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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft substituierte 6(4)-Benzyloxypyrimidine,
pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen umfassen,
und Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen. Die betreffenden
Verbindungen sind besonders nützlich
zum Inaktivieren des menschlichen DNA-Reparaturproteins O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Inaktivierung des menschlichen DNA-Reparaturproteins O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (AGT)
durch O6-Benzylguanin führt zu einer drastischen Steigerung
der zytotoxischen Reaktion von menschlichen Tumorzellen und Tumorxenotransplantaten
auf chemotherapeutische Wirkstoffe, deren Wirkungsmechanismus die
Modifikation von DNA-Guanin-Resten an der O6-Position
einbindet (Dolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5368–5372 (1990);
Dolan et al., Cancer Res. 51, 3367–3372 (1991); Dolan et al.,
Cancer Commun. 2, 371–377
(1990); Mitchell et al., Cancer Res. 52, 1171–1175 (1992); Friedman et al.,
J. Natl. Cancer Inst. 84, 1926–1931
(1992); Felker et al., Cancer Chem. Pharmacol. 32, 471–476 (1993);
Dolan et al., Cancer Chem. Pharmacol. 32, 221–225 (1993); Dolan et al.,
Biochem. Pharmacol. 46, 285–290
(1993)). Die AGT-Inaktivierungsaktivität zahlreicher O6-Benzylguaninanaloga
wurde mit dem Ziel verglichen, Informationen über die Typen von Substituentengruppen
und die Stellen, an denen sie an O6-Benzylguanin
angebunden werden könnten,
ohne seine AGT-Inaktivierungsaktivität signifikant zu verändern, zu
erhalten (Moschel et al., J. Med. Chem. 35, 4486–4491 (1992); Chae et al.,
J. Med. Chem. 37, 342–347
(1994)). Während
diese Studien zur Herstellung einer Vielzahl von Analoga führten, die
so potent wie oder etwas weniger potent als O6-Benzylguanin
waren, war keines dieser Analoga besser als O6-Benzylguanin.
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Somit
bleibt ein Bedarf an zusätzlichen
Verbindungen bestehen, die in der Lage sind, die chemotherapeutische
Behandlung von Tumorzellen bei Säugetieren
mit einem antineoplastischen Alkylierungsmittel zu verstärken, das
zytotoxische Läsionen
an der O6-Position von Guanin verursacht.
Die vorliegende Erfindung stellt solche Verbindungen und damit verbundene
pharmazeutische Zusammensetzungen sowie Behandlungsmethoden bereit.
Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie
zusätzliche
Eigenschaften eben dieser werden anhand der hierin bereitgestellten
Beschreibung der Erfindung einsichtig werden.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt 4(6)-substituiertes 2-Amino-5-nitro-6(4)-benzyloxypyrimidin-
und 2-Amino-5-nitroso-6(4)-benzyloxypyrimidin-Derivate, für die erkannt
wurde, dass sie wirksame AGT-Inaktivatoren sind, sowie pharmazeutische
Zusammensetzungen, die solche Derivate umfassen, gemeinsam mit einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger
bereit. Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Verbesserung
der chemotherapeutischen Behandlung von Tumorzellen bei Säugetieren
mit einem antineoplastischen Alkylierungsmittel bereit, das zytotoxische
Läsionen
an der O6-Position von Guanin verursacht,
indem eine wirksame Menge eines der zuvor genannten Derivate oder
eines 5-substituierten 2,4-Diamino-6-benzyloxypyrimidins an ein
Säugetier
und eine wirksame Menge eines antineoplastischen Alkylierungsmittels,
das zytotoxische Läsionen
an der O6-Position von Guanin verursacht,
verabreicht wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung der Formel II
bereit, worin R
1 NO
2 oder NO und R
2 ein
Substituent ist, der aus der aus Wasserstoff, Halogen, C
1-C
4-Alkyl, C
1-C
4-Hydroxyalkyl,
Thiol, C
1-C
4-Alkylthio,
Trifluormethylthio, C
1-C
4-Thioacyl,
Hydroxy, C
1-C
4-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Methansulfonyloxy, Trifluormethansulfonyloxy, C
1-C
4-Acyloxy, C
1-C
4-Aminoalkyl,
C
1-C
4-Alkylamino, C
1-C
4-Dialkylamino, Trifluormethylamino, Ditrifluormethylamino,
Aminomethansulfonyl, Amino-C
1-C
4-Alkylcarbonyl,
Aminotrifluormethylcarbonyl, Formylamino, Nitro, Nitroso, C
1-C
4-Alkyldiazo,
C
5-C
6-Aryldiazo,
Trifluormethyl, C
1-C
4-Halogenalkyl, Cyanomethyl,
C
1-C
4-Cyanoalkyl,
Cyano, C
1-C
4-Alkyloxycarbonyl,
C
1-C
4-Alkylcarbonyl, Phenyl, Phenylcarbonyl,
Formyl, C
1-C
4-Alkoxymethyl,
Phenoxymethyl, C
2-C
4-Vinyl,
C
2-C
4-Ethinyl und SO
nR',
worin n = 0, 1, 2 oder 3 und R' Wasserstoff,
C
1-C
4-Alkyl, Amino
oder Phenyl ist, bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Geeignete Verbindungen
umfassen jene Verbindungen, worin R
2 NO
2 und R
2 Wasserstoff
oder ein C
1-C
4-Alkyl
ist. Beispiele für
geeignete Verbindungen umfassen 2-Amino-4-benzyloxy-5-nitropyrimidin
und 2-Amino-4-benzyloxy-6-methyl-5-nitropyrimidin.
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Die
vorliegende Erfindung stellt darüber
hinaus Behandlungsmethoden bereit, die im Allgemeinen über pharmazeutische
Zusammensetzungen, die eine oder mehrere O
6-substituierte
Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen, verabreicht werden.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Verbesserung der chemotherapeutischen Behandlung von Tumorzellen
bei Säugetieren
mit einem antineoplastischen Alkylierungsmittel bereit, das zytotoxische
Läsionen
an der O
6-Position von Guanin verursacht, worin
das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer oder
mehrerer der zuvor beschriebenen Verbindungen der Erfindung der
Formeln I–V
an ein Säugetier
und die Verabreichung einer wirksamen Menge eines antineoplastischen
Alkylierungsmittel an dieses Säugetier
umfasst, das zytotoxische Läsionen
an der O
6-Position von Guanin verursacht.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch das Verfahren zur Verbesserung der
chemotherapeutischen Behandlung von Tumorzellen an einem Säugetier
mit einem antineoplastischen Alkylierungsmittel, das zytotoxische
Läsionen
an der O
6-Position von Guanin verursacht,
worin das Verfahren (i) die Verabreichung einer wirksamen Menge
von einer Verbindung der Formel VI
an ein Säugetier, worin R ein aus der
aus Wasserstoff, Halogen, C
1-C
4-Alkyl,
C
1-C
4-Hydroxyalkyl, Thiol, C
1-C
4-Alkylthio, Trifluormethylthio,
C
1-C
4-Thioacyl,
Hydroxy, C
1-C
4-Alkoxy, Trifluormethoxy,
Methansulfonyloxy, Trifluormethansulfonyloxy, C
1-C
4-Acyloxy,
Amino, C
1-C
4-Aminoalkyl,
C
1-C
4-Alkylamino,
C
1-C
4-Dialkylamino, Trifluormethylamino,
Ditrifluormethylamino, Aminomethansulfonyl, Amino-C
1-C
4-Alkylcarbonyl,
Aminotrifluormethylcarbonyl, Formylamino, Nitro, Nitroso, C
1-C
4-Alkyldiazo, C
5-C
6-Aryldiazo, Trifluormethyl,
C
1-C
4-Halogenalkyl,
Halogenmethyl, Cyanomethyl, C
1-C
4-Cyanoalkyl, Cyano, C
1-C
4-Alkyloxycarbonyl, C
1-C
4-Alkylcarbonyl,
Phenyl, Phenylcarbonyl, Formyl, C
1-C
4-Alkoxymethyl, Phenoxymethyl, C
2-C
4-Vinyl, C
2-C
4-Ethinyl und SO
nR', worin n = 0, 1,
2 oder 3 und R' Wasserstoff,
C
1-C
4-Alkyl, Amino
oder Phenyl ist, bestehenden Gruppe ausgewählter Substituent ist,
und
die Verabreichung einer wirksamen Menge eines antineoplastischen
Alkylierungsmittel, das zytotoxische Läsionen an der O
6-Position
von Guanin verursacht, umfasst.
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Mehrere
O6-substituierte Verbindungen wurden auf
ihre Fähigkeit
getestet, das menschliche DNA-Reparaturprotein, O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase
(AGT, Alkyltransferase), zu inaktivieren. Eine Gruppe an Verbindungen,
die als signifikant besser als O6-Benzylguanin
(der prototypische niedermolekulare Inaktivator) in Bezug auf die
Inaktivierung von AGT in menschlichen HT29-Dickdarmtumorzellextrakten
erkannt wurde, umfasste 5-substituierte 2,4-Diamino-6- benzyloxypyrimidine,
die Elektronen-ziehende Gruppen an Position 5 aufwiesen. Diese Derivate
waren auch hinsichtlich der Inaktivierung von AGT in intakten HT29-Dickdarmtumorzellen
wirksamer als O6-Benzylguanin. Diese Art
von Verbindung war in Bezug auf eine Verstärkung des Zelltötens durch
1,3-Bis(2-chlorethyl)-1-nitrosoharnstoff
(BCNU) von Dickdarm-, Brust- und Prostatakarzinomzellen, die in
Kultur gezüchtet
worden waren, gleich wirksam oder wirksamer als O6-Benzylguanin.
Sofern 5-substituierte 2,4-Diamino-6-benzyloxypyrimidine, die Elektronen-ziehende
Substituenten an Position 5 aufwiesen, keine unerwünschte Toxizität zeigen,
sollten sie als chemotherapeutische Adjuvanzien bessere Eigenschaften
zur Verstärkung
der Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen, deren Wirkungsmechanismus
die Modifikation der O6-Position von DNA-Guaninresten
umfasst, aufweisen als O6-Benzylguanin. Die
spezifischen Verbindungen, die auf AGT-Inaktivierungsaktivität untersucht
wurden, sind nachstehend veranschaulicht.
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Mit
Bezug auf die Pyrimidinderivate (3a–f) wurde 4-Amino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin (3a)
durch Behandeln von 4-Amino-6-chlor-5-nitropyrimidin (Boon et al.,
J. Chem. Soc., 96–102
(1951)) mit Natriumbenzyloxid in Benzylalkohol hergestellt. Derivate
3b–d wurden
mittels des Verfahrens von Pfleiderer et al. (Chem. Ber. 94, 12–18 (1961))
hergestellt. 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin (3e) und 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-brompyrimidin
(3f) wurden bereits davor von Kosary et al. (Acta Pharm. Hung. 49,
241–247
(1989)) hergestellt.
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Die
Verbindungen 5a (2-Amino-4-benzyloxy-5-nitropyrimidin) und 5b (2-Amino-4-benzyloxy-6-methyl-5-nitropyrimidin)
wurden durch Behandeln von 2-Amino-4-chlor-5-nitropyrimidin und 2-Amino-4-chlor-6-methyl-5-nitropyrimidin
(Boon et al., J. Chem. Soc., 96–102
(1951)) jeweils mit Natriumbenzyloxid in Benzylalkohol hergestellt.
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Die
Fähigkeit
dieser Verbindungen, das AGT-Protein in menschlichen HT29-Dickdarmtumorzellextrakten
und in intakten HT29-Zellen zu inaktivieren, ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Daten stellen die erforderliche Dosis der Verbindung dar, um
50% Inaktivierung in zellfreien Extrakten bei 30-minütiger Inkubation oder
in Zellen bei 4-stündiger
Inkubation zu erreichen.
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Tabelle
1. AGT-Inaktivierungsaktivität
von 6(4)-Benzyloxypyrimidin-Derivaten
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Zum
Vergleich betrug der ED50-Wert von O6-Benzylguanin 0,2 μM (Tabelle 1). Die substituierten
Pyrimidine 4-Amino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin (3a) und 2,4-Diamino-6-benzyloxypyrimidin
(3b) waren aktivere AGT-Inaktivierungsmittel, die dazwischen liegende
ED50-Werte von 28 bzw. 15 μM aufwiesen.
2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-brompyrimidin
(3f) war beträchtlich
aktiver als 3b, was darauf hinweist, dass Elektronen-ziehende Gruppen
an Position 5 eines 2,4-Diamino-6-benzyloxypyrimidin-Derivats einen positiven
Beitrag zur effizienten AGT-Inaktivierung leisten. Dies wird weiters
durch die sehr hohe Aktivität
unterstrichen, die 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin
(3d) und 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin (3e) zeigen, die stark Elektronen-ziehende
Nitroso- bzw. Nitro-substituenten
enthalten. Diese zwei Derivate sind die aktivsten AGT-Inaktivatoren,
die bis heute getestet wurden. Die Beobachtung, dass 2-Amino-4-benzyloxy-5-nitropyrimidin (5a)
viel aktiver ist als 3a, weist darauf hin, dass eine 2-Aminogruppe
für hohe
Aktivität
eines 6(4)-Benzyloxy-5-nitropyrimidin-Derivats maßgeblich
ist. Eine zusätzliche
Alkylgruppe an der 4(6)-Position (z.B. wie in 5b) steigert die Aktivität im Vergleich
zu 5a nicht auf signifikante Weise, obwohl eine Aminogruppe an der
4(6)-Position die
Aktivität
signifikant steigert. Somit steigt die AGT-Inaktivierungsaktivität in der
Serie 5a = 5b < 3d
= 3e wesentlich. Unter Berücksichtigung
dieser Überlegungen
scheint die Aktivität
von 2,4,5-Triamino-6-benzyloxypyrimidin (3e) außergewöhnlich zu sein, und die Ursachen
für diese
relativ hohe Aktivität
sind bis heute nicht geklärt.
Auch ist bedeutend, dass Pyrimidine 5a und 5b äußerst aktiv in Zellen sind,
was aufgrund ihrer entsprechenden Aktivität in HT29-Zellextrakten nicht
gänzlich
vorherzusehen ist.
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Die
Fähigkeit
zur Erhöhung
der Konzentrationen von 3c–e,
um das Töten
von menschlichen HT29-Dickdarmkarzinomzellen, DU-145-Prostatakarzinomzellen
und MCF-71-Brustkarzinomzellen durch BCNU (40 μM) zu fördern, ist in den Tabellen
2, 3 bzw. 4 dargestellt. Die Daten spiegeln die Anzahl an Zellkolonien
wider, die aus der Aussetzung gegenüber AGT-Inaktivator alleine
oder gegenüber
AGT-Inaktivator 2 Stunden vor Aussetzung gegenüber BCNU, beschrieben in Dolan
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5368–5372 (1990)), resultieren.
Die Daten für
O6-Benzylguanin sind zu Vergleichszwecken
ebenfalls dargestellt.
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In
Bezug auf die getesteten Pyrimidine war hinsichtlich einer Steigerung
von BCNU-Toxizität 2,4,5-Triamino-6-benzyloxypyrimidin
(3c) ebenso wirksam wie O6- Benzylguanin selbst,
obwohl die Nitroso- und Nitropyrimidinderivate (3d und 3e) bei einer
4fach geringeren Dosis ähnlich
wirksam waren.
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Tabelle
2. Töten
von HT-29-Dickdarmkarzinomzellen durch BCNU in Kombination mit AGT-Inaktivatoren
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Tabelle
3. Töten
von DU-145-Prostatakarzinomzellen durch BCNU in Kombination mit
AGT-Inaktivatoren
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Tabelle
4. Töten
von MCF-71-Brustkarzinomzellen durch BCNU in Kombination mit AGT-Inaktivatoren
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Obwohl
die menschliche Alkyltransferase sehr empfindlich gegenüber Inaktivierung
durch O6-Benzylguanin und den verschiedenen
zuvor beschriebenen Verbindungen ist, wurden zahlreiche Mutanten
gebildet, die gegenüber
O6-Benzylguanin resistent sind (Crone and
Pegg, Cancer Res. 53, 4750–4753
(1993)). Diese Resistenz wird möglicherweise
durch eine Reduktion des Raums verursacht, der die aktive Stelle
der Alkyltransferase umgibt, was zu einer Einschränkung des
Zugangs zu O6-Benzylguanin führt. Diese Mutanten werden
durch einzelne Basenänderungen
in der Alkyltransferase-DNA-Codiersequenz gebildet, was eine Veränderungen
von einer oder zwei Aminosäure(n)
in der Alkyltransferase hervorruft (Crone and Pegg, Cancer Res. 53,
4750–4753
(1993)). Somit verursacht, wie in Tabelle 5 angegeben, die Änderung
des Prolinrestes an Position 140 zu Alanin (Protein P140A) oder
des Glycinrestes an Position 156 zu einem Alanin (Protein G156A) eine
20fache bzw. eine 240fache Steigerung der Resistenz gegenüber O6-Benzylguanin. Die Alkyltransferase, die
ein Arginin anstelle eines Prolins an Rest 138 in Verbindung mit
einem Arginin anstelle eines Prolins an Rest 140 (Protein P138A/P140A)
aufweist, ist 88fach stärker
resistent gegenüber
Inaktivierung durch O6-Benzylguanin. Es
ist möglich,
dass solche resistenten Mutanten unter dem Selektionsdruck, der
durch die Behandlung mit O6-Benzylguanin
plus einem Alkylierungsmittel entsteht, in Tumoren auftreten oder
dafür ausgewählt werden.
Potentere Inhibitoren und/oder jene von geringerer Größe, die
besser in der Lage sind, in den Raum der aktiven Stelle der mutierten
Alkyltransferase zu passen, können
vorteilhaft verwendet werden, um dieser Resistenz beizukommen.
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Tabelle
5. Inhibition mutierter Alkyltransferaseproteine durch O
6-Benzylguanin oder 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin
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Wie
in Tabelle 5 gezeigt ist, war 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin
(3d) 50- bis 60fach
besser hinsichtlich der Inaktivierung der mutierten Alkyltransferasen
als O6-Benzylguanin. Dosen von 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin,
die zu intrazellulären
Konzentrationen über
5 μM führen, sind
daher zur Inaktivierung solcher resistenter Alkyltransferasen wirksam.
Konzentrationen über
200 μM von
O6-Benzylguanin würden erforderlich
sein, um solch eine Inaktivierung zu erlangen, und diese sind sehr
viel höher
als durch diese Verbindung in herkömmlichen Formulierungen erreicht
werden kann. Diese Daten in Bezug auf die Inaktivierung mutierter
Alkyltransferase und die Daten, die davor dargestellt wurden, weisen
darauf hin, dass Pyrimidinderivate, die Elektronen-ziehende Gruppen
an Position 5 aufweisen, bei der Verwendung als Adjuvanzien bei
Chemotherapien mit Wirkstoffen, deren Wirkungsmechanismus wie jener
von BCNU die Modifikation der O6-Position
von DNA-Guaninresten umfasst, bessere Eigenschaften aufweisen als
O6-Benzylguanin.
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Zusätzliche
2,4-Diamino-6-benzyloxypyrimidin-Derivate, die Elektronen-ziehende
Gruppen aufweisen, die keine Halogen- oder Nitrogruppen sind (z.B.
Formyl- oder Cyanogruppen), konnten auch leicht hergestellt werden.
2,4-Diamino-5-formyl-6-hydroxypyrimidin,
eine bekannte Verbindung (Delia & Otteman,
Heterocycles 20, 1805–1809
(1983)), kann mit Phosphoroxychlorid behandelt werden, sodass ein
2,4-Diamino-6-chlor-5-formylpyrimidin-Zwischenprodukt
gebildet wird, das unter Behandlung mit Natriumbenzyloxid in Benzylalkohol
2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-formylpyrimidin
produziert. Eine Behandlung des Formylpyrimidins mit Hydroxylamin
ergibt 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-cyanopyrimidin. Die Herstellung
einer großen
Anzahl von 5-substituierten 6(4)-Benzyloxypyrimidinen ist Fachleuten
im Bereich der Synthese von heterozyklischen aromatischen Verbindungen
möglich
(D. J. Brown, "The
Pyrimidines", in
The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Bd. 16, A. Weissberger
(Hrsg.), Wiley Interscience, New York (1962); D. J. Brown, "The Pyrimidines", Beilage I, in The
Chemistry of Heterocyclic Compounds, Bd. 16, A. Weissberger & E. C. Tayler
(Hrsg.), Wiley Interscience, New York (1970); J. H. Lister, "Fused Pyrimidines
Part II Purines",
in The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Bd. 24, Teil II, A.
Weissberger & E.
C. Taylor (Hrsg.), Wiley Interscience, New York (1971)).
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Die
O6-substituierten Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
einem Säugetier
zum Zweck der Steigerung der chemotherapeutischen Behandlung eines
bestimmten Karzinoms auf jegliche geeignete Art verabreicht werden.
Obwohl mehr als ein Weg verwendet werden kann, um eine bestimmte
Verbindung zu verabreichen, kann eine bestimmte Weise eine unmittelbarere
und wirksamere Reaktion hervorrufen als eine andere Methode. Demgemäß dienen
die hierin beschriebenen Verfahren als Beispiel und sind nicht als
Einschränkung
zu verstehen.
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Im
Allgemeinen werden die wie zuvor beschriebenen O6-substituierten
Verbindungen der vorliegenden Erfindung einer Person, die an einem
Karzinom erkrankt ist, in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung
verabreicht. Jene Personen, die einer Chemotherapie unterzogen werden
oder ihr bald unterzogen werden sollen, können mit O6-substituierten
Verbindungen, je nach Bedarf getrennt oder in Verbindung mit anderen
Behandlungen, behandelt werden. Bei therapeutischen Anwendungen
werden einem Patienten Zusammensetzungen in einer ausreichenden
Menge verabreicht, um eine wirksame Unterdrückung von AGT-Aktivität hervorzurufen,
wodurch die Zytotoxizität
der zuvor beschrieben chemotherapeutischen Behandlung verstärkt wird.
Eine angemessene Menge, um dies zu erreichen, ist als eine "therapeutisch wirksame
Dosis" definiert, die
ebenfalls eine "wirksame
AGT-inaktivierende Menge" ist.
Mengen, die für
einen therapeutischen oder prophylaktischen Zweck wirksam sind,
lassen sich z.B. aufgrund der Art und Schwere der behandelten Krankheit, des
Alters, des Gewichts und des allgemeinen Gesundheitszustandes eines
Patienten sowie des Urteils des die Behandlung verschreibenden Arztes
bestimmen. Das Ausmaß der
Dosis wird auch durch die ausgewählte O6-substituierte Verbindung, die Art der Verabreichung,
den Zeitplan und die Häufigkeit
der Verabreichung sowie das Bestehen, die Art und das Ausmaß jeglicher
negativer Nebenwirkungen, die mit der Verabreichung einer bestimmten
O6-substituierten
Verbindung einhergehen, und die erwünschte physiologische Wirkung
bestimmt. Fachleuten wird bekannt sein, dass verschiedene Erkrankungszustände längere Behandlungen
erfordern können,
die mehrfache Verabreichungen umfassen, eventuell auch unter Verwendung
einer Reihe verschiedener AGT-Inaktivatoren
und/oder chemotherapeutischer Wirkstoffe in jedem Verabreichungszyklus
oder nur in einzelnen Zyklen.
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Geeignete
chemotherapeutische Wirkstoffe, die zweckmäßig in Verbindung mit den O6-substituierten Verbindungen der vorliegenden
Erfindung verabreicht werden, umfassen Alkylierungsmittel, wie beispielsweise
chlorethylierende und methylierende Mittel. Solche Mittel können unter
Verwendung herkömmlicher
Verfahren verabreicht werden, wie jener, die in Wasserman et al.,
Cancer 36, 1258–1268
(1975), und Edward R. Barnhart (Hrsg.), Physicians' Desk Reference,
48. Auflage (1994), beschrieben werden. 1,3-Bis(2-chlorethyl)-1-nitrosoharnstoff
(Carmustin oder BCNU, Bristol-Myers, Evansville, IN) beispielsweise
kann intravenös
bei einer Dosierung von etwa 150 bis 200 mg/m2 alle
sechs Wochen verabreicht werden. Ein anderes Alkylierungsmittel, 1-(2-Chlorethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff
(Lomustin oder CCNU, Bristol-Myers) kann oral bei einer Dosierung
von etwa 130 mg/m2 alle sechs Wochen verabreicht
werden. Andere Alkylierungsmittel können in geeigneten Dosierungen über geeignete
Verabreichungswege, die erfahrenen Medizinern bekannt sind, verabreicht
werden.
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Geeignete
Dosen und Dosierungspläne
können
mittels herkömmlicher,
Bereichsabgrenzender Verfahren, die durchschnittlichen Fachleuten
bekannt sind, bestimmt werden. Im Allgemeinen wird die Behandlung mit
kleineren Dosierungen begonnen, die geringer sind als die optimale
Dosis der Verbindung. Hiernach wird die Dosierung in kleinen Schritten
erhöht,
bis die unter den gegebenen Rahmenbedingungen optimale Wirkung erreicht
wird. Das vorliegende Verfahren gemäß der Erfindung umfasst die
Verabreichung von etwa 0,1 μg
bis etwa 50 mg einer oder mehrerer der zuvor beschriebenen Verbindungen
pro kg Körpergewicht
der behandelten Person. Für
einen 70-kg-Patienten würden üblicherweise
eher Dosierungen von etwa 10 μg
bis etwa 200 mg einer O6-substituierten
Verbindung verwendet werden, möglicherweise
gefolgt von weiteren, geringeren Dosierungen von etwa 1 μg bis etwa
1 mg einer O6-substituierten Verbindung
in einer wochen- bis monatelangen Behandlung, wobei dies von der
jeweiligen physiologischen Reaktion eines Patienten abhängt, die
auf der Grundlage Karzinom-spezifischer Antigene oder anderer messbarer
Parameter, die in Verbindung mit der Tumorbelastung eines Patienten
stehen, bestimmt wird.
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Es
muss berücksichtigt
werden, dass Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung im Allgemeinen in schweren Erkrankungszuständen verwendet
werden, das bedeutet in lebensbedrohenden oder möglicherweise lebensbedrohenden
Situationen. In solchen Fällen
ist es hinsichtlich der Minimierung fremder Substanzen und der relativ
nichttoxischen Eigenschaft der O6-substituierten
Verbindungen möglich
und kann auch vom behandelnden Arzt als wünschenswert empfunden werden,
wesentlich überschüssige Mengen
dieser O6-substituierten Verbindungen zu
verabreichen.
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Einzelne
oder mehrfache Verabreichungen der Verbindungen können mit
Dosierungskonzentrationen und -mustern durchgeführt werden, die durch den behandelnden
Arzt bestimmt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen
Formulierungen eine Menge AGT-inaktivierender Verbindungen der Erfindung
bereitstellen, die ausreichend ist, um die zytotoxische Wirkung
der Chemotherapie wirksam zu verstärken.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen zur therapeutischen Behandlung
sind für
parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung konzipiert
und umfassen im Allgemeinen einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und
eine ausreichende Menge des Wirkstoffs, um die Aktivität des AGT-Proteins
zu reduzieren und vorzugsweise zu unterbinden. Der Träger kann
aus jenen herkömmlich
verwendeten Trägern
beliebig ausgewählt
sein und ist nur durch chemisch-physikalische Überlegungen eingeschränkt, wie
beispielsweise Löslichkeit
und Mangel an Reaktivität
mit der Verbindung, sowie durch die Art der Verabreichung.
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Beispiele
pharmazeutisch annehmbarer Säureadditionssalze
zur Verwendung in der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung
der Erfindung umfassen jene, die von anorganischen Säuren, wie
Salzsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Phosphorsäure,
Metaphosphorsäure,
Salpetersäure
und Schwefelsäure,
und von organischen Säuren,
wie Weinsäure,
Essigsäure,
Zitronensäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Glykolsäure, Gluconsäure, Bernsteinsäure, p-Toluolsulfonsäure und
Arylsulfonsäure,
abgeleitet sind.
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Die
hierin beschriebenen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, beispielsweise
Vehikel, Adjuvanzien, Träger
oder Verdünnungsmittel,
sind Fachleuten bekannt und für
die Öffentlichkeit
leicht zugänglich.
Vorzugsweise ist der pharmazeutisch annehmbare Träger einer,
der gegenüber
den aktiven Verbindungen chemisch inert ist, und einer, der unter
den Rahmenbedingungen der Verwendung keine negativen Nebenwirkungen
oder Toxizität
aufweist. Solche pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger umfassen
vorzugsweise Salzlösung
(z.B. 0,9%ige Salzlösung),
Cremophor EL (das ein Derivat von Rizinusöl und Ethylenoxid ist, erhältlich bei
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (z.B. 5% Cremophor EL/5% Ethanol/90%
Salzlösung,
10% Cremophor EL/90% Salzlösung
oder 50% Cremophor EL/50% Ethanol), Propylenglykol (z.B. 40% Propylenglykol/10%
Ethanol/50% Wasser), Polyethylenglykol (z.B. 40% PEG 400/60% Salzlösung) und
Alkohol (z.B. 40% t-Butanol/60%
Wasser). Der am meisten bevorzugte pharmazeutische Arzneimittelträger zur
Verwendung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung ist Polyethylenglykol,
wie beispielsweise PEG 400, und insbesondere eine Zusammensetzung,
die 40% PEG 400 und 60% Wasser oder Salzlösung umfasst.
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Die
Auswahl des Arzneimittelträgers
wird teilweise aufgrund der bestimmten O6-substituierten Verbindung
sowie des bestimmten Verfahrens getroffen, das zur Verabreichung
der Zusammensetzung verwendet wird. Demgemäß gibt es eine breite Palette
an geeigneten Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung.
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Die
folgenden Formulierungen zur oralen, parenteralen, subkutanen, intravenösen, intraarteriellen,
intramuskulären,
intraperitonealen, rektalen und vaginalen Verabreichung sowie zur
Verabreichung als Aerosol dienen nur als Beispiele und nicht als
Einschränkung.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können parenteral, z.B. intravenös, intraarteriell,
subkutan, intradermal oder intramuskulär, verabreicht werden. So stellt
die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bereit,
die eine Lösung
der O6-substituierten Verbindung, aufgelöst oder
suspendiert in einem annehmbaren Träger, der zur parenteralen Verabreichung
geeignet ist, umfassend wässrige
und nicht-wässrige,
isotonische sterile Injektionslösungen,
umfassen.
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Im
Allgemeinen sind die Erfordernisse für wirksame pharmazeutische
Träger
für parenterale
Zusammensetzungen durchschnittlichen Fachleuten bekannt. Siehe Banker & Chalmers (Hrsg.),
Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia,
PA, 238–250
(1982), und Toissel, ASHP Handbook on Injectable Drugs, 4. Auflage,
622–630
(1986). Solche Lösungen
können
Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Gelöststoffe enthalten, die die
Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten isotonisch machen,
sowie wässrige
und nicht-wässrige sterile
Suspensionen, die Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel,
Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen können. Die
Verbindung kann in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel
in einem pharmazeutischen Träger,
wie beispielsweise in sterilen Flüssigkeiten. oder Flüssigkeitsgemischen,
umfassend Wasser, Salzlösung,
wässrige
Dextrose und verwandte Zuckerlösungen,
einen Alkohol wie Ethanol, Isopropanol oder Hexadecylalkohol, Glykole
wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, Dimethylsulfoxid, Glycerinketale
wie 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, Ether wie Poly(ethylenglykol)
400, ein Öl,
eine Fettsäure,
einen Fettsäureester
oder ein Fettsäureglycerid
oder ein acetyliertes Fettsäureglycerid
mit oder ohne Zusatz eines pharmazeutisch annehmbaren Tensids wie
beispielsweise Seife oder Detergens, Suspensionsmittel wie Pektin,
Carbomere, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose
oder Emulgatoren und andere pharmazeutische Adjuvanzien, verabreicht
werden.
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Öle, die
in parenteralen Formulierungen nützlich
sind, umfassen Mineralöl,
tierische, pflanzliche oder synthetische Öle. Spezifische Beispiele für Öle, die
in solchen Formulierungen nützlich
sind, umfassen Erdnuss-, Sojabohnen-, Sesam-, Baumwollsamen-, Mais-
und Olivenöl,
Petrolat und Mineralöl.
Geeignete Fettsäuren
zur Verwendung in parenteralen Formulierungen umfassen Oleinsäure, Stearinsäure und
Isostearinsäure.
Ethyloleat und Isopropylmyristat sind Beispiele für geeignete
Fettsäureester.
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Geeignete
Seifen zur Verwendung in parenteralen Formulierungen umfassen Alkalimetall-,
Ammonium- und Triethanolaminfettsalze, und geeignete Detergenzien
umfassen (a) kationische Detergenzien wie beispielsweise Dimethyldialkylammoniumhalogenide
und Alkylpyridiniumhalogenide, (b) anionische Detergenzien wie beispielsweise
Alkyl-, Aryl- und Olefinsulfonate, Alkyl-, Olefin-, Ether- und Monoglyceridsulfate
und Sulfosuccinate, (c) nichtionische Detergenzien wie beispielsweise
Fettaminoxide, Fettsäurealkanolamide
und Polyoxyethylen-Polypropylen-Copolymere,
(d) amphotere Detergenzien wie beispielsweise Alkyl-β-aminopropionate und
quartäre
2-Alkylimidazolinammoniumsalze und (e) Gemische davon.
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Die
parenteralen Formulierungen enthalten typischerweise von etwa 0,5
Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% des Wirkstoffs in Lösung. Konservierungsstoffe
und Puffer können
verwendet werden. Um Irritationen an der Injektionsstelle zu minimieren
oder zu vermeiden, können
solche Zusammensetzungen ein oder mehrere nichtionische Tenside
enthalten, die eine Hydrophil-Lipophil-Wert (HLB) von etwa 12 bis
etwa 17 aufweisen. Die Menge an Tensid in solchen Formulierungen
liegt typischerweise im Bereich von etwa 5 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-%.
Geeignete Tenside umfassen Polyethylensorbitanfettsäureester
wie beispielsweise Sorbitanmonooleat und die hochmolekularen Addukte
von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, gebildet durch die Kondensation
von Propylenoxid mit Propylenglykol. Die parenteralen Formulierungen
können
in abgedichteten Einheitsdosen- oder in Mehrfachdosen-Behältern, wie
Ampullen und Phiolen, bereitgestellt und in gefriergetrocknetem
(lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, was lediglich den Zusatz
des sterilen Flüssigarzneimittelträgers, beispielsweise
Wasser, für
Injektionen unmittelbar vor der Verabreichung erfordert. Improvisierte
Injektionslösungen
und -suspensionen können
aus sterilen Pulvern, Körnchen
und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
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Topische
Formulierungen, umfassend jene, die zur transdermalen Wirkstofffreisetzung
nützlich
sind, sind Fachleuten bekannt und im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung zur Anwendung auf der Haut geeignet.
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Zur
oralen Verabreichung geeignete Formulierungen erfordern in Anbetracht
der Peptidyl- und/oder Kohlenhydrat-Eigenschaft mancher der O6-substituierten Verbindungen der vorliegenden
Erfindung und des wahrscheinlichen Abbaus davon zusätzliche Überlegungen,
sofern solche Verbindungen oral verabreicht werden, ohne sie gegen
die Verdauungssekrete des Magen-Darm-Trakts zu schützen. Solch
eine Formulierung kann aus (a) flüssigen Lösungen, wie beispielsweise
einer wirksamen Menge der Verbindung, aufgelöst in Verdünnungsmitteln wie Wasser, Salzlösung oder
Orangensaft; (b) Kapseln, Säckchen,
Tabletten, Pastillen und Pillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge
an aktivem Wirkstoff in Form von Festkörpern oder Körnchen enthalten;
(c) Pulvern; (d) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit;
und (e) geeigneten Emulsionen bestehen. Flüssige Formulierungen können Verdünnungsmittel
wie Wasser und Alkohole, beispielsweise Ethanol, Benzylalkohol und
die Polyethylenalkohole, entweder mit oder ohne Zusatz eines pharmazeutisch
annehmbaren Tensids, Suspensionsmittel oder Emulgatoren einbinden.
Kapseln können
in Form vom herkömmlichen hart-
oder weichschaligen Gelatine-Typ bereitgestellt werden, die beispielsweise
Tenside, Gleitmittel und inerte Füllstoffe wie Lactose, Saccharose,
Calciumphosphat und Maisstärke
enthalten. Tablettenformen können
einen oder mehrere Bestandteile, ausgewählt aus Lactose, Saccharose,
Mannit, Maisstärke,
Kartoffelstärke,
Alginsäure,
mikrokristalline Zellulose, Akazin, Gelatine oder Guaran, kolloidales
Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium,
Talk, Magnesiumstearat, Calciumstearat, Zinkstearat, Stearinsäure und
anderen Arzneimittelträgern,
Farbstoffen, Verdünnungsmitteln,
Puffersubstanzen, Zersetzungsmitteln, Befeuchtungsmitteln, Konservierungsmitteln,
Geschmacksstoffen und pharmakologisch kompatiblen Arzneimittelträgern, umfassen.
Pastillenformen können
den Wirkstoff in einem Geschmacksträger, üblicherweise Saccharose und
Akazin oder Tragant, umfassen oder können Pastillen sein, die den
Wirkstoff in einer inerten Grundsubstanz wie Gelatine und Glycerin
oder Saccharose und Akazin, in Emulsionen, Gelen und dergleichen
umfassen, die zusätzlich
zum Wirkstoff Arzneimittelträger,
wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, enthalten.
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Die
O6-substituierten Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können,
alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten,
zu Aerosol-Formulierungen umgesetzt werden, die über Inhalation verabreicht
und aufgenommen werden. Die Verbindungen werden vorzugsweise in
feinzerteilter Form zusammen mit einem Tensid und einem Treibmittel
bereitgestellt. Typische Prozentsätze für die aktive Verbindung liegen im
Bereich von 0,01 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorzugsweise von 1 Gew.-%
bis 10 Gew.-%. Das Tensid muss natürlich nichttoxisch und vorzugsweise
im Treibmittel löslich
sein. Beispiele für
solche Tenside sind Ester oder Partialester von Fettsäuren, die
6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie beispielsweise Capronsäure, Octansäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Olesterinsäure und
Oleinsäure,
mit einem mehrwertigen aliphatischen Alkohol oder seinem zyklischen
Anhydrid. Gemischte Ester, wie gemischte oder natürliche Glyceride,
können
verwendet werden. Das Tensid kann sich auf 0,1 Gew.-% bis 20 Gew.-% der Zusammensetzung,
vorzugsweise auf 0,25 bis 5 Gew.-%, belaufen. Der Rest der Zusammensetzung
ist üblicherweise
Treibmittel. Ein Träger
kann, wie erwünscht,
auch eingebunden sein, z.B. Lecithin für intranasale Verabreichung.
Diese Aerosol-Formulierungen können
in annehmbare, unter Druck gesetzte Treibmittel, wie beispielsweise
Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen, eingebracht
werden. Sie können auch
als Pharmazeutika für
nicht unter Druck stehende Präparate
formuliert werden, wie beispielsweise in einem Vernebler oder Zerstäuber. Solche
Spray-Formulierungen können
verwendet werden, um Schleimhäute zu
besprühen.
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Darüber hinaus
können
die Verbindungen und Polymere, die in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung nützlich
sind, in Form von Suppositorien durch Vermischen mit verschiedenen
Grundsubstanzen, wie emulgierenden oder wasserlöslichen Grundsubstanzen, bereitgestellt
werden. Geeignete Formulierungen zur vaginalen Verabreichung können in
Form von Pessaren, Tampons, Cremen, Gelen, Pasten, Schäumen oder Spray-Formulierungen,
die zusätzlich
zum Wirkstoff Träger
enthalten, die auf dem Gebiet der Erfindung als geeignet bekannt
sind, bereitgestellt werden.
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Die
Konzentration der O6-substituierten Verbindungen
der vorliegenden Erfindung in den pharmazeutischen Formulierungen
können
stark variieren, d.h. von weniger als etwa 1 Gew.-%, üblicherweise
bei oder zumindest etwa 10 Gew.-%, bis hin zu 20 bis 50 Gew.-% oder
mehr, und wird in erster Linie aufgrund der Flüssigkeitsvolumina, der Viskosität usw. in
Abstimmung mit der bestimmten Art der Verabreichung ausgewählt.
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So
könnte
eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion
so beschaffen sein, dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und
100 mg der O6-substituierten Verbindung
enthält.
Tatsächliche Verfahren
zur Herstellung parenteral verabreichbarer Verbindungen sind Fachleuten
bekannt oder einsichtig und werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical
Science (17. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985))
näher beschrieben.
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Fachleuten
wird bekannt sein, dass, zusätzlich
zu den zuvor beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die
O6-substituierten Verbindungen des vorliegenden
erfindungsgemäßen Verfahrens
als Einschlusskomplexe, wie beispielsweise Cyclodextrin-Einschlusskomplexe,
oder Liposomen formuliert werden können. Liposomen dienen dazu,
die Verbindungen auf ein bestimmtes Gewebe, wie beispielsweise lymphatisches
Gewebe oder kanzeröse
Leberzellen, zu richten. Liposomen können auch verwendet werden,
um die Halbwertszeit der O6-substituierten Verbindung
zu verlängern.
Liposomen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
umfassen Emulsionen, Schäume,
Mizellen, unlösliche
Monolayer, Flüssigkristalle, Phospholipid-Dispersionen,
lamellare Schichten und dergleichen. In diesen Präparaten
ist die freizusetzende O6-substituierte
Verbindung als Teil eines Liposoms, alleine oder in Verbindung mit
einem geeigneten chemotherapeutischen Mittel, eingebunden. Somit
können
Liposomen, die mit einer erwünschten
O6-substituierten Verbindung der Erfindung
gefüllt
sind, auf die Stelle eines bestimmten Gewebetyps, Leberzellen beispielsweise,
gerichtet werden, wo die Liposomen dann die ausgewählten Zusammensetzungen
zur Verstärkung
der Chemotherapie freigeben. Liposomen zur Verwendung im Rahmen
der Erfindung werden aus herkömmlichen Bläschen-bildenden
Lipiden gebildet, die im Allgemeinen neutrale und negativ geladene
Phospholipide und ein Sterin wie beispielsweise Cholesterin umfassen.
Die Auswahl der Lipide erfolgt im Allgemeinen unter Berücksichtigung
von beispielsweise Liposomengröße und Stabilität der Liposomen
im Blutkreislauf. Zahlreiche Verfahren sind zur Herstellung von
Liposomen erhältlich,
wie beispielsweise in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9,
467 (1980), und den US-Patenten 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028
und 5.019.369 beschrieben wird. Um das Liposom auf die Zellen eines
bestimmten Gewebetyps zu richten, kann ein Ligand, der in das Liposom
einzubinden ist, beispielsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen,
die spezifisch für
Zelloberflächen-Determinanten
des Zielgewebetyps sind. Eine Liposomsuspension, die eine O6-substituierte Verbindung enthält, kann
intravenös,
lokal, topisch usw. in einer Dosis verabreicht werden, die je nach
Art der Verabreichung, der bereitgestellten O6-substituierten
Verbindung, dem Stadium der behandelten Erkrankung usw. variiert.
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Wenn
auch die Wirksamkeit der O6-substituierten
Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Bezug auf bestimmte Typen
von Karzinomzellen, z.B. Dickdarm-, Prostata- und Brustkarzinomzellen,
gezeigt wurde, ist die vorliegende Erfindung dennoch auf die Behandlung
aller Karzinomarten anwendbar, die mit einem antineoplastischen
Alkylierungsmittel behandelt werden können, das zytotoxische Läsionen an
der O6-Position von Guanin verursacht. Solche
Karzinome umfassen beispielsweise Dickdarmkarzinome, Prostatakarzinome, Hirntumoren,
Lymphome, Arten der Leukämie,
Brustkarzinome, Ovarialkarzinome, Lungentumoren, Wilms Tumor, Rhabdomyosarkom,
multiples Myelom, Magentumoren, Weichteilsarkome, Hodgkin-Krankheit
und Non-Hodgkin-Lymphome.
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Demähnlich können hinsichtlich
der Wirkungsart der O6-substituierten Verbindungen
der vorliegenden Erfindung solche Verbindungen in Kombination mit
jeder beliebigen Art antineoplastischer Alkylierungsmittel verwendet
werden, die zytotoxische Läsionen
an der O6-Position von Guanin verursachen.
Solche antineoplastischen Alkylierungsmittel umfassen beispielsweise
Chlorethylierungsmittel (z.B. Chlorethylnitrosoharnstoffe und Chlorethyltriazine)
und monofunktionelle Alkylierungsmittel wie Streptozotocin, Procarbazin,
Dacarbazin und Temozolomid.
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Unter
den Chlorethylierungsmitteln sind die am häufigsten verwendeten chemotherapeutischen
Wirkstoffe 1-(2-Chlorethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff (CCNU,
Lomustin), 1,3-Bis(2-chlorethyl)-1-nitrosoharnstoff (BCNU, Carmustin),
1-(2-Chlorethyl)-3-(4-methylcyclohexyl)-1-nitrosoharnstoff
(MeCCNU, Semustin) und 1-(2-Chlorethyl)-3-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-1-nitrosoharnstoff
(ACNU). Diese Mittel wurden bereits klinisch gegen Tumoren des zentralen
Nervensystems, multiple Myelomen, Melanom, Lymphom, Magen-Darm-Tumoren
und andere feste Tumoren zum Einsatz gebracht (Colvin & Chabner, Alkylating
Agents; in: Cancer Chemotherapy: Principles and Practice, Chabner & Collins (Hrsg.),
Lippincott, Philadelphia, 276–313
(1990); McCormick & McElhinney,
Eur. J. Cancer 26, 207–221
(1990)). Chlorethylierungsmittel, die zur Zeit untersucht werden,
mit geringeren Nebenwirkungen sind 1-(2-Chlorethyl)-3-(2-hydroxyethyl)-1-nitrosoharnstoff
(HECNU), 2-Chlorethylmethylsulfonylmethansulfonat (Clomesone) und
1-[N-(2-Chlorethyl)-N-nitrosoureido]ethylphosphonsäurediethylester
(Fotemustin) (Colvin & Chabner,
Alkylating Agents; in: Cancer Chemotherapy: Principles and Practice,
Chabner & Collins
(Hrsg.), Lippincott, Philadelphia, 276–313 (1990); McCormick & McElhinney, Eur.
J. Cancer 26, 207–221
(1990)). Methylierende chemotherapeutische Mittel umfassen Streptozotocin
(2-Desoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido)-D-glucopyranose),
Procarbazin (N-(1-methylethyl)-4-[(2-methylhydrazino)methyl]benzamid), Dacarbazin
oder DTIC (5-(3,3-Dimethyl-1-triazenyl)-1H-imidazol-4-carboxamid)
und Temozolomid (8-Carbamoyl-3-methylimidazo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-on).
Temozolomid ist wirksam gegen maligne Melanome, Hirntumoren und
Mycosis fungoides. Streptozotocin ist wirksam gegen Bauchspeicheldrüsentumoren.
Procarbazin wird zur Behandlung der Hodgkin-Krankheit und von Hirntumoren verwendet,
und DTIC wird eingesetzt, um Melanome und Lymphome zu behandeln
(Colvin & Chabner,
Alkylating Agents; in: Cancer Chemotherapy: Principles and Practice,
Chabner & Collins
(Hrsg.), Lippincott, Philadelphia, 276–313 (1990); Longo, Semin.
Concol. 17, 716–735
(1990)).
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Die
nachstehenden Beispiele beschreiben die Synthesen der zuvor beschriebenen
Verbindungen. In Bezug auf die Verfahren und Materialien, die in
diesen Beispielen beschrieben werden, ist zu erwähnen, dass 1H-NMR-Spektren
auf einem Spektrometer VXR 500S von Varian mit 2/110-Datenstation
von Sun oder einem Varian-XL-200-Instrument,
das an ein Advanced Data System angeschlossen war, aufgenommen wurden. Proben
wurden in DMSO-d6 mit Me4Si
als internem Standard aufgelöst.
EI-Massenspektren wurden an einem VG-Micromass-ZAB-2F-Spektrometer mit
umgekehrter Geometrie erhalten, das an ein VG-2035-Datensystem angeschlossen
war. Elementaranalysen wurden durch Galbraith Laboratories, Inc.,
Knoxville, TN, durchgeführt.
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Die
meisten Reagenzien und Lösungsmittel
stammten von Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI. 2,4-Diamino-6-benzyloxypyrimidin
(3b) (Pfleiderer & Lohrmann,
Chem. Ber. 94, 12–18
(1961)), 2,4,5-Triamino-6-benzyloxypyrimidin (3c) (Pfleiderer & Lohrmann, Chem.
Ber. 94, 12–18
(1961)), 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitrosopyrimidin (3d) (Pfleiderer & Lohrmann, Chem.
Ber. 94, 12–18
(1961)), 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin
(3e) (Kosary et al., Acta Pharm. Hung. 49, 241–247 (1989)), 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-brompyrimidin
(3f) (Kosary et al., Acta Pharm. Hung. 49, 241–247 (1989)) und 4-Amino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin
(3a) wurden bereits davor hergestellt. Alternative Syntheseverfahren
sind nachstehend für
manche dieser Verbindungen zusammen mit spektroskopischen Daten,
die nicht im Vorfeld bereitgestellt waren, präsentiert. Untersuchungen zur
AGT-Inaktivierung wurden wie in Moschel et al., J. Med. Chem. 35, 4486–4491 (1992),
beschrieben durchgeführt.
Experimente zum Zelltöten,
die verschiedene AGT-Inaktivatoren in Kombination mit BCNU einbanden,
wurden wie in Dolan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5368–5372 (1990))
beschrieben durchgeführt.
Zellen waren 2 Stunden lang mit AGT-Inaktivator behandelt worden,
bevor sie BCNU ausgesetzt wurden.
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Beispiel 1: 4-Amino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin
(3a)
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4-Amino-6-chlor-5-nitropyrimidin
(Boon et al., J. Chem. Soc., 96–102
(1951)) (1,5 g, 8,6 mmol) wurde einer Lösung von Natrium (0,23 g, 9,9
mmol) in Benzylalkohol (14 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde in einem Ölbad mit
130°C 3,5
Stunden lang erhitzt und in Benzol (50 ml) gegossen. Ein gelber
Feststoff wurde durch Filtration erhalten und mit Benzol gewaschen.
Das Kristallisieren aus Benzol/Ether ergab eine analytisch reine Probe
von 3a: Ausbeute 0,71 g (34%), Schmelzpunkt 149–150°C; UV (pH 1) λmax 284
nm (ε =
0,368 × 104), 333 (0,488 × 104);
(pH 6,9) 284 (0,329 × 104), 336 (0,470 × 104);
(pH 13) 290 (0,344 × 104), 333 (0,49 × 104); 1H-NMR δ 5,50
(s, 2H, ArCH2), 7,33–7,49 (m, 5H, ArH), 8,12–8,24 (br
d, 2H, NHa und NHb,
Austausch mit D2O), 8,24 (s, 1H, H-2); MS
(EI) ber. m/z für
C11H10N4O3 246,0752, gefunden 246,0751; Anal. (C11H10N4O3) C, H, N.
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Beispiel 2: 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-nitropyrimidin
(3e)
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2,4-Diamino-6-chlor-5-nitropyrimidin
(O'Brien et al.,
J. Med. Chem. 9, 573–575
(1966)) (1,0 g, 5,28 mmol) wurde einer Lösung von Natrium (0,14 g, 6,08
mmol) in Benzylalkohol (9 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde in einem Ölbad mit
160°C 3,5
Stunden lang erhitzt, und das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck abgedampft, um einen gelben Feststoff
zu erhalten. Dieser Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
Das Kristallisieren aus Benzol/Ether ergab einen blassgelben filamentösen Feststoff:
Ausbeute 0,69 g (50%); Schmelzpunkt 194–195°C (171°C; Kosary et al., Acta. Pharm.
Hung. 49, 241–247
(1989)); UV (pH 1) λmax 236 nm (sh) (ε = 1,452 × 104),
264 (0,522 × 104), 321 (1,294 × 104);
(pH 6,9) 242 (sh) (0,965 × 104), 337 (1,493 × 104);
(pH 13) 242 (sh) (0,952 × 104), 338 (1,479 × 104); 1H-NMR δ 5,43
(s, 2H, ArCH2), 7,26 (br s, 2H, NH2, Austausch mit D2O), 7,33–7,51 (m,
5H, ArH), 7,93 (br s, 2H, NH2, Austausch
mit D2O); MS (EI) ber. m/z für C11H11N5O3 261,0861, gefunden 261,0866; Anal. (C11H11N5O3).
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Beispiel 3: 2,4-Diamino-6-benzyloxy-5-brompyrimidin
(3f)
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2,4-Diamino-5-brom-6-chlorpyrimidin
(Phillips et al., J. Org. Chem. 29, 1488–1490 (1963)) (2,3 g, 10 mmol)
wurde einer Lösung
von Natrium (0,29 g, 12,5 mmol) in Benzylalkohol (10 ml) unter Argon
zugesetzt. Die Lösung
wurde in einem Ölbad
mit 130°C
3 Stunden lang erhitzt, und der Benzylalkohol wurde unter reduziertem
Druck abgedampft, um einen weißen
Feststoff zu erhalten. Dieser Feststoff wurde mit Wasser gewaschen
und luftgetrocknet. Das Kristallisieren aus 50% wässrigem
Ethanol ergab weiße
Nadelkristalle von 3f: Ausbeute 2,32 g (76%); Schmelzpunkt 165–166°C (Lit. 136°C; Kosary
et al., Acta Pharm. Hung. 49, 241–247 (1989)); UV (pH 1) λmax 236
nm (ε =
0,873 × 104), 291 (1,388 × 104);
(pH 6,9) 236 (0,850 × 104), 277 (0,835 × 104);
(pH 13) 234 (0,869 × 104), 277 (0,827 × 104); 1H-NMR δ 5,30
(s, 2H, ArCH2), 6,15 (s, 2H, NH2,
Austausch mit D2O), 6,32 (s, 2H, NH2, Austausch mit D2O),
7,31–7,45
(m, 5H, ArH); MS (EI) ber. m/z für
C11H11N4O79Br 294,0115, gefunden 294,0127; ber. m/z
for C11H11N4O81Br 296,0094,
gefunden 296,0083; Anal. (C11H11N4OBr) C, H, N.
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Beispiel 4: 2-Amino-4-chlor-5-nitropyrimidin
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Eine
Suspension von 2-Amino-4-hydroxy-5-nitropyrimidin (5,0 g, 32,1 mmol)
in Phosphoroxychlorid (100 ml) wurde über Nacht unter Rückfluss
erhitzt, und das überschüssige Phosphoroxychlorid
wurde unter reduziertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit Eis (100
g) in einem Eisbad vermischt, und das Gemisch wurde mit konzentrierter
wässriger
Natriumcarbonatlösung
neutralisiert. Ein gelber Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt
und mit Wasser gewaschen: Ausbeute 1,39 g (25%); Schmelzpunkt 191–194°C Zersetzung; 1H-NMR δ 8,45
(br s, 2H, NH2, Austausch mit D2O),
9,03 (s, 1H, H-6); MS (EI) ber. m/z für C4H3N4O2 35Cl 173,9944, gefunden 173,9934; ber. m/z
für C4H3N4O2 37Cl 175,9915, gefunden
175,9916.
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Beispiel 5: 2-Amino-4-benzyloxy-5-nitropyrimidin
(5a)
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2-Amino-4-chlor-5-nitropyrimidin
(0,70 g, 4,0 mmol) wurde einer Lösung
von Natrium (0,12 g, 5,2 mmol) in Benzylalkohol (8 ml) unter Argon
zugesetzt. Die Lösung
wurde in einem Ölbad
bei 130°C
3 Stunden lang erhitzt, und etwa die Hälfte des Benzylalkohols wurde
unter reduziertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde unter konstantem
Rühren
10 Minuten lang in Wasser (50 ml) gegossen. Nach Neutralisation
mit Eisessig bildete sich ein brauner Niederschlag, der durch Filtration
gesammelt und mit Wasser gewaschen wurde. Dieser Feststoff wurde
aus Benzol kristallisiert, um 5a in Form eines goldenen kristallinen
Feststoffs zu bilden: Ausbeute 126 mg (13%); Schmelzpunkt 164–167°C; UV (pH
1) λmax 262 nm (ε = 0,879 × 104),
295 (sh) (0,571 × 104); (pH 6,9) 235 (sh) (0,448 × 104), 273 (0,360 × 104),
326 (1,085 × 104); (pH 13) 273 (0,404 × 104), 327
(1,055 × 104); 1H-NMR δ 5,51 (s,
2H, ArCH2), 7,35–7,54 (m, 5H, ArH), 8,05 (d,
2H, NH2, Austausch mit D2O),
8,92 (s, 1H, H-6); MS (EI) ber. m/z für C11H10N4O3 246,0752,
gefunden 246,0758; Anal. (C11H10N4C3) C, H, N.
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Beispiel 6: 2-Amino-4-benzyloxy-6-methyl-5-nitropyrimidin
(5b)
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2-Amino-4-chlor-6-methyl-5-nitropyrimidin
(Boon et al., J. Chem. Soc., 96–102
(1951)) (1,24 g, 6,58 mmol) wurde einer Lösung von Natrium (0,21 g, 9,13
mmol) in Benzylalkohol (14 ml) unter Argon zugesetzt. Die Lösung wurde
in einem Ölbad
bei 130°C
3,5 Stunden lang erhitzt und 10 Minuten lang unter ständigem Rühren in
Wasser (70 ml) gegossen. Nach Neutralisation mit Eisessig bildete
sich ein gelber Niederschlag, der durch Filtration gesammelt und
mit Wasser gewaschen wurde. Dieser Feststoff wurde aus Benzol kristallisiert, um
5b in Form eines hellgelben kristallinen Feststoffs zu bilden: Ausbeute
0,57 g (33%); Schmelzpunkt 159–160°C; UV (pH
1) λmax 268 nm (ε = 0,783 × 104),
345 (sh) (0,104 × 104); (pH 6,9) 282 (0,564 × 104),
345 (sh) (0,338 × 104); (pH 13) 282 (0,549 × 104);
345 (sh) (0,332 × 104); 1H-NMR δ 2,35 (s,
3H, CH3), 5,44 (s, 2H, ArCH2),
7,34–7,46
(m, 5H, ArH) 7,64 (b s, 2H, NH2, Austausch
mit D2O); MS (EI) ber. m/z für C12H12N4O3 260,0908, gefunden 260,0913; Anal. (C12H12N4O3) C, H, N.