DE69705512T2 - Verfahren zum nachweis und/oder quantifikation eines haptens in einer homogenen phase und vorrichtung dafür - Google Patents
Verfahren zum nachweis und/oder quantifikation eines haptens in einer homogenen phase und vorrichtung dafürInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung eines Haptens in einer homogenen Phase, sowie die Vorrichtung zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung, insbesondere die Ausrüstung, die die Diagnose und/oder die quantitative Bestimmung eines Haptens in einer homogenen Phase ermöglicht.
- In den letzten Jahren haben große Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologien es ermöglicht, Immuno-assays zu entwickeln, die die quantitative Bestimmung von Haptenen in einer homogenen Phase ermöglichen, das heißt, von Molekülen von geringer Größe, die natürlichen Ursprungs sind oder auf synthetischem Wege gewonnen werden, und unter anderem verwendet werden, um Tiere oder Menschen zu behandeln.
- Solche Moleküle können zum Beispiel aktive Bestandteile von Medikamenten, Hormone, Anabolika, ... sein.
- Um die Anwendung der Tests zur Diagnose und/oder quantitativen Bestimmung dieser Haptene zu erleichtern, wurde versucht, Immuno-assays zu entwickeln, die in einer homogenen Phase verwendet werden können.
- So wurden enzymatische Immuno-assays vorgeschlagen. Es handelt sich um den "substrate labelled fluorescent immuoassay", das "apoenzyme reactivation immunoassay system", den "enzyme multiplied immunoassay test" und den "enzyme channeling immunoassay", die von Voller und Bidwell beschrieben wurden (Voller A., Bidwell D.E., in Alternative Immunoassays, Collins WP Ed. John Wiley, Chichester, S. 78- 79 (1986)) sowie um den "cloned enzyme donnor immunoassay" (Henderson et al., Cli. Chem., 32, 9, S. 1637-1641 (1986)).
- In der Patentanmeldung EP-0117648 wird eine quantitative Immunbestimmung von Steroiden in einer homogenen Phase beschrieben, die auf der Inhibition der Ausfällung (clotting) der Milch beruht, wobei diese quantitative Bestimmung einen Hinweis auf die Fruchtbarkeit der milcherzeugenden Haustiere gibt.
- Bis heute ist es jedoch nicht gelungen, in einer homogenen Phase arbeitende, quantitative Immunbestimmungen zu entwickeln, die genügend empfindlich, spezifisch und reproduzierbar sind, um ihre laufende Verwendung bei der quantitativen Bestimmung und/oder dem Nachweis einer großen Anzahl von Haptenen in der klinischen Biologie und in verschiedenen Milieus (Blut, Urin, usw.) zu ermöglichen.
- Die bisher verwendeten Systeme auf der Basis Von Iod haben den Nachteil, daß praktisch alle Iodide an der Luft oxydierbar sind, wobei sie Iod erzeugen, das durch Sublimation verloren geht. Dies stellt daher eine erste Instabilitätsquelle dar. Andererseits wird die Stärkelösung durch Bakterien oder Pilze leicht abgebaut, was eine weitere Instabilitätsquelle darstellt.
- In der Patentanmeldung FR-2339172 wird ein reaktives System beschrieben, um zu bestimmen, ob Harnsäure oder ein anderer durch Iod oxydierbarer Stoff sich in einem Verhältnis, das größer als ein vorgegebener Wert ist, in alkalischem Milieu in einer Flüssigkeit befindet, wobei das reaktive System einen durch Wasser aktivierbaren Ioderzeuger, der in situ eine geeignete Menge freies Iod freisetzen kann, mit einem Indikator zum Nachweisen der Anwesenheit des Iods aufweist. Der Ioderzeuger und der Indikator sind auf einen Teststreifen aufgebracht. Folglich funktioniert eine solche Vorrichtung nur im trockenen Zustand, und sie ist daher auf eine Analyse bei einem festen System beschränkt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Diagnose und/oder quantitativen Bestimmung eines Haptens in einer homogenen Phase jeglicher Art (Blut, Serum, Urin, Milch, usw.), die genügend empfindlich, spezifisch und reproduzierbar sind.
- Insbesondere wird versucht, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die vor allem ermöglichen, Haptene, die in einer menschlichen oder tierischen physiologischen Flüssigkeit vorhanden sind, bei Konzentrationen in der Größenordnung von 100 pM oder darüber, ja sogar bei Konzentrationen in der Größenordnung von 10 pM oder darüber nachzuweisen.
- Ein spezielles Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die Empfindlichkeit dieses Verfahrens und dieser Vorrichtung durch Verringerung des "Untergrundgeräusches", das bei den Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik beobachtet wird, zu optimieren.
- Ein letztes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zu verwirklichen, die dazu geeignet ist, ohne Verunreinigung oder Abbau länger aufbewahrt zu werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Haptens in einer homogenen Phase, bei dem:
- - eine bekannte Menge eines Inhibitor-Hapten-Komplexes zu der Lösung, die das nachzuweisende und/oder quantitativ zu bestimmende Hapten enthält, zugegeben wird;
- - zu der Lösung eine Menge Antikörper zugegeben wird, die der Menge des Inhibitor-Hapten-Komplexes entspricht;
- - zu der Lösung eine β-Laktamase vom Typ C zugegeben wird, die eine aktive Stelle für zwei Substrate besitzt, die bei der aktiven Stelle in Wettbewerb treten, wobei das erste Substrat ein Reportersubstrat ist, das in ein vorzugsweise durch Messung der sichtbaren UV-Strahlung nachweisbares und/oder quantitativ bestimmbares Produkt umwandelbar ist, und das zweite Substrat der Inhibitor- Hapten-Komplex ist, der auf die Hydrolysegeschwindigkeit des Reportersubstrats wirkt;
- - die Konzentration des aus der Umwandlung des Reportersubstrats hervorgegangenen Produkts nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt wird, wobei die Konstante Km des Reportersubstrats mindestens 100-mal, vorzugsweise 10000- mal so groß wie die Konstante Km des Inhibitor-Hapten- Komplexes ist, und die Konstante kcat des Reportersubstrats mindestens 10-mal, vorzugsweise 10000-mal so groß wie die Konstante kcat des Inhibitor-Hapten-Komplexes ist.
- Vor den obigen Schritten können zu der Lösung, die das quantitativ zu bestimmende Hapten enthält, eventuell Substanzen zugegeben werden, um die eventuellen Störungen, wie Schutzmittel des Enzyms, Schutzmittel des Reportersubstrat, Schutzmittel des Inhibitor-Hapten-Komplexes oder dekontaminierende Mittel, zu beseitigen.
- Die Zugabe der oben angegebenen Menge Antikörper zu der Lösung kann mit einem Schritt zur Zugabe eines Reportersubstrat zu der Lösung kombiniert werden. Manche oder alle obenerwähnten Schritte können kombiniert werden, das heißt, gleichzeitig ausgeführt werden, und/oder die angegebene Reihenfolge der Schritte kann geändert werden.
- Die verschiedenen Schritte vor der Zugabe eines Enzyms zu der Lösung werden also nur zur Klarheit der Beschreibung als getrennte Schritte nacheinander wiedergegeben.
- Folglich haben bei Abwesenheit von freiem Hapten alle Inhibitor-Hapten-Komplex-Moleküle einen Antikörper gebunden, und die Moleküle sind folglich inaktiv. Die enzymatische Aktivität ist folglich maximal. Je größer die quantitativ zu bestimmende Haptenmenge ist, desto geringer ist dagegen die. Menge des Inhibitor-Hapten-Antikörper-Komplexes, was eine größe Verfügbarkeit der Inhibitor-Hapten-Komplex-Moleküle voraussetzt.
- Daraus folgt eine geringe enzymatische Aktivität, die sich durch eine geringe Umwandlung des Reportersubstrats äußert, die durch die geringe Absorption der sichtbaren UV- Strahlung nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt wird (siehe Fig. 1).
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Vorrichtung zum Nachweis und/oder zur Dosierung eines Haptens in einer homogenen Phase, die ein Enzym aufweist, das eine aktive Stelle für zwei Substrate besitzt, die bei der aktiven Stelle in Wettbewerb treten, sowie die zwei Substrate, wobei das erste Substrat ein Reportersubstrat ist, das in ein vorzugsweise durch Messung der sichtbaren UV-Strahlung nachweisbares und/oder quantitativ bestimmbares Produkt umwandelbar ist, und das zweite Substrat ein Inhibitor-Hapten-Komplex ist, der die Hydrolysegeschwindigkeit des Reportersubstrats moduliert. Die Vorrichtung weist außerdem Antikörper auf, die geeignet sind, den Inhibitor-Hapten-Komplex zu binden.
- Die Konstante kcat des Reportersubstrats ist groß, und liegt über 0,1 s&supmin;¹, vorzugsweise über 10 s&supmin;¹. Die Konstante Ki des Inhibitor-Hapten-Komplexes ist klein, und liegt unter 5000 uM, vorzugsweise unter 100 uM. Die Konstante kcat des Inhibitor-Hapten-Komplexes ist klein, und liegt unter 0,1 s&supmin;¹.
- Bei dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist das Enzym eine β-Laktamase, vorzugsweise vom Typ C. In vorteilhafter Weise wird die β-Laktamase in der Gruppe gewählt, die von den aus Enterobacter cloacae Q908R und P99 hervorgegangenen β-Laktamasen, und den aus Citrobacter freundii und Escherichia coli hervorgegangenen β-Laktamasen gebildet wird.
- Erfindungsgemäß werden der Inhibitor und das Reportersubstrat in der Gruppe gewählt, die von den Penicillinen, den Cephalosporinen und den β-Laktam- Antibiotika gebildet wird.
- Das Reportersubstrat wird vorzugsweise in der Gruppe gewählt, die von Cephaloridin, Nitrocefin, Cephalothin, Cephalexin, Cephalosporin C, Cephacetril und Cefazolin gebildet wird.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird der Inhibitor des Inhibitor-Hapten-Komplexes in der Gruppe, bestehend aus Carbenicillin, Oxacillin, Cefuroxin, Cefotaxim und Methicillin gewählt.
- Vorzugsweise wird die Umwandlung des Reportersubstrats durch die Messung der Eigenfärbung der Hydrolyseprodukte oder, wenn diese Produkte nicht gefärbt sind, durch ein Entwicklungssystem, insbesondere durch Färbung mit Iod/Stärke nachgewiesen.
- Dabei ist anzumerken, daß sich diese Art von Reaktion auch für andere quantitative Bestimmungen, wie die quantitative Bestimmung von Cephalexin mit Iod, eignen kann, wie nachstehend bei einem Ausführungsbeispiel beschrieben wird.
- In dem speziellen Fall des Nachweises und/oder der quantitativen Bestimmung der Konzentration des Produktes, das aus der Umwandlung des Reportersubstrats, von dem oben die Rede war, hervorgegangen ist, ermöglicht diese Stärke/Iod-Färbung den Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung eines Haptens bei geringen Konzentrationen und innerhalb eines diskriminierenden Farbbereichs bezüglich der allgemeinen Färbung der homogenen Phase.
- Bei dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß der Erfindung wird der Inhibitor vorzugsweise in der Gruppe gewählt, die gebildet wird von Carbenicillin, Oxacillin, Cefuroxin, Cefotaxim und Methicillin, sowie von jeder anderen Substanz mit einem β-Laktam-Kern oder einem mit dem β-Laktam-Kern verwandten Kern, oder sogar von jeder Substanz, die nicht unbedingt einen β-Laktam-Kern oder einem mit dem β-Laktam-Kern verwandten Kern aufweist, aber gegenüber der obenerwähnten Enzymgruppe meßbare kinetische Parameter (Km, Ki und kcat) aufweist, und eine Verlangsamung der Hydrolysegeschwindigkeit des Reportersubstrats sicherstellt.
- In vorteilhafter Weise ist das quantitativ zu bestimmende Hapten ein aktiver Bestandteil eines Medikaments, ein Hormon, ein Anabolikum oder eine Droge, die vorzugsweise in der Gruppe, bestehend aus Testosteron, Östridiol, Progesteron, Aldosteron, Cortisol, Methylamphetamin, Methadon, Tetrahydrocannabinol, Δ4-Androstenedion, Morphin, DHEA-Sulfat, Nandrolon, Theophyllin, Cocain und/oder ihren Hydrolysederivaten, gewählt wird.
- Die β-Laktamasen können in vier Familien aufgeteilt werden: A, B, C und D. Die Familien der Typen A, C und D sind durch ihre Wirkungsweise gekennzeichnet, die die Bildung eines Acyl-Enzym-Komplexes über eine aktive Stelle, die ein Serin umfaßt, voraussetzt. Die Enzyme vom Typ C wurden in vorteilhafter Weise ausgewählt aufgrund:
- - der aus der Literatur bekannten kinetischen Parameter,
- - ihres Reaktionsschema bei Anwesenheit eines Inhibitors,
- - ihrer kommerziellen Verfügbarkeit,
- - ihrer chemischen und thermischen Stabilität.
- Bei den Hydrolysereaktionen von Penicillin durch β- Laktamasen vom Typ C gibt es praktisch keine echten Inhibitoren. Die Ausdrücke "gutes und schlechtes Substrat" werden folglich verwendet, um die Penicilline bei ihren Wechselwirkungen mit den β-Laktamasen zu kennzeichnen. Zur Vereinfachung werden im Folgenden dennoch die Ausdrücke "Substrat" und "Inhibitor" verwendet.
- Ein gutes Substrat oder Reportersubstrat wird in Konjugation mit einem schlechten Substrat, das heißt, mit dem Hapten-Inhibitor-Komplex verwendet. Die Modelle zur Inaktivierung durch dieses letztere setzen die Bildung eines relativ stabilen Enzym-Inhibitor-Komplexes durch Bildung eines Acylenzyms voraus.
- Unter den verwendbaren β-Laktamasen können die β- Laktamasen von Enterobacter cloacae Q908R und P99, von Citrobacter freundii oder von Escherichia coli erwähnt werden.
- Die Auswahl des Inhibitors beruht auf kinetischen Parametern und auf den Möglichkeiten der Kopplung mit dem quantitativ zu bestimmenden Hapten (Anwesenheit von für die hemmende Aktivität nicht unerläßlichen funktionellen Gruppen). Auf der enzymatischen Ebene soll der ideale Inhibitor ein möglichst kleines kcat (eine sehr kleine Abbaugeschwindigkeit) aufweisen, während er zugleich ein möglichst kleines Km (hohe Affinität für das Enzym) aufweist. In dem Fall der in Betracht gezogenen Inhibitionsreaktionen liegt der Wert von Km nahe bei der Konstante Ki. Das Km kann daher aufgrund einer Bestimmung des Ki abgeschätzt werden. Das Ki wird aufgrund von kinetischen Messungen erhalten, die bei Anwesenheit eines Reportersubstrats mit bekannten Eigenschaften, und zwar bei Anwesenheit einer variablen Inhibitormenge, ausgeführt werden. Der ideale Inhibitor soll ebenfalls eine möglichst große Geschwindigkeitskonstante k&sbplus;&sub1; (die dem Schritt der Bindung des Inhibitors an dem Enzym entspricht) aufweisen.
- Gemäß diesem Prinzip konnten fünf Inhibitoren ausgewählt werden. Es handelt sich um:
- - Carbenicillin (Km = 0,5 bis 20 nM; kcat = 0,002 bis 0,004 s&supmin;¹),
- - Oxacillin (Km = 0,5 nM; kcat = 0,005 s&supmin;¹,
- - Cefuroxin (Km = 20 nM; kcat = 0,04 bis 0,15 s&supmin;¹),
- - Cefotaxim (Km = 20 bis 170 nM; kcat = 0,01 bis 0,17 s&supmin;¹),
- - Methicillin (Km = 2 bis 150 nM; kcat = 0,007 bis 0,08 s&supmin;¹).
- Der Inhibitor soll mindestens eine freie und für seine hemmende Aktivität nicht wesentliche chemische Gruppe aufweisen, die seine Kopplung an das quantitativ zu bestimmende Hapten ermöglicht.
- Der verwendete Inhibitor soll außerdem dazu geeignet sein, an ein Steroid, wie Nandrolon, an ein Medikament, wie Theophyllin, oder an eine Droge, wie Cocain, angekoppelt zu werden.
- Die Werte Km und kcat einer Reihe von Reportersubstraten, die verschiedenen β-Laktamasen gegenübergestellt sind, sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Die Daten wurden entweder experimentell bestimmt, oder aus in der Literatur verfügbaren Daten entnommen. TABELLE I: KINETISCHE PARAMETER VERSCHIEDENER PENICILLINE BEI ANWESENHEIT VON β-LAKTAMASEN
- ¹ Citro. F. ist eine β-Laktamase von Citrobacter freundii, und P99 und Q908R sind β-Laktamasen, die von Enterobacter cloacae herrühren. TABELLE 2: KINETISCHE PARAMTER VERSCHIEDENER CEPHALOSPORINE BEI ANWESENHEIT VON β-LAKTAMASEN
- Cephalosporin C, Cephacetril, Cephazolin (aber auch Apholexin) als Reportersubstrate verwendbar sind.
- Phenylmalonsäure wird durch Inkubation bei 35ºC in einem trockenen Äther-Dioxan-Gemisch mit 1,2 Äquivalenten Thionylchlorid während 3 Stunden in Säuremonochlorid umgewandelt. Die Lösungsmittel werden verdampft, und der in einem Äther-Dioxan-Gemisch aufgenommene Rückstand (heißes Öl) wird einer eisgekühlten Lösung von Nandrolon in Dioxan zugemischt. Das Gemisch, bei dem es einen Mangel an Steroid gibt, wird bei Umgebungstemperatur während 12 Stunden inkubiert. Das Produkt wird mit einer wässerigen Natriumbikarbonatlösung extrahiert, und dann nach Ansäuerung der Lösung bis auf pH 2 mit Chloroform wieder extrahiert. Das Steroid-phenylmalonat wird durch Verdampfung des Chloroforms erhalten (siehe Fig. 2).
- Die Ankopplung des Nandrolon-phenylmalonats an die 6- APA wird auf, herkömmliche Weise nach Aktivierung mit Carbonyl-diimidazol (CDI) verwirklicht. Die Reinigung der konjugierten Verbindung wird durch Extrahierung in Äther in einem Milieu mit pH 2 und 8,5 vor der abschließenden Rekristallisation eines Toluol-Petrolein-Gemisches erhalten (siehe Tabelle 9).
- Das Diethyl-phenylmalonat wird durch Wirkung eines Äquivalents KOH in einem hydro-alkoholischen Milieu zu Monoester hydrolysiert. Das Monoester wird danach durch eine herkömmliche Prozedur, bei der das Carboxyldiimidazol als Aktivierungsmittel beteiligt ist, mit der p-Aminomethylbenzoesäure gekoppelt. Das restliche Ethylester wird durch Hydrolyse mit KOH 5% und anschließende Veresterung mit Benzylalkohol durch ein entsprechendes Benzylester ersetzt, wobei die Methode der mit Isobutylchloroformat gemischten Anhydride bei Anwesenheit eines Äquivalents Triethylamin verwendet wird. Die verbleibende Carboxylgruppe wird durch das Isobutylchloroformat in herkömmlicher Weise aktiviert und dann an das Ecgonin angekoppelt. Die Carboxylsäure des Benzoylecgonin-Teils der konjugierten Verbindung wird mittels der gleichen Technik, die bei Anwesenheit von Methanol angewandt wird, durch Methylester umgewandelt. Die Benzylgruppe wird bei Anwesenheit von Palladium auf Kohle unter zwei Bar Wasserstoffdruck durch Hydrogenolyse entfernt. Die erzeugte Säure wird für die abschließende Ankopplung an die 6-APA verwendet, wobei eine vorherige Aktivierung mit Methansulfonylchlorid gemäß der Methode von Brown et al., Chem. Soc. Perkins Trans No. 1, S. 881 (1991) ausgeführt wird (siehe Fig. 3). Die Reinigung dieser Verbindung wird durch Extrahierung in Äther in einem Milieu mit pH 2 und 8,5 vor der abschließenden Rekristallisation des Toluol-Petrolein-Gemisches erhalten (siehe Tabelle 9).
- Um die Nachweisgrenze des Nandrolons und der anderen Steroide zu senken, koppelt man sie an einen stärkeren Inhibitor (der ein besonders niedriges Ki aufweist), wobei eine Rehe von Inhibitoren gebildet wird, die variable Inhibitoreneigenschaften aufweisen und an verschiedene Anwendungen, die eine unterschiedliche Inhibitorenwirkung erfordern, angepaßt sind. Die Synthese dieser Produkte wird nachstehend beschrieben. Die Methode, die angewandt wird, um die Zielmoleküle zu erhalten, besteht darin, daß Vorläufer synthetisiert werden, die den Steroid-Teil und die an das Penicillin gebundene Seitenkette aufweisen, wobei das Penicillin entsprechend modifiziert ist, um die Kopplung an das Steroid zu ermöglichen, und um signifikante Unterschiede von Ki zu erzeugen. Danach wird durch Kopplung des Vorläufers an die 6-APA ein Amid gebildet, um das endgültige Molekül zu erhalten. Das unten dargelegte allgemeine Syntheseverfahren ist in den Fig. 4 bis 13 zusammengefaßt.
- Ein Äquivalent 4-Carboxybenzaldehyd (I) wird in einem mit NaOH auf pH 4,5 eingestellten Wasser/Methanol-Gemisch mit zwei Äquivalenten Hydroxylamin-chlorhydrat zur Reaktion gebracht. Nach zweistündiger Reaktion wird die Lösung unter Vakuum konzentriert bis zur Ausfällung des Produktes (II). Das Präzipitat wird filtriert, mit eisgekühltem Wasser gewaschen, und in einem NaHCO&sub3;-Puffer bei pH 8 wieder aufgelöst. Die Produktlösung wird mit Kohle gereinigt, filtriert, und mit HCl wieder angesäuert. Das Produkt (II), das ausgefällt wird, wird isoliert, mit H&sub2;O gewaschen, und unter Vakuum getrocknet.
- Das Produkt II wird in einem Dioxan/CHCl&sub3;-Gemisch aufgelöst. Die in einem Aceton/Trockeneis-Gemisch abgekühlte Lösung wird danach mit Chlor gesättigt. Die chlorierte Lösung wird danach bis auf Umgebungstemperatur allmählich erhitzt. Nach vollständiger Reaktion wird die Lösung unter Vakuum verdampft. Das erhaltene Produkt (III) wird in Ethanol aufgelöst und durch Zugabe von Petrolein ausgefällt.
- Ein Äquivalent von Produkt III wird in einem Methanol/Acetonitril-Gemisch aufgelöst. Nach Abkühlung auf 0ºC werden zwei Äquivalente Na-tert-butyl-acetoacetat (IV) zu der Lösung von Produkt III langsam zugegeben. Am Ende der Reaktion wird zu der Lösung mit Essigsäure angesäuertes Wasser zugegeben. Das Produkt wird mit Chloroform aus der Lösung extrahiert. Die mit Wasser gewaschene Chloroformphase wird auf Natriumsulfat getrocknet. Sie wird danach bis zur Konzentration des Produktes (V) verdampft.
- Die Synthese erfolgt auf ähnliche Weise wie bei dem vorhergehenden Produkt, wobei das Ausgangsprodukt Bromethoxybenzaldehyd ist. Das Bromethoxybenzaldehyd wird in Oxym umgewandelt durch die Wirkung von Hydroxylamin- chlorhydrat in einem hydro-alkoholischen Milieu, dessen pH durch vorsichtige Zugabe von NaOH auf 5 gehalten wird. Die Wirkung des Chlors bei Sättigung in dem Chloroform während 2 Stunden wandelt das Oxym in Chloroxym um, mit anschließender Substitution des Phenylkerns durch ein Chloratom in der Orthoposition des Ethers. Das Produkt wird durch Chromatographie mit einer Silikasäule zwei Mal gereinigt, wobei die mobile Phase aus Toluol, Ethylacetat und Essigsäure (6; 1; 0,1) besteht, um die instabilen Verbindungen, die sich bei der Reaktion bilden, zu eliminieren. Die erhaltene stabile Verbindung (siehe Tabelle 9) wird danach mit 1 Äquivalent des Kaliumsalzes von Tert-butyl- acetoacetat zur Reaktion gebracht. Die Anlagerungsverbindung zyklisiert während der Reaktion, wobei das Tert-butyl-3-[4- (2-bromethoxy)-3-chlorophenyl]-5-methylisoxazol-4-carboxylat erhalten wird, das durch Reaktion mit NaI in einem Aceton- Milieu in ein entsprechendes iodiertes Derivat umgewandelt werden kann.
- Das Tert-butyl-3-(4-carboxyphenyl)-5-methylisoxazol-4- carboxylat wird geschützt durch Bildung eines Tert-butyl- dimethyl-silyl-Derivats bei der Carboxylgruppe durch Reaktion mit Tert-butyl-dimethyl-silyl-chlorid bei Anwesenheit von Imidazol. Das geschützte Derivat wird durch die Wirkung von Oxalylchlorid in einem Gemisch von Dimethylformamid und Dichloromethan in Säurechlorid umgewandelt. Das Säurechlorid wird danach durch ein Amid gebildet durch Reaktion mit Chloropropylamin, das in Form von Chlorhydrat in das Milieu eingebracht wird, das das Säurechlorid enthält, dem ein Überschuß von Triethylamin zugegeben wurde. Das so erhaltene chlorierte Derivat kann durch Reaktion mit NaI in Aceton in entsprechendes iodiertes Derivat umgewandelt werden.
- Das 4-Nitrobenzaldehyd wird durch Reaktion mit Hydroxylamin in einem hydro-alkoholischen Milieu mit pH 5 (Aufrechterhaltung des pH's durch Zugabe von KOH) in Oxym umgewandelt, und dann wird durch Chlorierung mit Hilfe von gasförmigem Chlor in dem Chloroform das Chlorooxym gebildet. Die Reaktion des erhaltenen Derivats mit dem Kaliumsalz von Tert-butyl-acetoacetat ergibt das Tert-butyl-3-(4- nitrophenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxylat, das mit Hilfe von Wasserstoff (2 bar), katalysiert durch Palladium auf Kohle, reduziert wird. Das aminierte Derivat wird in Form von Chlorhydrat in Ethylacetat isoliert.
- Das Para-hydroxybenzaldehyd wird in einem Gemisch von Dimethylformamid und Acetonitril bei Anwesenheit von Kaliumtert-butylat mit Propiolacton zur Reaktion gebracht. Das gebildet Derivat wird, wie oben für die verwandten Verbindungen beschrieben, in Oxym umgewandelt, und durch Reaktion mit 1 Äquivalent Tert-butyl-dimethyl-silyl-chlorid während 2 Stunden in Tetrahydrofuran, dem Imidazol zugegeben wurde, geschützt. Die Wirkung des Chlors auf das Produkt führt zu dem Chloroxym, das gemäß dem bereits beschriebenen Verfahren durch das Kaliumsalz von Tert-butyl-acetoacetat in Isoxazol umgewandelt wird.
- Das Nandrolon und das Testosteron wurden ohne Modifikation oder nach Hinzufügung eines 5-Aminovalerian- oder 3-Hydroxypropion-Arms verwendet.
- Die 5-Aminovaleriansäure wird durch eine Boc-Gruppe geschützt durch Reaktion von Ditertbutyldicarbonat in einem Wasser-Tetrahydrofuran-Gemisch bei Anwesenheit von NaOH. Das erhaltene Derivat wird mit einem Mangel von Testosteron oder Nandrolon bei Anwesenheit eines leichten Überschusses von Dicyclohexylcarbodiimid und von Dimethylaminopyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktion erfolgt in einem Gemisch von Dioxan und Tetrahydrofuran bei einer Temperatur von 0ºC. Der Schutz der Amingruppe wird weggenommen durch Reaktion von 4 Äquivalenten Phenol und 1 Äquivalent Trimethylsilylchlorid in einem Gemisch von Dichloromethan und Ethylacetat. Das gebildete Produkt wird in Ether isoliert.
- Das Steroid wird in einer im Autoklaven auf eine Temperatur von 120ºC erhitzten Pyridinlösung mit 1 Äquivalent Succinanhydrid zur Reaktion gebracht.
- Man bildet das Kaliumsalz des Steroids (Nandrolon, Testosteron und 11-α-Hydroxyprogesteron) durch Reaktion von 1 Äquivalent Steroid mit 1 Äquivalent Kaliumtert-butylat in einem Tetrahydrofuran-Milieu. Nach 15 Minuten verdünnt man mit dem dreifachen Volumen Dimethylformamid, und man gibt ein Äquivalent β-Propiolacton zu.
- Die Phenolfunktion des Östradiols durch Hinzufügung einer Tert-butyl-dimethyl-silyl-Gruppe geschützt. Östradiol und Thalliumethylat werden in äquivalenten Mengen in Benzol erhitzt, wobei der frei werdende Alkohol durch Destillation des azeotropen Gemischs kontinuierlich eliminiert wird. Wenn die Reaktion beendet ist, werden 1,1 Äquivalente Tert-butyl- dimethyl-silyl-chlorid zugegeben, und die Reaktion wird bis zur Beendigung der Substitution des Phenols fortgesetzt (Vorläufer 14). Man bildet das Kaliumsalz des geschützten Steroids, und man substituiert durch die Propionkette, wie oben für die Vorläufer 10 bis 12 beschrieben.
- Der Vorläufer 1 wird aktiviert in Lösung in Dichloromethan, zu dem eine Spur Dimethylformamid zugegeben wurde, bei Anwesenheit von 5 mg% Dimethylaminopyridin und 1 Äquivalent von entweder dem Vorläufer 14, oder von Nandrolon, oder von Testosteron, oder von 11-α-Hydroxyprogesteron und von einem leichten Überschuß von Dicyclohexylcarbodiimid, das zu der auf 0ºC abgekühlten Lösung allmählich zugegeben wird. Nach Elimination des Dicyclohexylharnstoffs wird das Produkt in Petrolether isoliert. Der Schutz der Isoxazol-4-carboxylsäure wird weggenommen durch die Wirkung der Trifluoressigsäure in einer zurückfließenden Nitromethanlösung während 40 Minuten. Das Produkt wird gereinigt durch Chromatographie mit einer Silikasäule, die durch eine mobile Phase aus Toluol, Ethylacetat und, Essigsäure 2; 1; 0,1 eluiert wird. Die Ketten 3, 4, 5 und 6 ergeben sich bei dieser Herstellung.
- Der Vorläufer 1 wird durch Isobutylchloroformat (1,1 Äquivalente) in Dioxan, das eine Spur Dimethylformamid enthält, bei einer Temperatur von 0ºC, bei Anwesenheit eines leichten. Überschusses von Triethylamin aktiviert. Zu dieser Lösung gibt man eine Lösung von einem der Vorläufer 6 oder 7 in Dimethylformamid zu, und man läßt bei Anwesenheit eines Überschusses von Triethylamin reagieren, wobei, nach Wegnahme des Schutzes wie oben, die Ketten 7 und 8 erhalten werden.
- Der Vorläufer 14, Nandrolon, Testosteron oder 11-α- Hydroxyprogesteron und Thalliumethylat, in äquivalenten Mengen in Benzol gegeben, werden erhitzt, wobei der frei werdende Alkohol durch Destillation des Benzols kontinuierlich eliminiert wird. Wenn die Reaktion beendet ist, wird 1 Äquivalent von entweder dem Vorläufer 2a oder 2b je nach der Reaktivität, oder dem Vorläufer 3a oder 3b je nach der Reaktivität zugegeben, und die Reaktion wird bis zu der vollständigen Substitution fortgesetzt. Die Ketten 9 bis 16 werden auf diesem Wege erhalten, nach Reinigung mit einer Silikasäule und, als mobile Phase, einem Gemisch von Petrolein und Toluol mit einer an die Lipophilie des Produktes angepaßten Zusammensetzung, und die Wegnahme des Schutzes erfolgt wie oben.
- Irgendeiner der Vorläufer 8 bis 13 wird durch Reaktion mit 1 Äquivalent Tert-butyl-dimethyl-silyl-chlorid bei Anwesenheit von Imidazol in einem aus Tetrahydrofuran bestehenden Milieu in Tert-butyl-dimethyl-silyl-ester umgewandelt. Dieser Ester wird in Dichlormethan bei Anwesenheit von Oxalylchlorid und katalytischen Mengen von Dimethylformamid zur Reaktion gebracht, um das entsprechende Säurechlorid zu bilden, das an den Vorläufer 4, der in äquivalenter Menge in das Reaktionsmilieu eingebracht wird, angekoppelt wird. Die Ketten 17 bis 22 werden so erzeugt, nach Wegnahme des Schutzes gemäß den oben beschriebenen Methoden. Der Vorläufer 5 wird in einem Dichloromethan- Milieu durch 1 Äquivalent. Oxalylchlorid bei Anwesenheit von katalytischen Mengen Dimethylformamid in Säurechlorid umgewandelt, und mit irgendeinem der Vorläufer 6, 7 oder 14, oder irgendeinem der folgenden Produkte: Nandrolon, Testosteron und 11-α-Hydroxyprogesteron, die in äquivalenten Mengen in das Reaktionsmilieu eingebracht werden, zur Reaktion gebracht. Die Ketten 23 bis 38 werden erhalten nach Wegnahme des Schutzes gemäß der bereits beschriebenen Methode.
- Das Carboxyl in Position 4 des Isoxazolkerns der Kette wird aktiviert durch Methansulfonylchlorid (1 Äquivalent) in einem auf -50ºC abgekühlten Tetrahydrofuran-Milieu, das 1 Äquivalent Diisopropylethylamin enthält. Nach Reaktion und Rückkehr auf Umgebungstemperatur wird 1 Äquivalent 6- Aminopenicillansäure, aufgelöst in einer 2%igen wässerigen Bicarbonatlösung und mit dem gleichen Volumen Aceton verdünnt, in das Milieu eingebracht. Nach Elimination der Lösungsmittel und Reinigung durch Extrahierung mit Äther aus Lösungen mit pH 2 und pH 8,5 isoliert man die konjugierten Verbindungen 1 bis 26 von dem Petrolein. Bei den Produkten 3, 9, 13, 22 und 28 muß jedoch eine Wegnahme des Schutzes bei dem Phenol durch das Gemisch HF/KF bei pH 5 in einem Tetrahydrofuran-Milieu erfolgen.
- Die Eigenschaften dieser konjugierten Verbindungen (Fig. 10 bis 13) sind in der Tabelle 9 wiedergegeben.
- Die Messungen wurden bei β-Laktamasen von verschiedenen Bakterienstämmen ausgeführt: Enterobacter cloacae P99, Escherichia coli und Citrobacter freundii, symbolisiert durch: P99, E. Coli und C. Freundii.
- Die Messungen sind in vier Teile unterteilt. Der erste Teil umfaßt die Messungen der enzymatischen Aktivität bei Anwesenheit von variablen Mengen Reportersubstrat (Nitrocefin) und Enzym (bei Abwesenheit eines Inhibitors). Der zweite Teil ist eine Abschätzung der hemmenden Aktivität der Inhibitoren (Tabelle 9). In dem dritten Teil sind die Messungen der enzymatischen Aktivität zusammengefaßt, um die bei der quantitativen Bestimmung zu verwendende Menge Antikörper zu bestimmen. Der vierte Teil weist die quantitative Bestimmung der Haptene auf.
- Die Messungen wurden bei Anwesenheit von Nitrocefin ausgeführt. Das Ziel war die Berechnung der katalytischen Konstante der Enzyme, die dazu dient, die Mengen Substrat und Enzym zu bestimmen, die verwendet werden müssen, um eine mit der Meßzeit kompatible enzymatische Geschwindigkeit zu erreichen. Die Fig. 14 zeigt den Verlauf der maximalen Geschwindigkeit (V&sub0;) der β-Laktamasen von P99, E. Coli und C. Freundii als Funktion der Konzentration an Enzym ([E]) und bei Anwesenheit von Nitrocefin (S) bei Konzentrationen von 60 uM für die Enzyme von P99 und E. Coli, und von 150 uM für das Enzym von C. Freundii. Die Fig. 14 zeigt, daß die enzymatischen Aktivitäten der Enzyme P99 und C. Freundii ähnlich sind. Die auf der Basis des Diagramms berechneten katalytischen Konstanten (kcat) dieser zwei Enzyme sind mit denjenigen der Literatur vergleichbar. Dagegen scheint die enzymatische Aktivität von E. Coli bezüglich des erwarteten Wertes relativ niedrig zu sein.
- Als Beispiel werden die Ergebnisse einer bei dieser Verbindung durchgeführten punktuellen Untersuchung wiedergegeben. Die in der Tabelle 9 wiedergegebenen Ergebnisse sind Werte, die gemäß einer ähnlichen Methode erhalten wurden. Messungen der maximalen enzymatischen Geschwindigkeit (V&sub1;), die bei dem Enzym bei Anwesenheit von Nitrocefin und Nandrolon-carbenicillinat ausgeführt wurden, dienten dazu, die Inhibitionskonstante (Ki) des Inhibitors zu bestimmen. Diese Messungen bestimmen die bei der quantitativen Bestimmung zu verwendenden Konzentrationen an Inhibitor (I). Tabelle 3
- Ziel dieser Messungen ist es, beispielsweise, die Wiederherstellung des größten Teils der enzymatischen Aktivität bei Anwesenheit einer genauen Menge Inhibitor abzuschätzen. In der Tabelle 4 sind die Geschwindigkeiten der enzymatischen Reaktion (Vab) wiedergegeben, die bei Anwesenheit von β-Laktamasen, Nitrocefin, Nandrolon- carbenicillinat und Anti-Nandrolon-Antikörpern aufgezeichnet wurden. In der Tabelle sind außerdem die Verdünnungsfaktoren des Serums, das die indem Meßmilieu verwendeten Antikörper enthält (Serumverdünnung) angegeben. Tabelle 4
- In der Tabelle 4 ist angegeben, daß für eine Konzentration an Inhibitor von 0,2 bis 0,24 uM eine Verdünnung des Antikörperserums um den Faktor. 625 zufriedenstellend zu sein scheint, um eine nahe bei V&sub0; liegende Geschwindigkeit wiederherzustellen. In der Tabelle ist außerdem angegeben, daß eine Erhöhung der Konzentration an Inhibitor um einen Faktor 5 eine Erhöhung der Konzentration an Serum im gleichen Verhältnis voraussetzt.
- Die quantitative Bestimmung von Nandrolon, bei Verwendung der konjugierten Verbindung 1 als Inhibitor, wurde auf die folgende Weise ausgeführt. Zu einer Probe Nandrolon wird eine Nandrolon-carbenicillinat-Lösung zugegeben. Zu dem so erhaltenen Gemisch wird verdünntes Antikörperserum zugegeben, und dann wird während 30 Sekunden verwirbelt. Danach wird eine Lösung aus Reportersubstrat, Puffer und Enzym zugegeben. Nach kurzem Schütteln wird die dekadische Extinktion des Milieus bei 482 nm während 5 Minuten kontinuierlich abgelesen.
- Ein Beispiel der quantitativen Bestimmung von Nandrolon ist in der Fig. 15 wiedergegeben. Das Beispiel zeigt den Verlauf der dekadischen Extinktion bei 482 nm (charakteristische Wellenlänge des hydrolysierten Nitrocefins) als Funktion der Zeit. Der Neigungswinkel jeder Geraden gibt die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion an. Die Geraden des Diagramms zeigen die Entwicklung der Geschwindigkeit mit der Konzentration an freiem Inhibitor. Die Messungen wurden bei Anwesenheit von β-Laktamase von P99 gemacht.
- Zwei in der Tabelle 5 wiedergegebene Beispiele der quantitativen Bestimmung von Nandrolon wurden mit den β- Laktamasen von P99 bzw. E. Coli ausgeführt. Sie zeigen, daß die Genauigkeit der mit der gleichen Konzentration an Inhibitor ausgeführten quantitativen Bestimmungen mit der β- Laktamase von P99 größer ist. Wenn diese letztere verwendet wird, liegt die in dem Meßmilieu nachweisbare minimale Konzentration an Nandrolon in der Größenordnung von 0,02 uM, was 10 Piko-Molen Substanz (Meßvolumen = 500 ul) entspricht. Die bei Verwendung der β-Laktamase von E. Coli nachweisbare minimale Konzentration ist wegen der Ungenauigkeit der mit Konzentrationen unter 0,05 uM (d.h., einer Menge von 25 Piko-Molen) gemachten Messungen schwierig zu bestimmen. Tabelle 5
- Die Fig. 16, in der der Verlauf von [(V&sub0;/V&sub1;)) - 1] als Funktion der Menge Nandrolon dargestellt ist, zeigt eine lineare Beziehung zwischen den zwei Parametern. Eine quantitative Bestimmung mit der β-Laktamase von E. Coli, die mit einer Konzentration an Inhibitor von 1 uM und einer geeigneten Menge Antikörper ausgeführt wurde, zeigt, daß die Bandbreite der quantitativen Bestimmung mit diesem Enzym erhöht werden kann und eine Empfindlichkeitsverringerung damit verbunden ist. Es ist daher wichtig, die Menge Inhibitor zu optimieren, mit dem Ziel, den besten Kompromiß zu verwirklichen.
- Wenn man die Meßzeit der Dosierung kennt, ist es möglich, aufgrund des kcat die Dosierungsmengen Enzym und Substrat abzuschätzen. Zum Beispiel wurde für die obengenannten Dosierungen eine Meßzeit von 5 Minuten festgesetzt. Während dieser 5 Minuten (dt) müßte die dekadische Extinktion bei 482 nm (maximale dekadische Extinktion des hydrolysierten Nitrocefins) im Idealfall bei Abwesenheit von enzymatischer Inhibition um eine Einheit ansteigen (dA = 1). Für das Enzym P99 (kcat = 780 s&supmin;¹) wünscht man, ein dA/dt = 1/300 (s&supmin;¹) zu beobachten, was sich angesichts des Extinktionskoeffizienten des hydrolysierten Nitrocefins (ε = 15000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹) durch eine Hydrolysegeschwindigkeit:
- V&sub0; = dA/dt = 1/(300 · 15000) = 2,2 10&supmin;&sup7; M s&supmin;¹
- äußert.
- Andererseits wird für β-Laktamasen angenommen, daß
- V&sub0; = kcat[E]
- was bedeutet, daß:
- kcat[E] = 2,2 10&supmin;&sup7; M s&supmin;¹
- [E] = 2,2 10&sup7;/780 = 2,8 10&supmin;¹&sup0; M
- Diese Konzentration liegt nahe bei der experimentell bestimmten idealen Konzentration (2,5 10&supmin;¹&sup0; M).
- Die minimale. Konzentration an Substrat, um die Bedürfnisse der quantitativen Bestimmung zu decken, kann ebenfalls abgeschätzt werden. Man weiß, daß während der Zeit der quantitativen Bestimmung (300 s) eine V&sub0; dt entsprechende Produktkonzentration, das heißt, eine Konzentration von 300 · 2,2 10&supmin;&sup7; = 65 10&supmin;&sup6; M in dem Milieu erzeugt wird. Dieser Wert entspricht ungefähr den 60 uM an Substrat, die bei den quantitativen Bestimmungen verwendet werden. Man muß eine ein wenig höhere Konzentration an Substrat verwenden, um durch Sättigung an Substrat eine maximale Geschwindigkeit sicherzustellen. Andererseits ist es wichtig, diese Konzentration zu begrenzen, um ein nahe bei eins liegendes Verhältnis Km/(Km + [S]) aufrechtzuerhalten.
- Alle theoretischen Berechnungen betreffend die zu verwendende Menge Inhibitor und die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung können mittels der Gleichung:
- ausgeführt werden.
- Die bei der quantitativen Bestimmung zu verwendende Menge Inhibitor hängt von der Inhibitionskonstanten Ki ab. Je kleiner diese Konstante ist, desto geringer ist die Menge Inhibitor, die notwendig ist, um eine Veränderung der nachweisbaren enzymatischen Geschwindigkeit zu beobachten.
- Eine Konzentration an Inhibitor, die zu einer Verringerung der enzymatischen Aktivität um 50% führt, scheint eine gute Basis zu sein, um eine quantitative Bestimmung auszuführen. Die Berechnung in dem Fall einer quantitativen Bestimmung mit dem Enzym von P99 bei Anwesenheit von Nandrolon-carbenicillinat (Ki = 70 nM), bei der die oben berechnete. Konzentration an Substrat (65 uM) verwendet wird, ergibt:
- Dieser Wert entspricht der Konzentration, die bei der quantitativen Bestimmung von Nandrolon mit der β-Laktamase von P99 verwendet wurde.
- Wenn man annimmt, daß man eine Veränderung der enzymatischen Geschwindigkeit um 10% leicht nachweisen kann, kann man eine Inhibitormenge nachweisen von:
- Im Fall einer Dosierung von Nandrolon, bei der eine Menge Inhibitor bei Anwesenheit einer stöchiometrischen Menge Antikörper verwendet wird, ist es möglich, die Konzentration von Nandrolon abzuschätzen, die notwendig ist, um den Inhibitor aus seinem immunologischen Komplex zu verdrängen und eine Konzentration an freiem Inhibitor von 24 nM zu erhalten. In dem Fall, in dem das Nandrolon eine Affinität für den Antikörper von der gleichen Größenordnung wie der Inhibitor hat, zeigt die Theorie von Scatchard, daß eine Konzentration von 24 nM Nandrolon den Inhibitor bis zu der Erreichung einer praktisch äquivalenten Konzentration an freiem Inhibitor verdrängt. Die Nachweisgrenze für ein Volumen von 500 ul ist folglich
- 20 10&supmin;&sup9; 500 10&supmin;&sup6; = 10 10&supmin;¹² mol.
- Dieser Wert wird experimentell bestätigt durch das Diagramm für die quantitative Bestimmung von Nandrolon, in dem (V&sub0;/Vi) - 1 als Funktion der Menge Nandrolon wiedergegeben wird.
- Die ausgeführten Dosierungen zeigen, daß es möglich ist, ein Hapten zu dosieren, ohne einen Inkubationsschritt auszuführen. Die Gesamtdauer einer Messung ist nicht größer als 7 bis 8 Minuten. Die Nachweisgrenze für Nandrolon bei dem System β-Laktamase von P99/Nandrolon-carbenicillinat/Nitrocefin/Antikörper ist 10 Piko-mol.
- Die Empfindlichkeit wird durch die Verwendung von Nandrolon-oxacillinat wesentlich verbessert, da die Werte von Ki für Oxacillin (0,5 nM) vorteilhafter sind als diejenigen von Carbenicillin (10 nM).
- Ähnliche Ergebnisse werden mit Theophyllin- carbenicillinat erhalten, dessen kinetische Eigenschaften (Ki) ausreichend sind, um bei einer quantitativen Bestimmung kommerziell genutzt werden zu können.
- Aus der Tabelle 6 ist ersichtlich, daß die Hydrolysegeschwindigkeit des Substrats durch die Anwesenheit von Serum beeinflußt wird. Bei Abwesenheit von Enzym beobachtet man Hydrolysegeschwindigkeiten des Substrats (Nitrocefin), die mit dem in dem Meßmilieu vorhandenen Prozentsatz, von Serum variieren. Aus der Tabelle 6 ist ersichtlich, daß die Zugabe von Natriumazid (NaN&sub3;) oder von 0,07 mg/ml Phenylbutazon diese Geschwindigkeit stark verringert. Außerdem verbessert die Zugabe von 0,07 mg/ml Phenylbutazon die Qualität der quantitativen Bestimmung, da die Verfügbarkeit des Substrats erhöht wird. Beispiele der quantitativen Bestimmung von Nandrolon bei Anwesenheit dieser zwei Schutzmittel sind in dieser Tabelle wiedergegeben.
- Meßvol.: Endvolumen, bei dem die enzymatische Kinetik verfolgt wird
- V: Abbaugeschwindigkeit des Substrats (Nitrocefin)
- Qenz: Konzentration an β-Laktamase P99 in dem Endvolumen
- Qsub: Konzentration an Nitrocefin in dem Endvolumen
- Qinh: Konzentration an Inhibitor in dem Endvolumen
- Qanal: Konzentration an Analyt in dem Endvolumen
- DSA: Verdünnung des Serums, das die Anti-Nandrolon- Antikörper enthält
- %serum: Prozentsatz von Serum in dem Endvolumen
- Tm: Getestetes Schutzmittel (PBS = Puffer Phosphat 0,1 M + NaCl 0,15 M)
- Puffer: Bei den Messungen verwendeter Puffer (Hépès/Phos = Gemisch 9/1 von PBS-Puffer und Hépès-Puffer 2,5 mM)
- pH: pH des bei den Messungen verwendeten Puffers Tabelle 6
- Die obenerwähnte Iod-Stärke-Methode zur Dosierung, die auf der Erzeugung von Iod innerhalb einer stabilisierten. Stärkelösung für das Cadmiumiodid basiert, findet bei der Dosierung weiterer Antibiotika Anwendung.
- Man setzt 100 ml einer Mischlösung an aus Cadmiumiodid 0,003 N und Kaliumiodat 0,00275 N, wozu man 54,92 mg Cadmiumiodid und 9,77 mg Kaliumiodat in einer Hépès- Pufferlösung pH 8,2 (10 mM), der 1% Stärkelösung zugegeben wurde, auflöst. Außerdem setzt man 100 ml DTPA-Lösung 0,2 M in dem Hépès-Puffer an. Schließlich setzt man eine Cephalexin-Stammlösung 1 mM an, wozu man 34 mg Cephalexin in 100 ml des oben beschriebenen Hépès-Puffers auflöst.
- - Man hydrolysiert und verdünnt die Cephalexin-Stammlösung, wozu man 1 ml entnimmt, den man mit 4 ml Natriumcarbonat 0,001 M während 15 Minuten behandelt, und dann füllt man mit dem Hépès-Puffer auf 100 ml auf.
- - Man setzt eine Iod-Stärke-Lösung an durch Entnahme von 20 ml Mischlösung, 25 ml DTPA und 3 ml Eisessig, und dann füllt man mit Hépès-Puffer bis auf das Volumen auf (Iod- Stärke-Lösung).
- - Man verwirklicht eine Skala für die Konzentration von hydrolysiertem Cephalexin von 1 bis 6 uM, wozu man Volumen von 100 bis 600 : 1 entnimmt, zu denen man 100 ul der Iod- Stärke-Lösung zugibt. Man füllt mit Hépès-Puffer auf ein Volumen von 1 ml auf.
- - Man mißt die endgültige dekadische Extinktion der Lösungen nach 5 Minuten bei 620 nm.
- 0 0.963
- 1 0.831
- 2 0.682
- 3 0.549
- 4 0.428
- 5 0.280
- 6 0.155
- Man erhält den Korrelationskoeffizienten 0,9961 und die Geradengleichung
- Y = -0,1345 X + 0,96
- - Man verdünnt das Cephalexin so, daß man eine Konzentration zwischen 0,5 und 2 mM erhält.
- - Man hydrolysiert und man verdünnt die vorherige Lösung gemäß der für die Herstellung der Skala verwendeten Technik.
- - Man entnimmt 250 ul der hydrolysierten Cephalexin-Lösung, man gibt 100 ul Stärke-Iod-Lösung zu, und man füllt mit Hépès-Puffer auf ein Volumen von 1 ml auf.
- - Nach 5 Minuten liest man die dekadische Extinktion bei 620 nm ab, und man berechnet die Konzentration bezüglich der vorher festgelegten Skala. 10. Dosierung von Nandrolon unter Verwendung von Nandrolon- carbenicillat (konjugierte Verbindung 1) und des Cephalexin-Iod-Stärke-Gemischs als Reportersubstrat mit der β-Laktamase von P99 (Tabelle 8) Tabelle 8
- Die Färbungsveränderung wird bei 620 nm beobachtet, und entspricht einem Iodverbrauch des bei dem Meßprozeß abgebauten Cephalexins. Das ul wird auf die folgende Weise erzeugt: Man entnimmt 100 ul einer Mischlösung aus Stärke- Cadmumiodid und Kaliumiodat (CdI&sub2; 0,002 N - KIO&sub3; 0,0024 N - Stärke 1,5%). Zu dieser Lösung gibt man 100 ul DTPA- Natriumsalz-Lösung 0,1 N zu, und man bringt den pH auf 2 durch Zugabe von HCl. Nach der Reaktion bringt man den pH auf 7 durch Zugabe einer genügenden Menge Hépès-Puffer 0,02 M, und dann füllt man auf das Endvolumen von 900 ul auf, nachdem man die Reagenzien der homogenen quantitativen Immunbestimmung eingebracht hat. Tabelle 9 Eigenschaften der konjugierten Verbindungen von Carbenicillin und Oxacillin
- Diese Dosierung erfolgt wie bei dem Beispiel 5, und ist in der Tabelle 10, sowie in der Fig. 17 wiedergegeben. Tabelle 10
Claims (21)
1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Haptens
in einer homogenen Phase, bei dem:
- eine bekannte Menge eines Inhibitor-Hapten-Komplexes zu der Lösung, die das
nachzuweisende und/oder quantitativ zu bestimmende Hapten enthält, zugegeben wird;
- zu der Lösung eine Menge Antikörper zugegeben wird, die der Menge des Inhibitor-
Hapten-Komplexes entspricht;
- zu der Lösung eine β-Laktamase vom Typ C zugegeben wird, die eine aktive Stelle für
zwei Substrate besitzt, die bei der aktiven Stelle in Wettbewerb treten, wobei das erste
Substrat ein Reportersubstrat ist, das in ein vorzugsweise durch Mesung der sichtbaren
UV-Strahlung nachweisbares und/oder quantitativ bestimmbares Produkt umwandelbar
ist, und das zweite Substrat der Inhibitor-Hapten-Komplex ist, der auf die
Hydrolysegeschwindigkeit des Reportersubstrats wirkt;
- die Konzentration des, aus der Umwandlung des Reportersubstrats hervorgegangenen
Produkts nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt wird, wobei die Konstante Km des
Reportersubstrats mindestens 100-mal größer als die Konstante Km des Inhibitor-Hapten-
Komplexes ist, und die Konstante kcat des Reportersubstrats mindestens 10-mal größer als
die Konstante kcat des Inhibitor-Hapten-Komplexes ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem vor den obenerwähnten Schritten zu der
Lösung, die das zu bestimmende Hapten enthält, Substanzen zugegeben werden, um die
eventuellen Störungen, wie, Schutzmittel der β-Laktamase, Schutzmittel des
Reportersubstrats, Schutzmittel des Inhibitor-Hapten-Komplexes oder dekontaminierende
Mittel zu beseitigen.
3. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Konstante kcat des Reportersubstrats größer als 0,1 s&supmin;¹,
vorzugsweise größer als 10 s&supmin;¹ ist.
4. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Konstanten Ki und kcat des Inhibitor-Hapten-Komplexes kleiner
als 5000 uM (vorzugsweise kleiner als 100 uM) bzw. kleiner als 0,1 s&supmin;¹ sind.
5. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die β-Laktamase in der Gruppe gewählt wird, die von den aus
Enterobacter cloacae Q908R und P99, Citrobacter freundii und Escherichia coli
hervorgegangenen β-Laktamasen gebildet wird.
6. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß der Inhibitor und das Reportersubstrat in der Gruppe gewählt
werden, die von Penicillinen, Cephalosporinen und β-Laktam-Antibiotika gebildet wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportersubstrat
in der Gruppe bestehend aus Cephaloridin, Nitrocefin, Cephalothin, Cephalexin,
Cephalosporin C, Cephacetril und Cefazolin gewählt wird.
8. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Umwandlung des Reportersubstrats durch ein Stärke-Jod-
Färbesystem nachgewiesen wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor in der
Gruppe bestehend aus Carbenicillin, Oxacillin, Cefuroxin, Cefotaxim und Methicillin,
gewählt wird.
10. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hapten in der Gruppe bestehend aus den aktiven Komponenten
von Medikamenten, Hormonen, Anabolika und/oder Drogen gewählt wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten in der
Gruppe bestehend aus Testosteron, Östridiol, Progesteron, Aldosteron, Cortisol,
Methylamphetamin, Methadon, Tetrahydrocannabinol, Δ4-Androstenedion, Morphin,
DHEA-Sulfat, Nandrolon, Theophyllin, Cocain und/oder ihren Hydrolysederivaten
gewählt wird.
12. Vorrichtung zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Haptens
in einer homogenen Phase, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine β-Laktamase vom Typ
C, die eine aktive Stelle für zwei Substrate besitzt, die bei der aktiven Stelle in
Wettbewerb treten, sowie die zwei Substrate umfaßt, wobei das erste- Substrat ein
Reportersubstrat ist, das in ein vorzugsweise durch Messung der sichtbaren UV-Strahlung
nachweisbares und/oder quantitativ bestimmbares Produkt umwandelbar ist, und das
zweite Substrat der Inhibitor-Hapten-Komplex ist, der die Hydrolysegeschwidigkeit des
Inhibitor-Hapten-Komplexes moduliert, wobei die Vorrichtung außerdem Antikörper
aufweist, die geeignet sind, den Inhibitor-Hapten-Komplex zu fixieren, und daß die
Konstante Km des Reportersubstrats mindestens 100-mal größer als die Konstante Km des
Inhibitor-Hapten-Komplexes ist, und daß die Konstante kcat des Reportersubstrats
mindestens 10-mal größer als die Konstante kcat des Inhibitor-Hapten-Komplexes ist.
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstante kcat
des Reportersubstrats größer als 0,1 s&supmin;¹, vorzugsweise größer als 10 s&supmin;¹ ist.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die
Konstanten Ki und kcat des Inhibitor-Hapten-Komplexes kleiner als 5000 uM
(vorzugsweise kleiner als 100 uM) bzw. kleiner als 0,1 s&supmin;¹ sind.
15. Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, daß die β-Laktamase in der Gruppe bestehend aus Enterobacter cloacae
Q908R und P99, Citrobacter freundii und Escherichia coli hervorgegangenen β-
Laktamasen gewählt wird.
16. Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß der Inhibitor und das Reportersubstrat in der Gruppe gewählt
werden, die aus Penicillinen, Cephalosporinen und β-Laktam-Antibiotika besteht.
17. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das
Reportersubstrat in der Gruppe bestehend aus Cephaloridin, Nitrocefin, Cephalothin,
Cephalexin, Cephalosporin C, Cephacetril und Cefazolin gewählt wird.
18. Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, daß die Umwandlung des Reportersubstrats durch ein Stärke-Jod-
Färbesystem nachgewiesen wird.
19. Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch
gekennzeichnet, daß der Inhibitor in der Gruppe bestehend aus Carbenicillin, Oxacillin,
Cefuroxin, Cefotaxim und Methicillin gewählt wird.
20. Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hapten in der Gruppe bestehend aus aktiven Komponenten von
Medikamenten, Hormonen, Anabolika und/oder Drogen gewählt wird.
21. Vorrichtung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten in der
Gruppe bestehend aus Testosteron, Östridiol, Progesteron, Aldosteron, Cortisol,
Methylamphetamin, Methadon, Tetrahydrocannabinol, Δ4-Androstenedion, Morphin,
DHEA-Sulfat, Nandrolon, Theophyllin, Cocain und/oder ihren Hydrolysederivaten
gewählt wird.
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