DE69629282T2

DE69629282T2 - Verwendung eines pyruvatdehydrogenaseaktivators zur behandlung der ischämie in gliedern

Info

Publication number: DE69629282T2
Application number: DE69629282T
Authority: DE
Inventors: Dumitru University Park CONSTANTIN-TEODOSIU; Archibald James University Park TIMMONS; Leonard Paul University Park GREENHAFF; Martin Simon POUCHER
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-11
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-03-12
Also published as: EP0814801A2; DE69629282D1; GB9505082D0; ATE245980T1; JPH11501653A; EP0814801B1; WO1996028151A2; AU4950296A; WO1996028151A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen und insbesondere die Behandlung von Claudicatio intermittens.
Die Zunahme der Größe der älteren Population hat, zusammen mit Faktoren wie dem hohen Vorkommen von Zigarrettenrauchen und schlechter Ernährung, zu einer Zunahme der Patienten geführt, die Zeichen von peripherer arterieller Verschlußkrankheit zeigen.
Zu den klinischen Anzeichen von Ischämie in den Gliedmaßen zählen beispielsweise Muskelschmerzen, die sich bei körperlicher Betätigung bemerkbar machen, jedoch beim Ruhen verschwinden. Dieses Phänomen ist allgemein als Claudicatio intermittens bekannt. Typischerweise spürt der Patient nach dem Zurücklegen einer relativ kurzen Strecke, beispielsweise. 100 m, einen krampfhaften Schmerz im Bein. Nachdem der Patient einige Minuten geruht hat, verschwindet der Schmerz gewöhnlich wieder, tritt aber nach Zurücklegen der gleichen kurzen Strecke wieder auf.
Während der Glycolyse wird Glucose in Pyruvat umgewandelt. Der Abbau von Aminosäuren wie Alanin, Serin und Cystein führt ebenfalls zur Bildung von Pyruvat. Das metabolische Schicksal von Pyruvat hängt vom jeweiligen Gewebe ab. Eine Reaktion von Pyruvat, die in den mitochondriellen Kompartimenten von Zellen abläuft, ist seine oxidative Decarboxylierung zu Acetyl-CoA. Diese Umwandlung wird durch den Enzymkomplex Pyruvatdehydrogenase (PDH) katalysiert.
In der Literatur gibt es viele Berichte darüber, daß Dichloracetat (DCA) unter anderem die Eigenschaft hat, daß es PDH-Kinase hemmt. Tierversuche mit PDH- Kinaseinhibitoren von Hatta und Atomi (1994, Biochemistry of Exercise Meeting, Aberdeen, Juli 1994) zeigten, daß DCA die Lactatoxidation erhöht und die Ausdauer normaler Mäuse im Laufrad um 20% verbesserte. Weiterhin wurde berichtet (Ludvik et al., 1993; Pflüg. Arch. 423: 251–254), daß DCA die Lactatproduktion in Probanden bei maximaler und 50% maximaler Belastung um bis zu 30% verminderte und die maximale Arbeitskapazität um 10% erhöhte. Bei Anginapatienten, denen Katheter gelegt wurden, erhöhte DCA das Schlagvolumen um 13%, ohne daß es zu Änderungen bei der Pulsfrequenz oder dem linksventrikulären inotropen Zustand (LV dp/dtmax) kam. Die Herzmuskeleffizienz wird ebenfalls von 24% auf 32% erhöht (Wargovich et al., 1988; Am. J. Cardiol. 61: 65–70). Weiterhin wurde von förderlichen Wirkungen von DCA bei Patienten mit Klasse-III-Herzversagen berichtet (Chatergee et al., 1994; J. Am. Coil. Cardiol. 23: 1617–1624).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, daß die Aktivierung von Pyruvatdehydrogenase zu einer Verbesserung der Funktion ischämischer Muskeln in Gliedmaßen und somit bei medizinischen Leiden wie Claudicatio intermittens führt. Die vorliegende Erfindung basiert insbesondere auf der unerwarteten Entdeckung, daß sich durch die Inhibierung von PDH-Kinase eine Verbesserung der Funktion ischämischer Muskeln in Gliedmaßen und somit bei medizinischen Leiden wie Claudicatio intermittens erzielen läßt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Pyruvatdehydrogenase-aktivierenden Mittels zur Herstellung eines Medikaments, das Pyruvatdehydrogenase in Warmblütern wie dem Menschen aktiviert, zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen bereitgestellt.
Das Medikament kann insbesondere zur Behandlung von Claudicatio intermittens eingesetzt werden.
Das Medikament ist zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen bei Warmblütern wie dem Menschen bestimmt, bei dem man eine wirksame Menge eines Pyruvatdehydrogenase-aktivierenden Mittels verabreicht.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Behandlung von Claudicatio intermittens bei Warmblütern wie dem Menschen bereitgestellt, bei dem man eine wirksame Menge eines Pyruvatdehydrogenase-activierenden Mittels verabreicht.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mittel eignen sich somit zur Behandlung von peripherer Verschlußkrankheit bei einem Verfahren zur Behandlung von peripherer Verschlußkrankheit bei Warmblütern wie dem Menschen, bei dem man eine wirksame Menge eines wie hier definierten Mittels verabreicht.
Die Hauptquellen für Energiesubstrat für Skelettmuskel sind Fettsäuren und Kohlenhydrate, mit respiratorischen Austauschquotienten (respiratory quotients, RQ) von 0,7 bzw. 1,0. Unter Ruhebedingungen hat Skelettmuskel normalerweise einen RQ um 0,7, der während anstrengender Betätigung auf etwa 1,0 ansteigt. Bei Patienten mit Claudicatio intermittens ist jedoch die Fähigkeit, die Substratversorgung umzuschalten, gestört, da der respiratorische Austauschquotient während der Betätigung der Gliedmaße mit den Symptomen nur in begrenztem Ausmaß ansteigt (Lundgren et al., 1988; Am. J. Physiol. 255: H1156–H1164). Der reduzierte RQ deutet auf eine größere Fettsäureabhängigkeit bei der ATP-Synthese in der Gliedmaße mit Ischämie hin. Obwohl sich das symptomatische Glied durch Erhöhung der Sauerstoffextraktion auf die geringe Zufuhr reagiert, ist dies nicht ausreichend, um die Oxidation von Fettsäuren zur ATP-Herstellung, bei der zur Produktion von ATP 14% mehr Sauerstoff erforderlich ist als bei Kohlenhydratquellen, aufrechtzuerhalten.
Die Erfinder gingen davon aus, daß sich die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der ATP-Konzentrationen und somit der Muskelfunktion verbessern lassen sollte, wenn es möglich wäre, den Stoffwechsel in der Gliedmaße mit den Symptomen auf den sauerstoffeffizienteren Kohlenhydratmetabolismus umzuschalten.
Ein von den Erfindern untersuchter Ansatz zur Verbesserung der Nutzung von Kohlenhydraten ist die vermehrte Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA durch Aktivierung von Pyruvatdehydrogenase (PDH). Die Aktivierung von PDH wird durch eine Reihe von Faktoren geregelt, wobei der Phosphorylierungsgrad der E1-Untereinheit der wichtigste dieser Faktoren ist. Die Phosphorylierung führt zu einer Inaktivierung des PDH-Komplexes, und dieser Prozeß wird durch eine Phosphatase und ein Kinaseenzym reguliert. Die Erfinder gehen davon aus, daß eine Inhibierung der PDH-Kinase die Phosphorylierung von PDH hemmen und zu einer vermehrten Pyruvat- und somit Kohlenhydratoxidation führen würde.
Die Erfinder haben unerwarteterweise gefunden, daß, wenn vor einer Betätigung der sauerstoffeffizientere Kohlenhydratmechanismus aktiviert ist, ein Pool von Acetylgruppen produziert wird. Dieser Pool steht während der Betätigung für den Eintritt in den TCA-Zyklus bereit, was eine sauerstoffeffiziente ATP-Produktion und eine verbesserte Skelettmuskelfunktion zur Folge hat.
Dichloracetat (DCA), das heißt Dichloressigsäure und deren Salze, ist als Mittel bekannt, das PDH-Kinase hemmt.
Das Mittel kann ein beliebiges PDH-aktivierendes Mittel enthalten. Diese Eigenschaft läßt sich mit dem Fachmann gut bekannten Standardlaborverfahren bestimmen. Mittel, die dazu fähig sind, PDH zu aktivieren, können beispielsweise identifiziert werden, indem man die PDH-Aktivität mit Methoden mißt, die auf der NADH-Bildungsrate, der ¹⁴CO₂-Bildungsrate oder der Acetyl-CoA-Bildungsrate basieren. Eine besonders geeignete Methode wurde von Dumitru Constantin-Teodosiu in seiner Doktorarbeit „Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity and acetyl group formation in skeletal muscle during exercise", Stockholm 1992, erhältlich von der Abteilung für klinische Chemie, Karolinska-Institut, Huddinge Universitätsklinik, S-14186 Huddinge, Schweden, beschrieben. Dieses Verfahren wurde auch von Constantin-Teodosiu, D. et al., „A sensitive radioisotopic assay of pyruvate dehydrogenase complex in human muscle tissue", Anal. Biochem., Band 198, S. 347–351, 1991, veröffentlicht.
Zu den besonders geeigneten Assays für die Identifizierung von Verbindungen, die PDH aktivieren, gehören beispielsweise die von Kerby und Randle, Biochem. Journal, 231, (1985), 523–529 oder von Brooks und Storey, Analytical Biochemistry, 212, (1993), 452-456 beschriebenen Methoden.
Im allgemeinen enthält das Mittel vorzugsweise ein Mittel, das das Enzym Pyruvatdehydrogenase-Kinase (PDH-Kinase) hemmt, und gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird somit die Verwendung eines Pyruvatdehydrogenase-aktivierenden Mittels zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen (und insbesondere zur Behandlung von Claudicatio intermittens) bereitgestellt.
Zu den bevorzugten Mittel gehören somit chemische Verbindungen, die PDH-Kinase hemmen. Diese Eigenschaft läßt sich mit dem Fachmann wohlbekannten Standardlaborverfahren, beispielsweise durch Methoden in Anlehnung an die oben in Bezug auf die Identifizierung.
von PDH-Aktivatoren erwähnten Methoden, wie den von Kerby und Randle, Biochem. Journal, 231, (1985), 523-529 oder von Brooks und Storey, Analytical Biochemistry, 212, (1993), 452-456 beschriebenen, bestimmen. Für den Fachmann ist die Abwandlung der oben in Bezug auf PDH erwähnten Assays zu Assays für die Identifizierung von PHD-Kinasehemmern eine Routinemodifikation.
Wie oben erwähnt ist DCA ein Mittel, von dem man weiß, daß es PDH-Kinase hemmt. Bei den unten beschriebenen experimentellen Verfahren wird DCA eingesetzt, um zu zeigen, daß PDH-Kinasehemmer die Geschwindigkeit, mit der bei betäubten Hunden mit eingeschränkter Blutzufuhr eine Ermüdung der kontrahierenden Skelettmuskeln eintritt, in gleichem Ausmaß wie bei Patienten mit Claudicatio intermittens reduzieren kann. Die unten beschriebenen experimentellen Verfahren zeigen somit, daß sich Mittel, die zur Aktivierung von PDH geeignet sind, und insbesondere Mittel, die PDH-Kinase hemmen können, zur Behandlung von Claudicatio intermittens geeignet sind.
Zu den bevorzugten PDH-Kinase-inhibierenden Mitteln gehören beispielsweise Dichloressigsäure und deren Derivate und Salze. Zu den Derivaten zählen beispielsweise Esterderivate. Geeignete Esterderivate sind u. a. Alkyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkylalkyl- und Phenylalkylester, bei denen die Phenyleinheit gegebenenfalls substituiert sein kann.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes davon,
wobei: R aus Wasserstoff, (1-10C)Alkyl, (3-10C)Cycloalkyl, (3-10C)Cycloalkyl(1-10C)alkyl und Phenyl(1-10C)alkyl, in welchem die Phenyleinheit gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten tragen kann, ausgewählt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen und insbesondere zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Claudicatio intermittens bereitgestellt.
Zu den Werten für gegebenenfalls an einer Phenyleinheit vorhandene Substituenten gehören beispielsweise unabhängig voneinander aus Halogen, (1-4C)Alkyl, (3-6C)Alkenyl, (1-4C)Alkoxy, Cyano, Trifluormethyl, Nitro, Carboxy, Amino, (1-4C)Alkylamino, Dialkylamino mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen, (1-4C)Alkylthio, (1-4C)Alkylsulfinyl, (1-4C)Alkylsulfonyl und (1-4C)Alkylendioxy ausgewählte Werte.
Besondere Werte für gegebenenfalls an einer. Phenyleinheit vorhandene Substituenten schließen beispielsweise
für Halogen Fluor, Chlor und Brom;
für Alkyl Methyl, Ethyl und Propyl;

für Alkenyl Allyl und 2-Methyl-2-propenyl;
für Alkoxy Methoxy, Ethoxy und Propoxy;
für Alkylamino Methylamino und Ethylamino;
für Dialkylamino Dimethylamino und Diethylamino;
für Alkylthio Methylthio und Ethylthio;
für Alkylsulfinyl Methylsulfinyl und Ethylsulfinyl;
für Alkylsulfonyl Methylsulfonyl und Ethylsulfonyl; und
für Alkylendioxy Methylendioxy und Isopropylidendioxy
ein.

Zu den besonderen Werten für R zählen beispielsweise:

für Alkyl	(1-6C)Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Pentyl oder Hexyl;
für Phenylalkyl	Phenyl (1-4C)alkyl wie Benzyl, Phenylethyl oder Phenylpropyl;
für Cycloalkyl	(3-6C)Cycloalkyl wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl;
für Cycloalkylalkyl	(3-6C)Cycloalkyl(1-4C)alkyl wie Cyclopropylmethyl, Cyclopentylmethyl, Cyclohexylmethyl oder 2-(Cyclohexyl)ethyl

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Verbindung um eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon, wobei R für Wasserstoff steht.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Verbindung um eine Verbindung der Formel I, in der R aus (1-10C)Alkyl, (3-10C)Cycloalkyl, (3-10C)Cycloalkyl(1-10C)alkyl und Phenyl(1-10C)alkyl, in welchem die Phenyleinheit gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten tragen kann, ausgewählt ist. Besondere, bevorzugte und spezielle werte schließen die oben erwähnten Werte ein.
Als pharmazeutisch unbedenkliche Salze der vorliegenden Erfindung eignen sich die, die mit einer Base gebildet werden, die ein pharmazeutisch unbedenkliches Kation liefert. Als Basen eignen sich Alkalisalze (wie Natrium- oder Kaliumsalze), Erdalkalisalze (wie Calcium- oder Magnesiumsalze), Ammoniumsalze und Salze mit einer organischen Base, die ein physiologisch unbedenkliches Kation liefert, wie Salze mit Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin, Piperidin oder Morpholin.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen lassen sich durch Standardverfahren der organischen Chemie erhalten, von denen bereits bekannt ist, daß sie sich auf die Herstellung strukturanaloger Verbindungen anwenden lassen. Solche Vorschriften für die Darstellung von Verbindungen der Formel I bzw. von deren pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden durch die folgenden bevorzugten Verfahren veranschaulicht, wobei R eine beliebige der hier definierten Bedeutungen haben kann.
Verbindungen der Formel I, in denen R nicht für Wasserstoff steht, lassen sich somit herstellen, indem man die Verbindung der Formel I (Cl₂CHCO₂R), in der R für Wasserstoff steht (das heißt Dichloressigsäure), mit einer Verbindung der Formel ROH unter den für die Veresterung von Carbonsäuren angewendeten Standardbedingungen umsetzt. Die Reaktion wird somit im allgemeinen in Gegenwart eines sauren Katalysators und gewöhnlich in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels durchgeführt. Es leuchtet ein, daß man den Alkohol (ROH) selbst als Lösungsmittel verwenden kann. Als Katalysatoren eignen sich beispielsweise Mineralsäuren wie konzentrierte Schwefelsäure oder Salzsäure und organische Säuren wie p-Toluolsulfonsäure. Als Lösungsmittel eignen sich beispielsweise inerte Kohlenwasserstoffe wie Toluol. Die Umsetzung kann durch Verwendung eines Überschusses an Alkohol (ROH) und/oder Entfernen von während der Reaktion gebildeten Wassers durch azeotrope Destillation oder den Einsatz von Molekularsieben unterstützt werden.
Die Verbindungen der Formel I, in denen R nicht für Wasserstoff steht, können auch durch Umsetzung von Dichloressigsäure mit dem entsprechenden Alkohol der Formel ROH in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels dargestellt werden. Als Dehydratisierungsmittel eignen sich beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid, N,N`-Carbonyldiimidazol und Azodicarbonsäurediethylester/Tri phenylphosphin. Die Umsetzung läßt sich in einem inerten Lösungsmittel wie einem Kohlenwasserstofflösungsmittel (zum Beispiel Toluol) bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Rückflußtemperatur der Reaktionsmischung durchführen.
Dichloressigsäure und deren Salze sind allgemein verfügbar und im Handel erhältlich.
Benötigt man ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz einer Verbindung der Formel I, so läßt sich dies beispielsweise durch Umsetzung der Verbindung mit der entsprechenden Base (die ein physiologisch unbedenkliches Kation liefert) oder durch eine andere herkömmliche Vorschrift zur Bildung von Salzen erhalten. In einigen Fällen kann sich die Verbindung einer basischen Gruppe bzw. Einheit nähern, so daß sich die Salze auch durch Umsetzung der Verbindung mit der entsprechenden Säure (die ein physiologisch unbedenkliches Anion liefert) darstellen läßt.
Wie oben erwähnt können die Verbindungen zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen und insbesondere zur Behandlung von Claudicatio intermittens eingesetzt werden. Bei einer Verwendung zur Behandlung von Krankheiten und medizinischen Leiden wie Claudicatio intermittens wird in Betracht gezogen, die Verbindung der Formel I (bzw. deren pharmazeutisch unbedenkliches Salz) oral, intravenös oder auf eine andere medizinisch unbedenkliche Route zu verabreichen, so daß man eine Dosis im allgemeinen Bereich von beispielsweise 0,01 bis 500 mg pro kg Körpergewicht erhält. Ein Beispiel für eine in Betracht gezogene Dosis ist eine Dosis im allgemeinen Bereich von 35–50 mg pro kg Körpergewicht. Es versteht sich jedoch, daß die genaue verabreichte Dosis natürlich von der Art und dem Schweregrad der Krankheit, dem Alter und dem Geschlecht des behandelten Patienten und dem Verabreichungsweg abhängt.
Im allgemeinen werden die Verbindungen der Formel I (bzw. ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon) gewöhnlich in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das heißt zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel oder Träger, verabreicht, und eine solche Zusammensetzung wird als weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Die Verbindung wird in einer Menge vorliegen, die die zu behandelnde Krankheit, beispielsweise Ischämie in Gliedmaßen, wirksam behandelt.
Eine gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung kann in verschiedenen Dosierungsformen vorliegen. Sie kann beispielsweise in Form, von Tabletten, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen zur oralen Verabreichung, in Form eines Zäpfchens zur rektalen Verabreichung oder in Form einer sterilen Lösung oder Suspension zur parenteralen Verabreichung wie z. B. durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion vorliegen.
Eine Zusammensetzung läßt sich nach herkömmlichen Vorschriften unter Anwendung von im Stand der Technik gut bekannten pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln und Trägern erhalten. Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können zweckmäßigerweise mit einer Beschichtung wie z. B. einem magensaftresistenten Überzug (zum Beispiel auf Grundlage von celluloseacetatphthalat) versehen werden, um die Auflösung des Wirkstoffs der Formel I (bzw. eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes davon) im Magen auf ein Mindestmaß abzusenken oder um einen unangenehmen Geschmack zu maskieren.
Die Erfindung wird jetzt anhand der beigefügten nicht einschränkenden experimentellen Methoden ausführlicher beschrieben. Bei den folgenden experimentellen Methoden.
wurde der PDH-Kinase-Inhibitor Dichloracetat eingesetzt, um zu bestimmen, ob Inhibitoren von PDH-Kinase die Ermüdungsgeschwindigkeit bei der Kontraktion von Skelettmuskeln von betäubten Hunden, bei denen die Blutzufuhr im gleichen Ausmaß wie bei Patienten mit Claudicatio intermittens eingeschränkt ist, absenken können. Geeignete DCA-Dosen schließen diejenigen im Bereich von 30 bis 300 mg·kg^–1 ein. Bei den folgenden experimentellen Methoden wurde DCA (in einer Dosis von 300 mg·kg^–1) als Natriumsalz von Dichloressigsäure verabreicht.
Experimentelle Methoden
Weiblichen Alderley Park-Beagle (12–18 kg) wurde 30 Minuten vor der Betäubung mit Natriumpentobarbiton (45 mg·kg^–1, i. v., Sagatal.) Morphium (10 mg, i. m.) verabreicht. Die Hunde wurden jeweils mit einem endotrachealen Schlauch intubiert und künstlich mit Raumluft beatmet, wobei eine Beatmungspumpe mit positivem Druck (Modell 16/24, Palmer Bioscience) zum Einsatz kam. Die Beatmung mit Raumluft wurde mit einer Geschwindigkeit von 17 Hüben pro Minute und einem Hubvolumen von 250 ml begonnen. Während der ganzen Zeit wurde die Rektaltemperatur kontrolliert und mit einer homeothermischen Heizdecke (Harvard Instruments, Edenbridge, Kent, UK) aufrechterhalten (Bereich 36,2°C –3a,6°C).
Operativer Eingriff
Die linke äußere Halsvene wurde zur kontinuierlichen Verabreichung von Anästhetikum (Natriumpentobarbiton, 12 mg/ml mit einer Geschwindigkeit von 5–6 ml/Stunde) unter Verwendung einer Infusionspumpe (Injectomat S. Fresenius, Villiers, Frankreich) kanüliert. Die rechte A. brachialis wurde kanüliert und mit einem Druckumwandler verbunden. Alle Drücke wurden mit Strain-gauge-Manometern (PDCR 75, Druck Ltd., Barendeecht, Niederlande), die mit Gleichstrombrückenverstärkern (Lectromed, MT8P, St. Peter, Jersey) verbunden waren, gemessen. Die Druckumwandler wurden zu Beginn jedes Experiments mit einer Quecksilbersäule geeicht. Die Pulsfrequenz wurde elektronisch von diesem Drucksignal abgeleitet. Die linke A. brachialis wurde zur Entnahme arterieller Blutproben kanüliert und zur Kontrolle, des Blutgas-Status der Tiere (280 Bood Gas System, Ciba-Corning, Medfield, M. A., USA) verwendet. Die rechte V. cubitalis wurde zur Infusion von Heparin (1 IE kg^–1 min^–1, Multiparin), das 30 Minuten vor Anschluß des extrakorporealen Perfusionskreislaufs verabreicht wurde, kanüliert. Die linke V. cubitalis wurde zur Verabreichung von 1M HCO3 (Polyfusor, Fresenius Healthcare, Basingstoke, Großbritannien), wodurch der arterielle pH-Wert im normalen Bereich gehalten wurde, kanüliert.
An beiden Läufen wurden die M. gracilis unter Anwendung von Diathermie (V.I.C.3, The Genito-Urinary Mfg Co Ltd, Großbritannien) und stumpfen Präparationsverfahren freigelegt. Die M. gracilis der beiden Hinterläufe wurden freigelegt und gefäßmäßig isoliert, so daß lediglich die arterielle Versorgung und der venöse Abfluß des M. gracilis sichergestellt waren. Dies wurde erreicht, indem man mit Ausnahme der den M. gracilis versorgenden Zweige alle Zweige der A. femoralis und der V. femoralis zwischen A. profunda femoris und A. poplitea bzw. V. profunda femoris und V. poplitea ligierte. Die mittlere V. femoralis caudalis wurde kanüliert und die Kanüle wurde in die V. femoralis vorgeschoben, so daß sich ihre Spitze distal zur V. gracilis befand. Die v. poplitea wurde distal zur V. saphena medialis abgebunden, um einen venösen Rückstrom aus den niedrigen und tiefen Teilen des Laufs zu verhindern. Alle anderen Zweige, die ihren Ursprung in der V. femoralis oder der V. saphena hatten und nicht vom M. gracilis stammten, wurden abgebunden. In beiden Läufen wurde zur Aufnahme der Perfusionsdrücke im M. gracilis die A. poplitea kanüliert und mit einem Druckumwandler verbunden.
Die N. obturatorii wurden identifiziert, und ein kleiner Abschnitt wurde freipräpariert und zentral gequetscht. In den distalen Abschnitt der einzelnen Nerven wurden Stimulierungselektroden gelegt. Die Muskelkontraktion wurde mit Stimulierungsparametern mit einer Dauer von 0,1 msec, 10 V, 0,3–3 Hz, begonnen. Die Muskeln wurden an ihrem Ursprung und am Ansatz freipräpariert. An die Sehnen am Ursprung des Muskels angebrachte starke Fäden (75% Polyester/25% Baumwolle) wurden an einen festen Pfosten, der als Verankerung diente, gebunden. An die Sehnen am Ansatz gebundene Fäden wurden zur Aufnahme der isometrischen Spannung mit Kraftumwandhern (FTC10, Grass, Quincy, M. A., USA) verbunden. Die Erschöpfung der Muskeln wurde über die Gleichung: Erschöpfung = (Spitzenspannung – Endspannung)/Spitzenspannung gemessen. Die Blutzufuhr zum linken M. gracilis durfte sich während der Muskelkontraktion ändern, wobei der Blutstrom mit einem um die A. femoralis. gelegten elektromagnetischen Strömungsmesser (Durchmesser 10–14 mm, Carolina Medical Electronics, King, North Carolina, U.S.A.) gemessen wurde. Der Nullwert für den Blutstrom wurde mit einem distal zum Strömungsmesser gelegten Schlingenverschluß bestimmt. Nach dem Ende des Experiments wurde der Strömungsmesser in situ mit dem Eigenblut der Hunde geeicht. Die Blutzufuhr zum rechten M. gracilis wurde auf eine konstante Rate eingestellt. Nach 30minütiger Heparininfusion (1 IE kg^–1 min^–1 i. v.) wurde die rechte A. femoralis proximal und distal kanüliert und mit einer Walzenperfusionspumpe (miniplus3, Gilson, Villiers le bel, Frankreich) verbunden. Der rechte M. gracilis wurde mittels Pumpe mit einer konstanten Durchflußrate, die dem arteriellen Blutdruck entsprach, perfundiert. Bevor mit dem Experimentprotokoll begonnen wurde, ließ man ungefähr 30 Minuten lang äquilibrieren, wobei die Blutgase gemessen und, falls erforderlich, korrigiert wurden. Alle Parameter wurden mit einem 8- Kanal-Papierschreiber (Graftech Linearcorder, Mk 8 WR3500, Nantwich, Großbritannien) aufgezeichnet.
Es wurde gefunden, daß die Muskelermüdung nach der Behandlung mit DCA von 46,5% (±3,6%) auf 25,0% (±3,2%) reduziert war.
Protokoll
Die Tiere wurden in Gruppen, die mit DCA, und Gruppen, die mit Vehikel (isotonischer Kochsalzlösung) behandelt wurden, aufgeteilt. DCA bzw. Vehikel wurden nach erfolgter Operation als konstante Infusion verabreicht. 45 Minuten später wurde mit der Kontraktion begonnen. Die Ermüdung der Muskeln wurde sowohl in den normalen Muskeln als auch in den Muskeln mit eingeschränkter Blutzufuhr gemessen. Proben arteriellen Bluts wurden aus der A. brachialis und Proben venösen Bluts wurden jeweils aus den M. gracilis im Ruhezustand, bei der Kontraktion und nach der Erholung entnommen. Die. Kontraktionsdauer belief sich auf 20 Minuten Stimulierung mit 3 Hz. Für die Blutgasanalyse entnommene Blutproben (0,4 ml) wurden sofort analysiert. Die aufgenommenen Parameter waren pH-Wert, pCO2, pO2, Sauerstoffsättigung und Gesamthämoglobin. weitere Proben (1,0 ml) wurden für die Analyse der Konzentrationen von Lactat, Glucose und nicht veresterten Fettsäuren (NVFS) entnommen.
Analytische Methoden
Die Proben wurden in 0,05 ml 3,2%iger Trinatriumcitratlösung aufgenommen und sofort zentrifugiert (Zentrifuge 5415, Eddendorf, 13000 U/min, 5 Minuten). Das Plasma wurde sofort abgenommen und jeweils für die Assays aliquotiert. Die Analyse auf Lactat (Lactatreagenskit, Sigma Diagnostics) erfolgte umgehend. Die Plasmaproben für die Glucoseanalyse wurden auf Eis gelagert und am Ende des Experiments gemessen (Glucose-Autostat GA 1120, Clandon). Plasmaproben für NVFS wurden für eine spätere Analyse (NEFA-C-Kit, ACS-ACOD-Methode, Wako) eingefroren. Die Proben nach der Erholung wurden entnommen, nachdem die Werte für den Blutdruck und den Blutstrom wieder die. Ausgangswerte erreicht hatten, was gewöhnlich innerhalb von 15 Minuten nach Ende der Stimulierung der Fall war.
Muskelmetaboliten
Nach der Entnahme der Blutproben nach dem Erholen und nach der Infusion von Wirkstoff/Vehikel wurde aus den Muskeln jeweils eine Biopsie aus dem ausgeruhten Muskel entnommen (Bergstrom-Nadel mit einem Durchmesser von 6 mm, Stille, Schweden, und Allendale-Nadel mit einem Durchmesser von 6 mm, Edinburgh, Schottland). Nach 20 Minuten Stimulierung wurde der Muskel dann mit Klammern ruhiggestellt, wobei immer noch stimuliert wurde, und ein kleiner Teil des Muskels wurde herausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff eingefroren (der gesamte Vorgang dauerte weniger als 6 Sekunden, wobei die obere Muskelschicht innnerhalb von 1 Sekunde gefroren war). Die Muskelproben wurden dann bis zur Gefriertrocknung und der Analyse in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Die Muskelproben wurden in zwei Portionen geteilt, wobei die eine Portion für die Analyse von ATP, Phosphokreatin (PKr), Kreatin (Kr) und intramuskulärem Lactat (Harris, R. et al., Scand. Journal Clin. Lab. Invest., 33, 109–120, 1974) bestimmt war. Die andere Portion wurde naß in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Kurz gesagt wurde die erste Portion Muskel gefriergetrocknet, von sichtbarem Bindegewebe und Blut freipräpariert und dann pulverisiert, mit eiskalter Perchlorsäure (0,5 M) extrahiert und mit Kaliumhydrogencarbonat (2,2 M) neutralisiert. Der Glykogengehalt wurde durch die von Harris et al., 1974 (siehe oben) beschriebene Methode bestimmt.
Acetylcarnitin und freies Carnitin wurden im gefriergetrockneten Extrakt durch die von Cederblad et al., Anal. Biochem., 185, (1990), 274–278 beschriebene Methode und die PDH-Aktivität (nach der Erholung und während Betätigung, aktiv und gesamt) wurde aus einer Probe von nassem Gewebe unter Anwendung der Methode von Constantin-Teodosiu, D. et al., „A sensitive radioisotopic assay of pyruvate dehydrogenase complex in human muscle tissue", Anal. Biochem., Band 198, S. 347–351, 1991, bestimmt. Diese Methode ist auch in Dumitru Constantin-Teodosiu, Doktorarbeit „Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity and acetyl group formation in skeletal muscle during exercise", Stockholm 1992, aus der Abteilung für klinische Chemie, Karolinska-Institut, Huddinge Universitätsklinik, S-14186 Huddinge, Schweden, beschrieben.
Die Änderungen bei den PKr- und Lactat-Werten waren bei Verabreichung von DCA reduziert. Die Verfügbarkeit von Acetylgruppen war bei den mit DCA behandelten Gruppen sowohl im Ruhezustand als auch bei der Kontraktion (RF-Muskel) höher. Eine vollständige Umwandlung von PDC läßt einen größeren Pyruvatstrom durch PDC zu und reduziert somit den anaeroben Beitrag zur ATP-Regeneration und minimiert die Akkumulation von Lactat.
Die oben beschriebenen Studien zeigen insbesondere, daß eine Erhöhung der Verfügbarkeit von Acetylgruppen im Ruhezustand zu einem größeren oxidativen Beitrag zur ATP-Regeneration, einer wesentlichen Reduzierung des anaeroben Metabolismus und einer deutlichen Verbesserung der Kontraktionsfähigkeit der Skelettmuskeln bei ischämischen Zuständen führt. Die Erfinder nehmen daher an (ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen), daß die Hauptwirkung von DCA die Reduktion der Akkumulation von Milchsäure und der damit verbundenen schädlichen Wirkungen des anaeroben Stoffwechsels sind.
Diese Arbeiten werden in Timmons, J.A. et al., J. Clin. Invest., Band 97, Nummer 3, Februar 1996, 879–883, die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist, diskutiert.
Für die Darreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur therapeutischen oder prophylaktischen Anwendung geeignete beispielhafte pharmazeutische Dosierungsformen schließen die folgenden Tabletten- und Kapselformulierungen ein, die durch in der Pharmazie gut bekannte herkömmliche Verfahren erhältlich sind und sich für den therapeutischen bzw. prophylaktischen Gebrauch im Menschen eignen:
Die Tablettenzusammensetzungen (a)–(c) können auf herkömmliche Weise magensaftresitent beschichtet sein, beispielsweise mit Celluloseacetatphthalat.

Claims

Verwendung eines Pyruvatdehydrogenaseaktivierenden Mittels zur Herstellung eines Medikaments, das Pyruvatdehydrogenase in Warmblütern wie dem Menschen aktiviert, zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Medikament um ein Medikament zur Behandlung von Claudicatio intermittens handelt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel ein Mittel enthält, das PDH-Kinase hemmt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Mittel Dichloressigsäure, ein Derivat davon oder ein Salz davon enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei das Mittel eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon enthält,
wobei R aus Wasserstoff, (1-10C)Alkyl, (3-10C)Cycloalkyl, (3-10C)Cycloalkyl(1-10C)alkyl und Phenyl(1-10C)alkyl, in welchem die Phenyleinheit gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten tragen kann, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei man das Mittel in einer Dosis im Bereich von 35–50 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Phenyleinheit gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus Halogen, (1-4C)Alkyl, (3-6C)Alkenyl, (1-4C)Alkoxy, Cyano, Trifluormethyl, Nitro, Carboxy, Amino, (1-4C)Alkylamino, Dialkylamin mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen, (1-4C)Alkylthio, (1-4C)Alkylsulfinyl, (1-4C)Alkylsulfonyl und (1-4C)Alkylendioxy tragen kann.
Verwendung nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei R aus (1-10C)Alkyl, (3-10C)Cycloalkyl, (3-10C)Cycloalkyl(1-10C)alkyl und Phenyl(1-10C)alkyl, in welchem die Phenyleinheit gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus Halogen, (1-4C)Alkyl, (3-6C)Alkenyl, (1-4C)Alkoxy, Cyano, Trifluormethyl, Nitro, Carboxy, Amino, (1-4C)Alkylamino, Dialkylamino mit bis zu sechs Kohlenstoffatomen, (1-4C)Alkylthio, (1-4C)Alkylsulfinyl, (1-4C)Alkylsulfonyl und (1-4C)Alkylendioxy tragen kann.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5, 6, 7 oder 8, wobei R für Wasserstoff steht.
Verwendung eines Mittels ausgewählt aus Dichloressigsäure, einem Salz davon und einem Ester von Dichloressigsäure, zur Herstellung eines Medikaments, das Pyruvatdehydrogenase in Warmblütern wie dem Menschen aktiviert, zur Behandlung von Ischämie in Gliedmaßen.
Verwendung nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Claudicatio intermittens.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Mittel aus Dichloressigsäure und Salzen davon ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Mittel um das Natriumsalz von Dichloressigsäure handelt.