DE69620249T2

DE69620249T2 - Dna marker für die grösse eines ferkelwurfes

Info

Publication number: DE69620249T2
Application number: DE69620249T
Authority: DE
Inventors: John Mileham; Stuart Plastow; Irene Southwood
Original assignee: DALGETY PLC LONDON
Current assignee: Pic Fyfield Ltd London Gb
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2016-06-13
Also published as: ATE215129T1; US6410227B1; DE69620249D1; CA2224394A1; WO1996041892A1; EP0879296B1; AU6012096A; EP0879296A1; JPH11507548A; PL324028A1; KR19990022827A; MX9710091A; PT879296E; NZ309858A; PL184518B1; CN1191576A; DK0879296T3; KR100441311B1; CZ401797A3; BR9608763A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Durchmustern von Schweinen zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Nichtvorhandenseins von Osteopontin (OPN)- Allelen, die assoziiert sind mit der Größe eines Wurfs sowie die Anwendung solcher Verfahren bei der Vorhersage der Größe eines Ferkelwurfs und Ausrüstungen zur Durchführung solcher Verfahren.
Bestünde die Möglichkeit, die Größe eines Wurfs von Jungtieren zu erhöhen, könnten die Fleischproduktion und die Effizienz der Tierzüchtung verbessert werden. Weniger Elterntiere brächten dieselbe Zahl von Nutztieren hervor, wodurch die Produktionskosten gesenkt würden. Außerdem würden Tierzuchtorganisationen von der Möglichkeit profitieren, eine größere Zahl von Nachkommen im Hinblick auf verbesserte genetische Eigenschaften zu durchmustern. Bei der Wurfgröße handelt es sich jedoch um ein problematisches Selektionsmerkmal, da sie auf nur ein Geschlecht beschränkt ist und stark von nicht-genetischen Faktoren beeinflusst wird (die Vererblichkeit, ein Maß des Anteils derjenigen Phänotyp- Variation, die sich auf genetische Unterschiede zurückführen lässt, beträgt bei Schweinen in Bezug auf die Wurfgröße etwa 0,1).
Ein Ansatz zur Verbesserung der Wurfgröße könnte darin bestehen, vorteilhafte Gene von Rassen, welche sich durch signifikant höhere Wurfgrößen auszeichnen, in Produktionszuchtlinien einzubringen. Die quantitative Genetik legt jedoch den Schluss nahe, dass komplexe Vererbungsmerkmale wie die Wurfgröße durch eine große Zahl von Genen gesteuert werden, von denen jedes einen geringen Einfluss auf das jeweilige Vererbungsmerkmal hat. Trifft dies zu, so läuft die genetische Weitergabe durch Selektion komplexer Vererbungsmerkmale wahrscheinlich sehr langsam ab. Eine alternative Betrachtungsweise ist die, dass, trotz der Beteiligung vieler Gene an komplexen Vererbungsmerkmalen, einige der beteiligten Gene (Hauptgene) stark auf das Vererbungsmerkmal einwirken. Trifft diese alternative Betrachtungsweise zu, dann könnte die genetische Weitergabe solcher Vererbungsmerkmale schnell ablaufen, vorausgesetzt es ist möglich, vorteilhafte Allele der relevanten Hauptgene zu identifizieren und zu selektionieren. Mit dem Aufkommen der genomischen Kartierung ist es möglich geworden, Gene zu identifizieren, die quantitative Vererbungsmerkmale beeinflussen (Genloci für quantitative Vererbungsmerkmale; quantitative trait loci; QTL), indem man nach Assoziationen zwischen dem jeweiligen Vererbungsmerkmal und molekularen Markern sucht, die im Genom von Tieren, für welche Genkarten verfügbar sind, in gleichmäßiger Verteilung vorkommen. Für Selektionszwecke ist es wesentlich, dass die Vererblichkeit solcher Markerphänotypen 1,0 beträgt.
Die Schweinerasse Chinesische Meishan produziert bekannterweise pro Wurf etwa 4 Ferkel mehr als die meisten europäischen Zuchtrassen. Von dieser Rasse stammende Gene für Fruchtbarkeit (Wurfgröße) wären für Programme, die auf die Erhöhung der Wurfgröße kommerzieller westlicher Schweinerassen abzielen, von großem Wert. In der Tat ist gezeigt worden, dass ein genetischer Marker der Meishan-Rasse, der mit dem Gen für den Östrogenrezeptor (ESR) assoziiert ist, einen vorteilhaften Effekt auf die Wurfgröße hat, und in WO92/18651 beschrieben ist.
Die Schafrasse Booroola-Merino ist außerordentlich fruchtbar. Häufig treten Wurfgrößen von drei oder mehr Tieren auf. Es ist gezeigt worden, dass die signifikant erhöhte Fruchtbarkeit dieser Rasse auf die Wirkung eines einzigen Gens, FECB, zurückzuführen ist (Übersichtsartikel von G W Montgomery, et al., Endocrine Reviews, 13 : 309-328 (1992)). Die genetische Kartierung mit menschlichen DNA-Markern zeigte, dass sich die menschliche Version von FECB auf Chromosom 4 befindet (G W Montgomery, et al., Nature Genetics, 4 : 410-114 (1993)) und eng mit dem Gen assoziiert ist, das für das sezernierte Phosphoprotein-1 (SPP-1) kodiert, auch bekannt als Osteopontin (OPN), 2ar, Knochensialoprotein-1, 44-kDa-Knochenphosphoprotein und als tumorsezerniertes Phosphoprotein. Vergleichende Kartierung (H Ellegren, et al., Genomics, 17 : 599-603 (1993)) zeigte, dass es zwischen Chromosom 4 des Menschen und Chromosom 8 des Schweins große Übereinstimmungen (Syntenie) gibt. Auch das Spp-1 Gen des Schweins befindet sich auf Chromosom 8.
In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass ein beim Rind mit FECB verlinkter Marker bei Herden, die hinsichtlich einer erhöhten Ovulationsrate selektioniert wurden, kein Marker für gesteigerte Wurfgröße ist (Blattman et al., Mid-West Animal Science Meeting, 18 : 43 (1995)).
Überraschenderweise fanden wir jedoch heraus, dass bestimmte DNA-Marker für OPN beim Schwein mit der Wurfgröße assoziiert sind, und darum dazu verwendet werden können, für Schweine zu selektionieren, bei denen eine höhere Wahrscheinlichkeit zur Hervorbringung einer gesteigerten Wurfgröße besteht, und gegen Schweine zu selektionieren, welche Allele aufweisen, die eine geringere Wurfgröße anzeigen. Wie hierin verwendet, bedeutet "gesteigerte Wurfgröße" eine signifikante Steigerung der Wurfgröße im Vergleich zum Durchschnitt in einer gegebenen Population.
Von Interesse ist die Anmerkung, dass die chromosomale Syntenie im Bereich um OPN durchbrochen wird, wenn man einerseits Schaf, Rind und Mensch und andererseits Schwein und Maus vergleicht (Montgomery et al., J. Reproduchon and Fertility supplement, 49 : 113-121 (1995)). Dies legt nahe, dass bei Tieren mit großen Würfen (Maus und Schwein) die Chromosomenstruktur im Vergleich zu Tieren mit kleinen Würfen (Mensch, Schafund Rind) in diesem Bereich verändert sein könnte, und zwar so, dass der Effekt des Hauptgens für Fruchtbarkeit verändert wird. Zu den möglichen Erklärungen gehört, dass die Expression des Hauptgens verstärkt oder verringert wurde, indem es in einen transkriptional aktiveren oder inaktiveren Bereich verbracht wurde; dass das Hauptgen unter die unmittelbare Kontrolle eines veränderten Promotorelements gestellt wurde; dass die Position des Hauptgens relativ zu OPN in einer Weise verändert wurde, dass OPN zu einem nützlicheren Marker zur Bewertung des Wurfgrößenpotentials beim Schwein als beim Schaf oder beim Rind wird.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zum Durchmustern von Schweinen bereit, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welches Verfahren den Schritt beinhaltet:
(i) Analysieren der genomischen DNA in einer Probe, die von einem Schwein erhalten wurde, um zu bestimmen, welches OPN-Allel/welche OPN-Allele vorhanden ist/sind. Geeigneterweise wird Schritt (i), nämlich die Bestimmung der OPN-Allele, ausgeführt, indem nach bestimmten DNA-Markern gesucht wird, die entweder direkt oder indirekt mit OPN verlinkt sind.
Die Assoziation zwischen genetischen Markern und Genen, die für ein bestimmten Vererbungsmerkmal verantwortlich sind, kann durch genetische Rekombination unterbrochen werden. Je kürzer daher der physische Abstand zwischen dem Marker und dem fraglichen Gen ist, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass es zwischen ihnen zu einer rekombinationsbedingten Trennung kommt.
Es ist auch möglich, eine Linkage zwischen spezifischen Allelen alternativer DNA- Marker und Allelen von DNA-Markern festzustellen, die bekannterweise mit einem bestimmten Gen assoziiert sind (z. B. das hierin erörterte OPN-Gen), von dem bereits gezeigt wurde, dass es mit einem bestimmten Vererbungsmerkmal assoziiert ist. Wählt man daher in dieser Situation das OPN-Gen, so wäre es zumindest kurzfristig möglich, für Schweine zu selektionieren, die wahrscheinlich einen größeren Wurf hervorbringen, oder alternativ gegen Schweine zu selektionieren, die wahrscheinlich einen kleineren Wurf hervorbringen, indem indirekt durch Selektion spezifischer Allele alternativer Marker auf Chromosom 8 für bestimmte Allele eines mit einem OPN-assoziierten Markers selektioniert wird. Zu den Beispielen für solche Marker, die auf Chromosom 8 beim Schwein bekannterweise mit OPN verlinkt sind, gehören Sw61, Sw1085, Sw194, Sw16, SW790 und 50178, bei welchen Markern es sich allesamt um Mikrosatelliten handelt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Reihe solcher Marker verwendet. Beispielsweise könnten Markerpaare verwendet werden, um das Hauptgen einzuklammern und alle möglichen Rekombinationseffekte zu verringern. Zu den Beispielen für solche Markerkombinationen gehören SO178 und SW61 und S0178 und SW790.
Da der Effekt mit dem Unterschied der Genreihenfolge beim Schwein (und bei der Maus) im Vergleich zum Schaf (und beim Menschen und Rind) in Zusammenhang stehen könnte, lässt dies vermuten, dass sich der nützlichste sekundäre Marker im nicht-homologen (nicht syntenischen) Bereich auf Chromosom 8 des Schweins befindet. Ein Beispiel für eine geeignete Kombination von Markern, von denen bekannt ist, dass sie diesen Bereich einklammern, wäre OPN und SO178. Dem Fachkundige wird jedoch bekannt sein, dass andere nützliche Marker routinemäßig identifiziert werden können.
Ein bestimmter genetischer Marker, der mit OPN assoziiert ist, ist ein Mikrosatellit. Dabei handelt es sich um einfache Sequenzwiederholungen von 4, 3 oder, was häufiger vorkommt, 2 Nukleotiden, welche im Wesentlichen etwa alle 50,000 Basen zufällig im Genom vorkommen (in einem haploiden Genom gibt es etwa 60,000 Mikrosatelliten). Es wird angenommen, dass ein Stottern der DNA-Polymerase während der Replikation und ein ungleichmäßiges Überkreuzen bei der Rekombination zu einem Verlust oder dem Auftreten von Wiederholungseinheiten führt. Dies bedeutet, dass Mikrosatelliten in der Regel polymorph sind und Allele haben, deren Länge durch unterschiedlich viele Wiederholungseinheiten bedingt wird.
Ein Beispiel für einen Mikrosatelliten, der mit einem bestimmten Gen assoziiert ist, ist (CA)n, was dazu führt, dass es verschiedene Allele gibt, deren Länge durch Wiederholungseinheiten wie z. B. (CA)&sub2;, (CA)&sub9;, (CA)&sub1;&sub0;, (CA)&sub1;&sub1;, und (CA) 2 bedingt wird.
Indem Primer verwendet werden, die in der Lage sind, an Bereiche zu hybridisieren (beispielsweise unter stringenten Bedingungen), welche an die mit dem bestimmten Gen assoziierten Mikrosatelliten angrenzen, können in Kombination mit standarisierten PCR- Techniken PCR-Produkte mit unterschiedlicher Länge hergestellt werden, deren Länge von der jeweiligen Länge des aus Wiederholungseinheiten zusammengesetzten Allels des Mikrosatelliten abhängt.
Die Analyse der Assoziation solcher PCR-Produkte, bei denen der mit dem OPN- Gen assoziierte Mikrosatellit verwendet wird, mit der Wurfgröße erlaubte die Bestimmung der Länge von Markerallelen, die mit erhöhter oder verringerter Wurfgröße bei Schweinen assoziiert sind.
Geeignete Primerpaare, die an flankierende Bereiche solcher Mikrosatelliten hybridisieren, beinhalten solche, die folgende Sequenz aufweisen:
GCTAGTTAATGACATTGTACATAA, oder
CCAATCCTATTCACGAAAAAGC, und
GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC, oder
CAACCCACTTGCTCCCAC.
Bei Schweinen wurden besonders Allele aus Wiederholungseinheiten für den oben genannten Mikrosatellitenmarker, genannt 132 und 136, mit einer größeren Wurfgröße assozüert. Außerdem wurde das Allel aus Wiederholungseinheiten, genannt 112, bei Schweinen mit einer geringeren Wurfgröße assoziiert.
Tatsächlich stammt das mit einer größeren Wurfgröße assoziierte Allel hauptsächlich von europäischen Elterntieren. Dies widerspricht den Erwartungen, da, wie oben erörtert, Meishan-Schweine pro Wurf vier Ferkel mehr hervorbringen als Landrace- oder Duroc- Schweine, und es lag nahe, zu vermuten, dass nützliche Marker mit Genen assoziiert sein könnten, welche von Meishan-Elterntieren vererbt werden.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zum Durchmustern von Schweinen bereit, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welches Verfahren die Schritte beinhaltet:
(i) Hybridisieren der genomischen DNA in einer Probe, die von einem Schwein erhalten wurde, mit einem oder mehreren passenden Primern.
(ii) Durchführen von einem oder mehreren PCR-Zyklen unter Verwendung der hybridisierten Nukleinsäure aus Schritt (i); und
(iii) Analysieren der Länge des aus Schritt (ii) erhaltenen PCR-Produkts.
Geeigneterweise werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Reagenzien und Anweisungen durchgeführt, welche in Form einer Ausrüstung präsentiert werden.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung in einem dritten Aspekt eine Ausrüstung zum Durchmustern von Schweinen bereit, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welche eines oder mehrere Reagenzien oder Materialien beinhaltet, die in der Lage sind, in einer Probe aus genomischer DNA eines Schweins OPN-Allele zu identifizieren.
Eine bevorzugte Ausrüstung der Erfindung beinhaltet Reagenzien oder Materialien, die in der Lage sind, Allele zu identifizieren, die mit den mit dem OPN-Gen verlinkten DNA-Markern assoziiert sind, z. B. den Mikrosatellitenmarker. Eine solche Ausrüstung würde vorzugsweise einen oder mehrere DNA-Primer, optional zusammen mit standardmäßigen PCR-Reagenzien, beinhalten.
Eine fachkundige Person wird schließlich erkennen, dass die hierin beschriebenen Verfahren und Ausrüstungen in Verbindung mit anderen, bereits beschriebenen Verfahren und Ausrüstungen zum Durchmustern von Schweinen verwendet werden können, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit größere Wurfgrößen hervorbringen (oder diejenigen, bei denen diese Wahrscheinlichkeit geringer ist). Ein Beispiel für solch andere Verfahren und Ausrüstungen sind die in WO92/18651 Beschriebenen.
Es wäre natürlich möglich, kombinierte Ausrüstungen herzustellen, die zum Durchmustern von Schweine-DNA verwendet werden können und in denen beide Methoden angewandt werden.
In WO-A-9218651 werden Verfahren offenbart, mit denen, beruhend auf der Linkage mit dem ESR-Gen, bestimmt werden kann, welche Schweine mit höherer Wahrscheinlichkeit größere Wurfgrößen hervorbringen. Ein Fachkundiger wird daher erkennen, dass die Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung mit den früher offenbarten ESR- Durchmusterungsverfahren kombiniert werden können, um ein noch mächtigeres Werkzeug für solche Bestimmungen bereit zu stellen. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zum Durchmustern von Schweinen bereit, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welches Verfahren die Schritte beinhaltet:
(i) Analysieren der genomischen DNA in einer Probe, die von einem Schwein erhalten wurde, um zu bestimmen, welches OPN-Allel/welche OPN-Allele vorhanden ist/sind; und
(ii) Analysieren der aus Schritt (i) erhaltenen genomischen DNA, um zu bestimmen, welches Allel/welche Allele von zumindest einem andere Gen, das mit der Wurfgröße bei Schweinen verlinkt ist, vorhanden ist/sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das zumindest eine andere Gen das ESR-Gen, wie beschrieben in WO-A-9218651.
In einem letzten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Ausrüstung zum Durchmustern von Schweinen bereit, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welche eine oder mehrere Reagenzien oder Materialien beinhaltet, die in der Lage sind, OPN-Allele in einer genomischen Schweine-DNA-Probe zu identifizieren, zusammen mit einer oder mehreren Reagenzien oder Materialien, die in der Lage sind, Allele von zumindest einem anderen Gen, das mit der Wurfgröße bei Schweinen verlinkt ist, in einer Probe von genomischer Schweine-DNA zu identifizieren.
Bevorzugte Merkmale jedes Aspekts der Erfindung sind entsprechend abgewandelt auf alle anderen Aspekte anwendbar.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche unter keinen Umständen als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollen.

BEISPIEL 1

Präparation der DNA

DNA kann aus jeder Art von Gewebe isoliert werden, das Zellkerne hat, beispielsweise aus weißen Blutkörperchen, Haarfollikeln, Ohrkerben und Muskeln. Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Präparation von Blutzellen; ändere Gewebe können in ähnlicher Weise verarbeitet werden, indem das Material direkt in K-Puffer suspendiert und von diesem Schritt aus wie bei der Präparation von Blutzellen vorgegangen wird. Das hier beschriebene Verfahren bringt ein Zelllysat hervor, das Roh-DNA enthält, welche sich für die PCR-Ampliflkation eignet. Dennoch sollte jedes Verfahren zur Präparation gereinigter DNA oder von Roh-DNA gleich effektiv sein.
Um eine Gerinnung zu verhindern, sollte Blut in 50 mM EDTA pH 8,0 aufgenommen werden. 50 ul Blut wurden in ein kleines Mikrozentrifugengefäß (0,5 ml Eppendorf-Gefäß oder ähnliches) abgefüllt. Es wurden 450 ul TE-Puffer dazu gegeben, um die roten Blutkörperchen zu lysieren (die Häm-Gruppe hemmt die PCR), und diese Mischung wurde 2 Sekunden lang auf dem Vortex gemischt. Die intakten weißen und verbleibenden roten Blutkörperchen wurden daraufhin 12 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge bei 13,000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch vorsichtiges Absaugen bei geringem Druck durch ein Vakuumpumpensystem entfernt. Es wurden nochmals 450 ul TE-Puffer hinzugegeben, um die verbliebenen roten Blutkörperchen zu lysieren, und wie zuvor die weißen Blutkörperchen durch Zentrifugieren zu sammeln. Wies das Pellet noch immer eine rötliche Farbe auf, so wurde diese Vorgehensweise solange wiederholt, bis das Pellet weiß war. Nach dem Entfernen des letzten Tropfens Überstand aus den pelletierten weißen Blutkörperchen wurden 100 ul K-Puffer mit Proteinase K zugegeben und die Mischung bei 55ºC 2 Stunden lang inkubiert. Die Mischung wurde dann für 8 Minuten auf 95-100ºC erhitzt und die DNA-Lysate bis zur weiteren Verwendung bei -20ºC aufbewahrt.

Reagenzien

TE-Puffer: 10 mM TRIS-HCl pH 8,0
1 mM EDTA
K-Puffer: 50,0 mM KCl
10,0 mM TRIS-HCL pH 8,3
2,5 mM MgCl&sub2;
0,5% Tween 20
Vor der Verwendung für die Lysate wurden pro 1,0 ml K-Puffer 10 ul einer Lösung aus 20 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) zugegeben.

PCR

Die Reaktionen wurden wie folgt in dünnwandigen 0,25 ml-Reaktionsgefäßen (Perkin Elmer) angesetzt:
1,5 ul 10 · Puffer;
1,5 ul 15 mM MgCl&sub2;;
1,5 ul 2 mM dNTPs (Phannacia);
0,5 ul von jedem Primer aus einer 5 mM Stammlösung (Genosys);
9 u1 steriles, deionisiertes Wasser;
0,1 ul (0,5 Einheiten) AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer);
1 ul DNA-Lysat.
Die Reaktionsgefäße wurden daraufhin in einen Thermal Cycler vom Typ Perkin Elmer 9600 gesetzt und die PCR entsprechend den unten gezeigten Bedingungen durchgeführt:
94ºC für 4 Minuten;
30 Zyklen mit je 94ºC für 30 Sekunden; 58ºC für 1 Minute; und 72ºC für 1 Minute. 72ºC für 4 Minuten;
4ºC bis zur weiteren Verwendung.

Reagenzien

10 · PCR-Puffer 100 mM Tris-HCl piEl 8,3 (25ºC), 500 mM KCl
Vorwärts-Primer GCTAGTTAATGACATTGTACATAA
oder CCAATCCTATTCACGAAAAAGC
Rückwärts-Primer GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC
oder CAACCCACTTGCTCCCAC
Ist einer der Primer mit einem Fluoreszenzmarker markiert, so können die Folgeprodukte in einem automatischen DNA-Sequenziergerät, wie diem DNA-Sequenzer 373 von Applied Biosystems, mit der Software Genescan und Genotyper analysiert werden.

BEISPIEL 2

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

5 ul der PCR-Produkte wurden mit 2 ul Ladepuffer gemischt und auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidflachgel in 1 · TBE-Puffer 4 Stunden lang bei 100 V aufgetrennt. Das Gel wurde daraufhin in einer Ethidiumbromidlösung der Konzentration 50 ng/ml 30 Minuten lang gefärbt und die PCR-Produkte auf einem Transilluminator bei UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert. Die Größe der PCR-Produkte in Basenpaaren wurde dann aus den relativen Mobilitäten im Vergleich mit bekannten Molekulargewichtsmarkern, die auf dem gleichen Gel aufgetrennt wurden, geschätzt. Die Schätzwerte der Größe der PCR- Produkte spiegelt die Länge der Mikrosatellitenallele wider.
Nach dem Gebrauch eines fluoreszenzmarkierten Primers in der PCR wurden die PCR-Produkte außerdem in einem DNA-Sequenzer von Applied Biosystems analysiert.

ERGEBNISSE

Häufigkeiten der OPN-Allele
Die Ergebnisse der Häufigkeiten der OPN-Allele bei verschiedenen Schweinepopulationen sind in Tabelle 1 präsentiert. TABELLE 1 Häufigkeiten der OPN-Allele bei verschiedenen Schweinepopulationen
L93 Tiere aus einer Population, die aus einer Kreuzung zwischen Landrace x Meishan entstand.
L94 Tiere aus einer Population, die aus einer Kreuzung zwischen Duroc x Meishan entstand.

Statistische Analyse

Weibliche Tiere aus L93 und L94 wurden hinsichtlich der Wurfgröße (sowohl die Gesamtzahl an Neugeborenen (GNG) als auch die Anzahl der Lebendgeburten (ALG)) durchgemustert, wenn möglich über mehrere Paritäten, und diese Daten wurden mit den Genotypen der OPN-Mikrosatelliten derselben Tiere verglichen. Die statistischen Assoziationen zwischen der Wurfgröße und den OPN-Genotypen wurden mit Hilfe der Methode der kleinsten Quadrate in einem allgemeinen linearen Modell untersucht. Für jeden OPN-Genotyp wurden Schätzungen der Mittelwerte der kleinsten Quadrate (MKQ) für die Wurfgröße durchgeführt. Die MKQ sind diejenigen Mittelwerte, die hinsichtlich anderer Effekte im Modell, welche die Wurfgröße beeinflussen könnten, korrigiert wurden.
Der Effekt der einzelnen OPN-Allele wurde mit Hilfe eines Allelsubstitutionsmodells weiter untersucht, wobei die Tiere in Gruppen klassifiziert wurden, je nachdem, ob sie 0, 1 oder 2 Kopien eines bestimmten Allels trugen. Für jede Gruppe wurden die MKQ-Werte geschätzt. Die Ergebnisse für L93 sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Allelsubstitutionsdaten für L93
Signifikanzstufe:*, P < 0,05; +, P < 0,10; NS, P > 0,10.
Das Modell berücksichtigt Jahreszeit, AI oder natürliche Beschäftigung; Ähnlichkeit, Generation und OPN-Genotyp.
GNG Gesamtzahl an Neugeborenen
ALG Anzahl der Lebendgeburten MKQ Mittelwerte der kleinsten Quadrate
n Anzahl der Messeinheiten, z. B. Würfe
Aus den Daten ist ersichtlich, dass Allel 112 mit einem negativen Effekt auf die Wurfgröße verbunden zu sein scheint, wogegen positive Trends für Allel 132 (ALG) und Allel 136 (GNG) zu sehen sind. Die in Tabelle 1 präsentierten Daten legen den Schluss nahe, dass, während die Allele 112 und 136 wahrscheinlich aus der Landrace-Abstammungslinie stammen, das Allel 132 entweder aus der Landrace- oder der Meishan-Abstammungslinie stammen könnte. Da jedoch das Allel 132 mehr als doppelt so häufig in Landrace- als in Meishan-Schweinen vorkommt, besteht die Wahrscheinlichkeit, dass ein signifikanter Anteil der Allele 132 in L93 aus der Landrace-Abstammungslinie stammt.
Um zu untersuchen, inwieweit diese Allele die Wurfgröße vorhersagen können, wurden zusätzliche Daten aus L94 in die Analyse aufgenommen. Allel 112 kam in dieser Linie nicht vor (dieses Allel kommt vermutlich nicht in der Duroc-Rasse vor). Die kombinierten Daten für die Allele 132 und 136 sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
Signifikanzstufe:***, P < 0,001; **, P < 0,01; +, P < 0,05; NS, nicht signifikant. Diese Daten zeigen, dass nur Allel 132 einen signifikanten positiven Effekt auf die Wurfgröße, sowohl in Bezug auf GNG als auch auf ALG, hatte. Obwohl Allel 136 für GNG fast signifikant war, besteht die Möglichkeit, dass der Effekt hier auf eine kleine Zahl von 136/136 Tieren (3) mit sehr hohen beobachteten Werten zurückzuführen ist.
Die Assoziation zwischen dem OPN-Allel 132 und einer großen Wurfgröße wurde nun in zwei unterschiedlichen Schweinelinien (L93 und L94) gezeigt. Dies zeigt an, dass ein QTL mit Einfluss auf die Wurfgröße eng mit dem OPN-Gen des Schweins assoziiert ist. Es ist jedoch möglich, dass bei anderen Familien, Linien oder Rassen von Schweinen ein anderes OPN-Allel mit einer erhöhten Wurfgröße assoziiert ist.
Die Ergebnisse einer erneuten Analyse der Daten für L93 und L94 und für eine zusätzliche Linie L07 (eine große weiße Linie), für die ein alternatives Modell verwendet worden ist, sind in Tabelle 4 unten gezeigt. Dazu gehörte die Einrichtung eines jeden OPN- Allels als Variable und die Kodierung jedes Tieres mit einer 0,1 oder 2 für jedes Allel (z. B. 0, 1 oder 2 Kopien eines jeden Allels).
Feste Effekte waren Art und Übereinstimmung von Herde-Jahreszeit-Bewirtschaltung. Das Vatertier wurde als Zufallseffekt miteinbezogen. ESR und OPN wurden als Kovariablen eingerichtet. Es wurden alle Daten pro Linie aufgenommen, nicht nur die der vollständig oder halb blutsverwandten Familien. OPN-Allele mit weniger als 10 Würfen eines zweiten Genotyps wurden von der Analyse ausgeschlossen.
Die analysierten Vererbungsmerkmale waren die Gesamtzahl an Neugeborenen (GNG) und die Anzahl der Lebendgeburten (ALG).
Für jede Linie wurden drei Modelle untersucht, einschließlich der festen und zufälligen Effekte und der Effekte des ESR, wie oben erwähnt.
1. Modell ausschließlich OPN
2. Modell einschließlich aller OPN-Allele
3. Modell einschließlich individueller OPN-Allele
Für jedes Modell wurde das -2Log-Likelihood-Verhältnis bestimmt. Die Signifikanz des Modells wurde berechnet, indem das Log-Likelihood-Verhältnis aus den Modellen 2 oder 3 von Modell 1 abgezogen und das Ergebnis mit einer Chi-Quadrat-Verteilung verglichen wurde. Der Unterschied zwischen den beiden Modellen bestand in den verwendeten Freiheitsgrade (FG).
Die Signifikanzstufen pro Linie für Modell 2 und jedes signifikante Allel in Modell 3 sind in der Tabelle unten gezeigt. TABELLE 4
Aus diesen Daten können die folgenden Schlussfolgerungen gezogen werden:
1. OPN verursachte eine signifikante Menge von Variationen der Wurfgröße (nach Einschluss von ESR) für L07 (p < 0,10); L93 (GNG: p < 0,10; ALG: p < 0,05) und L94 (GNG: p < 0,01; ALG: p < 0,05).
2. OPN-Allel 132 zeigte einen signifikant positiven Effekt auf die Wurfgröße in L93 und L94.
3. Andere Allele OPN122 (L07), OPN112 und OPN154(L93)und OPN124 (L94) zeigten signifikant negative Effekte.

BEISPIEL 3

Es wurden genomische DNA-Proben aus einer weiteren Linie L03 (eine weitere Linie großer weißer Schweine) gewonnen und analysiert. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 gezeigt. Es wurden 416 Tiere mit 1,010 Wurfberichten dokumentiert.
Es wurden mehrere verschiedene Modelle verwendet. Alle Modelle berücksichtigten den Effekt von Farm und Monat des Wurfs, Parität und Vatertier. ESR wurde bei allen Analysen als Kovariable eingerichtet.
Als Vererbungsmerkmale untersucht wurden die Gesamtzahl an Neugeborenen (GNG) und die Anzahl der Lebendgeburten (ALG).
Verwendete Modelle:
1. Gesamtzahl an Neugeborenen = Wurfmonat + Vatertier + ESR + OPN-Allel
2. GNG oder ALG = Wurfmonat + Vatertier + ESR + OPNI 12 + OPN122, etc. Tabelle 5
Diese Daten zeigen, dass OPN124 für jede Allelkopie einen signifikanten (p < 0,01) positiven Effekt von 0,7 im Hinblick auf GNG zeigte. Außerdem zeigte OPN142 einen Trend in Richtung eines negativen Effekts auf die Wurfgröße bei L03, ein Effekt, der dem bei L93 gesehenen ähnlich ist.
Wie oben erörtert ist gezeigt worden, dass ein anderes Gen, ESR, die Wurfgröße bei Schweinen beeinflusst, und es besteht die Wahrscheinlichkeit, dass in der Zukunft andere Gene identifiziert werden, die mit der Wurfgröße verlinkt sind. Wir haben untersucht, ob bestimmte vorteilhafte Allelkombinationen der beiden separaten Gene, OPN und ESR, einen additiven Effekt auf die Wurfgröße ausüben.
Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir uns die Assoziation zwischen Wurfgröße und verschiedenen Kombinationen aus ESR- und OPN-Allelen angesehen. Die unten in Tabelle 4 und 5 vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass sich vorteilhafte Allele von OPN in der Tat in positiver Weise mit vorteilhaften Allelen von ESR kombinieren können, so dass eine noch stärker erhöhte Wurfgröße realisiert werden kann als durch die vorteilhaften Allele von OPN oder ESR alleine. Tabelle 4: Allelsubstitutionseffekt für OPN- und ESR-Marker auf die Wurfgröße (GNG) in Linie 93 (L93)
Tabelle 5:
Erwarteter Vorteil in Bezug auf die Wurfgröße (GNG) bei verschiedenen Kombinationen von OPN- und ESR-Markern in Linie 93 (L93), beruhend auf den in Tabelle 4 präsentierten Daten
Bei den Effekte auf die Wurfgröße wird vollständige Additivität (OPN132 = +0,49; ESR B = +0,34) vorausgesetzt, außer den in Klammern gesetzten Werten, bei denen ein Effekt von OPN132 oder ESR B = +0,39 vorausgesetzt wurde.

Claims

1. Verfahren zum Durchmustern von Schweinen, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welches Verfahren folgenden Schritt beinhaltet:

(i) Analysieren der genomischen DNA in einer Probe, die von einem Schwein erhalten wurde, um zu bestimmen, welches OPN-Allel/welche OPN-Allele vorhanden ist/sind.

2. Verfahren zum Durchmustern von Schweinen, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welches Verfahren folgende Schritte beinhaltet:

(i) Hybridisieren der genomischen DNA in einer Probe, die von einem Schwein erhalten wurde, mit einem oder mehreren passenden Primern.

(ii) Durchführen von einem oder mehreren PCR-Zyklen unter Verwendung der hybridisierten Nukleinsäure aus Schritt (i); und

(iii) Analysieren der Länge des aus Schritt (ii) erhaltenen PCR-Produkts, um zu bestimmen, welches OPN-Allel/welche OPN-Allele vorhanden ist/ sind.

3. Verfahren zum Durchmustern von Schweinen, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welches Verfahren folgende Schritte beinhaltet:

(i) Analysieren der genomischen DNA in einer Probe, die von einem Schwein erhalten wurde, um zu bestimmen, welches OPN-Allel/ welche OPN-Allele vorhanden ist/ sind; und

(ii) Analysieren der aus Schritt (i) erhaltenen genomischen DNA, um zu bestimmen, welches Allel/welche Allele von zumindest einem anderen Gen, das mit der Wurfgröße in Ferkeln verlinkt ist, vorhanden ist/sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zumindest eine andere Gen das ESR Gen ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Bestimmung von OPN-Allelen in Schritt (i) die Bestimmung der Anwesenheit von zumindest einem Allel, das mit zumindest einem DNA-Marker assoziiert ist, der entweder direkt oder indirekt mit OPN verlinkt ist, beinhaltet:

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der DNA-Marker ein Mikrosatellit ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der DNA-Marker Sw1085, Sw194, Sw16, Sw790, So178 oder Sw61 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein oder mehrere Primer, die in der Lage sind, an eine mit dem Mikrosatellit assoziierte Region zu hybridisieren, zu der Probe der genomischen DNA hinzugefügt werden, gefolgt von einem oder mehreren PCR-Zyklen, um Primer-Verlängerungsprodukte zu bilden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das OPN-Allel oder die OPN-Allele, das/- die in der Probe der genomischen DNA anwesend ist/sind, unter Bezug auf die Länge des Primer-Verlängerungsproduktes/ der Primer-Verlängerungsprodukte bestimmt wird/werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei ein oder mehrere der folgenden Primer eingesetzt wird/werden:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA;

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTITTTCCACTGC; oder

CAACCCACTTGCTCCCAC.

11. Ausrüstung zum Durchmustern von Schweinen, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welche ein oder mehrere Reagentien oder Materialien enthält, die in der Lage sind, OPN-Allele in einer genomischen Schweine-DNA-Probe zu identifizieren.

12. Ausrüstung zum Durchmustern von Schweinen, um diejenigen zu bestimmen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen und/oder diejenigen die mit geringerer Wahrscheinlichkeit einen größeren Wurf hervorbringen, welche ein oder mehrere Reagentien oder Materialien enthält, die in der Lage sind, OPN-Allele in einer genomischen Schweine-DNA-Probe zu identifizieren, zusammen mit einem oder mehreren Reagentien oder Materialien, die in der Lage sind, Allele von zumindest einem anderen Gen, das mit der Wurfgröße in Schweinen verlinkt ist, in einer Probe genomischer Schweine- DNA zu identifizieren.

13. Ausrüstung nach Anspruch 12, wobei das zumindest eine andere Gen das ESR-Gen ist.

14. Ausrüstung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, welche Reagentien oder Materialien enthält, die in der Lage sind, Allele zu identifizieren, die mit mit dem OPN-Gen verlinkten DNA-Markern assoziiert sind.

15. Ausrüstung nach Anspruch 14, wobei der DNA-Marker ein Mikrosatellit ist und die Ausrüstung ein oder mehrere DNA-Primer enthält, die in der Lage sind, an eine Region der genomischen DNA zu hybridisieren, die mit dem Mikrosatellit assoziiert ist.

16. Ausrüstung nach Anspruch 15, wobei ein oder mehrere der folgenden Primer enthalten sind:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA;

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTEFFCCACTGC; oder

CAACCCACTTGCTCCCAC.

17. Ausrüstung nach Anspruch 15 oder 16, welche Standard-PCR-Reagentien enthält.

18. Verfahren zur Bestimmung, welches Allel oder welche Allele für einen mit dem Schweine-OPN-Gen assoziierten DNA-Marker assoziiertist/sind mit größerer Wurfgröße, welches folgende Schritte umfaßt:

(i) Bestimmung welches Allel oder welche Allele für einen bestimmten DNA- Marker, der mit dem OPN-Gen assoziiert ist, in einer Probe genomischer DNA, die von einem oder mehreren Schweinen erhalten wurde, vorhanden ist/sind.

(ii) Vergleichen des Ergebnisses von Schritt (i) mit einer ähnlichen Bestimmung, die bei einem oder mehreren Schweinen, von denen bekannt ist, daß sie größere Wurfgrößen hervorbringen, durchgeführt wurde.