DE69633457T2

DE69633457T2 - Antineoplastische peptide

Info

Publication number: DE69633457T2
Application number: DE69633457T
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Amberg; Teresa Barlozzari; Harald Bernard; Ernst Buschmann; Andreas Haupt; Hans-Guenther Hege; Bernd Janssen; Andreas Kling; Helmut Lietz; Kurt Ritter; Martina Ullrich; Jürgen Weymann; Thomas Zierke
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-11
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2016-12-12
Also published as: SK76798A3; AR004382A1; WO1997022621A2; TW474946B; ATE277076T1; DE69638206D1; IL124342A; CA2237721C; NO319273B1; KR20000064400A; CN1204342A; NO982711D0; AU731458B2; EP0866800A2; NZ324691A; PT866800E; KR100463739B1; ZA9610510B; IL124342A0; CZ184698A3

Description

Die hier beschriebene Erfindung betrifft neue Peptide und Derivate davon, die im Vergleich zu Dolastatin-10 und Dolastatin-15 (US-Patente 4,879,276 und 4,816,444) und zu den in WO 93/23424 beschriebenen Verbindungen möglicherweise verbesserte therapeutische Brauchbarkeiten zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen bieten. DE 44 15 997 A1 betrifft die Dolastatin-Derivate Me₂Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NH(CH₂Ph), die eine besonders gute antineoplastische Aktivität aufweisen sollen.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind Peptide der Formel I R¹R²N-CHX-CO-A-B-D-E-K Iworin R¹ Methyl ist;
R² Methyl ist;
A ein Valyl-Rest ist;
B ein N-Methylvalyl-Rest ist;
D ein Prolyl-Rest ist;
E ein Prolyl-Rest ist;
X Isopropyl ist;
worin
K für -NHC(CH₃)₃, -NHCH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)C(CH₃)₃, -N(CH₃)OCH₂CH₃, -N(CH₃)OCH₂CH₂CH₃, -N(CH₃)OCH(CH₃)₂, -N(CH₃)O(CH₂)₃CH₃, -N(CH₃)OCH₂C₆H₅, -NHC(CH₃)₂C₆H₅, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)(CH₂CH₃)₂, -NHCH[CH(CH₃)₂]₂, -NHC(CH₃)₂CN, -NHCH(CH₃)CH(OH)C₆H₅, -NH-C(CH₃)₂CH≡CH₂, -NHC(CH₃)₂C≡CH, -NHC(CH₂CH₃)₂C≡CH, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₂OH, -NHC(CH₃)₂CH(CH₃)₂, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)₂CH₂C₆H₅, -N(OCH₃)CH(CH₃)₂, -N(OCH₃)CH₂CH₃, -N(OCH₃)CH₂CH₂CH₃, -N(OCH₃)CH₂C₆H₅, -N(OCH₃)C₆H₅, -N(CH₃)OC₆H₅, -N(OCH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃ steht,
oder K für -NHCH(C₂H₅)₂, -NHCH(C₂H₅)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH(CH₃)₂, -NHC(CH₃)₂C₂H₅, -NHC(CH₃)₂CH(CH₃)₂, -NHCH(C₃H₇)₂, -NHCH(C₂H₅)C₃H₇, -NHCH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)C₂H₅, NH-Cyclohexyl, NH-Cycloheptyl steht, oder K für
steht,
oder K für
steht, und Salze davon mit physiologisch verträglichen Säuren.
Die obigen Verbindungen der Formel (I) entsprechen Peptiden der Formel (Ia) (CH₃)₂N-CH(CH(CH₃)₂)-CO-(Valyl)-(N-Methyl-valyl)-(Prolyl)-(Prolyl)-K (Ia)worin K wie oben definiert ist.
Bevorzugte Verbindungen der Formel I oder Ia sind diejenigen, worin K für -NH-Alkyl, -NH-Cycloalkyl, Alkyl-N |-Alkyl steht, wobei in diesen Resten eine CH₂-Gruppe durch O, ein H durch Phenyl oder 1 oder 2H durch F ersetzt sein können, wobei der N-Methoxy-N-methylamino-, N-Benzylamino- oder N-Methyl-n-benzylamino-Rest ausgeschlossen ist, oder K für

steht.
Bevorzugter steht K für -NHCH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH₂CH₃, -NHCH(CH₂CH₃)₂, -NHCH(CH₂CH₂CH₃)₂, -NHC(CH₃)₃, -NHCH(CH₂CH₃)CH₂CH₂CH₃, NHCH(CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)C(CH₃)₃, -NH-Cyclohexyl, -NH-Cycloheptyl, -N(CH₃)OCH₂CH₃, -N(CH₃)OCH₂CH₂CH₂CH₃, -N(CH₃)OCH(CH₃)₂, -N(OCH₃)CH(CH₃)₂, -N(CH₃)OCH₂C₆H₅, -NHC(CH₃)₂C₆H₅, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)(CH₂CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH(OH)C₆H₅, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₂OH, -NHC(CH₃)₂CH₂(CH₃)₂, -NHC(CH₃)CH=CH₂, -NHC(CH₃)₂CN, -NHC(CH₃)₂C≡CH, -N(OCH₃)C₆H₅, -NHCH[CH(CH₃)₂]₂, -N(OCH₃)CH₂C₆H₅, -N(OCH₃)CH₂CH₃, -N(OCH₃)CH₂CH₂CH₃, -N(OCH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃,
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I oder Ia, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern enthalten, und Verfahren zur Verwendung derselben zur Behandlung von Krebs in Säugern.
Die neuen Verbindungen können als Salze mit physiologisch verträglichen Säuren vorliegen, wie: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Succinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Mucinsäure, Benzoesäure, Glucoronsäure, Oxasäure, Ascorbinsäure und Acetylglycin.
Die neuen Verbindungen können mit bekannten peptidchemischen Verfahren hergestellt werden. So können die Peptide hergestellt werden, indem die Aminosäuren sequentiell zusammengefügt werden, oder indem geeignete kleine Peptidfragmente miteinander verknüpft werden. Beim sequentiellen Zusammenfügen wird die Peptidkette vom C-Terminus aus schrittweise verlängert, indem eine Aminosäure pro Schritt angefügt wird. Bei der Fragmentkopplung können Fragmente unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, und die Fragmente können wiederum durch sequentielles Aneinanderfügen von Aminosäuren oder durch Fragmentkopplung gewonnen werden.
Sowohl beim sequentiellen Zusammenfügen als auch bei der Fragmentkopplung ist es notwendig, die Gruppierungen durch Bildung einer Amidbindung miteinander zu verknüpfen. Enzymatische und chemische Methoden sind hierfür geeignet.
Chemische Verfahren zur Bildung der Amidbindung sind ausführlich in Müller, Methoden der organischen Chemie Band XV/2, S. 1–364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, S. 31–34 und 71–82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, S. 85–128, John Wiley & Sons, New York, 1976; The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodanszky, A. Bodanszky, Springer-Verlag, 1994, und weiteren Standardwerken zur Peptidchemie beschrieben. Zu bevorzugten Verfahren gehören das Azid-Verfahren, das Verfahren der symmetrischen und gemischten Anhydride, die Verwendung in situ erzeugter oder vorgebildeter aktiver Ester, die Verwendung Urethan-geschützter N-Carboxyanhydride von Aminosäuren und die Bildung der Amidbindung mit Hilfe von Kopplungsreagenzien, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), Pivaloylchlorid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDCI), n-Propan-phosphonsäureanhydrid (PPA), N-N-Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorylchlorid (BOP-CI), Brom-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBrop), Diphenylphosphorylazid (DPPA), Castro's Reagens (BOP, PyBop), O-Benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumsalze (HBTU), O-Azabenzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumsalze (HATU), Diethylphosphorylcyanid (DEPCN), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxythiophendioxid (Steglich's Reagens; HOTDO) und 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI). Die Kopplungsreagenzien können alleine oder zusammen mit Additiven, wie N,N-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), Azabenzotriazol, N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin verwendet werden.
Während die Verwendung von Schutzgruppen bei der enzymatischen Peptidsynthese im allgemeinen nicht notwendig ist, ist das reversible Schützen reaktiver Gruppen, die nicht an der Bildung der Amidbindung beteiligt sind, für beide Reagenzien in der chemischen Synthese erforderlich. Drei herkömmliche Schutzgruppentechniken sind für die chemische Peptidsynthese bevorzugt: die Benzyloxycarbonyl (Z)-, die t-Butoxycarbonyl (Boc)- und die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Techniken.
Ausgewiesen ist in jedem Fall die Schutzgruppe an der α-Aminogruppe der Ketten-verlängernden Einheit. Eine ausführliche Übersicht der Aminosäure-Schutzgruppen ist beschrieben in Müller, Methoden der organischen Chemie Band XV/1, Seiten 20–906, Thieme Verlag, Stuttgart (1974). Die beim Zusammenfügen der Peptidkette verwendeten Gruppierungen können in Lösung, in Suspension oder durch ein ähnliches Verfahren, wie beschrieben von Merrifield in J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149, umgesetzt werden.
Zu Lösungsmitteln, die für die Peptidsynthese geeignet sind, gehören alle Lösungsmittel, die unter den Reaktionsbedingungen inert sind, vor allem Wasser, N,N-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlormethan (DCM), Ethylacetat, 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) und Gemische dieser Lösungsmittel.
Die Peptidsynthese auf dem polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind. Allerdings besitzen bevorzugte Lösungsmittel darüberhinaus Harz-quellende Eigenschaften, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, und Gemische dieser Lösungsmittel. Nach beendeter Synthese wird das Peptid von dem polymeren Träger entfernt. Die Bedingungen, unter denen die Spaltung von den verschiedenen Harz-Typen möglich ist, sind in der Literatur offenbart. Die am häufigsten verwendeten Spaltungsreaktionen sind Säure- oder Palladium-katalysiert, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreien Fluorwasserstoff, wasserfreier Trifluormethansulfonsäure, verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure, die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemischen in Gegenwart einer schwachen Base, wie Morpholin, oder die Spaltung in Essigsäure/Dichlormethan/Trifluorethanol-Gemischen. Je nach den gewählten Schutzgruppen können diese unter den Spaltungsbedingungen abgespalten werden oder erhalten bleiben.
Das partielle Entschützen des Peptids kann dann auch sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisierungsreaktionen durchgeführt werden sollen.
Peptide, die am N-Terminus dialkyliert sind, können entweder hergestellt werden, indem man an den passenden N,N-Dialkylaminosäuren in Lösung oder am polymeren Träger koppelt, das Harz-gebundene Peptid in DMF/1% Essigsäure mit NaCNBH₃ und dem passenden Aldehyd reduktiv alkyliert oder das Peptid in Lösung in Gegenwart von Aldehyd oder Keton und Pd/C hydriert.
Die verschiedenen nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuren genauso wie die verschiedenen Nicht-Aminosäure-Gruppierungen, die hier beschrieben sind, können aus gewerblichen Quellen bezogen oder aus gewerblich erhältlichen Materialien mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise können die Aminosäure-Bausteine mit R¹- und R²-Gruppierungen in Anlehnung an E. Wuensch, Houben Weyl, Meth. d. Org. Chemie, Bd. XV, 1, S. 306 ff., Thieme Verlag Stuttgart 1974 und der darin zitierten Literatur hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Inhibierung oder sonstigen Behandlung solider Tumoren (z. B. Tumoren der Lunge, der Brust, des Colons, der Prostata, der Blase, des Rektums oder endometrialer Tumoren) oder hämatologischer Entartungen (z. B. Leukämien, Lymphomen) verwendet werden, wobei die Verbindung dem Säuger verabreicht wird.
Ein besonderer Vorteil der neuen Verbindungen ist, dass sie gegen enzymatischen Abbau sehr resistent sind und auch oral verabreicht werden können.
Die Verabreichung kann auf beliebige, für pharmazeutische und insbesondere onkologische Mittel übliche Wege erfolgen, wozu orale und parenterale Wege wie subkutan, intravenös, intramuskulär und intraperitoneal gehören.
Die Verbindungen können allein oder in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel I zusammen mit einem für den gewünschten Verabreichungsweg geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, verabreicht werden. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können Kombinationsprodukte sein, d. h. sie können auch weitere therapeutisch aktive Inhaltsstoffe enthalten.
Die einem Säuger zu verabreichende Dosis enthält eine wirksame tumorhemmende Menge des aktiven Inhaltstoffs, die von üblichen Faktoren abhängt, wie der biologischen Aktivität der jeweils eingesetzten Verbindung; der Verabreichungsart; dem Alter, Gesundheitszustand und Körpergewicht des Empfängers; der Art und dem Ausmaß der Symptome; der Behandlungsfrequenz; der Verabreichung anderer Therapien; sowie der gewünschten Wirkung. Eine typische Tagesdosis der liegt bei etwa 0,05 bis 50 mg/kg Körpergewicht bei oraler Verabreichung bei etwa 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht bei parenteraler Verabreichung.
Die neuen Verbindungen können in herkömmlichen, festen oder flüssigen pharmazeutischen Verabreichungsformen, beispielsweise unbeschichteten oder (Film)-beschichteten Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Zäpfchen oder Lösungen verabreicht werden. Diese werden auf herkömmliche Weise hergestellt. Die Wirksubstanzen können zu diesem Zweck mit herkömmlichen pharmazeutischen Hilfsmitteln verarbeitet werden, wie Tablettenbindemitteln, Füllstoffen, Konservierungsmitteln, Tablettenzerfallsmitteln, Fließregulatoren, Weichmachern, Benetzungsmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung, Antioxidantien und/oder Treibgasen (vgl. H. Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978). Die auf diese Weise erhaltenen Verabreichungsformen enthalten üblicherweise etwa 1 bis etwa 90 Gew.-% des Wirkstoffs.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen. Die proteinogenen Aminosäuren werden in den Beispielen mit dem bekannten Dreibuchstabencode abgekürzt. Weitere verwendete Abkürzungen: Me₂Val = N,N-Dimethylvalin, MeVal = N-Methylvalin.
A. Allgemeine Vorgehensweisen
I. Die Peptide des Anspruchs 1 werden entweder durch die klassische Lösungssynthese mit dem üblichen Z- und Boc-Verfahren, wie oben beschrieben, oder durch übliche Festphasensynthese-Verfahren mit den Boc- und Fmoc-Schutzgruppentechniken synthetisiert.
Im Falle der Festphasensynthese werden die N,N-Dialkylpenta- oder -Hexapeptidsäuren von dem festen Träger befreit und des weiteren mit den entsprechenden C-terminalen Aminen in Lösung gekoppelt. Man verwendete BOP-CI und PyBrop als Reagenzien für die Kopplung der auf die N-Methylaminosäuren folgenden Aminosäure. Die Reaktionszeiten wurden entsprechend erhöht. Zur reduktiven Alkylierung des N-Terminus entschützte man das Peptidharz am N-Terminus und setzte es dann mit einem 3-fachen molaren Überschuss Aldehyd oder Keton in DMF/1% Essigsäure unter Zugabe von 3 Äquivalenten NaCNBH₃ um. Nach Beendigung der Umsetzung (negativer Kaisertest) wusch man das Harz mehrmals mit Wasser, Isopropanol, DMF und Dichlormethan.
Bei der Lösungssynthese ist die Verwendung entweder von Boc-geschützten Aminosäure-NCA (N-tert-Butyloxycarbonyl-aminosäure-N-carboxyanhydriden), Z-geschützten Aminosäure-NCA (N-Benzyloxycarbonylaminosäure-N-carboxyanhydriden) oder die Verwendung von Pivaloylchlorid als Kondensationsmittel für die Kopplung der auf die N-Methylaminosäuren folgenden Aminosäure am vorteilhaftesten. Die reduktive Alkylierung des N-Terminus kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass man die N-terminal entschützten Peptide oder Aminosäuren mit den entsprechenden Aldehyden oder Ketonen unter Verwendung von NaCNBH₃ oder Wasserstoff, Pd/C, umsetzt.
II. Reinigung und Charakterisierung der Peptide
Die Reinigung erfolgte durch Gelchromatographie (SEPHADEX G-10, G-15/10% HOAc, SEPHADEX LH20/MeOH), Chromatographie mit mittlerem Druck (Trennphase: HD-SIL C-18, 20–45 μm, 100 Angström; Fließmittel: Gradient mit A = 0,1% TFA/Wasser, B = 0,1% TFA/MeOH) oder präparative HPLC (Trennphase: Waters Delta-Pak C-18, 15 μm, 100 Angström; Fließmittel: Gradient mit A = 0,1% TFA/Wasser, B = 0,1% TFA/MeOH).
Die Reinheit der erhaltenen Produkte wurde durch analytische HPLC bestimmt (Trennphase: 100 2,1 mm VYDAC C-18, 5I, 300 Angström; Fließphase: Acetonitril-Wasser-Gradient, gepuffert mit 0,1% TFA, 40°C).
Die Charakterisierung erfolgte durch Massenspektroskopie mit schnellem Atombeschuss und NMR-Spektroskopie.
B. Spezifische Vorgehensweisen
Beispiel 1 (SEQ ID NO: 1)

Me₂Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH₃)₂

a) Z-MeVal-Pro-OMe
66,25 g (250 mmol) Z-MeVal-OH wurden in 250 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 36,41 ml (262,5 mmol) Triethylamin wurde das Reaktionsgemisch auf –25°C gekühlt, und es wurden 32,27 ml (262,5 mmol) Pivaloylchlorid zugegeben. Nach 2,5-stündigem Rühren wurden 41,89 g (250 mmol) H-Pro-OMe × HCl in 250 ml Dichlormethan, das mit 36,41 ml (262,5 mmol) Triethylamin bei 0°C neutralisiert worden war, zum Reaktionsgemisch gegeben. Es wurde 2 Stunden bei –25°C und über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und gründlich mit einer gesättigten, wässrigen NaHCO₃-Lösung (3×), Wasser (1×), 5%iger Zitronensäure (3×) und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand (91,24 g) wurde mit Petroleumether über Nacht gerührt und filtriert. Es wurden 62,3 g Produkt erhalten.
b) H-MeVal-Pro-OMe
48,9 g (130 mmol) Z-MeVal-Pro-OMe wurden in 490 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 10,9 ml (130 mmol) konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und 2,43 g 10% Palladium/Kohle, wurde das Reaktionsgemisch hydriert. Filtration und Einengen zur Trockne ergaben 36,43 g Produkt.
c) Z-Val-MeVal-Pro-OMe
18,1 g (65 mmol) N-MeVal-Pro-OMe, 21,6 g (78 mmol) Z-Val-N-Carboxyanhydrid und 22,8 ml (130 mmol) Diisopropylethylamin wurden in 110 ml DMF bei 40°C 2 Tage gerührt. Nach dem Verdampfen des DMF wurde Dichlormethan zugegeben, und die organische Phase wurde mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (3×), Wasser (1×), 5%iger Zitronensäure (3×) und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Das Produkt (29,3 g) wurde als viskoses Öl erhalten.
d) H-Val-MeVal-Pro-OMe
29,3 g (61,6 mmol) Z-Val-MeVal-Pro-OMe wurden in 230 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 1,15 g 10% Palladium/Kohle wurde das Reaktionsgemisch hydriert. Filtration und Einengen zur Trockne ergaben 21.96 g Produkt.
e) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe
15,29 g (61 mmol) Z-Val-OH und 21,96 g (61 mmol) H-Val-MeVal-Pro-OMe wurden in 610 ml Dichlormethan gelöst und auf 0°C gekühlt. Nach Zugabe von 8,16 ml (73,2 mmol) N-Methylmorpholin, 2,77 g (20,3 mmol) HOBt und 11,74 g (61 mmol) EDCI wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit Dichlormethan verdünnt und gründlich mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (3×), Wasser (1×), 5%iger Zitronensäure (3×) und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt, was 31.96 g Produkt ergab.
f) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH
31.96 g (57 mmol) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe wurden in 250 ml Methanol gelöst. 102,6 ml 1 N LiOH wurde zugegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 500 ml Wasser wurde die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat gewaschen, bei 0°C auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt, was 30,62 g des gewünschten Produkts als weißen Feststoff ergab.
g) Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH₃)₂
2 g (3,35 mmol) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH und 0,664 g (3,35 mmol) N-Pro-NHCH(CH₃)₂ wurden in 34 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Nachdem man auf 0°C abgekühlt hatte, wurden 1,35 ml (12,1 mmol) N-Methylmorpholin, 0,114 g (0,84 mmol) HOBt und 0,645 g (3,35 mmol) EDCI dazugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 80 ml Dichlormethan wurden dazugegeben und die organische Phase gründlich mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (3×), Wasser (1×), 5%iger Zitronensäure (3×) und gesättigter NaCl-Lösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt, was 1,96 g des Produkts ergab, das bei der anschließenden Umsetzung ohne weitere Aufreinigung verwendet wurde.
h) Me₂Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH₃)₂
1,96 g Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH₃)₂ wurden in 11 ml Methanol gelöst. 0,054 g 10% Pd/C wurden unter einer Stickstoffatmosphäre dazugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 4 Stunden hydriert. Nach Zugabe von 0,86 ml (11,24 mmol) einer 37%igen wässrigen Formaldehyd-Lösung und 0,281 g 10% Pd/C wurde die Hydrierung 5 Stunden fortgesetzt. Filtrieren und Verdampfen des Lösungsmittels ergab 2,77 g eines Rohprodukts. Eine weitere Aufreinigung erreichte man, indem man das Peptid in Wasser löste, auf einen pH-Wert von 2 einstellte und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat extrahierte. Die wässrige Phase wurde dann auf einen pH-Wert von 8–9 eingestellt und viermal mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, was 1,37 g des gereinigten Produkts als weißen Schaum ergab. Die Verbindung wurde weiter aufgereinigt, indem man eine Flüssigchromatographie bei mittlerem Druck (10-50% A in 10 min; 50–90% A in 320 min) verwendete. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, lyophilisiert, erneut in Wasser gelöst und der pH-Wert wurde mit 1 N LiOH auf 9 eingestellt. Nach Extraktion mit Dichlormethan wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Die Lyophilisierung ergab 500 mg reines Produkt, das mittels Massenspektroskopie mit schnellem Atombeschuss charakterisiert wurde ([M + H]⁺ = 593).
Beispiel 2 (SEQ ID NO: 1)

Me₂Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH₃)₃

i) Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH₃)₃
2 g (3,35 mmol) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH und 0,692 g (3,35 mmol) N-Pro-NHC(CH₃)₃ wurden in 34 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Nachdem man auf 0°C abgekühlt hatte, wurden 1,35 ml (12,1 mmol) N-Methylmorpholin, 0,114 g (0,84 mmol) HOBt und 0,645 g (3,35 mmol) EDCI dazugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 80 ml Dichlormethan wurden dazugegeben und die organische Phase gründlich mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (3×), Wasser (1×), 5%iger Zitronensäure (3×) und gesättigter NaCl-Lösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt, was 1,8 g des Produkts ergab, das bei der anschließenden Umsetzung ohne weitere Aufreinigung verwendet wurde.
k) Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH₃)₃
1,8 g Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH₃)₃ wurden in 10 ml Methanol gelöst. 0,049 g 10% Pd/C wurden unter einer Stickstoffatmosphäre dazugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 4 Stunden hydriert. Nach Zugabe von 0,86 ml (11,24 mmol) einer 37%igen wässrigen Formaldehyd-Lösung und 0,252 g 10% Pd/C, wurde die Hydrierung 5 Stunden fortgesetzt. Filtrieren und Verdampfen des Lösungsmittels ergab 1,82 g eines Rohprodukts. Die Verbindung wurde weiter aufgereinigt, indem man eine Flüssigchromatographie bei mittlerem Druck (10–50% A in 10 min; 50–90% A in 320 min) verwendete. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, lyophilisiert, erneut in Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 1 N LiOH auf 9 eingestellt. Nach Extraktion mit Dichlormethan wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Die Lyophilisierung ergab 547 mg reines Produkt, das mittels Massenspektroskopie mit schnellem Atombeschuss charakterisiert wurde ([M + H]⁺ = 607).
Die nachstehenden Verbindungen wurden hergestellt; sie können gemäß den Beispielen 1 und 2 hergestellt werden:

3. Xaa Val Xab Pro Xac
4. Xaa Val Xab Pro Xad
5. Xaa Val Xab Pro Xae
6. Xaa Val Xab Pro Xaf
7. Xaa Val Xab Pro Xag
8. Xaa Val Xab Pro Xah
9. Xaa Val Xab Pro Xai
10. Xaa Val Xab Pro Xak
11. Xaa Val Xab Pro Xal
12. Xaa Val Xab Pro Xam
13. Xaa Val Xab Pro Xan
14. Xaa Val Xab Pro Xao
15. Xaa Val Xab Pro Xap
16. Xaa Val Xab Pro Xaq
17. Xaa Val Xab Pro Xar
18. Xaa Val Xab Pro Xas
19. Xaa Val Xab Pro Xat
20. Xaa Val Xab Pro Xau
21. Xaa Val Xab Pro Xav
22. Xaa Val Xab Pro Xaw
23. Xaa Val Xab Pro Xax
24. Xdd Val Xab Pro Xay
25. Xaa Val Xab Pro Xaz
26. Xaa Val Xab Pro Xba
27. Xaa Val Xab Pro Xbb
28. Xaa Val Xbc Pro Xay
29. Xaa Val Xab Pro Xbd
30. Xaa Val Xab Pro Xbe
31. Xaa Val Xab Pro Xbf
32. Xaa Val Xab Pro Xbg
33. Xaa Val Xab Pro Xbh
34. Xaa Val Xab Pro Xbi
35. Xaa Val Xab Pro Xbk
36. Xaa Val Xab Pro Xbl
37. Xaa Val Xab Pro Xbm
38. Xaa Val Xab Pro Xbn
39. Xaa Val Xab Pro Xbo
40. Xaa Val Xab Pro Xbp
41. Xaa Val Xab Pro Xbq
42. Xaa Val Xab Pro Xbr
43. Xaa Val Xab Pro Xbs
44. Xaa Val Xab Pro Xbt
45. Xaa Val Xab Pro Xbu
46. Xaa Val Xab Pro Xbv
47. Xaa Val Xab Pro Xbw
48. Xaa Val Xab Pro Xbx
49. Xaa Val Xab Pro Xby
50. Xaa Val Xab Pro Xbz
51. Xaa Val Xab Pro Xca
52. Xaa Val Xab Pro Xcb
53. Xaa Val Xab Pro Xcc
54. Xaa Val Xab Pro Xcd
55. Xaa Val Xab Pro Xce
56. Xaa Val Xab Pro Xcf
57. Xaa Xdf Xab Pro Xay
58. Xaa Val Xab Pro Xch
59. Xaa Val Xab Pro Xci
60. Xaa Val Xab Pro Xck
61. Xaa Val Xab Pro Xcl
62. Xaa Val Xab Pro Xcm
63. Xaa Val Xab Pro Xcn
64. Xaa Val Xab Pro Xco
65. Xaa Val Xab Pro Xcp
66. Xaa Val Xab Pro Xcq
67. Xaa Val Xab Pro Xcr
68. Xaa Val Xab Pro Xcs
69. Xaa Val Xab Pro Xct
70. Xaa Val Xab Pro Xcu
71. Xcw Val Xab Pro Xcv
72. Xcx Val Xab Pro Xcv
73. Xaa Val Xab Pro Pro Xcy
74. Xaa Val Xab Pro Pro Xcz
75. Xaa Val Xda Pro Xcv
76. Xaa Xdb Xab Pro Xcv
77. Xdc Val Xab Pro Xcv
78. Xaa Ile Xab Pro Xcv
79. Xdd Val Xab Pro Xcv
80. Xde Val Xab Pro Xcv
81. Xaa Xdf Xab Pro Xcv
82. Xaa Val Xab Pro Xcq
83. Xaa Val Xab Pro Pro Xdg
84. Xaa Val Xab Pro Pro Xdh
85. Xaa Val Xab Pro Pro Xdi
86. Xaa Val Xab Pro Pro Xdk
87. Xaa Val Xdl Pro Xcv
88. Xde Val Xab Pro Xay
89. Xaa Val Xdi Pro Xay
90. Xaa Val Xab Pro Xdm
91. Xaa Val Xab Pro Xdn
92. Xaa Val Xab Pro Xdo
93. Xaa Val Xab Pro Xdp
94. Xaa Val Xab Pro Xdq
95. Xaa Val Xab Pro Pro Xdr
96. Xaa Val Xab Pro Xds
97. Xaa Val Xbc Pro Xcv
98. Xaa Ile Xab Pro Xay
99. Xcw Val Xab Pro Xay
100. Xaa Val Xbc Pro Xal
101. Xaa Val Xdl Pro Xal
102. Xaa Xdf Xab Pro Xal
103. Xaa Ile Xab Pro Xal
104. Xdd Val Xab Pro Xal
105. Xde Val Xab Pro Xal
106. Xcx Val Xab Pro Xcy
107. Xcw Val Xab Pro Xal
108. Xcx Val Xab Pro Xal
109. Xcw Val Xab Pro Xav
110. Xcx Val Xab Pro Xav
111. Xcw Val Xab Pro Xaw
112. Xcx Val Xab Pro Xaw
113. Xab Val Xah Pro Xay
114. Xab Val Xab Pro Xcv
115. Xab Val Xab Pro Xal
116. Xab Val Xab Pro Xam
117. Xab Val Xab Pro Xan
118. Xab Val Xab Pro Xao
119. Xab Val Xab Pro Xav
120. Xab Val Xab Pro Xaw
121. Xab Val Xab Pro Xat
122. Xab Val Xab Pro Xau
123. Xab Val Xab Pro Xbf
129. Xab Val Xab Pro Xbm
125. Xab Val Xab Pro Xbn
126. Xab Val Xab Pro Xbo
127. Xab Val Xab Pro Xch
128. Xaa Val Xab Pro Xdt
129. Xaa Val Xab Pro Xdu
130. Xaa Val Xab Pro Xdv
131. Xaa Val Xab Pro Xdw
132. Xaa Val Xab Pro Xdx
133. Xaa Val Xab Pro Xdy
134. Xaa Val Xab Pro Xdz
135. Xaa Val Xab Pro Xea
136. Xaa Val Xab Pro Xeb
137. Xaa Val Xab Pro Xec
138. Xaa Val Xab Pro Xed
139. Xaa Val Xab Pro Xef
140. Xaa Val Xab Pro Xeg
141. Xaa Val Xab Pro Xeh
142. Xaa Val Xab Pro Xei
143. Xaa Val Xab Pro Xek
144. Xaa Val Xab Pro Xel
145. Xaa Val Xab Pro Xem
146. Xaa Val Xab Pro Xen
147. Xaa Val Xab Pro Xeo
148. Xaa Val Xab Pro Xep
149. Xaa Val Xab Pro Xeq
150. Xaa Val Xab Pro Xer
151. Xaa Val Xab Pro Xcg

Beispiele für die MS-Charakterisierung der synthetisierten neuen Verbindungen sind nachstehend aufgeführt:

BEISPIEL [Nr.]	MS-Analyse mit schnellem Atombeschuss [Molekulargewicht (gemessen)]
3.	565
4.	579
5.	593
6.	607
7.	621
8.	635
21.	607
12.	607
13.	621
14.	649
15.	635
16.	635
17.	635
18.	635
19.	621
20.	621
21.	635
22.	635
25.	633
26.	647
27.	661
31.	623
32.	671
33.	667
34.	681
35.	655

BEISPIEL [Nr.]	MS-Analyse mit schnellem Atombeschuss [Molekulargewicht (gemessen)]
36.	655
37.	669
38.	621
39.	635
41.	699
42.	621
43.	633
44.	667
45.	607
46.	647
47.	668
48.	655
49.	669
50.	685
52.	629
52.	625
53.	721
55.	579
58.	623
61.	597
62.	621
63.	609
64.	625
65.	635
66.	591
67.	715
68.	685
69.	685
70.	591
71.	607
72.	621
74.	706
75.	579
76.	579
77.	579
78.	607
79.	607

BEISPIEL [Nr.]	MS-Analyse mit schnellem Atombeschuss [Molekulargewicht (gemessen)]
80.	607
81.	607
82.	637
83.	692
84.	706
85.	706
86.	706
87.	607
90.	635
92.	659
93.	617
94.	636
95.	678
128.	671
131.	625
139.	625
151.	637

Tabelle I – Sequenzidentifizierung von Verbindungen, die nach Beispiel 1 und 2 hergestellt wurden

Verbindungsnummer(n)	Sequenz-ID-Nummer
1–56, 58–72, 75, 77, 79, 80, 82, 87–94, 96, 97, 99–101, 104–151	1
73, 74, 83–86, 95	2
57, 76, 81, 102	3
78, 98, 103	4

Die in der Zusammenfassung verwendeten Symbole Xaa haben nachstehende Bedeutungen:

Xaa: N,N-Dimethylvalin

Xab: N-Methylvalin

Xbc: N-Methyl-isoleucin

Xcc: Prolin-adamantyl(1)amid

Xcc: N-Methyl-N-ethyl-valin

Xcx: N,N-Diethylvalin

Xda: N-Methyl-2-aminobutyroyl

Xdb: 2-Aminobutyroyl

Xdc: N,N-Dimethyl-2-aminobutyroyl

Xdd: N,N-Dimethyl-2-tert-butylglycin

Xde: N,N-Dimethyl-isoleucin

Xdf: 2-tert-Butylglycin

Xdl: N-Methyl-2-tert-butylglycin
Erfindungsgemäße Verbindungen können mit üblichen Methoden, zu denen beispielsweise die nachstehend beschriebenen Methoden gehören, auf Antikrebs-Aktivität untersucht werden.
A. In vitro-Methodik
Die Zytotoxizität wurde gemessen, indem man eine Standard-Methodik für adhärente Zelllinien verwendete, wie den Mikrokultur-Tetrazolium-Assay (MTT). Genaueres zu diesem Assay ist veröffentlicht (Alley, M. C. et al., Cancer Research 48: 589–601, 1988). Exponentiell wachsende Kulturen von Tumorzellen, wie die des HT-29-Colonkarzinoms oder LX-1-Lungentumors werden verwendet, um Mikrotiterplatten-Kulturen anzulegen. Die Zellen werden zu 3000 Zellen pro Well in 96-Well-Platten (in 150 μl-Medium) ausgesät und über Nacht bei 37°C angezogen. Die Testverbindungen werden zugegeben, in 10-fachen Verdünnungen über einen Bereich von 10^–4 M bis 10^–10 M. Die Zellen werden dann 72 Stunden inkubiert. Um die Anzahl lebensfähiger Zellen in jedem Welt zu bestimmen, wird der MTT-Farbstoff zugegeben (50 μl einer 3 mg/ml-Lösung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid in Kochsalzlösung). Dieses Gemisch wird 5 Stunden bei 37°C inkubiert, und dann werden 50 μl 25% SDS, pH = 2, in jedes Well gegeben. Nachdem man über Nacht inkubiert hat, wird die Extinktion eines jeden Wells bei 550 nm mit einem ELISA-Lesegerät aufgenommen. Es werden die Werte für den Mittelwert +/– Standardabweichung aus den Daten wiederholter Wells berechnet, wobei man die Formel %T/C (% behandelte, lebensfähige Zellen/Kontrolle) verwendet.
Diejenige Konzentration der Testverbindung, die eine T/C von 50% Wachstumsinhibition ergab, wurde als der IC₅₀-Wert bezeichnet.
B. In vivo-Methodik
Erfindungsgemäße Verbindungen wurden weiterhin in einem präklinischen Assay auf eine in vivo-Aktivität getestet, die für die klinische Brauchbarkeit spricht. Derartige Assays wurden mit Nacktmäusen durchgeführt, auf die Tumorgewebe, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, transplantiert worden war (Xenotransplantat). Dies ist auf dem vorliegenden Gebiet hinlänglich bekannt. Die Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer Antitumor-Wirksamkeit bewertet, nachdem sie den Mäusen, die das Xenotransplantat aufwiesen, verabreicht worden waren.
Genauer gesagt, wurden humane Brusttumoren (MX-1), die in athymischen Nacktmäusen gewachsen waren, auf neue Empfängermäuse transplantiert, wobei man Tumorfragmente von etwa 50 mg Größe verwendete. Der Transplantationstag wurde als Tag 0 bezeichnet. 6 bis 10 Tage später wurden die Mäuse in Gruppen von 5–10 Mäusen für jede Dosis mit den Testverbindungen behandelt, wobei man eine intravenöse Injektion gab. Die Verbindungen wurden 3 Wochen lang jeden zweiten Tag mit einer Dosis von 1–100 mg/kg Körpergewicht verabreicht.
Tumordurchmesser und Körpergewicht wurden zweimal wöchentlich gemessen. Tumorvolumina wurden berechnet, indem man die mit Vernier-Calipers gemessenen Durchmesser und die Formel (Länge × Breite2)/2 = mm3 Tumorvolumenverwendete. Mittlere Tumorvolumina werden für jede Behandlungsgruppe berechnet, und T/C-Werte für jede Gruppe bezogen auf die unbehandelten Kontrolltumoren bestimmt.
Die neuen Verbindungen besitzen gute tumorhemmende Eigenschaften.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid der Formel (Ia) (CH₃)₂N-CH(CH(CH₃)₂)-CO-(Valyl)-(N-Methyl-valyl)-(Prolyl)-(Prolyl)-K (Ia)worin K für -NHC(CH₃)₃, -NHCH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)C(CH₃)₃, -N(CH₃)OCH₂CH₃, -N(CH₃)OCH₂CH₂CH₃, -N(CH₃)OCH(CH₃)₂, -N(CH₃)O(CH₂)₃CH₃, -N(CH₃)OCH₂C₆H₅, -NHC(CH₃)₂C₆H₅, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)(CH₂CH₃)₂, -NHCH[CH(CH₃)₂]₂, -NHC(CH₃)₂CN, -NHCH(CH₃)CH(OH)C₆H₅, -NH-C(CH₃)₂CH≡CH₂, -NHC(CH₃)₂C≡CH, -NHC(CH₂CH₃)₂C≡CH, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₂OH, -NHC(CH₃)₂CH(CH₃)₂, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)₂CH₂C₆H₅, -N(OCH₃)CH(CH₃)₂, -N(OCH₃)CH₂CH₃, -N(OCH₃)CH₂CH₂CH₃, -N(OCH₃)CH₂C₆H₅, -N(OCH₃)C₆H₅, -N(CH₃)OC₆H₅, -N(OCH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃ steht, oder K für -NHCH(C₂H₅)₂, -NHCH(C₂H₅)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH(CH₃)₂, -NHC(CH₃)₂C₂H₅, -NHC(CH₃)₂CH(CH₃)₂, -NHCH(C₃H₇)₂, -NHCH(C₂H₅)C₃H₇, -NHCH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)C₂H₅, NH-Cyclohexyl, NH-Cycloheptyl steht, oder K für
steht, oder K für
steht, und Salze davon mit physiologisch verträglichen Säuren.
Peptid nach Anspruch 1, worin K für -NHC(CH₃)₃, -NHCH(CH₃)C₂H₅, -NHCH(C₂H₅)₂, -NHCH(C₂H₅)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)C(CH₃)₃, -NHC(CH₃)₂C₂H₅, -NHCH[CH(CH₃)₂]₂, -NHC(CH₃)₂CH(CH₃)₂, -NHCH(C₃H₇)₂, -NHCH(C₂H₅)C₃H₇, -NH-Cyclohexyl, NH-Cycloheptyl, -N(CH₃)OC₃H₇, -NHC(CH₃)₂C₆H₅, -NHC(CH₃)(CH₂CH₃)₂, -NHC(CH₃)₂C≡CH, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₂OH, NHCH(CH₃)₂, -N(OCH₃)CH₂C₆H₅ steht, oder K für
steht, und Salze davon mit physiologisch verträglichen Säuren.
Peptid nach Anspruch 1, worin K für -NHC(CH₃)₃ steht, und Salze davon mit physiologisch verträglichen Säuren.
Peptid oder Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur therapeutischen Verwendung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid oder ein Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verwendung eines Peptid oder Salzes nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Salzes nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man mittels Lösungs- oder Festphasensynthese geeignete Aminosäuren oder Derivate davon sequentiell zusammenbaut und/oder geeignete Peptidfragmente miteinander verbindet, und das resultierende Peptid gewinnt.