DE69231615T2

DE69231615T2 - Genetische marker für die grösse eines ferkelwurfes

Info

Publication number: DE69231615T2
Application number: DE69231615T
Authority: DE
Inventors: D. Jacobson; F. Rothschild
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Biotechnology Research and Development Corp; Iowa State University Research Foundation ISURF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Biotechnology Research and Development Corp; Iowa State University Research Foundation ISURF
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-16
Publication date: 2001-06-28
Anticipated expiration: 2012-04-17
Also published as: WO1992018651A1; CA2108579C; EP0580767A4; US5374526A; JPH06506837A; ATE198357T1; BR9205918A; DK0580767T3; AU1917692A; ES2153359T3; JP3404534B2; DE69231615D1; CA2108579A1; GR3035473T3; EP0580767A1; AU660994B2; EP0580767B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft allgemein die Ermittlung genetischer Unterschiede für die Vermehrungseffizienz unter Schweinen und insbesondere genetische Marker, die zum Identifizieren von Schweinen, welche mit höherer Wahrscheinlichkeit große Wurfgrößen produzieren, dienlich sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Vermehrungseffizienz, welche als Anzahl von produzierten Schweinen je weiblichem Zuchttier definiert werden kann, ist der hauptsächliche Einschränkungsfaktor bei der effizienten Produktion von Schweinefleisch. Die Anzahl von lebendgeborenen Schweinen in den Vereinigten Staaten von Amerika beträgt durchschnittlich rund 9,5 Schweine je Wurf. Die Erblichkeit der Wurfgröße ist gering (10% - 15%), und herkömmliche genetische Verfahren zum Auswählen weiblicher Zuchttiere auf der Grundlage vergangener Wurfgröße erwiesen sich nicht als wirksam. Daher besteht ein Bedarf an einer Methode, welche sich mit der Selektion für die Vermehrung auf zellulärer oder DNA- Ebene auseinandersetzt.
Chinesische Rassen sind für das Erreichen der Pubertät in einem geringen Alter und für ihre großen Wurfgrößen bekannt. Amerikanische Rassen sind für ihre größeren Wachstumsraten und größere Magerkeit bekannt. Demnach wäre es erstrebenswert, die besten Eigenschaften beider Rassentypen zu kombinieren und dadurch die Effizienz der Schweinefleischproduktion in den USA zu verbessern. Diese Bestrebungen würden durch die Entdeckung von Genen oder genetischen Markern, welche mit erhöhter Wurfgröße bei Schweinen assoziiert sind, erheblich unterstützt.
Bei Säugetieren erfolgt die Vermehrung als Reaktion auf eine Kette von Ereignissen, welche zwischen dem Gehirn und den Fortpflanzungsorganen ablaufen. Die Steroidhormone, beispielsweise Östrogen, spielen eine entscheidende Rolle. Steroidhormone wirken mit Zellen und Geweben zusammen und lösen eine Reihe von Ereignissen aus, welche die Fähigkeit, sich erfolgreich fortzupflanzen, zur Folge haben.
Bei Schweinen übt Östrogen, welches in erster Linie von den Ovarien erzeugt wird, nachhaltige Wirkungen auf Uterus, Gehirn und Hypophyse aus. Östrogene modulieren den Beginn der Pubertät, das Fortpflanzungsverhalten, das zyklische Freisetzen von Gonadotropinen und das Stillverhalten. Die Wirkungen von Östrogenen treten infolge des Bindens von Östrogen an spezifische Rezeptorproteine auf, welche im Kern der auf Östrogen ansprechenden Zellen vorliegen. McEwen et al., Recent Prog. Horm. Res., 38 : 41-92 (1982).
Das Gen, welches für das Kodieren für den menschlichen Östrogenrezeptor verantwortlich ist, wurde identifiziert, und es ist bei der American Type Culture Collection frei verfügbar. Siehe ATCC Catalog Sept. 1990, Seite 112, Eintrag 57681. Der Name der Sonde lautet pOR3 und ist 1,3 kb. Green et al., Nature (London) 320 : 134-139 (1986). In einer Restriktionsfragmentpolymorphismus(RFLP)-Analyse wurde festgestellt, daß das menschliche Gen polymorph ist. Castagnoli et al., Nucl. Acids Res. 15 : 886 (1987); Coleman et al., Nucl. Acids Res. 16 : 7208 (1988). Die funktionellen Unterschiede der verschiedenen Genotypen sind nicht gut geklärt, sie wurden jedoch mit einer erhöhten Spontanabortushäufigkeit bei Menschen mit Brustkrebs in Zusammenhang gebracht. Lehrer et al., The Lancet, 335 : 622-624 (17. März 1990).
Das Östrogenrezeptorgen wurde für andere Spezies isoliert und sequenziert, jedoch nicht für Schweine. Koike et al., Nucl. Acids Res. 15 : 2499-2513 (1987), berichten über die Isolierung und Sequenzierung eines cDNA-Klons des Uterus-Östrogenrezeptors von Ratten. Die Verfasser stellen fest, daß ein Vergleich der Östrogenrezeptorsequenzen von Ratten, Menschen und Hühnern das Vorhandensein drei hochgradig konservierter Regionen andeuten, was darauf schließen läßt, daß diese drei Regionen bedeutende Rollen bei der Östrogenrezeptorfunktion spielen.
Darüber hinaus melden Koike et al., Biochemistry 26 : 2563-2568 (1987), die teilweise Identifizierung des Östrogenrezeptorbindungsorts von Schweinen. Das Dokument berichtet über ein Fragment von ungefähr 30 kDa, welches wahrscheinlich der hydrophoben C-Terminus-Halbregion entspricht und eine Homologie mit den entsprechenden Sequenzen von Ratten, Menschen und Hühnern aufweist, die größer als 90% ist.
Mehrere Gruppen bedienten sich der RFLP-Analyse, um Schweine-DNA zu untersuchen. Jung et al., Theor. Appl. Genet. 77 : 271-274 (1989), offenbart die Verwendung von RFLP-Techniken, um die genetische Variabilität zwischen zwei Schweinerassen aufzuzeigen. Bei diesen Rassen wurde für Schweineleukocytenantigen(SLA)-Klasse-I-Gene Polymorphismus nachgewiesen. Hoganson et al., Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science, 26.-28. März 1990, berichten über den Polymorphismus von Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex(MHC)-Genen für chinesische Schweine, was auch durch RFLP-Analyse nachgewiesen wurde. Jung et al., Animal Genetics, 20 : 79-91 (1989), berichten über die RFLP-Analyse von SLA-Klasse I- Genen bei bestimmten Ebern. Wie die Verfasser feststellen, lassen die Resultate darauf schließen, daß ein Zusammenhang zwischen SLA/MHC-Klasse I-Genen von Schweinen und Produktions- und Leistungsmerkmalen bestehen könnte. Weiters bekunden sie, daß die Verwendung von SLA-Klasse I-Restriktionsfragmenten als genetische Marker in der Zukunft möglicherweise zum Verbessern der Schweineleistung verwendet werden könne.
Chardon et al. (Immunogenetics, 21 : 161-171 (1985)) verwendete menschliche HLA-cDNA-Sonden, um den RFLP-Polymorphismus des SLA-Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes bei Schweinen zu analysieren.
WO 88/08457 offenbarte Polymorphismen im menschlichen Insulingen und zeigte, daß diese eine hohe Harzhypertonie bei einzelnen menschlichen Subjekten im vorhinein anzeigen können.
Vor der vorliegenden Erfindung wurde die RFLP-Analyse niemals auf das Östrogen-Rezeptorgen von Schweinen angewandt, welches nicht einmal identifiziert wurde. Die vorliegende Erfindung schafft Abhilfe für diese Mängel. Sie sieht ausgehend von der Entdeckung von Polymorphismus im Östrogen-Rezeptorgen von Schweinen genetische Marker vor, welche sich auf erhöhte Wurfgröße bei Schweinen beziehen. Dies ermöglicht die Durchmusterung und genetische Typisierung von Schweinen hinsichtlich ihrer Östrogenrezeptorgene. Dies ermöglicht ebenso die Feststellung einzelner männlicher und weiblicher Tiere, von denen zu erwarten wäre, daß sie eine Wurfgröße produzieren, die über dem Durchschnitt ihrer Rasse liegt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Durchmusterung von Schweinen vorzusehen, um jene zu bestimmen, welche eher dazu neigen, größere Würfe zu produzieren.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Feststellen genetischer Marker für die Schweinewurfgröße vorzusehen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, genetische Marker für Schweinewurfgröße vorzusehen.
Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Set zum Auswerten einer Probe von Schweine-DNA vorzusehen.
Weitere Aufgaben und Vorzüge der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargelegt und gehen zum Teil klar aus der Beschreibung hervor oder können durch die Anwendung der Erfindung in Erfahrung gebracht werden. Die Aufgaben und Vorzüge der Erfindung werden durch die in den beiliegenden Ansprüchen im besonderen hervorgehobenen Instrumentarien und Kombinationen erzielt.
Um die Aufgaben zu erreichen und nach Maßgabe des Erfindungszweckes, welcher in diesem Dokument enthalten ist und in großen Zügen beschrieben wird, sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchmusterung von Schweinen vor, um jene zu bestimmen, welche, wenn sie gezüchtet werden, eher dazu neigen, größere Würfe zu produzieren. Eine Probe genomischer DNA wird aus einem Schwein entnommen, und das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines Polymorphismus im Östrogenrezeptorgen, welches mit erhöhter Wurfgröße in Zusammenhang steht, wird festgestellt. Vorzugsweise ist der Polymorphismus ein Restriktionsfragment-Polymorphismus.
Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines spezifischen Fragmentes oder RFLP-Musters wird anhand folgender Schritte ermittelt. Erstens wird die genomische DNA mit einer Restriktionsendonuclease aufgeschlossen, welche das Schweineöstrogenrezeptorgen an zumindest einem Ort aufschneidet. Zweitens werden die aus dem Aufschließvorgang gewonnenen Fragmente getrennt, vorzugsweise mittels Gelelektrophorese. Drittens werden die Fragmente mit einer Sonde festgestellt, die in der Lage ist, an diese zu hybridisieren. Dies erzeugt ein Restriktionsmuster. Zuletzt wird das Restriktionsmuster mit einem bekannten RFLP-Muster für dieses Gen verglichen, welches mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird. Das zweite Muster ist eines, das durch Verwendung derselben Restriktionsendonuclease und derselben Sonde oder einer gleichwertigen Sonde gewonnen wird. Vorzugsweise handelt es sich bei der Sonde um das menschliche Östrogenrezeptorgen.
Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Feststellen eines genetischen Markers für Ferkelwurfgröße. Männliche und weibliche Schweine derselben Rasse oder Rassenkreuzung oder aus gleichartigen genetischen Abstammungslinien werden gezüchtet, und die Anzahl von Nachkommen, welche von jedem weiblichen Schwein geworfen werden, wird festgestellt. Der Polymorphismus im Östrogenrezeptorgen jedes Schweins wird festgestellt und mit der Anzahl von Nachkommen in Zusammenhang gebracht. Vorzugsweise wird RFLP-Analyse verwendet, um den Polymorphismus festzustellen, und insbesondere wird die genomische DNA mittels der Restriktionsendonuclease Pvu II aufgeschlossen. Für Schweine der Meishan-Rasse ergibt eine derartige Analyse ein 4,3 Kilobase-Fragment, das mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird.
Die Erfindung umfaßt weiters ein Set zum Auswerten einer Probe von Schweine- DNA. In seiner Minimalausführung ist das Set ein Behälter mit einem oder mehreren Reagenzien, welche Polymorphismus im Schweineöstrogenrezeptorgen identifizieren. Vorzugsweise ist das Reagens eine Sonde, welche mit dem Schweineöstrogenrezeptorgen oder Fragmenten davon hybridisiert. Vorzugsweise ist die Sonde das menschliche Östrogenrezeptorgen. Vorzugsweise umfaßt das Set weiters ein Restriktionsenzym, welches das Schweineöstrogenrezeptorgen an mindestens einem Ort aufspaltet.
Die beiliegende Figur, welche in diese Beschreibung aufgenommen wurde und einen Teil dieser darstellt, veranschaulicht eine Ausführungsform der Erfindung und dient gemeinsam mit der Beschreibung dazu, die Grundgedanken der Erfindung zu erläutern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 stellt die RFLP-Analyse der DNA von Duroc-Schweinen (Bahn 1) und chinesischen Schweinen (Bahn 2-16) unter Verwendung der menschlichen Östrogenrezeptorgen-Sonde dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der Folge wird ausführlich auf die zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, welche gemeinsam mit den nachfolgenden Beispielen dazu dienen, die Grundgedanken der Erfindung zu erläutern.
Die Erfindung betrifft genetische Marker für die Wurfgröße bei Schweinen. Sie sieht ein Verfahren zur Durchmusterung von Schweinen vor, um jene festzustellen, welche, wenn sie züchten, eher dazu neigen, größere Würfe zu produzieren, durch Feststellen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Polymorphismus im Östrogenrezeptorgen, welches mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird. In diesem Dokument bezeichnet der Begriff "erhöhte Wurfgröße" eine signifikante Erhöhung der Wurfgröße über den Mittelwert einer bestimmten Population.
Die Verwendung von RFLPs stellt das bevorzugte Verfahren zum Feststellen des Polymorphismus dar. Da jedoch die Verwendung der RFLP-Analyse letztlich von Polymorphismen und DNA-Restriktionsorten entlang dem Nucleinsäuremolekül abhängig ist, können auch andere Verfahren des Feststellens des Polymorphismus verwendet werden. Zu derartigen Verfahren gehören solche, die das polymorphe Genprodukt analysieren und Polymorphismen durch Feststellen der resultierenden Differenzen im Genprodukt ermittlen.
Die RFLP-Analyse im allgemeinen ist eine Durchschnittsfachleuten bestens bekannte Methode. Siehe beispielsweise US-Patent 4,582,788, ausgegeben am 15. April 1986 an Erlich, und US-Patent 4,666,828, ausgegeben am 19. Mai 1987 an Gusella. In großen Zügen umfaßt die Methode das Entnehmen der zu untersuchenden DNA, das Aufschließen der DNA mit Restriktionsendonuclease, das Trennen der entstehenden Fragmente und das Feststellen der Fragmente.
Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Probe genomischer DNA einem Schwein entnommen. Im allgemeinen werden periphere Blutzellen als Quelle der DNA herangezogen. Eine ausreichende Menge an Zellen wird entnommen, um eine ausreichende Menge DNA für die Analyse bereitzustellen. Diese Menge ist einschlägig versierten Fachleuten bekannt oder von diesen ohne weiteres zu ermitteln. Die DNA wird aus den Blutzellen mittels Verfahren, die einschlägig versierten Fachleuten bekannt sind, isoliert.
In bestimmten Fällen kann es erstrebenswert sein, die Menge von DNA durch Verwendung standardmäßiger Methoden, beispielsweise der Polymerasekettenreaktion, zu verstärken. Diese Methode wird in den US-Patenten 4,683,195, ausgegeben am 28. Juli 1987 an Mullis et al., 4,683,202, ausgegeben am 28. Juli 1987 an Mullis et al., 4,800,159, ausgegeben am 24. Januar 1989 an Mullis et al., 4,889,818, ausgegeben am 26. Dezember 1989 an Gelfand et al., und 4,902,624, ausgegeben am 20. Februar 1990 an Columbus et al., beschrieben.
Die isolierte DNA wird daraufhin mit einer Restriktionsendonuclease aufgeschlossen, welche die DNA an einer spezifischen Nucleotidsequenz, einem sogenannten Restriktionsort, hydrolytisch spaltet oder durchtrennt. Derartige Endonucleasen, die auch als Restriktionsenzyme bezeichnet werden, sind einschlägig versierten Fachleuten bestens bekannt. Für die vorliegende Erfindung sollte eine solche gewählt werden, die das Schweineöstrogenrezeptorgen an mindestens einem Ort spaltet und somit mindestens zwei Fragmente des Gens erzeugt. Mittels im Stand der Technik bekannter Methoden und in Verbindung mit den in diesem Dokument enthaltenen Lehren erfolgt eine Feststellung, ob derartige Fragmente polymorph sind oder nicht und ob der Polymorphismus mit der Wurfgröße in Zusammenhang steht. Vorzugsweise handelt es sich bei einer derartigen Restriktionsendonuclease um Pvu II. Die Menge eines derartigen Enzyms, welches der Probe, welche die Schweine-DNA enthält, zuzugeben ist und die anderen geeigneten Bedingungen zum Behandeln der Probe sind von einschlägig versierten Fachleuten unter Berücksichtigung der in diesem Dokument enthaltenen Lehren ohne weiteres zu bestimmen.
Die Restriktionsfragmente werden daraufhin anhand bekannter Methoden, welche allgemein unter anderem entweder die Trennung der Fragmente, um ein bestimmtes Muster zu erhalten, oder die Feststellung unterschiedlicher Größen der Fragmente vorsehen, analysiert. Die bevorzugte Methode, um dies zu bewerkstelligen, ist die Gelelektrophorese.
Bei diesem Verfahren werden die aufgeschlossenen Fragmente in einem Trägermedium der Größe nach unter der Einwirkung eines angelegten elektrischen Feldes getrennt. Gellagen oder -platten, beispielsweise Agarose oder Agaroseacrylamid, werden typischerweise als Trägermedium verwendet. Die Probe, welche die Restriktionsfragmente enthält, wird einem Ende des Gels zugegeben. Einer oder mehrere Größenmarker werden auf demselben Gel als Kontrollen verwendet, um eine Schätzung der Größe der Restriktionsfragmente zu ermöglichen. Dieser Vorgang ermöglicht im allgemeinen einen Auflösungsgrad, welcher Fragmente trennt, die sich der Größe nach um nur 100 Basenpaare voneinander unterscheiden.
Die getrennten Fragmente werden daraufhin vorzugsweise denaturiert und physisch vom Gel auf einen Filter übergeführt, vorzugsweise auf eine Nylonmembran, u. zw. durch Zusammenbringen des Gels mit dem Filter in Gegenwart geeigneter Reagenzien und unter geeigneten Bedingungen, welche den Übergang der DNA fördern. Derartige Reagenzien und Bedingungen sind einschlägig versierten Fachleuten bestens bekannt. Somit werden die relativen Positionen der DNA-Fragmente, welche sich aus dem Trennungsvorgang ergeben, aufrechterhalten.
Der nächste Schritt umfaßt die Feststellung der verschiedenen Größenkategorien der Fragmente oder, alternativ dazu, die Feststellung eines Fragments von bestimmter Größe. Letzteres kann von besonderer Bedeutung sein, zumal es sich um einen genetische Marker handelt, der mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird. In jedem der beiden Fälle ist die bevorzugte Methode die Verwendung einer Hybridisierungssonde. Eine derartige Sonde ist ein Oligonucleotid oder Polynucleotid, welches zu den Fragmenten ausreichend komplementär oder homolog ist, um mit diesen zu hybridisieren und Sonden-Fragment- Komplexe zu bilden. Vorzugsweise ist die Sonde eine cDNA-Sonde. Das Oligonucleotid oder Polynucleotid ist mit einer feststellbaren Komponente markiert. Dies ermöglicht die Feststellung der Restriktionsfragmente, an welche die Sonden hybridisiert sind. Die Sonden werden mittels herkömmlicher Markiermethoden, beispielsweise mit einer radioaktiven Markierung, Enzymmarkierung, fluoreszierenden Markierung, Biotin-Avidin- Markierung und dergleichen, markiert.
Bei der vorliegenden Erfindung wird eine cDNA für das menschliche Östrogenrezeptorgen als Polynucleotid der Sonde verwendet. Vorzugsweise ist die feststellbare Komponente ³²P oder Biotin-Avidin. Die Erfinder haben entdeckt, daß diese Sonde zum Schweineöstrogenrezeptorgen ausreichend homolog ist, um an dieses und an die verschiedenen von Restriktionsendonucleasen erzeugten Fragmente zu binden. Allerdings können andere, im wesentlichen gleichwertige Sonden von einschlägig versierten Fachleuten unter Berücksichtigung der in diesem Dokument enthaltenen Lehren bestimmt werden. In diesem Dokument ist eine Sonde, die der Humanöstrogenrezeptorgen-Sonde "im wesentlichen gleichwertig" ist, eine Sonde, die an dieselben polymorphen Fragmente von Aufschlußprodukten des Schweineöstrogenrezeptorgens hybridisiert wie die Humanöstrogenrezeptorgen-Sonde, wenn dasselbe Restriktionsenzym verwendet wird. Beispielsweise können bestimmte Fragmente, welche mit der Schweinewurfgröße assoziiert werden, mittels bekannter Methoden sequenziert werden, und synthetische Sonden können ebenfalls mittels bekannter Methoden hergestellt werden.
Beim bevorzugten Verfahren werden die Sonden mit der Nylonmembran, welche die Restriktionsfragmente enthält, während eines ausreichenden Zeitraums und unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht, damit die Sonden an die Fragmente hybridisieren können. Der Filter wird daraufhin vorzugsweise gewaschen, um ungebundene Sonden und andere unerwünschte Stoffe zu entfernen.
Die Sonden-Fragment-Komplexe, welche an den Filter gebunden sind, werden daraufhin mittels bekannter Methoden ermittelt. Beispielsweise beinhaltet, wenn die Sonde radioaktiv markiert (32P) wurde, das Ermitteln das Kontaktieren des Nylonmembranpapiers mit einem Stück strahlungsempfindlichen Films. Nach einem geeigneten Kontaktzeitraum werden die gewünschten Fragmente, einschließlich von Kontrollfragmenten, abgebildet.
Der Ermittlungsschritt ergibt ein Muster, welches sich aus der Trennung der Fragmente nach deren Größe ergibt. Der Vergleich dieser Fragmente mit Kontrollfragmenten von bekannter Größe, welche ebenfalls auf demselben Gel laufen gelassen wurden, ermöglicht die Schätzung der Größe der verschiedenen Fragmentgruppen. Die verschiedenen Polymorphismen im Schweineöstrogenrezeptorgen werden daraufhin durch Vergleichen der Muster, welche anhand einer ähnlichen Analyse von DNA aus einer Reihe verschiedener Schweine erzeugt wurden, bestimmt. Für einige der einzelnen Schweine werden sich die Muster vom üblichen Muster unterscheiden, welches sich für die meisten anderen Schweine ergibt. Dies läßt sich auf Längenpolymorphismen eines oder mehrerer Restriktionsfragmente zurückführen, d. h. Restriktionsfragmente von unterschiedlicher Länge, welche von der Endonuclease, welche das Schweineöstrogenrezeptorgen auftrennt, erzeugt werden. Dies deutet auf unterschiedliche Basenpaarsequenzen bei derartigen Schweinen hin.
Sobald ein bestimmter RFLP, d. h. ein Restriktionsfragment von einer bestimmten Länge, ermittelt wurde, kann durch Verwendung bekannter Methoden eine Sonde für dieses Fragment konstruiert werden. Dies ermöglicht alternative und schnellere Formate zum Feststellen eines derartigen Polymorphismus. Beispielsweise kann, sobald die DNA aufgeschlossen ist, ein Sandwich-Hybridisierungsformat verwendet werden. Eine derartige Analyse wird in den US-Patenten 4,486,539, ausgegeben am 4. Dezember 1984 an Ranki et al., und 4,536,419, ausgegeben am 7. Januar 1986 an Ranki et al., offenbart. Die Probe wird mit einer Einfangsonde in Kontakt gebracht, welche auf einem festen Träger immobilisiert ist. Die Sonde bindet das Fragment. Daraufhin wird der Träger gewaschen, und eine markierte Feststellsonde wird zugegeben. Nach neuerlichem Waschen wird die Nachweissonde festgestellt, wodurch das Vorhandensein des gewünschten Fragments nachgewiesen wird.
Sobald das RFLP-Muster ermittelt wurde oder ein bestimmtes polymorphes Fragment ermittelt wurde, wird es mit einem zweiten, bekannten RFLP-Muster oder -Fragment verglichen, welches mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird. Dieses zweite Muster oder Fragment wurde, unter Verwendung derselben Restriktionsendonuclease wie das erste und dieselbe Sonde oder ein Äquivalent davon, ebenfalls aus dem Schweineöstrogenrezeptorgen nachgewiesen.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung können die Restriktionsfragmente durch Lösungshybridisierung festgestellt werden. Bei dieser Methode werden die Fragmente zunächst mit der Sonde hybridisiert und daraufhin getrennt. Die getrennten Sonden-Fragment-Komplexe werden dann durch Nachweisen der feststellbaren Komponente in der Sonde wie oben besprochen festgestellt. Im allgemeinen werden derartige Komplexe auf dem Gel ohne Transfer auf Filterpapier bestimmt.
Wenngleich die oben genannten Verfahren im Kontext der Verwendung eines einzigen Restriktionsenzyms und einer einzigen Sonde beschrieben werden, sind diese Verfahren diesbezüglich nicht eingeschränkt. Ein(e) oder mehrere zusätzliche(s) Restriktionsenzym(e) und/oder Sonde(n) können, wenn dies gewünscht wird, verwendet werden. Zusätzliche Enzyme, Rassen und konstruierte Sonden können durch herkömmliches Experimentieren bestimmt werden.
Genetische Marker für Schweinewurfgröße werden wie folgt festgestellt. Männliche und weibliche Schweine derselben Rasse oder Rassenkreuzung oder aus gleichartigen genetischen Abstammungslinien werden gepaart. Die Anzahl von Nachkommen, welche von jedem weiblichen Schwein produziert wird, wird festgestellt. Die RFLP-Analyse der Eltern-DNA wird wie oben besprochen durchgeführt, um Polymorphismen im Östrogenrezeptorgen jedes Schweins festzustellen. Die Polymorphismen werden mit der Anzahl von Nachkommen in Bezug gesetzt. Mindestens 20 und vorzugsweise mindestens 40 weibliche Schweine werden zum Durchführen dieser Feststellungen herangezogen. Die Anzahl, wie oft ein weibliches Tier Nachkommen wirft (d. h. die Parität), beträgt mindestens eins. Vorzugsweise wird der Zyklus aus Zucht und Geburt mindestens 2 Mal und insbesondere 3 Mal wiederholt. Die bevorzugten Schweinerassen sind Meishan, Fengjing, Minzhu, Duroc, Hampshire, Landrace, Large White, Yorkshire, Spotted Poland China, Berkshire, Poland China und Chester White. Wenn diese Analyse für die Meishan-Rasse durchgeführt wird und der Polymorphismus anhand der RFLP-Analyse unter Verwendung der RFLP-Restriktionsendonuclease Pvu II festgestellt wird, wird ein 4,3-Kilobase-Fragment mit erhöhter Wurfgröße assoziiert.
Die Reagenzien, welche sich zum Anwenden der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, können in zweckmäßigen Sets verpackt werden. Die Sets sehen die erforderlichen Materialien vor, welche in geeigneten Behältern verpackt sind. Vorzugsweise sind die Behälter auch Träger, die der Durchführung der Analyse dienlich sind. Das Set enthält mindestens ein Reagens, das einen Polymorphismus im Schweineöstrogenrezeptorgen feststellt, der mit einer erhöhten Wurfgröße assoziiert wird. Vorzugsweise ist das Reagens eine Sonde, welche mit dem Schweineöstrogenrezeptorgen oder Fragmenten davon hybridisiert. Vorzugsweise sind sowohl die Sonde als auch ein Restriktionsenzym, welches das Schweineöstrogenrezeptorgen an zumindest einem Ort spaltet, im Set enthalten. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Sonde das Humanöstrogenrezeptorgen, ein Schweineöstrogenrezeptorgen oder ein Genfragment, welches mit einer feststellbaren Komponente markiert wurde, und das Restriktionsenzym umfaßt Pvu II. Vorzugsweise umfaßt das Set weiters zusätzliche Mittel, beispielsweise Reagenzien, zum Feststellen oder Messen der feststellbaren Komponente oder zum Vorsehen einer Kontrolle. Andere Reagenzien, die zur Hybridisierung, Prähybridisierung, DNA-Extraktion usw. verwendet werden, können auf Wunsch ebenfalls enthalten sein.
Die Verfahren und Materialien der Erfindung können auch allgemeiner verwendet werden, um Schweine-DNA auszuwerten, einzelne Schweine genetisch zu typisieren und genetische Unterschiede bei Schweinen festzustellen. Insbesondere kann ein Muster von Schweinegenom-DNA durch Referenzieren auf eine oder mehrere Kontrollen ausgewertet werden. Eine RFLP-Analyse wird in bezug auf das Schweineöstrogenrezeptorgen durchgeführt, und die Resultate werden mit einer Kontrolle verglichen. Die Kontrolle ist das Resultat einer RFLP-Analyse des Schweineöstrogenrezeptorgens eines anderen Schweins. Analog dazu kann ein Schwein durch Entnehmen einer Probe seiner genomischen DNA, Durchführen von RFLP-Analyse des Östrogenrezeptorgens in der DNA und Vergleichen der Resultate mit einer Kontrolle genetisch typisiert werden. Auch hier ist die Kontrolle das Resultat einer RFLP-Analyse des Schweineöstrogenrezeptorgens eines anderen Schweins. Letztlich können genetische Unterschiede zwischen Schweinen durch Entnehmen von Proben der genomischen DNA von zumindest zwei Schweinen, Feststellen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Polymorphismus im Östrogenrezeptorgen und Vergleichen der Resultate festgestellt werden.
Diese Analysen sind von Nutzen zum Feststellen genetischer Marker, die sich auf die Wurfgröße beziehen, wie oben besprochen wurde, zum Feststellen anderer Polymorphismen im Östrogenrezeptorgen, welche mit anderen Eigenschaften in Zusammenhang gebracht werden können, und für die allgemeine wissenschaftliche Analyse von Schweinegenotypen und -phänotypen.
Es versteht sich, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein bestimmtes Problem oder Milieu angesichts der in diesem Dokument enthaltenen Lehren im Bereich der Fähigkeiten eines einschlägig versierten Fachmannes liegt. Die Beispiele für Produkte und Prozesse der vorliegenden Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen hervor.

BEISPIEL 1

Genetischer Marker für erhöhte Wurfgröße bei Meishan-Schweinen

Materialien und Verfahren

Die Vorgangsweisen zum Feststellen der Restriktionsfragmentlängepolymorphismen (RFLPs) waren folgende: Zehn ml sterilen Blutes wurden jedem Schwein entnommen. Daraufhin erfolgte die Isolierung genomischer DNA aus weißen Blutkörperchen, gefolgt von der Aufschließung durch PvuII-Restriktionsendonuclease, Southern- Blotting und Hybridisierung mit der Östrogenrezeptorsonde, wie bei Flanagan et al., Immunogenetics 27 : 465-469 (1988), umrissen wird. Die Molekülgrößen der Restriktionsfragmente wurden durch Vergleich mit Molekülgrößenmarkern für mit Hind III abgetrennte Lambda-DNA-Restriktionsfragmente bestimmt, welche auf dem Hybridisierungsgelen parallel laufen gelassen wurden. Die Östrogenrezeptorsonde war eine 1,3kb-Sonde aus dem aus Menschen (Locus-ESR) isolierten Östrogenrezeptorgen, welche von The American Tissue Culture Collection NIH Repository of Human and Mouse DNA Probes (ATCC Nr. 57681) bezogen und mit 32P markiert wurde.

Ergebnisse

Unter Verwendung des Humanöstrogenrezeptorgens als Sonde haben wir die RFLP-Analyse auf chinesische, amerikanische und NIH-Zwerg-Schweine angewandt, um genetische Unterschiede für den homologen Östrogenrezeptorlocus im Schwein zu ermitteln. Unsere Ergebnisse zeigen auf, daß beim Schwein zumindest vier polymorphe Fragmente vorliegen. Diese Fragmente liegen bei 3,7, 4,3, 5,0 und 7, 7 kb.
Weiters untersuchten wir, ob die polymorphen Restriktionsfragmentmuster mit der Wurfgröße in unseren ursprünglichen 22 weiblichen Meishan-Schweinen in Beziehung standen. Siehe Tabelle 1. Unseren Resultaten zufolge scheint das Vorhandensein des 4,3kb- Fragmentes die Wurfgröße zu erhöhen, während das Nichtvorhandensein des 4,3kb- Fragmentes ein Nachteil zu sein scheint. Diese Daten lassen darauf schließen, daß wir einen Genmarker für die Wurfgröße bei Meishan-Schweinen gefunden haben.
Tabelle 1. Mittelwerte und Standardfehler der Wurfgröße bei weiblichen Meishan- Tieren nach Parität und Östrogenrezeptorfragment.

Claims

1. Verfahren zur Durchmusterung von Schweinen, um jene festzustellen, welche eher dazu neigen, größere Würfe zu produzieren, umfassend die folgenden Schritte:

Gewinnen einer Probe genomischer DNA eines Schweines; und

Feststellen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Polymorphismus im Östrogenrezeptorgen, welches mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Polymorphismus ein Restriktionsfragment-Polymorphismus (RFLP) ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Feststellens des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des RFLP die folgenden Schritte umfaßt:

Aufschließen der genomischen DNA mit einer Restriktionsendonuclease, welche das Schweineöstrogenrezeptorgen an zumindest einem Ort aufschneidet;

Trennen der aus dem Aufschließvorgang gewonnenen Fragmente;

Erfassen der Fragmente mit einer Sonde, die in der Lage ist, an die Fragmente zu hydridisieren und dadurch ein Restriktionsmuster zu erzeugen; und

Vergleichen des Musters mit einem zweiten RFLP-Muster für das Schweineöstrogenrezeptorgen, welches durch Verwenden der Restriktionsendonuclease und der Sonde oder einem Äquivalent davon gewonnen wurde, wobei das zweite RFLP-Muster mit erhöhter Wurfgröße assoziiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Restriktionsendonuclease Pvu II ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Trennung mittels Gelelektrophorese erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Sonde das menschliche Östrogenrezeptorgen oder ein wesentliches Äquivalent davon ist, wobei das Gen oder das wesentliche Äquivalent mit einem auffindbaren Bereich markiert sind.

7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des Vergleichens der Restriktionsmuster das größenmäßige Erfassen spezifischer Fragmente und das Vergleichen der Größen der Fragmente umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 3, welches weiters den Schritt des Verstärkens der Menge des Schweineöstrogenrezeptorgens vor dem Aufschließschritt umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Feststellens des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des RFLP die folgenden Schritte umfaßt:

Hinzufügen eines Restriktionsenzyms zur Probe, welches das Schweineöstrogenrezeptorgen in Fragmente spaltet; und

Erfassen der verschiedenen Größen der Fragmente.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Erfassens der verschiedenen Größen der Fragmente die folgenden Schritte umfaßt Trennen der Fragmente der Größe nach durch Verwendung von Gelelektrophorese in Gegenwart eines Kontroll-DNA-Fragmentes bekannter Größe;

Zusammenbringen der getrennten Fragmente mit einer Sonde, welche mit den Fragmenten hybridisiert, um Sonden-Fragment-Komplexe zu bilden; und

Bestimmen der Größe der getrennten Fragmente durch Feststellen des Vorhandenseins der Sonden-Fragment-Komplexe und Bestimmen ihrer relativen Positionen in bezug auf das Kontroll-DNA-Fragment

11. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Feststellens des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der RFLP die folgenden Schritte umfaßt:

Feststellen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines DNA-Fragmentes von bekannter Größe.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Schritt des Feststellens des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des DNA-Fragmentes von bekannter Größe die folgenden Schritte umfaßt:

Zusammenbringen der Probe mit einer Sonde, welche mit dem DNA-Fragment von bekannter Größe hybridisiert, um Sonden-Fragment-Komplexe zu bilden; und

Feststellen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Komplexe.

13. Verfahren zum Feststellen eines genetischen Markers für Ferkelwurfgröße, umfassend die folgenden Schritte:

Züchten männlicher und weiblicher Schweine derselben Rasse oder Rassenkreuzung oder aus gleichartigen genetischen Abstammungslinien;

Feststellen der Anzahl von Nachkommen, welche von jedem weiblichen Schwein geworfen werden;

Feststellen des Polymorphismus im Östrogenrezeptorgen jedes Schweins; und

Assoziieren der Anzahl von Nachkommen mit dem Polymorphismus.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Polymorphismus durch RFLP- Analyse festgestellt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt des Feststellens das Isolieren eines oder mehrerer Restriktionslängenfragmente umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das eine oder die mehreren Fragmente als ein Marker oder als Marker für erhöhte Ferkelwurfgröße identifiziert wird/werden.

17. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 16, wobei die Rasse aus der Gruppe, umfassend Meishan, Fengjing, Minzhu, Duroc, Hampshire, Landrace, Large White, Yorkshire und Chester White, ausgewählt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei der Rasse um Meishan handelt und der Polymorphismus durch RFLP-Analyse festgestellt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die RFLP-Analyse das Aufschließen genomischer DNA mit der Restriktionsendonuclease Pvu II umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die RFLP-Analyse ein 4, 3 Kilobase- Fragment erzeugt, das mit erhöhter Wurfgröße in Verbindung gebracht wird.

21. Genetischer Marker für erhöhte Wurfgröße bei Schweinen, umfassend das 4, 3 Kilobase-fragment, das durch Aufschließen von DNA gewonnen wurde, die das ESR- Gen umfaßt und aus den Schweinen mittels der Restriktionsendonuclease Pvu II isoliert wurde.