes varillas de empuje 15 que terminan en el extremo de los contenedores 16 arrastrados en la dirección de desplazamiento. En consecuencia, durante la acción del dispositivo de accionamiento 12, los contenedores son desplazados en dirección longitudinal a través de las acanaladuras 4 entre los dos extremos del bloque 2 mientras permanecen en estrecho contacto con la superficie 3 del bloque 2, en particular los lados interiores de las acanaladuras 4.

Encima de la cara superior 3 del bloque 2 se ha previsto una delgada película termoaislante, flexible, 17 como por ejemplo una película de HDPE o PTFE. La película 17 aísla los contenedores 16 del entorno y, junto con el bloque 2, forma un alojamiento cerrado 18. Dentro del alojamiento 18, los canales de refrigeración 5 se abren debajo de la película 17 por ejemplo en el lado alejado del tubo de alimentación 6 o a través de estrechos pasos a las acanaladuras 4. Después de salir de los tubos de refrigeración 5, el nitrógeno líquido se evapora y desplaza todo el aire del alojamiento 18, o por lo menos entre la película 17 y la superficie 3 del bloque 2. Esto evita que se forme condensación dentro del alojamiento 18, pues la condensación podría tener como consecuencia la imposibilidad de introducir, cuando menos normalmente, los contenedores 16 en las acanaladuras 4. Es más, la condensación es térmicamente desfavorable. A este respecto es preferible que el medio evaporado fluya en la dirección del extremo de alimentación 19, es decir, el extremo más caliente del aparato, de forma que los contenedores no vuelvan a calentarse de forma accidental. Por otra parte, todo aire dentro del aparato tenderá a fluir a lo largo de la dirección de desplazamiento de los contenedores 16. Por esta razón es ventajoso conseguir que el nitrógeno fluya básicamente en dirección opuesta para desplazar el aire. De cualquier modo, haciendo circular una parte relativamente pequeña de nitrógeno paralelamente al desplazamiento de los contenedores 16 se expulsa también el aire adyacente al extremo frío del aparato.

En la segunda unidad de refrigeración 9B se ha previsto un dedo de refrigeración 23 como medio iniciador de la cristalización. En la ejecución ilustrada, el dedo de refrigeración 23 se compone de una parte tubular 24 conectada al tubo de alimentación de medio refrigerante 6. La parte tubular 24 está situada en la superficie 3 del bloque 2 de suerte que los contenedores 16 toman contacto con la misma al pasar. Mediante una válvula de control 25 puede introducirse nitrógeno líquido a través de la parte tubular 24, enfriando de forma repentina y breve el dedo de refrigeración 23, esto es, enfriándolo más que la superficie 3 alrededor del dedo 23 en la unidad de refrigeración correspondiente 9B. El propósito se explica detalladamente más abajo.

En el extremo de alimentación 19 del bloque 2, es decir, el extremo ascendente en dirección de transporte, se ha dispuesto un alimentador 20 que se encarga de la distribución uniforme de los capilares 16 en la superficie 3 del bloque 2 y que en particular se encarga del posicionamiento de los capilares 16 en las acanaladuras 4. Este alimentador 20 puede construirse de muchas formas diferentes.

En el extremo de descarga 21 del bloque 2 se ha conectado un dispositivo de descarga 22 que se encarga de clasificar y almacenar los capilares con muestras congeladas en los mismos. Este dispositivo de descarga 22 puede construirse también de muchas formas diferentes.

Un aparato según las figuras 1-3 puede tener por ejemplo las medidas siguientes, medidas que no deberían interpretarse como limitantes en modo alguno. El bloque puede tener 1.600 mm de longitud L, un ancho B de 300 mm y un grosor de algunas decenas de milímetro. En la superficie 3 pueden haberse previsto 100 ranuras acanaladas 4 de 3 mm de ancho. En condiciones de uso pueden yuxtaponerse por ejemplo 100 capilares y 11 capilares pueden situarse uno tras otro en la superficie 3 del bloque 2.

La fig. 4 muestra esquemáticamente un gráfico de temperatura para un aparato según las fig. 1-3. Una línea dibujada T_{(sup.)} muestra el perfil de temperatura obtenido durante el servicio en la superficie 3. Una línea interrumpida T_{(cont.)} muestra el perfil de temperatura en el interior de un contenedor 16 transportado sobre la superficie. El eje horizontal inferior muestra las unidades de refrigeración correspondientes 9A-9I. Durante el servicio, los contenedores 16 pasan encima de la superficie 3 con una velocidad de por ejemplo 1.000 mm/min.

En una primera unidad de refrigeración 9A se fija una temperatura T_{1} cuya media es de +5ºC. Con este propósito se ha previsto en la unidad 9A una espiral calefactora 26 que puede conectarse cuando el termostato 8 de la unidad de refrigeración 9A registra una temperatura inferior a un valor límite mínimo.

En una segunda unidad de refrigeración 9B se fija una temperatura T_{2} cuya media es de -5ºC. La segunda unidad 9B está situada a una distancia de aproximadamente 200 mm del medio refrigerante de la primera unidad de refrigeración 9A, de forma que entre las dos unidades 9A y 9B se establece un gradiente de temperatura TG_{1} de aproximadamente 50ºC/min. La segunda unidad 9B mide aproximadamente 350 mm de longitud y tiene una temperatura aproximadamente igual en toda su longitud. Con esta finalidad, la segunda unidad de refrigeración 9B contiene tubos de refrigeración 5 dispuestos a intervalos intermedios uniformes, relativamente pequeños, debajo de la superficie 3 completa, en contraposición con las restantes unidades 9, en las que los tubos 5 está situados solamente debajo de una parte de la superficie 3.

Conforme los contenedores entran en la segunda unidad 9B, pasan junto al dedo de refrigeración 23. Cuando el extremo final de cada contenedor 16 se sitúa aproximadamente encima del dedo 23, la válvula de control 25 se abre brevemente y el dedo 23 se superenfría intensamente. En la fig. 4, el superenfriamiento intenso de la superficie 3 en el inicio de la segunda unidad de refrigeración 9B se representa mediante una inflexión T_{?} en la línea trazada T_{(sup.)}. Como resultado, la cristalización se inicia en los contenedores 16 lejos del centro de los mismos, completándose la cristalización en los contenedores 16 mientras atraviesan la segunda unidad 9B. La temperatura esencialmente constante (el gradiente de temperatura mínimo TG_{2}) en la segunda unidad 9B da lugar a una pausa de cristalización. En la segunda unidad, a raíz de la disipación del calor de cristalización, la temperatura en los contenedores puede aumentar hasta cerca de 0ºC.

Durante el servicio, la temperatura ambiente de los contenedores en la segunda unidad 9B se fija exactamente en función del tipo de células procesadas. Si se utiliza por ejemplo para congelar esperma bovino, la temperatura en la segunda unidad 9B se fija en aproximadamente -5ºC y se mantiene constante. No obstante, la temperatura puede disminuir ligeramente en la segunda unidad 9B, es decir, en la segunda unidad 9B puede fijarse un gradiente de temperatura TG_{2} bajo.

En la parte del aparato conectada a la segunda unidad 9B se fija preferentemente un gradiente de temperatura TG_{3} más alto que el de la parte anterior del aparato, como por ejemplo un gradiente o perfil de temperatura que proporcione un grado de refrigeración de 100ºC/min. Con esta finalidad, las temperaturas de las unidades de refrigeración siguientes 9C-9I se fijan sucesivamente en T_{3}= -15ºC, T_{4}= -25ºC, T_{5}= -40ºC, T_{6}= -55ºC, T_{7}= -75ºC, T_{8}= -95ºC, T_{9}= -120ºC. La distancia media entre las sucesivas unidades de refrigeración es por ejemplo de aproximadamente 150 mm.

El calor específico del hielo formado en los contenedores 16 es considerablemente menor a bajas temperaturas. Por esta razón, la distancia entre dos unidades de refrigeración últimas, vista en dirección de desplazamiento, puede ser relativamente grande comparada con la distancia entre dos unidades 9 iniciales, en tanto que las diferencias de temperatura entre unidades últimas pueden ser más grandes. Asimismo, para células vivas, en particular para células de esperma, el gradiente de temperatura TG o, cuando menos, el grado de refrigeración real a bajas temperaturas, es menos crítico para las probabilidades de supervivencia de las células. La conducción térmica del bloque 2 debería elegirse, por ejemplo mediante selección de material y dimensiones, de forma que el flujo de calor entre las unidades de refrigeración 9 sea considerablemente mayor que la cantidad de calor desprendido por los contenedores 16 en las unidades 9 correspondientes. Como resultado se obtiene un gradiente de temperatura suficientemente lineal en las unidades 9A y 9C-9I.

El dispositivo de descarga 22 se compone por ejemplo de varios conductos 27, conectados a receptáculos 29 dispuestos en medios refrigerantes 28 en los que pueden clasificarse y almacenarse contenedores. La clasificación de los contenedores puede tener lugar antes de la operación de congelación, pero puede realizarse también en el dispositivo de descarga 22. La operación puede realizarse manualmente o utilizando medios de clasificación mecánicos.

En el aparato descrito más arriba pueden introducirse por ejemplo 700 contenedores 16 por minuto en la correa, que significa el poder procesar una eyaculación entera en 3-4 minutos.

Asumiendo el uso de material idéntico para el bloque 2, puede afirmarse que un bloque 2 más grueso puede proporcionar la ventaja de necesitar menos unidades de refrigeración, que en consecuencia podrán separarse más y podrían tener más diferencia de temperatura unos con otros, como por ejemplo 20ºC. Esto es el resultado de un mayor flujo de calor a través del bloque relativamente grueso 2. A la inversa, en una ejecución más delgada del bloque 2 habrá que reducir la separación entre varias unidades de refrigeración 9, dejando diferencias de calor relativamente pequeñas como por ejemplo 5ºC. La construcción del aparato con forma modular, esto es, mediante la incorporación de las diferentes unidades de refrigeración 9 o, en su caso, de un número limitado de unidades 9 en un módulo separado, siendo los módulos iguales y acoplables unos con otros a nivel térmico y mecánico, proporciona la ventaja de que un aparato de este tipo puede fabricarse y ensamblarse de modo rentable. En términos de producción, uso y rentabilidad, un bloque 2 relativamente fino puede tener ventajas sobre otro bloque 2 relativamente grueso.

Por supuesto, es también posible elegir otra velocidad de desplazamiento de los contenedores 16 respecto al bloque 2, por ejemplo 500 mm/min., en combinación con un bloque 2 más corto de por ejemplo 800 mm. Para esto debería fijarse por ejemplo un gradiente de temperatura TG de 2ºC/cm. De esta forma puede ser suficiente con un bloque 2 relativamente delgado.

La fig. 5 muestra una ejecución alternativa de un aparato 101 conforme a la invención. Los componentes idénticos corresponden a números de referencia idénticos. La fig. 6 muestra un diagrama de control correspondiente. Si se utiliza un aparato de este tipo, los contenedores 116 pueden disponerse en posición fija en un bloque 102 durante el servicio y enfriarse para congelar en condiciones óptimas las muestras introducidas en los mismos.

El aparato 101 se compone de un bloque 102 fabricado con un material termoconductor como el metal, por ejemplo aluminio, cobre o aleaciones de los mismos, que contiene varios tubos de refrigeración 105. Los tubos de refrigeración 105 están conectados, vía un grupo de válvulas de control 107, a un tubo de alimentación 106 para un agente refrigerante, como por ejemplo nitrógeno líquido. En la superficie 103 del bloque 102 se han integrado medios termostáticos 108 conectados a una unidad de mando central 110. Mediante la unidad de mando central 110 pueden gobernarse las válvulas de control 107 para suministrar a través de los tubos de refrigeración 105 un volumen de medio refrigerante ajustado a la temperatura de la superficie 103 seleccionada en cada instante, dependiendo de la temperatura medida. De esta forma puede transferirse al bloque 102 y, por consiguiente, a los contenedores 116 dispuestos en el mismo, un protocolo de refrigeración CP introducido en la unidad de mando central 110 y ajustado a las células vivas a congelar.

En el mismo aparato 101, los contenedores 116 situados en la superficie 103 se cubren durante el servicio con una película termoaislante, flexible, 117, en tanto que los tubos de refrigeración 105 desembocan entre la superficie 103 del bloque 102 y la película 117. Un aparato según la fig. 5 es especialmente adecuado para usar contenedores de altura relativamente pequeña en comparación con la superficie, como por ejemplo bolsas delgadas como las que se utilizan usualmente para esperma de verraco (esperma de cerdos macho) y también para células en bandejas y portaobjetos. En o encima de la superficie 103 hay un dedo de refrigeración 123 que puede superenfriarse brevemente y tomar contacto con una parte de los contenedores 116 dispuestos en la superficie 103.

La fig. 6 muestra esquemáticamente un diagrama de control para usar con un aparato 101 conforme a la fig. 5, en el que componentes idénticos tienen idénticos números de referencia. La fig. 6 muestra gráficamente la relación entre la temperatura de la superficie 103 y la temperatura en los contenedores 116. Una línea trazada T_{(sup.)} muestra el perfil de temperatura obtenido en la superficie 103 durante el servicio y una línea interrumpida T_{(cont.)} muestra el perfil de temperatura en el interior de un contenedor 16 situado en la superficie. Fuera y paralelo al eje vertical se ha trazado la temperatura en ºC y paralelo al eje horizontal, el tiempo en minutos. Los valores mostrados son solamente a título ilustrativo y se han seleccionado para congelar esperma de verraco.

Antes de iniciar el trayecto de congelación, los contenedores 116 se enfrían hasta por ejemplo +5ºC. Acto seguido, los contenedores 116 se sitúan en la superficie 103 en el tiempo t_{1}. Mientras, o más tarde, la temperatura de la superficie T_{1} se fija en -5ºC. Los contenedores 16 y cada muestra introducido en los mismos se enfrían (TG_{1}) hasta que la temperatura en los contenedores es de aproximadamente -5ºC. Después, el dedo de refrigeración 123 se pone en contacto con una parte de cada contenedor 116 y se superenfría para iniciar la cristalización en los contenedores. La temperatura de la superficie 103 se mantiene en -5ºC durante una fase de cristalización t_{2} (gradiente de cambio de temperatura TG_{2} = 0) hasta que se ha completado la cristalización. Después se reduce gradualmente la temperatura de la superficie hasta -120ºC, disminuyendo por ejemplo la temperatura media TG_{3} en 100ºC/min. a 150ºC/min. para esperma bovino o 50ºC/min. para esperma de verraco, con objeto de congelar completamente las muestras, que podrán almacenarse para usos posteriores, en tanto que la temperatura de la superficie 103 puede retornarse nuevamente a la temperatura inicial T_{1} de -5ºC.

Un aparato conforme a la invención, compuesto por lo menos de una cara de contacto cuya temperatura puede controlarse utilizando medios de refrigeración y/o calefacción. En este contexto, una cara de contacto debería entenderse como una superficie capaz de influir por contacto directo o, cuando menos, semidirecto en la temperatura de los contenedores. La temperatura de la/cada cara de contacto se controla por ejemplo mediante el contacto con un medio de refrigeración, mediante convección o mediante radiación, en tanto que cada contenedor hace tope contra la cara de contacto.

La invención no se limita en modo alguno a los aparatos y métodos descritos en los ejemplos. Existen muchas variaciones posibles respecto a los mismos dentro del ámbito de las reivindicaciones.

Dependiendo por ejemplo del tipo y de la cantidad de células a congelar puede seleccionarse la precisión deseada, la probabilidad de supervivencia buscada, la composición del líquido o un tipo de entorno diferente en el que se acondicionan y congelan las células vivas, la temperatura final deseada y similares así como un protocolo de congelación diferente. Es más, pueden aplicarse otros tipos de superficies de contacto como por ejemplo guías tubulares en un aparato según las figuras 1-3 o escotaduras receptoras tubulares o cóncavas en un aparato conforme a la fig. 5. También pueden utilizarse combinaciones de superficies de este tipo. Por otra parte puede construirse un aparato a partir de la combinación de un aparato según la invención para la primera parte, generalmente más crítica, del trayecto de congelación, y un aparato del tipo conocido para una parte del trayecto de congelación después de la fase de cristalización, es decir, la parte del trayecto de congelación después de la cual se ha completado por lo menos en esencia la cristalización en los contenedores. Pueden utilizarse también otros medios de refrigeración y otros contenedores y situarse varias caras de contacto de forma que queden enfrentadas, siendo recibidos los contenedores o pasando entre las caras de contacto pertinentes. El protocolo de refrigeración pueden controlarse manualmente o de forma semiautomática.

Claims (16)

1. Aparato para congelar células vivas, en particular esperma, que se introducen en por lo menos una muestra en como mínimo un contenedor, habiéndose previsto medios para enfriar el/cada contenedor y comprendiendo el medio de refrigeración (5, 6, 7; 105, 106, 107) por lo menos una cara de contacto (3; 103) refrigerable durante el servicio para enfriar el/cada contenedor (16; 116) y la/cada muestra incluida en el mismo mediante contacto de tope, habiéndose previsto asimismo medios de control (10; 110) para controlar el grado de refrigeración (TG) y la temperatura ambiente del/de cada contenedor (16; 116) durante el enfriamiento y caracterizándose el aparato por llevar medios (12, 14, 15) para desplazar el/cada contenedor (16) en relación con la/cada cara de contacto (3) a lo largo de trayectos de refrigeración en los que el/cada contenedor puede refrigerarse en grados diferentes.

2. Aparato según la reivindicación 1, caracterizado por estar dispuestos los medios de control (10) para generar y conservar durante el servicio una diferencia de temperatura entre los extremos (19, 21), opuestos uno respecto a otro en la dirección de desplazamiento, de la/cada cara de contacto (3) de forma que, durante el servicio, el/cada contenedor (16) se desplaza en la dirección del extremo más frío (21).

3.Aparato según la reivindicación 2, caracterizado por estar dispuestos los medios de control (10) para fijar y conservar durante el servicio en un sector de cristalización (9B) del aparato (1) una diferencia de temperatura relativamente pequeña, preferentemente casi 0ºC, en la cara de contacto (3) o la parte de la cara de contacto en el sector de cristalización (9B), siendo tal la temperatura media en el sector de cristalización (9B) que la cristalización se produce en el/cada contenedor (16) mientras éste se desplaza a través del sector de cristalización (9B).

4. Aparato según alguna de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por disponer de una serie de caras de contacto (3) cada una de las cuales tiene, durante el servicio, como mínimo una temperatura media (T_{1}-T_{9}) igual o preferentemente menor que la de la cara de contacto precedente en la dirección de desplazamiento.

5. Aparato según alguna de las reivindicaciones 1-4, caracterizado por comprender los medios de control (10) en o adyacentes a cada cara de contacto (3) como mínimo medios de medición de temperatura (8) y medios de refrigeración (5), pudiendo controlarse los medios de refrigeración (5) en base a una señal emitida por los medios de medición de temperatura (8) para regular la temperatura y preferentemente el gradiente de temperatura en la superficie en cuestión (3).

6. Aparato según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por comprender el aparato (1) varios módulos, cada uno de ellos compuesto de por lo menos una cara de contacto (3) y estando los módulos acoplados térmicamente.

7. Aparato según alguna de las reivindicaciones 1-6, caracterizado por comprender la/cada cara de contacto (3) medios de guía (4) para conducir el/cada contenedor (16) de forma controlada a lo largo de la/cada cara de contacto (3).

8. Aparato según la reivindicación 1, caracterizado por comprender los medios de control (10, 110) en o adyacentes a cada cara de contacto (3, 103) como mínimo medios de medición de temperatura (6, 108) y medios de refrigeración (5, 105), pudiendo controlarse los medios de refrigeración (5, 105) en base a una señal emitida por los medios de medición de temperatura (6, 108) para regular la temperatura de la superficie en cuestión (3, 103).

9. Aparato según alguna de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por comprender los medios de refrigeración canales de refrigeración (5, 105) para conducir un medio refrigerante, habiéndose previsto válvulas (7, 107) para controlar el volumen de refrigerante que fluye a través de los canales (5, 105) durante el servicio.

10. Aparato según la reivindicación 9, caracterizado por comprender el aparato (1, 101) un alojamiento esencialmente cerrado (18, 118) en el que es refrigerado el/cada contenedor (16, 116), de por lo menos varios canales de refrigeración (5, 105) que desembocan en el alojamiento (18, 118), siendo el medio refrigerante un medio que, durante o después de la salida de los canales (5, 105), cambia a una fase gaseosa, y siendo tal la disposición que durante el servicio se evita por lo menos la condensación por efecto del medio refrigerante gaseoso dentro del alojamiento (18, 118).

11. Aparato según la reivindicación 10, caracterizado por tener por lo menos varios canales de refrigeración (5, 105) abiertos de forma que, durante el servicio, el medio refrigerante gaseoso avanza a través del alojamiento (18, 118) esencialmente en dirección contraria a la de desplazamiento de el/los contenedores (16/116).

12. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por preverse medios de cobertura (17, 117) para cubrir, durante la refrigeración, el/los contenedores (16/116) en el lado alejado de la/las caras de contacto (3, 103), siendo dicha cubierta (17,117) preferentemente flexible y termoaislante.

13. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 2-12, caracterizado por tener conectados al lado más frío (21) del mismo medios (22) para clasificar contenedores, descargarlos del aparato y almacenarlos.

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14. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por proporcionarse medios iniciadores de cristalización (23).

15. Método para congelar células vivas, en particular esperma, especialmente adecuado para ser utilizado en un aparato conforme a alguna de las reivindicaciones anteriores, y que se compone de los pasos siguientes:

- introducción en un contenedor de una muestra compuesta de numerosas células vivas;

- colocación del contenedor en un aparato refrigerador, en contacto con una superficie de refrigeración;

- refrigeración controlada del contenedor mediante enfriamiento regulado de la superficie de refrigeración, en donde:

- en un primer trayecto de enfriamiento, el contenedor se refrigera relativamente deprisa hasta que comienza la cristalización en el contenedor;

- en un segundo trayecto de enfriamiento, el contenedor se refrigera con relativa lentitud o no se refrigera en absoluto, manteniéndose en esencia constante preferiblemente la temperatura ambiente, en particular la temperatura de la cara de contacto, hasta completarse por lo menos sustancialmente la cristalización en el contenedor, y

- en un tercer trayecto de enfriamiento, el contenedor se refrigera relativamente deprisa por lo menos hasta una temperatura final a la que las células son básicamente estables a nivel químico, bioquímico y físico;

- a continuación, el contenedor continúa refrigerándose preferentemente hasta alcanzar la temperatura de almacenaje de las células;

- el contenedor se desplaza respecto a la superficie de refrigeración, a lo largo de los trayectos de refrigeración señalados.

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16. Método según la reivindicación 15, caracterizado por desplazarse el contenedor (16) a lo largo de la cara de contacto (3) o de varias caras de contacto entre un extremo inicial (19) con una temperatura relativamente alta y un segundo extremo (21) con una temperatura relativamente baja, y donde el gradiente de temperatura (TG) se controla con precisión a lo largo de la/las caras de contacto (3) en base a un protocolo de refrigeración (CP) adecuado para el tipo de células correspondiente.