DE69635901T2

DE69635901T2 - Polycyclische derivate

Info

Publication number: DE69635901T2
Application number: DE69635901T
Authority: DE
Inventors: Rennet George PROCTOR; Lang Alan HARVEY; Theresa Maureen MCKENNA; John Steven MULLINS
Original assignee: University of Strathclyde
Current assignee: University of Strathclyde
Priority date: 1995-11-29
Filing date: 1996-11-28
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2016-11-29
Also published as: US6130228A; EP0877735A1; JP2000501092A; WO1997019929A1; AU7702796A; DE69635901D1; EP0877735B1; GB9524346D0

Description

HINTERGRUND
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, von denen gefunden wurde, daß sie Antiacetylcholinesterase-Aktivität und/oder Hemmung von 5-HT-Aufnahme und/oder Hemmung von Noradrenalin-Aufnahme zeigen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung polycyclische Verbindungen und Analoge davon, Verfahren für deren Herstellung, pharmazeutische Formulierungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung als Neurotransmitter verstärkende Mittel, insbesondere für die Behandlung von Symptomen der Alzheimerschen Krankheit.
Es wurde viel Arbeit in der Forschung auf dem Gebiet von Arzneimitteln geleistet, die Neurotransmitter-Systeme im zentralen Nervensystem (CNS) beeinflussen. Neurotransmitter-Moleküle sind an schneller Kommunikation im normalen CNS und an pathologischen Zuständen des CNS beteiligt. Die meisten von den Arzneimitteln, die für den Psychiater oder Neurologen zur Behandlung einer CNS-Krankheit verfügbar sind, funktionieren direkt oder indirekt durch Beeinflussung der Neurotransmitterwege. Von allen derzeit bekannten CNS-Erkrankungen sind diejenigen, die mit organischer oder degenerativer Demenz verbunden sind, nicht imstande, mit dem Bereich von Arzneimitteln, der derzeit verfügbar ist, wirksam behandelt zu werden. Für eine spezielle Erkrankung, die Alzheimersche Krankheit, auch bekannt als degenerative Demenz, senile Demenz, senile Demenz des Alzheimer-Typs und organisches Hirnsyndrom, ist keine wirksame Behandlung bekannt.
Bestimmte Arzneimittel, wie beispielsweise sogenannte zentral aktive muskarinische Arzneimittel (d.h., Arzneimittel, die direkt auf die Acetylcholin-Rezeptoren wirken, wobei eine Reaktion erzeugt wird), wirken auf sogenannte muskarinische Rezeptoren. Es wurde gefunden, daß muskarinische Rezeptoren aus mindestens 3 Unterklassen: M₁, M₂ und M₃, aufgebaut sind. Diese Rezeptoren werden im Hirn, Herz und Darm gefunden, und infolgedessen trägt die Verwendung von muskarinischen Arzneimitteln die Möglichkeit unerwünschter Nebenwirkungen wie beispielsweise Übelkeit oder Verlangsamung oder Stillstand des Herzens mit sich.
Tacrin, ein tricyclischer Acetylcholinesterase-Inhibitor, ist, dafür bekannt, daß er als Nebenwirkung Leberschädigung erzeugt, die, obwohl nicht angenommen wird, daß sie von Natur aus irreversibel ist, nichtsdestotrotz unerwünscht ist.
Es gibt einen Bedarf, wirksamere Arzneimittel für die Behandlung oder Linderung von Symptomen von Krankheiten des CNS mit organischer oder degenerativer Demenz bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, wirksamere und/oder selektivere polycyclische Arzneimittel für die Behandlung oder Linderung von Symptomen von Krankheiten des CNS mit organischer oder degenerativer Demenz bereitzustellen.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den Beispielen offensichtlich.
DARLEGUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen mit der allgemeinen Formel (III) bereitgestellt:
wobei
R¹ Cl ist und R² H ist; oder
R¹ H ist und R² Cl ist.
Natürlich erkennt der angesprochene Fachmann, daß Additionssalze freier Säuren von Verbindungen der Formel (III) in der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingeschlossen sind.
Zu geeigneten Säureadditionssalzen gehören diejenigen, erzeugt aus Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff, Salpeter-, Perchlor-, Schwefel-, Citronen-, Wein-, Phosphor-, Milch-, Benzoe-, Glutamin-, Oxal-, Asparagin-, Brenztrauben-, Bernstein-, Fumar-, Malein-, Oxalessig-, Isethion-, Stearin-, Phthal-, Methansulfon-, p-Toluolsulfon-, Benzolsulfon-, Lactobion- und Glucuronsäure. Am meisten bevorzugt sind die Salze pharmazeutisch verträglich.
Die Verbindungen gemäß der Formel (III) sind:
Die Antiacetylcholinesterase- und die Hemmung der 5-HT-Aufnahme- und/oder Noradrenalin-Aufnahme-Aktivität von Verbindungen der Formel (III) wurde in einer Anzahl von Tests in vitro demonstriert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen von Verbindungen der allgemeinen Formel (III) bereitgestellt, welches Verfahren die Synthese eines α-Cyanoketons, wie beispielsweise des nachstehend dargestellten:
einschließt.
In diesem Fall wurde das α-Cyanoketon, Cyclopentanon-2-carbonitril, durch die Thorpe-Ziegler-Cyclisierung von 1,4-Dicyanobutan und nachfolgende Hydrolyse synthetisiert, wie vorstehend dargestellt ist.
Substituierte oder unsubstituierte Anilinverbindungen können dann gemäß dem folgenden allgemeinen Schema mit Cyanoketonen kondensiert werden und dann unter Verwendung von Lewissäuren zu einem Tacrinderivat umgewandelt werden:
Zu Beispielen von Lewissäuren, die in dem vorstehenden Schema verwendet werden können, gehören BF₃·O(CH₂CH₃)₂, AlCl₃ und TiCl₄. Zu Beispielen von unabhängig ausgewählten Substituenten, R, die hinzugegeben werden können, wobei Anilinderivate (A) erzeugt werden, gehören CH₃, OH, F, Br, Cl und -OCH₃. So kann es mehr als einen R-Substituenten an dem Anilinderivat (A) geben.
Von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird angegeben, daß sie bei der Linderung von Symptomen der Alzheimerschen Krankheit nützlich sind. Sie können bei der Behandlung verschiedenartiger Formen von organischer oder degenerativer Demenz angewendet werden.
Zusätzlich wird als weiterer oder alternativer Aspekt der Erfindung eine Verbindung der Formel (III) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder physiologisch funktionelles Derivate davon zur Verwendung in der Therapie, zum Beispiel bei der Behandlung von Alzheimerscher Krankheit, bereitgestellt.
Die Menge der Verbindung der Formel (III), die erforderlich ist, um bei einer Behandlung für degenerative Demenz, wie beispielsweise Alzheimersche Krankheit, wirksam zu sein, variiert natürlich und liegt letztlich im Ermessen des praktischen Arztes oder Tierarztes. Zu den Faktoren, die in Betracht zu ziehen sind, gehören das zu behandelnde Leiden, der Weg der Verabreichung und die Natur der Formulierung, das Körpergewicht des Säugers, die Oberfläche, das Alter und der allgemeine Zustand sowie die zu verabreichende spezielle Verbindung. Eine geeignete wirksame Dosis liegt in dem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 120 mg/kg Körpergewicht, z.B. 0,1 bis etwa 120 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise in dem Bereich von etwa 0,1 bis 50 mg/kg, zum Beispiel 0,5 bis 5 mg/kg. Die gesamte tägliche Dosis kann als Einzeldosis, mehrfache Dosen, z.B. zwei bis sechs Mal pro Tag, oder durch intravenöse Infusion für eine ausgewählte Zeitdauer verabreicht werden. Zum Beispiel würde für einen 75-kg-Säuger (z.B. ein Mensch) der Dosisbereich etwa 8 bis 9000 mg pro Tag betragen und eine typische Dosis könnte etwa 50 mg pro Tag betragen. Wenn gesonderte mehrfache Dosen angezeigt sind, könnte die Behandlung typischerweise in 15 mg einer Verbindung der Formel (III), gegeben bis zu 4 Mal pro Tag, bestehen.
Wenn es auch möglich ist, daß die aktive Verbindung allein verabreicht wird, ist es vorzuziehen, die aktive Verbindung in einer pharmazeutischen Formulierung darzubieten. Formulierungen der vorliegenden Erfindung für medizinischen Gebrauch umfassen eine Verbindung der Formel (III) oder ein Salz davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen. Der (Die) Träger sollte(n) pharmazeutisch verträglich in dem Sinne sein, mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für deren Empfänger nicht schädlich zu sein.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb weiterhin eine pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Verbindung der Formel (III) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder physiologisch funktionelles Derivat davon zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger dafür, bereit.
Es wird auch ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung bereitgestellt, das umfaßt, eine Verbindung der Formel (III) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder physiologisch funktionelles Derivat davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür in Verbindung zu bringen.
Zu Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung gehören diejenigen, die für orale, topische, rektale oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung geeignet sind. Bevorzugte Formulierungen sind diejenigen, die für orale oder parenterale Verabreichung geeignet sind.
Die Formulierungen können bequem in Einheitsdosierungsform dargeboten werden und können nach einem beliebigen der auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, die aktive Verbindung mit einem Träger in Verbindung zu bringen, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile ausmacht. Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem die aktive Verbindung in gleichmäßige und innige Verbindung mit einem flüssigen Träger oder einem fein verteilten festen Träger oder beiden gebracht wird und dann, wenn notwendig, das Produkt zu gewünschten Formulierungen geformt wird.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für orale Verabreichung geeignet sind, können als gesonderte Einheiten, wie Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung enthalten; als Pulver oder Körnchen; oder eine Lösung oder Suspension in einer wässerigen oder nichtwässerigen Flüssigkeit, wie beispielsweise ein Sirup, ein Elixier, eine Emulsion oder ein Arzneitrank, dargeboten werden.
Eine Tablette kann durch Zusammenpressen oder Formpressen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, hergestellt werden. Zusammengepreßte Tabletten können hergestellt werden, indem in einer geeigneten Maschine die aktive Verbindung in einer freifließenden Form, wie beispielsweise ein Pulver oder Körnchen, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel, Schmiermittel, inertem Verdünnungsmittel, grenzflächenaktiven oder dispergierenden Mittel, zusammengepreßt wird. Formgepreßte Tabletten können hergestellt werden, indem in einer geeigneten Anpassung ein Gemisch der gepulverten aktiven Verbindung mit einem geeigneten Träger preßgeformt wird.
Ein Sirup kann hergestellt werden, indem die aktive Verbindung zu einer konzentrierten wässerigen Lösung eines Zuckers, zum Beispiel Saccharose, zu der auch zusätzliche Bestandteile hinzugegeben sein können, hinzugegeben wird. Zu derartigen zusätzlichen Bestandteilen können Geschmacksstoffe, ein Mittel zur Verzögerung der Kristallisation des Zuckers oder ein Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit von irgendwelchen anderen Bestandteilen, wie beispielsweise ein mehrwertiger Alkohol, zum Beispiel Glycerin oder Sorbitol, gehören.
Formulierungen für rektale Verabreichung können als Suppositorium mit einem herkömmlichen Träger wie beispielsweise Kakaobutter dargeboten werden.
Formulierungen, die für parenterale Administration geeignet sind, umfassen passenderweise eine sterile wässerige Zubereitung der aktiven Verbindung, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des Empfängers ist. Derartige Formulierungen umfassen geeigneterweise eine Lösung eines pharmazeutisch und pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalzes einer Verbindung der Formel (III), die isotonisch mit dem Blut des Empfängers ist.
Verwendbare Formulierungen umfassen auch konzentrierte Lösungen oder Feststoffe, enthaltend eine Verbindung der Formel (III), die bei Verdünnung mit einem entsprechenden Lösungsmittel eine Lösung für parenterale Verabreichung wie vorstehend ergeben.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Bestandteilen können die Formulierungen dieser Erfindung einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile, ausgewählt aus Verdünnungsmitteln, Puffern, Geschmacksstoffen, Bindemitteln, grenzflächenaktiven Mitteln, Verdickern, Schmiermitteln, Konservierungsmitteln (einschließlich Antioxidantien) und dergleichen, einschließen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (III) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder physiologisch funktionellen Derivats davon für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von degenerativen Hirnerkrankungen, wie beispielsweise Alzheimersche Krankheit, bereit.
Die Erfindung wird jetzt durch die folgenden nicht begrenzenden Beispiele veranschaulicht.
AUSSTATTUNG
Schmelzpunkte wurden auf einer Gallenkamp-Schmelzpunktapparatur in offenen Kapillaren erhalten und sind unkorrigiert.
¹H-NMR-Spektren wurden auf einem Spektrometer Perkin-Elmer R32, betrieben bei 90 MHz, auf einem Spektrometer Bruker SM250, betrieben bei 250,13 MHz, und auf einem Spektrometer Bruker AMX400, betrieben bei 400,13 MHz, bei dem WM250 und dem AMX400 in Fourier-Transform-Arbeitsweise, aufgezeichnet. J-Werte sind in Hertz angegeben. ¹³C-Spektren wurden auf einem Bruker AMX400, betrieben bei 100,62 MHz, in Fourier-Transform-Arbeitsweise aufgezeichnet.
Infrarot-Spektren wurden auf einem FTIR-Spektrometer Unicam Mattson 1000-Serie als dünne Filme, Nujol-Suspensionen oder in Lösungszellen aufgezeichnet.
Flash-Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von CAMLAB Art.-Nr. 81538 MN Kieselgel 60 (0,040–0,063 mm) und Merck 7735 Silicagel Typ 60 (0,125–0,250 mm) oder auf modifiziertem C₁₈:C₁-Umkehrphasen-Silicagel^R ausgeführt. Proben wurden in der Lösung oder adsorbiert auf Siliciumdioxid aufgebracht.
Massenspektren wurden auf einem doppelt fokussierenden AEIMST-Massenspektrometer, modifiziert mit einer Festkörperkonsole, unter Verwendung eines computergestützten GEC-905-Datensystems erhalten.
Die Analyse von Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff wurde auf einem Analysator Carlo Erba 1106 unter Verwendung eine Technik, basierend auf dem klassischen Pregl-Dumas-Verfahren, bestimmt.
Halogene wurden durch Verbrennen der Probe in einem Sauerstoffkolben, der Wasserstoffperoxid und Kaliumhydroxid enthielt, und Titrieren einer alkoholischen Lösung der Produkte mit Quecksilber(II}nitrat unter Verwendung von Diphenylcarbazon als Indikator (Mercurimetrisches Verfahren) bestimmt.
Schwefel wurde durch Verbrennen der Probe in einem Sauerstoffkolben, der Wasserstoffperoxid und Wasser enthielt, und Titrieren einer alkoholischen Lösung der Produkte mit Bariumperchlorat unter Verwendung des gemischten Indikators THORON und Methylenblau bestimmt.
Toluol wurde über Natrium getrocknet; THF wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat vorgetrocknet und über Calciumhydrid oder Natriumbenzophenonketyl destilliert.
Alle Lösungen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat oder wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert.
Dünnschichtchromatographie wurde auf Kunststoffplatten ausgeführt, die mit 0,25 mm Aluminiumoxid, ebenfalls mit Fluoreszenzindikator UV₂₅₄, beide von CAMLAB geliefert, vorbeschichtet waren.
BEISPIEL 1: 2-AMINO-CYCLOPENT-1-EN-CARBONITRIL(ZWISCHENVERBINDUNG)
1,4-Dicyanobutan (Aldrich Chemicals) (21,6 g, 0,2 mmol), Natriumhydrid (60%ige Öldispersion; 8,0 g, 0,2 mmol) und THF (100 ml) wurden für 16 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen bei 0°C wurde Wasser (100 ml) hinzugegeben und die obere Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und das Lösungsmittel wurde verdampft. Umkristallisieren aus heißem (80°C) Toluol ergab das Produkt.
Smp. 145–146°C
(Gefunden: C, 6,6; H, 7,77; N, 26,05. Ber. für C₆H₈N₂ C, 66,6; H, 7,5; N, 25,9%).
δH [250 MHz, (CD₃)₂SO] 1,76 (1H, Quin, J=7,4, CH ₂-4), 2,33 (1H, t, J=7,9, CH ₂-3) 2,37 (1H, t, J=7,1, CH ₂-5), 6,36 (1H, br s, NH ₂).
BEISPIEL 2: 2-OXO-CYCLOPENTAN-CARBONITRIL (ZWISCHENVERBINDUNG)
Cyanoenamin (Beispiel 1) (2,7 g, 25 mmol) und 1 M Chlorwasserstoffsäure (30 ml) wurden bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit Ammoniumchlorid gesättigt, und die organischen Komponenten wurden in Dimethylether extrahiert, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert, und der Ether wurde verdampft. Kugelrohr-Destillation (100°C, 1 mm Hg) ergab das Produkt als farblose Flüssigkeit.
(Gefunden: C, 65,3; H, 6,3; N, 12,7. Ber. für C₆H₇NO C, 66,0; H, 6,5; N, 6,5; N, 12,8%) Max (Flüssigkeitsfilm)/cm^–1 3004 und 2902 (C-H), 2264 (CN) und 1779 (C=O).
δH (400 MHz; CDCl₃) 1,81–2,47(6H, m, CH ₂), 3,17 (1H, ddd, J=10,9, 8,5 und 0,6, CH-1).
BEISPIEL 3: 2-(3'-CHLORPHENYL)AMINOCYCLOPENT-1-EN-CARBONITRIL(ZWISCHENVER-BINDUNG, DIE ZU (16) UND (17) FUHRT)
3-Chloranilin (Aldrich Chemicals) (5,1 g, 40,0 mmol), Cyanoketon (Beispiel 2) (4,4 g, 40,4 mmol) und Calciumchlorid (5,0 g, 45,0 mmol) in THF (60 ml) wurden für 17 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Kugelrohr-Destillation (150°C, 0,2 mm Hg) ergab das Produkt als hellgelbes Pulver.
Smp. 111–112°C
(Gefunden: C, 65,9; H, 5,1; N, 12,6; Cl, 16,5. C₁₂H₁₁ClN₂ erfordert C, 65,9; H, 5,1; N, 12,8; Cl, 16,2%).
δH (250 MHz; CDCl₃) 1,99 (2H, Quin, J=7,4, CH ₂-4), 2,60 (2H, tt, J=7,2, 1,5 CH-5), 2,72 (2H, t, J=7,5, CH ₂-3), 6,77 (1H, br s, NH, 6,90) (1H, ddd, J=8,1, 2,1, 1,3, Ar-H-4'), 7,02 (1H, dd, J=2,0, 2,0, Ar-H-2'), (1H, ddd, J=9,8, 1,9, 1,0, Ar-H-6'), 7,23 (1H dd, J=8,0, 8,0, Ar-H-5').
BEISPIEL 4: 9-AMINO-8-CHLOR-2,3-DIHYDRO-1H-CYCLOPENTA[B]CHINOLIN UND 9-AMINO-6-CHLOR-2,3-DIHYDRO-1H-CYCLOPENTA[B]CHINOLIN (16) UND (17)
Unter Stickstoff wurde Titantetrachlorid (2,4 ml, 22 mmol) zu dem vorstehenden Enamin (Beispiel 3) (4,4 g, 20 mmol) hinzugegeben und das gerührte Gemisch wurde für 1 Stunde bei 140°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde 10 M Natriumhydroxidlösung (40 ml) hinzugegeben und das Gemisch wurde für 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlenlassen wurde dieses Gemisch filtriert und die Feststoffe wurden mit Dichlormethan gewaschen. Alle organischen Stoffe in dem Filtrat wurden ebenfalls in Dichlormethan extrahiert. Alle Extraktionen wurden vereinigt, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Kugelrohr-Destillation (175–200°C, 0,02 mm Hg), gefolgt von Chromatographie auf Siliciumdioxid mit Chloroform-Ethanol-10M-Ammoniaklösung (200:8:1) als Eluierungsmittel ergab zwei Produkte. Kugelrohr-Destillation der ersten Fraktion (160°C, 0,08 mm Hg) ergab ein weißes Pulver (16). Eine ähnliche Destillation der zweiten Fraktion (200°C, 0,03 mm Hg) ergab ein weißliches Pulver (17).

i) Smp. 185°C (16) (Gefunden: C, 65,95; H, 5,35; N, 12,8; Cl, 16,2. Ber. für C₁₂-H₁₁ClN₂; C, 65,9; H, 5,1; N, 12,8; Cl, 16,2%). δH [250 MHz; (CD₃)₂-SO] 2,07 (2H, Quin, J=7,6, CH ₂-2), 2,79 (2H, t, J=7,3, CH₂-1), 2,91 (2H, t, J=7,7, CH ₂-3), 6,53 (2H, br s, NH ₂), 7,34 (1H, dd, J=7,5, 1,5, Ar-H-7), 7,42 (1H, t, J=7,8, Ar-H-6), 7,65 (1H, dd, J=8,2, 1,5, Ar-H-5)
ii) Smp: 271–272°C (Zers.) (17) (Gefunden: C, 65,5; H, 4,9; N, 12,7; Cl, 17,4. C₁₂H₁₁ClN₂ erfordert C, 65,9; H, 5,1; N, 12,8; Cl, 16,2%). δH [250 MHz; (CD₃)₂SO] 2,06 (2H, Quin, J=7,5, CH ₂-2), 2,80 (2H, t, J=7,3, CH ₂-1), 2,91 (2H, t, J=7,7, CH ₂-3), 6,77 (2H, br s, NH₂), 7,34 (1H, dd, J=8,9, 2,2, Ar-H-7), 7,68 (1H, d, J=2,2, Ar-H-5), 8,18 (1H, d, d=9,0, Ar-H-8).

BEISPIEL 5: PHARMAKOLOGIE
Vier Assays wurden angewendet, um die biologische Aktivität zu messen: Hemmung der Aktivität der Aufnahme von Acetylcholinesterase (AChE),
Hemmung der Aktivität von Butyrylcholinesterase (BChE),
Hemmung der Aufnahme von 5-HT (Serotonin),
Hemmung der Aufnahme von Noradrenalin (NA).
Die biologische Aktivität von primärem Interesse war die von AChE und die 5-HT-Aufnahme. Die BChE-Aufnahme wurde so gemessen, daß Verbindungen, die selektiv für AChE sind, ausfindig gemacht werden konnten. Die Hemmung der Noradrenalinaufnahme wurde gemessen, da Verbindungen von Interesse sind, die die Fähigkeit haben, Transmission unter Beteiligung von Noradrenalin ebenso wie 5-HT und Acetylcholin zu verstärken.
BEISPIEL 5(A): ANTIACETYLCHOLINESTERASE-ASSAY
Der Anticholinesterase-Assay basiert auf dem Verfahren von Ellman et al., (Biochem. Pharmac. (1961) 7 S. 88–95), indem die Aktivität von AChE in den folgenden gekoppelten Reaktionen gemessen wird:

(PDS=4,4-Dithiopyridin; AChE=Acetylcholinesterase)
Absorptionsmaximum ist bei 324 nm.

(i) Enzymquelle für AChE
Das folgende Verfahren der Isolierung des Enzyms ist im wesentlichen eine Modifizierung des Verfahrens von Rotundo R.L. (1984) J. Biol. Chem. 259 (21) S. 13186–13194. 5 männliche Ratten (Sprague Dawley), die ungefähr 250 g wogen, wurden durch Überdosis von CO₂ und zervikale Dislokation getötet.
Das Hirn wurde entfernt und (9 Arbeitstakte bei 840 U/min) mit 4 Volumina von Phosphatpuffer pH 7,4 + 10 mM (EDTA) homogenisiert und für 30 Minuten bei 27000 g zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in Phosphatpuffer mit 10 nM EDTA + 1% Triton X100 (2 ml/g Naßgewicht) resuspendiert. Das rohe Homogenat wurde bei 27000 g für 30–40 Minuten zentrifugiert.
Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde in 0,5-ml-Aliquote verteilt und bei –20°C aufbewahrt, bis er benötigt wurde.
Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)

Na₂HPO₄ – 5,75 g
NaH₂PO₄2H₂O – 1,48 g
Aufgefüllt auf 500 ml mit destilliertem H₂O, pH 7,4.
Acetylthiochinolin – 5,2 mM (3,07 mg/2 ml Phosphatpuffer)
PDS – 21 mM

(ii) Assayverfahren
0,5-ml-Aliquote von Hirn (Enzymlösung), wie vorstehend hergestellt, wurden aufgetaut. 2 ml Phosphatpuffer wurden zu jedem Aliquot hinzugegeben. 2 ml der Enzymlösung wurden mit 2 ml PDS für 60 Minuten bei 0°C inkubiert. Die Zusammensetzung von Blindversuchs-, Kontroll- und Testlösungen ist nachstehend angegeben:
Blindversuch

0,9 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)
0,1 ml Enzym, PDS-Lösung

Kontrolle

0, 85 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)
0,1 ml Enzym, PDS-Lösung
0,05 ml Acetylthiochinolin (5,2 mM)

Anwesenheit von Inhibitor

0,8 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)
0,1 ml Enzym, PDS-Lösung
0,05 ml Acetylthiochinolin, 5,2 mM
0,05 ml Inhibitor (Beispiele 1–7), um endgültige Konzentrationen von 1, 3, 10, 30, 100, 300 nM; 1, 3, 10, 30, 100 μM zu ergeben.

Die Änderung der Extinktion wurde in 30-Sekunden-Intervallen für 3 Minuten bei 324 nm gemessen. Die Kontrolle wurde als 100% genommen. Der Inhibitor wurde als Prozentsatz der Kontrolle berechnet. Eine graphische Darstellung vom Log der Inhibitorkonzentration gegen% Kontrolle wurde aufgezeichnet und IC₅₀-Werte wurden durch Interpolation berechnet. Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
BEISPIEL 5(B): ANTIBUTYRYLCHOLINESTERASE-ASSAY
Der Anticholinesterase-Assay basiert auf dem Messen der Aktivität von BChE in den folgenden gekoppelten Reaktionen:

(PDS= 4,4-Dithiopyridin; BChE=Butyrylcholinesterase)

(i) Enzymquelle:
BChE (Sigma-Produkt c-7512) 2,5 mg/ml Phosphatpuffer mit 1% Triton X100 wurde für jeden Versuch frisch hergestellt. Die folgenden Komponenten wurden verwendet:
Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)

Na₂HPO₄ 5,75 g
NaH₂PO₄2H₂O 1,48 g
Aufgefüllt auf 500 ml mit destilliertem H₂O, pH 7,4.
Acetylthiocholin 5,2 mM (3,07 mg/2 ml Phosphatpuffer)
PDS 21 mM (2,31 mg in 1 ml CH₃CH₂OH, plus 4 ml Phosphatpuffer)

ii) Analysenverfahren
1 ml Enzymlösung (i) wurde mit 2 ml PDS für 60 Minuten bei 0°C inkubiert.
Die Komponenten des Blindversuchs, der Kontrollen und Testlösungen des Assays sind nachstehend bereitgestellt:
Blindversuch

0,9 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)
0,1 ml Enzym, PDS-Lösung

Kontrolle

0,85 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)
0,1 ml Enzym, PDS-Lösung
0,05 ml Acetylthiochinolin (5,2 mM)

Anwesenheit von Inhibitor

0,8 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4)
0,1 ml Enzym, PDS-Lösung
0,05 ml Acetylthiocholin (5,2 mM)
0,05 ml Inhibitor (Beispiele 1–7), um endgültige Konzentrationen von 1, 3, 10, 30, 100, 300 nM; 1, 10, 30,
100 μM zu ergeben.

Die Änderung der Extinktion wurde in 30-Sekunden-Intervallen bei 324 nm gemessen. Die Kontrolle wurde als 100% genommen. Der Inhibitor wurde als Prozentsatz der Kontrolle berechnet. Eine graphische Darstellung vom Log der Inhibitor-Konzentration gegen% Kontrolle wurde aufgezeichnet und IC₅₀-Werte wurden durch Interpolation berechnet.
BEISPIEL 5 (C): ASSAY DER HEMMUNG DER MONOAMINAUFNAHME
(i) Synaptosomale Zubereitung
Eine männliche Ratte (Sprague Dawley), die ungefähr 200–250 g wog, wurde durch zervikale Dislokation getötet. Das Hirn wurde herausgeschnitten und das Cerebellum wurde verworfen. Das Hirn wurde dann gewogen, und 10 ml eiskalte Saccharose (0,32 M) wurden pro Gramm Gewebe hinzugegeben. Das Hirn wurde dann mit einem Teflonstößel (Spielraum 0,16 mm) bei 840 U/min für 8 Auf-und-Ab-Arbeitstakte homogenisiert und dann bei 1000 g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde zurückbehalten (rohe synaptosomale Zubereitung).
ii) Assay der Hemmung der Monoaminaufnahme (5-HT und NA)
Der Assay basierte auf einem Verfahren, wie es von Snyder and Coyle (1969) J. Pharm. Exp. Ther. 165, 78–86 und Horn et al. (1973) J. Neurochem. 21, S. 883–888, beschrieben ist.
Kontrolle

2 ml Krebs-Puffer

Nichtspezifische Aufnahme

5-HT, bestimmt durch 10 μM Fluoxetin (2 ml) (Eli Lilly Limited).
NA, bestimmt durch 1 μM Desipramin (2 ml) (Sigma Chemical Co.)

Anwesenheit von Inhibitor
Verschiedene Konzentrationen von Inhibitor (d.h. von den Beispielen 1–7), die (1, 3, 10, 30, 100, 300 nM; 1, 3, 10, 30, 100 μM) für die Hemmung der Aufnahme von Monoaminen (2 ml) getestet werden sollten.
Krebs-Henseleit-Puffer Zur Herstellung von 1 Liter
Alle Röhrchen wurden dreifach angesetzt. 2 ml Krebs-Puffer (vorstehend), Inhibitor nichtspezifischer Aufnahme oder Arzneimittel (d.h. Beispiele 1–7), die getestet werden sollten, wurden in einem Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. 100 μl der hergestellten synaptosomalen Zubereitung wurden in jedes Röhrchen gegeben und für 5 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. Jede Reaktion wurde gestoppt, indem die Röhrchen in ein Eiswasserbad getaucht wurden. ³H-NA (10^–7 M) oder ³H-5-HT(10^–7 M) wurden in jedes Röhrchen gegeben und für 5 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. Jede Reaktion wurde gestoppt, indem die Röhrchen in ein Eiswasserbad getaucht wurden. Akkumulierte Monoamine wurden gesammelt, indem ein Brandell Cell Harvester (Brandell-Zellerntevorrichtung) unter mildem Vakuum verwendet wurde. Filter wurden gespült (2x), indem 4 ml eiskalte 0,9%ige Kochsalzlösung verwendet wurde. Szintillationsflüssigkeit wurde hinzugegeben (4 ml/Röhrchen). Die Radioaktivität wurde auf einem Szintillationszähler gemessen.
Nichtspezifische Werte wurden von den Gesamtwerten subtrahiert. Die Kontrolle wurde als 100% genommen. Arzneimittelwirkungen wurden als Prozentsatz des Kontrollinhibitorwertes berechnet. Eine graphische Darstellung vom Log der Arzneimittelkonzentration gegen% Kontrolle wurde aufgezeichnet und IC₅₀-Werte wurden durch Interpolation berechnet.
Die Ergebnisse sind wie in den Tabellen 1 und 2 angegeben. TABELLE 1
TABELLE 2

NA = nicht versucht

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (III):
wobei R¹ Cl ist und R² H ist; oder R¹ H ist und R² Cl ist; umfassend (i) Kondensieren eines cyclischen α-Cyanoketons der Formel (XI)
mit einem Anilinderivat der Formel (XII)
wobei R¹ Cl ist und R² H ist; oder R¹ H ist und R² Cl ist; und (ii) Cyclisieren des Kondensationsprodukts von Schritt (i) unter Verwendung einer Lewissäure.
Verbindung
Verbindung
Additionssalz einer freien Säure einer Verbindung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3.
Salz nach Anspruch 4, welches aus Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff, Salpeter-, Perchlor-, Schwefel-, Citronen-, Wein-, Phosphor-, Milch-, Benzoe-, Glutamin-, Oxal-, Asparagin-, Brenztrauben-, Bernstein-, Fumar-, Malein-, Oxalessig-, Isethion-, Stearin-, Phthal-, Methansulfon-, p-Toluolsulfon-, Benzolsulfon-, Lactobion- und Glucuronsäure erzeugt ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von degenerativen Hirnerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die degenerative Hirnerkrankung die Alzheimersche Krankheit ist.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.