DE69635732T2

DE69635732T2 - Verfahren zur radiolabeling ein somatostatin peptidanalog, das eine disulfidbindung enthält mit einem radioisotop des rheniums und ihre therapeutische anwendungen

Info

Publication number: DE69635732T2
Application number: DE69635732T
Authority: DE
Inventors: O. Paul Guadalajara ZAMORA; A. Buck Albuquerque RHODES; J. Michael Albuquerque MAREK
Original assignee: Rhomed Inc
Current assignee: Rhomed Inc
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2016-05-23
Also published as: WO1996037239A1; AU5926496A; JP2000515847A; EP0827412B1; EP0827412A1; ATE315411T1; DE69635732D1; US5985240A; CA2219492A1; EP0827412A4

Description

VERWEIS AUF VERWANDTE ANWENDUNGEN
Diese Erfindungsmeldung ist in Teilen eine weiterführende Erfindungsmeldung der vorläufigen U.S. Patentanmeldung 60/011,027, eingereicht am 2. Februar 1996, mit dem Titel „Ascorbate-Stabilized Radiopharmaceutical Method and Composition"; diese Erfindungsmeldung ist in Teilen auch eine weiterführende Erfindungsmeldung der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/447,453, eingereicht am 23. Mai 1995, mit dem Titel „Somatostatin Radiopharmaceutical Applications", die in Teilen eine weiterführende Erfindungsmeldung der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/269,929, eingereicht am 30. Juni 1994, mit dem Titel „Pofysralent Peptide Pharmaceutical Applications" ist, welche wiederum in Teilen eine Fortsetzung der Erfindungsmeldung der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/087,219, eingereicht am 2. Juli 1993, mit dem Titel „Chemotactic Peptide Pharmaceutical Applications" ist; welche wiederum in Teilen eine Fortsetzung der Erfindungsmeldung der U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 5,443,816, mit dem Titel „Peptide-Metal Ion Pharmaceutical Preparation and Method" ist; welche wiederum in Teilen eine Fortsetzung der Erfindungsmeldung der U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 5,102,990 mit dem Titel „Direct Radiolabeling of Antibodies and Other Proteins with Technetium or Rhenium" ist; welche wiederum in Teilen eine Fortsetzung der Erfindungsmeldung der U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 5,078,985 mit dem Titel „Radiolabeling, Antibodies and Other Proteins with Technetium or Rhenium by Regulated Reduction" ist; diese Erfindungsmeldung steht auch in Beziehung zur U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 5,277,893 mit dem Titel „Radiolabeling, 4ntibodies anc Other Proteins with Technetium or Rhenium by Regulated Reduction", zur U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 5,460,785 mit dem Titel „Direct Labeling of Antibodies and Other Proteins with Metal Ions"; zur U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 07/998,820 mit dem Titel „IKVAV Peptide Radiopharmaceutical Applications"; und zur U.S. Patentanmeldung mit der Nummer 07/998,910 mit dem Titel „YIGSR Peptide Radiopharmaceutical Applications"; wobei die Lehren aller vorangestellten hierin als Referenz miteinbezogen werden.
Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung (technischen Gebiet):
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung, der Zusammensetzungen und der Verwendungen von aus Somatostatin abgeleiteten, auf Peptiden basierenden Strahlenpharmazeutika für die Diagnose und Behandlung einer Erkrankung und umfasst auf Peptiden basierende, mit Metall-Ionen markierte und von Somatostatin abgeleitete Zusammensetzungen.
Hintergrund zum Stand der Technik:
Peptidbasierte Radiopharmaka. Die Verwendung von biologisch aktiven Peptiden, welches Peptide sind, die sich an spezifische Rezeptoren der Zellenoberfläche binden oder die auf andere Weise Zellfunktion verändern, hat einiges an Beachtung als Strahlenpharmazeutikum erhalten. Biospezifische Bildaufbereitungs- und Strahlentherapiemittel haben mit großen Eiweißen, wie zum Beispiel Antikörpern begonnen und haben sich zu Antikörperfragmenten für das Einsatzgebiet von Antigenen bindender Fragmente und kleiner biologisch aktiven Peptide entwickelt. Die kleinere Größe von biologisch aktiven Peptiden verleiht diesen pharmakologisch-kinetische Eigenschaften, wie zum Beispiel höheres Ziel zu nicht Ziel Verhältnis und schnelleren Abbau aus der Blutbahn, welche für einige Anwendungen wünschenswert sind.
Verschiedene peptidbasierte strahlenpharmazeutische Produkte sind in Entwicklung, einschließlich derer, die Somatostatin-Peptide als ein Bildaufbereitungsmittel verwenden. Isotopenmarkierte Peptid-Analoge aus Somatostatin, die für die diagnostische Bilddarstellung verwendet werden, umfassen Bildaufbereitungsmittel aus ¹²³I markierten Tyr-3-Octreotiden und ¹¹¹In-DTPA-Octreotiden und es wird Forschung betrieben mit einer Vielfalt von ^99mTc markierten Somatostatinanalogen, einschließlich direkt markierter Somatostatinanaloge. Ein Produkt aus ¹¹¹In-DTPA-Octreotiden ist kommerziell in den Vereinigten Staaten und europäischen Ländern verfügbar und wird von der Mallinckrodt Medical Inc. vertrieben.
Somatostatin und Analoge. Somatostatin ist ein vom Hypothalamus erzeugtes Hormon, das normalerweise die Freisetzung des Wachstumshormons der Hirnanhangdrüsen hemmt. Eine Anzahl von Peptid-Analogen ist entwickelt worden, die pharmakologische Wirkungen aufweisen und die das natürlich auftretende Hormon nachahmen. In normalen Probanden haben Somatostatin und seine Analoge die Fähigkeit, die Sekretion von Serotonin und die Peptide der Bauchspeicheldrüse und das Wachstumshormon zu unterdrücken. Rezeptoren für Somatostatin sind auf einer Vielfalt von menschlichen Tumoren und ihren Metastasen vorhanden. Es ist wurde herausgefunden, dass Somatostatinrezeptoren in einem breiten Spektrum von Tumorarten übermäßig häufig vorhanden sind, einschließlich derer, die im Gehirn (einschließlich Meningiomen, Astrocytomen, Neurblastomen, Hypophysenadenomen, Paragangliomen, Merkel Zellkarzinomen und Gilomen), im verdauungsfördernden Bauchspeicheldrüsentrakt (einschließlich Insulinomen, Gluconomen, AUODoma, VIPoma und Dickdarmkarzinomen), in Lunge, Schilddrüse, Brustdrüse, Prostata, Lymphsystem (einschließlich sowohl Hodgkins als auch nicht Hodgkins Lymphomen) und Eierstöcken auftreten. Außerdem weisen im Allgemeinen alle diejenigen Tumoren, die am häufigsten perkutane Metastasierung im Brustlymphgang hervor rufen, einschließlich Brustdrüsentumoren, Lungenkarzinomen (besonders kleine Lungenzellenkarzinome) und Lymphome (Hodgkins und nicht Hodgkins), ein überhöhtes Maß an Somatostatinrezeptoren auf, die durch Szintigraphie wahrgenommen werden können (Krenning EP, Kwekkeboom DJ, Bakker WH, Breeman WA, Kooij PP, et al: Somatostatin receptor scintigraphy with [111In-DTPA-D-Phe1]- and [123I-Tyr3]-octreatide; the Rotterdam experience with more than 1000 patients. Eur J Nucl Med 20: 716–731, 1993).
Trotz der hohen Raten des überhöhten Vorkommens von Somatostatinrezeptoren auf einer Vielfalt von Tumoren, haben Somatostatinanaloge keine verbreitete klinische Anwendung bei der Kontrolle von Karzinomen erreicht. Ihre gegenwärtige klinische Anwendung umfasst in erster Linie die Kontrolle von mit metastasenbildendem Karzinoid verbundenen Symptomen oder VIP absondernden Tumoren. Die Somatostatinanaloge weisen einen breiten therapeutischen Index auf und scheinen von größeren Nebenwirkungen frei zu sein. Die meisten Nebenwirkungen sind gastrointestinaler Natur und umfassen geringfügige Übelkeit, Blähungen, Durchfall, Verstopfung oder Steatorrhö. Teil des Grunds für die eingeschränkte klinische Anwendung kann begrün det sein in der Notwendigkeit von Therapien mit langfristiger Nachsorge, der daraus resultierenden hohen Kosten für eine solche Therapie und den unterschiedlichen, in klinischen Einrichtungen festgestellten Wirkungen.
Somatostatinanaloge, die Zubereitung von solchen Analogen und die Verwendungen für solche Analoge sind nach dem Stand der Technik bekannt. Solche Analoge werden bei der Behandlung von bestimmten Karzinomen und anderen Bedingungen verwendet, wobei ein handelsübliches Produkt Octreotid ist, das unter dem Handelsnamen Sandostatin von Sandoz hergestellt und verkauft wird.
Eine große Vielfalt von Somatostatinanalogen ist entwickelt worden. Diese umfassen RC-160, ein starkes Somatostatinanalog, ursprünglich synthetisiert von einem von Andrew V. Schally geleiteten Team an der Tulane University, (Cai RZ, Szoke B, Lu E, Fu D, Redding TW and Schally AV: Synthesis and biological activity of highly potent octapeptide analogues of somatostatin: Proc Natl Acad Sci USA, 83: 1896–1900, 1986). In aktuellen Untersuchungen, unter anderen durchgeführt von Schally, wurde die Effektivität von RC-160 beim Hemmen des Wachstums menschlicher Glioblastome in vitro und in vivo veranschaulicht. Siehe zum Beispiel Pinski J, Schally AV, Halmos G, Szepeshazi Kand Grot K: Somatostatin analogues and bombesin/gastrin -releasing peptide antagonist RC-3095 inhibit the growth of human glioblastomas in vitro and in vivo. Cancer Res 54: 5895–5901, 1994.
RC-160 ist ein zyklisches Somatostatinanalog, welches sich an die Somatostatinrezeptoren 2 und 5 bindet (Oberg K: Treatment of neuroendocrine tumors. Cancer Treat Rev 20: 331–355, 1994). Die allgemeine Anordnung von RC-160 ist wie folgt:
Andere verfügbare Somatostatinanaloge umfassen zyklische OctaPeptid-Analoge des Somatostatins wie
Peptidisotopenmarkierung. Peptide können mit einer Vielfalt von Mitteln isotopenmarkiert werden. Biologisch aktive Peptide für Radiopharmaka umfassen das von Olexa SA, Knight LC and Budzynski AZ, U.S. Pat. No. 4,427,646, Use of Radiolabeled Peptide Derived From Crosslinked Fibrin to Locate Thrombi In Vivo, offenbarte, in welchem Iodieren als Mittel für die Isotopenmarkierung erörtert wird. Peptide können direkt radioiodiniert werden durch elektrophile Substitution an reaktiven aromatischen Aminosäuren. Iodieren kann auch über vormarkierte Reagenzien erreicht werden, in welchen das Reagens iodiniert ist und gereinigt ist und dann mit dem Peptid verbunden wird. In Morgan CA Jr and Anderson DC, U.S. Pat. No. 4,986,979, Imaging Tissue Sites of Inflammation, wird die Verwendung von Chelaten und direktem Iodinieren offenbart.
Die Nutzung von DTPA und EDTA chelatiert kovalent gekoppelt zu Polypeptiden und ähnliche Substanzen sind nach dem Stand der Technik gut bekannt. Siehe Hnatowich, DJ, U.S. Patente mit den Nummern 4,479,930 und 4,668,503. DTPA ist als ein bifunktionales Chelatierungsmittel zur Isotopenmarkierung für eine Vielfalt von Peptiden mit ¹¹¹In verwendet worden, einschließlich eines α-Melanocyt simulierenden Hormons zur Abbildung von Melanomen, chemotaktischer Peptide für die bildliche Darstellung von Infektionen, Lamininfragmenten für das Abzielen auf tumorzugehörige Lamininrezeptoren und atrialer natriuretischer Peptide für die bildliche Darstellung atrialer natriuretischer Rezeptoren in der Niere.
Technetium-99m ist auf Grund seiner niedrigen Kosten, seiner breiten Verfügbarkeit, seiner ausgezeichneten Bildaufbereitungseigenschaften und seiner hohen spezifischen Leistungen ein bevorzugtes Isotop für die diagnostische Bilddarstellung. Zwei Ansätze sind für die Isotopenmarkierung von Eiweißen und Peptiden mit ^99mTc beschrieben worden: direkte Markierung und bifunktionale Chelate. In Dean RT; Lister-James J and Buttram S, U.S. Pat. No. 5,225,180, Technetium-99m Labeled Somatostatin-Derived Peptides for Imaging, wird die direkte Markierung des Somatostatins nach der Reduktion der natürlichen Disulfidverbindungen, die sich aus quer verbundenen Cysteinrückständen ergeben, offenbart. In U.S. Patent Nummer 5,460,785 mit dem Titel Direcit Labeling of Antibodies and Other Proteins with Metalions, weiter oben mit Verweis versehen, und U.S. Patent Nummer 5,443,876 mit dem Titel Peptide-Metal Ion Pharmaceutical Preparation and Method, ebenfalls weiter oben mit Verweis versehen, werden eine Vielfalt von Verfahren zur direkten Markierung von Peptiden durch Schwefel, Sauerstoff und Stickstoff enthaltende Aminosäuresequenzen, die zur Bindung zur Verfügung stehen, offenbart.
Eine Vielfalt von hoch affinen Chelaten ist entwickelt worden, um ^99mTc an spezifische Stellen auf Peptiden zu binden. In einem Ansatz wird das bifunktionale Reagens zuerst mit ^99mTc markiert und dann mit dem Peptid gepaart. Es können sich jedoch mehrfache Arten ergeben, und eine der Markierung nachfolgende Reinigung ist im Allgemeinen erforderlich. In einem anderen Ansatz wird ein chelatbildendes Mittel vor der Isotopenmarkierung kovalent an das Peptid angebunden. In Tolman GL, U.S. Patent mit der Nummer 4,732,864, Trace-Labeled Conjugates of Metallothionein and Target-Seeking Biologically Active Molecules, wird die Verwendung von Metalllothionein oder metalllothioneinen Fragmenten, die zu einem biologisch aktiven Molekül gepaart sind und Peptide umfassen, offenbart. Andere Chelate, die verwendet worden sind, umfassen eine Vielfalt von N₂S₂ und N₃S Liganden, DTPA und 6-hydrazino-nikotinate Gruppen.
Arten der Zuführung von strahlentherapeutischen Medikamenten. Wegen der niedrigen absoluten Aufnahme von Somatostatinanalogen durch Tumore nach intravenöser Injektion, der weit verbreiteten Verteilung von Somatostatinrezeptoren in anderen Geweben und des Bedarfs an hoch lokalisierten therapeutischen Radioisotopkonzentrationen gibt es eine Notwendigkeit für verbesserte Verfahren der Zuführung der von Somatostatin abgeleiteten strahlentherapeutischen Mittel für die Krebstherapie. Einige Forschungsgruppen haben die Verwendung lokaler oder regionaler Verabreichung von isotopenmarkierten Kolloidchelaten und Antikörpern für die Tumortherapie untersucht (Hoefnagef CA: Anti-cancer radiopharmaceuticals. Anticancer Drugs 2: 107–32, 1991). Zum Beispiel sind in Untersuchungen der Gehirnglioblastome positive Ergebnisse mit direkter intraläsionaler Radioimmuntherapie unter Verwendung von mit ¹³¹I markierten monocionalen Antikörpern erzielt worden (Riva P, Arista A, Sturiale C, Franceschi G et al: Possibility of control of malignant gliomas by direct intratumour or intralesional radioimmunotherapy (Abstract). J Nucl Med 5:144P (Abst. No. 582), 1994). Bei 34 auswertbaren Patienten wurde von einem mittleren Überleben von 18 Monaten berichtet gegenüber 12 erreichbaren Monaten, die mit traditionellen Behandlungen erzielbar waren, mit einer Reaktionsrate von 38,2% einschließlich 9 Stabilisierter, 7 teilweiser Remissionen und 6 vollständiger Remissionen.
WO 95/00553 A offenbart die Zubereitung von mit Rheniumradioisotopen einen Komplex ausgebildeten Somatostatin-Peptiden und ihre Verwendung in der Behandlung von Krebs.
Während die Verwendung von Antikörpern ein Behandlungsansatz ist, ist es offensichtlich geworden, dass eine andere Klasse von biologischen Stoffen schon viele der gesuchten Eigenschaften zum Zweck einer gezielten Behandlung aufweisen. Peptidhormone und ihre synthetischen Analoge weisen hohe Affinitätsinteraktionen mit den Zielzellen auf und erzeugen wenig oder keine Immunantwort.
Das Abzielen auf Tumoren mit somatostatinpositiven Rezeptoren in der diagnostischen Bildgebung weist eine Anzahl von Vorteilen auf, einschließlich der Folgenden: a) die Ausprägung des Zielrezeptors ist in vielen verschiedenen Tumorarten ausgeprägt erhöht und umgekehrt ist die Ausprägung dieses Rezeptors in normalen Geweben niedrig; b) die Affinitäten des Rezeptors für natürliches Hormon ist hoch und es sind zahlreiche synthetische Analoge, die höhere Affinität aufweisen, beschrieben worden; und c) das molekulare Gewicht des Isotopenindikators ist niedrig und zirkulierendes Peptid wird im Blutkreislauf rasch abgebaut. Der rasche Abbau des isotopenmarkierten Peptids aus dem Blutkreislauf führt zu sehr niedrigem Hintergrundrauschen, wodurch eine Bilddarstellung sogar in Anbetracht von niedrigen absoluten Aufnahmewerten des Tumors ermöglicht wird.
Während es offensichtlich ist, dass der rasche Abbau von isotopenmarkierten Peptiden einen beträchtlicher Vorzug in der diagnostischen Bilddarstellung darstellt, ist es ein deutlicher Nachteil in der zielgerichteten Strahlentherapie, wo die therapeutische Wirkung ganz von der absoluten Aufnahme des Radionuklids am Ort des Zieltumors abhängig ist. Daher wird die intravenöse Verabreichung eines isotopenmarkierten therapeutischen Mittels im Allgemeinen klinisch nicht erfolgreich sein, wenn sich das Mittel rasch abbaut. Für Bildaufbereitungszwecke ist die relative Aufnahme wichtig, während für therapeutische Zwecke die absolute Aufnahme wichtig ist. Jedoch zeigt die lokale oder regionale Verabreichung eines iso topenmarkierten therapeutischen Mittels bestimmte potentielle Vorzüge:

a) lokale oder regionale Verabreichung sondert das Peptid auf dem Tumor ab und lagert es nahe bei diesem ab, wodurch die höchste Wahrscheinlichkeit der Bindung an den Tumor zur Verfügung gestellt wird;
b) lokale oder regionale Zuführung kann einen physischen Raum ausbilden, der den Tumor umfasst, wodurch auf diese Weise der Zeitraum maximiert wird, in dem das Peptid nahe bei dem Tumor ist, um sowohl durch direkte Bindung wie auch durch nicht spezifische lokale Abstrahlung eine optimale Abstrahlung des Tumors zur Verfügung zu stellen;
c) lokale oder regionale Zuführung schließt häufig lokale Abbaumechanismen einschließlich des lymphatischen Systems ein, so dass Mikrometastasen in lokalen Lymphknoten bestrahlt werden können; und
d) lokale oder regionale Zuführung kann den raschen Abbau aus dem Blutstrom zur Verfügung stellen, sobald das Peptid in den Blutstrom abgebaut wird, wodurch die Abstrahlung auf Nicht-Zielorgane minimiert wird.

Intraartikuläre Verwendung von Somatostatin zur Behandlung von Arthritis. Zusätzlich zu jenen Verwendungen und potentiellen Verwendungen für Somatostatin und seine Analoge, die oben beschrieben wurden, hat die Forschung eine potentielle Verwendung dafür in der Behandlung der Arthritis angezeigt. Im Besonderen beschreibt die Literatur die passive, nicht isotopenmarkierte, intraartikuläre Verwendung von Somatostatin bei der Behandlung rheumatischer Arthritis. Fiaravanti A, Franci A, Gelli R, Minari C, Montemerani M, Moscato P, und Marcolongo R: Evaluation of the efficacy of intra-articular administration of somatostatin in rheumatoid arthritis. Clin-Ter. 142(5): 453–57, 1993. Eine andere Untersuchung umfasst die Verwendung von Goldsalzen und Somatostatin, um eine neue kombinierte Behandlung für psoriatische Arthritis zu bilden. Matucci-Cerinic M, Pignone A, Lotti T, Partsch G, Livi R, and Cagnoni M: Gold salts and somatostatin: a new combined analgesic treatment for psoriatic arthritis. Drugs-Expfl.-Clin.-Res „ 18(2): 53–61 (1992). Die Literatur beschreibt auch die Synovektomie durch Bestrahlung unter Verwendung von Radiokolloiden. Siehe zum Beispiel Ghinoi M, Vallabhajosula S, Goidsmith SJ, Klein MJ, Deutsch KF, Chinen LK, Broadack JW, Deutsch EA, Watson BA, and Tote AJ: Chemistry and biological behavior of samarium-153 and rhenium-1 86-labeled hydroxyapatite particles: potential radiopharmaceuticals for radiation synovectomy. J. Nucl. Med., 34: 1536–1542 (1993). Siehe auch Deutsch E, Brodack JW, Deutsch KF: Radiation synovectomy revisited. Eur. J. Nucl. Med, 45: 1113–1127 (1993). Die Strahlensynovektomie besteht aus der intraartikulären Injektion eines betaemittierenden Strahlenpharmazeutikums, um synovialer Entzündung entgegenzuwirken und diese zu kontrollieren. Die Verwendung von Isotopenkolloiden hat sich begründet auf der direkten, nahen Positionierung von radioaktivem Material an der Synovialmembran in Gelenken und durch einen aktiven Prozess der Kolloidaufnahme durch die Zellen der Synovialmembran. In einigen Anwendungen werden Kolloide gegenüber einer mehr löslichen Formen wie Partikeln bevorzugt, weil die Verwendung von Kolloiden hilft, die Radioaktivität ohne Streuverluste auf die Gelenke zu beschränken. Solcher Streuverlust kann zu hohen Ansammlungen in den lokalen Lymphknoten und in einem geringeren Maß in den Lungen führen und dadurch zu nicht tolerierbarer Strahlung auf Nicht-Zielorgane führen. Die Verwendung einer löslichen Form kann deshalb übermäßige, unerwünschte Strahlung auf den ganzen Körper verursachen. Ebenso kann sich eine Verabreichung über das Blut nicht auf die erwünschten Zellen richten und auch zu hoher Aufnahme in Nicht-Zielgebieten führen. Die Bedenken von Praktikern lagen darin, dass diese Behandlung als eine wiederholte Behandlung erwartet wird, und deshalb eine Anwendung der Radioaktivität auf andere Gewebe erforderlich macht. Einige der Vorteile der Anwendung von ¹⁸⁸Re in der Strahlensynovektomie sind in Wang SJ, Lin WY, Hsieh BT, Shen LH, Tsai ZT, Ting G, and Knapp FF, Jr.: Rhenium-188 sulphur colloid as a radiation synovectomy agent. Eur J. Nuc. Med. 22: 505–507 (1995) beschrieben worden.
Die Verwendung von Askorbat und ähnlichen "Stabilisatoren" für Strahlenpharmazeutika. Es ist bekannt, dass sich strahlenpharmazeutische Verbindungen nach der Isotopenmarkierung durch Oxidation und durch Autoradiolyse abbauen. Es ist bekannt, dass einige Strahlenpharmazeutika, wie zum Beispiel als Verbindungen markiertes Technetium-99m und Rhenium-186 oder Rhenium-188, Mittel wie Antioxidationsmittel oder Reduktionsmittel zur Stabilisierung erfordern, um das Radionuklid in einem geeigneten Oxidationszustand zu erhalten. Sowohl Technetium als auch Rhenium liegen normalerweise in ihrem höchsten oder +7 Oxidationszustand vor, der ihr stabiler Zustand ist, bis sie durch Zinn oder andere Reduktionsmittel in pharmazeu tischen Kits reduziert werden. Das markierte oder in einen Komplex ausgebildete strahlenpharmazeutische Kit wird instabil, wenn das in einen Komplex ausgebildete, reduzierte Isotop in einen höheren Oxidationszustand oxidiert wird, wobei das gebundene Isotop vom Liganden als freies (gelöstes) Pertechnetat +7 oder Perrhenat +7 freigesetzt wird. Verbindungen wie Askorbinsäure, Gentisinsäure und Andere sind verwendet worden, um die Oxidation des Radionuklids und/oder des Reduktionsmittels zu hemmen. Im Besonderen wird die Verwendung von Antioxidationsmitteln, typischerweise Askorbinsäure und Gentisinsäure, in der Literatur für den Zweck beschrieben, die Lagerfähigkeiten von zinnhaltigen strahlenpharmazeutischen Kits niedriger Reduktionskapazität zu verlängern.
Wie hierin angewendet, umfasst der Ausdruck "Autoradiolyse" den chemischen Abbau eines Peptids oder Eiweißes durch die Aussendung von Strahlung, die von dem zum Peptid oder Eiweiß gekoppelten Radioisotop ausgeht. Die Autoradiolyse kann durch die Ausformung von freien Radikalen in Wasser oder anderen Medien durch die von dem Radionuklid emittierte Strahlung verursacht werden. Freie Radikale sind Moleküle oder Atome, die ein einzelnes ungepaartes Elektron enthalten und hohe chemische Reaktivität aufweisen. Die Wirkung von Antioxidationsmitteln als stabilisierendes Mittel für ein strahlenpharmazeutisches Kit umfasst ihre Wirkung als "Radikalfänger für freie Radikale", wie sie nach dem Stand der Technik im Allgemeinen bekannt ist. Askorbinsäure und Gentisinsäure wirken dadurch als Radikalfänger für freie Radikale, dass sie den freien radikalen Zwischenprodukten reaktive Wasserstoffatome spenden, die ein nicht reaktives Molekül erzeugen (Kowaisky, R.J. and Perry, J.R, Radiopharmaceuticals in Nuclearmedicine Practice, Connecticut: Appleton and Lange 1987, 88–89). Die Autoradiolyse kann bei Rheniumisotopen ein bedeutsames Problem darstellen und ist typischerweise ein etwas geringeres Problem bei Technetium.
Die herkömmlichen Verfahren des Zusetzens von HSA zu einer Verbindung oder diese zwischen Zubereitung und Verwendung eingefroren zu halten, sind zur Anwendung bei vielen isotopenmarkierten Peptiden und Eiweißen nicht immer wirkungsvoll oder praktikabel. Trotz der Versprechungen, die eine Anzahl von neu entwickelten Peptiden für diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt haben, kann ihre Störanfälligkeit gegenüber Autoradiolyse ihre Verwendung einschränken. Daher ist die Entwicklung von wirkungsvollen, aber nicht schädlichen stabilisierenden Mitteln ein bedeutsamer und viel benötigter Fortschritt der Technik.
US Patent 5,328,679 offenbart ein Verfahren zur Markierung von Eiweißen mit Technetium/Rhenium.
WO 91/01754 A bezieht sich auf die direkte Isotopenmarkierung von Antikörpern und anderen Eiweißen mit Technetium oder Rhenium.
WO 95/00553 A offenbart isotopenmarkierte Somatostatin-Peptide zu Bilddarstellung und für therapeutischen Anwendungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
(OFFENBARUNG DER ERFINDUNG)
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isotopenmarkierung eines Somatostatin-Peptid-Analogs zur Verfügung gestellt, das eine Disulfid-Bindung mit einem Radioisotop umfasst. Bei diesem Verfahren wird zuerst eine Lösung einschließlich eines Somatostatin-Peptid-Analogs zur Verfügung gestellt, die mindestens eine Disulfid-Bindung enthält. Diese Lösung wird mit Zinn-Ionen und mit einem Radioisotop reagiert, unter Anwendung einer ausreichenden Menge von Zinn-Ionen, um sowohl die Disulfid-Bindungen des Peptids wie auch die des Radioisotops beträchtlich zu reduzieren. Das isotopenmarkierte Somatostatin-Peptid-Analog wird dann wiederhergestellt. Dieses Verfahren kann auch mit einem Rheniumisotop angewendet werden und ist besonders geeignet für Rhenium in der Form von Perrhenat. Das Perrhenat, oder ein Salz davon, kann Rhenium-188 und Rhenium-186 sein. Die Konzentration des Somatostatin-Peptid-Analogs in der Lösung kann zwischen etwa 25 μg und 1 mg pro ml betragen.
In dem Verfahren in dem Perrhenat Verwendung findet, kann die Menge der Strahlung zwischen etwa 10 und 500 mCi betragen, mit einer Reaktionszeit zwischen etwa 1 Minute und 4 Stunden. Die Markierungsreaktion erbringt die besten Ergebnisse, wenn die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 60°C bis 100°C erfolgt, es kann aber wirksam bei niedrigeren Temperaturen von etwa 60°C bis etwa 80°C markiert werden. Die Reaktion läuft, obwohl langsam, sogar bei 37°C ab, und würde vermutlich die Fertigstellung erreichen, wenn ausreichend Zeit zur Verfügung gestellt würde.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Isotopenmarkierung eines Somatostatin-Peptid-Analogs, das mindestens eine Disulfid-Bindung mit einem Radioisotop aus Rhenium umfasst, zur Verfügung gestellt, in welchem eine das Somatostatin-Peptid-Analog enthaltende Lösung mit Zinn-Ionen in Kontakt gebracht wird, die zur Verfügung gestellten werden, um die Disulfid-Bindungen des Peptids und des Radioisotops wesentlich und simultan mit dem später hinzuzufügenden Radioisotop zu reduzieren. In diesem Verfahrensschritt kann die Lösung einschließlich des Somatostatin-Peptid-Analogs und der Zinn-Ionen gefriergetrocknet oder eingefroren und unbegrenzt bis zur Isotopenmarkierung gelagert werden. Die Isotopenmarkierung wird durch Reagieren der das Somatostatin-Peptid-Analog und Zinn-Ionen mit einem Radioisotop, wie zum Beispiel Technetium und Rhenium beinhaltenden Lösung und Wiederherstellen des isotopenmarkierten Somatostatin-Peptid-Analogs erreicht. Wenn eine gefriergetrocknete Zubereitung Anwendung findet, können das Peptid und die Zinn-Ionen mit jedem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden, einschließlich normalen Salzes, oder, wenn sich das Radioisotop in einer wässrigen Lösung befindet, können diese durch Hinzufügen des Radioisotops gelöst werden. Das Radioisotop kann Rhenium in der Form von Perrhenat sein. Das Rhenium kann Rhenium-188 oder Rhenium-186 sein. In dem Verfahren in welchem Perrhenat verwendet wird, kann sich die Menge der Strahlung zwischen etwa 10 und 500 mCi bewegen, mit einer Reaktionszeit zwischen etwa 1 Minute und 4 Stunden. Die Markierungsreaktion erbringt die besten Ergebnisse, wenn die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 60°C bis etwa 100°C erfolgt, es kann aber wirksam bei niedrigeren Temperaturen von etwa 60°C bis etwa 80°C markiert werden.
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung wird auch ein Verfahren für die Behandlung von lokal in einzelne Anteile aufgegliederte Karzinome in einem Patienten, einschließlich menschlicher Patienten, zur Verfügung gestellt, welches die lokale Verabreichung einer wirkungsvollen therapeutischen Menge eines mit Rhenium markierten Peptids verwendet. Das Peptid kann Somatostatin, Somatostatin-Peptid, ein Analog von Somatostatin oder jedes Peptid sein, das sich an einem Somatostatinrezeptor bindet und welches mindestens eine Disulfid- Bindung enthält, wobei das Rhenium wahrscheinlich durch eine reduktive Einfügung direkt in die Disulfid-Bindung markiert ist und wobei das Re Atom sich zwischen den zwei Schwefelatomen befindet. Bei einem alternativen Verfahren ist es möglich, dass lokale Verabreichung auch mit jedem beliebigen Peptid angewendet werden kann, das sich an einen Somatostatinrezeptor bindet, einschließlich zyklischer Peptide, die keine Disulfid-Bindungen aufweisen. In solchen Fällen kann das Peptid durch jedes in der Technik bekannte Verfahren einschließlich der Verwendung von Chelaten, bifunktionalen Chelaten oder anderen Isotopenmarkierungsverfahren mit Rhenium oder einem anderen geeigneten therapeutischen Radioisotop markiert werden. Dieses Verfahren kann auf eine Vielfalt von lokal aufgegliederten Karzinomen, einschließlich des Prostatakarzinoms, der Glioblastome, des Bauchspeicheldrüsenkarzinoms, des Magenkrebses, der Sarkome, des Ovarialkarzinoms, des Dickdarmkarzinoms, des Gehirnkarzinoms, des Lungenkarzinoms, des Brustkrebses und der Lymphome angewendet werden. Es kann auch auf lokal aufgegliederte Karzinome angewendet werden, die sich innerhalb eines Bereiches befinden, wie Karzinome innerhalb der Prostatabinde, des Gehirns, des Hohlraums hinter dem Bauchfell, des Herzbeutels oder des Brusthohlraums. Das isotopenmarkierte Peptid kann unter Verwendung einer Vielfalt von Verfahren der lokalen Verabreichung verabreicht werden, einschließlich Injektionsverfahren wie direkter Injektion in das Karzinom, direkter Injektion in den Raum, der das Karzinom enthält und die intraarterielle Injektion in eine Arterie, die direkt zum Karzinom führt. Das Verfahren kann auch mit Peptid in einer partikelförmigen Form angewendet werden und umfasst mit Rhenium markiertes Peptid in partikelförmiger Form, wobei in diesem Fall die lokale Verabreichung durch ein Injektionsverfahren erfolgen kann, einschließlich Injektion der partikelförmigen Form des mit Rhenium markierten Peptids in den Raum, der das Karzinom enthält, und die Injektion der partikelförmigen Form des mit Rhenium markierten Peptids in eine Arterie, die direkt zu dem Karzinom führt.
Dieses Verfahren kann mit Radioisotopen aus Rhenium in der Form von Perrhenat, einschließlich Rhenium-186 und Rhenium-188 angewendet werden. Für das Verfahren, in welchem ein eine Disulfid-Bindung enthaltendes Peptid verwendet wird, kann Rhenium direkt durch Kontaktieren mit einer Lösung an der Disulfid-Bindung markiert werden, die das Peptid mit Zinn-Ionen umfasst und ausreichend Zinn-Ionen aufweist, um im Wesentli chen die Disulfid-Bindungen des Peptids und des Perrhenats völlig zu reduzieren, und die das Perrhenat umfasst, das die Mischung aus Peptid, Zinn-Ionen und Perrhenat inkubiert, um ein mit Rhenium markiertes Peptid auszuformen und das mit Rhenium markierte Peptid wieder zurück zu gewinnen. In dem Verfahren in welchem Perrhenat verwendet wird, kann die Menge der Strahlung zwischen etwa 10 und 500 mCi betragen mit einer Reaktionszeit zwischen etwa 1 Minute und 4 Stunden. Die Markierungsreaktion erbringt die besten Ergebnisse, wenn die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 60°C bis etwa 100°C erfolgt, es kann aber wirksam bei niedrigeren Temperaturen von etwa 60°C bis etwa 80°C markiert werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Erhöhung der Tumoreingrenzung durch ein mit einem therapeutischen Radioisotop isotopenmarkierten Somatostatin-Peptid-Analog zur Verfügung gestellt. Bei diesem Verfahren wird ein isotopenmarkiertes Somatostatin-Peptid-Analog mit einer Serumeiweißkomponente gemischt und ein wirkungsvolles therapeutisches Maß der Mischung aus isotopenmarkiertem Somatostatin-Peptid-Analog und Serumeiweißkomponente wird lokal verabreicht. Die Serumeiweißkomponente kann Gammaglobulin sein. Die Verfahren der lokalen Verabreichung, die für dieses Verfahren geeignet sind, umfassen direkte Injektion in das Karzinom, direkte Injektion in den Raum, der das Karzinom enthält, und direkte Injektion in eine Arterie, die direkt zum Karzinom führt. Dieses Verfahren kann mit therapeutischen Radioisotopen aus Rhenium, einschließlich Rhenium-188 und Rhenium-186 angewendet werden. Das Somatostatin-Peptid-Analog kann direkt markiert werden, wie weiter oben beschrieben, oder kann durch jedes bekannte Verfahren nach dem Stand der Technik markiert werden.
Die vorliegende Erfindung kann, zusätzlich zu der Verwendung von verschiedenen Somatostatin-Analogen, wie hierin offenbart, auch mit jedem isotopenmarkierten rezeptorspezifischen Peptid oder peptidomimetischen Mittel verwendet werden, das für den Rezeptor eines Karzinoms spezifisch ist. Zusätzlich zu bekannten und natürlich auftretenden Peptiden, können die Verfahren dieser Erfindung verwendet werden mit Peptiden, die von molekularen Kennungseinheiten abgeleitet sind, mit hoch regionsvariablen Antikörperanalogen, mit Peptidsequenzen, erhalten durch kombinatorische oder Bibliotheksverfahren und Ähnlichem. Solche Peptide müssen nicht mit Somatostatin ver wandt sein und müssen keine zyklischen Peptide sein. Sie können zum Beispiel Peptide beinhalten, die sich an ein breites Spektrum von tumorzugehörigen Zelloberflächenrezeptoren binden und bevorzugt an Zelloberflächenrezeptoren binden, die beim Binden internalisiert werden. Sie können auch Peptide beinhalten, die sich an natürlich auftretende Rezeptoren binden, die aber in bestimmten Karzinomen übermäßig auftreten, wie zum Beispiel Hormonrezeptoren. Solche Peptide können mit jedem eines breiten Spektrums von therapeutischen Radioisotopen markiert werden, wobei ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re bevorzugte Radioisotope sind. Solche isotopenmarkierte Peptide können durch direkte intraläsionale Verfahren verabreicht werden, wie die direkte Injektion in das Tumorgewebe oder durch lokale Verfahren, wie zum Beispiel durch eine direkte Injektion in einen Hohlraum, der den Tumor enthält, und durch intraarterielle Verfahren, wie zum Beispiel durch Injektion in eine Arterie, die das Organ versorgt, das den Tumor enthält. Die Verabreichung in den gewünschten Hohlraum oder die gewünschte Arterie kann durch jedes Verfahren durchgeführt werden, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, einschließlich langsamer Bolusinjektion in die Tumoren und Verabreichung durch Infusion in Katheter, einschließlich Verweilkathetern. Typische Hohlräume umfassen den Thorax, perikardiale und Unterleibshohlräume, aber die Verfahren dieser Erfindung können auf jeden Hohlraum angewendet werden. Es kann eine große Vielfalt von Tumoren behandelt werden unter der Voraussetzung, dass der Tumor Rezeptoren aufweist, für die das Peptid spezifisch ist. Beispiele im Thoraxhohlraum umfassen Karzinome der kleinen Lungenzellen, Lymphome, Mammakarzionome, Schilddrüsenkarzinome und bronchiale Karzinome.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Therapie von rheumatischer Arthritis durch intraartikuläre Verabreichung eines mit Rhenium markierten Somatostatin-Peptids zur Verfügung gestellt. Beim bevorzugten Verfahren wird ein RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog mit entweder ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re durch jedes Verfahren markiert, das hier oder woanders beschrieben wird, um zu einer kolloidalen Form der isotopenmarkierten Zubereitung zu gelangen. Patienten mit rheumatischer Arthritis werden mit diesem mit Rhenium markierten RC-160 Kolloid behandelt. Die Zubereitung wird direkt in ein großes Gelenk injiziert, von dem bekannt ist, dass es der Ort einer arthritischen Entzündung ist, wodurch das Kolloid innerhalb des Gelenks und der umliegenden Knochen anordnungen deponiert wird. Es wird angenommen, dass das ¹⁸⁸Re-RC-160 als Isotopenkolloid wirkt und dadurch die Radioaktivität nahe zu den Synovialzellen positioniert und aktiv von den Synovialzellen aufgenommen wird. Zusätzlich zu dieser kolloidalen Wirkung jedoch wird angenommen, dass die Präsenz von biologisch aktiven Peptiden (das heißt Somatostatinsequenzen) das direkte Abzielen auf entzündliche Zellen in dem Grundgerüst des entzündeten Gelenks ermöglicht, und dadurch zu einer wirkungsvolleren Therapie mit einer reduzierten totalen Radioaktivitätsbelastung beiträgt. Wiederholte Dosen können wie benötigt angewendet werden. Die Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und andere Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder ähnliche Verfahren bestimmt werden, wobei von der Strahlung von ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re Gebrauch gemacht wird. In anderen Ausführungsformen können entweder aus Partikeln bestehende oder hoch lösliche, mit Rhenium markierte Zubereitungen aus RC-160 auf ähnliche Weise verabreicht werden. Alternativ dazu wird die Zubereitung, ob Kolloid, partikelförmig oder löslich, in Blutgefäße injiziert, die zu dem Gelenk führen.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Zubereitung einer peptidbasierten stabilisierten, mit Rhenium markierten RC-160 strahlenpharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, das die geordneten Schritte des Markierens des besagten RC-160 Peptids mit einem Isotop bestehend aus Rhenium umfasst, um ein isotopenmarkiertes pharmazeutisches Produkt auszuformen, unabhängig davon ob die besagte Markierung durch die hierin offenbarten Verfahren geschieht oder auf sonstige Weise, wobei besagtes isotopenmarkiertes pharmazeutische Produkt bisher im Wesentlichen frei ist von irgendwelchen stabilisierenden Mitteln, und darauf folgendem Mischen des isotopenmarkierten pharmazeutischen Produkts mit einem stabilisierenden Mittel, welches mindestens Askorbinsäure oder Gentisinsäure umfasst.
Es ist dementsprechend ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel zur Markierung von Somatostatin-Peptiden mit Isotopen aus Rhenium, einschließlich ¹⁸⁸Re und ¹⁸⁶Re zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die gleichzeitige Reduktion von Disulfid-Bindungen in Somatostatin-Peptiden und die Reduktion des Perrhenats zur Verfügung stellen und dadurch ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das Peptid durch die Reduzierung von Disulfid-Bindungen mit Isotopen aus Rhenium zu markieren.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, wodurch die Tötungswirkung auf Karzinomzellen des mit Rhenium markierten Somatostatin-Peptids bedeutend größer ist als die mit entweder Rhenium oder dem Somatostatin-Peptid allein erhaltene Wirkung und ebenso größer ist wie die durch gleichzeitige Verabreichung von Rhenium und Somatostatin-Peptid erhaltene Wirkung.
Es ist ein weiters Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um ein therapeutisches Verfahren durch Verabreichung eines mit Rhenium markierten Somatostatin-Peptids in eine karzinomatöse abgetrennte oder aufgegliederte Region oder einen Bereich, wie zum Beispiel Karzinome innerhalb des Gehirns, des Thoraxhohlraums, der Prostatabinde oder anderer abgetrennter oder aufgegliederter Bereiche oder Regionen zur Verfügung stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Produkt zur Verfügung stellen, das die Markierung durch den Endbenutzer unter Verwendung von einer einzelnen Ampulle erlauben, die ein Somatostatin-Peptid und ein Metall-Ion als Reagenzien zur Markierung enthält, wobei dieses Verfahren nur einen einzelnen Schritt zur Erreichung der Markierung erfordert, der die Einbringung des medizinisch nutzbaren Metall-Ions ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren dafür zur Verfügung stellen, die Biodistribution von mit Metall-Ionen markierten Somatostatin-Peptiden und mit Metall-Ionen markierten Peptiden im Allgemeinen durch gleichzeitige Verabreichung von Mitteln zu verbesserter und positiver Biodistribution und Zielgenauigkeit auf das Peptid hin zu verbessern, einschließlich Mitteln wie zum Beispiel Albumin.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, optimale pharmazeutische Verfahren und Zusammensetzungen des mit Metall-Ionen markierten Somatostatin-Peptids zur Verfügung zu stellen, einschließlich der Optimierung der Phthalat Pufferkonzentrationen und des PH-Werts, wodurch die Stabilität des markierten Peptids gesteigert wird und die Markierung durch Schaffung von günstigen Bedingungen optimiert wird.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, wodurch Karzinome, die Somatostatinrezeptoren aufweisen, durch Verwendung von mit radioaktivem Rhenium markierten Somatostatin-Peptiden behandelt werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, wodurch Karzinome einschließlich Prostata-, Brust-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Gehirnkarzinom und andere Karzinomen, welche in bedeutendem Maß Somatostatinrezeptoren aufweisen, durch Verwendung eines mit Rhenium markierten Somatostatin-Peptids behandelt werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Therapie von rheumatischer Arthritis durch intraartikuläre Verabreichung eines mit Rhenium markierten Somatostatin-Peptids zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein wirkungsvolles Verfahren zur Therapie von rheumatischer Arthritis zur Verfügung zu stellen, wobei Radioaktivität nahe bei den Synovialzellen platziert und von diesen aktiv aufgenommen wird und wobei biologisch aktive Peptide, wie zum Beispiel Somatostatin es ermöglichen, direkt auf entzündete Zellen innerhalb das entzündeten Gelenks abzuzielen, was in einer reduzierten gesamten Belastung durch Radioaktivität resultiert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Zubereitung einer stabilisierten peptidbasierten und durch Rhenium markierten RC-160 strahlenpharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen unter Verwendung eines Mitglieds der Gruppe, die aus Askorbinsäure und Gentisinsäure besteht, als das stabilisierende Mittel.
Weitere Ziele, Vorzüge und neuartige Merkmale und weiterer Schutzumfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung werden zum Teil dargelegt in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und werden zum Teil bei Prüfung des Folgenden denjenigen offensichtlich werden, die in der Technik ausgebildet sind, oder können durch Anwendung der Erfindung gelernt werden. Die Ziele und Vorzüge der Erfindung können mittels der in den anhängenden Ansprüchen besonders ausgeführten Vermittlungen und Kombinationen realisiert und erreicht werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wachstumskurve der Tumorgröße von PC-3 Tumorheterotransplantaten, gemessen in cm³ für Tiere in der initialen Untersuchung. Drei Gruppen von Tieren mit je 10 Tieren wurden ausgewertet: 1) ¹⁸⁸Re-RC-160 – 200 μCi in 0,2 ml in den Tumor injiziert am Fr, Mo, Mi, Fr, Mo, Mi, Fr, (7 Dosen); 2) Scheininjektion, die gleiches Volumen und Zusammensetzung enthalten, aber ohne ¹⁸⁸Re-RC-160; und, 3) Kontrollgruppe die keine Injektionen erhält. Ungefähr an Tag 45 wurden die ¹⁸⁸Re-RC-160 Tiere in zwei Gruppen geteilt mit einer Gruppe bestehend aus 3, die kein Tumorwachstum zeigten, und einer Gruppe von 7, die erneutes Tumorwachstum zeigten.
2 zeigt die Überlebenszeit in Tagen für Tiere, die wie in 1 beschrieben behandelt wurden.
3 zeigt das durchschnittliche Körpergewicht von Tieren, die wie in 1 beschrieben behandelt wurden.
4 zeigt Daten von einer vergleichenden Untersuchung über Tumorwachstum in cm³ für über 5 aufeinander folgende Tage behandelten Tiere, gefolgt von einer zweiwöchigen Wartezeit und dann einer zweiten Serie von Dosen über 5 Tage. In diesem Versuch wurden nackte Mäuse mit PC-3 Tumorimplantaten mit ¹⁸⁸Re-RC-160 behandelt, im Vergleich zu Tieren, behandelt mit RC-160, ¹⁸⁸Re-IKVAV (SEQ. ID NO. 1), einem Peptid, das sich auch an Prostatakarzinome bindet und im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne Injektionen. Es gab 10 Tiere in jedem anfänglichen Wachstumsstadium; zur Zeit der zweiten Behandlung wurden die Tiere in jeder Gruppe in zwei Untergruppen aufgeteilt mit einer Untergruppe, die keine Behandlung erhielt, und eine zweite Untergruppe, die ¹⁸⁸Re-RC-160 erhielt. Auf diese Weise teilt sich jede Gruppe zu Beginn der zweiten Behandlung auf. Die unteren 4 Linien am rechten Ende der Y-Achse vertreten alle Untergruppen, die eine zweite Behandlung mit ¹⁸⁸Re-RC-160 erhalten haben.
5 zeigt die durchschnittlichen Körpergewichte für die Gruppen und Untergruppen, die in 4 beschrieben sind.
6 zeigt Daten von einer Anordnung mit drei Behandlungen, in der Tiere mit PC-3 Tumorheterotransplantaten in zwei Gruppen unterteilt wurden, wovon eine drei Serien von Behandlungen mit ¹⁸⁸Re-RC-160 erhielt und die Andere keine Behandlung erhielt. Diese Abbildung zeigt durchschnittliches Tumorvolumen in cm³. Zum Zeitpunkt von Tag 120 verblieb nur ein Tier in der Gruppe "Kontrollgruppe keine Behandlung", und es wies eine relativ leichte Tumorbelastung auf, die Anlass zu einem steilen Abfallen im Tumorvolumen gab.
7 zeigt die tatsächliche Überlebenszeit in Tagen für die, wie in 6 beschrieben, behandelten Tiere.
8a und 8b zeigen die Retention und die Biodistribution bei 24 Stunden von verabreichtem ¹⁸⁸Re-RC-160, gemischt mit dem menschlichem Serum Albumin und mit menschlichem Gammaglobulin.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
(BESTE MODI FÜR DAS AUSFÜHREN DER ERFINDUNG)
Bei Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung stellen Somatostatin-Peptide und ein verbundenes Isotopenmetall Materialien zur Verfügung, die nutzbar sind für in vivo diagnostische und therapeutischen Anwendungen. Wenn sie mit alpha oder beta emittierenden Radioisotopen, wie zum Beispiel Rhenium-186 (¹⁸⁶Re) oder Rhenium-188 (¹⁸⁸Re) markiert sind, können solche Peptide für die Therapie von spezifischen, den Zelloberflächerezeptoren zugeordneten Krankheiten verwendet werden, einschließlich Karzinomen, deren Rezeptoren positiv auf Somatostatin reagieren.
Die Begriffe „Bindung", „Komplex" und „Komplex bildend", wie sie durchwegs in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet werden, sind vorgesehen alle Arten physischer und chemischer Bindungen, alle Reaktionen, alle Bildungen von Komplexen, alle Anziehungen, Chelatbildungen und Ähnliches abzudecken.
Die Peptide der Erfindung können sein:

a) natürlich vorkommend,
b) erzeugt durch chemische Synthese,
c) erzeugt durch rekombinante DNS Technologie,
d) erzeugt durch biochemische oder enzymatische Zerstückelung von größeren Molekülen,
e) erzeugt durch Verfahren, die sich aus einer Kombination von a) bis d) ergeben, oder
f) erzeugt durch jedes andere Verfahren zur Herstellung von Peptiden.

Durch die Anwendung chemischer Synthese, dem bevorzugten Mittel der Produktion, ist es möglich, verschiedene Aminosäuren einzubringen, die nicht auf natürliche Weise entlang der Kette auftreten, die N- oder die C-Enden zu modifizieren und Ähnliches und dadurch eine größer Lebensdauer des Peptids, eine verbesserte Stabilität und Rezeptur, Widerstandsfähigkeit gegenüber Abbau der Protease und Ähnliches zur Verfügung zu stellen.
Der Begriff "Peptid", wie er durchwegs in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet wird, ist dazu vorgesehen, jede Anordnung zu umfassen, die aus zwei oder mehr Aminosäuren besteht. In den meisten Fällen umfassen die Peptide aus dieser Erfindung weniger als 100 Aminosäuren und vorzugsweise weniger als 60 Aminosäuren und am meisten bevorzugt einen Bereich von etwa 6 bis 20 Aminosäuren. Die Aminosäuren, die alle oder ein Teil des Peptids ausformen, können natürlich auftretende Aminosäuren, Isomere und Modifikationen von solchen Aminosäuren, Nicht-Eiweiß Aminosäuren, nach der Umsetzung modifizierte Aminosäuren, enzymatisch synthetisierte Aminosäuren, Konstrukte oder Anordnungen, die dafür entworfen sind, Aminosäuren nachzuahmen und Ähnliches sein, so dass der Begriff "Peptid" Pseudopeptide und Peptidnachahmer umfasst. Der Begriff "Peptid" umfasst auch Dimere oder Multimere aus Peptiden.
Somatostatin und Somatostatin-Peptide umfassen Peptide, in denen der hauptsächliche biologische Funktionsbereich die Sequenzen Tyr-Trp-Lys-Val (SEQ. ID NO. 2), Phe-Trp-Lys-Thr (SEQ. ID NO. 3) oder Ähnliche beinhaltet, einschließlich Ersatzstoffen für sowohl L- als auch D-Aminosäuren und Nachahmer, jedoch zusammengesetzte, die Peptidnachahmer und Pseudopeptide umfassen, die einen vergleichbaren biologischen Funk tionsbereich hervorbringen. Für Somatostatin-Peptide kann der biologische Funktionsbereich auch funktional definiert werden als jede Peptidsequenz, die sich an einen oder mehrere der bekannten Somatostatinrezeptoren bindet. Auf diese Weise umfassen Somatostatin und Somatostatin-Peptide natürliches Somatostatin, Somatostatin-Peptide welcher Natur auch immer, Analoge von Somatostatin oder Peptide, die sich an einen Somatostatinrezeptor binden.
Das Produkt, das sich aus den hierin ausgeführten Verfahren ergibt, kann sowohl für medizinische Anwendungen als auch Veterinäranwendungen verwendet werden. Typischerweise wird das Produkt bei Menschen verwendet, aber kann auch bei anderen Säugetieren verwendet werden. Der Begriff "Patient" soll dabei ein Säugetierindividuum bezeichnen und wird so in der Beschreibung und in den Ansprüchen durchgängig verwendet. Die hauptsächlichen Anwendungen der Erfindung betreffen menschliche Patienten, aber die Erfindung kann auf Laboratorien, Bauernhof, Zoo, Tierwelt, Haustier oder Sporttiere angewandt werden.
Es gibt eine Anzahl von klinischen Situationen, in denen die lokale Therapie eine besonders attraktive therapeutische Option in der Behandlung des Karzinoms sein kann, einschließlich: a) rettende Therapien, zum Beispiel in Patienten mit Resterkrankung von kleinem Volumen nach systemischer Chemotherapie; b) zusammenführende Therapie, zum Beispiel bei Patienten mit hochgradigen Tumoren, die dokumentiertes vollständiges Ansprechen nach systemischer Chemotherapie erreichen (für die die endgültige Rückfallrate an 80% herangeht); und c) lokale Intensivierungstherapie, zum Beispiel nach einer beschränkten Anzahl von Sitzungen mit systemischer Chemotherapie für "chemisches Debulking", insbesondere mit Mitteln mit bekannten strahlensensibilisierenden Eigenschaften wie 5 Fluor-Uracil.
Ebenso gibt es eine Anzahl von Karzinomen, für die die lokale Strahlentherapie als eine besonders attraktive therapeutische Option betrachtet werden kann, einschließlich: a) Glioblastomen, b) Bauchspeicheldrüsenkarzinomen und c) Dickdarmkarzinomen. Glioblastome weisen eine hohe Sterblichkeitsrate mit wenigen wirkungsvollen Therapien auf und entwickeln sich normalerweise als ein einzelner Knoten im Gehirn. Bauchspeicheldrüsenkarzinome metastasieren häufig in die Leber und entwickeln sich aus einem lokalisierten Bereich. Ebenso häufig metastasieren Dickdarmkarzinome in die Leber und gehen aus einer sehr beschränkten Anzahl von hauptsächlichen Bereichen hervor. Die Metastasierung in die Leber wird zunehmend mit chemotherapeutischen Mitteln durch intraarterielle Verabreichung behandelt, gefolgt von der Platzierung eines Verweilkatheters. Der Verweilkatheter erlaubt auch die intraarterielle Verabreichung der strahlentherapeutischen Peptide dieser Erfindung. Auf diese Weise kann die intraarterielle Verabreichung von entweder isotopenmarkierten löslichen Somatostatin-Peptiden oder isotopenmarkierten partikelförmigen Somatostatin-Peptiden angewendet werden.
Zusätzlich zu den Karzinomen, für die die lokale Strahlentherapie als eine besonders attraktive therapeutische Option betrachtet werden kann, ist die Verwendung des isotopenmarkierten Somatostatin-Peptids für die Behandlung der Arthritis durch intraartikuläre Verabreichung viel versprechend. Die Verwendung von ¹⁸⁸Re-RC-160 als ein Strahlenpharmazeutikum sollte besonders anwendbar sein zur Gelenkstherapie von Knie, Knöchel, Hüfte, der Schulter, dem Ellenbogen, dem Handgelenk und den Phalangen, mit angewandten Strahlungsdosen, die von der Größe der Gelenke abhängig sind, aber im Allgemeinen unterhalb 10 mCi liegen. Beim bevorzugten Verfahren wird ein RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog mit entweder ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert durch jedes Verfahren, das hier oder woanders beschrieben ist, um zu einer kolloidalen Form der isotopenmarkierten Zubereitung zu führen. Patienten mit rheumatischer Arthritis werden mit diesem mit Rhenium markierten RC-160 behandelt. Die Zubereitung wird direkt in ein großes Gelenk injiziert, das dafür bekannt ist, der Ort einer arthritischen Entzündung zu sein, wobei sich das Kolloid innerhalb des Gelenks und den umliegenden Knochenanordnungen anordnet. Das ¹⁸⁸Re-RC-160 auch als ein Isotopenkolloid, wodurch die Radioaktivität nahezu den Synovialzellen positioniert und von den Synovialzellen aktiv aufgenommen wird. Zusätzlich zu dieser Wirkung jedoch ermöglicht die Präsenz von biologisch aktiven Peptiden (das heißt Somatostatinsequenzen) direktes Abzielen auf entzündete Zellen innerhalb des Grundgerüsts des entzündeten Gelenks und trägt dadurch zu einer wirkungsvolleren Therapie mit einer reduzierten gesamten Radioaktivitätsbelastung bei. Wiederholte Dosen können wie benötigt verabreicht werden. Die Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und andere Parameter können durch Gammakameraauswertung oder ähnliche Verfahren bestimmt werden und machen Gebrauch von der Strahlung von ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re. In weiteren Ausführungsformen können entweder partikelförmige oder hoch lösliche, mit Rhenium markierte RC-160 Zubereitungen auf ähnliche Weise verabreicht werden. Alternativ dazu wird die Zubereitung in Blutgefäße injiziert, die zum Gelenk führen.
Es ist beabsichtigt, dass der überall in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Begriff "lokal aufgegliedert" jeden Karzinomtumor umfasst, der sich innerhalb eines definierbaren Organs oder Raums befindet. Dies umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Tumoren von spezifischen Organen, wie zum Beispiel Karzinomen des Gehirns, der Prostata, der Bauchspeicheldrüse, der Leber, der Eierstöcke, des Dickdarms, der Lunge oder der Brust. Dies umfasst auch, ist aber nicht beschränkt auf Karzinome, die sich innerhalb eines definierbaren Raums, wie zum Beispiel Karzinome des lymphatischen Systems oder innerhalb der Prostatabinde, des Gehirns, des peritonealen Hohlraums, des Herzbeutels oder des Brusthohlraums befinden. Es ist beabsichtigt, dass der überall in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Begriff "lokale Verabreichung" jedes Verabreichungsverfahren umfasst, dass das isotopenmarkierte Somatostatin-Peptid in den lokalen Raum verbringt. Dieses Verfahren umfasst Injektionsverfahren, wie zum Beispiel die direkte Injektion in das Karzinom, die direkte Injektion in einen Raum, der das Karzinom enthält, und die direkte Injektion in eine Arterie, die direkt zum Karzinom führt. Es umfasst auch Verfahren, die Gebrauch von einem dauerhaften oder vorübergehenden Katheter machen, Boluseinbringung sämtlicher Verfahren oder andere Verfahren der Einbringung einer wässrigen Zusammensetzung oder eine Zusammensetzung, die isotopenmarkierte partikelförmige Somatostatin-Peptide umfasst.
Isotopenmarkierte partikelförmige Somatostatin-Peptide, die auch als kolloidale Somatostatin-Peptide oder mikroaggregierte Somatostatin-Peptide beschrieben werden können, können auch zur therapeutischen Verwendung angewendet werden. Bestimmte Somatostatin-Peptide können mit Technetium oder Rhenium in der partikelförmigen Form isotopenmarkiert sein und als strahlentherapeutische Mittel verabreicht werden, während sie sich in der partikelförmigen Form befinden. Im Besonderen kann die intraarterielle Injektion von partikelförmigen Somatostatin-Peptiden von einer ausreichend großen Größe, die sich am Ende von Arteriolen und Kapillaren ansammelt, in einer Arterie verwendet werden, die einen Tumor versorgt. Mit diesen Verfahren ist es theoretisch möglich, am Ende der Arterie hoch selektive Strahlung zur Verfügung zu stellen, die um eine Größenordnung von 20 bis 30-mal größer ist als diejenige, die durch externe gerichtete Strahlung erzielbar ist. Auf diese Weise ermöglicht das partikelförmige Somatostatin-Peptid am Ende der Arterie hoch selektive oder lokale Ablagerung von Radionukliden im Tumor. In Abhängigkeit von der partikelförmigen Form kann das Peptid einem Prozess der langsamen Lösung unterliegen, sobald das partikelförmige Somatostatin-Peptid am Ort des Tumors ist. Das gelöste Peptid kann dann in die Tumormasse eindringen und sich an die Rezeptoren im Tumor selbst binden. Die kleine Größe des Peptids sollte die hoch effiziente Durchdringung von relativ gefäßarmen Bereichen des Tumors ermöglichen, wobei jedes ungebundene Peptid vom Körper durch die normalen Ausscheidungsprozesse rasch abgebaut wird.
Das Sequenzen bindende Metall, wie es in den Peptiden dieser Erfindung vorliegt, kann durch das Hinzufügen eines positiv geladenen Überleitungsmetall-Ions wie Zn, Cu, Sn, Ca oder Ni und Ähnlichem stabilisiert werden, das so gewählt ist, dass es eine niedrige Ordnung der Bindungsstärke aufweist. Durch eine Ersatzreaktion ersetzt das Überleitungsmetall-Ion das H Ion des Thiolats. Es wird angenommen, dass die divalenten Ionen von Zink und Zinn besonders attraktiv sind. Einige Überleitungsmetalle können gleichzeitig verwendet werden, um Disulfidbrücken zu reduzieren und um die das Metall bindenden Sequenzen, wie zum Beispiel Sn zu stabilisieren, was besonders nützlich ist bei Anordnungen mit Cystin. In jedem Fall werden die Überleitungsmetalle schwach an das Peptid gebunden.
Die positiv geladenen Überleitungsmetall-Ionen werden zu dem Peptid in einer wässrigen Lösung eingebracht, die einen entsprechenden Puffer enthält, wobei dieser Puffer auch als ein Metallkomplexbildner oder als Metallbindungspuffer dient. Der Puffer kann aus dicarboxylischen Säuren (Tartrat, Phthalat, Zitrat), Aminosäuren (Glycin, Di-Glycin, Tri-Glycin), Borat, Glukoheptanat oder Ähnlichem bestehen. Die Pufferkomponenten können auch als Stabilisatoren für Metall-Ionen und/oder als Übertragungsmittel oder Liganden für Radionuklide wie ^99mTc verwendet werden. Für die Isotopenmarkierung in sauren Umgebungen werden typischerweise 5 bis 50 mM Tartrat und 5 bis 40 mM Phthalat bei PH-Werten von etwa 5 bis etwa 7 verwen det. Für die Isotopenmarkierung in alkalischen Umgebungen werden Puffer wie zum Beispiel 10 mM Glycin oder Glycylglycin bei PH-Werten von etwa 8 bis etwa 10 verwendet. Der Puffer kann auch eine Anzahl von Hilfsmitteln und/oder Stabilisatoren einschließlich NaCl, Maltose, Inositol, Glucoheptonate und Ähnliches enthalten.
Das Peptid dieser Erfindung wird mit einem medizinisch nutzbaren Metall-Ion zu einem Komplex ausgebildet. Das medizinisch nutzbare Metall-Ion kann radioaktiv sein und Gammastrahlen, Betapartikel oder Positronen erzeugen, die bei der Kollision mit Elektronen in Gammastrahlen umgewandelt werden. Alternativ dazu kann das medizinisch nutzbare Metall-Ion paramagnetisch oder supramagnetisch sein. Das medizinisch nutzbare Metall-Ion kann bei diagnostischen Bildaufbereitungsverfahren einschließlich Gammaszintigraphie, computerisierter Einzelphotonenstrahlentomographie, Positronenstrahlentomographie oder Magnetresonanzdarstellung verwendet werden.
Besonders verwendbare Metall-Ionen können gefunden werden in der Gruppe, die gebildet wird aus den Elementen 26–30 (Fe, Co, Ni, Cu, Zn), 33–34 (As, Se) 42–50 (Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn) und 75–85 (Re, Os, Ir, Pt Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Po, At). Isotope der Elementen Tc und Re sind besonders anwendbar zur Verwendung in der diagnostischen Bilddarstellung und der Strahlentherapie. Das Isotop ^99mTc ist besonders anwendbar zur Verwendung in der diagnostischen Bilddarstellung. Die Isotope ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re sind besonders anwendbar zur Verwendung in der Strahlentherapie. Anderer Radionuklide mit diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen umfassen ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb, ²¹¹Pb und ²¹²Bi. Die Art des medizinisch nutzbaren Metall-Ions hängt von der spezifischen medizinischen Anwendung ab. Das medizinisch nutzbare Metall-Ion wird so gewählt, das es eine höhere Ordnung der Bindung aufweist als das positiv geladene Überleitungsmetall-Ion, das verwendet wird, um die das Metall bindenden Sequenzen zu stabilisieren. Im Falle von ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re werden die Peptide mit Perrhenat reagiert, welches entweder vor dem Hinzufügen zum Peptid oder alternativ und vorzugsweise in der Gegenwart des Peptids mit einem Reduktionsmittel behandelt wird, um Re mit einem niedrigeren Oxidationszustand zu erzeugen. In allen solchen Fällen ist das Produkt aus der Reaktion zwischen dem Metall-Ion und dem Peptid ein Komplex aus dem Metall-Ion und dem Peptid.
Die meisten zinnhaltigen Reduktionen werden bei einem PH-Wert von etwa 5 bis etwa 7 ausgeführt. Bei Aminosäureseitenketten in einer Lösung unterhalb eines PH-Werts von 7 sind die alkalischen Aminosäuren positiv geladen, sind die sauren Aminosäuren im Wesentlichen negativ geladen, sind die alkoholischen Aminosäuren neutral und Methionin ist neutral. Da sich reduziertes Rhenium oder Technetium bereitwilliger an neutrale Wasserstoffspender bindet als an positiv geladene Wasserstoffspender, ist Cys im PH-Bereich von 5 bis 7 ein optimaler Kandidat für die Stelle der Bindung. Die Ausbeuten von Isotopenmarkierungen sind vom PH-Wert abhängig und sind theoretisch optimal bei oder nahe dem pK_a.
In Zamora PO und Rhodos BA, United States Patent Nummer 5,443,816, mit dem Titel „Peptide-Metal Ion Pharmaceutical Preparation and Method", wird die Verwendung aus Zusammensetzungen von markierten peptidbasierten Metall-Ionen als Pharmaka gelehrt, zusammen mit Verfahren, Peptide, Eiweiße und weitere ähnliche Substanzen mit Isotopenmetallen, paramagnetischen Metallen und anderen medizinisch nutzbaren Metall-Ionen zu markieren. Diese Erfindung lehrt auch, dass Peptide, die einen biologischen Funktionsbereich und einen medizinisch nutzbaren, Metall-Ionen bindenden Einsatzbereich aufweisen, mit medizinisch nutzbaren Metall-Ionen zur Verwendung in der Diagnose und der Behandlung einer Vielfalt von pathologischen Gegebenheiten markiert werden können. Dementsprechend werden die Lehren dieses Patents hierin als Referenz aufgenommen.
Somatostatin-Peptide enthalten eine Disulfid-Bindung. In diesem Fall schließt ein Verfahren die anfängliche Reduktion der Disulfid-Bindung ein. Bei einem bevorzugten Verfahren werden die folgenden Schritte angewendet:

a) Inkubieren des Peptids mit einem Reduktionsmittel, um einige oder alle der Disulfid-Bindungen zu Thiolatgruppen zu reduzieren;
b) Überschüssiges Reduktionsmittel aus dem Peptidsubstrat zu entfernen, das Thiolatgruppen enthält;
c) Hinzufügen einer Quelle für Sn (II) Agens zu der das Thiolat enthaltenden Peptidzubereitung in einer Menge, die ausreichend ist, Sn (II) und Schwefel enthaltende Komplexe auszuformen; und,
d) Hinzufügen eines medizinisch nutzbaren Metall-Ions, wodurch das Metall-Ion das Sn (II) in den Sn (II) und Schwefel enthaltenden Komplexen ersetzt und das Metall-Ionen und Thiolat enthaltende Peptid Metall-Ionen und Schwefel enthaltende Komplexe ausformt.

Die Reihenfolge der Schritte kann geändert werden und das Verfahren erzeugt immer noch mit Metall-Ionen markierte Peptide. Dementsprechend ist das Verfahren nicht auf die hierin dargestellte Reihenfolge der Schritte beschränkt. Ausdrücklich ist es möglich und in einigen Fällen vorteilhaft, das Sn (II) vor dem Entfernen des überschüssigen Reduktionsmittels aus dem Peptidsubstrat hinzuzufügen, um Sn (II) enthaltende und Schwefel enthaltende Komplexe auszuformen. Auf diese Weise wird die Oxidation von Thiolatgruppen oder die Reformation von Disulfid-Bindungen und anderen Querverbindungen sofort reduziert.
Die zur Verfügung gestellte Menge von Sn (II) muss, wenn Pertechnetat (TcO₄) oder Perrhenat (ReO₄) das Metall-Ion ist, auch ausreichen um das Pertechnetat oder das Perrhenat auf den gewünschten Redoxzustand zu reduzieren. Wenn das vorhergehende Verfahren für Pertechnetat oder Perrhenat angewendet wird, dann kann ausreichendes Sn (II) in Schritt c) hinzugefügt werden, um das Metall-Ion zu reduzieren, wobei das Isotopenmetall in einem anschließenden Schritt hinzugefügt wird. Alternativ dazu kann zusätzliches Sn (II) jederzeit auch vor oder gleichzeitig mit der Einbringung des Metall-Ions hinzugefügt werden. Wenn zum Beispiel Sn (II) hinzugefügt wird, um Sn (II) enthaltende und Schwefel enthaltende Komplexe vor dem Entfernen des überschüssigen Reduktionsmittels aus dem Peptidsubstrat auszuformen, dann würde zusätzliches Sn (II) im Anschluss an das Entfernen des überschüssigen Reduktionsmittels hinzugefügt. Ebenso, wenn Sn (II) als das anfängliche Reduktionsmittel in Schritt a) verwendet wird und überschüssiges Sn (II), Zinnoxid und andere Verunreinigungen entfernt werden, dann würde ausreichendes weiteres Sn (II) in Schritt c) hinzugefügt oder gleichzeitig mit der Einbringung des Metall-Ions in einer Menge, die ausreichend ist, das Metall-Ion in den gewünschten Redoxzustand zu reduzieren.
Zahlreiche Reduktionsmittel sind beschrieben worden und sind jenen, die in der Technik ausgebildet sind, bekannt. Besonders nutzbare Arten von Reduktionsmitteln umfassen 2- Mercaptoethanol; 1,4-Dithiothreitol; 2,3-Dihydroxybutan-1,4-Dithiol; 2-Aminoethanethiol HCl; Thioglycolat; Cystein; reduziertes Glutathion; Na₂SO₃; Sn(II); Cu(I) und Ti (II). Das Reduktionsmittel kann in einem gelösten Stoff aufgelöst werden oder kann einer festen Phase beigefügt sein. Reduktionsmittel, die einer festen Phase beigefügt sind, sind kommerziell verfügbar und Verfahren für ihren Gebrauch sind jenen, die in der Technik ausgebildet sind, bekannt. Der Grad, bis zu dem das Peptid die Reduktion von Disulfid-Bindungen erfordert, hängt von der Beschaffenheit des Peptids und seiner beabsichtigten medizinische Anwendung ab. Allgemein gesagt werden normalerweise mildere Reduktionsbedingungen und kürzere Inkubationszeiten angewendet, als diejenigen, die erforderlich sind um Disulfid-Bindungen in Eiweißen oder komplexen Polypeptiden, wie zum Beispiel Antikörpern, zu reduzieren. In jedem Fall wird die Reduktion beendet, bevor übermäßige Zerstückelung des Peptids oder Verlust der biologischen Funktion des Peptids auftritt.
In einer spezifischer Ausführungsform wird Sn(II) als Reduktionsmittel in einer Konzentration von 5 mM verwendet. In dieser Ausführungsform wird das Sn(II) in einer Pufferlösung aufgelöst ist, die zusammensetzt ist aus etwa 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat mit PH-Wert 5,5 und der Sn(II) Puffer wird zu einem Peptidsubstrat mit einer Konzentration von 8,3 mg/mL beigemengt. Man lässt die Reduktionsreaktion für einen Zeitraum bei Zimmertemperatur fortfahren, wobei drei Stunden erfolgreich angewendet wurden bei einigen Peptiden, die eine einzelne Disulfid-Bindung aufweisen und wobei nach diesem Zeitraum die Reaktion durch Entfernen der überschüssigen Sn(II) Ionen durch Chromatographie beendet wird.
Das Entfernen des Reduktionsmittels, ob Sn(II) oder ein anderes Reduktionsmittel, kann mit einer Vielfalt von geeignetem Mitteln einschließlich solcher Verfahren wie Dialyse, Ultrafiltration, Membranfilterung mit positivem Druck, Ausfällung, präparative hoch performante Flüssigkeitschromatographie, Affinitätschromatographie, andere Formen von Chromatographie und präparativer isoelektrischer Fokussierung durchgeführt werden. Viele der Reduktionsmittel enthalten Thiole, die, wenn sie in der endgültigen Mischung zur Markierung vorhanden sind, mit dem medizinisch nutzbaren Metall-Ion einen Komplex bilden können. Solche Komplexe können schwerwiegende und unbekannte Nebenwirkungen haben, wenn sie in vivo verabreicht werden. Außerdem zeigen einige Reduktionsmittel unannehmbare Toxizität. Auf diese Weise begrenzt das Entfernen des Reduktionsmittels sowohl den Grad der Reduktion auf das gewünschte Maß, wie es auch gesteigerten Nutzwert und die Sicherheit der markierten Zubereitung durch Entfernen von toxischen oder anderen unerwünschten Reduktionsmitteln zur Verfügung stellt.
Thiolatgruppen in reduzierten Peptiden sind hoch reaktiv und können interagieren, um Disulfid-Bindungen umzuformen. Es wird angenommen, dass die Verwendung von Sn(II) als ein Schutzhilfsmittel die Reformation von Disulfid-Bindungen reduziert. Quellen für Sn(II) umfassen Zinntartrat, zinnhaltiges Glucoheptonat, zinnhaltiges Gluconat, zinnhaltiges Phosphonat, zinnhaltiges Chlorid, zinnhaltiges Sulfat, zinnhaltiges Acetat und zinnhaltiges Fluorid. Die Auswahl der Quelle von Sn(II) und seine letztendliche Konzentration hängt von der beabsichtigten medizinische Anwendung des Peptids, der Beschaffenheit des Peptids, der relativen und absoluten Anzahl von Thiolatgruppen und dem zu verwendenden Metall-Ion ab. In einer Ausführungsform wird Zinntartrat in einer Konzentration von 1,25 mM verwendet. Das Zinntartrat wird dem Peptid nach Entfernen des Peptidreduktionsmittels hinzugefügt. Das Zinntartrat wird bei einem PH-Wert von 5,6 in einem aus 10 mM Tartrat und 40 mM Phthalat zusammengesetzten Puffer vorbereitet und wird dem Peptid hinzugefügt, um eine letztendliche Konzentration von 1 mg/mL Peptidlösung zu erhalten.
Die Konzentration an Zinnhaltigkeit und gesamtem Zinn variiert je nach dem zu verwendenden Metall-Ion. Zum Beispiel ist eine bedeutend höher zinnhaltige Konzentration erforderlich, um Perrhenat zu reduzieren, als um Pertechnetat zu reduzieren. ¹⁸⁸Re in der Form von Perrhenat kann markiert werden unter Verwendung von Kits, die zwischen etwa 2,5 bis 15 mM Zinnhaltigkeit aufweisen, mit dementsprechend gesamtem Zinn von etwa 1 bis 5 mg oder höher, wenn ein Kit mit größerem Volumen angewendet wird, wobei alle einen PH-Wert zwischen etwa 5 und 6 aufweisen. Allgemein ausgedrückt erfordern Kits mit niedrigere Zinnkonzentration Erhitzung, wie zum Beispiel für 30 bis 60 Minuten in einem kochend heißen Bad, um das ganze verfügbare Perrhenat wirksam zu reduzieren, während Kits mit hohem totalen Zinngehalt ausreichende Reduktionskapazität aufweisen, das Perrhenat innerhalb von etwa einer Stunde zu reduzieren, wenn dieses bei Raumtemperatur inkubiert wird. Eine Erhöhung der oben genannten Zinnkonzentration oberhalb etwa 15 mM hat eine vernachlässigbare Auswirkung auf die Reduktionskapazität und bei höheren Konzentrationen wird es zunehmend schwieriger das Zinn in Lösung zu halten.
In einem alternativen Verfahren ist es möglich, ein Verfahren anzuwenden, das die gleichzeitige Reduktion sowohl der Disulfid-Bindung im Peptid als auch des Metall-Ions einschließt. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn Metall-Ionen wie Rhenium verwendet werden, in Anbetracht dessen, dass Perrhenat im Vergleich zu Pertechnetat wesentlich größere Reduktionsbedingungen erfordert. Bei einem bevorzugten Verfahren werden die folgenden Schritte angewendet:

a) Mischen das Peptids mit einem Reduktionsmittel, das dazu in der Lage ist, Disulfid-Bindungen zu Thiolatgruppen zu reduzieren und gleichzeitig Metall-Ionen in einen gewünschten Redoxzustand zu reduzieren;
b) Hinzufügen des Metall-Ions, so dass gleichzeitig die Reduktion von Disulfid-Bindungen des Peptids und die Reduktion des Metall-Ions eingeleitet werden, wie zum Beispiel durch Hinzufügen einer wasserhaltigen Zubereitung von Metall-Ionen zu einer gefriergetrockneten oder auf andere Weise getrockneten Mischung aus Peptid und Reduktionsmittel;
c) Zulassen, dass die Reaktion vervollständigt wird, wodurch das Reduktionsmittel die Disulfid-Bindungen reduziert, resultierend in Thiolat enthaltendem Peptid, und das Metall-Ion und das das Metall-Ion und das Thiolat enthaltende Peptid Metall-Ionen enthaltende und Schwefel enthaltende Komplexe ausbilden. Wenn Sn(II) oder ein anderes geeignetes Überleitungsmetall mit Reduktionspotential als Reduktionsmittel verwendet werden, dann kann der Reduktionsprozess der Disulfid-Bindung Sn(II) enthaltende und Schwefel enthaltende Peptidkomplexe zum Ergebnis haben und das Metall-Ion ersetzt das Sn(II) in den Sn(II) enthaltenden und Schwefel enthaltenden Peptidkomplexen und das das Metall-Ion und das Thiolat enthaltende Peptid formt Metall-Ionen enthaltende und Schwefel enthaltende Peptidkomplexe aus.

Die Reihenfolge der Schritte kann verändert werden und das Verfahren wird immer noch mit Metall-Ionen markierte Peptide erzeugen. Dementsprechend werden die Ansprüche nicht auf die dort beschriebene Reihenfolge der Schritte beschränkt. Ausdrücklich ist es möglich und in einigen Fällen vorteilhaft, dem Peptid das Metall-Ion vor dem Hinzufügen des Sn(II) hinzuzufügen, so dass die Schritte a) und b) umgekehrt werden. Es ist auch wünschenswert eine Oxidation der Zubereitung zu vermeiden, so dass die Reaktionen in einer im Grunde genommen sauerstofffreien Umgebung ablaufen. Dies kann zum Teil erreicht werden, in dem alle Lösungen mit inerten Gasen wie zum Beispiel Stickstoff oder Argon gereinigt werden und alle Reaktionen unter einer inerten Gasatmosphäre ausgeführt werden.
Bei Verwendung dieses Verfahrens und in Abhängigkeit von der verwendeten Strahlungsmarkierung kann die Menge des verwendeten Zinns erheblich variieren. Die Konzentration von Zinnhaltigkeit und gesamtem Zinn variiert je nach dem zu verwendenden Metall-Ion. Zum Beispiel ist eine bedeutend höhere zinnhaltige Konzentration erforderlich um Perrhenat zu reduzieren, als um Pertechnetat zu reduzieren. ¹⁸⁸Re in der Form der Perrhenat kann markiert werden unter Verwendung von Kits mit zwischen etwa 2,5 bis etwa 15 mM Zinnhaltigkeit, mit gesamtem Zinn dementsprechend von etwa 1 bis 5 mg oder höher, wenn ein Kit mit größerem Volumen angewendet wird, alles bei einem PH-Wert zwischen etwa 5 und 6. Allgemein ausgedrückt erfordern Kits mit niedrigere Konzentration der Zinnhaltigkeit Erhitzung, wie zum Beispiel für 30 bis 60 Minuten in einem kochend heißen Bad, um das ganze verfügbare Perrhenat wirksam zu reduzieren, während Kits mit hohem totalen Zinngehalt ausreichende Reduktionskapazität aufweisen, um das Perrhenat innerhalb von etwa einer Stunde zu reduzieren, wenn dieses bei Raumtemperatur inkubiert wird. Eine Erhöhung der oben genannten Zinnkonzentration oberhalb etwa 15 mM hat eine vernachlässigbare Auswirkung auf die Reduktionskapazität und bei höheren Konzentrationen wird es zunehmend schwieriger das Zinn in Lösung zu halten.
Sowohl für die Markierung von ¹⁸⁶Re wie auch für die Markierung von ¹⁸⁸Re wurde etwa 5 mM Zinntartrat für eine totale Zinnkonzentration von etwa 1,2 mg mit 200 μg Peptid angewendet. Für das Markieren derselben Menge des Peptids mit ^99mTc wurde etwa 0,5 mM Zinntartrat angewendet. Die Menge des Sn(II) in der Zubereitung muss so gewählt sein, dass sie ausreichend ist, um das Metall-Ion unter den angegebenen Reaktionsbedingungen vollständig auf den gewünschten Redoxzustand zu reduzieren, ohne dass solche Konzentrationen von Sn(II) vorliegen, dass das Zinn in der Lösung ausfällt. Die Ausfällung kann in großen Teilen durch die Auswahl von geeigneten Puffern kon trolliert werden. Die Menge des Sn(II) variiert auch mit den Reaktionsbedingungen; bei Zubereitungen zum Beispiel, die bei Temperaturen im Bereich von 80°C zu 100°C inkubiert werden, ist weniger Sn(II) erforderlich als wenn die Inkubation bei Raumtemperatur ausgeführt wird. Die Inkubationszeit variiert auch je nach den Bedingungen der Inkubation, vornehmlich den Temperaturen, obwohl PH-Wert und andere Bedingungen die Inkubationszeit auch beeinflussen. Allgemein ausgedrückt sind Inkubationen bei Temperaturen im Bereich von 80°C zu 100°C beträchtlich kürzer als Inkubationen bei Raumtemperatur und erfordern eine Inkubationsperiode von der Hälfte bis zu einem Zehntel oder weniger in der Dauer.
Unabhängig von dem angewendeten Verfahren hat das Hinzufügen von hoch molarer Askorbinsäure zu dem mit Rhenium markierten RC-160 nach der Markierung eine merkliche Wirkung bei der Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber radiolytischem Zerfall des Kits. Verfahren und Methoden für das Hinzufügen von Askorbat oder Gentisinsäure zu der Zusammensetzung werden detaillierter weiter unten beschrieben.
Ein Kit, entworfen zur Verwendung mit dem Somatostatin-Peptid RC-160, dessen Peptid weiter unten detaillierter beschrieben wird, enthielt 200μg des Peptids und 5 mM Zinnhaltigkeit, oder 1,2mg Zinn total, bei einem PH-Wert von 5,0. Wenn es durch hinzufügen von ¹⁸⁸Re als Perrhenat und Erhitzen für eine Stunde bei 90°C markiert wurde, betrug die Perrhenatreduktion und die Isotopenmarkierung im Grunde genommen 100%. Das gesamte Kolloid betrug weniger als 3% und ungebundenes Perrhenat betrug weniger als 0,5%. Wenn das Kit mit einem in einem Reaktor erzeugten ¹⁸⁶Re niedriger spezifischer Aktivität als Perrhenat (2,5 bis 5 mCi/μg) markiert wurde, wies es ausreichende Reduktionskapazität auf um vergleichbare Ergebnisse zu erzeugen.
Bei der Markierung mit Pertechnetat ist es möglich, zwischen 0,2 und 1 mM und vorzugsweise 0,5 bis 1 mM Zinnhaltigkeit zu verwenden, mit gesamtem Zinn so niedrig wie 40 μg, abhängig vom Füllungsvolumen.
Unabhängig vom angewendeten Verfahren, hängt die Form des verwendeten Zinns in Teilen von den Puffern ab, von denen in den Kits Gebrauch gemacht wird. So ist zum Beispiel in Kits mit Puffern, die Tartrat als Komplexbildner enthalten, die Verwendung von zinnhaltigen Tartratsalzen wünschenswert. Bei Kits, die andere Komplexbildner als Tartrat enthalten, wie zum Beispiel Kits, die EDTA enthalten, kann zinnhaltiges Chloriddihydrat angewendet werden. Allgemeinen ausgedrückt wird jede Zinnhaltigkeit in konzentrierter salzsaurer Säure hinzugefügt. Dies begünstigt die Aufrechterhaltung des Zinns im Sn(II) Oxidationszustand als Zinn-Ionen, anstatt des Sn(IV) Zustandes als Zinnoxid-Ionen. Sn(II) reduziert Isotopenmetalle wie Pertechnetat oder Perrhenat wirksam, während Sn(IV) dies nicht tut. Komplexbildner werden im Allgemeinen verwendet in einem 2 bis 20 fachen molaren Überschuss gegenüber dem gesamten Zinn, um sicher zu stellen, dass das gesamte Zinn, einschließlich sowohl der Zinn-Ionen wie auch jeglicher Zinnoxid-Ionen in einen Komplex ausgebildet wird. Nicht in einen Komplex ausgebildetes Zinn formt bei einem neutralen PH-Wert sofort ein unlösliches Hydroxid aus. In Abwesenheit von Komplexbildnern können oberhalb eines pH-Werts von 5,5 kolloidale Zinnarten ausgeformt werden, bevor sich das Hydroxid niederschlägt. Komplexbildnern trennen Zinn von der Hydrolysereaktion ab, hindern das Zinn aber nicht daran, Redoxreaktionen einzugehen. pH-Titrierungen zinnhaltigen Lösungen haben eine anwachsende Fähigkeit zur Komplexbildung gezeigt in der Reihenfolge ED-TA»Zitrat»Glucoheptonat»Tartrat»Apfelsäure. Obwohl Zinntartrat in einem molaren 1:1 Verhältnis von Zinn zu Tartrat als trockenes Salz existiert, legen empirische Hinweise nahe, dass ein minimal 2-facher Überschuss an Tartrat notwendig ist, um eine Zinnhaltigkeit bei neutralem pH-Wert zu stabilisieren. Jedoch können EDTA, Zitrat und Glucoheptonat alle die Zinnhaltigkeit bei etwa 1:1 molaren Verhältnissen bei neutralem PH-Wert stabilisieren; eine Arbeitsformel von 1,2:1 molarem Verhältnis des Komplexbildners zur Zinnhaltigkeit kann zufrieden stellend angewendet werden.
Unabhängig von dem angewendeten Verfahren können hohe Konzentrationen von Zinn durch die Verwendung von geeigneten Puffern stabilisiert werden. Zum Beispiel können Metall bindende Puffer, wie Diglycin und Triglycine bei 50 bis 100 mM, die Stabilität von hoch millimolaren Zinnkonzentrationen steigern. Zum Beispiel kann ein Puffer, der 50 mM Diglycin oder Triglycin mit einem entsprechenden Komplexbildner wie EDTA, Zitrat, Glucoheptonat oder Tartrat enthält, bei neutralem pH-Wert verwendet werden, um das Zinn zu stabilisieren und Ausfällung zu verhindern, wenn die gesamte Zinnkonzentration im Bereich von 5 bis 10 mM liegt. Geeignete Metall-Ionenpuffer umfassen Zitrate und Tartrate, polyaminocarboxcylische Säuren wie EDTA, DTPA und NTA (nitrilotriacetische Säure), ACES (N-2-acetamido-2-aminoethansulfonische Säure, ADA (N-2-acetamidoimino-diacetische Säure), Bicin, Tricin, Glycylglycin, Triglycin, Tetraglycin und MES (2-(N-morpholino)ethansulfonische Säure). Es ist zum Beispiel möglich, eine hoch millimolare zinnhaltige Lösung, die 5 mM Zinntartrat in 40 mM KH Phthalat und 10 mM NaK Tartrat umfasst bei neutralem pH-Wert und darüber zu stabilisieren durch Hinzufügen eines zweiten Metallbindungspuffers wie Glycylglycin in Konzentrationen von 50 bis 100 mM, das ein pKa von 8,2 aufweist. Allgemeinen ausgedrückt wird die Löslichkeit von Zinn durch Hinzufügen eines zweiten Metall bindenden Puffers verbessert, der ein pKa bei oder nahe bei dem pH-Wert der Zusammensetzung hat, die isotopenmarkiert werden soll. Wenn eine Zusammensetzung zur Isotopenmarkierung zum Beispiel Tartrat enthält, das ein pKa von 4,3 aufweist, und wenn die Zusammensetzung bei einem signifikant anderen pH-Wert als 4,3 isotopenmarkiert werden soll, dann kann gesteigerte Zinnkomplexbildung mit resultierender Stabilität des Zinns und Schutz vor Ausfällung durch Hinzufügen eines zweiten Metall bindenden Puffers mit einem pKa bei oder zu nahe bei dem pH-Wert der Zusammensetzung, die isotopenmarkiert werden soll erreicht werden.
In Abhängigkeit von dem verwendeten Somatostatinpeptid, müssen die Rezeptur und die Reaktionsbedingungen geändert werden. Zum Beispiel wurden Arbeiten durchgeführt unter Verwendung von eines RC-160 oder Vapreotid genannten Somatostatin-Peptids, vertrieben von Debiopharm S.A. aus der Schweiz. RC-160 ist ein zyklisches Somatostatinanalog, welches sich an die Somatostatinrezeptoren 2 und 5 binden soll (Oberg K: Treatment of neuroendocrine tumors. Cancer Treat. Rev. 20: 331–355, 1994). Dieses Peptid weist die strukturelle Formel auf:
RC-160 wurde sowohl als Glutamat als auch als Acetatsalz zur Isotopenmarkierung verwendet. RC-160 wurde anfangs in einem zweistufigen Verfahren mit ^99mTc und ¹⁸⁸Re isotopenmarkiert. Die Peptid-Disulfid-Bindung wurde in der ersten Stufe durch Erhitzung in der Gegenwart von Zinn-Ionen und Komplexbildner als Zinntartrat reduziert. ^99mTc Natriumpertechnetat und ¹⁸⁸Re Natriumperrhenat wurde dann hinzugefügt und die Zubereitung wurde weiter erhitzte um in einer zweiten Stufe die Isotopenmarkierung auszuführen.
Während der Isotopenmarkierung unterliegt RC-160 einem Phasenwechsel von einer löslichen Form zu einer vom PH-Wert abhängigen kolloidalen Form der Lösung. Auf diese Weise wird bei PH-Wert 6 oder höher ein Kolloid ausgeformt, während bei PH-Wert 5,5 oder geringer das Peptid löslich bleibt. Das kolloidale Material wird nur ausgeformt, wenn RC-160 in der Lösung vorliegt und ergibt sich nicht, wenn etwas andere Peptide verwendet werden oder wenn überhaupt keine Peptide verwendet werden. Das kolloidale ¹⁸⁸Re RC-160 kann in Äthanol aufgelöst werden oder durch einfaches Erhitzen auf 100° C. Dies deutet darauf hin, dass sich das Kolloid aus der Komplexbildung von Zinn-Ionen mit ¹⁸⁸Re und RC-160 ergibt, und sich nicht ergibt aus der Ausfällung von Zinnsalzen. Es wird angenommen, dass die verminderte Löslichkeit vom Peptid von der Neutralisierung der Ladung des Peptids herrührt.
Die Tartratkonzentration des Kit wurde dann bei einem pH-Wert von 5,0 von 10 mM auf 50 mM gesteigert. Dies ergab ein letztendliches molares Verhältnis des Kit von 10:1 des Tartratkomplexbildners zur Zinnhaltigkeit. Der ursprüngliche Puffer des Kit, Kaliumwasserstoffphthalat, wurde gesenkt von 40 mM auf 10 mM. Es wurde beobachtet, dass Phthalat in dem Kit notwendig ist, um ein einzelnes isotopenmarkiertes Maximum bei der HPLC Analyse zu erhalten. Kaliumwasserstoffphthalate in der niedrigeren 10 mM Konzentration wurden als ausreichend gefunden um diesem Zweck zu genügen, während es für müheloses Gefriertrocknen eine höhere Glasübergangstemperatur erfordert. Maltose wurde als Hilfsstoff für die Gefriertrocknung hinzugefügt.
Unabhängig von dem bestimmten Verfahren der Zubereitung das verwendet wurde, weist das Hinzufügen von hoch molarer Askorbinsäure nach der Markierung zu dem mit Rhenium markierten RC-160 Kit eine merkliche Auswirkung einer gesteigerten Widerstandsfähigkeit gegenüber radiolytischem Abbau des Kits auf.
Die Einbeziehung von Askorbinsäure in die Kitrezeptur vor der Markierung weist eine abträgliche Wirkung auf die Ausbeute der Isotopenmarkierung auf, sogar dann wenn Askorbat auch später nach der Isotopenmarkierung dazugegeben wird. Die Markierungsreaktion des reduzierten Rheniums mit dem Soma tostatinanalog RC-160 wird in der Gegenwart von entweder Askorbinsäure oder Natriumsulfit, einem gebräuchlichen Antioxidationsmittel, negativ beeinflusst.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nicht einschränkenden Beispielen veranschaulicht.
BEISPIEL 1 – ISOTOPENMARKIERUNG EINES EINE DISULFID-BINDUNG ENTHALTENDEN SOMATOSTATINPEPTID-ANALOGS
Das Peptid ist ein zyklisches Octa-Peptid-Analog des Somatostatins. Der biologische Funktionsteil des Moleküls steht in Verbindung mit dem Phe-D-Trp-Lys-Thr Teil des Moleküls. Die Disulfidbrücke zwischen den zwei Cysteinrückständen wird unter Verwendung von eines Sn(II) Reduktionsmittels reduziert, wodurch mutmaßlich Schwefel-Zinn Komplexe gebildet werden. Das Peptid wurde in Acetatpuffer mit dem pH-Wert 4,4 erzielt. Zu der das Peptid enthaltenden Lösung wurde (1:1) 10 mM Tartrat/40 mM Phthalatpuffer hinzugefügt bei PH-Wert 5,6 (P/T Puffer), um zu einer Lösung zu gelangen, die 500 μg Peptid/ml enthielt. Diese Lösung wurde gemischt (1:1) mit P/T Puffer, der 1,25 mM, zinnhaltige Tartrat enthielt, und wurde bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden inkubiert. Gleiche Teile von 0,5 ml wurden dann in einzelne Ampullen umgefüllt. Jedes Kit enthielt 0,25 mg Peptid, 40 mM Phthalat, 10 mM Tartrat und 44 μg Zinntartrat. Alle Lösungen wurden vor der Verwendung mit Stickstoff gesäubert und alle Vorbereitungen wurden unter einer anaeroben Atmosphäre ausgeführt. Das Peptid in den Markierungskits war markiert mit ^99mTc durch Hinzufügen von 1–2 mCi von Natriumpertechnetat (U.S.P.) und die Reaktion wurde 30 Minuten fortgeführt.
BEISPIEL 2 ZUBEREITUNG, MARKIERUNG UND AUSWERTUNG VON SOMATOSTATIN-PEPTID ISOTOPENMARKIERUNGSKITS
Drei Somatostatin-Peptide wurden als Isotopenmarkierungskits vorbereitet, RC-160, Octreotid und ((β-(2-Naphthyl)-cyclic2,7-D-Ala-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-Amide). RC-160 wurde von Debiopharm SA (Lausanne, Schweiz) zur Verfügung ge stellt und Octreotid wurde als Sandostatin 500 (Sandoz, Schweiz) erhalten.
^99mTc Markierungskits. Die für Isotopenmarkierung mit ^99mTc bestimmten Kits enthielten 0,4 ml letztendliches Volumen mit 100 μg des Peptids, 10 mM Tartrat, 40 mM Phthalat (pH-Werts 5,6) und 1,25 mM Zinntartrat. In einigen Fällen wurden Maltose und Glycin als Hilfsmittel verwendet, wie zum Beispiel 2% Maltose und 50 mM Glycin. Die Kits wurden unter einer Atmosphäre von Stickstoff versiegelt, für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und dann bei –30°C gelagert. Zur Isotopenmarkierung wurde eine Ampulle auf Raumtemperatur aufgetaut und Pertechnetatlösung wurde hinzugefügt. Alle Isotopenmarkierungen wurden initiiert durch Hinzufügen von 0,6 ml Pertechnetatlösung (5–15 mCi) und anschließender Erhitzung der Lösung bei 100°C für 30 Minuten.
Um die RC-160 Kits vorzubereiten, wurde das Peptid in stickstoffgereinigtem Wasser zu einer Konzentration von 500 μg/ml aufgelöst. Zu der Peptidlösung wurde ein gleiches Volumen eines 2X Konzentrats von Pufferlösung (pH-Werts 5,6.) hinzugefügt. Nach dem Mischen wurde die Lösung durch einen 0,22 Mikronfilter direkt in bernsteinfarbene Ampullen mit 1 ml Kapazität gefiltert, so dass jede Ampulle 0,4 ml enthielt. Die Ampullen wurden unter einer Atmosphäre von Stickstoff versiegelt, 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und bei –30°C eingefroren gelagert.
Rheniummarkierungskits. Die Isotopenmarkierungskits zur Verwendung mit ¹⁸⁸Re enthielten typischerweise ein letztendliches Volumen von 2,0 ml mit 500 μg Peptid in einer Pufferlösung aus 20 mM Tartrat und Phthalat (PH-Wert 5,6) und 5 mM Zinntartrat (PH-Wert 5,6). In diesen Kits wurde Maltose und Glycin als Hilfsmittel verwendet. Die Kits wurden vor dem Einfrieren 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubationszeit, bildete sich eine weiße Ausflockung in den RC-160 Kits, aber nicht in den Octreotid-Kits aus. Die Ausflockung wurde als das Peptid identifiziert und konnte durch das Hinzufügen von 0,6 ml Äthanol gelöst werden. Die Isotopenmarkierung wurde initiiert durch Hinzufügen von 2,0 ml Perrhenatlösung und anschließender Erhitzung der Lösung für 30 Minuten bei 100°C. Die isotopenmarkierten Peptide wurden mit vorgefiltertem 20%-igem menschlichem Albuminserum verdünnt. Diese Lö sungen des Peptids in Albumin zeigten keine Zeichen von Ausfällung, sogar bei Abkühlung und Lagerung über Nacht bei 4° C.
Strahlenchemische Auswertung. Es wurde herausgefunden, dass beide Peptide leicht isotopenmarkiert werden konnten mit einer Effizienz größer als 95% für die ¹⁸⁸Re und die ^99mTc Varianten, wie durch TLC bestimmt. Reverse Phase Chromatographie unter Verwendung von C₁₈ SepPaks bestätigte die hohe Markierungseffizienz, wie dies auch die analytische RP-HPLC tat. ^99mTc-RC-160 und ^99mTc-Octreotid verblieben am Ursprung der mit Siliziumdioxid beschichteten TLC Streifen (ITLC-SG), wenn Salzlösung als mobile Phase verwendet wurde und wanderten mit oder nahe bei der flüssigen Front wenn 85%-iges Äthanol als mobile Phase verwendet wurde. Dieses Verhalten wurde auch beobachtete mit ¹⁸⁸Re-RC-160, ¹⁸⁸Re-Octreotid, ¹³¹I-RC-160 und ¹²⁵I-(Tyr³)-Octreotid. Eine kleine Menge von ^99mTc verblieb am Ursprung, wenn 85%-iges Äthanol als die mobile Phase verwendet wurde und kann ^99mTc- oder ¹⁸⁸Re-Kolloide darstellen. Das TLC von ¹⁸⁸Re-RC-160 und ¹⁸⁸Re-Octreotiden demonstrierte, dass die Isotopenmetallintegrationen im Grunde genommen 100%ig war, mit keiner feststellbaren Isotopenkolloidformung.
Die analytische Reverse Phase HPLC unter Verwendung von einer C₁₈ Säule, eluiert mit Acetonitril bei einem kontinuierlichen Gradienten und analysiert durch einen Radioisotopdetektor hinter der Säule, zeigt nur auf einen kleinen Betrag von ungebundenem ^99mTc, eluiert in das leere Volumen und einen einzelnen großen Gipfel der Radioaktivität, eluiert bei etwa 25 Minuten (Flussrate 1 ml/Minute). Die chromatographische Wiederfindung lag bei größer als 95%. Das geringe Maß des bei der Analyse verwendeten Peptids (0,20 μg) ermöglichte keine wirkungsvolle Überwachung bei A₂₈₀. Jedoch wurden ^99mTc-RC-160, ¹⁸⁸Re-RC-160 und radioiodiniertes RC-160 alle zu derselben Zeit und an der gleichen Position eluiert.
^99mTc Markierung. RC-160 und Octreotid konnten beide leicht und reproduzierbar mit ^99mTc isotopenmarkiert werden, wie mittels TLC und Reverse Phase Chromatographie bestimmt wurde. In einer Serie von Zeitstudien wurde die Markierung sowohl von RC-160 wie auch von Octreotid im Wesentlichen in 15 Minuten beendet, und eine Zeit von 30 Minuten wurde für die weitere Untersuchungen gewählt. Die Isotopenmarkierungen wurden über einen Temperaturbereich (Raumtemperatur, 37°C, 70°C und 100°C) ausgeführt und anschließende Erhitzung bei 100°C für 30 Minuten wurde für die meisten Untersuchungen gewählt. Die Erhitzung führte zu einem einförmigeren isotopenmarkierten Produkt, wie durch analytische HPLC bestimmt. Unter Verwendung von von diesem Format konnten beide, RC-160 und Octreotid routinemäßig isotopenmarkiert werden mit 5–15 mCl ^99mTc bei einer Beimischung von größer als 95%.
Markierung mit ¹⁸⁸Re. RC-160 und Octreotid wurden ebenfalls isotopenmarkiert mit ¹⁸⁸Re. Es wurde jedoch festgestellt, dass eine Zunahme der Menge an Zinn-Ionen benötigt wird, um das anschließend hinzugefügte ¹⁸⁸Re zu reduzieren. Wie bei ^99mTc wurde eine Markierungszeit von 30 Minuten als optimal festgelegt, basierend auf einer kinetischen Untersuchung, die mehrere Zeitpunkte und Analyse durch Reverse Phase HPLC einschloss. Unter Verwendung von diesem Format wurden RC-160 und Octreotid isotopenmarkiert mit 6–8 mCi von ¹⁸⁸Re bei einer Beimischung von größer als 95%.
Die Vorinkubation in Zinn-Ionen von RC-160 für 4 Stunden bei Raumtemperatur in 5 mM Zinntartrat führte zu einem unlöslichen Peptidderivat. Solch eine Ausfällung wurde mit Octreotid nicht ausgeformt. Solch eine Ausfällung wurde optisch in den ^99mTc Markierungskits nicht beobachtet, in denen 1 mM Zinntartrat verwendet wurde, um anschließend hinzugefügtes ^99mTc zu reduzieren. Die Ausfällung war von der Zeit abhängig, da die anfängliche Mischung klar war und optisch klar blieb für mindestens 1 Stunde nach der anfänglichen Zusammenstellung.
Das ausgefällte RC-160 wurde in 30% Äthanol gelöst und wurde in dieser Form isotopenmarkiert mit entweder ^99mTc oder ¹⁸⁸Re. Das ausgefällte Peptid konnte auch in seiner ausgefällten Form mit ^99mTc oder ¹⁸⁸Re isotopenmarkiert werden, blieb aber optisch unlöslich. Nach Verdünnung (1:1) mit 20% menschlichem Albuminserum blieb das Peptid sogar bei Kühlung in Lösung.
Beispiel 3 – Zubereitung eines Markierungskit zur gleichzeitigen Reduktion von Disulfid-Bindungen und Metall-Ionen
Ein Somatostatin-Peptid-Kit wurde unter Verwendung des oben beschriebenen RC-160 Somatostatinanalogs entworfen. Die letztendliche Kitrezeptur für Rheniummarkierungskits war wie folgt:

RC-160 200 Mikrogramm

Maltose 1%

Natriumkaliumtartrat 45 mM

Kaliumwasserstoffphthalat 10 mM

Zinntartrat 5 mM

Gesamtes Zinn 1,187 Mikrogramm

pH-Wert 5,0

Füllvolumen 2,0 ml
Für ^99mTc Markierungskits war die Rezeptur die Gleiche, außer dass diese Kits nur 0,5 mM Zinntartrat enthielten.
Die Rezeptur wurde gleich verteilt in 5 ml Serum-Ampullen, die dann sofort in einen Gefriertrockner unter Argon geladen wurden. Die Temperatur des Schrankfaches betrug anfangs zwischen 0° und 5° C und wurde vor dem Beginnen des Gefriertrocknungszyklus für 2 Stunde auf –50°C gesenkt. Die Haupttrocknung fand bei einer Temperatur des Schrankfaches von –40° C für die Dauer von 16 Stunden statt, gefolgt von 4 Stunden bei –10°C, beides bei einem auf 0 mTorr eingestellten Druck in der Kammer und bei auf –55°C eingestellter Kondensierertemperatur. Die sekundäre Trocknung erfolgte für mindestens 8 Stunden bei einer Temperatur des Schrankfaches von 35°C, bei einem auf 0 mTorr eingestellten Druck in der Kammer, mit der gleichen Kondensierertemperatur. Die Trocknungskammer wurde dann verfüllt mit Argon, die Kits wurden verstöpselt und gelagert bei 0–5°C.
BEISPIEL 4 ISOTOPENMARKIERUNG VON SOMATOSTATINPEPTIDKITS FÜR DIE GLEICHZEITIGE REDUKTION VON DISULFID-BINDUNGEN UND METALLIONEN
Die in Ampullen abgefüllten Kits des Beispiels 3, die 1,187 mg an gesamtem Zinn enthielten, wurden sowohl mit ¹⁸⁸Re als auch ¹⁸⁶Re markiert. Um diese mit ¹⁸⁸Re zu markieren, wurde ¹⁸⁸Re Natrium Peffhenat, gewonnen aus einem experimentellen, am Oak Ridge National Laboratory entwickelten 188W/¹⁸⁸Re Generatorsystem (Knapp FF Jr, Mirzahdeh S, Beets AL, Sharkey R, Griffiths G, Juweid M, and Goldenberg DM: Curie-scale tungsten-188/rhenium generators for routine clinical applications, fn: Technetium and Rhenium In Chemistry and Nuclear Medicine, (eds) M Nicolini; G Bandoli; U Mazzi; SG Editoria[i, Padova, Italy, 7995, pp 319–324) verwendet und wurde für die Injektion in das Füllungsvolumen der Ampulle von 2 ml mit Salzlösung verdünnt. Die Ampulle wurde dann für 60 Minuten in ein kochend heißes Bad gestellt, dem folgende es der Untersuchung unterzogen wurde.
Um mit ¹⁸⁶Re zu markieren, wurde in einem Reaktor erzeugtes ¹⁸⁶Re vom Oak Ridge National Laboratory bezogen und der gewünschte Betrag an Millicurie wurde für die Injektion in das Füllungsvolumen der Ampulle von 2 ml mit Salzlösung verdünnt. Die Ampulle wurde dann für 60 Minuten in ein kochend heißes Bad gestellt, dem folgend es einer Untersuchung unterzogen wurde.
Für beide Kits zeigte die Reverse Phase HPLC Analyse einen einzelnen isotopenmarkierten Höchstwert auf dem isotopenmarkierten RC-160 Peptid. Der Prozentsatz an isotopenmarkiertem Kolloid wurde durch sofortige Dünnschichtchromatographie auf Kieselerde-Gel-Streifen, entwickelt in 85% Äthanol und 15% Wasseressigsäure bei einem pH-Wert von 3,5, Kolloid Rf = 0,0, bestimmt und zeigte weniger als 5% Kolloid. Der Prozentsatz an gelöstem Rhenium wurde bestimmt auf Kieselerdegel, entwickelt in 0,15 M NaCl, Rf = 1,0, und zeigte weniger als 1% ungebundenes Rhenium. Das lipophile, isotopenmarkierte RC-160 wandert mit der Vorderseite des Lösungsmittels in Äthanol und Essigsäure und verbleibt am Ursprung in 0,15 M NaCl.
Die Auswirkungen von Cystein auf die markierten Kits wurden untersucht, um die Festigkeit der Bindung zwischen Peptid und Metall durch Ersatz mit Cystein zu bestimmen. Die millimolare Konzentration von Cystein, die notwendig war, um 50% der markierten Aktivität zu ersetzen, betrug 40 mM Cystein für mit Rhenium markiertem RC-160. Markierungskits für Technetium wurden entsprechend dem Verfahren des Beispiels 3, aber mit geringerem Gehalt an Zinn als angegeben, zusammengestellt. Die Markierungskits für Technetium wurden, wie weiter oben beschrieben, unter Verwendung von ^99mTc Natriumpertechnetat markiert. Wenn die Kits Cystein ausgesetzt wurden, wurden nur 5 mM Cystein benötigt um 50% der markierten Aktivität zu ersetzen, wodurch angezeigt wird, dass das die Bindung zwischen Metall und Peptid bei mit Rhenium markiertem RC-160 8 mal so stark ist, wie das mit Technetium markierte RC-160, wenn es Cystein ausgesetzt wird.
BEISPIEL 5 – BIODISTRIBUTION BEI INJEKTIONEN DIREKT IN DEN TUMOR IN TIERMODELLEN
Der rasche Abbau von ¹⁸⁸Re-RC-160 oder ^99mTc-RC-160 (T 1/2 = 2–5 Minuten) aus dem Blut, demonstriert in normalen und heterotransplantierten nackten Mäusen, weist darauf hin, dass nur eine niedrige absolute Aufnahme von isotopenmarkierten Stoffen von einer intravenösen Injektion erwartet werden kann. Unter Verwendung dynamischer Bildaufbereitungsverfahren, gefolgt von seriellen statischen Bildern, wurde das lokalregionale Verhalten von ^99mTc-RC-160 (ein Ersatz für ¹⁸⁸Re-RC-160) untersucht. Direkte Injektion in den Tumor führte zu biologischen Halbwertszeiten von 12–14 Stunden, während Pertechnetat oder Perrhenat ohne Peptid eine biologische Halbwertszeit von 0,5–1 Stunde aufwies. Wenn ^99mTc-RC-160 oder Pertechnetat in normales Gewebe (Muskel) injiziert wurden, betrug die biologische Halbwertszeit entsprechend 0,5 Stunden beziehungsweise 5 Minuten. Injektionen direkt in den Hohlraum, die für lokale Anwendungen verwendet werden könnten, führten zu verschiedenen Zurückbehaltungszeiten. Injektion in den Thoraxraum führte zu einer biologischen Halbwertszeit von 6,4 Stunden. Injektion in den Unterleibshohlraum führte zu einer Halbwertszeit von 3,7 Stunden.
Lokale Verabreichung durch Injektion in den Tumor und Biodistribution in Mäusen ohne Thymusdrüsen mit menschlichen Prostatatumoren. Untersuchungen zur Biodistribution mit ¹⁸⁸Re-RC-160, injiziert sowohl als Mikropartikel, zubereitet gemäß dem Verfahren des Beispiels 2, aber ohne das Hinzufügen eines Alkohols, um das Peptid aufzulösen, wie auch in löslicher Form, zubereitet gemäß dem Verfahren des Beispiels 2, wurden in Mäuse ohne Thymusdrüsen ausgeführt, die Heterotransplantate der Zelllinie PC3 des menschlichen Prostatatumors trugen. PC3 ist eine auf Metastasierung beruhende, androgen unabhängige, schlecht zu differenzierende Zelllinie des Adenokarzinoma der Prostata und auf diese Weise stellt das experimentelle Modell ein fortgeschrittenes menschliches Karzinom dar.
Zwei Stunden nach der Injektion waren fast 30% der injizierten Dosis im Tumor ansässig, wenn ¹⁸⁸Re-RC-160 in Mikropartikelform injiziert wurde, wohingegen mit der löslichen Form etwa 12% im Tumor waren. Der überwiegende Rest der Radioaktivität wurde in den Eingeweiden (Magen, Dünndarm und Dickdarm) gefunden, was mit der bekannten Strecke der Ausscheidung über die Leber konsistent ist. Die Leber wies etwa 4% der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe auf. Nur kleine Mengen an Radioaktivität wurden in jedem anderen Organ gefunden, das geprüft wurde und die Bauchspeicheldrüse und das Gehirn umfasst. Es gab sehr geringe Aufnahme in der Milz oder den Knochen.
Zu einem Zeitpunkt von 6 Stunden nach der Injektion, betrug der Anteil des immer noch im Tumor befindlichen Materials etwa 30% für die Mikropartikelform und 10% für die lösliche Form. Zu einem Zeitpunkt nach 24 Stunden hatte der Betrag im Tumor auf etwa 10% für die Mikropartikel, beziehungsweise auf etwa 4% für das lösliche Material abgenommen.
Biodistribution bei der Negativkontrolle und Referenzzusammensetzungen in Tumor tragenden Mäusen. ¹⁸⁸Re-Perrhenat ([ReO₄]) und ¹⁸⁸Re-Mercaptoacetyl-Triglycin (¹⁸⁸Re-MAG3) wurden verwendet, um die nicht-spezifische Zurückbehaltung im Tumor von ¹⁸⁸Re nach direkter Injektion in den Tumor zu beurteilen. Keine von diesen Verbindungen wurde zu einem wesentlichen Grad vom Tumor einbehalten, nach dem dieser 6 Stunden nach der Injektion ausgewertet wurde. Die Menge an Radioaktivität im Tumor für ¹⁸⁸Re-Perrhenat betrug 0,49% I.D./gm +– 0,27% I.D./gm (S.E., n = 5), wobei die Menge an ¹⁸⁸Re-MAG3 im Tumor 0,05% I.D./gm +– 0,01% I.D./gm (S.E., n = 5) betrug. Im Falle von Perrhenat wurde gefunden, dass nur die Nieren (ausscheidendes Organ) und die Schilddrüse ein wesentliches Maß an Radioaktivität aufwiesen. Im Falle von ¹⁸⁸Re-MAG3, zeugten nur die Bauchspeicheldrüse, die Niere (ausscheidendes Organ) und in einem geringeren Maß die Milz von Aufnahme. Es wurde angenommen, dass der Umfang der Aufnahme in der Bauchspeicheldrüse innerhalb des experimentellen Fehlerbereichs lag. I-131-RC-160 wurde als positive Kontrollreferenzverbindung verwendet und 6 Stunden nach der Injektion wurde ermittelt, dass die Biodistribution im Wesentlichen ähnlich ist zu der, die mit ¹⁸⁸Re-RC-160 wie folgt beobachtet wird: a) signifikante Mengen an Radioaktivität wurden im Tumor gefunden (23,1% I.D./gm ± 10,4% S.E., n = 5); b) der Betrag an Radioaktivität im Blut war niedrig (0,8% I.D./gm ± 0,2%); c) radioaktives Material schien sich durch die Leber zum gastrointestinalen Trakt abzubauen; und d) geringe Radioaktivität wurde gefunden in Organen außer denen im gastrointestinalen Trakt und der Schilddrüse.
In vivo Konkurrenz von Somatostatinanalogen. Es wurden Versuche durchgeführt um zu bestimmen, ob ¹⁸⁸Re-RC-160 ersetzt werden konnte durch unmarkierte Somatostatinanaloge. Tieren wurde gleichzeitig eine zu verfolgende Menge an ¹⁸⁸Re-RC-160 und entweder unmarkiertes Octreotid oder unmarkiertes RC-160 injiziert. Das unmarkierte Material befand sich in signifikantem Überschuss zu den verabreichten Mengen an ¹⁸⁸Re-RC-160 und das unmarkierte Material wurde sowohl durch intraperitoneale, wie auch Injektion direkt in den Tumor verabreicht. Die Pegel der nach 6 Stunden nach der Injektion in den Tumoren gefundenen Radioaktivität waren vermindert, verglichen mit dem bei der Injektion von ¹⁸⁸Re-RC-160 allein erhaltenen Pegel, und zwar um etwa 80% für Octreotid und 70% für RC-160. Die durchschnittliche injizierte Dosis/Gramm in Prozent für Tumorgewebe betrug über 10% bei ¹⁸⁸Re-RC-160 alleine und war 1,9% +– 0,5% für ¹⁸⁸Re-RG-160, verabreicht zusammen mit Octreotid und 3,0% +– 0,8% für ¹⁸⁸Re-RC-160, verabreicht zusammen mit unmarkiertem RC-160 (S.E., n = 5). Das allgemeine Muster der Biodistribution war bei allen Behandlungen ähnlich, außer der in den Tumoren zurückbehaltenen Menge, mit offensichtlichem Abbau durch den gastrointestinalen Trakt und geringer wenn überhaupt vorhandener Ansammlung in anderen Organen. Daher scheinen sowohl unmarkiertes Octreotid wie auch unmarkiertes RCe-160 in vivo um dieselben Rezeptorbindungsstellen zu konkurrieren, was die rezeptorbasierte Bindung von ¹⁸⁸Re-RC-160 veranschaulicht.
BEISPIEL 6 – VERGLEICHENDE BIODISTRIBUTION VON SOMATOSTATINANALOGEN RC-160 UND OCTREOTIDEN MARKIERT MIT ^99mTc, ¹⁸⁸Re, UND ¹³¹I
Die Somatostatin-Peptid-Analoge Octreotid und RC-160 wurden in normalen Tieren nach direkter Markierung mit ^99mTc und ¹⁸⁸Re ausgewertet und verglichen mit denselben, mit ¹³¹I isotopenmarkierten Peptiden. Die Octreotid und RC-160 Markierungskits wurden vorbereitet und isotopenmarkiert gemäß dem Verfahren des Beispiels 2. Die Isotopeniodisationen wurden durchgeführt unter Verwendung von Chloramin T, durch Mischen von 10 μg Peptid in 70 μl PBS mit 10 μg Chloramin T in 20 μl PBS und 10 μl der ¹³¹I oder ¹²⁵I Lösung. Das iodinierte Peptid wurde in eine C₁₈ Minisäule eingebracht und das ungebundene Jod wurde durch Eludieren mit Wasser entfernt. Das iodinierte Peptid wurde eludiert mit Methanol und unter Vakuum getrocknet mit einem Rotationsverdunster. Das getrocknete Material wurde in Wasser aufgelöst, das 30% Äthanol für RC-160 oder mit Phosphat gepufferte Salzlösung für Octreotid enthielt. Für in vivo Anwendung wurde das isotopenmarkierte Peptid 1:1 verdünnt mit vorgefiltertem 20%-igem menschlichem Albuminserum. Diese Lösung des Peptids in Albumin zeigte keine Zeichen von Ausfällung, sogar bei Kühlung und Lagerung über Nacht bei 4° C.
Untersuchungen mit dynamischer Bilddarstellung. Untersuchungen mit dynamischer Bilddarstellung wurden in erwachsenen, männlichen Wistar Ratten durchgeführt. Die Tiere wurden unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von typischerweise 0,6 ml Ketamin/Rompun (1,4:0,2; v:v) betäubt. Für die Untersuchungen mit ^99mTc und ¹⁸⁸Re, wurden die Tiere in einer auf dem Rücken liegende Position vor dem Kopf einer planaren, hoch auflösenden Mittelenergie-Gammakamera platziert. Für die Untersuchungen mit ¹³¹I wurden die Tiere in einer auf dem Rücken liegende Position vor dem Kopf einer planaren Hochenergie-Gammakamera platziert. Den Tieren wurde 0,1–0,2 ml Testmaterial in die Schwanzvene injiziert. Bilder wurden die ersten 2 Minuten im Abstand 30 Sekunden aufgenommen und danach in Intervallen von 2 Minuten für die Dauer von 30 Minuten. In einigen Fällen wurden statische Abbildungen (10 min Belichtungszeit) für Perioden bis zu 2 Stunden nach der Injektion ausgeführt. Region of Interst (RIO) Verfahren wurden verwendet, um das Maß an Radioaktivität im ganzen Tier und in ausgewählten Organen über die Zeit zu beurteilen. Das Studium dynamischer Abbildungen von ^99mTc-RC-160 in einer erwachsenen männlichen Ratte offenbarten einen raschen Abbau zur Leber und nach 10 Minuten eine Aufnahme im Magen. Kein anderes Organ schien an einer Aufnahme oder einem Abbau beteiligt zu sein. Eine Aufnahme in der Schilddrüse wurde nicht beobachtet, noch wurde mehr als eine geringfügige Aufnahme in den Nieren und der Blase beobachtet. Das Sezieren der Tiere nach der Untersuchung bestätigte die Aufnahme im Magen. Die Mehrheit der Aktivität ergab sich in den Mageninhalten. Das meiste an Aktivität in den Magengeweben wurde im hinteren Teil des Magens gefunden. Die Region of Interest Auswertung des für Blutanhäufungen typischen Herzens/der Lunge zeigte einen zweiphasigen Abbau im Blut. Zu einem Zeitpunkt von 30 Minuten nach der Injektion war der Abbau im Blut eindeutig im zweiten Teil des Kurvenverlaufs des Abbaus. Dies stand im Gegensatz zum Abbau des ^99mTc Octreotids, welcher in erster Linie in Richtung von Leber/Darm wirkte, aber auch in Richtung Niere/Blase voranschritt.
Die dynamische Bilddarstellung von ¹³¹I-RC-160 zeigte auch einen raschen Abbau in die Leber und dann einen Abbau zum Magen. Das allgemeine Muster des Abbaus war im Grunde genommen identisch mit dem, das für ^99mTc-RC-160 beobachtet wurde. Die dynamische Bilddarstellung von ¹⁸⁸Re-RC-160 zeigte einen raschen Abbau in die Leber, im Gegensatz zu dem mit ^99mTc und dem mit ¹³¹I markierten RC-160, wurde es jedoch in den Darm abgebaut. Eine Wiederholung der Bilddarstellung nach 24 Stunden zeigte sehr geringe Restaktivität und keine Anhäufung in Knochen oder anderem Gewebe. Nach 30 Minuten war das meiste der Radioaktivität aus dem Blut und der Leber abgebaut und konnte im Dünndarm gefunden werden. Dieses allgemeine Muster des Abbaus war im Wesentlichen identisch zu dem mit ¹⁸⁸Re-Octreotid, welches sich auch in die Leber abbaute.
Untersuchungen zur Biodistribution in Mäusen. Untersuchungen zur Biodistribution wurden in erwachsenen, weiblichen NMRI Mäusen (etwa 25g) zu ausgewählten Zeiten (15 und 120 Minuten) nach der Injektion in die Schwanzvene ausgeführt. Jede experimentelle Gruppe wurde aus mindestens fünf Tieren zusammengesetzt, wobei jedes Tier 0,2 ml erhielt, die etwa 4 μCi enthielten. Die Tiere wurden durch eine Überdosis Äther getötet und ausgewählte Organe wurden seziert, gewogen und die zugehörige Radioaktivität wurde bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung eines spezifisch für ^99mTc markierte Zubereitungen entworfenen Computerprogramms analysiert. Die prozentuale Dosis je Organ für Blut, Knochen und Muskel wurde berechnet unter der Annahme von jeweils 7%, 8,2% und 40% des gesamten Körpergewichts für die genannten Gewebe. In einigen der Untersuchungen wurden die Ergebnisse auf ein gesamtes Körpergewicht von 30 g genormt. Die durch die dynamische Bilddarstellung erhaltenen, allgemeinen Beobachtungen wurden verwendet, um Zeitpunkte für vergleichende Untersuchungen zur Biodistribution zu wählen. Die Biodistributionen der verschiedenen isotopenmarkierten Peptidzubereitungen wurden in normalen Mäusen zu einem Zeitpunkt von 15 Minuten und 120 Minuten nach der Injektion ausgewertet. Die Ergebnisse wurden durch dynamische Bilddarstellungsverfahren in normalen Ratten erhärtet. ^99mTc-RC-160 wurde rasch vom Blut in die Leber abgebaut und nachfolgend in die Därme. Kein anderes Organ schien bedeutsam an der Aufnahme oder dem Abbau beteiligt zu sein, mit Ausnahme des Magens. Dies stand im Gegensatz zu dem Abbau von ^99mTc-Octreotid, welches in die Leber und anschließend in die Därme abgebaut wurde, aber auch in die Nieren abgebaut wurde. ^99mTC-RC-160 wurde schneller aus dem Blut angebaut als ^99mTC-Octrotid. Die Biodistributionen von ¹⁸⁸Re-Octreotid und ¹⁸⁸Re-RC-160 waren einander sehr viel ähnlicher als denjenigen von ihren mit ^99mTc mar kierten Gegenstücken, die einen signifikanten Abbau in die Leber und anschließend zu den Därmen und eine niedriger Ansammlung in den Nieren aufwiesen. Die Aufnahme von ¹⁸⁸Re-Octreotid in die Nieren war signifikant höher als die von ¹⁸⁸Re-RC-160. Beide mit ¹⁸⁸Re markierten Analoge zeigten ein höheres Maß an dem Blut zugeordneter Radioaktivität bei sowohl 15 Minuten als auch 120 Minuten nach der Injektion (im Vergleich zu den ^99mTc-Analogen), obwohl ¹⁸⁸Re-RC-160 langsamer abgebaut wurde als ¹⁸⁸Re-Octreotid.
BEISPIEL 7 – INTRATHORAX STRAHLENTHERAPIE VON MENSCHLICHEN KARZINOMEN DER KLEINEN LUNGENZELLEN IN NACKTEN MÄUSEN MIT ¹⁸⁸Re-RC-160
Die therapeutische Wirksamkeit von ¹⁸⁸Re-RC-160 in experimentellen Modellen mit menschlichen Karzinomen der kleinen Lungenzellen, die die klinische Darstellung nachahmen, wurde untersucht. Im experimentellen Modell wurden Zellen von der Zelllinie NCI-H69 des menschlichen Karzinoms der kleinen Lungenzellen in den Hohlraum der Brust von Mäusen und Ratten ohne Thymusdrüsen geimpft. Anschließend wurde die Biodistribution von ¹⁸⁸Re-RC-160 überwacht wie auch die Wirkung auf das anschließende Wachstum von Tumoren. Die Zelllinie NCI-H69 wurde von einem menschlichen Karzinom der kleinen Lungenzellen abgeleitet und wurde in Übereinstimmung mit experimentellen, therapeutischen Radiopharmaka verwendet. In nackten Mäusen zeigen NCI-H69 Tumore verminderte Tumorvolumina, wenn sie intraläsional mit unmarkierten Somatostatinanalogen behandelt werden, einschließend RC-160 (Pinski J, Schally AV, Halmos G, Szepenazi K, Groot K, O'Byme K, Cai RZ: Effects of somatostatin analogue RC-1 60 and bambesinlgastrin-releasing peptide antagonists on the growth of human small-cell and non-small-cell lung carcinomas in nude mice, BrJ Cancer 70: 886–892, 1994). Die Zelllinie erzeugt Tumoren, wenn sie subkutan implantiert wird oder in den Brusthohlraum oder das Lungenparenchym eingebracht wird.
Markierung von Peptiden. RC-160 wurde durch klassische Synthese synthetisiert und von DeBiopharm S.A. (Lausanne, Schweiz) geliefert, zubereitet in RC-160 Isotopenmarkierungskits in bernsteinfarbenen Ampullen der Kapazität 6 ml und enthielten ein letztendliches Volumen von 2,0 ml. Jedes Kit enthielt 500 μg Peptid in Tartrat/Phthalat Puffer, PH-Wert 5,2, und enthielt zusammen mit Hilfsmitteln Zinntartrat, um das Perrhenat zu reduzieren. Alle Kits wurden zubereitet unter Verwendung von durch Stickstoff gereinigten Lösungen und das Gas im oberen Teil wurde ebenso mit Stickstoffgas gereinigt. Die Ampullen wurden eingefroren bei –30°C gelagert. Für die Markierung wurden 2,0 ml ¹⁸⁸Re-Perrhenatlösung (15–20 mCi) hinzugefügt (letztendliches markiertes Volumen 4 ml), und die Ampullen wurden unter periodischem Mischen für 30 Minuten bei 80°C–90°C erhitzt. Am Ende der Inkubationsperiode wurde der Lösung ermöglicht leicht abzukühlen, und eine radioaktive Probe wurde zur radiochemischen Analyse entnommen. Vor der Verwendung in Tieren wurden Teilproben 1:1 gemischt mit 20%-igem menschlichem Albuminserum (klinische Güteklasse).
Untersuchungen der Biodistribution. Die Untersuchungen der Biodistribution wurden zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion in den Hohlraum des Thorax von erwachsenen, weiblichen nu/nu Mäusen ausgeführt. Jede experimentelle Gruppe wurde aus mindestens fünf Tieren zusammengesetzt, wobei jedes Tier 0,1 ml verabreicht bekam, die etwa 4 μCi enthielten. Die Tiere wurden durch eine Überdosis Äther getötet und ausgewählte Organe wurden seziert, gewogen und die zugehörige Radioaktivität wurde bestimmt. Die Daten wurden berechnet als Prozentsatz der Dosis pro Gramm Gewebe, obwohl in einigen Fällen die Daten auch berechnet wurden als Prozentsatz der Dosis pro Organ. Nach 4 Stunden wurden signifikante Ansammlungen von Radioaktivität in den Lungen, dem Herzen, den Därmen und der Brustwand gefunden. Durch eine 1 ml Spülung des Brusthohlraums (vor dem Entfernen der Organe) wurden fast 5% der gesamten injizierten Dosis zurück gewonnen. Geringere Mengen an Radioaktivität waren der Leber und den Nieren zugeordnet. Nach 24 Stunden enthielt die Lunge den höchsten Prozentsatz der injizierten Dosis/Gramm, obwohl signifikante Ansammlungen in der Brustwand, dem Herzen und in einer Spülung des Brusthohlraums gefunden wurden. Ein Vergleich wurde durchgeführt mit der Menge an ¹⁸⁸Re-RC-160, die dem Brusthohlraum in Tieren zugeordnet war, die mit NCI-H69 Zellen geimpft worden waren, verglichen mit derjenigen Menge, die in Tieren gefunden wurde, die keine Tumorzellen erhielten. Die tumorösen Tiere wiesen besonders nach 24 Stunden eine merklich höhere Zurückbehaltung auf.
Die Auswirkungen auf Tumore. In diesen Untersuchungen wurden Tiere mit 5–7,5 × 10⁶ NCI-H69 Zellen in 0,1 ml serenfreiem RPMI Mittel geimpft. Die Zellen wurden durch Injektion mit einer Nadel vom Kaliber 26 in einer Position ventral und auf der Mittellinie über der Leber unter dem Rippenkäfig eingebracht. Die Testmaterialien (RC-160 und ¹⁸⁸RC-160) wurden auf gleiche Weise mit einer Nadel vom Kaliber 26 in den Hohlraum des Thorax in einer Position ventral und auf der Mittellinie über der Leber unter dem Rippenkäfig eingebracht. Jede Injektion enthielt etwa 5 μg Peptid in einem Volumen von 0,1 ml und einer radioaktiven Dosis (wenn angewendet) von 200 μCi. In einer initialen Untersuchung wurden die Tiere: a) 1 Tag und 5 Tage mit Dosen von 200 μCi von ¹⁸⁸Re-RC-160 behandelt, oder b) erhielten keine Behandlung. Nach 28 Tagen wurden die Tiere eingeschläfert und der Brusthohlraum wurde untersucht. In der Gruppe, die mit ¹⁸⁸Re-RC-160 behandelt worden war, wurden in 8/10 Tieren keine Nachweise von Tumoren gefunden, während 2/10 Tiere eine minimale Erkrankung aufwiesen. In der Gruppe, die keine Behandlung erfuhr, zeigten 7/7 lokale Erkrankungen, die auf den Brusthohlraum eingeschränkt waren. In allen Fällen waren die sichtbaren Tumorbelastungen niedrig. Es wurden keine Veränderungen in der allgemeinen Lungenmorphologie beobachtet in "normalen" Tieren, denen ähnliche Dosierungen von ¹⁸⁸Re-RC-160 verabreicht wurden.
In einer zweiten Untersuchung wurden die Tiere: a) behandelte mit ¹⁸⁸Re-RC-160 an den Tagen 14, 17 und 25, b) behandelte allein mit RC-160 (an denselben Tagen und mit derselben Menge an Peptid), oder c) wurden keiner Behandlung unterzogen. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
Mit RC-160 und ¹⁸⁸Re-RC-160 behandelte Tiere zeigten einen anfänglichen Verlust an Gewicht als Folge der Behandlungen. Dieser Verlust an Gewicht scheint mit der Zeit zurück zu gehen.
In der mit ¹⁸⁸Re-Rc-160 behandelten Tiergruppe wurden in 5/5 Tieren keine Nachweise von Tumoren oder minimale Tumorbelastungen zum Zeitpunkt von 48 Tagen nach der anfänglichen Impfung mit Tumorzellen gefunden. Andererseits wiesen 3/3 der nur mit RC-160 behandelten Tiere Tumoren auf und 5/5 der Tiere, die keine Behandlung erhielten, wiesen Tumoren auf. In diesen Untersuchungen wurde eine Antitumorreaktion beobachtet bei der Verwendung von in den Hohlraum des Thorax verabreichtem ¹⁸⁸Re-RC-160. Der Vergleich mit Ergebnissen bei der Verwendung von RC-160 demonstriert, dass die therapeutische Reaktion auf Grund des ¹⁸⁸Re-RC-160 erfolgt und nicht auf Grund des Peptids allein. Der vorübergehende Gewichtsverlust war der einzige sichtbare Nachweis der Behandlung.
BEISPIEL 8 – LANGFRISTIGE VERSUCHE ZUR THERAPIE IN TIEREN MIT DURCH RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTID
Eine Reihe von Versuchen wurde geführt, in denen ¹⁸⁸Re-RC-160, zubereitet gemäß dem Verfahren des Beispiels 3 und markiert gemäß dem Verfahren des Beispiels 4, verglichen wurde mit einer Vielfalt vom Zubereitungen, und es wurden auch Überlebensstudien bei nackten Mäusen mit implantierten menschlichen Tumorheterotransplantaten durchgeführt. Für diese Untersuchungen wurden PC-3 Tumoren in Mäusen ohne Thymusdrüsen verwendet, wobei die Behandlung ausgelöst wurde, wenn die Tumoren ein Volumen von 0,1 bis 0,2 cm³ aufwiesen.
Anfangsstudie. Die Anfangsstudie untersuchte die Behandlung von nackten Mäusen, denen menschliche PC-3 Prostatatumoren mit ¹⁸⁸Re-RC-160 implantiert wurden. 19 Tage nach dem die Tumorzellen implantiert wurden, wurde mit der Behandlung begonnen. Drei Gruppen von Tieren mit jeweils 10 Tieren wurden untersucht: 1) ¹⁸⁸Re-RC-160 mit 200 μCi in 0,2 ml in den Tumor injiziert am Fr, Mo, Mi, Fr, Mo, Mi, Fr (7 Dosen); 2) Scheininjektion, die das gleiche Volumen und die gleiche Zusammensetzung enthielte, aber ohne ¹⁸⁸Re-RC-160; und 3) Vergleichsgruppe, die keine Injektion erhielt. Die Tumoren wurden 3-mal pro Woche über einen Zeitraum von 65 Tagen gemessen und dann danach einmal in der Woche, und die Tiere wurden einmal in der Woche gewogen. Die Überlebensrate wurde bis Tag 109 aufgezeichnet, an dem der Versuch beendet wurde. Zu dieser Zeit waren alle scheinbehandelten Tiere tot.
Die Wachstumskurven sind in 1 dargestellt. In der behandelten Gruppe hörten alle Tumoren auf zu wachsen und verkleinerten sich auf die Größe die sie aufwiesen, bevor mit Behandlung begonnen wurde. Weil den Tumorzellen gleichzeitig auch Matrigel injiziert wurde, verblieb ein restlicher faseriger Block, selbst wenn der Tumor tot war. Im Gegensatz dazu wachsen alle Tiere sowohl in der vorgetäuscht behandelten Gruppe als auch der negativen Vergleichsgruppe weiter. Die scheinbehandelten Tiere wiesen die größten Tumorgrößen auf. In einigen der behandelten Tiere begannen die Tumoren etwa 10 Tage nach der Behandlung wieder zu wachsen. Im Zeitraum von 20 Tagen nach der Behandlung waren die wieder wachsenden Tumoren offensichtlich größer und in ihrem Erscheinungsbild unterschiedlich. Die wachsenden Tumoren waren verfärbt, vaskularisiert und dehnten die Haut. Die toten oder ruhenden Tumoren waren weiß, gefäßarm und zeigten über die Zeit keine Änderung in ihrem Erscheinungsbild. Offensichtlich tote oder ruhende Tumoren, die nicht begannen, innerhalb von zehn Tagen wieder zu wachsen, blieben bis zum Ende des Versuchs unverändert.
In der behandelten Gruppe wurden 3 Tiere (30%) geheilt, definiert als kein erkennbares Tumorwachstum zu einem Zeitpunkt zwei Monate nach dem Ende der Behandlung. 3 andere Tiere in der Behandlungsgruppe zeigten erneutes Wachstum ihrer Tumoren, das etwa 10 Tage nach der Behandlung begann. Zum Zeitpunkt der Beendigung des Versuchs waren alle der scheininjizierten Tiere gestorben. In den meisten Fällen waren die Tumoren in ihrer Gesamtheit so groß wie der Rest des Körpers des Tiers. Einige Tiere unterlagen auch einer Metastasen bildenden Erkrankung. Drei der nicht behandelten Tiere blieben am Leben, zwei mit sehr sperrigen Tumoren, die darauf hinwiesen, dass sie bald sterben würden, und eins mit einem kleineren Tumor, der langsamer wuchs. Sechs Tiere in der behandelten Gruppe waren am Leben, drei mit wachsenden Tumoren und drei ohne erneut wachsende Tumoren. Siehe dazu 2.
3 zeigt die durchschnittlichen Körpergewichte der drei Gruppen von Tieren. Die behandelten Tiere verloren im Durchschnitt etwa 6 Gramm Körpergewicht oder etwa 20% ihres Körpergewichts. Sie stellten ihre ursprünglichen Körpergewichte innerhalb etwa 2 Wochen nach der Behandlung wieder her. Dieser Gewichtsverlust ging einher mit einer Abnahme im Nahrungsverbrauch während der Behandlungszeit. Am Ende des Versuchs war die überlebende Behandlungsgruppe im Durchschnitt etwa 120 schwerer als die unbehandelten Überlebenden. Gewichtsverlust und Appetitverlust waren die einzigen beobachteten ungünstigen Auswirkungen, außer dass ein Tier in der Behandlungsgruppe einiges an Verdickung um die Peripherie des Tumors herum zeigte und ein anderes Tier in der Behandlungsgruppe eine Strahlungsverbrennung der Haut zeigte. Beide von diesen Tieren wiesen Tumoren auf, die nicht wieder zu wachsen begannen und waren am Ende des Versuchs gesund. Die Behandlung von nackten Mäusen mit wachsenden Implantaten von menschlichem Prostatatumor, PC-3, war erfolgreich mit einer Serie von 7 Injektionen aus jeweils ¹⁸⁸Re-RC-160 mit 200 μCi. Alle Tiere wiesen Zurückentwicklung der Tumoren auf, was eine therapeutische Reaktionsrate von 100 % erbrachte. Ein erneutes Wachsen von Tumoren trat in 7 der behandelten Tiere, beginnend etwa 10 Tage nach der Behandlung auf. 30% verblieben für einen Zeitraum von zwei Monate nach der Therapie tumorfrei.
Vergleichende Untersuchung. Da es in 70% der Tiere, die eine Serie von 7 Behandlungen mit 200 μCi an jedem zweiten Tag erhielten, beobachtet wurde, dass erneutes Wachstum auf die Tumorzurückentwicklung folgte, wurde ein modifizierter Behandlungsplan übernommen. In diesem Plan wurde eine Behandlungsplanung verwendet, in welcher eine Serie von Dosen über 5 aufeinander folgende Tage verabreicht wurde, denen eine Wartezeit von zwei Wochen folgte und dann eine zweite Serie von Dosen über 5 Tage. In diesem Versuch wurden nackte Mäuse mit PC-3 Tumorimplantaten mit ¹⁸⁸Re-RC-160 behandelt, im Vergleich zur Behandlung mit RC-160 und ¹⁸⁸Re-IKVAV (SEQ. ID NO. 1), einem Peptid, das sich auch an Prostatakarzinome bindet, behandelten Tieren und einer Kontrollgruppe ohne Injektionen. PC-3 Tumoren wurden in eine Serie von 40 nackten Mäusen implantiert und dies ergab vier Gruppen aus zehn Tieren. Nachdem die Tumoren gut genug etabliert waren um die Behandlung zu beginnen, wurden die Tiere für eine Woche täglich behandelt. Nach einer zwei Wochen dauernden Erholungsperiode, wurde die Hälfte der Tiere in jeder der vorherigen 4 Gruppen wieder täglich behandelt, wie untenstehend gezeigt.
Behandlungsentwurf
Bei Verwenden dieses Protokolls wurden Tumoren wirksamer behandelt, als im vorherigen Versuch, da die Heilungsrate von 30% auf 80% stieg in der Gruppe, die zwei aufeinander folgende Behandlungen erhielt. Jedoch zeigte die Gruppe, die nur die zweite Behandlung erhielt, auch eine Heilungsrate von 80%. Die Behandlung mit RC-160 alleine ergab keine Heilung, genauso wie die Behandlung mit ¹⁸⁸Re-IKVAV (SEQ. ID NO. 1), was darauf hinweist, dass es die Verbindung des RC-160 mit dem ¹⁸⁸Re ist, welche die biologische Wirkung erbringt.
Behandlungsergebnisse
Das Tumorwachstum wurde durch die erste Behandlung signifikant reduziert. Obwohl die Differenz nicht statistisch bedeutsam war, war es überraschend zu beobachten, dass die RC-160 Tumoren scheinbar schneller wuchsen als die in der Kontrollgruppe. Die Beobachtung war, dass RC-160, während es verabreicht wird, das Tumorwachstum verlangsamt oder den Tumor zurückentwickelt. Wenn aber diese Tumoren beginnen wieder zu wachsen, scheinen sie schneller zu wachsen als die in der Kontrollgruppe, wie untenstehend gezeigt: Tumorgröße zwei Wochen nach der ersten Behandlung
Um die Behandlungswirkungen besser zu verstehen wurden individuelle Tumorwachstumskurven analysiert. Ohne Behandlung nahm die Tumorgröße weiter zu. Nach etwa 25 Tagen begannen die Tumoren von drei Tieren mit beschleunigten Raten zu wachsen, während andere fortfuhren, mit etwa derselben Rate zu wachsen. Die Tiere verlieren während der Behandlung Gewicht. Es wurde beobachtet, dass sie während dieser Zeit nicht viel essen. Ihre Gewichte kehren nach der Behandlung auf den Normalzustand zurück und dann fahren die Tiere fort zu wachsen. In Kontrollgruppen werden die Messungen des Gewichts der Tiere irreführend, da die Tumoren groß werden. In einigen Fällen verlieren die Tiere offensichtlich Gewicht, da ihre Tumoren so groß werden, wie sie selbst sind. Die gemessenen Körpergewichte sind die Summe aus dem wachsenden Tumor und dem schrumpfenden Körper. Das Phänomen des beschleunigten Tumorwachstums, beginnend etwa drei Wochen nach dem Beginn des Versuchs, wurde auch in einigen der nur mit RC-160 behandelten Tiere beobachtet. Dies wurde auch in einigen Tieren beobachtet, die das ¹⁸⁸Re-IKVAV (SEQ. ID NO. 1) erhielten, war aber um 1 bis 3 Wochen verzögert.
Das ¹⁸⁸Re-RC-160 verursachte während der Behandlung einen Verlust an Körpergewicht, das über die folgenden 3 Wochen wiederhergestellt wurde. Siehe dazu 4 und 5. Wenn die Tiere ein zweites Mal behandelt wurden, war der Rückgang des Körpergewichts dramatischer. Jedoch verläuft die Erholung rasch, innerhalb von etwa 2 Wochen. Eine Behandlung mit ¹⁸⁸Re-IKVAV (SEQ. ID NO. 1) verursachte auch einen Rückgang des Gewichts während der Behandlung.
¹⁸⁸Re-RC-160 ist hoch wirkungsvoll beim Reduzieren von Tumoren in Tieren, die direkte Injektion des Materials in ihre Tumoren erhalten. In allen Fällen haben sich die Tumoren von mit ¹⁸⁸Re-RC-160 behandelten Tieren in der Größe vermindert und 80% wuchsen nicht erneut, wenn zwei aufeinander folgende Behandlungen durchgeführt wurden. Diese Tiere wurden offensichtlich von ihren Karzinomen geheilt, ¹⁸⁸Re-RC-160 war sowohl wirkungsvoller als RC-160 alleine wie auch ¹⁸⁸Re verbunden mit einem anderen Peptid.
Verfahren mit drei Behandlungen. Ein zusätzlicher Versuch wurde geführt, wobei zwei Gruppen von je zwölf Mäusen mit implantierten PC-3 Tumorheterotransplantaten verglichen wurden. Eine Gruppe erhielt keine Behandlung und diente als Kontrollgruppe. Die andere Gruppe erhielt ¹⁸⁸Re-RC-160, verabreicht als Injektion direkt in den Tumor mit drei Behandlungsserien; die erste Behandlung erstreckte sich über fünf aufeinander folgende Tage, denen 17 Tage ohne Behandlung folgten, eine zweite Serie von Behandlungen erstreckte sich über die Dauer von drei aufeinander folgenden Tage, gefolgt von 31 Tage ohne Behandlung und der Abschluss mit einer dritten Serie von Behandlungen erstreckte sich über die Dauer von drei aufeinander folgenden Tagen. 7 zeigt das Tumorwachstum; die Tiere, die keine Behandlung erhielten, zeigten beständiges Tumorwachstum, während die behandelten Tiere eine auf die Behandlung folgende Zurückentwicklung in Tumorvolumen zeigten. Wie in 6 dargestellt, überlebten alle Tiere, die ¹⁸⁸Re-RC-160 erhielten über die 120 Tage nach Aufnahme der Untersuchung. Zu diesem Zeitpunkt waren alle außer einem Tier in der keine Behandlung erfahrenden Gruppe gestorben. ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re im Vergleich. In einer weiteren Untersuchung wurde die Verwendung von RC-160, markiert mit von einem Reaktor erzeugten 186Re verglichen mit dem, markiert durch in einem Generator erzeugten ¹⁸⁸Re. Alle Tiere hatte PC-3 Tumorheterotransplantate wie oben beschrieben und wurden mit gleichen μCi Beträgen von entweder ¹⁸⁸Re-RC-160 oder ¹⁸⁶Re-RC-160 behandelt, wobei Tiere, die keine Behandlung erhielten, als Kontrollgruppe dienten. Tumorrückentwicklung wurde beobachtet sowohl mit ¹⁸⁸Re-RC-160 wie auch mit ¹⁸⁶Re-RC-160.
BEISPIEL 9 – THERAPIE VON MENSCHLICHEM GLIOBLASTOMA MULTIFORME DURCH LOKALE VERABREICHUNG DES MIT RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTIDS
Entweder Octreotid, RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog oder andere Somatostatin-Peptid-Analoge werden entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert gemäß der Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4. Patienten mit Glioblastoma multiforme bekommen das mit Rhenium markierte Somatostatin-Peptid direkt in den Tumorstandort injiziert unter Verwendung von Ultraschall, CT Scanning oder anderen Bildaufbereitungsmodalitäten, um das Karzinom innerhalb des Gehirns zu lokalisieren. Wiederholte Dosen werden wie notwendig verabreicht. Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und anderer Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder durch ähnliche Mittel bestimmt werden und machen Gebrauch von der Gammastrahlung von ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re. Wahlweise kann vor Verabreichung der mit Rhenium markierten therapeutischen Dosis die Wirksamkeit der Therapie vorhergesagt werden durch Verabreichung einer Dosis zur Bildgewinnung, die entweder eine Markierung aus Indium oder aus Technetium umfasst, um zu bestimmen, ob ausreichend Somatostatinrezeptoren auf dem Tumor vorliegend sind. Solch eine Dosis zur Bildgewinnung kann dasselbe Somatostatin-Peptid-Analog wie für Therapie aufweisen oder es kann ein anderes Analog sein, von dem nachgewiesen wurde, dass es sich an dieselben Somatostatinrezeptoren bindet. Für mit ^99mTc markierte Peptide können solche mit den Verfahren gemäß den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 markiert werden. Alternativ dazu können handelsübliche Produkte wie ¹¹¹In-DTPA-Octrectid angewendet werden.
BEISPIEL 10 THERAPIE VON MENSCHLICHEM PROSTATAKARZINOM DURCH LOKALE VERABREICHUNG DES MIT RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTIDS
Entweder Octreotid, RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog oder andere Somatostatin-Peptid-Analoge werden entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert gemäß der Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4. Patienten mit lokalisiertem Prostatakarzinom erhalten mit Rhenium markiertes Somatostatin-Peptid direkt in den Ort des Tumors injiziert, wobei wahlweise Ultraschall, CT Scanning oder andere Bildaufbereitungsmodalitäten verwendet werden, um das Karzinom innerhalb der Prostata zu lokalisieren. Wieder das Karzinom innerhalb der Prostata zu lokalisieren. Wiederholte Dosen werden wie benötigt verabreicht. Die Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und anderer Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder durch ähnliche Mittel bestimmt werden und machen Gebrauch von der Gammastrahlung von ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re. Als Alternative können solche Mittel lokal innerhalb der Prostatabinde injiziert werden, entweder als eine prophylaktische Maßnahme oder als Reaktion auf einen Nachweis wiederkehrender Erkrankung, wie zum Beispiel einer Zunahme in dem Prostata spezifischen Antigen (PSA). Wahlweise kann vor Verabreichung der mit Rhenium markierten therapeutischen Dosis die Wirksamkeit der Therapie vorhergesagt werden durch Verabreichung einer Dosis zur Bildgewinnung, die entweder eine Markierung aus Indium oder aus Technetium umfasst, um zu bestimmen, ob ausreichend Somatostatinrezeptoren auf dem Tumor vorliegend sind. Solch eine Dosis zur Bildgewinnung kann dasselbe Somatostatin-Peptid-Analog wie für die Therapie aufweisen oder es kann ein anderes Analog sein, von dem nachgewiesen wurde, dass es sich an dieselben Somatostatinrezeptoren bindet. Für mit ^99mTc markierte Peptide können solche mit den Verfahren gemäß den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 markiert werden. Alternativ dazu können handelsübliche Produkte wie ¹¹¹In-DTPA-Octrectid angewendet werden.
BEISPIEL 11 – THERAPIE VON MENSCHLICHEM BAUCHSPEICHELDRÜSENKARZINOM DURCH LOKALE VERABREICHUNG VON MIT RHENIUM MARKIERTEM SOMATOSTATIN-PEPTID
Entweder Octreotid, RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog oder andere Somatostatin-Peptid-Analoge werden entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert gemäß den Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4 markiert. Patienten mit lokalisiertem Bauchspeicheldrüsenkarzinom erhalten mit Rhenium markiertes Somatostatin-Peptid direkt in den Ort des Tumors injiziert, wobei wahlweise Ultraschall, CT Scanning oder andere Bildaufbereitungsmodalitäten verwendet werden, um das Karzinom innerhalb der Bauchspeicheldrüse zu lokalisieren. Wiederholte Dosen werden wie benötigt verabreicht. Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und anderer Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder durch ähnliche Mittel bestimmt werden und machen Gebrauch von der Gammastrahlung von ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re. Wahlweise kann vor Verabreichung der mit Rhenium markierten therapeutischen Dosis die Wirksamkeit der Therapie vorhergesagt werden durch Verabreichung einer Dosis zur Bildgewinnung, die entweder eine Markierung aus Indium oder aus Technetium umfasst, um zu bestimmen, ob ausreichend Somatostatinrezeptoren auf dem Tumor vorliegend sind. Solch eine Dosis zur Bildgewinnung kann dasselbe Somatostatin-Peptid-Analog wie für Therapie aufweisen oder es kann ein anderes Analog sein, von dem nachgewiesen wurde, dass es sich an dieselben Somatostatinrezeptoren bindet. Für mit ^99mTc markierte Peptide können solche mit den Verfahren gemäß den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 markiert werden. Alternativ dazu können handelsübliche Produkte wie ¹¹¹In-DTPA-Octrectid angewendet werden.
BEISPIEL 12 – THERAPIE VON KARZINOMEN INNERHALB DES THORAXHOHLRAUMS DURCH LOKALE VERABREICHUNG DES MIT RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTIDS
Entweder Octreotid, RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog oder andere Somatostatin-Peptid-Analoge werden entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert gemäß den Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4 markiert. Patienten mit Karzinomen im Thoraxhohlraum erhalten mit Rhenium markiertes Somatostatin-Peptid direkt in in einen oder mehrere Tumoren im Thoraxhohlraum injiziert, wobei wahlweise Ultraschall, CT Scanning oder andere Bildaufbereitungsmodalitäten verwendet werden, um das Karzinom innerhalb des Thoraxhohlraums oder der Lunge zu lokalisieren. Wiederholte Dosen werden wie benötigt verabreicht. Die Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und anderer Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder durch ähnliche Mittel bestimmt werden und machen Gebrauch von der Gammastrahlung von ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re. Solche Karzinome können primäre Karzinome innerhalb des Thoraxhohlraums sein oder können Metastasen bildende Tumoren sekundär zu kleinen Karzinomen der Lungenzellen, des Brustkarzinoms, des Eierstockkarzinoms oder anderer Karzinome sein. Wahlweise kann vor Verabreichung der mit Rhenium markierten therapeutischen Dosis die Wirksamkeit der Therapie vorhergesagt werden durch die Verabreichung einer Dosis zur Bildgewinnung, die entweder eine Markierung aus Indium oder aus Technetium umfasst, um zu bestimmen, ob ausreichend Somatostatinrezeptoren auf dem Tumor im Thoraxhohlraum vorliegen. Solch eine Dosis zur Bildgewinnung kann dasselbe Somatostatin-Peptid-Analog wie für die Therapie aufweisen oder es kann ein anderes Analog sein, von dem nachgewiesen wurde, dass es sich an dieselben Somatostatinrezeptoren bindet. Für mit ^99mTc markierte Peptide können solche mit den Verfahren gemäß den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 markiert werden. Alternativ dazu können handelsübliche Produkte wie ¹¹¹In-DTPA-Octrectid angewendet werden.
BEISPIEL 13 – AUSWIRKUNG VON TRÄGERMOLEKÜLEN AUF DIE ZURÜCKBEHALTUNG UND DIE BIODISTRIBUTION DES MIT RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTIDS
Die Auswirkung auf die Zurückbehaltung in Organen und die Biodistribution durch die gleichzeitige Verabreichung von verschiedenen Trägermolekülen wurde untersucht. Vorläufige Untersuchungen zeigten hohe Bindung von ¹⁸⁸Re-RC-160 an Serenproteine in der Größenordnung von 80 %, wie durch Ausfällung und Mikrofiltration bestimmt. Lösliches ¹⁸⁸Re-RC-160 wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2 zubereitet und wurde mit entweder 10% Serenalbumin, 10% menschlichem Gammaglobulin oder 4% isotonischer Glucose gemischt. Die Zubereitung wurde in den Thoraxhohlraum von normalen BALB/c weiblichen Mäusen eingebracht und die Zurückbehaltung und die Biodistribution wurden zu Zeitpunkten von 4 und 24 Stunden nach der Injektion ausgewertet. Signifikante Unterschiede zwischen den drei Zubereitungen wurden beobachtet, wobei sich die Zurückbehaltung in Lunge, Thymus und Thoraxhohlraum durch die gleichzeitige Verabreichung von löslichem ¹⁸⁸Re-RC-160 und menschlichem Gammaglobulin signifikant erhöhte, wie in den 8A und 8B gezeigt wird. Ähnliche Ergebnisse wurden zum Zeitpunkt vier Stunden erhalten. Allgemein gesprochen erhöhte die gleichzeitige Verabreichung von Serenprotein und besonders von menschlichem Gammaglobulin die Zurückbehaltung des ¹⁸⁸Re-RC-160 in der Region oder dem Hohlraum, in den es eingebracht wurde.
BEISPIEL 14 – THERAPIE VON KARZINOMEN MIT DURCH RHENIUM MARKIERTEM SOMATOSTATIN-PEPTID BEI GLEICHZEITIGER VERABREICHUNG MIT EINEM TRÄGERMOLEKÜL
Entweder Octreotid, RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog oder andere Somatostatin-Peptid-Analoge werden entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert gemäß den Verfahren der Beispiele 2, 3 oder 4 markiert. Solches isotopenmarkiertes Peptid wird gemischt mit einem Trägermolekül, zum Beispiel einem Serenprotein, wie zum Beispiel menschlichem Serenalbumin oder menschlichem Gammaglobulin und das isotopenmarkierte Peptid wird gleichzeitig mit dem Trägermolekül verabreicht. Wenn es direkt in einen Tumor injiziert wird, weist das isotopenmarkierte Peptid erhöhte Zurückbehaltung innerhalb des Tumors auf. Wenn es in einen abgeteilten Raum, wie zum Beispiel den Thoraxhohlraum injiziert wird, weist das isotopenmarkierte Peptid erhöhte Zurückbehaltung innerhalb des abgeteilten Raums auf.
BEISPIEL 15 – THERAPIE VON KARZINOMEN UNTER VERWENDUNG VON PARTIKELFÖRMIGEN FORMEN DES MIT RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTIDS
RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog wird entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert gemäß dem Verfahren des Beispiels 2, um zu einer kolloidalen oder partikelförmigen Form der isotopenmarkierten Zubereitung zu führen. Patienten mit Karzinomen werden mit diesem mit Rhenium markierten RC-160 behandelt. Die Zubereitung wird direkt in eine Arterie injiziert, die den zu behandelnden Tumor versorgt, wo sich die Partikel innerhalb der kapillaren Schicht des Tumors niederlassen. Alternativ dazu wird die Zubereitung in einen Hohlraum injiziert, der das Karzinom umfasst, wie zum Beispiel zur Behandlung von Tumoren innerhalb des Thoraxhohlraums, wobei in diesem Fall die mit Rhenium markierten Somatostatin-Peptid-Partikel direkt in den Thoraxhohlraum injiziert werden. Alternativ dazu können solche Peptidpartikel auch direkt in einen oder mehrere Tumoren injiziert werden und es werden wahlweise Ultraschall, CT Scanning oder andere Bildaufbereitungsmodalitäten verwendet, um das Karzinom zu lokalisieren. Wiederholte Dosen werden wie benötigt verabreicht. Die Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und anderer Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder ähnlichen Mitteln bestimmt werden und machen Gebrauch von der Gammastrahlung des ¹⁸⁸Re oder des ¹⁸⁶Re.
BEISPIEL 16 – THERAPIE VON RHEUMATISCHER ARTHRITIS DURCH INTRAARTIKULÄRE VERABREICHUNG EINES MIT RHENIUM MARKIERTEN SOMATOSTATIN-PEPTIDS
RC-160 Somatostatin-Peptid-Analog wird entweder mit ¹⁸⁸Re oder ¹⁸⁶Re markiert durch jedes beliebige Verfahren wie hier oder anderswo beschrieben, insbesondere mit dem Verfahren des Beispiels 2, aber mit Isotopenmarkierung bei einem PH-Wert von 6 oder mehr, um eine kolloidale Form der isotopenmarkierten Zubereitung zu ergeben. Patienten mit rheumatischer Arthritis werden mit diesem mit Rhenium markierten RC-160 behandelt. Die Verwendung von ¹⁸⁸Re-RC-160 als ein Strahlenpharmazeutikum ist besonders anwendbar in der Therapie der Gelenke des Knies, des Knöchels, der Hüfte, der Schulter, des Ellenbogens, des Handgelenks und der Phalangen, mit angewandten Strahlungsdosen, die von der Größe des Gelenks abhängen, aber im Allgemeinen unterhalb 10 mCi liegen. Die Zubereitung wird direkt in ein großes Gelenk injiziert, das als Stelle einer arthritischen Entzündung bekannt ist, wo sich das Kolloid innerhalb des Gelenks und der umliegenden Knochenanordnungen ablagert. Wiederholte Dosen werden wie benötigt verabreicht. Die Lokalisierung des Mittels, Dosimetrie und anderer Parameter können durch Auswertung einer Gammakamera oder ähnlichen Mitteln bestimmt werden und machen Gebrauch von der Gammastrahlung des ¹⁸⁸Re oder des ¹⁸⁶Re.
BEISPIEL 17 – ZUBEREITUNG EINER STABILISIERTEN, PEPTIDBASIERTEN, MIT RHENIUM MARKIERTEN RC-160 STRAHLENPHARMAZEUTISCHEN ZUSAMMENSETZUNG
Die RC-160 Isotopenmarkierungskits wurden unter Verwendung von aseptischen Verfahren zubereitet. Jedes Kit wurde in einer 10 ml Serenampulle zubereitet unter Verwendung einer 2 ml Flüssigkeitsfüllung. Die flüssige Füllung enthielt 200 μg von RC-160 Peptid in 45 mM Natriumkaliumtartrat, 10 mM Kaliumwasserstoffphthalatpuffer, PH-Wert 5,0, und in 5 mM Zinntartrat mit 1% Maltose, hinzugefügt als ein gefriertrocknendes Hilfsmittel. Jedes Kit enthielt ein Maximum von 1,19 μg an Zinn. Nach dem Abfüllen wurden die Ampullen gefriergetrocknet, der obere Raum mit Stickstoffgas gefüllt und die Ampullen wurden verstöpselten und gekrimpt. Die gefriergetrockneten Ampullen wurden dann gekühlt gelagert bei 2–8°C. Um einen Kit zu markieren, wurden den Kits 4–5 ml ¹⁸⁸Re-Perrhenatlösung hinzugefügt, die 10–100 mCi enthielten und die Kits wurden dann für 30–45 Minuten in einem kochend heißen Wasserbad erhitzt. Nachfolgend auf eine kurze Abkühlperiode wurden 2 ml Askorbinsäure zur Injektion USP durch einen 0,22 Mikronfilter zu dem markierten Kit hinzugefügt. Zwei Arten des parenteralen Askorbats wurden mit ähnlichen Ergebnissen eingesetzt, Askorbinsäure zur Injektion, USP, 500 mg/2 ml und Ascorvit, 100 mg (Jenapharm, Deutschland).
Es wurde festgestellt, dass ¹⁸⁸Re-RC-160, zu welchem kein Askorbat hinzugefügt wurde, bis zu zwei Stunden nach der Markierung stabil war; danach jedoch begann das ¹⁸⁸Re-RC-160 einer Abkoppelung vom Peptid zu unterliegen, wie durch ITLC bestimmt und durch HPLC bestätigt. Dieses Abkoppeln trat mit ¹⁸⁸Re auf, aber nicht mit ^99mTc, wenn es in denselben Mengen, 20 mCi, verwendet wurde, was darauf hinwies, dass diese Wirkung spezifisch für Rhenium ist. Es wurde beobachtet, dass das Hinzufügen von Askorbat nach der Markierung das Abkoppeln im Wesentlichen eliminiert und das ¹⁸⁸Re-RC-160 stabilisiert. Ein HPLC Profil zu einem Zeitpunkt von 30 Stunden nach der Markierung mit 65 mCi, zu welchem Askorbat nach der Markierung hinzugefügt wurde, wies nach, dass sehr wenig freies Rhenium gefunden werden konnte. Untersuchungen zur Ersetzung des Cystein mit durch Askorbat stabilisiertem Re-RC-160 wies nach, dass die Festigkeit der Re/Peptid Bindung durch die Verwendung von Askorbat nicht verändert wurde, wobei das EC₅₀ für das mit Askorbat stabilisierte Material ähnlich dem ohne die Verwendung des Askorbats erhaltenen war.
Hinzufügen von Natriumsulfit (1 mg/mlk PH-Wert 7,4), Natriumbisulfit (1 mg/ml, PH-Wert 5,5) oder Mischungen aus Askorbat- und Natriumsulfit (Ascorvit^TM Rezeptur), Natriumbisulfit oder EDTA (Askorbat zur Injektion, USP, Rezeptur) war auch wirkungsvoll beim Stabilisieren des RC-160, obwohl nicht so wirksam wie die Verwendung von Askorbat allein. Das Hinzufügen von 50 mg/ml Askorbat brachte dieselben Ergebnisse wie das Hinzufügen von 250 mg/ml des Askorbats. Das Hinzufügen von Askorbat zu ¹⁸⁸Re-RC-160 bei 37°C ergab keine verbesserte Effizienz der Markierung oder eine wesentlicher Änderung in den Festigkeiten der Re-Peptid Bindungen, wie in Untersuchungen zur Ersetzung durch Cystein angezeigt.
Es wurde gefunden, dass die Reihenfolge des Hinzufügens der Askorbinsäurelösung kritisch war. Es wurde gefunden, dass das Hinzufügen des Askorbats nach der Markierung zu Stabilisierung führte. Wenn derselbe Betrag und dieselbe Konzentration des Askorbats vor dem Hinzufügen des Rheniums hinzugefügt wurde, wurde das RC-160 nicht wirksam isotopenmarkiert. Die durch analytische RP-HPLC erhaltenen Ergebnisse wurden bestätigt durch TLC Untersuchungen und durch isokratische Elutionen von C-18 SepPak Säulen. Sogar wenn die Menge an vor dem Hinzufügen des Rheniums hinzugefügter Askorbinsäure auf 400 μg reduziert wurde, wurde die Isotopenmarkierung schwerwiegend beeinträchtigt. Ein side-by-side Vergleich der durch RP-HPLC erhaltenen Ergebnisse offenbarte ein Elutionsprofil, das bezeichnend war für eine ineffiziente Isotopenmarkierung in der Gegenwart von dieser geringen Menge an Askorbinsäure. Die RPHPLC Ergebnisse wurden durch TLC bestätigt. Im Falle der in der Gegenwart von 400 μg Askorbinsäure isotopenmarkierten Zubereitung führte das weitere Hinzufügen von Askorbinsäure nach dem ersten Hinzufügen nach der Markierung zu keinerlei Verbesserung bezüglich der Effizienz der Markierung.
Das Hinzufügen von Askorbat oder Askorbat/Sulfitlösungen maximiert die Reduktion des Peptids RC-160, die im Überfluss vorhanden ist, ohne das ¹⁸⁸Re-RC-160 zu beeinträchtigen. Das Kit zur Isotopenmarkierung kann mit einem Überschuss an Zinn-Ionen und RC-160 entworfen werden, um eine Vielfalt von Markierungsbedingungen in Einklang zu bringen, wie zum Beispiel jene, die bei Verwendung im Feld erwartet werden könnten. In der Gegenwart von ¹⁸⁸Re-RC-160 reagieren das RC-160 und die Zinn-Ionen miteinander und führen zu etwas, von dem angenommen wird, dass es metallzyklisiertes ¹⁸⁸Re-RC-160 ist. Es wurde durch RP-HPLC veranschaulicht, dass ¹⁸⁸Re-RC-160 nicht identisch ist mit durch Zinn-Ionen reduziertem RC-160 oder mit durch Dithiothreitol reduziertem RC-160. Da ¹⁸⁸Re vom W-188/¹⁸⁸Re Generator im Wesentlichen frei von Trägern erzeugt wird, reduzieren die überschüssigen Zinn-Ionen das nicht zu einem ¹⁸⁸Re Komplex ausgebildete RC-160. Das Hinzufügen des Askorbats nach der Markierung maximiert die Reduktion des überschüssigen RC-160, wodurch es im Wesentlichen biologisch inaktiv gemacht wird und außerstande ist, in vivo wirksam mit ¹⁸⁸Re-RC-160 konkurrieren, um sich an Rezeptoren zu binden. Das Nettoergebnis ist ein isotopenmarkiertes Peptid mit einer sehr hohen spezifischen Aktivität.

Claims

Verfahren zur Isotopenmarkierung eines Somatostatin-Peptid-Analogs, das eine Disulfid-Bindung enthält, mit einem Radioisotop des Rheniums, gekennzeichnet durch die Schritte: a) Zusammenbringen einer das Somatostatin-Peptid-Analog enthaltenden Lösung mit genügend Zinn-Ionen, um im Wesentlichen und gleichzeitig die Disulfid-Bindung des Peptids und das Radioisotop des Rheniums zu reduzieren; b) Umsetzen der Lösung mit dem Radioisotop des Rheniums bei einer Temperatur von 60 °C bis 100 °C, wobei die Zinn-Ionen gleichzeitig die Disulfid-Bindungen und das Radioisotop des Rheniums reduzieren; und c) Auffangen des Rhenium-isotopenmarkierten Somatostatin-Peptid-Analogs.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Radioisotop Rhenium in Form von ¹⁸⁸Re- oder ¹⁸⁶Re-Perrhenat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 80 °C bis etwa 100 °C abläuft.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Somatostatin-Peptid-Analogs in der Lösung zwischen etwa 25 μg und 1 mg pro ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich den Schritt der Zugabe eines stabilisierenden, Ascorbinsäure oder Gentisinsäure enthaltenden Mittels zu dem aufgefangenen isotopenmarkierten Somatostatin-Peptid-Analog umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach dem Zusammenbringen der das Somatostatin-Peptid-Analog enthaltenden Lösung mit den Zinn-Ionen, jedoch vor der Zugabe des Rheniums, die Lösung gefriergetrocknet wird.
Verwendung eines isotopenmarkierten Somatostatin-Peptid-Analogs, das nach einem Verfahren nach den Ansprüchen 1–6 erhalten wurde, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von beim Patienten regional verteilten Karzinomen, wie z.B. Prostatakrebs, Glioblastoma, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magenkrebs, Sarkoma, Eierstockkrebs, Darmkrebs, Gehirntumor, Lungenkrebs, Brustkrebs oder Lymphoma, wobei das Karzinom in der Prostata, der Bauchbinde, dem Gehirn, in der Bauchhöhle, im Herzbeutel oder in der Brusthöhle lokalisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Menge an Rhenium zwischen annähernd 10 und 500 mCi beträgt.