KR20000022423A - Mage-2 유래의 분리된 펩티드 - Google Patents
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Abstract
MAGE-2 분자로부터 유래되고 HLA-A*0201 분자에 결합하는 새로운 펩티드가 개시되어 있다. 이들중 몇몇은 그것의 HLA-A*0201 파트너 분자에 착체화될 때 CTL 증식을 유발하기 때문에 특히 유용하다.
Description
숙주 유기체에 의해 암세포의 인식부족 또는 인식연구가 많은 다른 방향에서 진행되어 왔다. 이 분야에 대한 이해는 기본적으로 면역학 및 종양학 둘 다에 대한 이해가 필요하다.
마우스 종양에 대한 초기 연구는 이들이 동유전자형 동물로 이식될 때 종양세포를 거부하는 분자를 표시하고 있음을 나타냈다. 이들 분자는 수용 동물에서의 T-세포에 의해 "인식"되고, 이식된 세포의 분해로 세포융해 T-세포 응답을 일으킨다. 이 증거는 메틸콜란트렌과 같은 화학적 발암물질에 의해 시험관내에서 유발된 종양으로 처음 얻어졌다. 종양에 의해 발현되고 T-세포 응답을 도출해 낸 항원이 각 종양에 대해 다르다는 것을 발견하였다. 세포 표면 항원에서의 차이 및 화학적 발암물질로 종양을 유발하는데 대한 일반적 교시에 대해서 Prehn, et al., J. Natl. Canc. Inst. 18: 769-778 (1957); Klein et al., Cancer Res. 20: 1561-1572 (1960); Gross, Cancer Res. 3: 326-333 (1943), Basombrio, Cancer Res. 30: 2458-2462 (1970) 참조. 이러한 항원 부류는 "종양 특이적 이식 항원" 또는 "TSTA"로 공지되어 왔다. 화학적 발암물질에 의해 유발될 때 그러한 항원의 제시를 관찰하여, 종양이 자외선 조사에 의해 시험관내에서 유발되었을 때 유사한 결과를 얻었다. Kripke, J. Natl. Canc. Inst. 53: 333-1336 (1974) 참조.
T-세포 매개된 면역응답이 상기한 종양 유형에 대해 관찰되었을 때, 자연발생 종양이 일반적으로 비면역원이라고 생각되었다. 따라서 이것은 종양 운반 피험체에서의 종양에 대한 응답을 유발한 항원을 제공하지 않는다고 생각된다. Hewitt, et al., Brit. J. Cancer 33: 241-259 (1976) 참조.
세포주를 제공하는 tum-항원 부류는 마우스 종양세포 또는 세포주의 돌연변이 유발에 의해 얻어진 면역원 변이체이고, 그 개시가 참고로 포함되는 Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980)에 기재되어 있다. 상세하게 하기 위해, tum-항원은 동유전자형 마우스에서의 면역응답을 발생하지 않고 종양(즉, "tum+" 세포)을 형성할 종양세포를 돌연변이시켜 얻어진다. 이 tum+세포가 돌연변이될 때, 이것은 동유전자형 마우스에 의해 거부되고, 종양(이번에는 "tum-")을 형성하지 못한다. 그 개시가 참고로 포함되는 Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272 (1977) 참조. 많은 종양 유형이 이 현상을 나타내었다. 예를들면, Frost et al., Cancer Res. 43: 125 (1983) 참조.
tum-변이체는 이것이 면역거부 프로세스를 개시하기 때문에 진행성 종양을 형성하지 못한다고 생각된다. 이 가설을 지지하는 증거로는 거의 치사량의 방사선조사에 의해 억제된 면역체계가 있는 마우스에서 행하기 위한, 통상 종양을 형성하지 못하는 종양의 "tum-" 변이체의 능력, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5282-5285 (1979); 12-15일동안 지수로 증식되는 마스토시토마 P815의 tum-세포를 복막내 주사한 다음에 림프구 및 마크로파지의 유입중에 단지 며칠동안에 배출되는 관찰(Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152: 1175-1183 (1980))을 들 수 있다. 다른 증거로는 방사선의 면역억제량을 세포의 다음 챌린지로 투여할 때조차, 동일한 tum-변이체로의 후속 챌린지를 방해하게 하는 면역 메모리를 마우스가 획득한다는 관찰을 들 수 있다(Boon et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 74: 272-275 (1977); Van Pel et al., 상기 참조; Uyttenhove et al., 상기 참조). 자연발생 종양이 돌연변이 유발을 일으켰을 때, 응답을 발생한 면역원 변이체가 제조되었다는 것이 나중의 연구로 알게 되었다. 실제, 이들 변이체는 원래의 종양에 대해 면역보호 응답을 유도해 낼 수 있었다. Van Pel et al., J. Exp. Med. 157: 1992-2001 (1983) 참조. 따라서, 동유전자형 거부응답에 대한 표적인 종양에서 이른바 "종양거부항원"의 제시를 유발해 내는 것이 가능하다고 나타났다. 외부 유전자를 자연발생 종양으로 트랜스펙션하였을 때 유사한 결과가 얻어졌다. 이와 관련하여 Fearon et al., Cancer Res. 48: 2975-1980 (1988) 참조.
종양세포의 표면에 제공되어 분해되는 세포융해 T 세포에 의해 인식되는 항원 부류가 인식되어 왔다. 이러한 항원부류는 이하 "종양거부항원" 또는 "TRA"로 언급될 것이다. TRA는 항체응답을 유도할 수도 있고 또는 유도하지 못할 수도 있다. 이들 항원을 연구한 정도는 시험관내에서 세포융해 T 세포 특징연구, 즉 특정한 세포융해 T 세포(이하 "CTL") 서브셋에 의한 항원의 동정 연구를 통해서였다. 제공된 종양거부항원을 인식하였을 때 서브셋이 증식되고 종양거부항원을 제공하는 세포가 분해된다. 특징연구는 CTL 클론을 동정하고, 이것은 구체적으로 종양거부항원을 발현하는 세포를 분해한다. 이 작업의 예는 Levy et al., Adv. Cancer Res. 24: 1-59 (1977); Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980); Brunner et al., J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 406-412 (1982); Palladino et al., Canc. Res. 47: 5074-5079 (1987)에서 발견할 수 있다. 이러한 유형의 분석은 부 조직적합성 항원, 수컷 특이적 H-Y 항원을 포함하는 CTL로 인식된 다른 유형의 항원 및 본문에서 논의된 "tum-" 항원으로 언급되는 항원부류에 요구된다.
상기한 피험체 물질의 종양 예는 P815로 공지되어 있다. 그 개시가 참고로 포함되는 DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274-2278 (1988); Szikora et al., EMBO J 9: 1041-1050 (1990), 및 Sibille et al., J. Exp. Med. 172: 35-45 (1990) 참조. P815 종양은 메틸콜란트렌으로 DBA/2 마우스에서 유발되고 시험관내에서 종양 및 세포주 둘다로서 배양된 마스토시토마이다. P815 세포주는 P91A(DePlaen, 상기 참조), 35B(Szikora, 상기 참조) 및 P198(Sibille, 상기 참조)로 언급된 변이체를 포함하는 돌연변이 유발을 행하는 많은 tum-변이체를 발생시켰다. 종양거부항원과 반대로-이것은 중요한 차이이다-tum-항원은 종양세포가 돌연변이 유발된 후에만 존재한다. 종양거부항원은 돌연변이 유발을 하지 않고 주어진 종양 세포에 존재한다. 따라서, 문헌을 참고로 하여, 세포주는 "P1"로 언급된 세포주와 같은 tum+일 수 있고, tum-변이체를 제조하도록 유발될 수 있다. tum-표현형은 모 세포주의 것과 다르기 때문에, tum-모 세포주와 비교하여 tum-세포주의 DNA에서의 차이를 기대하고, 이 차이는 tum-세포에서의 관심있는 유전자를 위치결정하는데 사용될 수 있다. 그 결과, P91A, 35B 및 P198과 같은 tum-변이체의 유전자는 유전자의 코딩부위에서의 점 돌연변이에 의해 통상의 대립유전자와 상이하다는 것을 알았다. Szikora 및 Sibille, 상기 참조 및 Lurquin et al., Cell 58: 293-303 (1989) 참조. 이것은 본 발명의 TRA로 인한 경우가 아님이 입증되었다. 이들 논문은 tum-항원으로부터 유래된 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 Ld분자로 존재한다는 것을 입증하고 있다. P91A는 Ld로, P35는 Dd로, 그리고 P198은 Kd로 존재한다.
대상 출원으로 동일한 양수인에게 양도된, 1922년 5월 22일 출원된 PCT 출원 PCT/US92/04354는 MAGE 부류로 언급되는 사람 종양거부항원 전구체 코딩 유전자 부류를 교시하고 있다. 몇몇 이들 유전자는 van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991)에도 논의되어 있다. MAGE 부류의 각종 유전자가 본문에서 논의된 다른 목적 뿐만 아니라 종양세포에서 발현되고, 그러한 종양 진단을 위한 마커로서 사용할 수 있다는 것이 이제 분명하다. Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991) 및 De Plaen, et al., Immunogenetics 40: 360 (1994) 참조. 단백질이 세포 표면위에서 처리되고 제공되는 메카니즘이 이제 문서화되었다. 본 기술분야의 전개에 있어 개괄적인 검토는 Barinaga, "Getting Some 'Backbone': How MHC Binds Peptides", Science 257: 880 (1992)에서 발견될 수 있고; 또한, Fremont et al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992) 참조. 이들 논문은 일반적으로 MHC/HLA 분자에 결합하는 펩티드가 9개의 아미노산 길이("노나펩티드")이고 노나펩티드의 제1과 제9의 잔기가 중요하다는 것을 가리키고 있다.
MAGE 부류의 유전자에 대한 연구로 이제 특정 노나펩티드가 몇몇 종양세포의 표면에 사실 제공된다는 것과, 노나펩티드의 제시는 제공하는 분자가 HLA-A1일 것을 요구한다는 것이 밝혀졌다. MAGE-1 종양거부항원("TRA" 또는 "노나펩티드")의 착체는 세포융해 T 세포("CTL")에 의해 항원을 제공하는 세포를 분해시킨다.
현재 출원된 트래버서리(Traversari) 등의 출원일련번호 08/217,187, 그리고 타운젠드(Townsend) 등의 일련번호 08/217,186이 주목되고 있고, 이 둘은 다른 MAGE로부터 유래된 펩티드에서의 작업을 제공한다.
1992년 8월 31일 출원된 미국특허출원 일련번호 07/938,334, 그리고 1993년 6월 7일 출원된 미국특허출원 일련번호 073,103에 있는 연구는 다양한 MAGE 유전자의 상동부위와 관련 노나펩티드에 대해 코딩하는 MAGE-1 유전자의 부위를 비교할 때, 많은 상동성이 있음을 알았다. 실제, 이들 관찰은 본문에 개시되고 청구된 본 발명의 양태중 한 가지이고, 모든 부류의 노나펩티드는 동일한 N-말단 및 C-말단 아미노산을 갖는다. 이들 노나펩티드는 단독으로 또는 담체 펩티드와 커플링하여 면역원으로서의 그 사용을 포함하는 다양한 목적에 유용하다는 것이 기재되었다. 노나펩티드는 항원성 에피토프에 기여하는데 충분한 크기를 갖고, 여기서 생성된 항체는 단독으로 또는 보다 큰 폴리펩티드의 일부로서 존재하는 노나펩티드를 동정하는데 유용하다고 기재되었다.
이들 참고문헌, 특히 일련번호 073,103은 HLA-A1 및 MAGE-3 사이의 관계를 나타냈으나, 코카서스인의 약 26% 그리고 니그로인의 약 17%만이 세포 표면에 HLA-A1 분자가 제공되어 있다. 따라서, MHC 분자의 다른 유형에 의해 제공된 펩티드에 대한 추가의 정보를 갖는데 유용하여 적당한 비율의 인구가 상기 논의된 연구로부터 이익을 얻을 수 있다.
이제 다음 개시에 기재된 MAGE-2 유래 펩티드의 항원 제시는 MHC 부류 I 분자 HLA-A2와 착체화하는 펩티드를 동정한다는 것을 알았다. 치료적 및 진단적 사용을 포함하는 본 발견의 결과는 다음 개시에 기재된 본 발명의 대상중에 있다.
본 발명은 면역유전학 및 펩티드화학에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HLA-A2 분자에 대한 리간드로서 그리고 면역원을 포함하는 각종 방법에 유용한 운데카펩티드, 데카펩티드 및 노나펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 유전자 MAGE-2로 코딩된 종양거부항원 전구체로부터 유래되고, MHC-부류 I 분자 HLA-A2로 제공되는 이른바 "종양거부항원"에 관한 것이다.
도 1은 HLA-A2.1의 0.5 최대 상향조절을 포함하여 펩티드 농도를 계산하는 예시 그래프이다.
도 2는51Cr 방출분석으로 측정한 다양한 물질에 대한 HPV 클론의 응답에 대한 비교 데이터를 제공한다.
도 3A 내지 도 3D는 양성의 벌크 배양 분석으로부터의 결과를 나타낸다.
실시예 1
실험 조건:
모든 실험은 다르게 언급되지 않는 한 실온에서 수행하였다. 모든 Fmoc 보호된 아미노산, 합성 폴리머, 펩티드 및 TFA를 -20℃에서 보관하였다.
펩티드 합성
펩티드를 자동화된 복합 펩티드 합성기(Abimed AMS 422)에서 고상 방법으로 합성하였다(Gausepohl and Frank, Biotech, Sept. 1990; Gausepohl et al. in E. Giralt and D. Andreu (eds), Peptides 1990: 206-207 (1990) 참조).
펩티드를 여러 회에 걸쳐 제조하고, 각각에서 48개의 다른 펩티드를 동시에 합성하였다.
폴리스티렌 매트릭스상의 폴리에틸렌글리콜 스페이서 암의 그래프트 폴리머인 Tentagel S AC (Rapp et al., in Innovation and Perspective in Solid Phase Peptide Synthesis, 205-210 (1990); Sheppard and Williams, Int. J. Peptide Protein Res. 20: 451-454 (1982))를 수지(펩티드당 40-60mg, 10μmol Fmoc 아미노산 적재)로서 사용하였다.
반복 커플링을 NMP중의 0.67M BOP 90μl(Gausepohl et al., Peptides 241-243 (1988); Castro et al., Tett. Lett. 14: 1219-1222 (1975)), NMP 2/1 (v/v)중의 NMM 20μl 및 NMP(6배 초과량)중의 적당한 Fmoc 아미노산의 0.60M 용액 100μl(Fields and Noble, Int. J. Pep. Prot. Res. 35: 161-214 (1990))의 혼합물을 각 반응용기에 가함으로써 수행하였다. 반응시간의 70%에 이르렀을 때 디클로로메탄 약 50μl를 각 반응용기에 가하였다.
Fmoc-탈보호를 피페리딘/DMA 1/4(v/v) 3×0.8ml를 각 반응용기에 가함으로써 수행하였다.
커플링- 및 탈보호 시간을 각각 30분과 3×3분에서 출발하여 합성이 진행됨에 따라 증가시켰다.
커플링 및 Fmoc-탈보호후의 세척을 DMA 6×1.2ml로 행하였다. 필요한 순서를 다 한 다음에 최종 Fmoc-보호를 제거하고 펩티딜수지를 DMA, 디클로로메탄, 디클로로메탄/에테르 1/1(v/v) 및 에테르로 각각 연속적으로 세척하고 건조시켰다.
펩티드 절단 및 분리
수지로부터의 펩티드의 절단 및 측쇄 보호기의 제거는 5분 간격으로 TFA/물 19/1(v/v) 6×200μl를 각 반응용기에 가함으로써 수행하여 유리 카르복실산 펩티드를 얻었다. Trp 함유 펩디트를 위해 TFA/물/에탄티올 18/1/1(v/v/v)을 사용하였다.
먼저 TFA를 펩티드에 가한 지 2시간 후에 에테르/펜탄 1/1(v/v) 10ml를 가하고 -20℃로 냉각시켜 합한 여액으로부터 침전되었다. 펩티드를 원심분리(-20℃, 2500g, 10분)로 분리하였다.
펠릿을 에테르/펜탄 1/1(v/v)로 처리하고 동일한 원심분리 과정으로 분리한 후에 펩티드를 15분동안 45℃에서 건조시켰다.
각 펩티드를 물 2ml(또는 10부피% 아세트산 2ml)에 용해하고, 3분동안 액체 질소에서 용액을 동결시키고 원심분리(1300rpm, 8-16시간)하면서 냉동건조시켰다.
분석 및 정제
펩티드의 순도는 역상 HPLC로 측정하고, 약 50nmol의 분액을 30부피% 아세트산 100μl에 용해하였다. 이 용액 30μl를 A: 물, B: 아세토니트릴, C: 물중의 2부피% TFA의 3조 용매시스템이 장착된 RP-HPLC 시스템에 가하였다.
구배 용리(1.0ml/분)를 30분동안 90% A, 5% B, 5% C에서 20% A, 75% B, 5% C로 수행하였다. 검출은 214nm에서 하였다.
임의로 취한 시료를 PDMS상에서 질량 분광법으로 분석하였다. 31개의 결합 펩티드를 모두 PDMS상에서 질량 분광법으로 분석하고 HP Aminoquant상에서 가수분해한 후에 아미노산을 정량분석하였다. 모든 분석시료중에서 이론치와 측정치 질량의 차이는 사용된 장치의 프로듀서로 특정화된 바와 같이 실험오차(0.1%) 내에 있었다. 모든 아미노산 조성물은 기대한 바와 같았다.
실시예 2
펩티드
동결건조한 모든 71개의 MAGE-2 펩티드 중에서, 1mg을 칭량하고 DMSO 10μl에 용해하였다. 모든 용해된 펩티드중에서 0.9% NaCl중의 0.5mg/ml의 희석액을 만들고 pH를 증류수에 희석한 5% 아세트산(CH3COOH, Merck Darmstadt, Germany)으로 또는 증류수에 희석한 1N NaOH(Merck Darmstadt, Germany)로 pH 7로 중화하였다.
세포
174CEM.T2 세포를 100IU/ml 페니실린(Biocades Pharma, Leiderdorp, The Netherlands), 100μg/ml 카나마이신(Sigma St. Louis, USA), 2mM 글루타민(ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, CA, USA) 및 10% 태아단계의 송아지 혈청(FCS, Hyclone Laboratories Inc. Logan, Utah, USA)로 보충된 이스코브(Iscove)의 변형된 둘베코(Dulbecco)의 배지(Biochrom KG Seromed Berlin, Germany)에서 배양하였다. 세포를 가습공기중의 5% CO2, 37℃에서 3일동안 2.5×105/ml의 밀도에서 배양하였다.
펩티드 결합
174CEM.T2 세포를 FCS가 없는 배지에서 2회 세척하고 혈청 없는 배지를 2×106세포/ml의 밀도로 하였다. 이 현탁액중에서 40μl를, 개개의 펩티드 희석액(500ug/ml 내지 15.6μg/ml 범위)의 0.9% NaCl중의 2배 일련의 희석액 10μl와 함께 V 바닥의 96웰 플레이트(Greiner GmbH, Frickenhausen, Germany)에 넣었다. 최종 농도는 8×104174CEM.T2 세포와 함께 200μg/ml 내지 3.1μg/ml 펩티드의 범위에 있다. 이 용액을 온화하게 3분동안 교반하고 나서 가습공기중의 5% CO2, 37℃에서 16시간동안 배양하였다. 다음에 세포를 0.9% NaCl, 0.5% 소혈청 알부민(Sigma St. Louis, USA), 0.02% NaN3(Merck Darmstadt, Germany) 100μl로 1회 세척하였다. 1200rpm에서 원심분리한 후에 펠릿을 4℃에서 30분동안 HLA-A2.1 특정 마우스 단일클론성 항체 BB7.2의 포화량 50μl에 재현탁하였다. 다음에 세포를 2회 세척하고 전체 부피 25μl이고 1:40의 희석액중의 플루오레세인 이소티오시아네이트(Tago Inc. Burlingame, CA, USA)로 콘주게이션된 염소 항마우스 IgG의 F(ab)2단편으로 30분동안 배양하였다.
최종 배양후에, 세포를 2회 세척하고 형광을 FACScan 플로시토미터(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)로 488nm에서 측정하였다. 174CEM.T2 세포상의 HLA-A2.1의 0.5 최대 상향조절을 한 농도는 형광지수가 펩티드 농도에 대해 좌표화된 그래프를 사용하여 측정하였다. 결과는 표 I에 나타낸다.
174CEM.T2 세포주는 "엠프티"를 발현하고 펩티드가 이들 분자의 펩티드 제공 홈에 결합될 때 안정화될 수 있는 불안정한 HLA-A2.1 분자를 발현한다. 용이하게 분해되지 않을 안정화된 HLA-A2.1 분자는 분석한 펩티드의 결합결과이다. 이것은 HLA-A2.1 분자의 세포 표면 발현에서 증가된다. 형광지수는 HLA-A2.1 분자의 상향조절량에 대한 측정값이다. 이 형광지수는 다음 식에 따라 계산된다:
MF=평균 형광
FI=형광지수=
바탕 형광의 형광지수는 0이다.
결과
174CEM.T2 세포로 발현된 HLA-A2.1 분자에 결합할 수 있는 MAGE-2 펩티드를 동정하기 위해, MAGE-2의 아미노산 서열을 van der Bruggen, et al., Science 254: 1643-1647 (1991)에 따라 검사하였다. 공개된 HLA-A2.1 결합모티프에 적합한 9, 10 또는 11개의 아미노산의 모든 펩티드를 검사하였다(표 I).
표 III 중의 서열 1-11의 펩티드만이 실시예 2에 기재된 HLA-A2.1 분자에의 결합을 나타내는, 낮은 펩티드 농도에서 HLA-A2.1 분자의 발현은 상향조절될 수 있었다. 50개의 다른 펩티드는 이것을 할 수 없었다. 형광측정의 결과는 표 I 및 표 II에 주어진다. 174CEM.T2 세포상의 HLA-A2.1 분자의 0.5 최대 상향조절은 FI가 각 개개의 펩티드에 대한 펩티드 농도에 대해 좌표화된 그래프를 사용하여 측정하였다.
이들 실험은 HLA-A2.1 모티프에 적합한 단지 제한된 부분의 펩티드가 고 친화성인 이 HLA 분자에 결합할 수 있어, HLA 분자에 결합하였을 때만 펩티드를 인식하는, 사람 CTL에 의해 인식되는 MAGE-2 단백질인 것을 나타낸다.
| 펩티드 번호 | 아미노산 서열 | 부위 | 서열번호 |
| 1 | STLVEVTLGEV | 잔기 43-53 | 1 |
| - | LVEVTLGEV | 잔기 45-53 | 2 |
| 2 | KMVELVHFL | 잔기 112-120 | 3 |
| 3 | VIFSKASEYL | 잔기 149-158 | 4 |
| 4 | YLQLVFGIEV | 잔기 157-166 | 5 |
| 5 | QLVFGIEVV | 잔기 159-167 | 6 |
| 6 | QLVFGIEVVEV | 잔기 159-169 | 7 |
| 7 | IIVLAIIAI | 잔기 203-211 | 8 |
| 8 | KIWEELSMLEV | 잔기 220-230 | 9 |
| 9 | ALIETSYVKV | 잔기 277-286 | 10 |
| 10 | LIETSYVKV | 잔기 278-286 | 11 |
대부분의 HLA-A2.1 결합 펩티드는 Falk et al., Nature 351: 290-296(1991); Hunt et al., Science 255: 1261-1263(1992); 그리고 Nijman et al., J. Immunother 14: 121-126(1993)에 따라 HLA-A2.1 모티프를 사용하여 발견되었다. 단지 한 개가 추가된 HLA-A2.1 펩티드는 Ruppert et al., Cell 74: 929-937(1993)의 확장된 HLA-A2.1 모티프를 사용하여 발견되었다.
실시예 3
본 실시예는 시험관내에서 1차 면역응답의 유발을 나타낸다. 일반적으로 1차 응답을 유발하는 가능성에 대한 예시로서, MAGE-2 펩티드를 포함하여 프로세싱 검출 세포주 174CEM.T2를 사용하는 HPV 펩티드에 대한 그러한 응답을 나타낸다.
HLA-A2.1 세포 (T2)의 발현은 관련 펩티드 함유 배지에서 T2 세포를 배양함으로써 증가된다. T2 세포는 많은 양의 HLA-A2.1에 결합된 관련 펩티드를 제공하므로 양호한 항원 제공 세포(APC)이다. 최근에 기재된 응답유발 방법에서(Kast et al., J. Immunother 14: 115-120 (1993)), T2 세포주는 APC로서 사용되고 후 피콜 단핵세포는 응답세포로서 사용된다.
방법
1) HLA-A2.1의 T2에의 펩티드 적재
ml당 2×106세포 농도의 T2 세포를, 글루타민(2mM, ICN Biochemicals Inc., Costa Meisa, USA), 항생물질(100IU/ml 페니실린(Brocades Pharma, Leiderdorp, The Netherlands, 100μg/ml 카나마이신(Sigma, St. Louis, USA)) 및 80μg/ml 농도의 선택한 펩티드 MLDLQPETT(서열 62)를 갖는 혈청 없는 IMDM(=Iscoves Modified Dulbecco's Medium: Biochrom KG, Seromed Berlin, Germany)에서 T25 플라스크(Becton Dickinson, Falcon, Plymouth England)에서 37℃에서 13시간동안 배양하였다.
2) HPV로부터의 T2 항원 제조 세포(APC)의 미토마이신 C 처리
이들 배양된 T2 항원 제조 세포를 스핀다운하고 이어서 37℃에서 1시간동안 혈청 없는 RPMI(Gibco Paisley Scotland) 배지에서 미토마이신 C가 있는 20×106세포/ml(50μg/ml)의 밀도에서 처리하였다. 다음에 T2 세포를 RPMI에서 3회 세척하였다.
3) 1차 면역응답 유발을 위한 제조
96-웰-U 바닥 플레이트(Costar, Cambridge, USA)의 모든 웰을, 50μl의 혈청 없는 RPMI 완전배지(글루타민(2mM, ICN Biochemicals Inc., Costa Meisa, USA), 페니실린(100IU/ml, Brocades Pharma, Leiderdorp, The Netherlands), 카나마이신(100μg/ml, Sigma, St. Louis, USA)) 및 80μg/ml 농도의 펩티드 MLDLQPETT(서열 21)에서 100,000 미토마이신 C-처리된 T2 세포로 충전하였다.
4) 응답세포
응답세포는 HLA-A2.1 아형 도너의 단핵 말초혈 림프구(PBL)이다. PBL을 피콜-과정(피콜 제조: Lymphoprep of Nycomedpharma, Oslo, Norway)에 의해 연막으로부터 분리하고 RPMI에서 2회 세척하였다. 분리 및 세척후에, PBL을 30% 사람 푸울화된 혈청(HPS)이 있는 RPMI 완전배지에서 재현탁하였다(HPS를 혼합 림프구 배양물에서 현탁 활성에 대해 시험하였다).
5) 1차 면역응답 유발
50μl의 배지(문단 4에서 기재한 배지, 상기 참조)중의 400,000 PBL을 T2 세포로 미리 충전된 96-웰-U 바닥의 플레이트의 각 웰에 가하고 5% CO2및 90% 습기가 있는 배양기에서 37℃에서 7일동안 배양하였다.
6) 재자극(7일)
PBL, 펩티드 MLDLQPETT(서열 21) 및 상기한 T2 세포의 배양후 7일째에, PBL을 펩티드 MLDLQPETT(서열 62)로 재자극하였다. 이 목적을 위해 96웰 이외의 배지 및 모든 세포를 수확하였다. 생존가능한 세포를 피콜-과정으로 분리하고 RPMI에서 세척하였다. 새로운 96-웰-U 바닥 플레이트에서 이들 생존가능한 세포 50,000개를 15% HPS가 있는 50μl의 RPMI 완전배지와 함께 각 웰에 시딩하였다. 웰당 20,000개의 자기이식한, 조사된 (3000rad) PBL 및 50,000개의 자기이식한, 조사된 (10000rad) EBV-형질전환된 B-림프구를 80μg/ml의 농도에서 15% HPS 및 펩티드 MLDLQPETT(서열 62)가 있는 50μl의 RPMI 완전배지와 함께 가하였다. 세포를 5% CO2및 90% 습기가 있는 배양기에서 37℃에서 7일동안 배양하였다.
7) 재자극(14일)
PBL, 펩티드 MLDLQPETT(서열 62) 및 T2 세포의 배양후 14일째에, PBL을 펩티드 MLDLQPETT(서열 62)로 재자극하였다. 포인트 6으로 이 과정을 하기 위해 상기한 내용을 반복하였다.
8) 제한 희석에 의한 클로닝
PBL, 펩티드 MLDLQPETT(서열 62) 및 T2 세포의 배양후 21일째에, 96웰 이외의 배지 및 세포를 수확하였다. 생존가능한 세포를 피콜-과정으로 분리하고 15% HPS가 있는 RPMI 완전배지에서 세척하였다. 이 생존가능한 세포의 벌크 배양물을 제한 희석으로 클로닝하였다. 새로운 96-웰-U 바닥 플레이트(Costar, Cambridge, USA)의 각 웰에 15% HPS가 있는 50μl의 RPMI 완전배지를 100개의 생존가능한 세포(=HPV16 벌크 항 MLDLQPETT(서열 62))와 함께 가하였다. 다른 새로운 96-웰-U 바닥 플레이트에 대해 이것을 웰에 대한 세포수는 후속 플레이트가 웰당 10, 1 또는 0.3개의 세포에서 세포의 희석액을 함유한 것만 제외하고 정확하게 반복하였다. 모든 웰에 20,000개의 푸울화되고 조사된 (3000rad) PBL의 4개의 상이한 도너 및 10,000개의 푸울화되고 조사된 (10,000rad) EBV-형질전환된 B-세포의 3개의 상이한 HLA-A2.1 도너(VU-4/518/JY)를 15% HPS 및 40μg/ml 농도의 펩티드 MLDLQPETT(서열 62), 2ug/ml 농도의 루코어글루티닌(Pharmacia, Uppsala, Sweden), 120IU/ml 농도의 사람 재조합 IL-2(Eurocetus, Amsterdam, The Netherlands)가 있는 50μl의 RPMI 완전배지와 함께 가하였다.
9) 팽창 클론
웰당 100μl의 최종 부피로 다음을 가한다=>
-25,000 생존가능한 세포
-20,000 조사된 PBL-푸울(상기 참조)
-10,000 조사된 EBV-푸울(상기 참조)
-2μg 펩티드 MLDLQPETT(서열 62)
-6 IU 재조합 IL-2.
49일째에 세포독성 분석을 표적세포로서 T2(관련 펩티드 MLDLQPETT(서열 62)가 있거나 또는 없음) 및 이펙터 세포로서 어떤 혼합 배양물 시료 및 65개의 클론으로 수행하였다. 바탕 킬링은 무관한(그러나 HLA-A2.1 결합) 펩티드: GILGFVFTL(서열 64)로 배양한 T2 세포의 킬링으로 정의된다. 이 인플루엔자 매트릭스 단백질 유래의 펩티드는 HLA-A2.1 제한된 인플루엔자 특이적 CTL에 대한 에피토프이고 본 기술분야에서 공지되어 있다.
HPV 벌크 항-서열 62 이펙터 세포는 서열 62 민감세포를 킬링하는데 특이적이라고 생각된다.
제한희석 분석은 HPV 벌크 배양세포로 행해지고, 23일 후에 세포독성 분석은 5개의 클론으로 수행하였다. 대표 클론의 결과는 도 2에 나타낸다.
실시예 4
몇 개의 군이 펩티드의 HLA-A*0201 분자에의 결합에 대한 필요조건으로 보고되었다. 매우 중요한 (앵커), 및 중요한 (우성) 잔기는, 예를들면 모두 참고로 포함되는 Falk et al., Nature 351: 290 (1991); Nijman et al., Eur. J. Immunol. 23: 1215 (1993); Ruppert et al., Cell 74: 929 (1993)에 기재되었다. 둘 다 참고로 포함되는 Drijfhout et al., Human Immunol. 43: 1 (1995); D'Amaro et al., Human Immunol. 43: 13 (1995)에 기재된 스크리닝 프로그램, 이들 논문의 데이터를 사용하여, MAGE-2에 대해 유래된 아미노산 서열을 추정되는 결합 펩티드에 대해 스크리닝하였다. 펩티드는 한 앵커 및 한 우성 잔기 또는 두 앵커 잔기가 존재한다면 참고 모티프에 적합하다고 생각되었다. 모든 이들 펩티드를 공지된 고상 합성기술을 사용하여 합성하고, 다음에 참고로 포함되는 van der Burg et al., Human Immunol. 44: 189-198 (1995)에 따라 펩티드 결합경쟁 분석에서 시험하였다. 요약하면, HLA-A*0201에 대한 EBV 형질전환된 B 세포주 동질접합체인 세포주 JY를 90초 동안 얼음 냉 시트르산 완충액(pH 3.2)에 노출시켜 결합펩티드로 스트리핑하였다. (완충액은 0.263M 시트르산, 0.123M Na2HPO4와 동일한 부피였다). 다음에 스트리핑한 세포를 IMDM으로 세척하고 다음에 1.5ug/ml β-마이크로글로불린으로 보충된 IMDM으로 재현탁하였다. 참고 펩티드, 즉
Phe Leu Pro Ser Asp Cys Phe Pro Ser Val
(서열 63)
을 사용하고 시스테인 잔기에서 플루오레세인으로 표지화하였다. 분석에서, 150nM의 서열 63을 96웰, U 바닥 플레이트의 별도의 웰에 놓고, 여기에 가해진 시험용 펩티드의 양을 적정하였다. 스트리핑한 JY 세포(7×105세포)의 시료를 24시간동안 4℃에서 펩티드로 배양하였다. 다음에 세포를 1% 소혈청 알부민 함유 PBS로 세척하고 나서 10% 파라포름알데히드 함유 PBS로 고정하고 형광 표지된 참고 펩티드의 결합억제에 대해 분석하였다.
억제율은 다음 식을 사용하여 측정하였다:
1=
"MF 바탕값"은 참고 펩티드가 없이 얻어진 형광값을 의미하도록 언급된다. "MF 참고 펩티드"는 단지 150nm의 참고 펩티드로 배양한 후에 얻어진 형광값을 의미하도록 언급된다. 반로그 형태의 펩티드중 몇몇 일련의 희석액의 결과를 좌표화함으로써, 50% 억제율("IC50")을 계산할 수 있었다. 다음의 표 IV는 몇몇 이들 데이터를 나타낸다. 서열은 시험한 펩티드가 앞의 실시예에서 언급된 것일 때 제공된다. 아스테리스크(*)는 IC50이 100μM 보다 큰 것을 가리키고 서열 71, 72 및 73은 HLA-A*0201 분자를 결합하는 것으로 공지되어 있는 모든 종래기술의 펩티드이다.
| 펩티드 | IC50 |
| 서열 1 | * |
| 서열 3 | 7 |
| 서열 4 | * |
| 서열 5 | 7 |
| 서열 6 | 47 |
| 서열 7 | 26 |
| 서열 8 | * |
| 서열 9 | 10 |
| 서열 10 | * |
| 서열 11 | * |
| 서열 13 | * |
| 서열 15 | 30 |
| 서열 27 | 80 |
| 서열 31 | 42 |
| 서열 47 | 6 |
| 서열 48 | * |
| Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val(서열 64) | 17 |
| Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val(서열 65) | * |
| Lys Ala Ser Glu Tyr Leu Gln Leu Val(서열 66) | 14 |
| Gln Val Met Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile(서열 67) | 82 |
| Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu(서열 68) | 27 |
| Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Glu Thr(서열 69) | 9 |
| Phe Leu Pro Ser Asp Asp Phe Pro Ser Val(서열 70) | 1 |
| Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu(서열 71) | 3 |
| Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(서열 72) | 9 |
대조표준을 제외한 단지 7개의 펩티드가 저농도에서 사용될 때의 참고펩티드, 즉 서열 3, 5, 9, 47, 64, 66 및 69의 결합을 억제할 수 있다는 것을 주목한다. 다음에 이들 펩티드를 다른 실험에서 시험하였다.
실시예 5
실시예 4의 실험은 착체 안정성에 관련된 인자로서 온도를 배제하는 4℃에서 시행하였다. 제2세트의 실험을 37℃의 사람 생리학적인 온도에서 시행하였다. van der Burg, et al., J. Immunol. 156(1) 33087에 따른 방법은 본질적으로 다음과 같다. 실시예 4에 기재된 JY 세포를 에메틴으로 처리하여 단백질 합성을 중지시켰다. 이것은 세포가 그 표면상에서 새로 합성된 HLA-A*0201 분자를 제공하는 것을 못하게 한다. 다음에, 세포를 온화한 산 처리의 사용을 통해 어떤 제공된 펩티드로 스트리핑하였다. 다음에 이것을 200ug/ml의 농도에서 시험용 펩티드와 접촉시켰다. 펩티드 적재된 세포를 냉 이스코버 변형된 둘베코의 배지(IMDM)로 세척하고 0시간에서 출발하여 2, 4 및 6시간동안 37℃에서 IMDM에서 배양하였다. 존재하는 HLA-A*0201 펩티드 착체량을 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수가능한 HLA-A2 구조-특이적 단일클론성 항체 BB 7.2와, GaM-Fitc로 세포를 착색함으로써 측정하였다. 접촉 단계를 FACScan 분석으로 수행하였다. 다음에 형광지수를 계산하였다:
F1=
MF바탕값은 펩티드 없이 얻은 값이다. 각 시료를 두 번 시험하고 평균 FI를 각 나열된 시간 지점에서 계산하였다. 잔존 HLA-A2 분자의 백분율을 t=0에서 FI를 발견함으로써 계산하고 다음을 적용하였다:
%잔존(t=n)=(FIt=n/FIt=0)×100
펩티드의 MHC로부터의 분리는 선형 프로세스인 것이 공지되어 있다. 또한 장기간동안 안정한 착체를 형성하기 위한 펩티드의 능력은 생체내에서의 그 펩티드의 면역원성에 관련된다는 것이 공지되어 있다. (예를들면 van der Burg, et al., 상기 참조). 펩티드의 안정성은 t=2에서 출발하여 분자의 50%가 붕괴하는데 필요한 시간에서 측정하였다. 이 값은 이하 "DT50"으로 언급된다. 순차측정의 선형 복귀분석은 DT50을 계산할 수 있는 잔존 HLA-A2 분자의 백분율에 대해 좌표화하였다. 상기 나열된 7개의 펩티드중에서, 서열 3, 5 및 9는 37℃에서 6시간에 걸쳐 DT50이 있는 펩티드-HLA-A*0201 착체를 유발하였다. 다른 펩티드는 저레벨의 친화성을 나타냈다.
| 펩티드 | IC50 | DT50 |
| 서열 3 | 7 | >6 |
| 서열 5 | 7 | >6 |
| 서열 9 | 10 | >6 |
| 서열 47 | 6 | 3 |
| 서열 64 | 17 | 4 |
| 서열 66 | 14 | 3.5 |
| 서열 69 | 9 | 5 |
시험용 펩티드 서열 71 및 72는 둘다 6보다 큰 DT50값을 가졌다.
실시예 6
상기 나열된 펩티드의 면역원성을 시험하였다. 이들 실험에서, 유전자 도입된 HLA-A*0201Kb마우스를 사용하였다. 이들 마우스는 키메릭 HLA-A*0201Kb유전자의 생성을 발현하고, 여기서 HLA-A*0201의 α3 도메인은 무린 H-2Kbα3 도메인으로 치환된다. 얻어진 분자는 HLA-A*0201 분자에 결합하고, 무린 CD8+세포와 상호작용한다.
마우스를 2-3개의 동물군으로 사용하였다. 각각을 인컴플릿 프로인트 조제에 유화된, 참고로 포함되는 Millich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1610 (1988)에 기재된 바와 같은, HBV 코어 항원 유래의 T 헬퍼 에피토프 140μg과 혼합된 펩티드 50μg으로 플랭크에 주사하였다. 동물을 동일한 혼합물로 14일 후에 부스팅하였다. 마우스를 최후 주사한 지 11-14일 후에 희생시키고 이들의 비장세포를 나일론 울에 통과시키고, 정치한 T25 조직배양 플라스크에서 페니실린, 8% 열 불활성화된 FCS 및 20μM 2-메르캅토에탄올로 보충된, 1×107완전히 세척된, 동유전자형의 펩티드 적재의 LPS-유도 림프원구 IMDM으로 시험관내에서 3×107개의 세포 시료를 재자극하였다. 배양물을 5% CO2가습된 공기 분위기하에서 37℃에서 6일동안 배양하고 나서 이들 벌크 배양물의 세포융해 활성을 시험하였다. 이것은, 예를들면 De Waal et al., J. Immunol. 125: 2665 (1983); Bouma et al., Human Immunol. 35: 85 (1992)에 따라 형광 유로퓸 방출분석 또는 표준51Cr을 포함하였다. 요약하면, 표지된 표적 세포를 37℃에서 적어도 20분동안 10μg/ml의 펩티드로 적재하였다. 다음에 적정한 양의 이펙터 세포를 적어도 4시간동안 동일한 양의 표적세포로 배양하였다. 자연발생 및 최대 방출을 6개의 군에서 측정하였다. 응답은 특정 펩티드로 적재된 표적세포의 세포독성 분석에서의 세포분해가 두 E/T 비에서 적어도 10% 더 높을 때 비적재된 표적세포의 바탕 세포분해보다 양성이라고 생각된다. 도 3A-도 3D는 펩티드 서열 71 뿐만 아니라 서열 3, 5 및 9에 대한 양성의 벌크 배양 결과를 제공한다. 잔존 펩티드는 면역원성이 없었다.
실시예 7
상기 언급된 벌크 CTL 배양물을 TNF 방출분석으로 시험하였다. 구체적으로, COS-7 세포를 Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365 (1987)의 공지된 DEAE-덱스트란 클로로퀸 방법을 사용하여, HLA-A*0201Kb, MAGE-2 및/또는 pcDNAI/Amp로 클로닝된 티로시나제 cDNA로 트랜스펙션하였다. 48시간 후에, 배지를 따라내고, COS-7 세포를 TNF 방출분석에서 자극기 세포로서 사용하였다. 요약하면, 5×103무린, 벌크 배양물 세포, 또는 2×103사람 CTL을 트랜스펙션된 COS-7 세포에 가하였다. 24시간 후에, 상청액을 수확하고 TNF 내용물을 TNF 민감 WEHI 164 클론 13개의 세포를 사용하여 측정하였다.
펩티드 서열 3 및 5로 면역된 마우스로부터 유래된 벌크 배양물은 HLA-A*0201Kb및 MAGE-2로 트랜스펙션된 COS-7 세포의 인식을 나타냈고, 이들 두 펩티드를 처리하여 HLA-A*0201로 제공하였다.
데이터는 서열 1-11의 펩티드가 동정된 서열의 단일 폴리펩티드인 것을 제안한다. 그러나, 이들 펩티드의 상동체, 이소형 또는 유전자 변이체는 세포 환경내외에서 존재할 수 있다. 본 발명은 상기 펩티드의 모든 그러한 상동체, 이소형 또는 유전자 변이체를 포함하는데, 단 이들은 HLA-A2 분자에 결합한다.
펩티드의 상동체인 폴리펩티드는 구체적으로 표 II에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 40% 전환된, 바람직하게는 적어도 약 60% 전환된, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 전환된 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다.
상기한 펩티드의 다른 변이체는 본 발명 범위에 포함된다는 것이 본 기술분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다. 이것은 구체적으로 단지 보존 아미노산 치환에 의해서만 상기 언급되고 합성된 펩티드와 상이한 어떤 변이체를 포함한다. 특히, C(시스테인)를 A(알라닌), S(세린), α-아미노부티르산 및 다른 것들로 치환하는 것은 시스테인 함유 펩티드가 합성 및 취급동안에 (공기) 산화되기 쉽다는 것이 공지되어 있기 때문이다. 많은 그러한 보존 아미노산 치환은 Taylor, J. Mol. Biol. 188: 233-258 (1986)에 기재되어 있다.
상기한 펩티드 또는 그것의 단편은 보존 아미노산 치환, 결실 또는 다른 프로세스에 의해서든지 아미노산 서열에서의 어떤 변이를 포함하는데, 단 폴리펩티드는 HLA-A2 분자에 결합한다. 펩티드의 단편은 5개 이상의 아미노산 만큼 적은 서열의 소 펩티드일 수 있고, 상기 서열은 상기 폴리펩티드가 HLA-A2.1 분자에 결합할 때 표 II에 기재된 것이다.
나타낸 펩티드보다 큰 폴리펩티드는 특히 본 발명 범위내에 포함되고, 이 때 상기 폴리펩티드는 HLA-A2.1 양성 개체에서의 MAGE-2 특정 CTL 응답을 유발하고 표 II에 기재된 (일부) 아미노산 서열 또는 그것의 보존 치환을 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 9 내지 12개, 보다 바람직하게는 9 내지 11개 또는 9 내지 10개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
본 발명은 고상 기술등이 있는 유전자공학, 펩티드 합성이든지 모든 방법으로 생성된 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 상기 펩티드는 말단부에서 제작된 다양한 화학적 변형을 가질 수 있고 이것은 본 발명 범위내에 있다. 또한 다른 화학적 변형도 가능하고, 특히 환상 및 다이머 구조가 가능하다. 용어 "유도체"는 모든 그러한 변형된 펩티드를 커버하도록 의도된다.
본 발명의 폴리펩티드는 흑색종 세포 및 다른 암 세포를 포함하는 MAGE-2 발현세포 관련된 질병의 예방, 진단 및/또는 치료 또는 방지에 대한 유용성을 찾을 수 있다.
모든 적용을 위해 펩티드는 면역원 형태로 투여된다. 펩티드가 비교적 짧기 때문에, 이것은 액체등 또는 조제의 사용과 같은 면역원성 부여 결합 담체물질이 있는 혼합물, 착체, 콘주게이션 또는 화학약품을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 예방적 또는 치료적 사용량의 크기는 물론, 환자(나이, 성, 체중 등), 치료될 상태의 심한 정도, 본 발명의 특정 폴리펩티드 및 그 투여경로 군으로 다양해질 것이다. 어떤 적당한 투여경로는 본 발명에 의해 동정된 폴리펩티드의 효과적인 투여량 뿐만 아니라 약학 분야에서 공지된 어떤 투여형태를 달성하는데 사용될 수 있다. 또한 폴리펩티드는 서방형 수단 및/또는 운반장치에 의해 투여될 수 있다. 이들은 특히, T 세포 활성화제 유사 인터루킨-2 등과 같은 다른 활성물질과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 진단사용과 같은 다른 목적에도 유용할 수 있다. 예를들면, 이들은 본 발명에 따른 펩티드에 의한 백신주사가 성공적이었는지를 체크하는데 사용될 수 있다. 이것은 상기 펩티드가 백신주사한 사람의 T 세포를 활성화할 수 있는지를 시험관내에서 시험함으로써 행해질 수 있다.
상기한 바와 같이, HLA-A*0201 및 특정 펩티드와 같은 HLA-A2 분자의 착체에 특이적인 분리된 세포융해 T 세포 클론("CTL") 및 생체내에서의 이것의 제조방법도 생각된다. 본 문맥에서 "제조"는 본질적으로 HLA-A2 분자에 의해 특정 펩티드의 제시에 의한 CTL의 자극증식을 의미한다. 이것은, 예를들면 추가의 CTL를 필요로 하는 피험체를 사용하여 행할 수 있다.
펩티드 및 HLA-A2 분자의 모든 착체가 CTL 증식이 되는 것은 아니나, 표적 HLA-A*0201 분자에 대한 펩티드의 특이성은, 그래도 세포가 HLA-A2 양성인지 아닌지를 알기 위한 진단 마커로서 유용하다는 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 기술분야의 숙련자에게 분명하고 여기서 반복할 필요는 없다.
사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명하는 용어로서 사용되고, 나타낸 그리고 기재된 특징의 어떤 대등물 또는 그것의 일부를 배제하는 그러한 용어 및 표현의 사용을 의도하지 않고, 다양한 변형이 본 발명 범위내에서 가능하다는 것을 인식한다.
서열목록
(1) 일반적 정보
(i) 출원인:
(ii) 발명의 명칭: 펩티드 및 ＨＬＡ-Ａ2 분자의 착체에 특이적인 ＭＡＧＥ-2, 세포융해 Ｔ세포로부터 유래된 분리 펩티드 및 그것의 사용
(iii) 서열의 개수 : 69
(iv) 서신연락주소:
(A) 수신인: 펠프 앤드 린치
(B) 거리: 써드 애비뉴 805
(C) 도시: 뉴욕
(D) 주 : 뉴욕
(E) 국명: 미국
(F) 우편번호: 10022
(v) 컴퓨터판독형태:
(A) 매체유형: 저장장치 360 kb 5.25인치 디스켓
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 운영체계: PC-DOS
(D) 소프트웨어: 워드퍼팩
(vi) 계류중 출원데이타:
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(vii) 선출원 데이타:
(A) 출원번호: 08/217,188
(B) 출원일 : 1994년 3월 24일
(viii) 대리인정보:
(A) 성명: 핸슨 노르만 디.
(B) 등록번호: 30,946
(C) 사건번호: LUD 5447
(ix) 전기통신정보:
(A) 전화: (212) 688-9200
(B) 팩스: (212) 838-3884
(2) 서열 1에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 2에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 3에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 4에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 5에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 6에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 7에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 8에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 9에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 10에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 11에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 12에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 13에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 14에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 15에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 16에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 17에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 18에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 19에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 20에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 21에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 22에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 23에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 24에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 25에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 26에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
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(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 27에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 28에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 29에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 30에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 31에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 32에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
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(2) 서열 33에 대한 정보
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(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
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(2) 서열 34에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 35에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 36에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 37에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
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(2) 서열 38에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
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(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 39에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 40에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
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(D) 형태: 선형
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(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 42에 대한 정보
(i) 서열특징:
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(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(2) 서열 45에 대한 정보
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(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(2) 서열 46에 대한 정보
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(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 47에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(A) 길이: 10 아미노산 잔기
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(2) 서열 49에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
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(2) 서열 50에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 51에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 11 아미노산 잔기
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(2) 서열 52에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(2) 서열 53에 대한 정보
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(A) 길이: 10 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
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(2) 서열 56에 대한 정보
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(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 57에 대한 정보
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(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 58에 대한 정보
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(A) 길이: 9 아미노산 잔기
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(i) 서열특징:
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(2) 서열 60에 대한 정보
(i) 서열특징:
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(2) 서열 61에 대한 정보
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(A) 길이: 11 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
(2) 서열 62에 대한 정보
(i) 서열특징:
(A) 길이: 9 아미노산 잔기
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자유형: 단백질
Claims (7)
- HLA-A2 분자 및 서열 3, 서열 5 및 서열 9중 하나의 착체에 특이적인 분리된 세포융해 T 세포클론.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리된 세포융해 T 세포클론은 HLA-A2 분자의 착체에 특이적인 것을 특징으로 하는 분리된 세포융해 T 세포클론.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리된 세포융해 T 세포클론은 HLA-A2 분자 및 서열 5의 착체에 특이적인 것을 특징으로 하는 분리된 세포융해 T 세포클론.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리된 세포융해 T 세포클론은 HLA-A2 분자 및 서열 9의 착체에 특이적인 것을 특징으로 하는 분리된 세포융해 T 세포클론.
- HLA-A2 및 서열 3, 서열 5 및 서열 9중 하나의 착체에 세포융해 T 세포증식을 유발하는데 충분한 양으로, 서열 3, 서열 5 및 서열 9중 적어도 하나의 양을 세포에 HLA-A2 분자를 제공하는 피험체에 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 피험체에서 세포융해 T 세포의 제조를 유발하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 피험체가 세포융해 T 세포 증식을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68 및 서열 69로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
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