JP2000515847A - ペプチド放射性医薬品用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は医学的に有用な金属イオンで標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類を用いる放射療法に関する。本発明は特に過レニウム酸塩でソマトスタチン誘導ペプチド類を標識化するための方法および試薬に関し、そこでは少なくとも１個の二硫化物結合を含有するソマトスタチン−誘導ペプチド同族体を含む溶液が準備され、その溶液を第一スズイオンおよぴ放射性同位体と反応させ、ここで第一スズイオンはペプチドの二硫化物結合および放射性同位体を実質的に還元させるのに十分なものであり、そして放射性標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド同族体が回収される。放射性標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類の局所的投与方法、放射性標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類の増加した局所的保持方法、放射性標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類を使用する関節炎の処置方法、および放射性標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類の安定化方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド放射性医薬品用途 技術分野 本発明はペプチドをベースとした金属イオンで標識化されたソマトスタチン− 誘導組成物を含む、疾病の診断および処置用のソマトスタチン−誘導ペプチドを ベースとして放射性医薬品の製造方法、組成物、および使用に関する。 背景技術 本出願は１９９６年２月２日に出願されたアスコルビン酸塩−安定化放射性医 薬方法および組成物という名称の米国暫定特許出願番号６０／０１２１,０２７ の一部継続出願であり、この出願はまた１９９５年５月２３日に出願されたソマ トスタチン放射性医薬品用途という名称の米国特許出願番号０８／４４７,４５ ３の一部継続出願であり、それは１９９４年６月３０日に出願された多価ペプチ ド医薬品用途という名称の米国特許出願番号０８／２６９,９２９の一部継続出 願であり、それはまた１９９３年７月２日に出願された化学走性ペプチド医薬品 用途という名称の米国特許出願番号０８／０８７,２１９の一部継続出願であり 、それはまたペプチド−金属イオン医薬品調合物および方法という名称の米国特 許第５,４４３,８１６号の一部継続出願であり、それはまたテクネチウムまたは レニウムを用いる抗体および他の蛋白質の直接的放射性標識化という名称の米国 特許第５,１０２,９９０号の一部継続出願であり、それはまた調節された還元に よるテクネチウムまたはレニウムを用いる抗体および他の蛋白質の標識化という 名称の米国特許第５,０７８,９８５号の一部継続出願であり、この出願はまた放 射性核種を用いる一硫化物または二硫化物結合を含有する基質の直接的標識化と いう名称の米国特許第５,２７７,８９３号、金属イオンを用いる抗体および他の 蛋白質の直接的標識化という名称の米国特許第５,４６０,７８５号、ＩＫＶＡＶ ペプチド放射性医薬品用途という名称の米国特許出願番号０７／９９８,８２０ 、およびＹＩＧＳＲペプチド放射性医薬品用途という名称の米国特許出願番号０ ７／９９８,９１ ０に関連しており、上記の全ての教示はここで引用することにより本発明の内容 となる。 ペプチドをベースとした放射性医薬品。特異的な細胞表面受容体に結合するか または他の方法で細胞機能を変えるペプチド類である生物学的に活性なペプチド 類の使用は放射性医薬品としてある程度は考えられていた。生体特異的な造影お よび放射療法剤は例えば抗体の如き大きな蛋白質で始まり、そして抗体フラグメ ント、抗原結合領域フラグメントおよび小さい生物学的に活性なペプチド類へと 発展する。比較的小さい寸法の生物学的に活性なペプチド類は一部の用途に望ま れる例えば比較的高い目標対非目標および比較的速い血液浄化値の如き薬力学性 質を与える。 造影剤としてソマトスタチン−誘導ペプチド類を使用するものを含む数種のペ プチドをベースとした放射性医薬製品が開発中である。診断用造影に使用される ソマトスタチンの放射標識化されたペプチド同族体には¹²³Ｉ−標識化されたＴ ｙｒ−３−オクトレオチドおよび¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチド造影剤が 包含され、そして直接的に標識化されたソマトスタチン同族体を含む種々の^99m Ｔｃ−標識化されたソマトスタチンに関して研究が行われている。¹¹¹Ｉｎ−Ｄ ＴＰＡ−オクトレオチド製品は米国およびヨーロッパ諸国で市販されており、そ してマリンクロット・メディカル・インコーポレーテッドにより販売されている 。 ソマトスタチンおよび同族体。ソマトスタチンは通常は下垂体成長ホルモンの 放出を抑制する視床下部により製造されるホルモンである。天然−産出ホルモン に似た薬理学的活性を有する多数のペプチド同族体が開発されている。正常な対 象では、ソマトスタチンおよびその同族体はセロトニンおよぴ胃腸脾臓ペプチド 類並びに成長ホルモンの分泌を抑制する能力を有する。ソマトスタチンの受容体 は種々の人間腫瘍およびそれらの転移に対して発現される。ソマトスタチン受容 体は脳（髄膜、星状細胞膜、神経芽腫、下垂体腺腫、労神経節腫、エルケル細胞 癌および神経膠腫を含む）、消化−脾臓管（インスリノーマ、グルコノーマ、Ａ ＵＤオーマ、ＶＩＰオーマおよび結腸癌を含む）、肺、甲状、乳腺、前立腺、リ ンパ系（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含む）並びに卵巣で発生するもの を含む広範囲の腫瘍タイプで過剰発現されることが見いだされた。さらに、乳腺 腫瘍、肺癌（特に小細胞肺癌）、並びにリンパ腫（ホドキンズおよび非ホドキン ズ）を含む経皮胸腔転移を最も頻繁に生ずる腫瘍は全て一般的にシンチグラフィ ーにより検出可能なソマトスタチン受容体を過剰発現する（Krenning EP，Kwekk eboom DJ，Bakker WH，Breeman WA，Kooij PP，et al:Somatostatin receptor s cintigraphy with[111in-DTPA-D-Phe1]-and[1231-Tyr3]-octreotide;the Rotter dam experience with more than 1000 patients．Eur J Nucl Med 20:716-731， 1993）。 種々の腫瘍に対するソマトスタチン受容体の高割合の過剰発現にもかかわらず 、ソマトスタチン同族体は癌の抑制に関する広範囲の臨床的用途は得ていない。 それらの最近の臨床的用途は主として転移癌またはＶＩＰ−分泌腫瘍に関連する 兆候の抑制である。ソマトスタチン同族体は広い治療指数を有しておりそして腫 瘍副作用はないようである。副作用のほとんどは胃腸性でありそして少量の吐き 気、鼓脹、下痢、便秘、または脂肪便を含む。限定される臨床的使用の理由の一 部は長期維持療法に関する要望、そのような療法の必然的な高価格、および臨床 的設定時に観察される可変的な影響によるものかもしれない。 ソマトスタチン同族体、そのような同族体の製造、およびそのような同族体の 使用は先行技術で既知である。そのような同族体はある種の癌および他の症状の 処置で使用されており、１種の市販製品はサンドにより製造されそしてサントス タチンという商品名で販売されているオクトレオチドである。 多種のソマトスタチン同族体が開発されてきている。これらには、Andrew V.S challyをリーダーとしたツラン大学チームにより最初に合成された有効なソマト スタチン同族体であるＲＣ−160(Cal RZ，Szoke B，Lu E，Fu D，Redding TW an d Schally AV:Synthesis and biological activity of highly potent octapept ide analogues of somatostatin．Proc Natl Acad Sci USA，83:1896-1900，198 6）が包含される。Schallyにより行われた最近の研究では、中でも、インビトロ およびインビボでの人間の成長の抑制におけるＲＣ−160の有効性が示されてい る。ソマトスタチン同族体およびボンベシン／ガストリン−放出性ペプチド拮抗 薬ＲＣ−３０９５はインビトロおよびインビボでにおける人間の多形膠芽腫の成 長を抑制する。Cancer Res 54'5895-5901，1994。 ＲＣ−160は環式ソマトスタチン同族体であり、それはソマトスタチン受容体 ２および５と結合する(Oberg K:Treatment of neuroendocrine tumors．Cancer Treat Rev 20:331-355，1994)。ＲＣ−160の一般的な構造は下記の通りである： 他の利用できるソマトスタチン同族体にはソマトスタチンの環式オクタペプチ ド同族体、例えば が包含される。 ペプチド放射標識化。ペプチド類は種々の手段により放射標識化される。放射 性医薬品用の生物学的に活性なペプチド類にはOlexa SA，Knight LC and Budzyn ski AZの米国特許第４,４２７,６４６号、インビボでトロンビンを配置するため の架橋結合されたフィブリンから誘導される放射標識化されたペプチドの使用に より開示されているものが包含される。ペプチド類は反応性芳香族アミノ酸にお ける求電子置換により直接的に放射ヨウ素化できる。ヨウ素化は予備標識化され た試薬によっても実施することができ、そこでは試薬がヨウ素化されそして精製 され、次にペプチドに結合される。Morgan CA JrおよびAnderson DCの米国特許 第４,９８６,９７９号には、炎症の組織部位の造影、キレート類の使用および直 接的ヨウ素化が開示されている。 ポリペプチド類に共有結合されたＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ並びに同様な物質の 有用性は当技術で既知である。Hnatowich，DJ米国特許第４,４７９,９３０号お よび第４,６６８,５０３号。ＤＴＰＡは黒色腫を造影するためのα−黒色細胞− 疑似ホルモン、感染造影用の化学走生ペプチド類、腫瘍−関連ラミニン受容体に 目標設定するためのラミニンフラグメントおよび腎臓における動脈ナトリウム排 泄増加受容体を造影するための動脈ナトリウム排泄増加ペプチドを含む種々のペ プチド類を¹¹¹Ｉｎで放射標識化するための二官能性キレート剤として使用され ている。 テクネチウム−９９ｍはその低い価格、容易な入手性、優れた造影性質および 高い特異的活性により診断用造影のための好適な同位体である。蛋白質およびペ プチド類の^99mＴｃを用いる放射標識化、直接的標識化および二官能性キレート 類に関する二種の方式がDean RT，Lister-James J and Buttram Sの米国特許第 ５,２２５,１８０号の造影用テクネチウム−９９ｍ標識化されたソマトスタチン −誘導ペプチド類には、架橋結合されたシステイン基から生ずる固有二硫化物結 合の還元後のソマトスタチンの直接的標識化が開示されている。以上で引用され ている金属イオンを用いる抗体および他の蛋白質の直接的標識化という名称の米 国特許第５,４６０,７８５号およびこれも以上で引用されているペプチド−金属 イオン医薬品調合物および方法という名称の米国特許第５,４４３,８１６号には 、結合用に利用できる硫黄−、酸素−および窒素−含有アミノ酸配列によるペプ チド類の種々の直接的標識化方法が開示されている。 ^99mＴｃをペプチド上の特異的部位に結合させるための種々の高親和性キレー ト類が開発されている。一つの方式では、二官能性試薬を最初に^99mＴｃで標識 化し、そして次にペプチドと共役させる。しかしながら、複数の種が生じること があり、そして標識化後の精製が一般的に必要である。他の方式では、キレート 剤が放射標識化前にペプチドに共役結合される。Tolman GLの米国特許第４,７３ ２,８６４号のメタロチオネインおよび目標−探求性の生物学的活性分子のトレ ース−標識化された共役物では、ペプチドを含む生物学的活性分子と共役された メタロチオネインまたはメタロチオネインフラグメントの使用が開示されている 。使用される他のキレート類には種々のＮ₂Ｓ₂およびＮ₃Ｓ配位子、ＤＴＰＡ、 並びに６−ヒドラジノ−ニコチネート基が包含される。 放射療法薬の分配方式。静脈内注入後のソマトスタチン同族体の低い絶対的腫 瘍吸収性、他の組織中へのソマトスタチン受容体の広範囲の分配、および高度に 局在化された治療放射性同位体濃度に対する要求の理由のために、癌療法用の在 所−誘導放射療法剤の改良分配方法に対する要望がある。ある研究グループは腫 瘍療法用の放射標識化されたコロイドキレート類および抗体の局部的または局所 的投与の使用を開発している(Hoefnagel CA:Anti-cancer radiopharmaceuticals ．Anticancer Drugs 2:107-32，1991)。例えば、脳多形膠芽腫の研究では、¹³¹ Ｉ−標識化されたモノクローン抗体を使用する直接的な病変内放射免疫療法で陽 性結果が得られた(Riva P，Arista A，Sturiale C，Franceschi G et al:Possib ility of contol of maglignant gliomas by direct intratumour or intralesi onal radioimmunotherapy(Abstract)．J Nucl Med 5:144P(Abst．No．582)，199 4)。３４人の評価可能な患者では、従来の処置により得られる１２カ月に対して 、１８カ月の平均生存が報告されており、３８.２％の応答率であり、９人の安 定化、７人の部分的後退および６人の完全後退を含んでいた。 抗体の使用は一つの処置方式であるが、他の種類の生物学的試薬が目標付け目 的に求められる性質の多くをすでに有することは明らかになっている。ペプチド ホルモン類およびそれらの合成同族体は目標細胞との高親和性相互作用を受け、 そして免疫応答をほとんどまたは全く生じない。 診断用造影におけるソマトスタチン受容体−陽性腫瘍の目標付けは下記の事項 を含む多くの利点を有する：ａ）目標受容体の発現は多種の腫瘍タイプの中で上 方−調節され、そして逆に正常組織上での受容体の発現は低い、ｂ）固有ホルモ ンに対する受容体の親和力は高くそしてより高い親和力を有する多数の合成同族 体が記載されており、そしてｃ）トレーサーの分子量は低くそして循環するペプ チドが循環系から急速に浄化される。循環系からの放射標識化されたペプチドの 急速浄化は非常に低い背景をもたらして、低い絶対的腫瘍吸収面でも造影を可能 にする。 放射標識化されたペプチド類の急速な浄化は診断造影においてかなり有利であ ることは明らかであるが、治療効果が目標腫瘍部位における放射ヌクリドの絶対 的吸収性に全て依存するような目標設定放射療法においては顕著な欠点である。 それ故、放射標識化された治療剤の静脈内投与は一般的にはその試剤が急速に浄 化される場合には臨床的に成功を収めない。造影目的のためには相対的吸収性が 重要である。しかしながら、放射標識化された治療剤の局部的または局所的投与 はある種の下記の潜在的な利点を有する： ａ）局部的または局所的投与がペプチドを腫瘍に対して金属イオン封鎖し且つ並 置させて、腫瘍結合の最高の確率を与え、 ｂ）局部的または局所的分配が腫瘍を含む物理的区画を与えて、ペプチドが腫瘍 に近付く時間を最大にして直接的結合および非−特異的な局部的照射の両者によ る腫瘍の最適照射を与え、 ｃ）局部的または局所的分配頻度はリンパ系を含む局所的浄化機構を含んでいる ため、局所的リンパ節の中の微小転移を照射することができ、そして ｄ）機構または局所的分配は血液流からの急速な浄化を与えることができ、ペプ チドが血液から浄化されると、それにより非−目標器官に対する照射が最少にな る。 関節炎処置用のソマトスタチンの動脈内使用。上記のソマトスタチンおよびそ の同族体の用途および潜在的用途の他に、関節炎処置におけるその潜在的用途も 研究により示された。特に、文献はリウマチ様関節炎の処置におけるソマトスタ チンの受動的な放射標識が付いていない動脈内使用を記載している。Fioravanti A，Franci A，Gelli R，Minari C，Montemerani M，Moscato P，and Marcolong o R:Evaluation of the efficcacy of intra-articular administration of som atostatin in rheumatoid arthritis，Clin-Te．142(5):453-57，1993。他の研 究は乾癬性関節炎用の新規な組み合わせ処置を行うための金塩およびソマトスタ チンの使用を含む。Matucci-Cerinic M，Pignone A，Lotti T，Partsch G，Livi R，and Cagnoni M:Gold salts and somatostatin:a new combined analgesic t reatment for psoriatic arthritis．Drugs-Exptl.-Clin.-Res.，18(2):53-61(1 992)。文献はまた放射コロイドを使用する照射滑膜切除術も記載している。例え ば、Chinol M，Vallabhajosula S，Goldsmith SJ，Klein MJ，Deutsch KF，Chin en LK，Broadack JW，Deutcsh EA，Watson BA，and Tofe AJ:Chemistry and bio logical behavior of Samarium-153 and rhenium 186-labeled hydroxyapatite particles:potential radiopharmaceuticals for radiation synovectomy，J．N ucl Med.，34:1536-1542（1993）を参照のこと。また、Deutsch E，Brodack JW ，Deutsch KF:Radiation synovectomy revisited．Eur．J．Nucl．Med，45 1113 -1127(1993)も参照のこと。照射滑膜切除術はベータ−発生放射性医薬品の動脈 内注入からなっており、滑膜炎症に反作用しそして抑制する。関節中での滑膜に 対する放射活性物質の直接的な並置に関する放射コロイドの使用が滑膜の細胞に よるコロイド吸収の活性な工程により予測されていた。一部の用途では、コロイ ドは例えば粒子の如き比較的可溶性が大きい形態より好ましく、その理由は コロイドの使用が放射活性を漏出なしで関節に限定するのを助けるからである。 そのような漏出は局所的なリンパ節中での高い蓄積をそしてそれより少ない程度 で肺にもたらすことがあり、そしてそれにより非目標器官に対する許容できない 照射をもたらす。可溶性形態の使用は従って過度の望ましくない全身照射を引き 起こす。同様に、血液を介する投与は適当な細胞に目標設定しないかもしれずそ して高い非−目標吸収性をもたらすかもしれない。実施者の関心は、この処置が 繰り返し処置がであると予測されるため他の組織への放射活性の必然的な投与で ある。放射滑膜切除術用の¹⁸⁸Ｒｅ使用の利点の幾つかはWang SJ，Lin WY，Hsic h BT，Shen LH，Tsai AT，Ting G，and Knapp FF，Jr.:Rhenium-188 sulphur co lloid as a radiation synovectomy agent．Eur．J．Nuc．Med．22:505-507(199 5)に記載されている。 放射性医薬品用のアスコルビン酸塩および同様な「安定剤」の使用。放射性医 薬品組成物は放射標識化後に酸化および自動放射分解により変性することが知ら れている。例えばテクネチウム−９９ｍおよびレニウム−１８６またはレニウム −１８８の如き一部の放射性医薬品は適当な酸化状態で放射ヌクリドを保つため に例えば酸化防止剤または還元剤の如き安定剤を必要とすることが知られている 。テクネチウムおよびレニウムの両者は通常は、それらが第一スズまたは他の還 元剤を用いて放射性医薬品キット中で換言されるまで、それらの安定状態でらう それらの最高のすなわち＋７酸化状態で存在する。標識化されたまたは錯体形成 された放射性医薬品キットは、錯体形成され換言された同位体がそれより高い酸 化状態に酸化されると、不安定になって結合された同位体を配位子から遊離（未 結合）過テクネチウム酸ナトリウム＋７または遊離過レニウム酸塩＋７として放 出する。例えばアスコルビン酸、ゲンチシン酸などの如き化合物を使用して放射 ヌクリドおよび／または還元剤の酸化を抑制していた。特に、酸化防止剤、典型 的にはアスコルビン酸および／またはゲンチシン酸、は文献中に換言能力の低い 第−スズを含有する放射性医薬品キットの寿命を延長させる目的のために記載さ れている。 ここで使用されている「自動放射分解」という語は、ペプチドまたは蛋白質と 結合された放射性同位体から放出される照射の作用によるペプチドまたは蛋白質 の化学的分解を含む。自動放射分解は放射ヌクリドから放出される放射による水 または他の媒体中でのフリーラジカルの生成により引き起こされるかもしれない 。フリーラジカルは１個の対になっていない電子を含有する分子または原子であ り、そして高い化学的反応性を示す。放射性医薬品キット安定剤としての酸化防 止剤の作用は当技術で一般的に知られているように「フリーラジカルスカベンジ ャー」としてのそれらの作用を含む。アスコルビン酸および／またはゲンチシン 酸は、反応性水素原子をフリーラジカルスカベンジャーとして作用する(Kowalsk y，R．J．and Perry，J．R，Radiopharmaceutical in Nuclear Medicine Practi ce，Connecticut:Appleton and Lange 1987，88-89)。自動放射分解はレニウム 同位体ではかなりの問題になることがあるが、それはテクネチウムでは典型的に は幾分問題が小さい。 組成物に対してＨＳＡを添加するかまたはそれを沈澱と使用との間で凍結維持 する伝統的な技術は必ずしも常に多くの放射標識付けされたペプチド類および蛋 白質と共に使用するためには有効でなかったりまたは実際的でなかったりする。 診断および治療用途のための多くの新たに開発されたペプチド類により示される 将来性にもかかわらず、自動放射分解に関するそれらの疑念がそれらの使用を制 限しているかもしれない。従って、有効であるが非−損傷的である安定剤の開発 には意義がありそして当技術で大いに要求されている進歩である。 発明の開示 本発明によると、放射性同位体との少なくとも１個の二硫化物結合を含有する ソマトスタチン−誘導ペプチド同族体を放射標識化する方法が提供される。この 方法では、最初に少なくとも１個の二硫化物結合を含有するソマトスタチン−誘 導ペプチド同族体を含む溶液が準備される。この溶液を第一スズイオンおよび放 射性同族体と、十分量の第一スズイオンがペプチドの二硫化物結合および放射性 同族体の両者を実質的に還元するように、反応させる。放射標識化されたソマト スタチン−誘導ペプチド同位体が次に回収される。この方法はテクネチウム放射 性同位体を用いて使用してもよいが、過テクネチウム酸ナトリウムの形態のテク ネチウム用に特に適する。この方法をレニウム同位体を用いて使用してもよく、 そして過レニウム酸塩の形態でのレニウムが特に適する。過レニウム酸塩または その塩はレニウム−１８８およびレニウム−１８６であることができる。溶液中 のソマトスタチン−誘導ペプチド同族体の濃度は１ｍｌ当たり約２５μｇ〜１ｍ ｇの間であることができる。 過レニウム酸塩が使用される方法では、照射量は約１０〜５００ｍＣｉであっ てよく、反応時間は約１分間〜４時間の間である。標識化反応は、反応が約８０ ℃〜約１００℃の温度で起きる時に最良の結果を生ずるが、約６０℃〜８０℃の 比較的低い温度で効果的に標識化してもよい。反応は３７℃でも進行するが遅く 、そして限られた十分な時間があるなら多分完了するまで進むであろう。 別の態様では、少なくとも１個の二硫化物結合を含有するソマトスタチン−誘 導ペプチド同族体をテクネチウムまたはレニウムの放射性同位体で標識化する方 法が提供され、そこではソマトスタチン−誘導ペプチド同族体を含む溶液を準備 された第一スズイオンと接触させてペプチドの二硫化物および放射性同位体を実 質的に且つ同時に還元し、その後に放射性同位体を加える。この段階で、ソマト スタチン−誘導ペプチド同族体および第一スズイオンを含む溶液を凍結乾燥また は凍結し、そして放射標識化まで無期限に貯蔵することができる。放射標識化は 、ソマトスタチン−誘導ペプチド同族体および第一スズイオンを含む溶液を放射 性同位体、例えばテクネチウムおよびレニウム、と反応させそして放射標識化さ れたソマトスタチン−誘導ペプチドを同時に回収することにより、実施される。 凍結乾燥された調合物が使用される場合には、ペプチドおよび第一スズイオンを 一般的な食塩水を含む適当な溶媒で可溶性にしてもよく、または放射性同位体が 水溶液中にある場合には放射性同位体の添加により可溶性にしてもよい。放射性 同位体は過テクネチウム酸ナトリウムの形態のテクネチウムまたは過レニウム酸 塩の形態のレニウムであってよい。レニウムはレニウム−１８８またはレニウム −１８６であってよい。過レニウム酸塩が使用される方法では、照射量は約１０ 〜５００ｍＣｉの間であってよく、反応時間は約１分間〜４時間の間である。標 識化反応は、反応を約８０℃〜約１００℃の温度において行う時に最少の結果を 生ずるが、約６０℃〜８０℃の比較的低い温度においても効果的に標識化付けし てもよい。 本発明によると、人間患者を含む患者内での局所的に区画化された癌の処置方 法も提供され、それは治療有効量のレニウム−標識化されたペプチドの局所的投 与を使用する。ペプチドはソマトスタチン、ソマトスタチン誘導ペプチド、ソマ トスタチンの同族体またはソマトスタチン受容体に結合しそして少なくとも１個 の二硫化物結合を含有するペプチドであってよく、レニウムは多分直接的な還元 的挿入で二硫化物結合の中で標識化し、そこではＲｅ原子は２個の硫黄原子の間 に置かれている。別の方法では、局所的な投与を二硫化物結合を含有しない環式 ペプチド類を含むソマトスタチン受容体に結合するペプチドと共に使用してもよ い。そのような場合には、ペプチドはレニウムまたは他の適する治療用放射性同 位体を用いて、キレート、二官能性キレート、または他の放射標識化方法の使用 を含む当技術で既知の方法により、標識化してもよい。この方法は前立腺癌、多 形膠芽腫、脾臓癌、胃癌、肉腫、卵巣癌、結腸癌、脳癌、肺癌、乳癌およびリン パ腫を含む種々の局所的に区画化された癌で使用してもよい。それはまたある領 域内に存在する局所的に区画化された癌、例えば前立腺筋膜、脳、腹腔、心膜ま たは胸郭腔内の癌、で使用してもよい。放射標識化されたペプチドは例えば癌の 中への直接的注入、癌を含有する区画中への直接的注入および癌を含有する区画 中への動脈内注入および癌に直接通じる動脈内への注入の如き注入方法を含む多 種の局所的投与により投与してよい。この方法を粒子形態のレニウム−標識化さ れたペプチドを含む粒子形態のペプチドを用いて使用してもよく、この場合には 局所的投与は粒子形態のレニウム−標識化されたペプチドの粒子形態の癌を含有 する区画中への注入および癌に直接通じる動脈内へのレニウム−標識化されたペ プチドの注入を含む注入方法によるものであってよい。 この方法をレニウム−１８６およびレニウム−１８８を含む過レニウム酸塩の 形態のレニウムの放射性同位体を用いて使用してもよい。二硫化物結合を含有す るペプチドが使用される方法に関しては、ペプチドを含む溶液を第一スズイオン と接触させて、十分な第一スズイオンがペプチドおよび過レニウム酸塩の二硫化 物結合を十分な第一スズイオンが実質的に完全に還元し、ペプチド、第一スズイ オンおよび過レニウム酸塩の混合物を培養してレニウム−標識化されたペプチド を製造し、そしてレニウム−標識化されたペプチドを回収することによりレニウ ムを二硫化物に直接的に標識化する。過レニウム酸塩が使用される方法では、照 射量は約１０〜５００ｍＣｉの間であってよく、反応時間は約１分間〜４時間の 間である。標識化反応は反応が約８０℃〜約１００℃の温度で起きる時に最良の 結果を生ずるが、約６０℃〜８０℃の比較的低い温度でも効果的に標識化しても よい。 本発明によると、治療用の放射標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド同 族体の腫瘍での保持性を増加させる方法も提供する。この方法では、放射標識化 されたソマトスタチン−誘導ペプチド同族体を血清蛋白質成分と混合し、そして 治療有効量の放射標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド同族体および血清 蛋白質成分の混合物を局所的に投与する。血清蛋白質成分はガンマグロブリンで あってよい。この方法に適する局所的投与手段には、癌への直接的注入、癌を含 有する区画への直接的注入、および癌に直接通じる動脈内への直接的注入が包含 される。この方法をレニウム−１８８およびレニウム−１８６を含むレニウムの 治療用放射性同位体を用いて使用してもよい。ソマトスタチン−誘導ペプチド同 族体を上記の通りにして直接的に標識化してもよく、または当技術で既知の手段 により標識化してもよい。 本発明は、ここに開示されている種々のソマトスタチン同族体の使用の他に、 癌受容体に特異的な放射標識化された受容体−特異的ペプチドまたはペプチド疑 似剤を用いて使用してもよい。既知のそして天然産出性ペプチド類の他に、本発 明の方法は分子認識単位から誘導されるペプチド類、超可変領域同族体、組み合 わせまたはライブラリー法により得られるペプチド配列などを用いて使用しても よい。そのようなペプチド類はソマトスタチンと関連している必要はなく、しか も環式ペプチドである必要もない。それらには、例えば、広範囲の腫瘍関連細胞 表面受容体と結合するペプチド類および好適には結合で内部移行される細胞表面 受容体が包含される。それらには天然産出受容体と結合するペプチド類も含まれ るが、それらは例えばホルモン受容体の如きある種の癌の中では過剰発現する。 そのようなペプチドは広範囲の治療用放射性同位体のいずれかで標識化してもよ く、¹⁸⁶Ｒｅおよび¹⁸⁸Ｒｅが好適な放射性同位体である。そのような放射標識化 されたペプチド類は例えば腫瘍物体中への直接的注入の如き直接的な病変内手段 により、または例えば腫瘍を含有する腔内への腔内注入の如き局部的手段により 、そして例えば腫瘍を含有する器官に供給される動脈の中への注入の如き動脈内 手段により分配できる。投与は腫瘍中への遅延−巨丸剤、留置カテーテルを含む 還流によるカテーテル中への投与を含む当技術で既知の手段によるものであって よい。代表的な腔には胸膜腔、心臓腔および腹腔が包含されるが、本発明の方法 はいずれの腔を用いても使用できる。広範囲の腫瘍を処置して、ペプチドが特異 的である腫瘍発現受容体を与える。それらの例には、胸膜腔の中では、小細胞肺 癌、リンパ腫、乳癌、甲状癌および気管支癌が包含される。 本発明によると、レニウム−標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチドの動 脈内投与によるリウマチ様関節炎の治療方法も提供される。好適な方法では、Ｒ Ｃ−160ソマトスタチン誘導ペプチド同族体に¹⁸⁸Ｒｅまたは¹⁸⁶Ｒｅを用いてこ こにまたは他のところに記載されているいずれかの方法により標識化してコロイ ド形態の放射標識化された調合物を生ずる。リウマチ様関節炎の患者をこのレニ ウム−標識付きＲＣ−160コロイドで処置する。調合物を関節炎の部位であるこ とが知られている大きい関節の中に直接的に注入し、そこでコロイドは関節およ び周囲の骨構造内に位置する。¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160は放射コロイドとして作用し 、それにより放射活性を滑膜細胞に並置しそして滑膜細胞により活性的に吸収さ れる。しかしながら、コロイド作用の他に、生物学的に活性なペプチド類（すな わち、ソマトスタチン配列）の存在が炎症関節のマトリックス内での炎症細胞の 直接的に目標設定を一緒に可能にすると信じられている。必要なら繰り返し投与 を行ってもよい。試薬、投与量、および他のパラメーターの局在化をガンマカメ ラ評価、または¹⁸⁸Ｒｅもしくは¹⁸⁶Ｒｅを使用する同様な手段により測定するこ とができる。ＲＣ−160調合物も同様に投与される。或いは、コロイド、粒子ま たは可溶性物質である調合物を関節に通じる血管の中に注入する。 本発明の他の面によると、ＲＣ−160ペプチドをレニウムの同位体を用いてこ こにまたは他のところに開示されている方法により標識化してこれまでは安定剤 を実質的に含まない放射標識化された医薬製品を製造し、そして次に少なくとも アスコルビン酸またはゲンチシン酸を含む安定化剤を放射標識化された医薬製品 と混合することを含む決められた段階を含んでなる安定化されたレニウム−標識 化 されたＲＣ−160ペプチドをベースとした放射性医薬品組成物を製造する方法も 提供される。 従って、本発明の目的はソマトスタチン−誘導ペプチド類を¹⁸⁸Ｒｅまたは¹⁸⁶ Ｒｅを含むレニウムの同位体で標識化する方法および手段を提供することである 。 本発明の別の目的はソマトスタチン−誘導ペプチド類中の二硫化物結合および 過レニウム酸塩の同時還元方法を提供してそれにより還元された二硫化物結合に よってペプチドをレニウムの同位体で標識化する手段を提供することである。 本発明の他の目的はレニウム−標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチドの 癌細胞死滅効果をレニウムまたはソマトスタチン−誘導ペプチドだけで得られる 効果よりかなり増加させ、且つ同様にレニウムおよびソマトスタチン−誘導ペプ チドの同時添加により得られる効果より効果が大きい手段を提供することである 。 本発明の別の目的は癌性の金属イオン封鎖されたまたは区画化された領域また は部分、例えば脳、胸膜腔、前立腺筋膜または他の金属イオン封鎖されたまたは 区画化された領域または部分、の中へのレニウム−標識化されたソマトスタチン −誘導ペプチド類の投与により治療工程を行う方法を提供することである。 本発明の別の目的はソマトスタチン−誘導ペプチドおよび金属イオン標識化試 薬を含有する単一瓶を使用して最終使用者により行われる標識化を可能にする方 法および生成物を提供することであり、この方法は標識化を行うために単一段階 だけを必要とし、それは医学的に有用な金属イオンの導入である。 本発明の別の目的は金属−イオン標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド および金属−イオン標識化されたペプチド類の生体分配を一般的には、改良され たそして好ましい生体分配およびペプチドの目標設定を与えるための例えばアル ブミンの如き試薬の同時投与により改良するための方法を提供する。 本発明の別の目的はフタル酸塩緩衝濃度およびｐＨの最適化、標識化されたペ プチドの安定性増加および好適条件の制定による標識付けの最適化を含む金属− イオン標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類の最適な薬学的方法および 組成物を提供することである。 本発明のさらに別の目的はソマトスタチン受容体を発現する癌を放射活性であ るレニウム−標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチド類の使用により処置で きるような手段を提供することである。 本発明の他の目的は前立腺、胸、肺、脾臓、脳を含む癌並びにレニウム−標識 化されたソマトスタチン−誘導ペプチドの使用によりソマトスタチン受容体を意 義あるほど発現する手段を提供することである。 本発明の他の目的はレニウム−標識化されたソマトスタチン−誘導ペプチドの 動脈内投与によるリウマチ様関節炎の治療方法を提供することである。 本発明の他の目的は放射活性が滑膜細胞と並置−位置にあり、そしてそれによ り活性的に吸収される例えばソマトスタチンの如き生物学的に活性なペプチド類 が炎症中の関節内で炎症細胞の直接的な目標設定を可能にして放射活性の減じら れた総負荷量をもたらす。 本発明の他の目的はアスコルビン酸およびゲンチシン酸よりなる群の員を安定 剤として使用して安定化されたレニウム−標識化されたＲＣ−160ペプチド−ベ ースの放射性医薬品組成物を製造する方法を提供することである。 本発明の他の目的、利点および新規な特徴並びにそれ以上の応用範囲の一部は 以下の詳細な記述中に示されるであろうし、そして一部は下記の試験で当技術の 専門家に明らかになるであろうし、または本発明の実施により習得されるかもし れない。本発明の目的および利点は添付されている請求の範囲に特に指摘されて いる指示および組み合わせにより実現されそして得られる。 図面の簡単な説明 図１は最初の研究における動物に関するｃｍ³で測定したＰＣ−３腫瘍キセノ グラフト腫瘍寸法の成長曲線を示す。各々１０匹の動物からなる３群の動物を研 究した：１）金曜、月曜、水曜、金曜、月曜、水曜、金曜（７回の投与）におけ る０.２ｍｌ腫瘍内注入量の¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160−200μＣｉ；２）同じ量および 組成を含有するが¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160を含まないシャム注入、並びに３）注入を 含まない対照。約４５日目に¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160動物を２つの群に分け、一方の ３匹の群は腫瘍成長を示しそして７匹の群が腫瘍の再成長を示した。 図２は図１に記載された通りにして処置された動物に関する生存時間、日数、 を示す。 図３は図１に記載された通りにして処置された動物の平均体重を示す。 図４は５連続日にわたり処置され、２週間の待機期間が続き、そして次に５日 間にわたる第二系統が続く動物に関する腫瘍成長、ｃｍ³、の比較研究からのデ ータを示す。この実験では、ＰＣ−３腫瘍のある裸のマウスを¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−1 60で処置し、それと比べて動物をＲｅ−ＲＣ−160、¹⁸⁸Ｒｅ−ＩＫＶＡＶ（ＳＥ Ｑ．ＩＤ Ｎｏ．１）、前立腺癌にも結合するぺプチド、並びに注入なしの対照 で処置した。各々の初期成長では１０匹の動物がおり、第二処置時には各群の動 物がを２つの副群に分け、一方の副群は処置を受けず、そして第二副群は¹⁸⁸Ｒ ｅ−ＲＣ−160を受けた。それ故、各群を第二処置の開始時に二分する。Ｙ軸の 右端部にある低い方の４本の線は全て¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160の第二処置を受ける副 群を表す。 図５は図４に記載されている群および副群に関する平均体重を示している。 図６は３種の処置処方からのデータを示しており、ここではＰＣ−３腫瘍異種 移植片を有する動物を２つの群に分け、一方は３系統の¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160を摂 取しそして他方は処置を受けなかった。この図は平均腫瘍容量、ｃｍ³、を示し ている。１２０日までに１匹だけの動物が「未処置群」に残っており、そして相 対的に軽い腫瘍負荷量を有しており、腫瘍容量における沈澱性小滴を生じた。 図７は図６に閏して示されている通りにして処置された動物に関する実際の生 存時間、日数、を示す。 図８ａおよび８ｂは人間血清アルブミンと混合しそしてヒトガンマグロブリン と混合して投与された¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160の２４時間における保持および生分配 を示す。 実施例 本発明の方法を使用すると、ソマトスタチン−誘導ペプチド類および結合され た放射性金属がインビボ診断および治療用途用に有用な物質を提供する。例えば テクネチウム−９９ｍ（^99mＴｃ）の如きガンマ−発生放射性同位体で標識化さ れる時には、そのようなぺプチド類は特定の細胞表面受容体−関連疾病または病 理学の診断造影用に使用することができる。アルファまたはベータ放出性放射性 同位体、例えばレニウム−１８６（¹⁸⁶Ｒｅ）またはレニウム−１８８（¹⁸⁸Ｒｅ ） で標識化された時には、そのようなペプチド類はソマトスタチン−受容体陽性癌 を含む特異的細胞表面受容体−関連疾病の療法用に使用することができる。 明細書および請求の範囲全体で使用されている「結合」、「結合性」、「錯体 」および「錯体形成」という語は全てのタイプの物理的および化学的結合、反応 、錯体生成、吸引、キレ−ト化などを包括することを意図する。 本発明のペプチド類は、 ａ）天然産出性であり、 ｂ）化学合成により製造され、 ｃ）組み換えＤＮＡ技術により製造され、 ｄ）比較的大きい分子の生化学または酵素断片化により製造され、 ｅ）ａ）〜ｄ）の組み合わせから生ずる方法により製造され、または ｆ）ペプチド類を製造するための他の手段により製造される ことができる。 好適な製造手段である化学合成法を使用することにより、天然には産出しない 種々のアミノ酸類を連鎖に沿って加えること、Ｎ−もしくはＣ−末端を改質して 、ペプチドのより長い寿命、改良された安定性および調合物、プロテアーゼ分解 に対する耐性などを与えることができる。 明細書および請求の範囲全体で使用されている「ペプチド」という語は２種も しくはそれ以上のアミノ酸類からなる構造を含むことを意図する。ほとんどの場 合、本発明のペプチド類は１００個より少ないアミノ酸類、そして好適には６０ 個より少ないアミノ酸類、そして最も好適には約６〜２０個のアミノ酸類を含む 。ペプチドの全部または一部を形成するアミノ酸類は天然産出アミノ酸類、その ようなアミノ酸の異性体および修飾体、非−蛋白質アミノ酸類、後翻訳修飾され たアミノ酸類、酵素により合成されたアミノ酸類、アミノ酸類を模するように設 計された構成または構造などであることができるため、「ペプチド」という語は 疑似ペプチド類およびペプチド模擬物質を含む。「ペプチド」という語はペプチ ドの二量体または多量体も含む。 ソマトスタチンおよびソマトスタチン−誘導ペプチド類には、配列Ｔｙｒ−Ｔ ｒｐ−Ｌｙｓ−ＶａＩ（ＳＥＱ.ＩＤ ＮＯ.２）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔ ｈ ｒ（ＳＥＱ.ＩＤ ＮＯ.３）などを含むペプチド類並びに最初の生物学的−機能 領域が両方のＬ−およびＤ−アミノ酸置換物質、および匹敵する生物学的機能領 域を生成するペプチド疑似物質および他のペプチド様構成を含んで構成されてい る疑似物が包含される。ソマトスタチン−誘導ペプチド類に関しては、既知のそ して規定されたソマトスタチン受容体の１つもしくはそれ以上と結合するペプチ ド配列であるため、生物学的−機能領域は機能的に規定されている。それ故、ソ マトスタチンおよびソマトスタチン−誘導ペプチド類には天然ソマトスタチン、 どの性質でもよいソマトスタチン−誘導ペプチド、ソマトスタチンの同族体また はソマトスタチン受容体に結合するペプチド類が包含される。 ここに示されている方法から生ずる生成物は医学的用途および獣医学的用途の 両者のために使用することができる。典型的には、この生成物は人間において使 用されるが、他の哺乳動物でも使用される。「患者」という語は哺乳動物対象を 示すことを意図しており、そしてそのようにして明細書および請求の範囲全体で 使用されている。本発明の主な適用は人間患者を包括するが、本発明は研究室、 農場、動物園、野生動物、ペットまたはスポーツ動物に適用できる。 ａ）例えば全身的化学療法後の少量の残存疾病を有する患者における救命療法 、ｂ）例えば全身的化学療法後に報告される完全応答（これに関しては最終的な 破壊割合は８０％に達する）に達する高い等級の腫瘍を有する患者、およびｃ） 例えば「化学的な塊の破壊」のための全身的化学療法での限定された工程回数後 の局所的強化療法、特に例えば５フルオロ−ウラシルの如き既知の放射敏感性を 有する試薬を用いる療法、を含む局部的療法が癌の管理における特に威力的な治 療選択であるような多くの臨床的症状がある。 同様に、局部的放射療法が特に魅力的な治療選択であると考えられるａ）多形 膠芽腫、ｂ）脾臓癌、およびｃ）結腸癌を含む多くの癌がある。多形膠芽腫は高 い死亡率を有しており有効な療法がわずかしかなく、そして一般的には脳の中の 単一節として発展する。脾臓癌はしばしば肝臓に転移し、そして局在化された部 位から発展する。同様に、結腸癌もしばしば肝臓に転移し、そして非常に限られ た数の主要部位で発生する。肝臓への転移は留置カテーテル設置後の動脈内投与 により化学療法剤を用いてますます処理されてきている。留置カテーテルは本発 明の放射療法ペプチド類の動脈内投与も可能にする。それ故、放射性標識化され た可溶性ソマトスタチン−誘導ペプチド類または放射性標識化された粒状のソマ トスタチン−誘導ペプチド類の動脈内投与を使用してもよい。 局部的放射療法が特に魅力的な治療選択であると考えられる癌の他に、動脈内 投与による関節炎の処置のための放射性標識化されたソマトスタチン−誘導ペプ チドの使用も将来性を示す。放射性医薬品としての¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160の使用は 、関節の寸法によるが一般的には１０ｍＣｉより少ない適用放射投与量で膝、踝 、腰、肩、肘、手首および指節骨の関節療法に特に適用可能であるはずである。 好適な方法では、ＲＣ−160ソマトスタチン−誘導ペプチド同族体は¹⁸⁸Ｒｅまた は¹⁸⁶Ｒｅのいずれかを用いてここにまたは他に記載されている方法により標識 化されて、放射性標識化された調合物のコロイド形態を生ずる。リウマチ様関節 炎患者をこのレニウム−標識化されたＲＣ−160で処置する。調合物を関節炎症 部位であることが知られている大きい関節の中に直接的に注入し、そこでコロイ ドが関節および周辺骨構造内に存在するであろう。¹⁸⁶Ｒｅ−ＲＣ−160は放射コ ロイドとして作用し、それにより放射活性を滑膜細胞に並置させそして滑膜細胞 により活性的に吸収させる。しかしながら、この作用の他に、生物学的に活性な ペプチド類（すなわち、ソマトスタチン配列）の存在が炎症のある関節のマトリ ックス内での炎症細胞の直接的な目標設定を可能にしそしてそれにより減じられ た合計放射活性負荷量でより有効な療法に寄与する。必要なら繰り返し投与を行 ってもよい。試剤の局在化、投与量、および他のパラメーターはガンマカメラ評 価により、または同様な手段により、¹⁸⁸Ｒｅまたは¹⁸⁶Ｒｅの照射を用いて、測 定できる。他の態様では、粒状または高度に可溶性のレニウム−標識化されたＲ Ｃ−160調合物を同様に投与してもよい。或いは、調合物を関節に通ずる血管中 に注入する。 明細書および請求の範囲全体にわたり使用されている「局所的に区画化された 」という語は規定できる器官または区画内に位置する癌腫瘍を含むことを意図す る。これには特定器官の腫瘍、例えば脳、前立腺、脾臓、肝臓、卵巣、結腸、肺 、または胸の癌、が包含されるが、それらに限定されない。これには、規定でき る区画内に位置する癌、例えばリンパ系統のまたは前立腺、脳、腹膜腔心臓ま たは胸郭内の癌が包含されるが、それらに限定されない。明細書および請求の範 囲全体にわたり使用されている「局所的な投与」という語は放射性標識化された ソマトスタチン−誘導ペプチドを局所的区画に分配させる投与方法を含むことを 意図する。この方法には、例えば癌の中への直接的な注入、癌を含有する区画中 への直接的な注入、および癌に直接的に通ずる動脈内への直接的な注入の如き注 入方法が包含される。それには、永久的もしくは一時的カテーテル、いずれかの 手段による巨丸剤分配、または水性組成物もしくは放射性標識化された粒状ソマ トスタチン−誘導ペプチド類を含む組成物を分配させる他の手段を利用する方法 も包含される。 コロイド状ソマトスタチン−誘導ペプチド類または微小塊状ソマトスタチン− 誘導ペプチド類としても記載できる放射性標識化された粒状ソマトスタチン−誘 導ペプチド類を治療用途のために使用することもできる。ある種のソマトスタチ ン−誘導ペプチド類を粒状形態のテクネチウムまたはレニウムで放射性標識化さ れそして粒状形態のまま放射性治療剤として使用することができる。特に、小動 脈の端部および毛管中に位置するのに十分な大きさの寸法の粒状ソマトスタチン −誘導ペプチドの動脈内注入を腫瘍への動脈供給において利用することができる 。この手段により、外部光線照射により得られるものより２０〜３０倍程度大き い高度に選択された動脈端部照射を分配することが理論的に可能になる。それ故 、粒状のソマトスタチン−誘導ペプチドは腫瘍中での放射ヌクリドの高度に選択 的な小動脈端部または局部的除去が可能になる。粒状形態によっては、粒状ソマ トスタチン−誘導ペプチドが腫瘍の部位にあるなら、ペプチドは遅い溶媒和工程 を受けることができる。溶媒和されたペプチドは次に腫瘍本体に浸透しそして腫 瘍自身の中で受容体に結合することができる。ペプチドの小さい寸法のために、 腫瘍の相対的に無血管である領域の高度に有効な浸透を可能にするはずであり、 未結合ペプチドは体から通常の浄化工程により急速に浄化されるはずである。 本発明のペプチド中で見られるような金属結合配列は、低い結合強度を有する ように選択される正に荷電され遷移金属イオン、例えばＺｎ、Ｃｕ、Ｓｎ、Ｃｏ 、またはＮｉなど、の添加により安定化してもよい。置換反応により、遷移金属 イオンはチオレートのＨイオンと置換する。亜鉛およびスズの２価イオンは特に 魅 力的であると考えられている。二硫化物架橋を減じそして金属結合配列を安定化 させるために、一部の遷移金属、例えばシスチン調合物、では特に有用なＳｎ（ II）、を同時に使用することができる。 正に荷電された遷移金属イオンをペプチド中に適当な緩衝液を含有する水溶液 の中に加え、その緩衝液は金属錯体形成剤または金属結合緩衝液としても作用す る。緩衝液はジカルボン酸類（酒石酸塩、フタル酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸 類（グリシン、ジ−グリシン、トリ−グリシン）、ホウ酸塩、グルコヘプトン酸 塩などからなっていてもよい。緩衝液成分を金属イオン用安定剤としておよび／ または例えば^99mＴｃの如き放射ヌクリド用転移剤もしくは配位子として使用す ることもできる。酸性条件における放射性標識化用には、典型的には５〜５０ｍ Ｍの酒石酸塩および５〜４０ｍＭフタル酸塩が約５〜約７のｐＨ値において使用 される。緩衝液はＮａＣｌ、マルトース、イノシトール、グルコヘプトン酸塩な どを含む多数の賦形剤および／または安定剤を含有していてもよい。 本発明のペプチドは医学的に有用な金属イオンと錯体形成される。医学的に有 用な金属イオンは放射活性であってよくそしてガンマ線、ベータ粒子、または電 子との衝突でガンマ線に転化される陽子を発生させることができる。医学的に有 用な金属イオンは常磁性または超磁性であってもよい。医学的に有用な金属イオ ンは蝦蟇シンチグラフィー、単一光子放出コンピューター処理両方、陽子放出ト モグラフィーまたは磁気共鳴造影を含む診断用造影工程で使用してもよい。 特に有用な金属イオンは元素２６−３０（Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ）、 ３３−３４（Ａｓ、Ｓｅ）、４２−５０（Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ 、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ）および７５−８５（Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ 、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ）からなる群に見られる。元素ＴｃおよびＲｅ の同位体が診断用造影および放射療法における使用に特に適用できる。同位体^{99 m} Ｔｃは診断用造影における使用に特に適用できる。同位体¹⁸⁶Ｒｅおよび¹⁸⁸Ｒ ｅは放射療法における使用に特に適用できる。診断または治療用途を有する他の 放射ヌクリド類には⁶² Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁹⁸ Ａｕ、¹⁹⁹Ａｕ、²⁰³Ｐｂ、²¹¹Ｐｂおよび²¹²Ｂｉが包含される。医学的に有用な 金 属イオンのタイプは特定の医学的用途に依存する。金属結合配列を安定化させる ために使用される正に荷電された遷移金属イオンより高い結合度を有するように 医学的に有用な金属イオンを選択する。^99mＴｃの場合には、ペプチド類をペプ チドへの添加前の過レニウム酸ナトリウムと反応させるか、或いはそして好適に はペプチドの存在下で還元剤で処置して比較的低い酸化状態を有するＴｃを発生 させる。同様に、¹⁸⁶Ｒｅおよび¹⁸⁸Ｒｅの場合には、ペプチド類をペプチドへの 添加前の過レニウム酸ナトリウムと反応させるか、或いはそして好適にはペプチ ドの存在下で還元剤で処置して比較的低い酸化状態を有するＲｅを発生させる。 全てのそのような場合には、金属イオンおよびペプチドの間の反応の生成物は金 属イオンおよびペプチドの錯体である。 ほとんどの第一スズ還元は約５〜約７のｐＨにおいて実施される。ペプチド７ より低い溶液中でのアミノ酸部位連鎖では、塩基性アミノ酸類は正に荷電され、 酸性アミノ酸類は大きく負に荷電され、アルコール性アミノ酸類は中性であり、 そしてメチオニンは中性である。還元されたレニウムまたはテクネチウム結合は ５〜７のｐＨ範囲において正に荷電された水素供与体よりむしろ中性の水素供与 体の方がより容易に結合する。Ｃｙｓは最適な結合部位候補である。放射性標識 化収率はｐＨに依存しており、そして理論的にはｐＫ.においてまたはその近く で最適である。 Peptide-Metal Ion Pharmaceutical Preparation and Methodの名称のZamora PO and Rhodes BAの米国特許第５,４４３,８１６号には、医薬品としてのペプチ ドをベースとした金属−イオン標識の付いた組成物が、放射性金属、常磁性金属 および他の医学的に有用な金属イオンを用いるペプチド類、蛋白質および他の同 様な物質の標識化方法と一緒に、教示されている。本発明は、生物学的機能領域 および医学的に有用な金属イオン結合領域を含有するペプチド類を種々の病理学 的状態の診断および処置における使用のために医学的に有用な金属イオンで標識 化できることも教示している。従って、この特許の教示は引用することにより本 発明の内容となる。 ソマトスタチン−誘導ペプチド類は二硫化物結合を含有する。この場合、一つ の方法は二硫化物結合の初期還元を含む。好適な方法では、下記の段階が使用さ れる： ａ）ペプチドを還元剤で培養して二硫化物結合の一部または全てをチオレート基 に還元し、 ｂ）過剰の還元剤をチオレート基を含有するペプチド基質から除去し、 ｃ）Ｓｎ（II）剤をチオレート−含有ペプチド調合物にＳｎ（II）−含有および 硫黄−含有錯体を生成するのに十分な量で加え、そして ｄ）医学的に有用な金属イオンを加え、それにより金属イオンがＳｎ（II）−含 有および硫黄−含有錯体中のＳｎ（II）を置換して金属イオン−含有および硫黄 −含有錯体を生成する。 段階の順序を変えてもよく、そしてその方法でも依然として金属イオン−標識 の付いたペプチド類を生成するであろう。従って、この方法はここに示された段 階の順序に限定されるものではない。特に、過剰の還元剤をペプチド基質から除 去する前にＳｎ（II）を加えてＳｎ（II）−含有および硫黄−含有錯体を生成す ることが可能でありそしてある場合には有利である。この方法で、チオレート基 の酸化または二硫化物結合の再生成および他の架橋結合が直ちに最少にされる。 Ｓｎ（II）の供給量は、過テクネチウム酸ナトリウム（ＴｃＯ₄）または過レ ニウム酸塩（ＲｅＯ₄）が金属イオンである場合には、過テクネチウム酸ナトリ ウムまたは過レニウム酸塩を所望するレドックス状態に還元するのに十分なもの でなければならない。以上の方法を過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウ ム酸塩用に使用する場合には、十分なＳｎ（II）を段階ｃ）に加えて金属イオン を還元しなければならず、放射性金属はその後の段階で加えられる。或いは、追 加のＳｎ（II）を金属イオンの導入の前または同時のいずれかの時間に加えても よい。例えば、過剰の還元剤をペプチド基質から除去する前にＳｎ（II）を加え てＳｎ（II）−含有およぴ硫黄−含有錯体を生成する場合には、追加のＳｎ（II ）が過剰の還元剤の除去後に加えられるであろう。同様に、Ｓｎ（II）を段階ａ ）における初期還元剤として使用しそして過剰のＳｎ（II）、第二スズおよび他 の不純物を除去する場合には、十分な追加量のＳｎ（II）を段階ｃ）においてま たは金属イオンの導入と同時にそして金属イオンを所望するレドックス状態に還 元するのに十分な量で加えるであろう。 多数の還元剤が記載されておりそして当技術の専門家に既知である。特に有用 なタイプの還元剤には２−メルカプトエタノール、１,４−ジチオスレィトール 、２,３−ジヒドロキシブタン−１,４−ジチオール、２−アミノエタンチオール ＨＣｌ、チオグリコレート、システイン、還元されたグタチオン、Ｎａ₂ＳＯ₃、 Ｓｎ（II）、Ｃｕ（Ｉ）およびＴｉ（II）が包含される。還元剤を溶質中に溶解 させてもよくまたは固相に結合していてもよい。固相に結合された還元剤は市販 されており、そしてそれらの使用方法は当技術の専門家に既知である。ペプチド がＳｎ（II）結合還元を必要とする程度はペプチドの性質およびその意図する医 学的用途に依存する。一般的に述べると、蛋白質または例えば抗体の如き複雑な ポリペプチド類中でのＳｎ（II）を減じるために必要なものより穏やかな還元条 件およびより短い培養期間が一般的に使用される。いずれの場合にも、還元はペ プチドの過度の断片化またはペプチドの生物学的機能の損失前に停止される。 一つの特定態様では、Ｓｎ（II）が還元剤として５ｍＭの濃度で使用される。 この態様では、Ｓｎ（II）を約１０ｍＭ酒石酸塩および４０ｍＭフタル酸塩から なるｐＨ５.５の緩衝液の中に溶解させ、そしてＳｎ（II）緩衝液をペプチド基 質と８３ｍｇ／ｍＬの濃度で混合する。還元反応をそのままある期間にわたり室 温で進行させ、単一二硫化物結合を含有するある種のペプチド類では３時間が成 功裡に使用され、その時間後にクロマトグラフィーにより過剰のＳｎ（II）イオ ンを除去することにより反応を停止させる。 Ｓｎ（II）またはある種の他の還元剤のどちらであっても、還元剤の除去は例 えば透析、限外濾過、正の圧力の膜濾過、沈澱、分取高性能液体クロマトグラフ ィー、親和クロマトグラフィー、他の形態のクロマトグラフィーおよび分取等電 点電気泳動の如き方法を含む種々の適当な手段により実施することができる。還 元剤の多くはチオール類を含有しており、それらが最終的な標識化混合物の中に 存在する場合には、医学的に有用な金属イオンと錯体形成できる。そのような錯 体はインビボ投与の場合には重篤で且つ未知の副作用を有することがある。さら に、ある種の還元剤は許容できないほどの毒性を示す。それ故、還元剤の除去は 還元度を所望するものに限定し且つ有毒なまたはそうでなくても望ましくない還 元剤の除去により標識化された調合物の有用性および安全性の増加の両者を与え る。 還元されたペプチド類の中のチオレ−ト基は高度に反応性でありそして相互反 応して二硫化物結合を再形成することができる。保護剤としてのＳｎ（II）の使 用は二硫化物の再形成を最少にすると信じられている。Ｓｎ（II）の原料には、 酒石酸第一スズ、グルコヘプトン酸第一スズ、グルコン酸第一スズ、ホスホン酸 第一スズ、塩化第一スズ、硫酸第一スズ、酢酸第一スズ、および弗化第一スズが 包含される。Ｓｎ（II）の原料の選択およびその最終的濃度はペプチドの意図す る医学的用途、ペプチドの性質、チオレート基の相対的および絶対的数並びに使 用する金属イオンに依存する。一つの態様では、酒石酸第一スズは１.２５ｍＭ の濃度で使用される。酒石酸第一スズはペプチドにペプチド−還元剤の除去後に 加えられる。酒石酸第一スズは１０ｍＭ酒石酸および４０ｍＭフタル酸からなる ｐＨ５６の緩衝液の中で製造され、そしてペプチドに加えられて１ｍｇ／ｍＬの ペプチド溶液の最終的濃度を生ずる。 第一スズおよび合計スズの濃度は使用する金属イオンに依存して変動する。例 えば、過レニウム酸塩を還元するためには過テクネチウム酸ナトリウムを還元す るよりかなり高い第一スズ濃度が要求される。比較的大きい容量のキットが使用 される場合には、全て約５〜６の間のｐＨにおいて、過レニウム酸塩の形態での¹⁸⁸ Ｒｅを約２.５〜１５ｍＭの間の第一スズを有するキットを用いて標識化して もよく、合計スズは対応して約１〜６ｍｇもしくはそれ以上の範囲である。一般 的に述べると、比較的低い第一スズ濃度キットは全ての利用できる過レニウム酸 塩を効果的に還元するためには例えば３０〜６０分間にわたる沸騰浴中での加熱 を必要とするが、高い合計スズキットは室温において培養され時に約１時間以内 に過レニウム酸塩を還元するのに十分な還元能力を有する。約１５ｍＭより上へ の第一スズ濃度の増加は還元能力に対する無視できるほどの影響を有しており、 そして比較的高い濃度ではそれは第一スズを溶液中に保つのがますます難しくな る。 別の方法では、ペプチドおよぴ金属イオンの両者中の二硫化物結合の両者の同 時還元を含む方法を使用することができる。この方法は、例えばレニウムの如き 金属イオンを異様する時には、過レニウム酸塩は過テクネチウム酸ナトリウムと 比べて実質的に大きい還元条件を必要とするため、特に有利である。好適な方法 では、下記の段階が使用される： ａ）ペプチドを二硫化物結合をチオレート基に還元させうる還元剤と混合し、そ して同時に金属イオンを所望するレドックス状態に還元し、 ｂ）例えば水性金属イオン調合物を凍結乾燥されたかまたは他の方法で乾燥され たかペプチドおよび還元剤の混合物に加えることにより、ペプチドの二硫化物結 合の還元およぴ金属イオンの同時還元が開始されるような方法で金属イオンを加 え、 ｃ）反応をそのまま進めて完了させ、それにより還元剤が二硫化物結合を還元し て、チオレートを含有するペプチドおよび金属イオンを生じ、そして金属イオン およびチオレートを含有するペプチドが金属イオン−含有および硫黄−含有ペプ チド錯体を生成する。Ｓｎ（II）または還元可能性を有する他の適する遷移金属 が還元剤として使用される場合には、二硫化物結合還元方法はＳｎ（II）−含有 および硫黄−含有ペプチド錯体を生ずるかもしれず、そして金属イオンがＳｎ（ II）−含有および硫黄−含有錯体中のＳｎ（II）を置換し、そして金属イオンお よびチオレート−含有ペプチドが金属イオン−含有および硫黄−含有ペプチド錯 体を生成する。 段階の順序は変えてもよく、そしてこの方法は依然として金属イオン−標識化 されたペプチド類を製造するであろう。従って、請求の範囲はここに示された段 階の順序に限定されるものではない。特に、Ｓｎ（II）を加える前に金属イオン をペプチドに加えることが可能でありそしてある種の場合には有利であるため、 段階ａ）およびｂ）が逆転される。調合物の酸化を避けることも望ましいため、 反応は本質的に酸素を含まない環境で起きる。これは部分的には、全ての溶液に 例えば窒素またはアルゴンの如き不活性気体をパージしそして全ての反応を不活 性気体雰囲気下で実施することにより行うことができる。 この方法を使用し且つ使用する放射標識により、使用する第一スズの量をかな り変えることができる。第一スズおよび合計スズの濃度は使用する金属イオンに 依存して変動する。例えば、過レニウム酸塩を還元するためには過テクネチウム 酸ナトリウムを還元するためよりかなり高い第一スズ濃度が必要である。過レニ ウム酸塩の形態の¹⁸⁸ Ｒｅを約２.５〜１５ｍＭの間の第一スズを有するキットを使用して標識化し てもよく、合計スズは対応して約１〜５ｍｇもしくはそれ以上の範囲であり、全 て約５〜６の間のｐＨにおける。一般的に述べると、比較的低い第一スズ濃度キ ットは全ての利用できる過レニウム酸塩を効果的に還元するためには例えば３０ 〜６０分間にわたる沸騰浴中での加熱を必要とするが、高い合計スズキットは室 温において培養され時に約１時間以内に過レニウム酸塩を還元するのに十分な還 元能力を有する。約１５ｍＭより上への第一スズ濃度の増加は還元能力に対する 無視できるほどの影響を有しており、そして比較的高い濃度ではそれは第一スズ を溶液中に保つのがますます難しくなる。 ¹⁸⁶Ｒｅまたは¹⁸⁸Ｒｅ標識化の両者に関しては、約１.２ｍｇの合計スズ濃度 に関して、約５ｍＭの酒石酸第一スズが２００μｇのペプチドと共に使用された 。同じ量のペプチドを^99mＴｃで標識化するためには、約０.５ｍＭの酒石酸第一 スズが使用された。調合物中のＳｎ（II）の量は、スズが溶液から沈澱するよう なＳｎ（II）濃度を有することなく、特定の反応条件下で金属イオンを所望する レドックス状態に完全に還元するのに十分なようなものでなけらばならない。沈 澱は大部分は適当な緩衝液の選択により調節することができる。Ｓｎ（II）の量 は反応条件に応じても変動し、例えば８０℃〜１００℃の範囲の温度で培養され る調合物では、培養を室温で行う培養より少ないＳｎ（II）が必要である。培養 時間も培養条件により、主として温度により、変動するが、ペプチドおよび他の 条件も培養時間に影響を与える。一般的に述べると、８０℃〜１００℃の範囲の 温度における培養は室温における培養はより実質的に短く、半分ないし１／１０ もしくはそれ以下の短さの培養時間を必要とする。 使用する方法とは関係なく、レニウム−標識化されたＲＣ−160の後−標識化 に対する高モル量アスコルビン酸の添加はキットの放射分解に対する耐性増加の 顕著な効果を有する。アスコルビン酸またはゲンチジン酸を組成物に加えるため の方法および技術は以下に詳細に記載されている。 以下でさらに詳細に記載されているペプチドであるソマトスタチン−誘導ペプ チドＲＣ−160と共に使用するまでに調合された一つのキットは２００μｇのペ プ チドおよび５ｍＭの第一スズ、すなわち１.２ｍｇの合計スズをｐＨ５.０で含有 していた。過レニウム酸塩の添加および９０℃での１時間にわたる加熱により標 識が付けられる時には、過レニウム塩還元および放射標識化は本質的に１００％ であった。合計コロイドは３％より少なく、そして未結合過レニウム塩も０.５ ％より少なかった。過レニウム酸塩としての反応器で製造された低い特異的活性¹⁸⁶ Ｒｅ（２.５〜５ｍＣｉ／μｇ）で標識化される時には、キットは匹敵する結 果を生成するのに十分な還元能力を有していた。 過テクネチウム酸ナトリウムで標識化するためには、０.２〜１ｍＭの間の第 一スズ、そして好適には０.５〜１ｍＭの第一スズを使用すことが可能であり、 合計スズは充填容量に依存して４０μｇ程度の低さである。 使用される方法とは関係なく、使用される第一スズの形態はある部分はキット 中で使用される緩衝液に依存する。例えば、酒石酸塩を錯体生成剤として含有す る緩衝液を有するキットでは酒石酸第一スズ塩の使用が望ましい。例えばＥＤＴ Ａを含有するキットの如き使用塩以外の錯体生成剤を含有するキットに関しては 塩化第一スズ二水和物を使用してもよい。一般的なベルト、全ての第一スズが濃 塩酸の中に加えられる。これはスズを第二スズイオンとしてのＳｎ（IV）状態よ りむしろ第一スズイオンとしてのＳｎ（II）酸化状態で維持することを好む。Ｓ ｎ（II）は例えば過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸塩の如き放射 性金属を効果的に還元するが、Ｓｎ（IV）はしない。第一スズイオンおよび第二 スズイオンの両者を含むスズの全てを確実に錯体生成するためには、錯体生成剤 は一般的に合計するためにはより２〜２０モル過剰で使用される。錯体生成され ていないスズは中性ｐＨにおいて容易に不溶性水酸化物を生成する。錯体生成剤 の不存在下では、ｐＨ５.５より上のコロイド状水酸化物種が水酸化物が沈澱す る前に生成するかもしれない。錯体生成剤はスズを加水分解反応から金属イオン 封鎖するが、スズがレドックス反応に入るのを妨害しない。第一スズ溶液のｐＨ 滴定はＥＤＴＡ>>クエン酸塩>>グルコヘプトン酸塩>>酒石酸塩>>リンゴ酸塩につ れて増加する錯体生成能力を示した。酒石酸第一スズはスズ：乾燥塩状の酒石酸 塩の１：１モル比として存在するが、経験的な証明は第一スズを中性ｐＨで安定 化させるためには最大２倍過剰の酒石酸塩が必要であることを示唆している。し か しながら、ＥＤＴＡ、クエン酸塩およびグルコヘプトン酸塩が全て第一スズを約 １：１モル比で中性ｐＨにおいて安定化させることができ、錯体生成剤：第一ス ズの１.２：１モル比の実際の調合物を満足のいくように利用することができる 。 使用される方法とは関係なく、高濃度のスズを適当な緩衝液の使用により安定 化させてもよい。例えば、５０〜１００ｍＭのジグリシンおよびトリグリシンの 如き金属結合緩衝液が中性ｐＨにおける高いミリモル濃度の安定性を増加させる ことができる。例えば、５０ｍＭのジグリシンまたはトリグリシンを含有する緩 衝液を例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩、グルコヘプトン酸塩または酒石酸塩の如き 適当な錯体生成剤と共に使用してスズを安定化させそして合計スズ濃度が５〜１ ０ｍＭの範囲である時に沈澱を防止することができる。適当な金属イオン緩衝液 はクエン酸塩および酒石酸塩、ポリアミノカルボン酸類、例えばＥＤＴＡ、ＤＴ ＰＡおよびＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ−２−アセトアミド−２− アミノエタンスルホン酸）、ＡＤＡ（Ｎ−２−アセトアミドイミノ−二酢酸）、 ビシン、トリシン、グリシルグリシン、トリグリセン、テトラグリシン、および ＭＥＳ（２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸）が包含される。例えば、４０ ｍＭフタル酸ＫＨおよび１０ｍＭ酒石酸Ｎａｋ中に５ｍＭ酒石酸第一スズを含ん でなる高いミリモル第一スズ溶液を、中性ｐＨおよびそれ以上において、例えば ８.２のｐＫａを有する例えばグリシルグリシンの如き第二の金属結合緩衝液の ５０〜１０ｍＭ濃度における添加により、安定化させることができる。一般的に 述べると、第一スズの溶解度は放射性標識化しようとする組成物のｐＨまたはそ の近くでｐＫａを有する第二の金属結合緩衝液の添加により増加させられる。例 えば、放射性標識化組成物が４.３のｐＫａを有する酒石酸塩を含有する場合お よび組成物を４.３とかなり異なるｐＨにおいて放射性標識化しようとする場合 には、放射標識を付けようとする組成物のｐＨまたはその近くでｐＫａを有する 第二の金属結合緩衝液の添加により増加したスズ錯体生成が生じたスズの安定性 および沈澱からの保護と共に得られる。 使用されるソマトスタチンペプチドにより、調合物および反応条件を変えなけ ればならない。例えば、ＲＣ−160またはＶａｐｒｅｏｔｉｄｅと称するソマト スタチン−誘導ペプチドを使用して作業が行われ、そしてそれはスイスのデビオ フ ァームＳ.Ａ.により供給された。ＲＣ−160は環式ソマトスタチン同族体であり 、それはソマトスタチン受容体２および５に結合すると報告されている（Oberg K:Treatment of neuroendocrine tumors．Cancer Treat．Rev．20:331-355，199 4）。このペプチドは構造式 を有する。ＲＣ−160は放射性標識化用にグルタミン酸塩および酢酸塩の両者と して使用される。ＲＣ−160は最初に^99mＴｃおよび¹⁸⁸Ｒｅを用いて二段階方法 により放射性標識化される。ペプチド二硫化物結合は第一スズイオンおよび第一 基質としての錯体生成剤の第一段階における酒石酸第一スズとしての存在下で加 熱することにより減じられる。^99mＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムまたは¹⁸⁸Ｒ ｅ過レニウム酸ナトリウムを次に加えそして沈澱をさらに加熱して第二段階で放 射性標識化をする。 放射性標識化中に、ＲＣ−160は溶液のｐＨにより可溶性形態からコロイド形 態への相転移を受ける。それ故、ｐＨ６またはそれ以上ではコロイドが生成する が、ｐＨ５.５またはそれ以下ではペプチドは可溶性のままである。コロイド物 質はＲＣ−160が溶液中に存在している時にのみ製造され、そして一部の他のペ プチドが使用される時またはペプチド類が全く使用されない時には起きない。コ ロイド状¹⁸⁸Ｒｅ−ＲＣ−160は１００℃への簡単な再加熱によりエタノール中に 溶解させることができる。このことは、コロイドが¹⁸⁸ＲｅおよびＲＣ−160を用 いるイオンの錯体生成から生じ、そしてスズ塩の沈澱からは生じない。ペプチド の溶解度減少はペプチドの負荷中和によるものであると信じられている。 キット酒石酸塩濃度を次にｐＨ５.０において１０ｍＭから５０ｍＭに高める 。これが１０：１酒石酸塩錯体生成剤：第二スズの最終的なキットモル比を与え る。元のキット緩衝液であるフタル酸水素カリウムを４０ｍＭから１０ｍＭに下 げた。ＨＰＬＣ分析により単一放射性標識化されたピークを生成するためにはフ タル酸塩がキット中で必要であることが観察された。この目的のためには比較的 低い１０ｍＭ濃度におけるフタル酸水素カリウムで十分であることが見いだされ るが、容易な凍結乾燥用には比較的高いガラス転移温度に影響を与える。マルト ースが 凍結乾燥賦形剤として加えられる。 使用される特定の製造方法とは関係なく、レニウム標識化されたＲＣ−160キ ット後標識化に対する高いモルのアスコルビン酸の添加はキットの放射分解耐性 増加の顕著な影響を有する。 標識化前のキット調合物中のアスコルビン酸の含有は、アスコルビン酸もその 後に加えられる場合でも、放射標識収率に対する重要な影響を有する。ソマトス タチン同族体ＲＣ−160を用いる還元されたレニウムとソマトスタチン同族体Ｒ Ｃ−160との標識化反応は一般的な酸化防止剤であるアスコルビン酸または亜硫 酸ナトリウムのいずれかの存在下で悪影響を受ける。 本発明は以下の実施例で更に説明するが、これらによって制限されるものでは ない。 実施例１−ジスルフィド結合を有するソマトスタチンペプチド類似体の放射性標 識 このペプチドはソマトスタチンの環状オクタペプチド類似体である。この分子 の生物学的機能部分は該分子のＰｈｅ-Ｄ-Ｔｒｐ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ部分に関係して いる。２つのシステイン残基間のジスルフィド架橋はＳｎ（II）還元剤を使用し て還元され、硫黄−スズコンプレックスが形成されると推定される。このペプチ ドはｐＨ4.4の酢酸塩緩衝液中で得られた。このペプチド含有溶液に10ｍＭ酒石 酸塩／40ｍＭフタル酸塩緩衝液、ｐＨ5.6（Ｐ/Ｔ緩衝液）を加え（１：１）てペ プチド500μｇ／mlを含有する溶液を得た。この溶液を、1.25ｍＭ酒石酸第一ス ズを含有するＰ／Ｔ緩衝液と混合し（１：１）、そして室温で少なくとも３時間 インキュベートした。次に、0.5ml分別物を個々のバイアル中に入れた。各キッ トはペプチド0.25mg、40ｍＭフタル酸塩、10ｍＭ酒石酸塩及び酒石酸第一スズ44 μｇを含有していた。溶液を全て使用前に窒素で浄化し、そして調製物を全て酸 素欠如雰囲気下にした。標識用キット中のペプチドは、過テクネチウム酸ナトリ ウム（米国薬局方）１〜２ｍＣｉを加えることによって^99mＴｃで標識し、そし て反応を30分間進行させた。 実施例２−ソマトスタチン誘導ペプチド放射性標識用キットの調製、標識化及び 評価 ３種のソマトスタチン誘導ペプチド、ＲＣ-160、オクトレオチド（octreotide ）及び（β-(2-ナフチル)-環状2,7-Ｄ-Ａｌａ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｄ-Ｔｒｐ-Ｌｙｓ -Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｔｈｒ-アミド）を放射性標識用キットとして調製した。ＲＣ-1 60はデビオファーム エスエー（Debiopharm ＳＡ）（スイス国ローザンヌ）によ って供給され、そしてオクトレオチドはサンドスタチン（Sandstatin）500（San doz、スイス）として得た。 ^99mＴｃ-標識用キット。^99mＴｃでの放射性標識化を意図したキットは0.4mlの 最終容量を有しており、ペプチド100μｇ、10ｍＭ酒石酸塩、40ｍＭフタル酸塩 （ｐＨ5.6）及び1.25ｍＭ酒石酸第一スズを含有していた。場合によっては、賦 形剤としてマルトース及びグリシン、例えば２％マルトース及び50ｍＭグリシン を使用した。キットは窒素雰囲気下で密封し、室温で４時間インキュベートし、 そしてその後−30℃で貯蔵した。放射性標識化のために、バイアルを解凍して室 温に温めそして過テクネチウム酸ナトリウム溶液を添加した。放射性標識化は全 て過テクネチウム酸ナトリウム溶液0.6ml（５〜15ｍＣｉ）を添加し、そして続 いてこの溶液を100℃で30分間加熱して開始した。 ＲＣ-160キットを調製するために、ペプチドを窒素で浄化した水に溶解して50 0μｇ／mlの濃度にした。このペプチド溶液に２倍濃度の緩衝液（ｐＨ5.6）を等 量加えた。混合した後、溶液を0.22ミクロンフィルターで１ml容量の琥珀色のバ イアル中に直接ろ過して各バイアルが0.4mlを含有するようにした。バイアルを 窒素雰囲気下で密封し、室温で４時間インキュベートしそして−30℃で凍結保存 した。 レニウム標識用キット。¹⁸⁸Ｒｅで使用される放射性標識用キットは典型的に は2.0mlの最終容量を有しており、20ｍＭ酒石酸塩及びフタル酸塩の緩衝液（ｐ Ｈ5.6）及び５ｍＭ酒石酸第一スズ（ｐＨ5.6）中に500μｇのペプチドを有して いた。これらのキットでは、賦形剤としてマルトースとグリシンを使用した。キ ットは凍結する前に室温で４時間インキュベートした。インキュベーション期間 中に白 色の綿状物がＲＣ-160キット中で形成したが、オクトレオチドキット中では形成 しなかった。綿状物はペプチドであり、そしてエタノール0.6mlを添加して溶解 することができた。放射性標識化は過レニウム酸塩溶液2.0mlを添加し、そして 続いてこの溶液を100℃で30分間加熱して開始した。放射性標識ペプチドを予め ろ過した20％ヒト血清アルブミンで希釈した。これらペプチドのアルブミン溶液 は、冷却しそして４℃で一夜貯蔵しても沈殿の徴候を示さなかった。 放射化学的評価。上記両ペプチドは容易に放射性標識され、^99mＴｃ及び¹⁸⁸Ｒ ｅ改変体では、ＴＬＣで測定したとき、95％以上の標識化効率であることが分か った。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣとしてＣ₁₈セプパク（Sep Paks）を使用する逆相ク ロマトグラフィーで、高い標識化効率が確認された。^99mＴｃ-ＲＣ-160及び^99m Ｔｃ-オクトレオチドは、移動相として生理食塩液を使用したときシリカ被覆Ｔ ＬＣ片（ＩＴＬＣ-ＳＧ）の原点に残り、そして移動相として85％エタノールを 使用したとき溶媒と共に最前部に又はその近くに移動した。この挙動は¹⁸⁸Ｒｅ- ＲＣ-160、¹⁸⁸Ｒｅ-オクトレオチド、¹³¹Ｉ-ＲＣ-160及び¹²⁵Ｉ-(Ｔｙｒ³)-オク トレオチドでも観察された。移動相として85％エタノールを使用したとき少量の^99m Ｔｃが原点に残り、そしてこれは^99mＴｃ-又は¹⁸⁸Ｒｅ-コロイドを表わして いると思われる。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160及び¹⁸⁸Ｒｅ-オクトレオチドのＴＬＣは放射 性金属の取込みが本質的に100％であり検出可能な放射性コロイドは形成されて いないことを示した。 Ｃ₁₈カラムを使用しアセトニトリルの連続傾斜で溶出しそしてカラム後放射性 同位体検出器で分析した分析用逆相ＨＰＬＣでは、空容量中に溶出する少量の非 結合^99mＴｃと、概ね25分で溶出する（流速度１ml／分）単一の大きな放射能の ピークしか示していない。クロマトグラフィー回収は95％以上であった。この分 析で使用した少量のペプチド（0.20μｇ）はＡ₂₈₀で効果的にモニターすること ができなかった。しかし乍ら、^99mＴｃ-ＲＣ-160、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160及び放射性 ヨウ素化ＲＣ-160は全て同一の時間及び位置で溶出した。 ^99mＴｃ-標識化。ＲＣ-160及びオクトレオチドは、ＴＬＣ及び逆相クロマトグ ラフイーで測定するとき、^99mＴｃで容易に且つ再現可能的に放射性標識された 。一連の時間試験で、ＲＣ-160か又はオクトレオチドの標識化は本質的に15分で 完了したので、更なる試験では30分の時間を選択した。放射性標識化を或る温度 範囲 （室温、37℃、70℃及び100℃）で実施し、そしてその後大部分の試験では100℃ 30分間の加熱を選択した。加熱によって、分析用ＨＰＬＣで測定されるように更 に均一な放射性標識生成物が得られた。この様式を使用すると、ＲＣ-160とオク トレオチドを共に５〜15ｍＣｉの^99mＴｃで定型的に放射性標識することができ 、取込みは95％以上であった。 ¹⁸⁸Ｒｅ-標識化。ＲＣ-160とオクトレオチドは¹⁸⁸Ｒｅでも放射性標識された 。しかし乍ら、後で添加される¹⁸⁸Ｒｅを還元するために第一スズイオンの量を 増加させなければならないことが分かった。幾つかの時間点に係わる動力学試験 及び逆相ＨＰＬＣによる分析に基づいて、^99mＴｃと同様に、30分の標識化時間 が最適であると決定された。この様式を使用すると、ＲＣ-160及びオクトレオチ ドは６〜８ｍＣｉの¹⁸⁸Ｒｅで放射性標識され、取込みは95％以上であった。 ５ｍＭ酒石酸第一スズ中室温で４時間ＲＣ-160を第一スズイオン中で予備イン キュベーションすると不溶性のペプチド誘導体が得られた。このような沈殿物は オクトレオチドでは形成されなかった。このような沈殿物は、１ｍＭの酒石酸第 一スズを使用してその後添加された^99mＴｃを還元する^99mＴｃ標識用キットでは 光学的に観察されなかった。初期混合物は清明でありそして初期処方後少なくと も１時間光学的に清明であったので、沈殿は時間依存性であった。 沈殿したＲＣ-160を30％エタノールで溶解し、そしてこの形態で^99mＴｃか又 は¹⁸⁸Ｒｅのどちらかを用いて放射性標識した。沈殿したペプチドは沈殿形態で^{9 9m} Ｔｃ又は¹⁸⁸Ｒｅを用いて放射性標識することもできたが、光学的に不溶性の ままであった。20％ヒト血清アルブミンで希釈（１：１）すると、更に冷却して もペプチドは溶液中に留まった。 実施例３−ジスルフィド結合と金属イオンの同時還元用標識用キットの調製 ソマトスタチン誘導ペプチドキットは上記したＲＣ-160ソマトスタチン類似体 を使用して処方した。レニウム標識用キットの最終的なキット処方は次のとおり であった： ＲＣ-160 200マイクログラム マルトース １％ 酒石酸ナトリウムカリウム 45ｍＭ フタル酸水素カリウム 10ｍＭ 酒石酸第一スズ ５ｍＭ 総スズ量 1,187マイクログラム ｐＨ 5.0 充填容量 2.0ml ^99mＴｃ標識用キットでは、これらのキットが0.5ｍＭ酒石酸第一スズしか含有 していないことを除いて、処方は同じであった。 上記処方物を５mlの血清バイアル中に分別して入れ、そして次にこれを直ちに アルゴン下で凍結乾燥器中に入れた。貯蔵温度は初期には０°から５℃の間であ り、そして凍結乾燥サイクルを開始する前に２時間−5O0Cに下げた。初期乾燥は −4O℃で16時間、続いて−10℃で４時間の貯蔵温度であり、そしてこれらの両方 で室圧力は０ミリトルに設定しそしてコンデンサ−温度は−55℃に設定した。二 次乾燥は35℃の貯蔵温度であり、その際乾燥室圧力は少なくとも８時間０ミリト ルに設定しそしてコンデンサ−温度は同一であった。次いで、乾燥室にアルゴン を逆充填し、キットに栓をし、そして０〜５℃で貯蔵した。 実施例４−ジスルフィド結合と金属イオンの同時還元用ソマトスタチンペプチド キットの放射性標識化 1,187mgのスズ総量を含有する実施例３のバイアル入りキットを、¹⁸⁸Ｒｅと^{18 6} Ｒｅの両方で標識した。¹⁸⁸Ｒｅで標識するために、オークリッジ国立研究所で 開発された実験的¹⁸⁸Ｗ／¹⁸⁸Ｒｅ発生器システムから得られる¹⁸⁸Ｒｅ過レニウ ム酸ナトリウムを使用し（Knapp FF Jr、Mirzahdeh S、Beets AL、Sharkey R、 Griffiths G，Juweid M及びGoldenberg DM:定型的な臨床適用用のキュリー目盛 りタングステン-188／レニウム発生器、Technetium and Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine中、M Nicolini、G Bandoli、U Mazzi（編集）；SG Edito riali、イタリア国パドーバ、1995年、319〜324頁）、そして注射用生理食塩液 で希釈して２mlのバイアル充填容量とした。次に、バイア ルを沸騰浴に60分間に入れ、そしてその後試験に付した。 ¹⁸⁶Ｒｅで標識するために、反応器生成¹⁸⁶Ｒｅをオークリッジ国立研究所から 取得し、そして所望のミリキュリー量を注射用生理食塩液で希釈して２mlのバイ アル充填量とした。次に、バイアルを沸騰浴に60分間入れ、そしてその後試験に 付した。 両キットについては、逆相ＨＰＬＣ分析で放射性標識ＲＣ-160ペプチドの単一 の放射性標識ピークが示される。放射性標識コロイドのパーセントは即時型薄層 シリカゲルクロマトグラフィー片で測定し、85％エタノール及び15％酢酸水、ｐ Ｈ3.5で展開し、コロイドのＲｆは0.0であり、そしてコロイドは５％未満である ことが示された。非結合レニウムのパーセントはシリカゲルで測定し、0.15Ｍ ＮａＣｌで展開し、Ｒｆ＝1.0であり、そして非結合レニウムは１％未満である ことが示された。親油性の放射性標識ＲＣ-160はエタノール及び酢酸中では溶媒 と共に最前部に移動しそして0.15Ｍ ＮａＣｌ中では原点に留まる。 システイン置換によってペプチド-金属結合強度を測定するために上記標識キ ットのシステインチャレンジを実施した。標識活性の50％を置換するために必要 なシステインのミリモル濃度はレニウム標識ＲＣ-160では40ｍＭシステインであ った。テクネチウム標識用キットは実施例３の方法に従って処方したが、特定さ れたようなより低いスズ含有量を有していた。テクネチウム標識用キットは、^{99 m} Ｔｃ過テクネチウム酸ナトリウムを使用して上記したようにして標識した。シ ステインチャレンジに付したとき、標識活性の50％を置換するためには５ｍＭの システインしか必要でなく、システインでチャレンジしたとき、レニウム標識Ｒ Ｃ-160では金属とペプチドの結合がテクネチウム標識ＲＣ-160より８倍強いこと が示された。 実施例５−動物モデルにおける腫瘍内注射の生体分布 正常及び異種移植片移植ヌードマウスで示された¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160又は^99mＴ ｃ-ＲＣ-160の血液からの急速なクリアランス（Ｔ 1/2＝２〜５分）は、静脈内 注射では放射性標識の低い絶対的取込みしか期待できないことを示した。動的画 像化技術、続いて連続静止画像化を使用して、^99mＴｃ-ＲＣ-160（¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ -160の代用品）の局部領域挙動を試験した。直接的な腫瘍内注射は12〜14時間の 生物学 的半減期をもたらし、一方ペプチドを有していない過テクネチウム酸ナトリウム 又は過レニウム酸塩は0.5〜１時間の生物学的半減期を有していた。^99mＴｃ-Ｒ Ｃ-160又は過テクネチウム酸ナトリウムを正常組織（筋肉）内に注射したとき、 生物学的半減期はそれぞれ0.5時間と５分であった。局部適用に使用できる洞内 注射は種々の保持時間を生じさせた。胸膜腔への注射は6.4時間の生物学的半減 期をもたらした。腹腔への注射は3.7時間の半減期をもたらした。 ヒト前立腺腫瘍を有する無胸腺マウスにおける腫瘍内注射による局部投与及び 生体分布。実施例２の方法によって調製したがペプチドを溶解するためにアルコ ールを添加しないで微粒子としてか又は実施例２の方法によって調製した溶解形 態で注射した¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の生体分布試験は、ヒト前立腺腫瘍細胞系ＰＣ3 から得られる異種移植片を有する無胸腺マウスで実施した。ＰＣ3は転移誘導で アンドロゲン非依存性のあまり分化していない前立腺腺癌細胞系であるので、実 験モデルは進行性ヒト癌のモデルである。 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を微粒子形態で注射したとき、注射後２時間目に、注射投与 量の30％近くが腫瘍内に留まり、一方溶解形態では概ね12％が腫瘍内に存在した 。放射能の残りの大部分は腸（胃、小腸及び大腸）中に見られ、肝臓による既知 の排泄経路と一致していた。肝臓は組織１グラム当たりの注射投与量の概ね４％ を有していた。膵臓及び脳を含む試験した他の臓器中には少量の放射能しか見ら れなかった。脾臓又は骨での取込みは殆どなかった。 注射後６時間までに、腫瘍内に未だ存在している材料の量は微粒子形態で概ね 30％そして溶解形態で10％であった。24時間までに、腫瘍内の量は微粒子及び可 溶性材料でそれぞれ約10％及び４％に減少していた。 腫瘍を有するマウスにおける陰性対照及び参照化合物の生体分布。¹⁸⁸Ｒｅ-過 レニウム酸塩（［ＲｅＯ₄］_-）及び¹⁸⁸Ｒｅ-メルカプトアセチル−トリグリシン （¹⁸⁸Ｒｅ-ＭＡＧ3）を使用して、腫瘍内への直接注射による¹⁸⁸Ｒｅの非特異的 腫瘍保持を評価した。注射６時間後に試験したとき、これら化合物はいずれもそ れ程には腫瘍に保持されていなかった。¹⁸⁸Ｒｅ-過レニウム酸塩の腫瘍内放射能 の量は0.49％Ｉ.Ｄ./ｇ±0.27％Ｉ.Ｄ./ｇ（Ｓ.Ｅ.、ｎ＝５）であり、一方腫瘍 内の¹⁸⁸Ｒｅ-ＭＡＧ3は0.05％Ｉ.Ｄ./ｇ±0.01％Ｉ.Ｄ.（Ｓ.Ｅ.、ｎ＝５）であ った。過レ ニウム酸塩の場合には、腎臓（クリアランス臓器）及び甲状腺だけが相当な量の 放射能を有していることが分かった。¹⁸⁸Ｒｅ-ＭＡＧ3の場合には、膵臓、腎臓 （排泄臓器）そしてより少ない程度であるが脾臓だけが取込みを示した。膵臓内 取込みは実験誤差の範囲内であると考えられた。Ｉ-131-ＲＣ-160を陽性対照参 照化合物として使用し、そして注射６時間後の生体分布は以下のとおりであり、¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160で観察されたものと一般的に類似していることが分かった:ａ ）かなりの量の放射能が腫瘍内に見られた(23.1％Ｉ.Ｄ./ｇ±10.4％Ｓ.Ｅ.、ｎ ＝５);ｂ）血液中の放射能の量は少なかった(0.8％Ｉ.Ｄ./ｇ±0.2％);ｃ）放射 性物質は肝臓から胃腸管までで除去されるように思われた;そしてｄ）放射能は 胃腸管及び甲状腺以外の臓器では殆ど見られなかった。 ソマトスタチン類似体のインビボ競合。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を非標識ソマトスタ チン類似体で置換できるかどうかを測定する実験を実施した。動物には痕跡量の¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160と非標識オクトレオチド又は非標識ＲＣ-160のどちらかを同時 に注射した。非標識材料は投与した¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の量に対して顕著に過剰な 量であり、そして非標識材料はｉ.ｐ.と腫瘍内注射の両方で投与した。注射後６ 時間目に腫瘍内で見られた放射能の値は、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の単独注射で得られ た値と比較して、オクトレオチドでは概ね80％、そしてＲＣ-160では70％減少し た。注射投与量／腫瘍組織グラムの平均パーセントは¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160単独で10 ％を超え、そしてオクトレオチドと共に投与した¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で1.9％±0.5 ％であり、そして非標識ＲＣ-160と共に投与した¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で3.0％±0.8 ％（Ｓ.Ｅ.、ｎ＝５）であった。生体分布の全体的なパターンは、腫瘍内に保持 された量を除いて、全ての処置で類似しており、明らかに胃腸管によって除去さ れそして他の臓器での蓄積は、あるとしても、僅かしかなかった。かくして、非 標識オクトレオチドと非標識ＲＣ-160は共に、インビボで同一のレセプター結合 部位について競合し、レセプターに基づく¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の結合を示している ように思われる。 実施例６−^99mＴｃ、¹⁸⁸Ｒｅ及び¹³¹Ｉで標識したソマトスタチン類似体ＲＣ-16 0及びオクトレオチドの比較生体分布 ソマトスタチン誘導ペプチド類似体オクトレオチド及びＲＣ-160は^99mＴｃ及 び¹⁸⁸ Ｒｅで直接標識化した後正常な動物で評価し、そして¹³¹Ｉで放射性標識した 同じペプチドと比較した。オクトレオチド及びＲＣ-160標識用キットは実施例２ の方法で調製しそして放射性標識した。放射性ヨウ素化はクロラミンＴを使用し て、70μｌのＰＢＳ中10μｇのペプチドを20μｌのＰＢＳ中10μｇのクロラミン Ｔ及び10μｌの¹³¹Ｉ又は¹²⁵Ｉ溶液と混合して実施した。ヨウ素化ペプチドをＣ₁₈ ミニカラムに適用しそして水で溶出して非結合ヨウ素を除去した。ヨウ素化ペ プチドをメタノールで溶出しそしてロータリーエバポレーターを用いて真空下で 乾燥した。乾燥した材料を、ＲＣ-160では30％エタノールを含有する水に、そし てオクトレオチドではリン酸緩衝食塩液に溶解した。インビボで使用するために 、放射性標識ペプチドは、予めろ過した20％ヒト血清アルブミンで１：１に希釈 した。このペプチドのアルブミン溶液は、冷却しそして４℃で一夜貯蔵しても沈 殿の徴候を示さなかった。 動的画像化試験。動的画像化試験は成熟雄ウイスターラットで実施した。動物 は、典型的には0.6mlのケタミン／ロンパン（Rompun）（1.4:0.2;ｖ：ｖ）の腹 腔内注射を使用して麻酔した。^99mＴｃと¹⁸⁸Ｒｅの試験では、動物を中位エネル ギーの高解像平面ガンマ線カメラの先端に背臥位に置いた。¹³¹Ｉ試験では、動 物を高エネルギーの平面ガンマ線カメラの先端に置いた。動物には0.1〜0.2mlの 試験材料を尾静脈に注射した。最初の２分間は30秒間隔で、そしてその後は２分 間隔で30分間画像を集めた。場合によっては、注射後２時間までの期間静止画像 （10分間の収集）を実施した。関係域（ＲＩＯ）方法を使用して、期間中の動物 全体及び選択臓器の放射能の量を評価した。成熟雄ラットにおける^99mＴｃ-ＲＣ -160の動的画像化試験によって肝臓への急速なクリアランスと10分後の胃への取 込みが明らかになった。他の臓器は取込みやクリアランスに関係していないよう に思われた。甲状腺取込みは認められず、そしてまた腎臓や膀胱では僅かな取込 み以上のものは観察されなかった。試験後の動物の解剖で胃への取込みが確認さ れた。活性の大部分は胃内容物中に存在していた。胃組織の活性の殆どは胃後部 に見られた。血液プールの代表としての心臓／肺の関係域の評価で二相血液クリ アランスが示された。注射後30分までは、血液クリアランスは明らかにクリアラ ンス曲線の二次的部分であった。これは、主として肝臓／腸に除去されるが腎臓 ／ 膀胱にも除去される^99mＴｃ-オクトレオチドのクリアランスと対照的であった。 ¹³¹Ｉ-ＲＣ-160の動的画像化でも肝臓への急速なクリアランスそしてその後の 胃へのクリアランスが明らかになった。クリアランスの全体的なパターンは ^99m Ｔｃ-ＲＣ-160で観察されたものと本質的に同一であった。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の 動的画像化で肝臓への急速なクリアランスが明らかになったが、これは^99mＴｃ- 及び¹³¹Ｉ-標識ＲＣ-160とは異なって腸に除去された。24時間後の反復画像化で 残存活性は殆どないことが明らかになり、そして骨又は他の組織での蓄積はなか った。30分までに、放射能は殆ど血液及び肝臓から除去されておりそして小腸中 で見ることができた。この全体的なクリアランスパターンは、肝臓にも除去され た¹⁸⁸Ｒｅ-オクトレオチドと本質的に同一であった。 マウスにおける生体分布試験。生体分布試験は成熟雌ＮＭＲＩマウス（概ね25 ｇ）で、尾静脈への注射後選択した時間（15及び120分）に実施した。各実験群 は少なくとも５匹の動物からなっており、各動物には概ね４μＣｉを含有する0. 2mlを投与した。動物はエーテルを過剰投与して屠殺し、そして選択した臓器を 切除し、重量を測定しそして関連放射能を測定した。データは、^99mＴｃ-標識調 製物用に特別に設計したコンピュータープログラムを使用して分析した。血液、 骨及び筋肉について臓器当たりの投与量パーセントは、これらの組織では総体重 のそれぞれ７、8.2及び40％と推定して計算した。これら試験の幾つかでは、結 果を30ｇの総体重に標準化した。動的画像化で得られた全体的な観察を使用して 比較生体分布試験の時間点を選択した。種々の放射性標識ペプチド調製物の生体 分布は注射後15分及び120分目に正常マウスで評価した。これらの結果は正常ラ ットにおける動的画像化技術で立証された。^99mＴｃ-ＲＣ-160は血液から肝臓へ そしてその後腸へ急速に除去された。胃を除いて、他の臓器はどれも取込み又は クリアランスに顕著に関与しているようには思われなかった。これは、肝臓へそ してその後腸へ除去されたが腎臓へも除去された^99mＴｃ-オクトレオチドのクリ アランスと対照的であった。^99mＴｃ-ＲＣ-160は^99mＴｃ-オクトレオチドより速 く血液から除去された。¹⁸⁸Ｒｅ-オクトレオチドと¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の生体分布 は互いに、これらの^99mＴｃ-標識対応物の生体分布よりはるかに類似しており、 肝臓へそしてその後腸へかなり除去されそして腎臓での蓄積は少なかった。¹⁸⁸ Ｒｅ-オクトレオチドの腎 臓取込みは¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160より顕著に高かった。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160は¹⁸⁸Ｒｅ- オクトレオチドより緩慢に除去されたが、¹⁸⁸Ｒｅ-標識類似体は共に注射後15分 目と120分目の両方で、より高い血液関連放射能の量を示した（^99mＴｃ-類似体 と比較したとき）。 実施例７−ヌードマウスにおけるヒト小細胞肺癌の¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160による胸内 放射線療法 臨床状態を模擬するヒト小細胞肺癌の実験モデルにおける¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の 治療的効果を評価した。実験モデルで、ヒト小細胞肺癌細胞系ＮＣＩ-Ｈ69細胞 から得られた細胞を無胸腺マウス及びラットの胸腔内に接種した。続いて、その 後の腫瘍増殖に対する効果である¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の生体分布をモニターした。 細胞系ＮＣＩ-Ｈ69はヒト小細胞肺癌から誘導されそして実験的な治療用放射性 医薬品と一緒に使用されてきた。ヌードマウスでは、ＲＣ-160を含む非標識ソマ トスタチン類似体を用いて病変内処置したとき、ＮＣＩ-Ｈ69腫瘍は腫瘍容積の 減少を示した(Pinski J、Schally AV、Halmos G、Szepenazi K、Groot K、O'Byr ne K，Cai RZ：ヌードマウスにおけるヒト小細胞及び非小細胞肺癌の増殖に与え るソマトスタチン類似体ＲＣ-160及びボンベシン／ガストリン放出ペプチドアン タゴニストの効果、Br J Cancer 70:886〜892、1994年)。この細胞系は、皮下に 移植するか又は胸腔若しくは肺実質内に導入したとき、腫瘍を生じさせる。 ペプチドの標識化。ＲＣ-160は古典的な合成法で合成されそしてデビオファー ムＳ.Ａ.（スイス国ローザンヌ）によって供給され、そしてＲＣ-160放射性標識 用キットは６ml容量の琥珀色バイアル中で調製されそして2.0mlの最終容量を有 していた。各キットは酒石酸塩／フタル酸塩緩衝液、ｐＨ5.2中に500μｇのペプ チドを含有しており、過レニウム酸塩を還元するために酒石酸第一スズを賦形剤 と一緒に含有していた。キットは全て、窒素で浄化した溶液を使用して調製しそ して頂部空間の気体も同様に窒素ガスで追い出した。バイアルは−30℃で凍結貯 蔵した。標識するために、¹⁸⁸Ｒｅ-過レニウム酸塩溶液（15〜20ｍＣｉ）2.0ml を添加し（４mlの最終的な標識用容量）そしてバイアルは、定期的に混合し乍ら 80℃〜 90℃で30分間加熱した。インキュベーション期間終了時に、溶液を僅かに冷却し そして分別物を放射化学分析用に取り出した。動物で使用する前に、分別物を20 ％ヒト血清アルブミン（臨床用等級）と１：１で混合した。 生体分布試験。生体分布試験は成熟雌ｎｕ/ｎｕマウスで、胸膜腔内に注射し た後選択した時間で実施した。各実験群は少なくとも５匹の動物からなっており 、各動物には概ね４μＣｉを含有する0.1mlを投与した。動物はエーテルを過剰 投与して屠殺し、そして選択した臓器を切除し、重量を測定しそして関連放射能 を測定した。データは組織１グラム当たりの投与量パーセントとして計算したが 、場合によってはデータを臓器当たりの投与量パーセントとしても計算した。４ 時間後、放射能の顕著な蓄積が肺、心臓、腸及び胸壁に関連して見られた。胸腔 の１ml洗浄液（臓器を取り出す前の）は総注射投与量の５％近くを回収した。肝 臓及び腎臓に関係していた放射能の量はより少なかった。24時間後、顕著な蓄積 が胸壁、心臓及び胸腔洗浄液に関連して見られたが、肺は最も高い注射投与量／ グラムのパーセントを保持していた。比較は、胸腔にＮＣＩ-Ｈ69細胞を接種さ れていた動物の胸腔に関連した¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の量を、腫瘍細胞を接種されな かった動物で見られた量と比較して行った。腫瘍形成動物は、特に24時間後に顕 著により高い保持を有していた。 腫瘍に対する効果。これらの試験では、血清不含ＲＰＭＩ培地中５〜7.5×10⁶ 個のＮＣＩ-Ｈ69細胞を動物に接種した。細胞は26ゲージの針を用いて肝臓の腹 側中線位置からそして肋骨下に注射して導入した。試験材料（ＲＣ-160及び¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160）も同様にして、肝臓の腹側中線位置からそして肋骨下に26ゲー ジの針を用いて胸膜腔に注射した。各注射は0.1mlの容量中に概ね５μｇのペプ チドを含有しておりそして放射性投与量（使用したとき）は200μＣｉであった 。初期試験では、動物は次のとおりであった:ａ）１日目及び５日目に200μＣｉ 投与量の¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で処置するか、又はｂ）処置しなかった。28日後に、 動物を麻酔しそして胸腔を試験した。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で処置した群では、８／ 10匹の動物で腫瘍の徴候は見られず、一方２／10匹の動物は最小限の疾病を有し ていた。処置しなかった群では、７／７匹が胸腔に限定された局部疾病を示した 。全ての場合に、目に見える腫瘍負荷は少なかった。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の同様な 投与量法を投与した 「正常」動物では全体的な肺形態学の変化は観察されなかった。 第２の試験では、動物は次のとおりであった:ａ）14、17及び25日目に¹⁸⁸Ｒｅ -ＲＣ-160で処置するか、ｂ）ＲＣ-160単独で処置する（同じ日にそして同じペ プチド量で）か、又はｃ）処置しなかった。結果は次の表で示す： 表１：胸腔に5.0×10⁵個のＮＣＩ-Ｈ69小細胞肺癌細胞を接種して２週間後に開 始した無胸腺マウスの胸内処置の効果。各「Ｘ」は個々の動物の応答を記し、そ して「−」はこの応答を示す動物が観察されなかったことを示す。 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 ＲＣ-160 無し 腫瘍の徴候なし XXXXXX − − 最小限の腫瘍負荷 XXX X X 限定された腫瘍負荷 X XXXX XXXXXX 広範囲の腫瘍負荷 − XXX XXX ＲＣ-160及び¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で処置した動物は処置後に体重の初期減少を示し た。この体重減少は時間とともになくなるように思われる。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で 処置した動物群では、腫瘍細胞の初期接種後48日目に５／５匹の動物で腫瘍又は 最小限の腫瘍負荷の徴候は全く見られなかった。他方、ＲＣ-160だけで処置した ３／３匹の動物は腫瘍を有しており、そして処置を受けなかった５／５匹の動物 は腫瘍を有していた。これらの試験では、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を使用して胸膜腔に 投与すると、抗腫瘍応答が観察された。ＲＣ-160を使用した結果との比較によっ てこの治療的応答が¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160によるものであって、ペプチド単独による ものでないことが示される。一時的な体重減少は目視できる唯一の処置徴候であ った。 実施例８−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドによる長期動物治療法試験 一連の実験を実施し、実施例３の方法で調製しそして実施例４の方法で標識し た¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を多様な製剤と比較し、そしてまたヒト腫瘍異種移植片を移 植 したヌードマウスの生存試験も実施した。これらの試験では、無胸腺マウス内で ＰＣ-3腫瘍を使用し、腫瘍が0.1から0.2cm³の容積を有していたときに処置を開 始した。 初期試験。初期試験ではＰＣ-3ヒト前立腺腫瘍を移植したヌードマウスの¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160による処置を評価した。腫瘍細胞を移植して19日後に、処置を開 始した。各10匹の動物の３つの群を試験した:１）金、月、水、金、月、水、金 曜日に0.2ml中200μＣｉの¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を腫瘍内に注射（７回の投与量）; ２）同一容量及び組成を有しているが、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を含有していない模擬 薬（sham）の注射;並びに３）注射を投与しない対照。腫瘍は１週間に３回65日 間、そしてその後１週間に１回測定し、そして動物は１週間に１回体重を測定し た。生存は、実験が終了した109日まで記録した。この時点で模擬薬処置動物は 全て死亡していた。 増殖曲線は図１に示す。処置群では、腫瘍は全て増殖を停止しそして処置開始 前の大きさに縮小した。腫瘍細胞はマトリゲル（Matrigel）と共に同時注射した ので、たとえ腫瘍が死亡したとしても、残存繊維状パッドは残った。対照的に、 模擬薬群と陰性対照群の両群の動物は全て増殖し続けた。模擬薬処置動物は最も 大きい腫瘍サイズを示した。処置動物のなかには、処置後約10日目に腫瘍が再度 増殖し始めたものもいた。処置法後20日までに、再増殖腫瘍は明らかにより大き くなりそして外観が異なっていた。増殖中の腫瘍は着色し、目に見えるようにな りそして皮膚を引き伸ばした。死亡又は不活性の腫瘍は白色で無血管性であり、 そして期間中外観の変化を示さない。10日のうちに再増殖を開始しなかった一見 して死亡又は不活性の腫瘍は実験終了まで変化しなかった。 処置群では、３匹の動物（30％）が治癒し、処置終了後２ヵ月目に腫瘍増殖な しと定義された。処置群の他の３匹の動物は処置後約10日目に腫瘍再増殖の開始 を示した。実験終了時に、模擬薬を注射した動物は全て死亡していた。殆どの場 合に、腫瘍は動物の身体の残りの部分と同様に嵩が大きくなっていた。動物によ っては転移性疾病を経験した動物もいた。非処置動物のうち３匹は生存しており 、２匹は動物が間もなく死亡することを示す非常に嵩のある腫瘍を有しており、 そして１匹は、一層緩慢に増殖している一層小さい腫瘍を有していた。処置群の ６ 匹の動物は生存しており、３匹は増殖中の腫瘍を有しており、そして３匹には腫 瘍の再増殖はなかった。図２参照。 図３は、３つの動物群の平均体重を示す。処置した動物は平均約６グラム又は 約20％の体重が減少した。これら動物は処置後約２週間で元の体重に回復した。 この体重減少は処置期間中の食物消費の減少と関係があった。実験終了時に、生 存処置群は、平均して、非処置生存動物より約120％重かった。処置群の１匹の 動物が腫瘍周辺に腫脹を示しそして処置群の別の１匹の動物が皮膚の放射線火傷 を幾らか示したことを除くと、体重減少と食欲減退が、観察された唯一の副作用 であった。これらの動物は共に再増殖しない腫瘍を有しており、そして実験終了 時に健康であった。ヒト前立腺腫瘍の増殖中の移植片、ＰＣ-3を有するヌードマ ウスの治療は、各200μＣｉの¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の７回注射シリーズで成功した 。動物は全て腫瘍が退化し、100％の治療応答率が得られた。腫瘍の再増殖は処 置動物のうちの７匹で生起し、そしてこれは処置後約10日目に始まった。30％は 治療後２ヵ月間腫瘍を有していなかった。 比較試験。腫瘍退化後の再増殖が、１日置きに200μＣｉの７回処置シリーズ を使用した動物の70％で観察されたので、修正治療計画を採用した。この計画で は、１シリーズ投与量の連続５日間投与、続く２週間の待機期間、そしてその後 ２回目の投与量シリーズの５日間という治療スケジュールを使用した。この実験 ではＰＣ-3腫瘍移植片を有するヌードマウスを¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で処置し、ＲＣ -160、¹⁸⁸Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ（配列識別番号１）（このペプチドも前立腺癌と結合 する）で処置した動物及び注射をしない対照と比較した。ＰＣ-3腫瘍を一連の40 匹のヌードマウスに移植して、10匹の動物の４つの群とした。腫瘍が処置開始に 十分なほど確立されたとき、動物を１週間毎日処置した。２週間の回復期間後、 上記４つの各群の動物の半分を以下に示すようにして再度毎日処置した。 処置計画 群 １回目の処置 ２回目の処置 １ａ 注射なし対照 なし １ｂ 注射なし対照 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 ２ａ ＲＣ-160 なし ２ｂ ＲＣ-160 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 ３ａ ¹⁸⁸Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ(配列識別番号１) なし ３ｂ ¹⁸⁸Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ(配列識別番号１) ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 ４ａ ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 なし ４ｂ ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 このプロトコールを使用すると、２回の連続処置を受けた群では治癒率が30％ から80％になったので、腫瘍は以前の実験より効果的に処置された。しかし乍ら 、２回目の処置だけを受けた群も80％の治癒率を示した。¹⁸⁸Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ（ 配列識別番号１）による処置と同様に、ＲＣ-160単独で処置しても治癒は全くも たらされず、生物学的効果をもたらすのはＲＣ-160と¹⁸⁸Ｒｅの組合せであるこ とを示していた。 処置結果 １回目の処置 ２回目の処置 治癒パーセント （４週間後の再増殖なし） 注射なし対照 なし 0％ 注射なし対照 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 80％ ＲＣ-160 なし 0％ ＲＣ-160 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 40％¹⁸⁸ Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ なし 0％ （配列識別番号１）¹⁸⁸ Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 40％ （配列識別番号１）¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160 なし 0％¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 80％ 腫瘍増殖は１回目の処置によって顕著に減少した。この差異は統計的には有意で なかったが、ＲＣ-160の腫瘍が対照より速く増殖するように思われたことを観察 したのは驚くべきことであった。この観察は、ＲＣ-160は投与されている間に腫 瘍増殖を緩慢にするか又は退行させるというものであった。しかしこれらの腫瘍 が再増殖を開始したときには、それらは以下に示されるように、対照より速く増 殖するように思われる： １回目の処置の２週間後の腫瘍の大きさ 群 平均腫瘍容積、cm³ ｐ値 ＲＣ-160 0.556 0.0010 注射なし対照 0.419 0.0224¹⁸⁸ Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ 0.315 0.14 （配列識別番号１）¹⁸⁸ Ｒｅ-ＲＣ-160 0.120 処置効果をより良く理解するために、個々の腫瘍の増殖曲線を分析した。処置 をしないと、腫瘍サイズは増加し続けた。約25日後、３匹の動物の腫瘍は加速速 度で増殖し始め、一方他の動物は概ね同じ速度で増殖し続けた。動物は処置中に 体重が減少する。動物はこの期間中あまり食べないことが観察される。動物の体 重は処置後正常に戻り、そしてその後動物は成長し続ける。対照では、動物の体 重測定によって腫瘍が大きくなっていると誤解させられる。場合によっては、動 物の腫瘍が大きくなればなるほど、動物は明らかに体重が減少している。測定さ れる体重は増殖している腫瘍と縮小している身体の合計である。ＲＣ-160単独で 処置した動物のなかには、実験開始の約３週間後に始まる腫瘍増殖加速現象が観 察されたものもあった。これは、¹⁸⁸Ｒｅ-ＩＫＶＡＶ（配列識別番号１）を投与 した動物のなかには観察されたものもいたが、１〜３週間遅れた。 ¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160は処置中に若干の体重減少をもたらし、そしてこれはその後 の３週間で元に戻った。図４及び図５参照。動物を２回目に処置したとき、体重 減少は一層劇的であった。しかし乍ら、回復は急速で、約２週間である。¹⁸⁸Ｒ ｅ-ＩＫＶＡＶ（配列識別番号１）処置も処置中に体重減少を引き起こした。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160は、腫瘍中にこの物質を直接注射された動物の腫瘍の縮小に 非常に有効である。全ての場合に、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160で処置した動物の腫瘍はサ イズが小さくなり、そして２回連続処置したとき80％は再増殖しなかった。これ らの動物では明らかに癌が治癒していた。¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160はＲＣ-160単独か又 は異なるペプチドと組み合わせた¹⁸⁸Ｒｅのどちらよりも有効であった。 ３回処置法。追加実験を実施して、ＰＣ-3腫瘍異種移植片を有する各12匹のマ ウスの２つの群を比較した。１つの群には処置をせず、そして対照として使用し た。もう１つの群には３回の処置シリーズを用いて直接腫瘍内注射として¹⁸⁸Ｒ ｅ-ＲＣ-160を投与した;１回目の処置は連続５日間、それに続く処置をしない17 日間であり、２回目の処置シリーズは連続３日間、それに続く処置をしない31日 間であり、そして連続３日間の３回目の処置シリーズで終了した。図７は腫瘍増 殖を示す;処置をしなかった動物は腫瘍増殖の継続を示し、一方処置した動物は 処置後に腫瘍容積の退化を示した。図６に示されるように、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を 投与した動物は全て実験開始後120日間生存した。処置なし対照では１匹を除い て全ての動物がこの日までに死亡していた。 ¹⁸⁶Ｒｅと¹⁸⁸Ｒｅの比較。別の試験では、反応器生成¹⁸⁶Ｒｅで標識したＲＣ- 160の使用を反応器生成¹⁸⁸Ｒｅと比較した。動物は全て上記したＰＣ-3腫瘍異種 移植片を有しており、そして同じμＣｉ量の¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160か又は¹⁸⁶Ｒｅ-Ｒ Ｃ-160のどちらかで処置し、処置を与えない動物を対照として使用した。腫瘍退 化は¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160と¹⁸⁶Ｒｅ-ＲＣ-160の両方で観察された。 実施例９−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの局部投与によるヒト多形 性膠芽腫の治療法 オクトレオチド、ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体、又は他のソマ トスタチン誘導ペプチド類似体のいずれかを実施例２、３又は４の方法によって¹⁸⁸ Ｒｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどちらかで標識する。多形性膠芽腫患者にレニウム標識 ソマトスタチン誘導ペプチドを、超音波、ＣＴスキャン又は他の画像化様式を使 用して腫瘍部位に直接注射して脳内の癌に局在化させる。必要により投与量を反 復投与する。薬剤の局在化、投与量決定及び他のパラメーターは、¹⁸⁸Ｒｅ又は^{1 86} Ｒｅ のガンマ線を使用して、ガンマ線カメラ評価又は同様な手段によって決定するこ とができる。任意に、レニウム標識治療投与量を投与する前に、ソマトスタチン レセプターが腫瘍に十分に存在しているかどうかを決定するために、インジウム 又はテクネチウム標識のどちらかを使用して、画像化投与量を投与して治療法の 有効性を予測することができる。このような画像化投与量は治療法で使用される ものと同じソマトスタチン誘導ペプチド類似体であるか又は同じソマトスタチン レセプターに結合することが証明されている別の類似体であることができる。^{99 m} Ｔｃ標識ペプチドに関しては、これは実施例１、２、３又は４の方法で標識す ることができる。或いは、¹¹¹Ｉｎ-ＤＴＰＡ-オクトレオチドのような市販で入 手可能な製品を使用することができる。 実施例１０−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの局部投与によるヒト前 立腺癌の治療法 オクトレオチド、ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体、又は他のソマ トスタチン誘導ペプチド類似体のいずれかを実施例２、３又は４の方法によって¹⁸⁸ Ｒｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどちらかで標識する。局在性前立腺癌患者にレニウム標 識ソマトスタチン誘導ペプチドを、任意に超音波、ＣＴスキャン又は他の画像化 様式を使用して腫瘍部位に直接注射して前立腺内の癌に局在化させる。必要によ り投与量を反復投与する。薬剤の局在化、投与量決定及び他のパラメーターは、¹⁸⁸ Ｒｅ又は¹⁸⁶Ｒｅのガンマ線を使用して、ガンマ線カメラ評価又は同様な手段 によって決定することができる。代替法では、このような薬剤は予防手段として か又は疾病再発の徴候、例えば前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）値の増加に応答して 外科手術後の前立腺筋膜内に局部的に注射することができる。任意に、レニウム 標識治療投与量を投与する前に、ソマトスタチンレセプターが腫瘍に十分に存在 しているかどうかを決定するために、インジウム又はテクネチウム標識のどちら かを使用して、画像化投与量を投与して治療法の有効性を予測することができる 。このような画像化投与量は治療法で使用されるものと同じソマトスタチン誘導 ペプチド類似体であるか又は同じソマトスタチンレセプターに結合することが証 明されている別の類似体であることができる。^99mＴｃ標識ペプチドに関しては 、これ は実施例１、２、３又は４の方法で標識することができる。或いは、¹¹¹Ｉｎ-Ｄ ＴＰＡ-オクトレオチドのような市販で入手可能な製品を使用することができる 。 実施例１１−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの局部投与によるヒト膵 臓癌の治療法 オクトレオチド、ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体、又は他のソマ トスタチン誘導ペプチド類似体のいずれかを実施例２、３又は４の方法によって¹⁸⁸ Ｒｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどちらかで標識する。局在性膵臓癌患者にレニウム標識 ソマトスタチン誘導ペプチドを、任意に超音波、ＣＴスキャン又は他の画像化様 式を使用して腫瘍部位に直接注射して膵臓内の癌に局在化させる。必要により投 与量を反復投与する。薬剤の局在化、投与量決定及び他のパラメーターは、¹⁸⁸ Ｒｅ又は¹⁸⁶Ｒｅのガンマ線を使用して、ガンマ線カメラ評価又は同様な手段に よって決定することができる。任意に、レニウム標識治療投与量を投与する前に 、ソマトスタチンレセプターが腫瘍に十分に存在しているかどうかを決定するた めに、インジウム又はテクネチウム標識のどちらかを使用して、画像化投与量を 投与して治療法の有効性を予測することができる。このような画像化投与量は治 療法で使用されるものと同じソマトスタチン誘導ペプチド類似体であるか又は同 じソマトスタチンレセプターに結合することが証明されている別の類似体である ことができる。^99mＴｃ標識ペプチドに関しては、これは実施例１、２、３又は ４の方法で標識することができる。或いは、¹¹¹Ｉｎ-ＤＴＰＡ-オクトレオチド のような市販で入手可能な製品を使用することができる。 実施例１２−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの局部投与による胸膜腔 内癌の治療法 オクトレオチド、ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体、又は他のソマ トスタチン誘導ペプチド類似体のいずれかを実施例２、３又は４の方法によって¹⁸⁸ Ｒｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどちらかで標識する。胸膜腔内に癌を有する患者にレニ ウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドを胸膜腔に直接注射する。任意に、このよ うなペプチドは、超音波、ＣＴスキャン又は他の画像化様式を使用して胸膜腔内 の １つ又はそれより多い腫瘍中に直接注射して胸膜腔又は肺内部の癌に局在化させ ることもできる。必要により投与量を反復投与する。薬剤の局在化、投与量決定 及び他のパラメーターは、¹⁸⁸Ｒｅ又は¹⁸⁶Ｒｅのガンマ線を使用して、ガンマ線 カメラ評価又は同様な手段によって決定することができる。このような癌は胸膜 腔内の原発性癌であるか又は小細胞肺癌、胸部癌、卵巣癌若しくは他の癌に続発 性の転移腫瘍であることができる。任意に、レニウム標識治療投与量を投与する 前に、ソマトスタチンレセプターが胸膜腔内の腫瘍に十分に存在しているかどう かを決定するために、インジウム又はテクネチウム標識のどちらかを使用して、 画像化投与量を投与して治療法の有効性を予測することができる。このような画 像化投与量は治療法で使用されるものと同じソマトスタチン誘導ペプチド類似体 であるか又は同じソマトスタチンレセプターに結合することが証明されている別 の類似体であることができる。^99mＴｃ標識ペプチドに関しては、これは実施例 １、２、３又は４の方法で標識することができる。或いは、¹¹¹Ｉｎ-ＤＴＰＡ- オクトレオチドのような市販で入手可能な製品を使用することができる。インジ ウム又はテクネチウム標識画像化投与量は、全身的に、例えば静脈内注射によっ て送達するか又は局部的に、例えば胸膜腔への直接注射によって送達することが できる。 実施例１３−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの保持及び生体分布に与 える担体分子の効果 臓器保持及び生体分布に与える種々の担体分子との同時投与の効果を評価した 。予備試験では、沈殿及びミクロろ過で測定するとき、80％のオーダーの¹⁸⁸Ｒ ｅ-ＲＣ-160と血清タンパク質の高い結合を示した。可溶性の¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160 は実施例２の方法で調製し、そして10％血清アルブミン、10％ヒトガンマグロブ リン又は４％等張グルコースのいずれかと混合した。この調製物を正常なＢＡＬ Ｖ/ｃ雌マウスの胸膜腔内に注射し、そして注射後４及び24時間目に保持及び生 体分布を評価した。３種の調製物間で顕著な差異が観察され、図８ａ及び８ｂに 示されるように、肺、胸腺及び胸膜腔の保持は可溶性¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160とヒトガ ンマグロブリンの同時投与によって顕著に増加した。４つの時間点で類似の結果 が得られた。一般的に言って、血清タンパク質、特にヒトガンマグロブリンとの 同時投与は^{18 8} Ｒｅ-ＲＣ-160が注射される領域又は洞内での¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の保持を高めた 。 実施例１４−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドと担体分子との同時投与 による癌の治療法 オクトレオチド、ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体、又は他のソマ トスタチン誘導ペプチド類似体のいずれかを実施例２、３又は４の方法によって¹⁸⁸ Ｒｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどちらかで標識する。このような放射性標識ペプチドを 担体分子、例えばヒト血清アルブミン又はヒトガンマグロブリンのような血清タ ンパク質と混合し、そしてこの放射性標識ペプチドを担体分子と共に同時投与す る。腫瘍内に直接注射した場合、放射性標識ペプチドは腫瘍内での保持の増加を 示す。胸膜腔のような区画内に注射した場合、放射性標識ペプチドはこの区画で の保持の増加を示す。 実施例１５−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの微粒子形態を使用する 癌治療法 ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体を実施例２の方法によって¹⁸⁸Ｒ ｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどちらかで標識してコロイド又は微粒子形態の放射性標識調 製物を得る。このレニウム標識ＲＣ-160で癌患者を治療する。治療すべき腫瘍に 入る動脈にこの調製物を直接注射し、そしてそこで微粒子は腫瘍の毛細血管床内 に留まる。或いは、この調製物を、例えば胸膜腔内の腫瘍を治療するために、癌 を有する洞内に注射し、そしてこの場合にはレニウム標識ソマトスタチン誘導ペ プチド微粒子を胸膜腔内に直接注射する。或いは、このようなペプチド微粒子を 、任意に超音波、ＣＴスキャン又は他の画像化様式を使用して、１つ又はそれよ り多い腫瘍中に直接注射して癌に局在化させることもできる。必要により投与量 を反復投与する。薬剤の局在化、投与量決定及び他のパラメーターは、¹⁸⁸Ｒｅ 又は¹⁸⁶Ｒｅのガンマ線を使用して、ガンマ線カメラ評価又は同様な手段によっ て決定することができる。 実施例１６−レニウム標識ソマトスタチン誘導ペプチドの動脈内投与によるリ ウマトイド関節炎の治療法 ＲＣ-160ソマトスタチン誘導ペプチド類似体を本明細書又は他で記載された任 意の方法、そして詳細には実施例２の方法によって¹⁸⁸Ｒｅか又は¹⁸⁶Ｒｅのどち らかで標識する。但し、コロイド形態の放射性標識調製物を得るためにはｐＨ６ 又はそれ以上で放射性標識する。リウマトイド関節炎患者をこのレニウム標識Ｒ Ｃ-160で治療する。放射性医薬品としての¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160の使用は特に膝、足 首、腰、肩、肘、手首及び指節骨の関節治療法に適用可能であり、適用される放 射線投与量は関節の大きさに依存するが、一般的には10ｍＣｉ未満である。この 調製物は関節炎の炎症部位であることが知られている大関節中に直接注射し、そ してそこでコロイドは関節及び周囲の骨構造内に留まる。必要により投与量を反 復投与する。薬剤の局在化、投与量決定及び他のパラメーターは、¹⁸⁸Ｒｅ又は^{1 86} Ｒｅ放射線を使用してガンマ線カメラ評価又は同様な手段によって決定するこ とができる。 実施例１７−安定化したレニウム標識ＲＣ-160ペプチドに基づく放射性医薬品組 成物の調製 ＲＣ-160放射性標識用キットは無菌技術を使用して調製した。各キットは２ml の液体量を使用して10ml血清バイアル中で調製した。この液体量は、凍結乾燥賦 形剤として１％マルトースを添加した５ｍＭ酒石酸第一スズ中に、45ｍＭの酒石 酸ナトリウムカリウム中200μｇのＲＣ-160、10ｍＭフタル酸水素カリウム緩衝 液、ｐＨ5.0を含有していた。各キットは最大1.19μｇのスズを含有していた。 充填後、バイアルを凍結乾燥し、先端空間を窒素でガス充填し、そしてバイアル に栓をして塞いだ。次いで、凍結乾燥バイアルを２〜８℃で冷凍貯蔵した。キッ トを標識するために、10〜100ｍＣｉを含有する¹⁸⁸Ｒｅ-過レニウム酸塩溶液４ 〜５mlをキットに添加し、そしてその後キットを沸騰水浴中で30〜45分間加熱し た。短時間の冷却期間後、注射用アスコルビン酸（米国薬局方）２mlを、0.22ミ クロンフィルターから標識キットに添加した。２つのタイプの非経口アスコルビ ン酸塩、注射用アスコルビン酸（米国薬局方）500mg／２ml及びアスコルビット （Ascorvit）100mg（Jenapharm、ドイツ）を使用して同様な結果を得た。 アスコルビン酸塩が添加されていない¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160は標識後２時間までの 間安定であることが分かった;しかし乍ら、その後、ＩＴＬＣで測定されそして ＨＰＬＣで確認されたように、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160はペプチドから分離し始めた。 この分離は¹⁸⁸Ｒｅで生起したが、Ｔｃ-99mでは同じ量、20ｍＣｉで使用したと き生起せず、この効果はレニウムに特異的であることが示唆された。標識後にア スコルビン酸塩を添加するとこの分離が本質的に消失して¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を安 定化することが分かった。標識後にアスコルビン酸塩を添加した65ｍＣｉでの標 識後30時間目のＨＰＬＣプロフィールは遊離レニウムが殆ど見られないことを示 していた。アスコルビン酸塩で安定化したＲｅ-ＲＣ-160によるシステイン置換 試験は、アスコルビン酸塩を使用してもＲｅ／ペプチド結合強度が変化せず、ア スコルビン酸塩で安定化した材料のＥＣ₅₀はアスコルビン酸塩を使用しないで得 られたものと類似していた。 亜硫酸ナトリウム(１mg／ml、ｐＨ7.4)、重亜硫酸ナトリウム（１mg／ml、ｐ Ｈ5.5）又はアスコルビン酸塩と亜硫酸ナトリウムの混合物(Ascorvit^TM製剤)、 重亜硫酸との混合物若しくはＥＤＴＡとの混合物（注射用アスコルビン酸塩、米 国薬局方、製剤）の添加も、アスコルビン酸塩の単独使用ほど効果的ではなかっ たが、Ｒｅ-ＲＣ-160の安定化に有効であった。50mg／mlのアスコルビン酸塩を 添加すると250mg／mlのアスコルビン酸塩添加と同じ結果が得られた。37℃で標 識された¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160にアスコルビン酸塩を添加しても標識効率の改善又は システイン置換試験で示されるＲｅ-ペプチド結合強度に実質的な変化は生じな かった。 アスコルビン酸塩／酸溶液の添加順序が重要であることが分かった。標識後に アスコルビン酸塩を添加すると安定化がもたらされることが分かった。レニウム 添加前に同じ量で同じ濃度のアスコルビン酸塩を添加したとき、ＲＣ-160は効果 的には放射性標識されなかった。分析用ＲＰ-ＨＰＬＣで得られた結果はＴＬＣ 試験及びＣ-18セプパクカラムからのイソクラティク溶出で確認された。レニウ ム添加前に添加したアスコルビン酸の量を400μｇに減少させたときでも、放射 性標識化は非常に害された。ＲＰ-ＨＰＬＣで得られた結果を並べて比較すると 、この少量のアスコルビン酸の存在下では溶出プロフィールが不十分な放射性標 識化を示していることが分かった。ＲＰ-ＨＰＬＣの結果はＴＬＣで確認された 。400μ ｇのアスコルビン酸の存在下で放射性標識した調製物の場合には、標識後のアス コルビン酸の更なる添加後の添加では標識化効率に何の改善ももたらさなかった 。 アスコルビン酸塩、又はアスコルビン酸塩／亜硫酸塩溶液を添加すると過剰に 存在するペプチドＲＣ-160の還元を最大にし、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160を害しない。放 射性標識用キットは、多様な標識化状況、例えば現場使用で予想されるような状 況に適応させるために、過剰の第一スズイオン及びＲＣ-160と共に処方すること ができる。¹⁸⁸Ｒｅの存在下では、ＲＣ-160と第一スズイオンは相互作用して、 金属環状¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160と考えられるものが得られる。ＲＰ-ＨＰＬＣによっ て、¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160は第一スズイオンで還元されたＲＣ-160又はジチオトレイ トールで還元されたＲＣ-160とは同−でないことが証明された。¹⁸⁸ＲｅはＷ-18 8／¹⁸⁸Ｒｅ発生器から本質的に担体不含で生成されるので、過剰の第一スズイオ ンは¹⁸⁸Ｒｅとコンプレックスを形成していないＲＣ-160を還元する。標識後に アスコルビン酸塩を添加すると過剰のＲＣ-160の還元が最大になり、そしてそれ によって本質的に生物学的に不活性となるので、レセプターとの結合に関してイ ンビボで¹⁸⁸Ｒｅ-ＲＣ-160と効果的に競合し得ない。最終的な成果は非常に高い 比活性を有する放射性標識ペプチドである。 上記したものは全て単なる説明であり、そして他の同等な実施態様が可能であ りそして意図している。本発明はこれらの好ましい実施態様を参照して記載した が、他の実施態様が同じ結果を達成することができる。本発明の改変及び修飾は 当該技術分野の熟練者に自明でありそして特許請求の範囲にはこのような修飾及 び均等物を全て含めるように意図している。上記で引用した全ての出願、特許及 び刊行物並びに対応する出願の開示は全て参照として本明細書に組み入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／６５１，１７９ (32)優先日 平成８年５月21日(1996．5．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マレック，マイケル ジェイ アメリカ合衆国 ニュー メキシコ 87106 アルブクエルク カーリスル ブ ルヴァード サウスイースト 503

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つのジスルフィド結合を有するソマトスタチン誘導ペプチド 類似体をレニウムの放射性同位体で放射性標識する方法であって、該方法は： ａ）少なくとも１つのジスルフィド結合を有するソマトスタチン誘導ペプチド 類似体を含有する溶液を提供し、 ｂ）上記の少なくとも１つのジスルフィド結合を有するソマトスタチン誘導ペ プチドを含有する溶液を第一スズイオンと接触させ、その際該第一スズイオンは 該ペプチドのジスルフィド結合とその後添加されるレニウムの放射性同位体を実 質的に還元するのに十分であり、 ｃ）ソマトスタチン誘導ペプチド類似体と第一スズイオンを含有する溶液をレ ニウムの放射性同位体と反応させ、 ｄ）レニウムで放射性標識したソマトスタチン誘導ペプチド類似体を回収する 、工程を含んでいる。 ２．治療用放射性同位体で放射性標識したソマトスタチン、ソマトスタチン誘 導ペプチド、ソマトスタチンの類似体又はソマトスタチンレセプターと結合する ペプチドを含むペプチドの治療的有効量を局部的に投与することを含む、患者内 部の局部的に区分された癌の治療方法。 ３．放射性標識ソマトスタチン誘導ペプチド類似体を血清タンパク質成分と混 合し、そして放射性標識ソマトスタチン誘導ペプチド類似体と血清タンパク質成 分の混合物の治療的有効量を局部的に投与することを含む、治療用放射性同位体 で放射性標識したソマトスタチン誘導ペプチド類似体の腫瘍保持を高める方法。 ４．関節炎の炎症部位であることが知られている大関節への直接的関節内注射 によってか又は大関節に入る血管中に注射することによって、治療用放射性同位 体標識ソマトスタチン誘導ペプチド類似体の治療的有効量を投与することを含む リウマトイド関節炎の治療方法。 ５．上記治療用放射性同位体が¹⁸⁸Ｒｅ又は¹⁸⁶Ｒｅの形態のレニウムである請 求項２、３又は４に記載の方法。 ６．上記放射性同位体が¹⁸⁸Ｒｅ又は¹⁸⁶Ｒｅ過レニウム酸塩の形態のレニウム である請求項１に記載の方法。 ７．上記の局部的に投与されるペプチドが少なくとも１つの還元可能なジスル フィド結合を更に含んでおりそしてこのジスルフィド結合の還元により生じる窒 素又は硫黄金属配位部位と直接結合した治療用放射性同位体を有している請求項 ２に記載の方法。 ８．上記レニウムの量が概ね10ｍＣｉから500ｍＣｉの間である請求項５又は ６に記載の方法。 ９．上記反応が約80℃から約100℃までの温度で生起する請求項１に記載の方 法。 １０．上記溶液中のソマトスタチン誘導ペプチド類似体の濃度が１ml当たり約 25μｇから１mgの間である請求項１に記載の方法。 １１．上記の回収された放射性標識ソマトスタチン誘導ペプチド類似体にアス コルビン酸又はゲンチシン酸を含有する安定化剤を添加する工程を更に含んでい る請求項１に記載の方法。 １２．ソマトスタチン誘導ペプチド類似体を含有する溶液を第一スズイオンと 接触させた後であるが、レニウムを添加する前に上記溶液を凍結乾燥する請求項 １に記載の方法。 １３．上記の局部的に区分された癌が前立腺癌、膠芽腫、膵臓癌、胃癌、肉腫 、 卵巣癌、結腸癌、大脳癌、肺癌、胸部癌又はリンパ腫を含んでいる請求項２に記 載の方法。 １４．上記の局部的に区分された癌が前立腺筋膜、大脳、腹膜腔、心膜又は胸 腔内に位置する癌を含んでいる請求項２に記載の方法。 １５．上記の局部投与が癌への直接注射、癌を有する区画への直接注射又は癌 に直接入る動脈への動脈内注射からなる注射方法によるものである請求項２に記 載の方法。 １６．上記の治療用放射性同位体が¹⁸⁸Ｒｅ又は¹⁸⁶Ｒｅの形態の過レニウム酸 塩であり、そしてペプチドのジスルフィド結合と過レニウム酸塩を実質的に完全 に還元するのに十分な第一スズイオンを有するペプチドを含有する溶液を過レニ ウム酸塩と接触させ、ペプチド、第一スズイオン及び過レニウム酸塩の混合物を インキュベートしてレニウム標識ペプチドを形成させ、そしてこのレニウム標識 ペプチドを回収することを含む工程によってジスルフィド結合に対して直接標識 している請求項２に記載の方法。 １７．上記の治療用放射性同位体標識ペプチドが微粒子形態であり、そして局 部投与が癌を有する区画への微粒子形態の治療用放射性同位体標識ペプチドの注 射又は癌に直接入る動脈への微粒子形態の治療用放射性同位体標識ペプチドの注 射によるものである請求項２に記載の方法。 １８．上記患者がヒトである請求項２に記載の方法。 １９．上記血清タンパク質成分がガンマグロブリンである請求項３に記載の方 法。 ２０．上記の治療用放射性同位体標識ソマトスタチン誘導ペプチド類似体がコ ロイドか又は微粒子形態のどちらかである請求項４に記載の方法。