EP1242632A2 - Dna-matrizes und deren verwendung zur untersuchung von individuen einer population - Google Patents

Dna-matrizes und deren verwendung zur untersuchung von individuen einer population

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EP1242632A2
EP1242632A2 EP01901142A EP01901142A EP1242632A2 EP 1242632 A2 EP1242632 A2 EP 1242632A2 EP 01901142 A EP01901142 A EP 01901142A EP 01901142 A EP01901142 A EP 01901142A EP 1242632 A2 EP1242632 A2 EP 1242632A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
population
matrix
individuals
specific
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01901142A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gottfried Brem
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agrobiogen GmbH Biotechnologie
Original Assignee
Agrobiogen GmbH Biotechnologie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agrobiogen GmbH Biotechnologie filed Critical Agrobiogen GmbH Biotechnologie
Publication of EP1242632A2 publication Critical patent/EP1242632A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • DNA matrices and their use to study individuals in a population
  • the present invention relates to the production of genotype arrays of a population on DNA matrices.
  • the invention relates in particular to the use of such DNA matrices for the determination of features, specific genes, alleles, mutations, expression patterns etc. in the individuals of the population examined in each case.
  • a chip which can be divided into hundreds of thousands of raster segments, is equipped with a certain number of cDNA fragments, synthetic oligonucleotides or other probes that represent certain known mutations, and a DNA sample obtained from the individual to be examined is then prepared examined the chip.
  • Chips that are suitable for the detection of the same known mutations In order to be able to carry out this process at all from the point of view of costs, a large number of identical chips must be produced at the same time, i.e. Chips that are suitable for the detection of the same known mutations.
  • analysis for known mutations requires a series of individual analyzes to be carried out or the use of a specific chip with which these specific changes can be determined for each individual. This means that millions of analyzes or chips are required to examine a population for a certain property or mutation.
  • Another problem with current chip technology is that the genomic DNA samples from millions of untyped individuals must be kept in order to be able to carry out the analyzes at a later point in time or to be able to carry out additional or more extensive analyzes. This is costly and requires a large amount of storage space. Logistical problems also arise if, for example, individual individuals have to be selected from the entire sample quantity for re-typing. An object of the present invention is therefore to solve the above problems.
  • This object is achieved according to the invention by a method in which the genomic DNA of an individual of a population is transferred to at least one DNA matrix in a first step and this matrix is then used to demonstrate whether an individual from the population has a specific property or mutation , is examined with a probe that detects the property / mutation.
  • Fig. 1 shows schematically a matrix and the implementation of the method.
  • a prerequisite for the use of the invention is that DNA-containing samples of a certain population of individuals in a population, such as certain parts or all members of a population group, a social class or country, of animals, such as farm animals, for example cattle, pigs, etc. obtained and applied to the matrix or fixed there.
  • the term population therefore encompasses not only a population of individuals but also only mating communities.
  • the DNA-containing samples can be obtained in a conventional manner, for example by collecting blood, saliva, mucous membrane or skin samples, etc., and the samples can be preserved as soon as they are obtained.
  • Containers suitable for obtaining and preserving DNA-containing samples are described, for example, in DE 199 57 861.3.
  • the samples can be obtained in the same way or also using the sample collection system described in WO 99/61882.
  • the DNA is isolated and prepared from the samples obtained in accordance with conventional techniques (see, for example, Maniatis, 1992, Cold Spring Harbor, A Laboratory Manual) or using commercially available kits (such as, for example, Nucleo Spin Multi # 740629,24,123813 from Mackery-Nagel).
  • the DNA samples obtained are then processed in such a way that they can be fixed using pipetting robots (for example Packard's BioChipArrayer) to predetermined coordinates of the one or more matrices (see FIG. 1), ensuring that a specific coordinate is assigned to a specific individual on the DNA matrix.
  • pipetting robots for example Packard's BioChipArrayer
  • the materials known in the prior art such as glass, silicon, nylon, cellulose, etc., are suitable as the matrix, and there are no restrictions with regard to the size of the matrix.
  • the matrix can be larger than the known DNA chips, but can also be larger.
  • the size of the matrix to be used will essentially depend on the number of the population to be examined and the possibilities of the automated devices available.
  • the genomic DNA of the individual (corresponds in its entirety to the genotype of the individual) on the matrix can also be carried out in a duplicate or quadruplet in order to improve the evaluability or increase the accuracy, since a later statement based on an examination only then will be considered correct if both or all four order points of the same genotype lead to the same result.
  • these control analyzes can also be achieved by real repetitions, by examining two or more identical chips with one probe and comparing the results.
  • the matrix is divided into raster segments such that each individual DNA sample that is fixed on the matrix is assigned to a section and can thus be identified.
  • populations comprising millions of individuals can also be assembled on a few matrix units.
  • the population recorded in this way can then be examined for certain features, such as the presence of certain alleles, mutations, the predisposition to develop certain diseases or the resistance to diseases, etc.
  • the at least one chip i.e. examines the complete set of matrices bearing all of the genotypes of this particular population with a specific probe that allows a specific statement regarding the property.
  • a segment of a (mutated) gene can be used as a probe, which is known to cause a certain predisposition to a certain disease, such as MHS in pigs, BLAD in cattle, etc.
  • These sensors can be linked to conventional materials, such as radioactive isotopes, dyes or fluorescent substances, for visual detection if necessary.
  • the genotype template set can also be used to directly carry out a PCR, a TMA (Transcription Mediated Amplification), a bDNA reaction (branched DNA) or another method for specific DNA Carrying out and evaluating evidence.
  • a PCR Transcription Mediated Amplification
  • a bDNA reaction branched DNA
  • solid phase PCR for example, all individuals of a population can be examined for a property of interest in a single approach, which represents an enormous cost advantage, since millions of individuals are analyzed for a variant in a single PCR reaction, because of the effort for the PCR approach on the individuals of the whole population is then not significantly larger than for a PCR reaction for an individual.
  • the evaluation of the genotype matrices after hybridization or PCR reaction is generally carried out using an automated device, since this would be too high due to the error rate that would occur if the miniaturized, complex result patterns on the matrices were assigned manually to the individuals , The hybridization or PCR pattern is therefore recorded with a scanner and evaluated with an image analysis system.
  • the position on the matrix generally determines which individual is located there and the result of the hybridization or PCR reaction at this position is linked to the identity of the individual and is shown in an evaluation protocol or an evaluation file.
  • individual individuals who are also on the matrices can be determined in an extra, individual conventional singular PCR reaction or another detection method with separately stored DNA and then as positive and negative controls for the matrix approach can be used.
  • the results of the matrix analyzes which may be stored in files, can then be made available for authorized persons or facilities to query.
  • the DNA chips according to the invention can also be used to determine the tolerability or responsiveness of drugs.
  • Effective drugs sometimes behave like poisons in the body.
  • the recommended dose may be effective for some individuals, may have no positive effect on others, and may be toxic or even fatal to others.
  • Side effects from medications are known to be among the ten most common types of death in humans.
  • the goal of modern pharmacogenetics is therefore to adapt drug administration to the individual genotype. Genetic differences, such as certain SNPs that can influence these effects, must be identified and analyzed.
  • each approved or new drug can now be examined before it is launched on the market - as far as the corresponding genetic components are known and the genotype arrays are available - with what certainty it will work, which or how many Individuals cannot be cured and to what extent there are intolerances.
  • the population matrices can be stored easily and unproblematically for a long time, with little space requirement, that is to say almost unlimitedly inexpensively. This is a major advantage over conventional methods, in which the storage of millions of samples causes enormous logistical problems and relatively high costs. 2) These matrices can then be examined or analyzed in total with a single probe, for example by hybridization or with other techniques such as PCR, LCR, bDNA, TMA or the like for a specific feature, variant or mutation etc.
  • the melting temperature differences in hybridization with sequences that do not clearly correspond can be used excellently for the detection of base exchanges. Since only one probe is used per matrix, the hybridization conditions, such as the temperature, can be optimally selected for the respective probe. The person skilled in the art will choose the appropriate hybridization temperature based on his general knowledge, taking into account the length of the probe and its G / C content.
  • Post-typing with newly discovered markers, mutations, etc. can be carried out at any time and very cost-effectively in a single approach for the entire population recorded up to that point, without having to resort to the individual samples again.
  • An analysis of the chips / matrices created in stock makes this procedure completely unproblematic. For example, within a week after the discovery / publication and the decision to use a new marker, the entire population can be typed using the invention and the results made available to millions of individuals for interested / authorized users.
  • Example 1 illustrate the invention and are not intended to limit it in any way.
  • Example 1 illustrate the invention and are not intended to limit it in any way.
  • the EU labeling regulation stipulates that they must be labeled in the EU using double-ear tags. These ear tags must be retracted within the first week of life. If one uses this identification with ear tags to take a tissue sample from the animals, which is easily possible by means of the system described in WO 99/61882, a genotype collection of all cattle in the EU can be constructed simply and inexpensively. This means that after a certain time all 80 million EU cattle are collected on these genotype matrices, with the new calves being added to new matrices and assigned to the pool.
  • the template set of the farm animal species can now be examined with 50 different SNP markers (one set for each marker). This means that a genetic fingerprint can be recorded for all 80 million animals, which allows an individual animal to be uniquely identified from billions of genotypes or to ensure its identity and, if applicable, its parentage.
  • Analyzes with specific markers can be used to determine for all cattle in the EU which genetic constellation they have, for example, with various milk protein genes, or to find out which animals are carriers of positive QTLs, whether they have certain mutations (e.g. BLAD) make them appear suitable as models for human diseases, for example certain hemoglobin variants, whether they have specific genetic intolerances, how they will respond to treatment with medication, which medication is optimal for a particular disease for this genotype, which dosage is helpful, which animal dispositions or have resistance to or against certain pathogens or influences, etc.
  • certain mutations e.g. BLAD
  • ancestry, origin and identity assurance can be carried out for all animals easily, reliably and quickly and can be carried out.
  • meat samples could be taken from all imported carcasses, from which DNA is isolated and used to produce genotype matrices. This is also possible with frozen products.
  • the DNA of the suspect sample is compared with the genotypes preserved on the matrices, which makes it easy and inexpensive to determine whether the suspect sample is identical to a reserve sample from imported meat or not.
  • transgenic grain that is exported to Europe from overseas, it often happens that non-transgenic grain is mixed with a small amount of transgenic grain.
  • DNA samples could be collected from all residents and applied to genotype matrices. Such an agreement has already been reached in Iceland, so that samples can be collected, stored and anonymized analyzed by all residents. With the corresponding legal situation under the Data Protection Act, the basis can also be created in other countries for DNA samples from a human sub-population or population group to be collected on a voluntary basis and then for medical applications (for example to identify the right medication, the appropriate dosage, evidence of genetic incompatibilities or problems etc.) may be used. The present invention thus shows how these samples, if they are collected, can be stored and analyzed optimally and inexpensively.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Genotypen-Arrays einer Polulation auf DNA-Matrizen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung derartiger DNA-Matrizen zur Bestimmung von Merkmalen, bestimmten Genen, Allelen, Mutationen, Expressionsmuster usw. bei den Individuen der jeweils untersuchten Population.

Description

DNA-Matrizes und deren Verwendung zur Untersuchung von Individuen einer Population
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Genotypen-Arrays einer Population auf DNA-Matrizes. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung derartiger DNA- Matrizen zur Bestimmung von Merkmalen, bestimmten Genen, Allelen, Mutationen, Expressionsmuster usw. bei den Individuen der jeweils untersuchten Population.
Mit dem Aufschwung der Molekularbiologie und verwandter Techniken ist es möglich geworden, Individuen auf das Vorhandensein bestimmter Mutationen in ihrem Genom zu untersuchen. Dabei hat sich die sogenannte DNA-Chip Technologie durchgesetzt, mit deren Hilfe eine Vielzahl von Mutationen eines Individuums auf einmal untersucht werden können.
Dabei wird ein Chip, der in hunderttausende von Rastersegmenten aufgeteilt sein kann, mit einer bestimmten Anzahl an cDNA-Fragmenten, synthetischen Oligonukleotiden oder anderen Sonden bestückt, die bestimmte bekannte Mutationen repräsentieren, und eine von dem zu untersuchenden Individuum gewonnene DNA-Probe wird dann auf dem Chip untersucht.
Um dieses Verfahren vom Gesichtspunkt der Kosten her überhaupt durchfuhren zu können, müssen gleichzeitig eine Vielzahl baugleicher Chips hergestellt werden, d.h. Chips, die sich jeweils für den Nachweis der gleichen bekannten Mutationen eignen.
Dies beinhaltet jedoch den Nachteil, dass eine nach der Herstellung der Chips neu gefundene Mutation, auf die zusätzlich untersucht werden soll, d.h. das Aufnehmen eines neuen Gens in den Chip, die Produktion neuer Chips erforderlich macht, die diese Spezifität zusätzlich enthalten, und die Bestimmung dieses Merkmals erlauben. Die ggf. noch vorhandenen Chips ohne diese neue Spezifität sind damit nur begrenzt nutzbar geworden. Für die Tierzucht bedeuten dies, daß dann, wenn eine neue Variante/Marker hinzukommt, die nunmehr auch für alle Tiere interessant ist, beispielsweise ein neuer QTL (quantitative trait locus) entdeckt wurde oder ein zusätzlicher SNP (single nucleotide polymorphisms) plötzlich für die Zucht oder andere Zwecke interesssant geworden ist, alle vorher schon mit Hilfe eines Chips genotypisierten Tiere nachtypisiert werden müssen.
Grundsätzlich erfordert die Analyse auf bekannte Mutationen, wie beispielsweise auf die vorstehend aufgeführten SNPs, die Durchführung einer Reihe von Einzelanalysen oder die Verwendung eines spezifischen Chips, mit dem diese bestimmten Änderungen bestimmt werden können, für jedes einzelne Individuum. Dies beinhaltet, dass Millionen von Analysen oder Chips erforderlich sind, um eine Population auf eine bestimmte Eigenschaft bzw. Mutation zu untersuchen.
Wird die Untersuchung unter Zuhilfenahme von Sonden-Chips mittels der Hybdrisierungs- technik durchgeführt, dann besteht weiter das Problem, dass die verschiedenen Sonden bei unterschiedlichen Temperaturen mit dem entsprechenden Pendant auf der Matrix hybridisieren. D.h. eine Analyse unter Nutzung des Phänomens der Schmelztemperaturunterschiede von sich in einem oder mehreren Nukleotiden unterscheidenden Sequenzen im Vergleich zu den homologen Sequenzen ist mit der Chip- Technologie nicht so ohne weiteres möglich.
Ein weiteres Problem der gegenwärtigen Chip-Technologie besteht zudem darin, dass die genomischen DNA-Proben von Millionen nicht typisierter Individuen aufbewahrt werden müssen, um die Analysen zu einem späteren Zeitpunkt durchführen oder zusätzliche bzw. weitergehende Analysen vornehmen zu können. Dies ist kostenaufwendig und erfordert ein großes Lagerplatz-Angebot. Weiterhin treten dabei auch logistische Probleme auf, wenn beispielsweise einzelne Individuen aus der gesamten Probenmenge zum Nachtypisieren herausgesucht werden müssen. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die vorstehenden Probleme zu lösen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gelöst, bei dem in einem ersten Schritt die genomische DNA eines Individuums einer Population auf mindestens eine DNA- Matrix überführt wird und diese Matrix dann zum Nachweis, ob ein Individuum aus der Population eine bestimmte Eigenschaft bzw. Mutation aufweist, mit einer die Eigenschaft/Mutation erfassenden Sonde untersucht wird.
In den Figuren,
Fig. 1 zeigt schematisch eine Matrix und die Durchführung des Verfahrens.
Voraussetzung für die Nutzung der Erfindung ist, dass von einer bestimmten Grund- gesamtheit von Individuen einer Population, wie bestimmten Teilen oder allen Angehörigen einer Bevölkerungsgruppe, einer Gesellschaftsschicht oder Landes, von Tieren, wie Nutztieren, beispielsweise Rindern, Schweinen usw. DNA-haltige Proben gewonnen und auf die Matrix aufgebracht bzw. dort fixiert werden. Der Begriff Population umfaßt daher nicht nur eine Grundgesamtheit der Individuen sondern auch lediglich Paarungsgemeinschaften.
Die Gewinnung der DNA-haltigen Proben kann bei Menschen auf herkömmlichem Weg geschehen, beispielsweise durch Gewinnen von Blut-, Speichel-, Schleimhaut-, oder Haut- Proben, usw., wobei die Proben bereits bei der Gewinnung konserviert werden können. Zur Gewinnung und Konservierung von DNA-haltigen Proben geeignete Behälter sind beispielsweise in der DE 199 57 861.3 beschrieben. Bei Tieren können die Proben auf die gleiche Art und Weise gewonnen werden oder auch mittels des in der WO 99/61882 beschriebenen Probengewinnungssystems.
Aus den gewonnen Proben wird die DNA gemäß herkömmlichen Techniken isoliert und präpariert (siehe beispielsweise Maniatis, 1992, Cold Spring Harbor, A Laboratory Manual) bzw. mit im Handel erhältlichen Kits (wie beispielsweise Nucleo Spin Multi #740629,24,123813 von Mackery-Nagel). Die gewonnen DNA-Proben werden anschließend derart aufbereitet, dass sie mit Pipettier-Robotern (beispielsweise dem BioChipArrayer von Packard) auf vorbestimmten Koordinaten der einen oder mehreren Matrizen fixiert werden können, (siehe Fig. 1), wobei sichergestellt wird, daß eine bestimmte Koordinate auf der DNA-Matrix einem bestimmten Individuum zugeordnet wird.
Als Matrix eignen sich die im Stand der Technik bekannten Materialien, wie beispielsweise Glas, Silizium, Nylon, Zellulose usw., wobei hinsichtlich der Größe der Matrix keine Beschränkungen vorhanden sind. So kann die Matrix die Größer der bekannten DNA-Chips aufweisen, jedoch auch größer sein. Die Größe der einzusetzenden Matrix wird im wesentlichen von der Anzahl der untersuchenden Population sowie den Möglichkeiten der verfügbaren automatisierten Vorrichtungen abhängen.
Das Auftragen der genomischen DNA der Individuen (entspricht in ihrer Gesamtheit dem Genotyp des Individuums) auf die Matrix kann auch im Duplikat bzw. Quadruplet erfolgen, um die Auswertbarkeit zu verbessern bzw. die Genauigkeit zu erhöhen, da eine spätere Aussage aufgrund einer Untersuchung nur dann als richtig gewertet werden wird, wenn beide bzw. alle vier Auftragspunkte des gleichen Genotyps zum gleichen Ergebnis führen. Diese Kontroll- Analysen können jedoch auch durch echte Wiederholungen erreicht werden, indem zwei oder mehrere gleiche Chips mit einer Sonde untersucht und die Ergebnisse verglichen werden.
Die Matrix ist, wie in Fig. 1 dargestellt, derart in Rastersegmente eingeteilt, dass jede individuelle DNA-Probe, die auf der Matrix fixiert wird, einem Abschnitt zugeordnet ist und damit identifiziert werden kann. Damit entsteht eine Ansammlung an DNA-Proben (Genotypen- Array) mit einer sehr großen Anzahl an Genotypen auf einem einzigen Träger. Durch die Verwendung mehrerer Träger können auch Populationen, die Millionen von Individuen umfassen, auf einigen wenigen Matrix-Einheiten zusammengestellt werden.
Neu hinzukommende Individuen der Population werden auf zusätzlichen Einheiten der Matrix, ggf. in bestimmten Zeitabständen (beispielsweise monatlich oder jährlich) neu erfasst, so dass die Grundgesamtheit im wesentlichen immer vervollständigt bleibt. Diese Sammlung von Matrix-Einheiten (Genotypen-Arrays, Genom-Chips) repräsentiert daher die Genotypen einer gesamten Population. Von jeder Genotypen-Matrix wird eine Vielzahl von Kopien hergestellt, die dann für die Analysen verwendet werden.
Die derart erfaßte Population kann dann auf bestimmte Merkmale untersucht werden, wie beispielsweise das Vorhandensein bestimmter Allele, Mutationen, die Prädisposition bestimmte Erkrankungen zu entwickeln bzw. die Resistenz gegen Erkrankungen usw..
Zu diesem Zweck wird der mindestens eine Chip, d.h. das vollständige Set von Matrizen, das die Gesamtheit der Genotypen dieser bestimmten Population trägt, mit einer spezifischen Sonde untersucht, die hinsichtlich der Eigenschaft eine spezifische Aussage zulässt.
So kann als Sonde beispielsweise ein Segment eines (mutierten) Gens eingesetzt werden, das bekanntermaßen eine bestimmte Prädisposition für eine bestimmte Erkrankung bewirkt, wie beispielsweise MHS beim Schwein, BLAD beim Rind usw.
Zur ggf. visuellen Erfassung können diese Sonden mit herkömmlichen Materialien verknüpft sein, wie radioaktiven Isotopen, Färb- oder fluoreszierenden Stoffen.
Das Genotyp-Matrizen- Set kann jedoch neben einer Hybridisierung mit der Sonde auch dazu verwendet werden, direkt auf dem Träger eine PCR, eine TMA (Transcription Mediated Amplification), eine bDNA-Reaktion (branched DNA) oder ein anderes Verfahren für spezifische DNA-Nachweise durchzuführen und auszuwerten.
Mit beispielsweise der "Festphasen-PCR" können somit alle Individuen einer Population in einem einzigen Ansatz auf eine interessierende Eigenschaft untersucht werden, was einen enormen Kostenvorteil darstellt, da Millionen von Individuen in einer einzigen PCR- Reaktion hinsichtlich einer Variante analysiert werden, denn der Aufwand für den PCR- Ansatz an den Individuen der ganzen Population ist dann nicht wesentlich grösser als bei einer PCR-Reaktion für ein Individuum. Die Auswertung der Genotyp-Matrizen nach Hybridisierung oder PCR-Reaktion erfolgt im allgemeinen über eine automatisierte Vorrichtung, da dies aufgrund der Fehlerrate, die bei der manuellen Zuordnung der miniaturisierten, komplexen Ergebnis-Muster auf den Matrizen zu den Individuen auftreten würde, zu hoch wäre. Das Hybridisierungs- oder PCR-Muster wird deshalb mit einem Scanner erfasst und mit einem Bildanalysesystem ausgewertet.
Dazu sind Hard- und Software- Systeme geeignet, die für die Auswertung von konventionellen DNA-Chips entwickelt worden sind und dort bereits Verwendung finden. Durch die Position auf der Matrix ist generell festgelegt, welches Individuum sich dort befindet und das Ergebnis der Hybridisierung oder PCR-Reaktion an dieser Position wird mit der Identität des Individuums verknüpft und in einem Auswertungs-Protokoll oder einer Auswertungs- Datei dargestellt.
Zur weiteren Kontrolle und Absicherung der Auswertung können einzelne Individuen, die sich ebenfalls auf den Matrizen befinden, in einer extra angesetzten, individuellen konventionellen singulären PCR-Reaktion oder einem anderen Nachweisverfahren mit gesondert gelagerter DNA bestimmt werden und dann als Positiv- und Negativ-Kontrollen für den Matrizen- Ansatz verwendet werden.
Die ggf. in Dateien gespeicherten Ergebnisse der Matrix-Analysen können dann für berechtigte Personen oder Einrichtungen zur Abfrage zur Verfügung gestellt werden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Chips können zudem zur Bestimmung der Verträglichkeit bzw.- Ansprechbarkeit von Arzneimitteln verwendet werden.
Wirksame Arzneien verhalten sich im Körper manchmal auch wie Gifte. Die empfohlene Dosis kann bei bestimmten Individuen gut wirksam sein, bei anderen überhaupt keinen positiven Effekt haben und bei wiederum anderen toxisch oder gar tödlich sein. Beim Menschen zählen Nebenwirkungen von Medikamenten bekanntermaßen zu den zehn häufigsten Todesarten. Das Ziel moderner Pharmakogenetik ist es daher, Medikamentengaben auf den individuellen Genotyp abzustimmen. Genetische Feinunterschiede wie beispielsweise bestimmte SNPs, die diese Wirkungen beeinflussen können, müssen dazu aufgespürt und analysiert werden.
Für jedes zugelassene oder neu in den Markt einzuführende Medikament kann nun mit Hilfe der vorliegenden Erfindung somit bereits vor Markteinführung untersucht werden, - soweit die entsprechenden genetischen Komponenten bekannt sind und die Genotypen-Arrays vorliegen - mit welcher Sicherheit es wirken wird, welche bzw. wieviele Individuen nicht geheilt werden können und in welchem Umfang es zu Unverträglichkeiten kommt.
Im Spezialfall kann daher vor der Behandlung eines Individuums durch Abfrage der vorstehend beschriebenen EDV-Datei, in der die Ergebnisse der SNP-Analyse für das betreffende Medikament gespeichert sind, festgestellt werden, ob das vorgesehene Medikament geeignet ist, diesem Patienten zu helfen und welche Dosierungshöhe angebracht scheint oder ob ein anderes Medikament zu bevorzugen ist.
Diese Vorgehensweise ist insbesondere bei Nutztierpopulationen von großem Interesse, da bei Tieren bislang keine Möglichkeit vorhanden ist, derartige Untersuchungen durchzuführen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die pharmakogenetische Analyse kostengünstig durchgeführt werden, so daß sie auch bei Tieren interessant wird.
Die vorstehend beschriebene Vorgehensweise, die gegenüber den bekannten Systemen einen vollständigen Paradigmenwechsel darstellt, weist zusammengefaßt die folgende Vorteile auf:
1) Die Populations-Matrizen können leicht und unproblematisch mit geringem Platzbedarf lange Zeit, d.h. nahezu unbegrenzt kostengünstig gelagert werden. Dies ist gegenüber konventionellen Verfahren, bei denen die Lagerung von Millionen von Proben enorme logistische Probleme und relativ hohe Kosten verursacht, ein grösser Vorteil. 2) Diese Matrizen können dann in toto mit jeweils einer einzigen Sonde, beispielsweise durch Hybridisierung oder mit anderen Techniken, wie beispielsweise PCR, LCR, bDNA, TMA o.a. auf ein bestimmtes Merkmal, eine Variante oder Mutation etc. untersucht bzw. analysiert werden.
3) Dadurch sind nur relativ wenige Einzelanalysen erforderlich sind, die nahezu ausschließlich von der Anzahl der verschiedenen Einzeltypsisierungen abhängig ist und nicht von der Anzahl der Probanden. Damit können selbst Millionen von Individuen leicht typisiert werden.
4) Die Schmelztemperaturunterschiede bei der Hybridisierung mit nicht eindeutig korrespondierenden Sequenzen können hervorragend zur Detektion von Basenaustauschen genutzt werden. Da pro Matrix nur eine Sonde verwendet wird, können die Hybrisierungsbedingungen, wie beispielsweise die Temperatur für die jeweilige Sonde optimal gewählt werden. Der Fachmann, wird aufgrund seines allgemeinen Wissens unter Berücksichtigung der Länge der Sonde sowie deren G/C-Gehaltes die entsprechende Hybrisidisierungstemperatur wählen.
5) Nachtypisierungen mit neu entdeckten Markern, Mutationen usw. können jederzeit und sehr kostengünstig in einem einzigen Ansatz für die ganze bis dahin erfasste Population durchgeführt werden, ohne dass in erneuter Rückgriff auf die Einzelproben der Individuen erforderlich wird. Eine Analyse der auf Vorrat angelegten Chips/Matrizes erlaubt dieses Vorgehen völlig unproblematisch. Innerhalb beispielsweise einer Woche nach der Entdeckung/Publikation und der Entscheidung über die Verwendung eines neuen Markers kann bei Nutzung der Erfindung die gesamte Population typisiert sein und die Ergebnisse für Millionen von Einzelindividuen für Interessierte/Zugriffsberechtigte zugänglich gemacht werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht dazu gedacht sie in irgendeiner Form zu beschränken. Beispiel 1:
Herkunftssicherung und Marker-Genotypisierungen bei Nutztieren
Bei Nutztieren, wie beispielsweise Rindern, ist durch die EU-Kennzeichnungsverordnung vorgeschrieben, dass diese in der EU mittels Doppel-Ohrmarken gekennzeichnet werden müssen. Diese Ohrmarken müssen innerhalb der ersten Lebenswoche eingezogen werden. Nutzt man diese Kennzeichnung mit Ohrmarken dazu, von den Tieren eine Gewebeprobe zu entnehmen, was mittels des in der WO 99/61882 beschriebenen Systems einfach möglich ist, kann eine Genotypen-Sammlung aller Rinder der EU einfach und kostengünstig aufgebaut werden. Das bedeutet, dass nach einer gewissen Zeit alle 80 Millionen Rinder der EU auf diesen Genotypen-Matrizen gesammelt sind, wobei die neu hinzukommenden Kälber jeweils auf neuen Matrizes gesammelt und dem Pool zugeordnet werden.
Das Matrizen-Set der Nutztierspezies kann nun mit 50 verschiedenen SNP-Markern (jeweils ein Set für einen Marker) untersucht werden. Damit kann für alle 80 Millionen Tiere ein genetischer Fingerabdruck erfasst werden, der es erlaubt, ein einzelnes Tier eindeutig aus Milliarden von Genotypen herausfinden zu können bzw. dessen Identität und ggf. auch Abstammung zu sichern.
Gleiches gilt für Schweine, Schafe, Ziegen, Kameliden, Pferde, Kaninchen, Vögel etc.
Analysen mit spezifischen Markern können dazu benutzt werden, für alle Rinder der EU festzustellen, welche genetische Konstellation sie beispielsweise bei diversen Milchprotein- Genen haben, oder herauszufinden, welche Tiere Träger von positiven QTLs sind, ob sie bestimmte Mutationen haben (beispielsweise BLAD), die sie als Modelle für menschliche Erkrankungen geeignet erscheinen lassen, beispielsweise bestimmte Hämoglobinvarianten, ob sie spezifische genetische Unverträglichkeiten haben, wie sie auf Behandlung mit Medikamenten reagieren werden, welches Medikament bei einer bestimmten Erkrankung für diesen Genotyp optimal ist, welche Dosierung hilfreich ist, welche Tiere Dispositionen oder Resistenzen für bzw. gegen bestimmte Krankheitserreger oder -Einflüsse aufweisen usw.. Beim Schwein kann neben den vorstehend aufgezeigten Möglichkeiten beispielsweise für alle Tiere einer Rasse oder einer Population höchst einfach, schnell und kostengünstig eine Typisierung hinsichtlich des Genotyps für MHS, Estrogenrezeptor- Varianten, intramuskuläres Fett-Genorte, bestimmte Varianten, die für die Xenotransplantation Vorteile bringen usw. vorgenommen werden.
Darüber hinaus kann mit dem vorgeschlagenen System einfach, zuverlässig und schnell eine Abstammungs-, Herkunfts- und Identitätsssicherung für alle Tiere vorgenommen und fortgeschri eben werden.
Beispiel 2:
Aufdeckung von Verwechslungen in der Fleischvermarktung
Zunehmend mehr Lebensmittelkonzeme und Vermarkter von Fleisch und Fleischprodukten garantieren mittlerweile die angegebene Herkunft ihrer Produkte, dass es sich beispielsweise um im Inland geborene und aufgezogene Tiere, von diesen hergestellte Erzeugnisse handelt oder um Produkte aus bestimmten biologisch besonders wertvollen Produktionsbetrieben. Durch eine eindeutige und überprüfbare Herkunfts- und Identitätssicherung (siehe WO 99/61882) können solche Verwechslungen oder ggf. vorkommende betrügerische Vertauschungen aufgedeckt werden.
Im Rahmen der Schlachtung und vor allem bei und nach der Zerlegung und Vermarktung ist das Fleisch jedoch durch viele Hände gegangen, wobei häufig nicht mehr zu klären ist, wer für die Vertauschung verantwortlich ist. Dies kann dadurch gelöst werden, dass bei jedem Übergang von einem Marktteilnehmer zum nächsten Rückstellproben gezogen werden. Durch eine spätere Analyse kann dann bei Problemen geklärt werden, wann die Identität der Probe verloren gegangen ist.
Beispiel 3:
Import von Schlachtkörpern und Fleisch aus dem Ausland Wegen der BSE-Problematik wehren sich derzeit Länder dagegegen, dass nach der durch die Kommission in Brüssel verfügte Aufhebung des Importverbotes nunmehr wieder ausländisches Rindfleisch auf den heimischen Markt gelangen und dort unerkannt angeboten werden könnte, so daß die Sicherheit bzw. auch die Gesundheit der inländischen Verbraucher gefährdet sein könnte.
Trotz einer möglichen Kennzeichnung der Produkte, daß diese aus dem Ausland stammen, bestehen bei den Verbrauchern immer noch Bedenken und Verunsicherungen, da die Kennzeichnung vom ausländischen Fleisch entfernt und das Fleisch verbotenerweise als einheimisches Produkt vermarktet werden könnte.
Zur Aufdeckung solcher betrügerischer/verfälschender Etikettierung könnten von allen importierten Schlachtkörpern Fleischproben entnommen werden, aus denen DNA isoliert und zur Herstellung von Genotyp-Matrizen genutzt werden. Dies ist auch bei gefrorenen Produkten möglich.
Im Verdachtsfall wird DNA der Verdachtsprobe mit den auf den Matrizen konservierten Genotypen verglichen wodurch einfach und kostengünstig festgestellt werden kann, ob die Verdachtsprobe mit einer Rückstellprobe aus Import-Fleisch identisch ist oder nicht.
Beispiel 4:
Untersuchung auf Beimengung von transgenen Produkten
Bei transgenem Getreide, das aus Übersee nach Europa exportiert wird, kommt es häufig vor, dass nicht-transgenes Getreide mit einer geringen Menge transgenem Getreide vermischt ist.
Zur Untersuchung solcher Fälle werden von allen angelandeten Getreidechargen ca. zehntausend Körner entnommen und einzeln oder gepoolt nach DNA- Aufbereitung auf einer Matrix konserviert. Im Verdachtsfall können nun Getreideproben, die während der weiteren Vermarktung und Verarbeitung des Getreides genommen werden, durch Vergleich mit den Genotypen auf den Matrizen eindeutig bestimmten Lieferungen und konkreten transgenen Veränderungen zugeordnet werden.
Ähnliche Untersuchungen können auch bei transgenen Tieren oder deren Produkten gewünscht werden.
Beispiel 5:
DNA-Sammlungen
Mittlerweile sind in einer Reihe von Ländern die gesetzlichen Grundlagen geschaffen, um DNA-Proben von bestimmten Personenkreisen asservieren zu dürfen. Diese DNA-Proben könnten auf Genotyp-Matrizen aufgebracht und dann für Untersuchungen im Verdachtsfall, also bei einschlägigen Rechtsverletzungen, herangezogen werden. Beispiel 6:
Datensammlungen bestimmter Individuen einer Population
In bestimmten Regionen oder Ländern könnten von allen Bewohnern mit deren Einverständnis DNA-Proben gesammelt, und auf Genotyp-Matrizen aufgebracht werden. In Island ist bereit ein derartiges Einverständnis erzielt worden, so dass dort von allen Bewohnern Proben gesammelt, eingelagert und anonymisiert analysiert werden können. Bei entsprechender Rechtslage nach Datenschutzgesetz können auch in anderen Ländern die Grundlagen dafür geschaffen werden, dass DNA- Proben einer menschlichen Sub-Population oder Bevölkerungsgruppe auf freiwilliger Basis zusammengetragen werden dürfen und dann für medizinische Anwendungen (beispielsweise zur Identifikation des richtigen Medikamentes, der geeigneten Dosierung, dem Nachweis von genetischen Unverträglichkeiten oder Problemen etc.) verwendet werden dürfen. Die vorliegende Erfindung zeigt somit auf, wie diese Proben, wenn sie denn gesammelt werden, optimal und kostengünstigt gelagert und analysiert werden können.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung von Individuen einer Population unter Verwendung von DNA-Matrizen, wobei die genomische DNA im wesentlichen aller Individuen einer Population auf mindestens einer Matrix fixiert wird, derart, daß jedem Individuum ein bestimmtes identifizierbares Segment auf der Matrix zugeordnet wird, und die Matrix mit einer Sonde von Interesse untersucht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Proben im Duplikat bzw. Quadruplet auf der DNA-Matrix aufgetragen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Untersuchung mit einer Sonde mittels Hybridisierung, PCR, TMA oder einer bDNA-Reaktion erfolgt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA-Matrix vor Verwendung gelagert wurde.
5. DNA-Matrix, welche einen Träger aufweist, an dem DNA gebunden werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß sie genomische DNA von Individuen einer bestimmten Population in vorbestimmten, identifizierbaren Segmenten enthält.
6. DNA-Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Population Nutztiere sind.
7. Verwendung einer DNA-Matrix nach einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Untersuchung eines Individuums auf eine bestimmte Eigenschaft.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Eigenschaft eine Prädisposition für bzw. eine Resistenz gegen eine bestimmte Erkrankung oder die Verträglichkeit bzw. Ansprechbarkeit auf ein bestimmtes Arzneimittel ist.
9. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Eigenschaft auf einer Mutation in einem Gen oder dem Vorhandensein eines bestimmten Allels beruht.
10. Verwendung einer DNA-Matrix nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Herkunftssicherung und Marker-Genotypisierungen bei Nutztieren, Aufdeckung von Verwechslungen in der Fleischvermarktung, Untersuchung von Produkten auf die Beimengung von transgenen Ausgangsstoffen, zur Sammlung von DNA-Daten bestimmter Populatinsindividuen und zur Populationsdatensammlungen.
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