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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen und
insbesondere die Behandlung von Claudicatio intermittens.
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Die Zunahme der Größe der älteren Population
hat, zusammen mit Faktoren wie dem hohen Vorkommen von Zigarrettenrauchen
und schlechter Ernährung,
zu einer Zunahme der Patienten geführt, die Zeichen von peripherer
arterieller Verschlußkrankheit
zeigen.
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Zu den klinischen Anzeichen von Ischämie in den
Gliedmaßen
zählen
beispielsweise Muskelschmerzen, die sich bei körperlicher Betätigung bemerkbar
machen, jedoch beim Ruhen verschwinden. Dieses Phänomen ist
allgemein als Claudicatio intermittens bekannt. Typischerweise spürt der Patient
nach dem Zurücklegen
einer relativ kurzen Strecke, beispielsweise. 100 m, einen krampfhaften
Schmerz im Bein. Nachdem der Patient einige Minuten geruht hat,
verschwindet der Schmerz gewöhnlich
wieder, tritt aber nach Zurücklegen der
gleichen kurzen Strecke wieder auf.
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Während
der Glycolyse wird Glucose in Pyruvat umgewandelt. Der Abbau von
Aminosäuren
wie Alanin, Serin und Cystein führt
ebenfalls zur Bildung von Pyruvat. Das metabolische Schicksal von
Pyruvat hängt vom
jeweiligen Gewebe ab. Eine Reaktion von Pyruvat, die in den mitochondriellen
Kompartimenten von Zellen abläuft,
ist seine oxidative Decarboxylierung zu Acetyl-CoA. Diese Umwandlung
wird durch den Enzymkomplex Pyruvatdehydrogenase (PDH) katalysiert.
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In der Literatur gibt es viele Berichte
darüber,
daß Dichloracetat
(DCA) unter anderem die Eigenschaft hat, daß es PDH-Kinase hemmt. Tierversuche
mit PDH- Kinaseinhibitoren
von Hatta und Atomi (1994, Biochemistry of Exercise Meeting, Aberdeen,
Juli 1994) zeigten, daß DCA
die Lactatoxidation erhöht
und die Ausdauer normaler Mäuse
im Laufrad um 20% verbesserte. Weiterhin wurde berichtet (Ludvik
et al., 1993; Pflüg.
Arch. 423: 251–254),
daß DCA
die Lactatproduktion in Probanden bei maximaler und 50% maximaler
Belastung um bis zu 30% verminderte und die maximale Arbeitskapazität um 10%
erhöhte.
Bei Anginapatienten, denen Katheter gelegt wurden, erhöhte DCA
das Schlagvolumen um 13%, ohne daß es zu Änderungen bei der Pulsfrequenz
oder dem linksventrikulären
inotropen Zustand (LV dp/dtmax) kam. Die Herzmuskeleffizienz wird
ebenfalls von 24% auf 32% erhöht
(Wargovich et al., 1988; Am. J. Cardiol. 61: 65–70). Weiterhin wurde von förderlichen
Wirkungen von DCA bei Patienten mit Klasse-III-Herzversagen berichtet
(Chatergee et al., 1994; J. Am. Coil. Cardiol. 23: 1617–1624).
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Der vorliegenden Erfindung liegt
die Entdeckung zugrunde, daß die
Aktivierung von Pyruvatdehydrogenase zu einer Verbesserung der Funktion
ischämischer
Muskeln in Gliedmaßen
und somit bei medizinischen Leiden wie Claudicatio intermittens
führt.
Die vorliegende Erfindung basiert insbesondere auf der unerwarteten
Entdeckung, daß sich
durch die Inhibierung von PDH-Kinase
eine Verbesserung der Funktion ischämischer Muskeln in Gliedmaßen und
somit bei medizinischen Leiden wie Claudicatio intermittens erzielen
läßt.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird die Verwendung eines Pyruvatdehydrogenase-aktivierenden Mittels
zur Herstellung eines Medikaments, das Pyruvatdehydrogenase in Warmblütern wie
dem Menschen aktiviert, zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen bereitgestellt.
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Das Medikament kann insbesondere
zur Behandlung von Claudicatio intermittens eingesetzt werden.
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Das Medikament ist zur Verwendung
bei einem Verfahren zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen bei
Warmblütern
wie dem Menschen bestimmt, bei dem man eine wirksame Menge eines
Pyruvatdehydrogenase-aktivierenden Mittels verabreicht.
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Insbesondere wird ein Verfahren zur
Behandlung von Claudicatio intermittens bei Warmblütern wie dem
Menschen bereitgestellt, bei dem man eine wirksame Menge eines Pyruvatdehydrogenase-activierenden Mittels
verabreicht.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Mittel eignen
sich somit zur Behandlung von peripherer Verschlußkrankheit
bei einem Verfahren zur Behandlung von peripherer Verschlußkrankheit
bei Warmblütern
wie dem Menschen, bei dem man eine wirksame Menge eines wie hier
definierten Mittels verabreicht.
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Die Hauptquellen für Energiesubstrat
für Skelettmuskel
sind Fettsäuren
und Kohlenhydrate, mit respiratorischen Austauschquotienten (respiratory
quotients, RQ) von 0,7 bzw. 1,0. Unter Ruhebedingungen hat Skelettmuskel
normalerweise einen RQ um 0,7, der während anstrengender Betätigung auf
etwa 1,0 ansteigt. Bei Patienten mit Claudicatio intermittens ist
jedoch die Fähigkeit,
die Substratversorgung umzuschalten, gestört, da der respiratorische
Austauschquotient während
der Betätigung
der Gliedmaße
mit den Symptomen nur in begrenztem Ausmaß ansteigt (Lundgren et al.,
1988; Am. J. Physiol. 255: H1156–H1164). Der reduzierte RQ
deutet auf eine größere Fettsäureabhängigkeit
bei der ATP-Synthese in der Gliedmaße mit Ischämie hin. Obwohl sich das symptomatische
Glied durch Erhöhung
der Sauerstoffextraktion auf die geringe Zufuhr reagiert, ist dies
nicht ausreichend, um die Oxidation von Fettsäuren zur ATP-Herstellung, bei
der zur Produktion von ATP 14% mehr Sauerstoff erforderlich ist
als bei Kohlenhydratquellen, aufrechtzuerhalten.
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Die Erfinder gingen davon aus, daß sich die
Fähigkeit
zur Aufrechterhaltung der ATP-Konzentrationen und somit der Muskelfunktion
verbessern lassen sollte, wenn es möglich wäre, den Stoffwechsel in der
Gliedmaße
mit den Symptomen auf den sauerstoffeffizienteren Kohlenhydratmetabolismus
umzuschalten.
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Ein von den Erfindern untersuchter
Ansatz zur Verbesserung der Nutzung von Kohlenhydraten ist die vermehrte
Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA durch Aktivierung von Pyruvatdehydrogenase
(PDH). Die Aktivierung von PDH wird durch eine Reihe von Faktoren
geregelt, wobei der Phosphorylierungsgrad der E1-Untereinheit der wichtigste dieser Faktoren
ist. Die Phosphorylierung führt
zu einer Inaktivierung des PDH-Komplexes,
und dieser Prozeß wird
durch eine Phosphatase und ein Kinaseenzym reguliert. Die Erfinder gehen
davon aus, daß eine
Inhibierung der PDH-Kinase die Phosphorylierung von PDH hemmen und
zu einer vermehrten Pyruvat- und somit Kohlenhydratoxidation führen würde.
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Die Erfinder haben unerwarteterweise
gefunden, daß,
wenn vor einer Betätigung
der sauerstoffeffizientere Kohlenhydratmechanismus aktiviert ist,
ein Pool von Acetylgruppen produziert wird. Dieser Pool steht während der
Betätigung
für den
Eintritt in den TCA-Zyklus
bereit, was eine sauerstoffeffiziente ATP-Produktion und eine verbesserte Skelettmuskelfunktion
zur Folge hat.
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Dichloracetat (DCA), das heißt Dichloressigsäure und
deren Salze, ist als Mittel bekannt, das PDH-Kinase hemmt.
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Das Mittel kann ein beliebiges PDH-aktivierendes
Mittel enthalten. Diese Eigenschaft läßt sich mit dem Fachmann gut
bekannten Standardlaborverfahren bestimmen. Mittel, die dazu fähig sind,
PDH zu aktivieren, können
beispielsweise identifiziert werden, indem man die PDH-Aktivität mit Methoden
mißt,
die auf der NADH-Bildungsrate,
der 14CO2-Bildungsrate
oder der Acetyl-CoA-Bildungsrate
basieren. Eine besonders geeignete Methode wurde von Dumitru Constantin-Teodosiu
in seiner Doktorarbeit „Regulation
of pyruvate dehydrogenase complex activity and acetyl group formation
in skeletal muscle during exercise", Stockholm 1992, erhältlich von
der Abteilung für
klinische Chemie, Karolinska-Institut,
Huddinge Universitätsklinik,
S-14186 Huddinge, Schweden, beschrieben. Dieses Verfahren wurde
auch von Constantin-Teodosiu, D. et al., „A sensitive radioisotopic
assay of pyruvate dehydrogenase complex in human muscle tissue", Anal. Biochem.,
Band 198, S. 347–351,
1991, veröffentlicht.
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Zu den besonders geeigneten Assays
für die
Identifizierung von Verbindungen, die PDH aktivieren, gehören beispielsweise
die von Kerby und Randle, Biochem. Journal, 231, (1985), 523–529 oder
von Brooks und Storey, Analytical Biochemistry, 212, (1993), 452-456 beschriebenen
Methoden.
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Im allgemeinen enthält das Mittel
vorzugsweise ein Mittel, das das Enzym Pyruvatdehydrogenase-Kinase
(PDH-Kinase) hemmt,
und gemäß einer
besonderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird somit die Verwendung eines Pyruvatdehydrogenase-aktivierenden
Mittels zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen (und
insbesondere zur Behandlung von Claudicatio intermittens) bereitgestellt.
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Zu den bevorzugten Mittel gehören somit
chemische Verbindungen, die PDH-Kinase hemmen. Diese Eigenschaft
läßt sich
mit dem Fachmann wohlbekannten Standardlaborverfahren, beispielsweise
durch Methoden in Anlehnung an die oben in Bezug auf die Identifizierung.
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von PDH-Aktivatoren erwähnten Methoden,
wie den von Kerby und Randle, Biochem. Journal, 231, (1985), 523-529 oder von Brooks
und Storey, Analytical Biochemistry, 212, (1993), 452-456 beschriebenen, bestimmen.
Für den
Fachmann ist die Abwandlung der oben in Bezug auf PDH erwähnten Assays
zu Assays für
die Identifizierung von PHD-Kinasehemmern eine Routinemodifikation.
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Wie oben erwähnt ist DCA ein Mittel, von
dem man weiß,
daß es
PDH-Kinase hemmt. Bei den unten beschriebenen experimentellen Verfahren
wird DCA eingesetzt, um zu zeigen, daß PDH-Kinasehemmer die Geschwindigkeit,
mit der bei betäubten
Hunden mit eingeschränkter
Blutzufuhr eine Ermüdung
der kontrahierenden Skelettmuskeln eintritt, in gleichem Ausmaß wie bei
Patienten mit Claudicatio intermittens reduzieren kann. Die unten
beschriebenen experimentellen Verfahren zeigen somit, daß sich Mittel,
die zur Aktivierung von PDH geeignet sind, und insbesondere Mittel,
die PDH-Kinase hemmen können,
zur Behandlung von Claudicatio intermittens geeignet sind.
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Zu den bevorzugten PDH-Kinase-inhibierenden
Mitteln gehören
beispielsweise Dichloressigsäure
und deren Derivate und Salze. Zu den Derivaten zählen beispielsweise Esterderivate.
Geeignete Esterderivate sind u. a. Alkyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkylalkyl-
und Phenylalkylester, bei denen die Phenyleinheit gegebenenfalls substituiert
sein kann.
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In einer besonderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung
der Formel I oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes davon,
wobei: R aus Wasserstoff,
(1-10C)Alkyl, (3-10C)Cycloalkyl, (3-10C)Cycloalkyl(1-10C)alkyl und Phenyl(1-10C)alkyl,
in welchem die Phenyleinheit gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten
tragen kann, ausgewählt
ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen und
insbesondere zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von
Claudicatio intermittens bereitgestellt.
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Zu den Werten für gegebenenfalls an einer Phenyleinheit
vorhandene Substituenten gehören
beispielsweise unabhängig
voneinander aus Halogen, (1-4C)Alkyl, (3-6C)Alkenyl, (1-4C)Alkoxy, Cyano, Trifluormethyl,
Nitro, Carboxy, Amino, (1-4C)Alkylamino, Dialkylamino mit bis zu
sechs Kohlenstoffatomen, (1-4C)Alkylthio, (1-4C)Alkylsulfinyl, (1-4C)Alkylsulfonyl
und (1-4C)Alkylendioxy
ausgewählte
Werte.
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Besondere Werte für gegebenenfalls an einer.
Phenyleinheit vorhandene Substituenten schließen beispielsweise
für Halogen
Fluor, Chlor und Brom;
für
Alkyl Methyl, Ethyl und Propyl;
für Alkenyl Allyl und 2-Methyl-2-propenyl;
für Alkoxy
Methoxy, Ethoxy und Propoxy;
für Alkylamino Methylamino und
Ethylamino;
für
Dialkylamino Dimethylamino und Diethylamino;
für Alkylthio
Methylthio und Ethylthio;
für
Alkylsulfinyl Methylsulfinyl und Ethylsulfinyl;
für Alkylsulfonyl
Methylsulfonyl und Ethylsulfonyl; und
für Alkylendioxy Methylendioxy
und Isopropylidendioxy
ein.
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Zu den besonderen Werten für R zählen beispielsweise:
| für Alkyl | (1-6C)Alkyl
wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Pentyl oder Hexyl; |
| für Phenylalkyl | Phenyl
(1-4C)alkyl wie Benzyl, Phenylethyl oder Phenylpropyl; |
| für Cycloalkyl | (3-6C)Cycloalkyl
wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl; |
| für Cycloalkylalkyl | (3-6C)Cycloalkyl(1-4C)alkyl wie
Cyclopropylmethyl, Cyclopentylmethyl, Cyclohexylmethyl oder 2-(Cyclohexyl)ethyl |
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Bei einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung handelt es sich bei der Verbindung um eine Verbindung
der Formel I oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon,
wobei R für
Wasserstoff steht.
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Bei einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Verbindung um
eine Verbindung der Formel I, in der R aus (1-10C)Alkyl, (3-10C)Cycloalkyl, (3-10C)Cycloalkyl(1-10C)alkyl und
Phenyl(1-10C)alkyl, in welchem die Phenyleinheit gegebenenfalls
einen oder mehrere Substituenten tragen kann, ausgewählt ist.
Besondere, bevorzugte und spezielle werte schließen die oben erwähnten Werte
ein.
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Als pharmazeutisch unbedenkliche
Salze der vorliegenden Erfindung eignen sich die, die mit einer Base
gebildet werden, die ein pharmazeutisch unbedenkliches Kation liefert.
Als Basen eignen sich Alkalisalze (wie Natrium- oder Kaliumsalze),
Erdalkalisalze (wie Calcium- oder Magnesiumsalze), Ammoniumsalze
und Salze mit einer organischen Base, die ein physiologisch unbedenkliches
Kation liefert, wie Salze mit Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin,
Piperidin oder Morpholin.
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Die gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendeten Verbindungen lassen sich durch Standardverfahren der
organischen Chemie erhalten, von denen bereits bekannt ist, daß sie sich
auf die Herstellung strukturanaloger Verbindungen anwenden lassen.
Solche Vorschriften für
die Darstellung von Verbindungen der Formel I bzw. von deren pharmazeutisch
unbedenklichen Salzen werden durch die folgenden bevorzugten Verfahren
veranschaulicht, wobei R eine beliebige der hier definierten Bedeutungen
haben kann.
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Verbindungen der Formel I, in denen
R nicht für
Wasserstoff steht, lassen sich somit herstellen, indem man die Verbindung
der Formel I (Cl2CHCO2R),
in der R für
Wasserstoff steht (das heißt
Dichloressigsäure), mit
einer Verbindung der Formel ROH unter den für die Veresterung von Carbonsäuren angewendeten
Standardbedingungen umsetzt. Die Reaktion wird somit im allgemeinen
in Gegenwart eines sauren Katalysators und gewöhnlich in Gegenwart eines geeigneten
Lösungsmittels
durchgeführt.
Es leuchtet ein, daß man
den Alkohol (ROH) selbst als Lösungsmittel
verwenden kann. Als Katalysatoren eignen sich beispielsweise Mineralsäuren wie
konzentrierte Schwefelsäure
oder Salzsäure
und organische Säuren
wie p-Toluolsulfonsäure. Als
Lösungsmittel
eignen sich beispielsweise inerte Kohlenwasserstoffe wie Toluol.
Die Umsetzung kann durch Verwendung eines Überschusses an Alkohol (ROH)
und/oder Entfernen von während
der Reaktion gebildeten Wassers durch azeotrope Destillation oder
den Einsatz von Molekularsieben unterstützt werden.
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Die Verbindungen der Formel I, in
denen R nicht für
Wasserstoff steht, können
auch durch Umsetzung von Dichloressigsäure mit dem entsprechenden
Alkohol der Formel ROH in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels
dargestellt werden. Als Dehydratisierungsmittel eignen sich beispielsweise
Dicyclohexylcarbodiimid, N,N`-Carbonyldiimidazol und Azodicarbonsäurediethylester/Tri phenylphosphin.
Die Umsetzung läßt sich in
einem inerten Lösungsmittel
wie einem Kohlenwasserstofflösungsmittel
(zum Beispiel Toluol) bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis
zur Rückflußtemperatur
der Reaktionsmischung durchführen.
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Dichloressigsäure und deren Salze sind allgemein
verfügbar
und im Handel erhältlich.
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Benötigt man ein pharmazeutisch
unbedenkliches Salz einer Verbindung der Formel I, so läßt sich
dies beispielsweise durch Umsetzung der Verbindung mit der entsprechenden
Base (die ein physiologisch unbedenkliches Kation liefert) oder
durch eine andere herkömmliche
Vorschrift zur Bildung von Salzen erhalten. In einigen Fällen kann
sich die Verbindung einer basischen Gruppe bzw. Einheit nähern, so
daß sich
die Salze auch durch Umsetzung der Verbindung mit der entsprechenden
Säure (die
ein physiologisch unbedenkliches Anion liefert) darstellen läßt.
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Wie oben erwähnt können die Verbindungen zur Behandlung
von Ischämie
in Gliedmaßen
und insbesondere zur Behandlung von Claudicatio intermittens eingesetzt
werden. Bei einer Verwendung zur Behandlung von Krankheiten und
medizinischen Leiden wie Claudicatio intermittens wird in Betracht
gezogen, die Verbindung der Formel I (bzw. deren pharmazeutisch
unbedenkliches Salz) oral, intravenös oder auf eine andere medizinisch
unbedenkliche Route zu verabreichen, so daß man eine Dosis im allgemeinen
Bereich von beispielsweise 0,01 bis 500 mg pro kg Körpergewicht
erhält.
Ein Beispiel für
eine in Betracht gezogene Dosis ist eine Dosis im allgemeinen Bereich
von 35–50
mg pro kg Körpergewicht.
Es versteht sich jedoch, daß die
genaue verabreichte Dosis natürlich
von der Art und dem Schweregrad der Krankheit, dem Alter und dem
Geschlecht des behandelten Patienten und dem Verabreichungsweg abhängt.
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Im allgemeinen werden die Verbindungen
der Formel I (bzw. ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon)
gewöhnlich
in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das heißt zusammen
mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel oder Träger, verabreicht,
und eine solche Zusammensetzung wird als weiteres Merkmal der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt. Die Verbindung wird in einer Menge vorliegen,
die die zu behandelnde Krankheit, beispielsweise Ischämie in Gliedmaßen, wirksam
behandelt.
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Eine gemäß der vorliegenden Erfindung
hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung kann in verschiedenen
Dosierungsformen vorliegen. Sie kann beispielsweise in Form, von
Tabletten, Kapseln, Lösungen oder
Suspensionen zur oralen Verabreichung, in Form eines Zäpfchens
zur rektalen Verabreichung oder in Form einer sterilen Lösung oder
Suspension zur parenteralen Verabreichung wie z. B. durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion
vorliegen.
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Eine Zusammensetzung läßt sich
nach herkömmlichen
Vorschriften unter Anwendung von im Stand der Technik gut bekannten
pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln und Trägern erhalten.
Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können zweckmäßigerweise mit einer Beschichtung
wie z. B. einem magensaftresistenten Überzug (zum Beispiel auf Grundlage
von celluloseacetatphthalat) versehen werden, um die Auflösung des
Wirkstoffs der Formel I (bzw. eines pharmazeutisch unbedenklichen
Salzes davon) im Magen auf ein Mindestmaß abzusenken oder um einen
unangenehmen Geschmack zu maskieren.
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Die Erfindung wird jetzt anhand der
beigefügten
nicht einschränkenden
experimentellen Methoden ausführlicher
beschrieben. Bei den folgenden experimentellen Methoden.
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wurde der PDH-Kinase-Inhibitor Dichloracetat
eingesetzt, um zu bestimmen, ob Inhibitoren von PDH-Kinase die Ermüdungsgeschwindigkeit
bei der Kontraktion von Skelettmuskeln von betäubten Hunden, bei denen die
Blutzufuhr im gleichen Ausmaß wie
bei Patienten mit Claudicatio intermittens eingeschränkt ist, absenken
können.
Geeignete DCA-Dosen schließen
diejenigen im Bereich von 30 bis 300 mg·kg–1 ein.
Bei den folgenden experimentellen Methoden wurde DCA (in einer Dosis
von 300 mg·kg–1)
als Natriumsalz von Dichloressigsäure verabreicht.
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Experimentelle Methoden
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Weiblichen Alderley Park-Beagle (12–18 kg)
wurde 30 Minuten vor der Betäubung
mit Natriumpentobarbiton (45 mg·kg–1,
i. v., Sagatal.) Morphium (10 mg, i. m.) verabreicht. Die Hunde
wurden jeweils mit einem endotrachealen Schlauch intubiert und künstlich
mit Raumluft beatmet, wobei eine Beatmungspumpe mit positivem Druck
(Modell 16/24, Palmer Bioscience) zum Einsatz kam. Die Beatmung
mit Raumluft wurde mit einer Geschwindigkeit von 17 Hüben pro
Minute und einem Hubvolumen von 250 ml begonnen. Während der ganzen
Zeit wurde die Rektaltemperatur kontrolliert und mit einer homeothermischen
Heizdecke (Harvard Instruments, Edenbridge, Kent, UK) aufrechterhalten
(Bereich 36,2°C –3a,6°C).
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Operativer Eingriff
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Die linke äußere Halsvene wurde zur kontinuierlichen
Verabreichung von Anästhetikum
(Natriumpentobarbiton, 12 mg/ml mit einer Geschwindigkeit von 5–6 ml/Stunde)
unter Verwendung einer Infusionspumpe (Injectomat S. Fresenius,
Villiers, Frankreich) kanüliert.
Die rechte A. brachialis wurde kanüliert und mit einem Druckumwandler
verbunden. Alle Drücke
wurden mit Strain-gauge-Manometern
(PDCR 75, Druck Ltd., Barendeecht, Niederlande), die mit Gleichstrombrückenverstärkern (Lectromed,
MT8P, St. Peter, Jersey) verbunden waren, gemessen. Die Druckumwandler
wurden zu Beginn jedes Experiments mit einer Quecksilbersäule geeicht.
Die Pulsfrequenz wurde elektronisch von diesem Drucksignal abgeleitet.
Die linke A. brachialis wurde zur Entnahme arterieller Blutproben
kanüliert
und zur Kontrolle, des Blutgas-Status der Tiere (280 Bood Gas System,
Ciba-Corning, Medfield,
M. A., USA) verwendet. Die rechte V. cubitalis wurde zur Infusion
von Heparin (1 IE kg–1 min–1,
Multiparin), das 30 Minuten vor Anschluß des extrakorporealen Perfusionskreislaufs
verabreicht wurde, kanüliert.
Die linke V. cubitalis wurde zur Verabreichung von 1M HCO3 (Polyfusor,
Fresenius Healthcare, Basingstoke, Großbritannien), wodurch der arterielle
pH-Wert im normalen Bereich gehalten wurde, kanüliert.
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An beiden Läufen wurden die M. gracilis
unter Anwendung von Diathermie (V.I.C.3, The Genito-Urinary Mfg
Co Ltd, Großbritannien)
und stumpfen Präparationsverfahren
freigelegt. Die M. gracilis der beiden Hinterläufe wurden freigelegt und gefäßmäßig isoliert,
so daß lediglich
die arterielle Versorgung und der venöse Abfluß des M. gracilis sichergestellt
waren. Dies wurde erreicht, indem man mit Ausnahme der den M. gracilis versorgenden
Zweige alle Zweige der A. femoralis und der V. femoralis zwischen
A. profunda femoris und A. poplitea bzw. V. profunda femoris und
V. poplitea ligierte. Die mittlere V. femoralis caudalis wurde kanüliert und die
Kanüle
wurde in die V. femoralis vorgeschoben, so daß sich ihre Spitze distal zur
V. gracilis befand. Die v. poplitea wurde distal zur V. saphena
medialis abgebunden, um einen venösen Rückstrom aus den niedrigen und
tiefen Teilen des Laufs zu verhindern. Alle anderen Zweige, die
ihren Ursprung in der V. femoralis oder der V. saphena hatten und
nicht vom M. gracilis stammten, wurden abgebunden. In beiden Läufen wurde
zur Aufnahme der Perfusionsdrücke
im M. gracilis die A. poplitea kanüliert und mit einem Druckumwandler
verbunden.
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Die N. obturatorii wurden identifiziert,
und ein kleiner Abschnitt wurde freipräpariert und zentral gequetscht.
In den distalen Abschnitt der einzelnen Nerven wurden Stimulierungselektroden
gelegt. Die Muskelkontraktion wurde mit Stimulierungsparametern
mit einer Dauer von 0,1 msec, 10 V, 0,3–3 Hz, begonnen. Die Muskeln
wurden an ihrem Ursprung und am Ansatz freipräpariert. An die Sehnen am Ursprung
des Muskels angebrachte starke Fäden
(75% Polyester/25% Baumwolle) wurden an einen festen Pfosten, der
als Verankerung diente, gebunden. An die Sehnen am Ansatz gebundene
Fäden wurden
zur Aufnahme der isometrischen Spannung mit Kraftumwandhern (FTC10,
Grass, Quincy, M. A., USA) verbunden. Die Erschöpfung der Muskeln wurde über die
Gleichung: Erschöpfung
= (Spitzenspannung – Endspannung)/Spitzenspannung
gemessen. Die Blutzufuhr zum linken M. gracilis durfte sich während der
Muskelkontraktion ändern,
wobei der Blutstrom mit einem um die A. femoralis. gelegten elektromagnetischen
Strömungsmesser
(Durchmesser 10–14 mm,
Carolina Medical Electronics, King, North Carolina, U.S.A.) gemessen
wurde. Der Nullwert für
den Blutstrom wurde mit einem distal zum Strömungsmesser gelegten Schlingenverschluß bestimmt.
Nach dem Ende des Experiments wurde der Strömungsmesser in situ mit dem
Eigenblut der Hunde geeicht. Die Blutzufuhr zum rechten M. gracilis
wurde auf eine konstante Rate eingestellt. Nach 30minütiger Heparininfusion
(1 IE kg–1 min–1 i.
v.) wurde die rechte A. femoralis proximal und distal kanüliert und
mit einer Walzenperfusionspumpe (miniplus3, Gilson, Villiers le
bel, Frankreich) verbunden. Der rechte M. gracilis wurde mittels
Pumpe mit einer konstanten Durchflußrate, die dem arteriellen
Blutdruck entsprach, perfundiert. Bevor mit dem Experimentprotokoll
begonnen wurde, ließ man
ungefähr
30 Minuten lang äquilibrieren,
wobei die Blutgase gemessen und, falls erforderlich, korrigiert
wurden. Alle Parameter wurden mit einem 8- Kanal-Papierschreiber (Graftech Linearcorder,
Mk 8 WR3500, Nantwich, Großbritannien)
aufgezeichnet.
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Es wurde gefunden, daß die Muskelermüdung nach
der Behandlung mit DCA von 46,5% (±3,6%) auf 25,0% (±3,2%)
reduziert war.
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Protokoll
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Die Tiere wurden in Gruppen, die
mit DCA, und Gruppen, die mit Vehikel (isotonischer Kochsalzlösung) behandelt
wurden, aufgeteilt. DCA bzw. Vehikel wurden nach erfolgter Operation
als konstante Infusion verabreicht. 45 Minuten später wurde
mit der Kontraktion begonnen. Die Ermüdung der Muskeln wurde sowohl in
den normalen Muskeln als auch in den Muskeln mit eingeschränkter Blutzufuhr
gemessen. Proben arteriellen Bluts wurden aus der A. brachialis
und Proben venösen
Bluts wurden jeweils aus den M. gracilis im Ruhezustand, bei der
Kontraktion und nach der Erholung entnommen. Die. Kontraktionsdauer
belief sich auf 20 Minuten Stimulierung mit 3 Hz. Für die Blutgasanalyse
entnommene Blutproben (0,4 ml) wurden sofort analysiert. Die aufgenommenen
Parameter waren pH-Wert, pCO2, pO2, Sauerstoffsättigung und Gesamthämoglobin. weitere
Proben (1,0 ml) wurden für
die Analyse der Konzentrationen von Lactat, Glucose und nicht veresterten Fettsäuren (NVFS)
entnommen.
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Analytische Methoden
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Die Proben wurden in 0,05 ml 3,2%iger
Trinatriumcitratlösung
aufgenommen und sofort zentrifugiert (Zentrifuge 5415,
Eddendorf, 13000 U/min, 5 Minuten). Das Plasma wurde sofort abgenommen
und jeweils für die
Assays aliquotiert. Die Analyse auf Lactat (Lactatreagenskit, Sigma
Diagnostics) erfolgte umgehend. Die Plasmaproben für die Glucoseanalyse
wurden auf Eis gelagert und am Ende des Experiments gemessen (Glucose-Autostat
GA 1120, Clandon). Plasmaproben für NVFS wurden für eine spätere Analyse
(NEFA-C-Kit, ACS-ACOD-Methode, Wako) eingefroren. Die Proben nach
der Erholung wurden entnommen, nachdem die Werte für den Blutdruck
und den Blutstrom wieder die. Ausgangswerte erreicht hatten, was
gewöhnlich
innerhalb von 15 Minuten nach Ende der Stimulierung der Fall war.
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Muskelmetaboliten
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Nach der Entnahme der Blutproben
nach dem Erholen und nach der Infusion von Wirkstoff/Vehikel wurde
aus den Muskeln jeweils eine Biopsie aus dem ausgeruhten Muskel
entnommen (Bergstrom-Nadel mit einem Durchmesser von 6 mm, Stille,
Schweden, und Allendale-Nadel mit einem Durchmesser von 6 mm, Edinburgh,
Schottland). Nach 20 Minuten Stimulierung wurde der Muskel dann
mit Klammern ruhiggestellt, wobei immer noch stimuliert wurde, und
ein kleiner Teil des Muskels wurde herausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff
eingefroren (der gesamte Vorgang dauerte weniger als 6 Sekunden,
wobei die obere Muskelschicht innnerhalb von 1 Sekunde gefroren
war). Die Muskelproben wurden dann bis zur Gefriertrocknung und
der Analyse in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt.
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Die Muskelproben wurden in zwei Portionen
geteilt, wobei die eine Portion für die Analyse von ATP, Phosphokreatin
(PKr), Kreatin (Kr) und intramuskulärem Lactat (Harris, R. et al.,
Scand. Journal Clin. Lab. Invest., 33, 109–120, 1974) bestimmt war. Die
andere Portion wurde naß in
flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Kurz gesagt wurde die erste Portion Muskel
gefriergetrocknet, von sichtbarem Bindegewebe und Blut freipräpariert und
dann pulverisiert, mit eiskalter Perchlorsäure (0,5 M) extrahiert und
mit Kaliumhydrogencarbonat (2,2 M) neutralisiert. Der Glykogengehalt
wurde durch die von Harris et al., 1974 (siehe oben) beschriebene
Methode bestimmt.
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Acetylcarnitin und freies Carnitin
wurden im gefriergetrockneten Extrakt durch die von Cederblad et
al., Anal. Biochem., 185, (1990), 274–278 beschriebene Methode und
die PDH-Aktivität
(nach der Erholung und während
Betätigung,
aktiv und gesamt) wurde aus einer Probe von nassem Gewebe unter
Anwendung der Methode von Constantin-Teodosiu, D. et al., „A sensitive
radioisotopic assay of pyruvate dehydrogenase complex in human muscle
tissue", Anal. Biochem.,
Band 198, S. 347–351,
1991, bestimmt. Diese Methode ist auch in Dumitru Constantin-Teodosiu,
Doktorarbeit „Regulation
of pyruvate dehydrogenase complex activity and acetyl group formation
in skeletal muscle during exercise", Stockholm 1992, aus der Abteilung
für klinische
Chemie, Karolinska-Institut, Huddinge Universitätsklinik, S-14186 Huddinge, Schweden, beschrieben.
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Die Änderungen bei den PKr- und
Lactat-Werten waren bei Verabreichung von DCA reduziert. Die Verfügbarkeit
von Acetylgruppen war bei den mit DCA behandelten Gruppen sowohl
im Ruhezustand als auch bei der Kontraktion (RF-Muskel) höher. Eine vollständige Umwandlung
von PDC läßt einen
größeren Pyruvatstrom durch
PDC zu und reduziert somit den anaeroben Beitrag zur ATP-Regeneration und
minimiert die Akkumulation von Lactat.
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Die oben beschriebenen Studien zeigen
insbesondere, daß eine
Erhöhung
der Verfügbarkeit
von Acetylgruppen im Ruhezustand zu einem größeren oxidativen Beitrag zur
ATP-Regeneration, einer wesentlichen Reduzierung des anaeroben Metabolismus
und einer deutlichen Verbesserung der Kontraktionsfähigkeit
der Skelettmuskeln bei ischämischen
Zuständen
führt.
Die Erfinder nehmen daher an (ohne an diese Theorie gebunden sein
zu wollen), daß die
Hauptwirkung von DCA die Reduktion der Akkumulation von Milchsäure und der
damit verbundenen schädlichen
Wirkungen des anaeroben Stoffwechsels sind.
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Diese Arbeiten werden in Timmons,
J.A. et al., J. Clin. Invest., Band 97, Nummer 3, Februar 1996, 879–883, die
hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist,
diskutiert.
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Für
die Darreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur therapeutischen
oder prophylaktischen Anwendung geeignete beispielhafte pharmazeutische
Dosierungsformen schließen
die folgenden Tabletten- und Kapselformulierungen ein, die durch
in der Pharmazie gut bekannte herkömmliche Verfahren erhältlich sind
und sich für
den therapeutischen bzw. prophylaktischen Gebrauch im Menschen eignen:
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Die Tablettenzusammensetzungen (a)–(c) können auf
herkömmliche
Weise magensaftresitent beschichtet sein, beispielsweise mit Celluloseacetatphthalat.
