DE69722954T2 - Pit-1 genpolymorphismus und eigenschaftsauswahl in tieren - Google Patents

Description

• HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft einen genetischen Marker, der mit verschiedenen Gestaltsmerkmalen assoziiert ist. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren, worin ein Polymorphismus in einem Pit-1-Gen verwendet wird, um Merkmale von Tieren wie die Milchproduktion und einen muskulösen Körperbau einfach zu bestimmen.
• Beschreibung des Standes der Technik
• Zur Zeit ist die Selektion eines bestimmten Merkmals in einem Säuger sehr kostspielig und sehr langsam. Üblicherweise schließt das Selektionsverfahren eine genealogische Evaluierung der Säugervorgeschichte über einen langen Zeitraum ein. Diese Evaluierung beruht auf verschiedenen Merkmalen des Säugers oder Tieres wie Geburtsgewicht, Wachstumsgewicht, Körperbau, Muskelstärke, Festigkeit, Marmorierung, Farbe und ähnliches.
• Bis heute umfasst der größte Teil der Selektion eines bestimmten Merkmals in einem Tier das visuelle Charakterisieren der spezifischen Merkmale über einen gewissen Zeitraum oder das Wiegen des Tiers zu bestimmten Zeiten. Die Tiere mit den zu selektierenden Qualitätsmerkmalen werden anschließend mit ähnlichen Tieren gezüchtet, so dass das bestimmte Merkmal hoffentlich in der nächsten Generation oder den folgenden Generationen dominant ist.
• Die derzeitigen Verfahren zur Merkmalsselektion in Säugern sind oft langwierig und unterliegen der Beurteilung eines Experten in dem Gebiet, wie einem Züchter. Jedoch gibt es nie eine wirkliche Gewissheit, dass die getroffene Wahl in den folgenden Generationen dominieren wird. So erfordert z. B. die Selektion einer Kuh, die ein gutes milchproduzierendes Tier ist, zwischen 36 und 48 Monaten für diese Wahl und nachdem die Wahl getroffen worden ist, beruht sie oft auf einer Hypothese und der Beurteilung des Züchters.
• In Hinblick auf die Ungewissheit, die Kosten und die Zeit, die mit den gegenwärtigen Verfahren zur Merkmalsselektion in Tieren einher gehen, werden zur Zeit neue Methoden entwickelt, wobei die Methoden ein wissenschaftlicheres Verfahren einsetzen, das hoffentlich das Selektionsverfahren verbessert.
• Eine solche Methode ist die Untersuchung von Kandidaten-Genen, um zu bestimmen, ob bestimmte Gene mit Gestaltsmerkmalen in Säugern assoziiert sind und ob folglich diese Gene als molekulare Marker verwendet werden können, um bestimmte interessante Merkmale selektieren zu können. Diese Methode erfordert zunächst die Identifizierung von Kandidaten-Genen oder anonymen genetischen Markern, die mit den interessanten Merkmalen assoziiert sind. Der Kandidaten-Gen-Ansatr kann ertolgreich sein, jedoch müssen zunächst Gene in den betreffenden Spezies identifiziert werden und mit den Merkmalen von Interesse korreliert werden.
• Das Somatotropin-System hat mehrere Gene, die in der Kontrolle von bestimmten Merkmalen in Tieren eine Rolle spielen können, da dieses System mit dem Wachstum, der Laktation, der Reproduktion und der Immunität assoziiert ist. Das Somatotropin-System ist recht kompliziert und ist auf einem Hypothalamus-Niveau mit Somatocrinin und Somatostatin verbunden; auf einem Hypophyse-Niveau mit dem Hypophyse-spezifischem Transkriptionsfaktor (Pit-1) verbunden, der für die Expression von Wachstumshormonen in Säugern verantwortlich ist; auf einem Leber-Niveau mit Wachstumshormonrezeptor und Wachstumshormon-Plasma-Transportprotein verbunden, und auf einem zellulären Niveau mit Wachstumshormonrezeptor, Insulin-Wachstumsfaktor-1 und Insulin-Wachstumsfaktortransportprotein verbunden.
• Die Selektion von Genen dieses Somatotropin-Systems, die bestimmte Merkmale in Tieren beeinflussen können, ist recht kompliziert, da dieses System viele verschiedene Funktionen in unterschiedlichen Teilen des Tieres aufweist, vom Hypophyse-Niveau bis zum zellulären Niveau.
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Selektion eines Gens, den hypophysespezifischen Transkriptionsfaktor (in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen als Pit-1 bezeichnet), der als ein genetischer Marker fungieren kann, um bestimmte Merkmale in Tieren zu kennzeichnen.
• Pit-1 ist ein Mitglied der POU-Familie von Homeo-Domänen Transkriptionsfaktoren und spielt eine wichtige Rolle in Entwicklungsprozessen. Die POU-Domäne wurde ursprünglich als eine hochkonservierte Region von 150 bis 160 Aminosäuren identifiziert, die in drei Säugertranskriptionsfaktoren, Pit-1, Oct-1, Oct-2 und auch in dem Produkt des Nematoden-Gens Unc-86, gefunden wurde (Herr et al., Genes & Dev., 2: 1513 (1988); Ruvun und Finnery, Cell 64: 475 (1991)).
• Pit-1 ist ein hypophysen-spezifischer Transkriptionsfaktor, der Wachstumshormone reguliert, Prolactin aktiviert und in der Hypophysenzell-Differenzierung und Proliferation eine Rolle spielt (Steinfelder et al., P.N.A.S., USA 88: 3130 (1991)). Mutationen in dem Pit-1 Gen waren für die Zwerg-Phenotypen der Maus von Snell und Jackson verantwortlich und führten zu einer Hypophysenvorderlappen-Hypoplasie (Li et al., Nature 347: 528 (1992)). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung der Pit-1 Synthese zu einer Verminderung der Prolactin- und Wachstumshormon-Expression (GH) und zu einer dramatischen Verminderung der Zellproliferation in GHund Prolactin-produzierenden Zelllinien führte (McCormick et al., Nature 345: 829 (1990)).
• Auch in Menschen wurde über verschiedene Mutationen in dem Pit-1 Gen in Patienten mit familiärer Hypophysenhypoplasie berichtet (Pfaffle et al., Science 257: 1118 (1992)); und in Patienten mit sporadischer kombinierter Hypophysenhormonschwäche (Radovick et al., Science 257: 1115 (1992); Tatsumi et al., Nature Genetics 1: 56 (1992)).
• Die cDNS-Sequenz von Rinder-Pit-1 wurde durch Bodner M. et al., Cell 55(3): 505568 (1988) veröffentlicht und ist in 2 dargestellt.
• Die Verbindung von Pit-1 Polymorphismen mit Wachstums- und Skelettmerkmalen in Schweinen ist von Yu et al., J. Anim. Sci. 73: 1282 (1995) beschrieben worden. Yu et al., supra, beschrieben drei Pit-1 Polymorphismen in Schweinen beruhend auf zwei "Restriction Fragment Length Polymorphisms" (in der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen als RFLP bezeichnet), wobei eine Pit-1-POU-Domänen-cDNS-Sonde und die Restriktionsenzyme BamHI und MspI und ein PCR/RFLP unter Verwendung von RsaI eingesetzt wurden.
• Die Ergebnisse der Mixed-Model-Analyse von Yu et al., supra, zeigten, dass Schweine mit dem MspI CC-Genotyp mit einer schwereren Geburtsrate als die DD-Genotyp-Schweine in Zusammenhang standen. Desweiteren war ein schwereres Geburtsgewicht mit den Pit-1 BamHI Polymorphismen deutlich mit dem BB-Genotyp assoziiert, auch wenn die Autoren davor warnten, solch eine Verbindung zu folgern, da die BB-Genotyppopulation extrem klein war.
• Auch wenn Woolard et al., J. Anim. Sci. 72: 3267 1994) einen Hinfi-Polymorphismus in dem Rinder-Pit-1-Genlocus erkannten, unterließen es diese Autoren, diese Mutation mit dem Selektionsmerkmal in Tieren in Verbindung zu bringen. Die in Woolard, supra, gezogene Schlussfolgerung bestand darin, dass die festgestellten polymorphen Fragmente mit der autosomalen Mendel-Vererbung konsistent waren.
• Yu et al., oder Woolard et al. enthalten weder eine Offenbarung einer Verbindung des Allel-Musters AB mit der Milchproduktion noch eine Offenbarung einer Verbindung des Allel-Musters BB mit einem muskulösem Körperbau bei Tieren.
• Folglich überwindet die vorliegende Erfindung die Nachteile der gegenwärtigen Methoden zur Merkmalsselektion bei Tieren durch Bereitstellen einer wissenschaftlichen Grundlage für die Selektion von Merkmalen durch Verwendung eines genetischen Markers.
• Desweiteren kann das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren verwendet werden, um überlegene Milch-produzierende Tiere von Tieren mit Fleischproduktionsvermögen zu unterscheiden.
• Es wurde überraschend gefunden, dass ein Polymorphismus in dem Pit-1 Gen zur Charakterisierung von Merkmalen wie Milchproduktion und muskulösem Körperbau bei Tieren eingesetzt werden kann. Es wurden zwei Allele, A und B, für das Pit-1 Gen erkannt, welches für die Aktivierung von Prolactin und Wachstumshormongenexpression verantwortlich ist. Das AA-Muster war weniger häufig als das AB- oder BB-Muster. Die deutliche Überlegenheit des Pit-1 AB-Musters oder AA-Musters gegenüber dem BB-Muster wurde für Milch, Protein und Knochigkeit festgestellt. Ebenso war das BB-Genotypmuster mit einem muskulösen Körperbau des Tiers verbunden.
• Diese Entdeckung ermöglicht die Verwendung der Mutation in dem Pit-1 Gen als ein genetischer Marker zur Identifizierung von gewissen Merkmalen in Tieren. Wenn diese bestimmten Merkmale einmal identifiziert worden sind, können die Tiere auf dem Markt aufgrund ihrer besseren Merkmale zu einem erhöhten Wert verkauft werden.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist demnach die Bereitstellung eines genetischen Markers zur Merkmalsselektion in Tieren.
• Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kennzeichnung von Tieren bereit, die bessere Milchproduktionsmerkmale oder Muskelaufbaumerkmale aufweisen.
• Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung gentechnisch veränderte Tiere bereit, die überlegene Milchproduktion-, Knochigkeit-, Fett-, Protein- oder Muskelaufbaumerkmale aufweisen. Diese und weitere Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung gelöst, wie durch die Zusammenfassung der Erfindung, die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und die Ansprüche belegt.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung stellt folglich einen genetischen Marker bereit, der zur Merkmalsselektion in Säugern verwendet werden kann.
• Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von einem Polymorphismus, der in dem Pit-1 Gen vorliegt, bereit, wobei der Polymorphismus verwendet werden kann, um bessere Merkmale in Tieren im Hinblick auf Knochigkeit, Fett, muskulösen Körperbau, Protein oder Milchproduktion auszuwählen.
• Folglich betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem der Stoffaspekte einen genetischen Marker, der verwendet wird, um bei Tieren im Hinblick auf ein Merkmal für das Milchproduktionsvermögen oder das Fleischproduktionsvermögen zu unterscheiden, wobei der genetische Marker eine Mutation in einem Fragment des Pit-1 Gens umfasst, bei welchem drei Allel-Muster festgestellt werden, wobei das vollständig mutierte Muster einen Hinweis darstellt.
• In der vorliegenden Anmeldung wird die Marker-Charakteristik für das Milchproduktionsvermögen als AA für dessen homozygoten Zustand des Allels bezeichnet und die Marker-Charakteristik für das Fleischproduktionsvermögen als BB für dessen homozygoten Zustand bezeichnet.
• Die Sequenzen der Allele A und B unterscheiden sich nur in dem Übergang des Adenosins in Position 1178 der Sequenz in 2 von Pit-1 AA in ein Guanin in Pit-1 BB, wie die Erfinder mittels der in Beispiel B dargestellten Versuche zeigen konnten.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich die drei Allel-Muster nach Verdau mit einer Restriktionsendonuklease, welche das mutierte Pit-1 Gen-Fragment und nicht das nichtmutierte Pit-1 Gen-Fragment spaltet, wobei das vollständig verdaute Muster einen Hinweis auf einen muskulösen Körperbau des Tiers darstellt, während das intermediäre verdaute/nichtverdaute Muster und das vollständig nichtverdaute Muster einen Hinweis auf ein Milchproduktionsmerkmal des Tiers darstellen.
• In einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der eingesetzten Restriktionsendonuklease um HinfI.
• Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die drei Allel-Muster unterschieden, indem Sonden eingesetzt werden, die mit der mutierten Region in dem Pit-1 Gen überlappen, wobei eine Sonde für das mutierte Pit-1 Gen spezifisch ist und eine andere für das nichtmutierte Pit-1 Gen spezifisch ist.
• Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Feststellen gewisser Merkmale in einem Tier, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
• (1) Isolieren von genomischer DNS aus einem Tier;
• (2) gegebenenfalls Isolieren eines Fragments aus der genomischen DNS, welches ein Fragment eines Pit-1 Gens umfasst;
• (3) Feststellen einer Mutation in dem Pit-1 Gen; und
• (4) Analysieren der Mutation, um ein Merkmal bei dem Tier zu bestimmen, wobei bei der Analyse die Merkmale im Hinblick auf einen muskulösen Körperbau und Fett von den Merkmalen im Hinblick auf die Milchproduktion bei den Tieren unterschieden werden.
• In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Feststellen durch Verwendung von Restriktionsendonukleasen durchgeführt.
• In einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Feststellen durchgeführt, indem Sonden eingesetzt werden, die mit dem mutierten Gen in dem Pit-1 Gen überlappen, insbesondere der Position 1178.
• Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung gentechnisch veränderte Tiere, die die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen charakteristischen Merkmale aufweisen.
• KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• 1 ist ein Elektrophoresegel, das die PCR/"Restriction Fragment Length Polymorphism"-Muster darstellt, unter Verwendung der Restriktionsenzyme HinfI auf dem Pit-1 Gen, festgestellt in Holstein-Friesischen- und Simmental-Bullen. Die Größen der verdauten Fragmente sind auf der linken Seite angegeben, und die Muster sind oben. Die Länge der Fragmente (in Kilobasen) wurden bezogen auf die DNS-Größenmarker φX174 DNS/HaeIII-Fragmente abgeschätzt.
• 2 stellt die Sequenz von Rinder-Pit-1-cDNS dar.
• 3 ist ein elektrophoretisches Muster, welches die PCR-Amplifizierungsprodukte darstellt, die nach Amplifizierung mit den folgenden Primer erhalten wurden:
  Linien 1-3-5: Pit-1 AA und Pit-1 B,
  Linien 2-4-6: Pit-1 BB und Pit-1 B.
• AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
• Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, umfasst "Tier" alle Säuger, Vögel und Fische einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kühe, Bullen, Ziegen, Schweine, Schafe, Hühner und ähnliches. Im Hinblick auf den hohen Konservierungsgrad des Pit-1 Gens zwischen verschiedenen Arten (> 95%) ist die Erfindung leicht von einer Art auf eine andere übertragbar. Die vorliegende Erfindung kann auch in Menschen verwendet werden, um Merkmale wie die Fähigkeit zur Metabolisierung von Wachstumshormonen festrustellen.
• Die Bezeichnung "Polymorphismus" bezieht sich auf das simultane Auftreten von Genomen in der Population, die allelische Variationen aufweisen, wie entweder in Allenen festgestellt, die unterschiedliche Phenotypen erzeugen oder in Änderungen der DNS festgestellt, die das Restriktionsmuster verändern.
• Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, umfasst die Bezeichnung "Merkmal" jede Charakteristik, insbesondere eine, die ein Tier von einem anderen unterscheidet.
• Die Bezeichnung "Knochigkeit" (angularity), wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen eingesetzt wird, steht für ein objektives Kriterium, das eingesetzt wird, um bestimmte Merkmale eines Tiers in Bezug auf bestimmte Messungen, die am Körper des Tiers vorgenommen werden können, zu identifizieren. Die Messungen werden am Tier im Hinblick auf gewisse morphologische Charakteristiken vorgenommen.
• Um beispielsweise die Knochigkeit für ein Milchproduktionsmerkmal zu bestimmen, werden die Beckenknochen und die Muskeln, die die Beckenknochen umgeben, eines Tieres gemessen, um zu bestimmen, ob sie hervorstehen oder nicht. Daraufhin kann eine Skala aufgestellt werden. Wenn die Knochen sehr hervorstehend sind, so gibt es wenig runde Muskeln und folglich sind die Tiere milchproduzierend. Im Gegensatr dazu wird ein Tier, wenn die Knochen nicht hervorstehend sind und das Tier viele runde Muskeln aufweist, nicht als ein guter Milchproduzent sondern eher als ein Fleischproduzent betrachtet.
• Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen angegeben; umfasst die Bezeichnung "muskulöser Körperbau" Tiere, die bessere Fleischproduzenten, die wegen ihres Fleisches geschlachtet werden können, als Milchproduzenten sind.
• Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Pit-1 Genpo-Iymorphismus als ein potenzieller Marker für genetische Variationen in Tieren. Pit-1 codiert für einen Transkriptionsfaktor in einer Zelle und jede Mutation dieses Gens kann die Transkriptionsfähigkeit durch Verminderung oder Verstärkung verändern, was zu Polymorphismen führt, die das Ergebnis unterschiedlicher Merkmale in einem Tier hervorrufen.
• Das Pit-1 Gen wurde zuvor in einer 13-kb Rinder-genomischen Bibliothek durch Woolard et al., supra, identifiziert. Ein 13-kb Klon wurde aus dieser Bibliothek isoliert, indem eine markierte Rinder-Pit-1-cDNS als eine Sonde eingesetzt wurde für:
• 
• Die Charakterisierung von XhoI, HinfI und EcoRI Subklonen dieses 13-kb-Inserts durch Restriktionsenzymverdau und Sequenzieren identifizierte diesen Klon als ein Rinder-Pit-1-genomisches Fragment.
• Es können ähnliche Methoden wie die von Woofard et al., supra, gelehrten verwendet werden, um das Pit-1 Gen in anderen genomischen Bibliotheken als der Rinderbibliothek zu identifizieren. Dies wird die Identifizierung von spezifischen Sequenzen innerhalb des Pit-1 genomischen Fragments ermöglichen, die verwendet werden können, um diese Sequenz aus anderen Tieren als die im folgenden beschriebenen zu amplifizieren.
• Der erste Schritt bei der Identifizierung einer Mutation in dem Pit-1 Gen in einem Tier besteht darin, eine Probe des Tiers zu entnehmen wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Samen, Blut, Zellen, Biopsiegewebe, Fäkalien und ähnliches. Die genomische DNS kann aus den erhaltenen Proben extrahiert werden, indem im Stand der Technik bekannte Methoden verwendet werden, wie in Sambrook et al., Molecule Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe 1989, beschrieben.
• Es ist jedoch bevorzugt, die genomische DNS zu extrahieren, indem das von Walsh, Biotechniques, 10: 506 (1991) beschriebene Verfahren für Samen oder das von Lewin und Stewart-Haynes Biotechniques, 13: 522 beschriebene Verfahren für Blut angewendet werden.
• Nach Extraktion der genomischen DNS gibt es einige im Stand der Technik bekannte Methoden, um die Mutation in dem Pit-1 Gen festzustellen. Jede Detektionsmethode kann zur Feststellung der Mutation verwendet werden. Beispiele für diese Methoden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, RFLP, SSCP, DGGE, CFLP und Einzelbasenmutationen, wie von Prosser, Trends Biotech 11: 238–246 (1993) und Sambrook et al., supra, beschrieben. Diese Methoden werden im folgenden noch ausführlicher beschrieben.
• In der RFLP-Methode ("Restriction Fragment Length Polymorphism") beispielsweise werden PCR-Primer verwendet, um mittels Standardverfahren ein Fragment zu amplifizieren, das das Pit-1 Gen enthält. Es kann jeder PCR-Primer verwendet werden, der die Amplifizierung der Pit-1 Sequenz ermöglicht und die Isolierungsmethode des bestimmten Klons, welcher solche Primer identifizieren würde.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die PCR-Primer aus Intron V und Exon 6 eines Fragments entwickelt werden, das den Polymorphismus des Pit-1 Gens enthält, wie das 451-bp-Fragment, das durch Woolard et al., supra, beschrieben worden ist. Gemäß einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die PCR-Primer wie folgt:
• 
• Die Amplifizierung des Pit-1 Fragments kann nach Standard-PCR-Verfahren durchgeführt werden, wie von Sambrook et al., supra, beschrieben. Es ist jedoch bevorzugt, die genomische DNS in 50 μl Reaktionsvolumen, die 2 mM MgCl₂ enthalten, zu amplifizieren.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die folgenden Bedingungen für die PCR-Reaktion verwendet werden: Zwischen 88 bis 98°C für 10 bis 15 Minuten; und zwischen 90°C bis 100°C für etwa 1 Minute, gefolgt von zwischen 25 bis 50 Cyclen bei zwischen 90°C bis 100°C für 20 bis 40 Sekunden; 40°C bis 60°C für 1 bis 5 Minuten, und 68°C bis 80°C für etwa 1 bis 5 Minuten. Der letzte Schritt kann einen Cyclus bei zwischen 68°C und 80°C für 8 bis 12 Minuten umfassen.
• Nach der Amplifizierung wird die spezielle Mutation in Pit-1 ausgeschnitten, indem verschiedene im Stand der Technik bekannte Restriktionsenzyme oder Endonukleasen eingesetzt werden. Diese Restriktionsenzyme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, BamHI, EcoRI, SmaI, HinfI und ähnliches. Man betrachte beispielsweise die in Sambrook et al., supra, beschriebenen Enzyme. Es ist von besonderem Interesse, eine Restriktionsendonuklease zu verwenden, die das mutierte Allel des Pit-1 Gens spaltet und das nicht-mutierte Allel des Pit-1 Gens nicht spaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird im Hinblick auf die Identifizierung hinsichtlich der Milchproduktions-, Fett-, Proteinmerkmale und muskulösem Körperbau-Merkmal in Tieren Hinfleingesetzt.
• Nach dem Verdau wird die Probe anschließend elektrophoretisch auf Agarose-Gel aufgetrennt und mit einer Färbung wie z. B. Ethidiumbromid identifiziert, es kann jedoch jede Färbung angewendet werden, die die Fragmente identifiziert.
• Bei SCCP (Einzelstrangkonformationspolymorphismus, single stranded conformation polymorphism) handelt es sich ebenfalls um eine im Stand der Technik bekannte Methode, die eine Mutation oder Mutationen in dem isolierten genomischen Pit-1 Fragment identifizieren kann. Diese Methode beruht auf der PCR-Amplifizierung, wobei ähnliche Primer wie vorstehend beschrieben eingesetzt werden. Das amplifizierte Fragment wird anschließend mit einer Markierung wie ³²P oder mit jeder anderen geeigneten radioaktiven Markierung markiert. Das radioaktiv markierte Fragment wird anschließend denaturiert, z. B. durch Erhitzen und anschließendem raschen Abkühlen. Nach dem Kühlen wird das Fragment elektrophoretisch aufgetrennt, wobei eine nicht denaturierende Technik verwendet wird, und anschließend audioradiografiert.
• Die DGGE (denaturierende Gradientengelelektrophorese, denaturing gradient gel electrophoresis) ist noch eine weitere Methode, um die Pit-1 Mutation festrustellen. In diesem Verfahren wird das Fragment durch PCR amplifiziert, wobei geeignete Primer eingesetzt werden, wie die vorstehend beschriebenen, und einem denaturierenden Gradienten unterworfen werden. Die Probe wird weiter elektrophoretisch aufgetrennt und die Mutation wird detektiert.
• Noch eine weitere Methode, die zur Feststellung der Mutation eingesetzt werden kann, ist CFLP ("Cleavage Fragment Length Polymorphism"). Diese Methode kann Mutationen einer einzigen Base in der DNS-Sequenz zwischen zwei Molekülen der Wildtyp-DNS und eines Mutantentyps der DNS feststellen. Diese Methode wird jetzt durch Boehringer Mannheim vermarktet und kann in Form eines Kits bezogen werden.
• Eine weitere Methode, die zur Feststellung der Mutation in dem Pit-1 Gen angewendet werden kann, verwendet Primer, die mit der mutierten Region des Pit-1 Gens überlappen.
• Bevorzugter werden zwei getrennte Amplifizierungsreaktionen mit der extrahierten genomischen DNS-Probe durchgeführt, wobei zwei Sets von Primern eingesetzt werden, worin ein Set einen Primer enthält, der überlappt und der für das mutierte Pit-1 Gen spezifisch ist, und wobei das andere Set einen Primer enthält, der überlappt und der für das nichtmutierte Pit-1 Gen spezifisch ist. Noch bevorzugter sind die verwendeten Primer markiert, so dass das Amplifizierungsprodukt einfach sichtbar gemacht werden kann. Wenn die untersuchte genomische DNS ein homozygotes mutiertes Pit-1 Gen (zwei mutierte Allele) enthält, dann erzeugt nach dieser Methode nur diejenige Amplifizierungsreaktion, die die für die mutierte Region spezifische Sonde verwendet, ein Signal (d. h. ein Amplifizierungsprodukt). Wenn die untersuchte genomische DNS heterozygot ist (ein mutiertes Allel und ein nichtmutiertes Allel), dann führen beide Amplifizierungsreaktionen zu einem Signal (einem Ampliflzierungsprodukt). Wenn die untersuchte genomische DNS ein homozygotes nichtmutiertes Pit-1 Gen enthält, so wird analog nur diejenige Ampliflzierungsreaktion, bei der eine für die nichtmutierte Region spezifische Sonde verwendet wird, ein Signal ergeben. So wird innerhalb von einem einzigen Amplifizierungsschritt das Allel-Muster der untersuchten DNS ersichtlich.
• In einer zweiten Ausführungsform ist die Verwendung der in der WO 97/06276 beschriebene Technik besonders geeignet, um in einem einzigen Schritt den homozygoten oder heterozygoten Zustand des Markers festzustellen.
• In diesen Methoden ist es nicht erforderlich, das amplifizierte Produkt weiter zu zerschneiden, um die unterschiedlichen Muster unterscheiden zu können. Desweiteren ist es nicht erforderlich, ein spezifisches Pit-1 Genfragment vor dem Detektionsschritt zu amplifizieren. Schließlich kann die Sichtbarmachung in Abhängigkeit der Art der verwendeten Markierung sehr einfach sein. Wenn z. B. die Proben radioaktiv markiert sind, kann die Sichtbarmachung durch Elektrophorese vorgenommen werden. Von noch größerem Interesse ist die unmittelbare Sichtbarmachung, die erhalten wird, wenn die Proben mit Färbungen markiert werden.
• In der ersten Ausführungsform kann der Test in sehr einfachen Vorrichtungen durchgeführt werden, z. B. in Platten. Die Proben der genomischen DNS werden in 2 Wells eingeführt, ein Well mit dem markierten Sonden-Set, das eine Sonde enthält, welche mit der Pit-1 Genmutation überlappt und für das mutierte Pit-1 Gen spezifisch ist, das andere mit dem Sonden-Set, das eine Sonde enthält, die mit der Pit-1 Genmutation überlappt und für das nichtmutierte Pit-1 Gen spezifisch ist.
• Nach der Amplifizierung werden die Markierungen direkt in den Platten sichtbar und können durch automatische Vorrichtungen analysiert werden.
• In dieser Amplifizierungsmethode wird der zweite Primer, der in jedem der Sondensets eingesetzt wird, derart ausgewählt, dass er die Amplifizierung eines Produkts ermöglicht, das 200 bis 400 bp enthält, bevorzugter 320–370 bp. Solche zweiten Primer können z. B. aus den folgenden Primern ausgewählt werden:
• 
• Die Länge jeder dieser Primer ist bevorzugt zwischen 20 und 40 Basen, bevorzugter zwischen 25 und 35.
• Die Selektion von geeigneten Sonden für diese Strategie wurde ermöglicht durch die Identifizierung – durch die Erfinder – einer Mutation in dem Pit-1 Gen, die für den festgestellten Polymorphismus verantwortlich ist. Genauer gesagt tritt diese Mutation in der Pit-1 codierenden Region auf, am Nukleotid 1178, wo ein Adinin in dem mutierten Gen durch ein Guanin substituiert ist. Diese Mutation ist in 2 dargestellt.
• Die Position der Sonde, die mit der mutierten Region (der Mutation) überlappt, kann variieren.
• In der ersten Ausführungsform sind die zwei Paare von Primern bevorzugt:

  

  für den AA-Genotyp, Charakteristik für das Milchproduktionsvermögen, und

  

  für den BB-Genotyp, Charakteristik für das Fleischproduktionsvermögen.
• In der zweiten Ausführungsform, wenn die Methode nach der WO 97/06276 verwendet wird, sind die zwei Paare von Primern, die zur Produktion von amplifizierten Fragmenten unterschiedlicher Größe führen:

  

  für den AA-Genotyp, eine Charakteristik für das Milchproduktionsvermögen, und

  

  und ein zweiter Primer Pit-1 C', der derart ausgewählt wird, dass die Amplifizierung wenigstens 10 bp kürzer oder länger ist als jene, die mit Pit-1 AA und Pit-1 B für den BB-Genotypen erhalten wird, eine Charakteristik für das Fleischproduktionsvermögen.
• Wenn auch viele Detektionsmethoden für Mutationen zur Verfügung stehen, so ist die vorliegende Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen Methoden beschränkt und umfasst alle Methoden zum Feststellen einer Mutation.
• Die Allele und allelischen Muster werden anschließend identifiziert und es wird eine statistische Analyse durchgeführt, um die bestimmten Merkmale festzustellen, die durch die Identifizierung der Allele nachgewiesen wurden. Insbesondere kann jedes statistische Programm verwendet werden, das Tochterertrag-Abweichungen (daughter yield deviations) (DYD) und deregressive Proofs (deregressed proofs DRP) identifizieren kann. Bevorzugt wird die statistische Analyse durchgeführt, indem das gemischte Verfahren (MIXDED procedure) von SAS angewendet wird (User's Guide: Statistics, Version 6, 4. Auflage, SAS Inst., Inc. Cary, N.C. (1990), Technischer Report P 229 SAS Inst. Inc., Cary, N.C. (1992)). Die in der vorliegenden Erfindung verwendete statistische Analyse ist in den folgenden Beispielen ausführlich erläutert.
• Desweiteren umfasst die vorliegende Erfindung einen Kit, enthaltend Extraktionsmaterialien für genomische DNS, die PCR-Primer mit den SEQ ID NRs 1 und 2 (wie vorstehend dargestellt), Materialien, die für die Sichtbarmachung der Mutation ertorderlich sind wie Elektrophoresegels und ähnliches. Der Inhalt des Kits kann in Abhängigkeit der angewendeten Detektionsmethoden, die vorstehend ausführlich erläutert wurden, variieren.
• Von der vorliegenden Erfindung sind auch Primer umfasst, die mit der Mutation in dem Pit-1 Gen überlappen.
• Genauer gesagt betrifft die Erfindung auch einen Primer, der 20 bis 40 Basen umfasst, welcher komplementär zu einer Region des Pit-1 Gens ist, die eine Mutation aufweist.
• Desweiteren umfasst die Erfindung Primer-Sets, die die Amplifizierung einer Region von 200 bis 400 Basen in dem Pit-1 Gen ermöglichen, wobei die Region eine Mutation enthält.
• Die folgenden Primer werden von der vorliegenden Erfindung umfasst:
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• Um die vorliegende Erfindung und deren Vorteile näher darzustellen, werden die folgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei diese selbstverständlich nur beispielhaft und nicht etwa beschränkend aufzufassen sind.
• BEISPIEL A
• 1. DNS-EXTRAKTION UND PCR
• Die genomische DNS von 89 kommerziell erhältlichen registrierten italienischen Holstein-Friesischen Bullen wurde aus dem Samen extrahiert, wie von Lucy et al., Domest. Anim. Endocrinol 10: 325 (1993) beschrieben.
• Die RFLP an dem Pit-1 Gen unter Verwendung von HinfI Restriktionsenzym konnte durch PCR-Analyse gezeigt werden, die nach Woolard et al., supra, durchgeführt wurde.
• Die PCR-Primer wurden aus Intron V und Exon 6 entwickelt. Die Sequenzen der verwendeten Primer waren 5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (SEQ ID NR: 1) und 5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (SEQ ID NR: 2). Diese Primer wurden verwendet, um nach Standardverfahren ein 451-bp Fragment der genomischen DNS in 50 μl Reaktionsvolumen, die 2 mM MgCl₂ enthielten, zu amplifizieren. Die Bedingungen waren 94,5°C, 10 Minuten, und 94°C, 1 Minute, gefolgt von 35 Cyclen bei 95°C, 30 Sekunden, 56°C, 1 Minute und 72°C, 2 Minuten. Der letzte Schritt war 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden mit HinfI verdaut und auf 2% Agarose-Gelen mit 1 μg/ml Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt (1).
• Die "Daughter Yield Deviations" (DYD), durchgeführt im März 1996, wurden von Holstein-Friesischen Bullen von der italienischen Holstein-Friesischen Züchtervereinigung ANAFI erhalten (Associazione Nazionale Allevatori Frison Italiana, Cremona, Italien). Die DYD-Werte wurden für Fett- und Protein-Prozentsatr nicht errechnet, da diese Merkmale nur indirekt aus Lösungen für Ertragsmerkmale und Durchschnittspopulationswerte für diese Merkmale abgeschätzt werden. Demgemäss wurden die DYD-Werte nach dem gleichen Ansatz wie die Berechnung von genetischen Werten für Prozentsatz-Merkmale errechnet.
• Da ähnliche DYD für Typ-Merkmale nicht zur Verfügung standen, wurden die genetischen Werte in "deregressed proofs" (DRP) transformiert (Banos et al., Interbull Annual Meeting, Aarhus, Denmark, Bulletin Nr. 8, 1993, Sigbjorn et al., J. Dairy Sci, 78: 2047 (1995)), die als angenäherte DYD angesehen werden können.
• Die Durchschnitts- und Standardabweichungen von DYD für Milchproduktionsmerkmale und/oder DRP für Gestaltsmerkmale der Bullenprobe sind in Tabelle 1 dargestellt. Die effektive Anzahl von Töchtern, die ein Maß für die Anzahl von Töchtern darstellt, angepasst an ihre Verteilung innerhalb der Herden, war für Ertragsmerkmale verfügbar, aber nicht für Typmerkmale. Es erfolgte daher eine Angleichung nach der folgenden Formel: effektive Anzahl = tatsächliche Anzahl x Quadratwurzel des Quotienten von Herdenanzahl zu Töchteranzahl.
• TABELLE 1 Tabelle 1. Durchschnittliche Tochterertrag-Abweichungen (daughter yield deviations) für Milchmerkmale und deregressive Proofs für Gestaltsmerkmale von 89 Holstein-Friesische Bullen

  
• 
• 2. STATISTISCHE ANALYSE
• Die statistische Analyse wurde durchgeführt, indem das MIXED-Verfahren von SAS, supra, angewendet wurde. Das verwendete MIXED-Modell war y = Xb + Zu + eworin
  y = Vektor von DYD oder DRP der Bullen; b = Vektor von festen Effekten, die mit dem Pit-1 Muster assoziiert sind, u = Vektor von statistischem, additiven polygenen Effekt von Bullen, und e = Vektor von statistischen Resteffekten. Dieses Modell wurde gelöst, indem die folgenden gemischten Modellgleichungen verwendet wurden:

  

  worin A die Additiv-Beziehungsmatrix zwischen den 89 Bullen darstellt, die unter Verwendung der gesamten bekannten Verwandtschaft erstellt wurde (1842 bekannte Vorfahren, R^–1 = D/δ² _e, worin angenommen wird, dass D eine diagonale Matrix ist, mit der Anzahl der effektiven Töchter für jeden Bullen in ihrer Diagonale. Diese Matrix wird anschließend durch die Schätrung der Restvarianz δ² _e geteilt. Dies ist eine geschätzte REML (Patterson und Thompson, Biometrika 58: 545 (1971)), im vorliegenden Fall identisch zu nicht-interaktiver Minimalvarianz quadratischer erwartungstreuer Schätzung "non-interactive minimum variance quadratic unbiased estimation" (Rao, J. Mult.
• Anal. 1: 445 (1971)), nachdem die Konvergenz nach einer Runde eintritt. Die gefundene Schätrung weist die Eigenschaft auf, dass sie die quadratischen Formen darstellt, was die Probenvarianz minimiert. Es wurden zwei Annahmen getroffen, keine Restkovarianzen zwischen DYD oder DRP und Erblichkeiten (h²) von DYD oder DRP gleich der Verwendung von Erblichkeiten für genetische Auswertungen, mit der Ausnahme des Fett- und Proteinprozentsatres, bei dem angenommen wurde, dass 0,5 die Erblichkeit darstellt (Tabelle 2). Diese Methode neigt dazu, die additive Erblichkeit zu überschätzen, da die Varianz aufgrund der Zuchttiere in dem Modell für das Vorliegen des Pit-1 Musters nicht reduziert wird, jedoch sollte diese Überschätrung keine sehr große Bedeutung aufweisen. TABELLE II Tabelle 2. Angenommene Erblichkeiten und Milchmerkmale und Gestaltsmerkmal von italienischen Holstein-Rindern

  Merkmal	Erblichkeit
  Milchmerkmale
  Milch, kg	0,25
  Fett, kg	0,25
  Protein, kg	0,25
  Fett, %1	0,50
  Protein, %1	0,50
  Gestaltsmerkmale
  Endpunktzahl	0,15
  Statur	0,38
  Stärke	0,29
  Körperfülle	0,31
  Knochigkeit (Angularity)	0,31
  Winkel der Kruppe	0,25
  Breite der Kruppe	0,29
  Hinterbeine	0,16
  Füße	0,18
  Vordereuter	0,15
  Höhe des Hintereuters	0,20
  Breite des Hintereuters	0,24
  Euterstütre (udder support)	0,15
  Euterfülle	0,29
  Zitrenanordnung	0,22
  Zitrenlänge	0,22

• Die linearen Kontraste wurden als Unterschiede zwischen Muster-Lösungen erstellt. Die Untersuchung von Kontrasten wurde durchgeführt, indem die folgende Statistik verwendet wurde: F = b'I – I'CbbI)–1I'bworin I'b Unterschiede zwischen Muster-Lösungen darstellt, wobei 1 der lineare Kontrastvektor ist, C^bb eine Abschätzung des Blocks der generalisierten Umkehrfunktion des Matrix-Koeffizienten, der mit Muster-Effekten assoziiert ist, und (I'C^bbI) ist die Umkehrfunktion des Standardfehlers im Quadrat des linearen Kontrasts. Der Freiheitsgrad des Zählers wurde unter Verwendung von Stellung(I) = 1 approximiert. Der Nenner wurde auf n – Stellung(X) = 86 gesetzt, worin n die Anzahl von Beobachtungen darstellt.
• Es ist nicht sicher, dass das Vorliegen eines bestimmten Musters nur einen Haupteffekt aufweist. Daher wurde die folgende Strategie, die auf Wellen et al., J. Dairy Sci. 73: 2525 (1990) beruht, zur Untersuchung dieser Hypothese eingesetzt.
• 1. Merkmale, die Einzelmerkmalsignifikanzkontraste zwischen Mustern zeigen, wurden gruppiert, gegebenenfalls in Beziehung stehende Merkmale wurden ebenfalls eingeschlossen.
• 2. Gewichtete Korrelations-V- und Covarianz-B-Matrixes zwischen diesen Merkmalen wurden erhalten.
• 3. Eine kanonische Transformation wurde als V = QEQ' definiert, worin E eine Diagonalmatrix von Eigenwerten und Q eine Matrix von Eigenvektoren ist.
• 4. Die Transformationsmatrix T wurde als Q^–1S definiert, worin S eine Diagonalmatrix der inversen Standardabweichungen der Originalmerkmale ist, daher TPT = E.
• 5. Die Transformationsmatrix wurde verwendet, um die in Beziehung stehenden Merkmale in nicht in Beziehung stehende kanonische Merkmale zu transformieren.
• 6. Die ungefähren Erblichkeiten und Gewichtungen für die kanonischen Merkmale wurden als gewichtete Mittelwerte der Werte für die Anfangsmerkmale erhalten, die gewichtete Koeffizienten waren die Quadratwerte von Q^–1.
• 7. Die kanonischen Merkmale wurden analysiert, wobei die vorstehend für die Anfangsmerkmale verwendeten Methoden eingesetzt wurden. Die kanonischen Merkmale, die nur geringe relative Eigenwerte zeigen, erklären wenig der beobachteten Varianz.
• 8. Mehrfachmerkmalslinearkontraste für Originaleffekte können abgeschätzt werden, indem Rücktransformationen von signifikanten kanonischen Kontrasten verwendet werden.
• 9. Die Ergebnisse für diese neuen Merkmale sind anschließend geeignet, um zu bestimmen, ob nur ein Effekt des Pit-1 Musters beobachtet werden kann, oder ob mehr als ein signifikanter Effekt vorliegt. Rücktransformierte Kontraste spiegeln die signifikanten Unterschiede zwischen Originalmerkmalen wieder, bezogen auf einen bestimmten Effekt von Pit-1 auf das kanonische Merkmal.
• 3. ERGEBNISSE
• PCR/RFLP
• Das PCR-Produkt hatte eine Länge von 451 bp. Der Verdau des PCR-Produktes mit HinfI ergab zwei Allele: das A-Allel, das nicht durch HinfI verdaut wurde, und ein 451 bp Fragment ergab, und das B-Allel, das an einer Restriktionsstelle geschnitten wurde und zwei Fragmente mit einer Länge von 244 und 207 bp ergab, wie von Woolard et al., supra, beschrieben (1).
• Beziehung zwischen PCR/RFLP und der Milchproduktion
• Die Häufigkeiten der drei Muster AA, AB und BB lagen bei 2,2%, 31,5% und 66,3 %. Die Frequenzen der A- und B-Allele wurden durch einen Maximumwahrscheinlichkeitsansatz (Maximum likelihood approach) abgeschätzt, mit 18,8% für A und 81,2% für B.
• Tabelle 3 zeigt die linearen Kontraste und Standardabweichungen zwischen den 3 Pit-1 Mustern. Die hochsignifikanten Kontraste (P < 0,01), die für die Hinterbeine beobachtet wurden, scheinen daher mehr darauf zu beruhen, dass die Tiere vom Typ AA in diesem Merkmal extrem sind, als auf einem tatsächlichen biologischen Grund. Hochsignifikante Kontraste zwischen AB- und BB-Mustern wurden für Milch- und Proteinertrag gefunden (P < 0,01). Signifikante Kontraste wurden für Fettprozentsatz und Knochigkeit gefunden (P < 0,05). Das AB-Muster oder AA-Muster war hinsichtlich Milch, Proteinertrag und Knochigkeit überlegen und im Hinblick auf den Fettprozentsatz unterlegen. Diese Ergebnisse können so interpretiert werden, dass sie sich aus einem einzigen positiven Effekt des Heterozygots AB oder AA auf den Milchertrag ergeben, wodurch der Proteinertrag positiv beeinflusst wird, jedoch nicht der Fettertrag, was zu der beobachteten negativen Beeinflussung des Fettprozentsatzes führt. Der Einfluss von Pit-1 auf die Knochigkeit ist in diesem Zusammenhang nicht sehr überraschend, da davon ausgegangen wird, dass dieses lineare Merkmal in enger Beziehung zum Milchertrag steht.
• TABELLE III Tabelle 3. Lineare Kontraste (C) und Standardfehler (SE) zwischen den drei Pit-1 Mustern, beobachtet an 89 Holstein-Friesischen Bullen.

  
• 
• Um die Hypothese eines Einzeleffekts zu untersuchen, führten wir eine kanonische Transformation von Milch-, Fett- und Proteinerträgen durch. Die Erträge wurden als Prozentsatz analysiert, DYD wurden als Funktionen der Erträge erhalten; dies führt daher zu keiner neuen Information. Die Knochigkeit wurde hinzugefügt. Die phenotypische Korrelationsmatrix wurde berechnet. Die Beobachtungen wurden gewichtet, indem die Anzahl von effektiven Töchtern verwendet wurde. Da diese Anzahl für Ertrags- und Typ-Merkmale unterschiedlich war, wurden annähernde Gewichtungen erhalten, als gewichtete Mittelwerte der Anzahl von effektiven Töchtern. In Tabelle 4 sind die Korrelationen dargestellt. Die Korrelationen zwischen Ertragsmerkmalen zeigten die erwarteten Werte mit höheren Korrelationen zwischen Milch und Protein als zwischen Fett und einem der anderen Merkmale. Die Knochigkeit zeigte Korrelationen zwischen 0,42 und 0,51 mit Ertragsmerkmalen.
• TABELLE 4 Korrelationen zwischen Tochterertrag-Abweichungen (daughter yield deviations) für die Milchmerkmale und Knochigkeit (angularity)

  
• Die Ergebnisse der kanonischen Auflösung der Korrelationsmatrix sind in Tabelle 5 dargestellt. Das erste und zweite kanonische Merkmal erklärt 90% der Gesamtvarianz. Insbesondere das letzte kanonische Merkmal war nicht sehr informativ. Tabelle 5 zeigt auch die Eigenvektoren und die relative Bedeutung der unterschiedlichen Merkmale in jedem Eigenvektor. Das erste kanonische Merkmal ist eine Kombination aller vier Merkmale mit relativen Einflüssen zwischen 15% für Knochigkeit und 30% für Protein. Das zweite kanonische Merkmal jedoch ist spezifischer mit der Knochigkeit verbunden, mit einer relativen Bedeutung von 81% in diesem Merkmal. Das dritte ist mit Fett und weniger mit Milch assoziiert, das vierte nur mit Milch und Protein.
• TABELLE 5. Standardisierte Eigenvektoren und Eigenwerte der vier kanonischen Merkmale (zwischen den Klammern die relativen Bedeutungen der Eigenwerte in der Gesamtvarianz und der Werte in Eigenvektoren in kanonischen Merkmalen)

  
• Tabelle 6 zeigt die linearen Kontraste und Standardfehler, die für die vier kanonischen Merkmale beobachtet wurden. Entgegen den Erwartungen wurde gefunden, dass für die Kontraste zwischen den AB- und BB-Mustern das erste und zweite kanonische Merkmal sehr hochsignifikant (P < 0,001) und das vierte leicht signifikant (P < 0,05) waren. Dieses Ergebnis zeigt, dass Pit-1 mehr als einen Effekt aufweisen könnte. Das erste kanonische Merkmal ist spezifischer mit der Knochigkeit verbunden. Das letzte Merkmal reflektiert das Gleichgewicht zwischen Milch- und Proteinerträgen. Um diese Kontraste leichter verständlich zu machen, sind in Tabelle 7 die Werte der Kontraste und der Standardfehler, ausgedrückt auf den Originalskalen, dargestellt. Wir konnten beobachten, dass die Rücktransformationskontraste für Milch, Fett und Protein für den ersten kanonischen Kontrast sehr wichtig waren. Bei allen waren ferner die AB-Tiere den BB-Tieren überlegen. Für das zweite kanonische Merkmal waren die AB unterlegen im Hinblick auf Milch, Fett und Protein und überlegen im Hinblick auf Knochigkeit. Dies zeigt wiederum, dass der Einfluss von Pit-1 auf die Knochigkeit wichtig zu sein scheint, zum Einen über die Verbindung zwischen Erträgen und Knochigkeit, aber auch direkt auf die Knochigkeit mit einem leicht negativen Einfluss auf die Erträge. Das kanonische Merkmal 3 zeigte keine signifikanten Kontraste und das kanonische Merkmal 4 erklärte trotz seiner Signifikanz nur sehr wenig der Gesamtvarianz. Nach Gruppierung aller signifikanten kanonischen Merkmale konnten wir höhere gruppierte Kontraste als in der Einzelmerkmalssituation beobachten. Dies war besonders klar für Fettertrag und Knochigkeit, jedoch auch für Milch und Protein. Der Grund dafür scheint darin zu liegen, dass die Mehrtachmerkmalskontraste Informationen aus den korrelierten Merkmalen enthalten, insbesondere für Fett und Knochigkeit kann dies die Unterschiede erklären. Die Standardfehler stiegen nicht deutlich an, sie waren sogar für Milch- und Fetterträge reduziert.
• TABELLE 6. Lineare Kontraste (C) und Standardfehler (SE} zwischen drei Pit-1 Mustern für vier kanonische Merkmale, beobachtet an 89 Holstein-Friesischen Bullen

  
• TABELLE 7. Linearer Kontrast (C) und Standardfehler des Kontrasts (SE) zwischen AB und BB, erhalten durch Rücktransformation mit 89 Holstein-Friesischen Bullen

  
• BEISPIEL B
• Sequenzierung des Pit-1 Gens und Charakterisierung einer Mutation
• Diese Methode erzeugt separate Populationen von radioaktiv markierten Oligonukleotiden, die an einem Fixpunkt beginnen und statistisch verteilt an einem festgelegten Rest oder einer Kombination von Resten enden. Da jede Base in der DNS die gleiche Wahrscheinlichkeit aufweist, ein variables Ende darzustellen, besteht jede Population aus einer Mischung von Oligonukleotiden, deren Längen durch die Lage einer bestimmten Base entlang der Länge der Original-DNS bestimmt werden. Diese Populationen von Oligonukleotiden werden durch Elektrophorese aufgetrennt, unter Bedingungen, die zwischen individuellen DNS unterscheiden können, die sich hinsichtlich der Länge durch nur ein Nukleotid unterscheiden. Wenn die Populationen in benachbarte Bahnen eines Sequenziergels aufgetragen werden, kann die Anordnung der Nukleotide entlang der DNS direkt von einer autoradiografischen Abbildung des Gels abgelesen werden. Literaturstelle: Sanger, F., S. Nicklen und A. R. Coulson. 1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad, Sci, 74: 5463.
• BEISPIEL C
• Detektionsexperimente unter Verwendung von Primern
• 1) Ligase-Kettenreaktion
• Die Ligase-Kettenreaktion (LCR), die nur Oligonukleotidsonden und DNS-Ligase verwendet, ist in der Lage, ungefähr 1000 Kopien einer bestimmten Ziel DNS-Sequenz in Gegenwart eines großen Überschusses an anderer DNS-Sequenzinformation zu detektieren. Seit der ersten Beschreibung im Jahr 1989 (Backman und Wang, 1989, Europäische Patentanmeldung Nr. 0 320 308; Royer et al., 1989, Europäische Patentanmeldung Nr. 0 324 616; Wallace, 1989, Europäische Patentanmeldung Nr. 0 336 731; Wu und Wallace, 1989, Genomics 4: 560–569; Orgel, 1989; Richards und Jones, 1989) wurde LCR durch den Einsatz einer thermostabilen DNS-Ligase in Verbindung mit nichtradioaktiver Detektion verbessert (Bond et al., 1990).
• TABELLE 8. Regression im Hinblick auf die Anzahl Kopien des Pit-1 A-Allels (Gensubstitutionseffekt) und im Hinblick auf das Vorliegen von AB (Dominanzeffekt), beobachtet für 455 gültige Aufzeichnungen (Laktationsdauer 250–730 Tage) von 174 Cana-Kühen

  
• 2) FLP an dem Pit-1 Gen unter Verwendung des HinfI-Restriktionsenzyms konnte durch PCR-Analyse festgestellt werden, durchgeführt gemäß Woolard et al., supra.
• Unter Verwendung der durch Sangen et al., supra, beschriebenen Methode konnten wir die Punktmutation an dem Nukleotid 1178 (a versus g) identifizieren, die mit dem "reproted" RFLP assoziiert ist. Ferner wurde eine neue PCR-Methode ohne HinfI Restriktionsenzym und unter Verwendung von Primern, die mit der Mutation überlappen, entwickelt.
• Polymerase-Kettenreaktionsmethode
• RFLP an dem Pit-1 Gen konnte durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) festgestellt werden. In Kürze dargestellt: es wurden zwei PCR-Primer, die mit der Mutation überlappen (Primer AA = 5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3' und Primer BB = 5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3') in Verbindung mit einem dritten Primer (Primer B = 5'-GACAGGGAAAGTGATATAGAAAGGGAGATAGA-3') verwendet, um ein 360 bp Fragment der genomischen DNS in einem 50 μl-Reaktionsvolumen, das 2 mM MgCl₂ enthielt, zu amplifizieren. Die Bedingungen waren 95°C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Cyclen bei 95°C für 1 Minute, 65,2°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute. Der Endschritt war 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch auf 2% Agarosegelen mit 1 μg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt (3).
• SCHLUSSFOLGERUNGEN
• Es konnten zwei Allele für das Pit-1 Gen, dem Wachstumshormonfaktor-1/Hypophysenspezifischem Transkriptionsfaktor, der für die Aktivierung von Prolactin und GH-Genexpression verantwortlich ist, unterschieden werden, wobei eine Restriktionsstelle verwendet wurde, die durch HinfI erkannt wird. Es wurden zwei Allele festgestellt, wobei A nicht verdaut wurde und B diese Stelle aufwies. Das AA-Muster war weniger häufig als das AB- oder BB-Muster. Die deutliche Überlegenheit des Pit-1 AB-Musters oder AA-Musters in Vergleich zu BB wurde für Milch, Protein und Knochigkeit festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass heterozygote Tiere höhere Produktionen und ein besseres Milchproduktionsvermögen aufweisen. Es wurde gefunden, dass der Fettprozentsatz für AB-Tiere geringer ist als für BB-Tiere, ein Ergebnis, das aus einem höheren Milchertrag bei nahezu konstantem Fettertrag folgt.
• Diese Ergebnisse zeigen einen Einzeleffekt von Pit-1. Jedoch konnte durch einen kanonischen Transformationsansatz gezeigt werden, dass wenigstens zwei unterschiedliche Effekte von Pit-1 auftreten; einer auf die Erträge und die Knochigkeit und ein weiterer nur auf die Knochigkeit. Diese Ergebnisse können dadurch erklärt werden, dass Pit-1 mehr als eine Rolle bei der Aktivierung von Prolactin und der GH-Genexpression spielt. Eine erste Rolle beeinflusst die Milch-, Protein- (und Fett)-Erträge, eine zweite Rolle steht mit der Muskelentwicklung der Tiere im Zusammenhang, d. h. das Vorliegen von AB reduziert den muskulösen Körperaufbau durch Verbesserung der Knochigkeit.
• Interessanterweise zeigen diese Befunde die Nützlichkeit der kanonischen Transformation, um zwischen Effekten auf in Beziehung stehenden Merkmalen zu unterscheiden. Die Verbindung des Pit-1 Polymorphismus mit Milchmerkmalen in Milchkühen konnte auf der Originalskala, aber auch auf der transformierten Skala gezeigt werden. Die Beziehungen waren für Gestaltsmerkmale weniger wichtig, außer hinsichtlich der Knochigkeit, die ein Merkmal darstellt, das mit dem Milchertrag in Zusammenhang steht. Wiederum zeigte die kanonische Transformation, dass die Effekte auf die Knochigkeit nur partiell eine direkte Konsequenz des Einflusses von Pit-1 auf Milchmerkmale darstellten.
• Die Identifizierung einer bestimmten Mutation in dem Pit-1 Gen ermöglicht die Ausführung der schnellen und empfindlichen Methode, um zwischen den verschiedenen Allelen und den entsprechenden Merkmalen zu unterscheiden.

Claims (13)

1. Verwendung eines genetischen Markers, um bei Rindern im Hinblick auf ein Merkmal für das Milchproduktionsvermögen oder das Fleischproduktionsvermögen zu unterscheiden, dadurch gekennzeichnet, dass der genetische Marken eine Mutation in einem Fragment eines Pit-1-Gens umfasst, bei welchem drei Muster von Allelen beobachtet werden, wobei eines der Allelmuster vollständig mutiert ist und ein Hinweis auf ein Merkmal für einen muskulösen Körperbau bei dem Rind ist, während die zwei anderen Allelmuster, von denen eins mutiert und nicht mutiert ist und das andere nicht mutiert/nicht mutiert ist, ein Hinweis auf ein Merkmal im Hinblick auf die Milchproduktion bei dem Rind sind.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Mutation eine Veränderung von A zu G an der Nukleotidposition 1178 der Sequenz aus 2 ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Beobachtung über ein Elektrophoresegel erfolgt.
4. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Merkmal eines muskulösen Körperbaus mit dem Allelmuster BB verbunden ist, wobei das Allel B ein Guanin an der Nukleotidposition 1178 der Sequenz aus 2 aufweist.
5. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Merkmal im Hinblick auf die Milchproduktion mit dem Allelmuster AB oder dem Allelmuster AA verbunden ist, wobei das Allel A ein Adenin an der Nukleotidposition 1178 der Sequenz aus 2 aufweist und das Allel B ein Guanin an derselben Position aufweist.
6. Ein Verfahren zum Feststellen gewisser Merkmale, die mit einem Polymorphismus des Pit-1-Gens in einem Rind zusammenhängen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Isolieren von genomischer DNA aus einer Rinderprobe; (2) gegebenenfalls Isolieren eines Fragments aus der genomischen DNA, welches ein Fragment des Pit-1-Gens umfasst; (3) Feststellen des Allelmusters des Pit-1-Gens; und (4) Analysieren des Allelmusters, um Merkmale bei dem Rind zu bestimmen, wobei bei der Analyse des Allelmusters die Merkmale eines muskulösen Körperaufbaus und von Fett von den Merkmalen im Hinblick auf die Milchproduktion bei dem Rind unterschieden werden.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei in Schritt (3) das Feststellen des Allelmusters in dem Pit-1-Gen unter Verwendung einer Restriktionsendonuklease durchgeführt wird.
8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Restriktionsenzym HinfI ist.
9. Das Verfahren gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das Fragment des Pit-1-Gens unter Verwendung von PCR-Primern isoliert wird.
10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die PCR-Primer sind:

    
11. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Schritt des Feststellens nach dem Verdau weiterhin eine Analyse über RFLP oder CFLP oder SSCP oder DGGE umfasst.
12. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei in Schritt (3) das Feststellen der Mutation, die an dem Polymorphismus des Pit-1-Gens beteiligt ist, unter Verwendung eines Primers (von Primern) durchgeführt wird, welcher (welche) mit der Mutation in dem Pit-1-Gen überlappt (überlappen).
13. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die PCR-Primer die folgenden sind:

    

    für den Genotyp AA, der für das Milchproduktionsvermögen charakteristisch ist, und

    

    für den Genotyp BB, der für das Fleischproduktionsvermögen charakteristisch ist.