DE69520959T2 - Isolierte von tumor abstossenden vorläufer antigen mage-2 abgeleitete peptide und deren verwendung - Google Patents

Isolierte von tumor abstossenden vorläufer antigen mage-2 abgeleitete peptide und deren verwendung

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Universiteit Leiden
Ludwig Institute for Cancer Research New York
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Description

    BEREICH DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Immungenetik und Peptidchemie. Im besonderen bezieht sie sich auf Nonapeptide, die auf verschiedene Arten nützlich sind, einschließlich Immunogenen und als Liganden für HLA-A2- Moleküle. Im besonderen bezieht sie sich auf ein sogenanntes "tumorabstoßendes Antigen", das vom Vorläufer des tumorabstoßenden Antigens, der durch das Gen MAGE-2 kodiert und das HLA-A2-Molekül der Klasse 3 präsentiert ist, abgeleitet ist.
    • HINTERGRUND UND BISHERIGER STAND DER TECHNIK
  • Die Untersuchung der Erkennung oder Nichterkennung von Krebszellen durch einen Wirtsorganismus ist in viele verschiedene Richtungen gegangen. Ein Verständnis des Gebiets setzt ein gewisses Verständnis grundlegender Immunologie und Onkologie voraus.
  • Frühe Forschungen an Mäusetumoren ergaben, daß diese Moleküle aufwiesen, die bei der Transplantation in syngenetische Tiere zum Abstoßen von Tumorzellen führten. Diese Moleküle werden von den T- Zellen des Empfängertiers "erkannt" und rufen eine zytolytische Reaktion der T-Zellen mit einer Lyse der transplantierten Zellen hervor. Dieser Beweis wurde zuerst anhand von Tumoren erhalten, die in vitro mit chemischen Karzinogenen wie Methylcholanthren induziert wurden. Die von den Tumoren dargestellten Antigene, welche die Reaktion der T-Zelle hervorriefen, waren bei jedem Tumor verschieden. Vergleiche Prehn, et al., J. Natl. Canc. Inst. 18: 769-778 (1957); Klein et al., Cancer Res. 20: 1561-1572 (1960); Gross, Cancer Res. 3: 326-333 (1943), Basombrio, Cancer Res. 30: 2458-2462 (1970) für allgemeine Lehrmeinung über das Induzieren von Tumoren mit chemischen Karzinogenen und Unterschiede der Antigene in der Zellenoberfläche. Diese Klasse von Antigenen ist als "tumorspezifische Transplantationsantigene" oder "TSTA" bekannt. Im Anschluß an die Beobachtung der Präsentation solcher Antigene, nachdem sie mit chemischen Karzinogenen induziert wurden, wurden ähnliche Ergebnisse bei Tumoren, die in vitro über Ultraviolettstrahlung induziert worden waren, erhalten. Vergleiche Kripke, J. Natl. Canc. Inst. 53: 333-1336 (1974).
  • Während durch T-Zellen vermittelte Immunreaktionen für die oben beschriebenen Tumortypen beobachtet werden konnten, erwiesen sich spontane Tumoren im allgemeinen als nicht immunogen. Aus diesem Grund wurde angenommen, daß sie nicht Antigene präsentieren, die in dem tumorbehafteten Versuchsobjekt eine Reaktion auf den Tumor hervorriefen. Vergleiche Hewitt, et al., Brit. J. Cancer 33: 241-259 (1976).
  • Die Familie der tum&supmin; Antigene präsentierenden Zellinien sind immunogene Varianten, die durch Mutagenese von Maustumorzellen oder Zellinien erhalten werden, wie bei Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980) beschrieben wird. Um ins Detail zu gehen, werden tum&supmin; Antigene erhalten, indem Tumorzellen, die bei syngenetischen Mäusen keine Immunreaktion hervorrufen und Tumoren (d. h. "tum&spplus;" Zellen) bilden, mutiert werden. Wenn diese tum&spplus; Zellen mutagenisiert werden, werden sie von syngenetischen Mäusen abgestoßen und bilden keine Tumoren (deshalb "tum&supmin;"). Vergleiche Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272 (1977). Bei vielen Tumortypen hat sich dieses Phänomen gezeigt. Vergleiche z. B. Frost et al., Cancer Res. 43: 125 (1983).
  • Es scheint, daß tum&supmin; Varianten keine progressiven Tumoren bilden, weil sie einen Prozeß des Immunabstoßes einleiten. Der Beweis, der für diese Hypothese spricht, beinhaltet die Fähigkeit von "tum&supmin;" Tumorvatianten, d. h., diejenigen, die normalerweise keine Tumoren bilden, dies bei Mäusen, deren Immunsystem durch eine sublethale Bestrahlung unterdrückt wird, sehr wohl tun, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5282-5285 (1979); und die Beobachtung, daß intraperitoneal injizierte Mastozytom P815 tum&supmin; Zellen sich 12-15 Tage lang exponentiell vermehren und dann in nur ein paar Tagen inmitten eines Zustroms von Lymphozyten und Makrophagen beseitigt werden (Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152: 1175-1183 (1980)). Ein weiterer Beweis besteht in der Beobachtung, daß Mäuse ein Immungedächtnis erwerben, das ihnen erlaubt, einem nachfolgenden Reiz derselben tum&supmin; Variante zu widerstehen, selbst wenn immunosuppressive Strahlenmengen mit dem darauffolgenden Zellenreiz verabreicht werden (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272-275 (1977); Van Pel et al., oben; Uyttenhove et al., oben).
  • Später angestellte Untersuchungen ergaben, daß immungenetische Varianten, die eine Reaktion verursachten, erzeugt wurden, wenn spontane Tumoren einer Mutagenese unterworfen wurden. Diese Varianten konnten tatsächlich eine Immunschutzreaktion gegen den ursprünglichen Tumor hervorrufen. Vergleiche Van Pel et al., J. Exp. Med. 157: 1992-2001 (1983). Somit konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, die Präsentation eines sogenannten "tumorabstoßenden Antigens" in einem Tumor, der ein Target für eine syngenetische Abstoßreaktion ist, hervorzurufen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Transfektion von fremden Genen in spontane Tumoren erzielt. Vergleiche diesbezüglich Fearon et al., Cancer Res. 48: 2975-2980 (1988).
  • Eine Klasse von Antigenen wurde erkannt, die auf der Oberfläche von Tumorzeilen präsentiert werden und von den zytolytischen T-Zellen erkannt werden, was zu einer Lyse führt. Diese Klasse von Antigenen wird im folgenden als "tumorabstoßende Antigene" oder "TAA" bezeichnet. TAA können Antikörperreaktionen hervorrufen oder auch nicht. Das Ausmaß, in dem diese Antigene untersucht worden sind, bezieht sich auf das Gebiet der Charakterisierungsuntersuchungen zytolytischer T-Zellen, in vitro, d. h. die Untersuchung der Identifizierung des Antigens mit einer bestimmten Untergruppe der zytolytischen T-Zelle (im folgenden als "CTL" bezeichnet). Die Untergruppe breitet sich nach Erkennung des präsentierten tumorabstoßenden Antigens rasch aus und die das Antigen präsentierenden Zellen werden aufgelöst. Charakterisierungsuntersuchungen haben CTL-Klone identifiziert, die spezifisch die Antigene darstellenden Zellen auflösen. Beispiele dieser Arbeit finden sich bei Levy et al., Adv. Cancer Res. 24: 1-59 (1977); Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184- 1193 (1980); Brunner et al., J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 126: 406-412 (1982); Palladino et al., Canc. Res. 47: 5074-5079 (1987). Diese Analyseart wird für andere Typen von Antigenen, die von CTL erkannt werden, einschließlich minorer Histokompatibilitätsantigene, spezifisch männlicher H-Y-Antigene und der Klasse von Antigenen, die als "tum&supmin;" Antigene bezeichnet und hier besprochen wurden, benötigt.
  • Ein für den Gegenstand beispielhafter und oben beschriebener Tumor ist als P815 bekannt. Vergleiche DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274-2278 (1988); Szikora et al., EMBO J 9: 1041-1050 (1990) und Sibille et al., J. Exp. Med. 172: 35-45 (1990). Der P815 Tumor ist ein Mastozytom, das mit Methylcholanthren in eine DBA/2 Maus induziert wird und als ein in vitro Tumor sowie eine Zellinie gezüchtet wird. Die P815 Linie hat nach einer Mutagenese viele tum&supmin; Varianten erzeugt, einschließlich Varianten, die als P91A (DePlaen, oben), 35B (Szikora, oben) und P198 (Sibille, oben) bezeichnet werden. Im Gegensatz zu den tumorabstoßenden Antigenen - und dabei handelt es sich um einen sehr wichtigen Unterschied - sind die tum&supmin; Antigene nur nach Mutagenese der Tumorzellen vorhanden.
  • Tumorabstoßende Antigene sind auf einem gegebenen Tumor ohne Mutagenese vorhanden. Somit kann, unter Bezugnahme auf die Literatur, eine Zellinie tum&spplus; sein, wie die als "P1" bezeichnete Linie, und provoziert werden, um tum&supmin; Varianten zu erzeugen. Da sich das tum&supmin; Erscheinungsbild von dem der Mutterzellinie unterscheidet, erwartet man einen Unterschied in der DNA der tum&supmin; Zellinien im Vergleich zu ihren tum&spplus; Mutterlinien und dieser Unterschied kann ausgenutzt werden, um das Gen, an dem man interessiert ist, in den tum&supmin; Zellen örtlich zu bestimmen. Infolgedessen hat sich herausgestellt, daß sich Gene von tum&supmin; Varianten wie P91A, 35B und P198 von ihren normalen Allelen durch Punktmutationen in den Verschlüsselungsbereichen des Gens unterscheiden. Vergleiche Szikora und Sibille, oben, und Lurquin et al., Cell 58: 293-303 (1989). Es wurde festgestellt, daß das bei den TAA dieser Erfindung nicht der Fall ist Diese Artikel zeigten auch, daß die von dem tum&supmin; Antigen abgeleiteten Peptide zur Erkennung der CTL durch das Ld Molekül präsentiert sind. P91A wird durch Ld, P35 durch Dd und P198 durch Kd präsentiert.
  • Die am 22. Mai 1992 eingereichte PCT-Anmeldung PCT/US92/04354, die an denselben Anmelder wie die gegenwärtige Anmeldung erteilt wurde, lehrt über eine Familie von Verschlüsselungsgenen des menschlichen Vorläufers des tumorabstoßenden Antigens, als MAGE-Familie bezeichnet. Einige dieser Gene werden auch in von der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991) besprochen. Es ist jetzt klar, daß die verschiedenen Gene der MAGE-Familie in Tumorzellen dargestellt werden und als Diagnosemarker für solche Tumoren sowie für andere hier besprochene Zwecke dienen können. Vergleiche auch Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); von der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991). Der Mechanismus, mit dem ein Protein verarbeitet und auf einer Zellenoberfläche präsentiert wird, ist jetzt recht ausführlich beschrieben worden. Einen schnellen Überblick über die Entwicklung auf dem Gebiet kann man in Barinaga, "Getting Some 'Backbone': How MHC Binds Peptides", Science 257: 880 (1992) gewinnen; vergleiche auch Fremont et al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992). Diese Artikel weisen im allgemeinen auf eine Bedingung, daß das Peptid, das mit einem MHC/HLA-Molekül eine Bindung eingeht, neun Aminosäuren lang (ein "Nonapeptid") sein muß und auf die Wichtigkeit des ersten und neunten Rests des Nonapeptids hin. Wo 94 03205 offenbart das allgemeine Prinzip von Nonapeptid- oder Decapeptidzusammensetzungen, die bei Positionen 2 und 9 Rückstände konservierten, welche insbesondere ausgewählte MHC-Allele binden konnten und in durch MHC-Allele beschränkten T-Zellen eine T-Zellen- Aktivierung hervorrufen konnten. Die Peptide sind nützlich, um eine Immunreaktion gegen ein gewünschtes Antigen zu bewirken. Epitope von einer Anzahl von immunogenen Zielproteinen werden beschrieben, einschließlich Peptide, die von Prostatakrebs spezifischen Antigenen, Hepatitis B Kern- und Oberflächenantigenen, Melanomantigenen, humanes T-Zell-Leukämievirus-Antigenen und humanes Papillomavirus- Antigenen hergeleitet sind.
  • Untersuchungen der MAGE Genfamilie haben jetzt ergeben, daß tatsächlich ein bestimmtes Nonapeptid auf der Oberfläche einiger Tumorzellen präsentiert wird und daß die Präsentation des Nonapeptids erfordert, daß das Präsentationsmolekül HLA-A1 ist. Komplexe des MAGE-1 tumorabstoßenden Antigens (das "TAA" oder "Nonapeptid") führen zur Lyse der Zelle, die es durch zytolytische T-Zellen ("CTL") präsentiert.
  • Augenmerk wird z. B. auf die gleichzeitig eingereichten Anmeldung- Eingangsnr. 217,187 (Patent Nr. 5,554,506) an Traversari et al., und Eingangsnr. 217,186 (Patent Nr. 5,585,461) an Townsend et al., die beide Arbeiten bezüglich anderer von MAGE abgeleiteter Peptide präsentieren, gelegt.
  • Forschungsarbeiten, die z. B. in der U.S. Patentanmeldung-Eingangsnr. 071938,334 (US 5,405,940), eingereicht am 31. August 1992, und in der U.S. Patentanmeldung-Eingangsnr. 073,103 (US 5,462,871), eingereicht am 7. Juni 1993, präsentiert werden, haben bei dem Vergleich von homologen Bereichen verschiedener MAGE Gene mit dem Bereich der MAGE-1 Genverschlüsselung des relevanten Nonapeptids eine weitgehende Homologie ergeben. Diese Beobachtungen führen dann auch zu einem der Aspekte der hier offenbarten und beanspruchten Erfindung, das heißt eine Familie von Nonapeptiden, die alle dieselben Aminosäuren am N- Ende und am C-Ende aufweisen. Es wurde beschrieben, daß diese Nonapeptide für verschiedene Zwecke, einschließlich ihrer Verwendung als Immunogene allein oder in Verbindung mit Trägerpeptiden sehr nützlich sind. Nonapeptide sind groß genug, um eine antigene Determinante zu bilden und die dazu gebildeten Antikörper wurden zur Identifizierung des Nonapeptids, wie es alleine besteht oder als Teil eines größeren Polypeptids, als sehr nützlich beschrieben.
  • Diese Verweise, insbesondere Eingangsnr. 073,103 (US 5,462,871), zeigten eine Verbindung zwischen HLA-A1 und MAGE-3; es präsentieren jedoch nur ungefähr 26% der weißen Bevölkerung und 17% der schwarzen Bevölkerung HLA-A1-Moleküle auf Zellenoberflächen. Deshalb wäre es nützlich, weitere Information über Peptide zu erhalten, die durch andere Arten von MHC-Molekülen präsentiert werden, so daß ein angemessener Teil der Bevölkerung aus der oben besprochenen Forschung einen Nutzen ziehen kann.
  • Es wurde jetzt herausgefunden, daß die Präsentation von Antigenen von MAGE-2 abgeleiteten Peptiden, in der folgenden Offenbarung erläutert, Peptide identifiziert, die mit dem MHC-Klasse I Molekül HLA-A2 einen Komplex bilden. Die Auswirkungen dieser Erfindung unter anderem für therapeutische und diagnostische Zwecke gehören zu den Zielen der Erfindung, die in der folgenden Offenbarung wie folgt vorgelegt werden.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN BEISPIEL 1 Versuchsbedingungen:
  • Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Versuche bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle Fmoc-geschützten Aminosäuren, Synthesepolymere, Peptide und TFA wurden bei -20ºC gelagert.
    • Peptidsynthese
  • Die Peptide wurden durch Festphasen-Strategien auf einem vollautomatischen, multiplen Peptidsynthesizer (Abimed AMS 422) (vergleiche Gausepohl und Frank, 1990; Gausepohl et al., (1990)) synthetisiert.
  • Die Peptide wurden in mehreren Durchläufen hergestellt, wobei bei jedem jeweils 48 verschiedene Peptide gleichzeitig synthetisiert wurden.
  • Tentagel S AC (Rapp et al., 1990; Sheppard und Williams, 1982), ein Pfropfpolymer von Polyethylenglycol-Spacer-Armen auf einer Polystyrolmatrix, wurde als Harz verwendet (40-60 mg pro Peptid, 10 umol Fmoc-Aminosäure-Beladung).
  • Wiederholungskupplungen wurden durchgeführt, indem jedem Reaktionsgefäß eine Mischung aus 90 ul 0,67 M BOP (Gausepohl et al., 1988; Castro et al., 1975) in NMP, 20 ul NMM in NMP 2 : 1 (Volumenverhältnis) und 100 ul einer 0,60 M Lösung der geeigneten Fmoc- Aminosäure (Fields und Noble, 1990) in NMP (6-facher Überschuß) zugegeben wurde. Bei 70% der Reaktionszeit wurden jedem Reaktionsgefäß ungefähr 50 ul Dichlormethan zugegeben.
  • Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wurde durchgeführt, indem jedem Reaktionsgefäß 3 mal 0,8 ml Piperidin/DMA 1 : 4 (Volumenverhältnis) zugegeben wurde.
  • Die Kupplungszeiten und Abspaltungszeiten der Fmoc-Gruppe wurden im Laufe der Synthese verlängert, wobei jeweils bei 30 Min. und 3 mal 3 Min. begonnen wurde.
  • Die Waschungen nach den Kupplungen und Abspaltungen der Fmoc- Gruppe wurden mit 6 mal 1,2 ml DMA vorgenommen. Nachdem die erforderliche Sequenz erreicht worden war und die letzte Abspaltung der Fmoc-Gruppe entfernt worden war, wurde das Peptidylharz jeweils mit DMA, Dichlormethan, Dichlormethan/Ether 1 : 1 (Volumenverhältnis) und Ether umfassend gewaschen und getrocknet.
    • Peptidspaltung und -isolierung
  • Das Spalten der Peptide vom Harz und das Entfernen der Seitenkettenschutzgruppen wurde durchgeführt, indem jedem Reaktionsgefäß 6 mal 200 ul TFA/Wasser 19 : 1 (Volumenverhältnis) in Abständen von 5 Min. zugegeben wurde, wodurch freie Carbonpeptide erhalten wurden. Für Peptide, die Trp enthalten, wurde TFA/Wasser/Ethanethiol 18 : 1 : 1 (Volumenverhältnis) verwendet.
  • Zwei Stunden nach der ersten Addition von TFA wurden die Peptide von den kombinierten Filtraten durch Addition von 10 ml EtherlPentan 1 : 1 (Volumenverhältnis) und Abkühlung zu -20ºC präzipitiert. Die Peptide wurden durch Zentrifugieren (-20ºC, 2500 g, 10 Min.) isoliert.
  • Nach der Behandlung des Pellets mit Ether/Pentan 1 : 1 (Volumenverhältnis) und der Isolierung durch dasselbe Zentrifugierverfahren wurden die Peptide bei 45ºC 15 Min. lang getrocknet.
  • Jedes der Peptide wurde in 2 ml Wasser (oder 2 ml 10 Vol.% Essigsäure) aufgelöst, die Lösung in flüssigem Stickstoff 3 Min, lang gefroren und während des Zentrifugierens (1300 U/min, 8-16 Std.) gefriergetrocknet.
    • Analyse und Reinigung
  • Die Reinheit der Peptide wurde durch RP-HPLC bestimmt; ein Aliquot von etwa 50 nmol wurde in 100 ul 30 Vol.% Essigsäure aufgelöst. Von dieser Lösung wurden 30 ul auf ein RP-HPLC-System angewendet, das mit einem ternären Lösungsmittelsystem ausgerüstet war; A: Wasser, B: Acetonitril, C: 2 Vol.-% TFA in Wasser.
  • Die Gradientelution (1,0 ml/Min.) wurde aus 90% A,5% B,5% C zu 20% A,75% B,5% C in 30 Min. durchgeführt. Die Bestimmung lag bei 214 nm. Wahlweise herausgenommene Proben wurden mittels
  • Massenspektrometrie auf einem PDMS analysiert. Die 31 bindenden Peptide wurden alle mittels Massenspektrometrie auf einem PDMS und mittels einer quantitativen Aminosäureanalyse nach der Hydrolyse auf einem HP-Aminoquant analysiert. Bei allen der analysierten Proben lag der Unterschied zwischen der berechneten und gemessenen Masse innerhalb des Versuchsfehlers (0,1%) wie durch den Hersteller der verwendeten Apparatur vorgeschrieben. Alte Aminosäurezusammensetzungen entsprachen den Erwartungen.
    • BEISPIEL 2 Peptide
  • Von allen gefriergetrockneten 71 MAGE-2-Peptiden wurde 1 mg gewogen und in 10 ul DMSO aufgelöst Von allen aufgelösten Peptiden wurde eine Verdünnung aus 0,5 mg/ml in 0,9% NaCl hergestellt und der pH wurde zu einem pH von 7 mit 5% in destilliertem Wasser verdünnter Essigsäure (CH&sub3;COOH, Merck Darmstadt, Deutschland: 56-1000) oder 1 N in destilliertem Wasser verdünnten NaOH (Merck Darmstadt, Deutschland: 6498) neutralisiert.
    • Zellen
  • 174CEM.T2-Zellen wurden in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (Biochrom KG Seromed Berlin, Deutschland: F045) kultiviert und mit 100 IU/ml Penizillin (Biocades Pharma, Leiderdorp, Niederlande), 100 ug/ml Kanamycin (Sigma St. Louis, USA: K-0254), 2 mM Glutamin (ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, CA, USA: 15-801-55) und 10% fetalem Kalbsserum (FCS, Hyclone Laboratories Inc. Logan, Utah, USA: A-1115-L) ergänzt. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 2,5 · 10&sup5;/ml während 3 Tagen bei 37ºC, 5% CO&sub2; in Feuchtluft kultiviert.
    • Peptidbindung
  • 174CEM.T2-Zellen wurden zweimal in Nährmedium ohne FCS gewaschen und in ein serumfreies Kulturmedium bei einer Dichte von 2 · 10&sup6; Zellen/ml gegeben. Von dieser Suspension wurden 40 ul zusammen mit 10 ul zweifacher Reihenverdünnungen in 0,9% NaCl der einzelnen Peptidverdünnungen (in dem Bereich zwischen 500 ug/ml und 15,6 ug/ml) in eine V-Boden-Gewebekulturplatte mit 96 Löchern (Greiner GmbH, Frickenhausen, Deutschland: 651101) gegeben. Die Endkonzentrationen liegen in dem Bereich zwischen 200 ug/ml und 3,1 ug/ml Peptid mit 8 · 104 174CEM.T2-Zellen. Diese Lösung wurde 3 Minuten lang leicht gerührt, wonach eine Inkubationszeit von 16 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2; in Feuchtluft stattfand. Dann wurden die Zellen einmal mit 100 ul 0,9% NaCl, 0,5% Kalbsserumalbumin (Sigma St. Louis, USA: A-7409), 0,02% NaN&sub3; (Merck Darmstadt, Deutschland: 822335) gewaschen. Nach einer Zentrifugendrehung bei 1200 U/Min wurde das Pellet 30 Minuten lang bei 4ºC in 50 ul gesättigten Mengen eines HLA-A2.1 spezifischen monoklonalen Antikörpers BB7.2 einer Maus resuspendiert. Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen und 30 Minuten lang mit F(ab)&sub2;- Fragmenten Antimaus-IgG einer Ziege, das mit Fluorescein-Isothiocynat (Tago Inc. Burlingame, CA, USA: 4350) in einer Verdünnung von 1 : 40 und einem Gesamtvolumen von 25 ul konjugiert worden war, inkubiert.
  • Nach der letzten Inkubation wurden die Zeilen zweimal gewaschen und die Fluoreszenz wurde bei 488 Nanometer auf einem FACScan Durchflußzytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) gemessen. Die Konzentration, bei der die 0,5 maximale Upregulation des HLA-A2.1 auf 174CEM.T2-Zellen erreicht wurde, wurde bestimmt, indem graphische Darstellungen verwendet wurden, bei denen der Fluoreszenz- Index der Peptidkonzentration gegenübergestellt wurde. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3 ersichtlich.
    • TABELLE 3
  • Die von einem humanen, mit einem Melanom assoziierten Protein MAGE-2 abgeleiteten bindenden Affinitäten der Peptide, die auf das HLA-A2.1- Profil (Sammlung von Falk et al., 1991, Hunt et al., 1992 und Nijman et aL, 1993) passen.
  • Die 174CEM.T2-Zellinie exprimiert "leere" und instabile HLA-A2.1- Moleküle, die stabilisiert werden können, wenn ein Peptid an die das Peptid präsentierende Rille dieser Moleküle gebunden ist. Ein stabilisiertes HLA-A2.1-Molekül, das sich nicht leicht abbaut, ist das Ergebnis des Bindens eines analysierten Peptids. Dies führt zu einer Erhöhung bei der Zellenoberflächenexpression des HLA-A2.1-Moleküls. Der Fluoreszenz-Index ist ein Maß für die Menge der Upregulation der HLA-A2.1-Moleküle. Dieser Fluoreszenz-Index wird gemäß der folgenden Formel berechnet:
  • MF = Mittlere Fluoreszenz
  • Der Fluoreszenz-Index der Hintergrundfluoreszenz beträgt 0.
    • Ergebnisse
  • Um MAGE-2-Peptide, die sich mit durch 174CEM.T2-Zellen exprimierten HLA-A2.1-Molekülen binden können, zu identifizieren, wurde die Aminosäuresequenz von MAGE-2 untersucht (4). Alle neun, zehn oder elf langen Aminosäurepeptide, die auf das veröffentlichte HLA-A2.1 bindende Profil passten, wurden untersucht (Tabelle 3).
  • Nur die Peptide Nr. 1-11 aus Tabelle 33 konnten die Expression der HLA- A2.1-Moleküle bei einer niedrigen Peptidkonzentration upregulieren, wobei sie ihr Binden an das HLA-A2.1-Molekül, wie in Beispiel 2 beschrieben, angeben. Keine der anderen 60 Peptide waren imstande, dies zu tun. Die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung sind in Tabelle 3 angegeben. Die 0,5 maximale Upregulation von HLA-A2.1-Molekülen auf 174CEM.T2-Zellen wurde durch die Verwendung von graphischen Darstellungen bestimmt, in denen der Fl der Peptidkonzentration für jedes individuelle Peptid gegenübergestellt wurde.
  • Diese Experimente weisen darauf hin, daß nur ein begrenzter Anteil an Peptiden, die auf das HLA-A2.1-Profil passen, die Fähigkeit aufweisen, sich mit diesem HLA-Molekül mit hoher Affinität zu binden und sind daher die einzigen Kandidaten des MAGE-2-Proteins, von einem humanen CTL erkannt zu werden, da CTL Peptide nur dann erkennen, wenn sie mit HLA- Molekülen gebunden sind.
    • TABELLE 33.
  • Die von einem humanen, mit einem Melanom assoziierten Protein MAGE-2 abgeleiteten bindenden Affinitäten zusätzlicher Peptide, die auf das erweiterte HLA-A2.1-Profil (Rupert et al.) passen.
    • TABELLE 333
  • Peptide, die vom Melanomprotein MAGE-2 hergeleitet sind und sich mit HLA-A2.1 binden.
    • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel zeigt die in vitro Induktion einer primären Immunantwort. Zur Illustration der Möglichkeit einer Induktion primärer Antworten im allgemeinen, einschließlich MAGE-2-Peptiden, werden solche Antworten auf HPV-Peptide unter Verwendung der fehlerhaften Verarbeitungszellinie 174CEM.T2 gezeigt.
  • Die Expression der HLA-A2.1-Zellen (T2) ist durch die Inkubation der T2- Zellen in einem relevanten Peptid, welches Medium enthält, erhöht. T2- Zellen präsentieren das mit HLA-A2.1 gebundene relevante Peptid in hoher Menge und sind daher gute Antigen präsentierende Zellen (APC). Beim kürzlich beschriebenen Antwort induzierenden Verfahren (Kast et al., 1993) wird die T2-Zellinie als APC verwendet und post-Ficoll einkernige Zellen werden als Antwortzellen verwendet. 1
    • Verfahren 1) Peptidbeladung von HLA-A2.1 auf T2
  • T2-Zellen in einer Konzentration von 2 · 10&sup6; Zellen pro ml wurden über einen Zeitraum von 13 Stunden bei 37ºC in einer T25 Flasche (Becton Dickinson, Fatcon, Plymouth, England, Kat. Nr. 3013) in serumfreiem IMDM (= Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium: Biochrom KG, Seromed, Berlin, Deutschtand, Kat. Nr. F0465) mit Glutamin (2 mM, ICN Biochemicals Inc., Costa Meisa, USA, Kat. Nr. 15-801-55), Antibiotika (100 IU/ml Penizillin (Brocades Pharma, Leiderdorp, Niederlande, 100 ug/ml Kanamycin (Sigma, St Louis, USA, K-0245)) und dem ausgewählten Peptid MLDLQPETT in einer Konzentration von 80 ug/ml inkubiert.
    • 2) Mitomycin C Behandlung von T2 (APC)
  • Diese inkubierten T2-Zellen wurden zentrifugiert und anschließend bei einer Dichte von 20 · 10&sup6; Zellen/ml mit Mytomycin G (50 ug/ml) in serumfreiem RPMI-Medium (Gibco Paislan, Schottland, Kai Nr. 041-02409) eine Stunde lang bei 37ºC behandelt. Danach wurden die T2-Zellen dreimal in RPMI gewaschen.
    • 3) Vorbereitung zur primären Immunantwortinduktion
  • Alle Löcher der U-Boden-Gewebekulturplatte mit 96 Löchern (Costar, Cambridge, USA, Kat. Nr. 3799) wurden mit 100 000 Mitomycin C behandelten T2-Zellen in 50 ul serumfreiem, kompletten RPMI-Medium (Glutamin (2 mM, ICN Biochemicals Inc., Costa Meisa, USA, Kai Nr. 15- 801-55), Penizillin (100 IU/ml, Brocades Pharma, Leiderdorp, Niederlande), Kanamycin (100 ug/ml, Sigma, St. Louis, USA, K-0245)) und dem Peptid MLDLQPETT in einer Konzentration von 80 ug/ml gefüllt.
    • 4) Antwortzellen
  • Antwortzellen sind einkernige, periphere Blutlymphozyten (PBL) eines HLA-A2.1-Untergruppendonators (= C.B.). Die PBL wurden von einer Leukozytenmanschette mittels des Ficoll-Verfahrens (Ficoll-Präparat: Lymphoprep von Nycomedpharma, Oslo, Norwegen, Kat. Nr. 105033) getrennt und zweimal in RPMI gewaschen. Nach dem Trennen und Waschen wurden die PBL in komplettem RPMI-Medium mit 30% humanem Poolserum (HPS) (HPS wird in gemischten Lymphozytkulturen auf Suppressionsaktivität geprüft) resuspendiert.
    • 5) Inkubation der primären Immunantwort
  • 400 000 PBL-C.B. in 50 ul eines Mediums (das unter 4 beschriebene Medium) wurde jedem Loch der U-Boden-Gewebekufturplatte mit 96 Löchern zugegeben, das schon mit T2-Zellen gefüllt ist, und 7 Tage lang bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; und 90 % Feuchtigkeit kultiviert.
    • 6) Restimulation (Tag 7)
  • Am Tag 7 nach der Inkubation von PBL, dem Peptid MLDLQPETT und den T2-Zellen (1-5) wurden die PBL-C.B. mit dem Peptid MLDLQPETT restimuliert. Zu diesem Zweck wurden alle Zellen und das Medium aus den 96 Löchern entnommen. Lebensfähige Zellen wurden mittels des Ficoll-Verfahrens isoliert und in RPMI gewaschen. 50 000 dieser lebensfähiger Zellen wurden einer neuen U-Boden-Gewebekulturplatte mit 96 Löchern in jedem Loch mit 50 ul eines kompletten RPMI-Mediums mit 15% HPS angeimpft. Pro Loch wurden 20 000 autologe, bestrahlte (3 000 Rad) PBL und 50 000 autologe, bestrahlte (10 000 Rad) EBV-transformierte B-Lymphozyten (= EBV-C.B.) zusammen mit 50 ul des kompletten RPMI- Mediums mit 15% HPS und dem Peptid MLDLQPETT in einer Konzentration von 80 ug/ml zugegeben. Die Zellen wurden 7 Tage lang bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; und 90% Feuchtigkeit kultiviert.
    • 7) Restimulation (Tag 14)
  • Am Tag 14 nach der Inkubation von PBL, dem Peptid MLDLQPETT und den T2-Zellen (1-5) wurden PBL-C.B. mit dem Peptid MLDLQPETT restimuliert. Dazu wird das Verfahren gemäß 6 wiederholt.
    • 8) Klonen durch Grenzverdünnung
  • Am Tag 21 nach der Inkubation von PBL, dem Peptid MLDLQPETT und den T2-Zellen wurden die Zellen und das Medium von den 96 Löchern entnommen. Lebensfähige Zellen wurden durch das Ficoll-Verfahren isoliert und in komplettem RPMI mit 15% HPS gewaschen. Diese Menge lebensfähiger Zellen wurde durch Grenzverdünnung geklont. Jedem Loch einer U-Boden-Gewebekulturplatte mit 96 Löchern (Costar, Cambridge, USA, Kat. Nr. 3799) wurden 50 ui komplettes RPMI-Medium mit 15% HPS zusammen mit 100 lebensfähigen Zellen (= HPV16 Menge Anti- MLDLQPETT) zugegeben. Für weitere, neue U-Boden-Gewebekulturplatten mit 96 Löchern wurde dies genau so wiederholt, außer daß die Anzahl der Zellen für die Löcher anders war: Nachfolgende Platten enthielten 10, 1 oder 0,3 Zellen pro Loch. Allen Löchern wurden 20 000 gepoolte und bestrahlte (3000 Rad) PBL von vier verschiedenen Donatoren und 10 000 gepoolte und bestrahlte (10 000 Rad) EBV-transformierte B-Zellen von drei verschiedenen HLA-A2.1-Donatoren (VU-4/518/JY) mit 50 ut komplettem RPMI-Medium mit 15% HPS und dem Peptid MLDLQPETT in einer Konzentration von 40 ug/ml, Leukoagglutinin in einer Konzentration von 2% (Pharmacia, Uppsala, Schweden, Kat. Nr. 17-063-01), humanem, rekombinantem IL-2 in einer Konzentration von 120 IU/ml (Eurocetus, Amsterdam, Niederlande) zugegeben.
    • 9) Ausbreitung der Klons
  • Bei einem endgültigen Volumen von 100 ul, wird pro Loch folgendes zuzugeben =>
  • - 25 000 lebensfähige Zellen
  • - 20 000 bestrahlte PBL-Pool (wie unter 8)
  • - 10 000 bestrahlte EBV-Pool (wie unter 8)
  • - 2 ug Peptid MLDLQPETT
  • - 6 IU rekombinantes IL-2.
  • Am Tag 49 wurde ein Zytotoxizitätsassay mit 65 Klons und einer Menge als Effektorzellen und T2 (mit oder ohne dem relevanten Peptid MLDLQPETT) als Targetzellen durchgeführt. Hintergrundtötung wird definiert als das Töten der T2-Zelien, die mit einem irrelevanten (aber HLA- A2.1 bindenden) Peptid - GILGFVFTL - inkubiert wurden. Dieses von dem Influenzamatrixprotein hergeleitete Peptid ist das Epitop für HLA-A2.1 begrenzte, Influenza spezifische CTL.
  • Es stellte sich heraus, daß die meisten HLA-A2.1 bindenden Peptide das HLA-A2.1-Profil (Sammlung von Rammensee et al., 1991, Hunt et al., 1992 und Nijman et al., 1993) verwenden. Es stellte sich bei lediglich 1 zusätzlichen HLA-A2.1 bindenden Peptid heraus, daß es das erweiterte HLA-A2.1-Profil (Ruppert et al., 1993) verwendete.
  • Diese Erfindung beinhaltet die Verwendung von Polypetiden, die durch jedes Mittel generiert werden, sei es Gentechnik, Peptidsynthese mit Festphasen-Techniken oder andere. An den terminalen Enden der vorhergehenden Peptide können verschiedene chemische Modifikationen unternommen werden und sie können trotzdem noch innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegen. Es sind auch andere chemische Modifikationen möglich, insbesondere zyklische und dimere Konfigurationen. Der Begriff "Derivate" soll alle solchen modifizierten Peptide abdecken.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide finden in der Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten, an denen MAGE-2 exprimierende Zellen beteiligt sind, einschließlich Melanomzellen und andere Krebszellen Anwendung.
  • Bei allen Anwendungen werden die Peptide in immunogener Form verabreicht. Da die Peptide relativ kurz sind, kann eine Verbindung mit einem Immunogenität übertragenden Trägermaterial, wie etwa Lipide oder dergleichen, oder die Verwendung von Hilfsmitteln nötig sein.
  • Das Ausmaß einer prophylaktischen oder therapeutischen Dosis erfindungsgemäßer Polypetide wird natürlich je nach Gruppe von Patienten (Alter, Geschlecht, Gewicht, etc.), der Stärke der zu behandelnden Kondition, dem besonderen erfindungsgemäßen Polypeptid und dessen Art von Verabreichung variieren. Es kann jede geeignete Art von Verabreichung angewendet werden, um eine wirksame Dosis eines durch diese Erfindung identifizierten Polypeptids, wie einer Dosisform, die in dem Bereich der Pharmazeutik wohlbekannt ist, zu erreichen. Zudem können die Polypeptide auch durch ein gesteuertes Abgabemittel und/oder Verabreichungsvorrichtungen verabreicht werden. Sie können auch in Verbindung mit anderen aktiven Substanzen wie insbesondere T-Zellen aktivierende Agenten wie etwa Interleukin-2, etc. verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können auch für andere Zwecke wie etwa zur Diagnostik nützlich sein. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um nachzuprüfen, ob eine Impfung mit einem erfindungsgemäßen Peptid erfolgreich verlaufen ist. Dies kann in vitro durch Testen, ob das Peptid die T-Zellen der geimpften Person aktivieren kann, durchgeführt werden.
  • Weitere Aspekte der Erfindung werden dem Experten klar sein und müssen hier nicht erwähnt werden.
    • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER: Melief, Cornelis J. M.
  • Visseren, M. J. W.
  • Kast; W. M.
  • von der Bruggen, Pierre
  • Boon-Falleur, Thierry
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Isolated Tumor Rejection Antigen Precursor MAGE-2 Derived Peptides, and Uses Thereof
  • (iii) ANZAHL SEQUENZEN: 62
  • (iv) KORRESPONDENZADDRESSE:
  • (A) ADRESSAT: Felfe & Lynch
  • (B) STRASSE: 805 Third Avenue
  • (C) STADT: New York City
  • (D) STAAT: New York
  • (E) LAND: USA
  • (F) PLZ: 10022
  • (v) MASCHINENLESBARE FORM:
  • (A) DATENTRÄGER: Diskette, 5,25 Inch, 360 KB Speicher
  • (B) COMPUTER: IBM PS/2
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS
  • (D) SOFTWARE: Wordperfect
  • (vi) LAUFENDE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) AKTENZEICHEN:
  • (B) EINREICHUNGSDATUM:
  • (C) KLASSIFIZIERUNG:
  • (vi) LAUFENDE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) AKTENZEICHEN: 08/217, 188
  • (B) EINREICHUNGSDATUM: 24-MÄRZ-1994
  • (viii) ANWALT:
  • (A) NAME: Hanson, Norman D.
  • (B) EINTRAGUNGSNUMMER: 30,946
  • (C) REFERENZ/VERZEICHNISNUMMER: LUD 5340-PCT
  • (ix) TELEKOMMUNIKATION:
  • (A) TELEFON: (212) 688-9200
  • (B) FAX: (212) 838-3884
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  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 30:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 31:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
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  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 31:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 32:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
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  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 32:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 33:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 33:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 34:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG; SEQ ID NR: 34:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 35:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
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  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 35:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 36:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
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  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 36:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 37:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäurereste
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 38:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäurereste
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 39:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 40:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäurereste
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  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäurereste
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 44:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA;
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 46:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 47:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 49:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 50:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 51:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 52:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 53:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 54:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäurereste
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 55:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäurereste
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 56:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 1D NR: 56:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 57:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 58:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 59:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 60:
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  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 61:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
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  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 61:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID NR: 62:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäurereste
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 62:

Claims (20)

1. Ein isoliertes Peptid, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 7, SEQ ID NR.: 8, SEQ ID NR.: 9, SEQ ID NR.: 10 und SEQ ID NR.: 11.
2. Isoliertes Peptid gemäß Anspruch 1, bezeichnet als SEQ ID NR.: 1.
3. Isoliertes Peptid gemäß Anspruch 1, bezeichnet als SEQ ID NR.: 6.
4. Isoliertes Peptid gemäß Anspruch 1, bezeichnet als SEQ ID NR.: 9.
5. Ein isolierter Komplex aus HLA-A2 und dem isolierten Peptid gemäß Anspruch 1.
6. Isolierter Komplex gemäß Anspruch 5, wobei das Peptid als SEQ ID NR.: 1 bezeichnet ist.
7. Isolierter Komplex gemäß Anspruch 5, wobei das Peptid als SEQ ID NR.: 6 bezeichnet ist.
8. Isolierter Komplex gemäß Anspruch 5, wobei das Peptid als SEQ ID NR.: 9 bezeichnet ist.
9. Ein isolierter zytolytischer T-Zellenklon, der spezifisch ist für einen Komplex aus HLA-A2 und einem Peptid, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 7, SEQ ID NR.: 8, SEQ ID NR.: 9, SEQ ID NR.: 10 und SEQ ID NR.: 11.
10. Isolierter zytolytischer T-Zellenklon gemäß Anspruch 9, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 1 ist.
11. Isolierter zytolytischer T-Zellenklon gemäß Anspruch 9, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 6 ist.
12. Isolierter zytolytischer T-Zellenklon gemäß Anspruch 9, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 9 ist.
13. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch mit einem Komplex aus HLA-A2 und einem Peptid eine Bindung eingeht, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 7, SEQ ID NR.: 8, SEQ ID NR.: 9, SEQ ID NR.: 10 und SEQ ID NR.: 11.
14. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 13, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 1 ist.
15. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 13, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 6 ist.
16. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 13, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 9 ist.
17. Eine therapeutische Zusammensetzung, die zumindest einen zytolytischen T-Zeilenklon umfaßt, der ausreicht, um eine Krebszelle, die einen Komplex aus HLA-A2 und einem Peptid, das aus SEQ ID NR.: 1, 2, 4, 6-11 ausgewählt wird, präsentiert, auf deren Zellenoberfläche aufzulösen.
18. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 1 ist.
19. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 6 ist.
20. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Peptid SEQ ID NR.: 9 ist.
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