DE69519126T2

DE69519126T2 - Glycophospholipid und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE69519126T2
Application number: DE69519126T
Authority: DE
Inventors: Goro Hanagata; Makoto Shiota; Kiyoshi Tatsumi
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1994-05-17
Filing date: 1995-05-16
Publication date: 2001-03-01
Anticipated expiration: 2015-05-17
Also published as: JP2787279B2; EP0684252B1; US5856453A; DE69519126D1; EP0684252A1; JPH0834793A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Glycophospholipid, worin das Glycophospholipid an ein Zuckermolekül bindet und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Das erfindungsgemäße Glycophospholipid ist als biochemisches Reagenz, Rohmaterial für die Medizin und Nahrungsmittel oder als oberflächen aktives Mittel nützlich.

2. Hintergrund der Erfindung

Phospholipide haben verschiedene Funktionen im Organismus. Phospholipide, wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin als Komponente der Biomembran bilden eine bimolekulare Lipidmembran, um die Zellmembranen vor der äußeren Umgebung zu schützen, wodurch eine geeignete Umgebung zum Funktionieren des Proteins zur Verfügung gestellt wird. Zusätzlich ist bekannt, daß sie als Quelle für Cholin, Phosphor, Fettsäuren dienen und als Depot von Arachidonsäure zur Biosynthese von Prostaglandinen dienen. Kürzlich ist ein Kontrollmechanismus der Zelldifferenzierung teilweise gelüftet worden. Mehr noch einige Phospholipide, wie PAF (Plättchen-Aktivierungs-Faktor) demonstrieren selbst starke physiologische Aktivität. Demgemäß haben Phospholipide wichtige Funktionen im Körper.
Glycolipide sind auch die Bestandteile der Zellmembran. Diese Glycolipide auf der äußeren Oberfläche der Zellmembran werden angesehen, daß sie als Oberflächen-Marker der Zelle dienen, weil die Vielfalt der Zuckerkette und der verschiedenen Muster der Zuckerkettenexpression gemäß der Art der Zellen ist. Die differenzierten Zellen exprimieren ein spezifisches Glycolipid auf der Oberfläche der Zelle. Die Tatsachen legen nahe, daß die Glycolipide verschiedene Zellfunktionen haben. Zum Beispiel die Funktion als Rezeptor, um die Aktivität der Membran gebundenen Enzyme zu kontrollieren, um den Ionenkanal zu kontrollieren, um die Fluidität der Membran zu kontrollieren, um die Zelldifferenzierung, etc. zu kontrollieren.
Glyceroglycolipide sind allgemeine Namen für Materialien, die sowohl eine wasserlösliche Zuckerkette als auch eine fettlösliche Gruppe in einem Molekül enthalten. In Tierzelle sind die meisten Glycolipide Sphingolipide, die Sphingosin enthalten. Glycolipide, die Glycerin enthalten, sind nur in Pflanzen, Bakterien, etc. gefunden worden. Kürzlich wurde die Ansicht vertreten, daß Glyceroglycolipide eine gewisse physiologische Aktivitäten in Tierzellen haben, zum Beispiel, da ein Seminolipid gefunden wurde, das in Schwemetests existiert. In Verbindung mit Phospholipid und Zucker ist gefunden worden, daß Phosphatidylinositol als ein Anker (GPI- Anker) funktioniert, der zu dem Protein über Inositol eine Zuckerkette an ein Molekül bindet, um das Protein an die Zellmembran zu binden. Strukturanalysen von verschiedenen GPI- Ankern, wie denen des Antigens der Trypanosomamembran, der Acetylcholinesterase der menschlichen roten Blutzelle, etc. ist berichtet worden. Das Protein kann sich an die Oberfläche der Membran bewegen, so daß GPI angesehen wird, die enzymatische Aktivität und Funktion als ein Rezeptor zu kontrollieren. Phospholipide, die eine ähnliche strukturelle Zusammensetzung haben, wie im vorliegenden Anspruch 1 definiert, werden in J. Biol. Chem. 264, Seiten 13834-13839 (1989), Biochem. Biophys. Acta. 1124, Seiten 241-248 (1992) und Biochem. Biophys. Acta. 1112, Seiten 251-258 (1992) beschrieben.
In Biochem. J. 78, Seiten 185-194 (1961) wird ein Verfahren zur Isolierung von Butter- Phospholipiden beschrieben, das die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und die Chromatographie an einer Säule aus Kieselsäure verwendet.
In Chem. Int. (1968), Seiten 1731-1732 wird beschrieben, daß Phospholipide, die chemisch gebundene Zuckerreste enthalten, zum Beispiel aus Butter isoliert, eine hohe emulgierende Aktivität haben und als effiziente Emulgatoren verwendet werden können.
Des weiteren ist aus der US-A-4,762,822 bekannt, daß Organismen, die gastrointestinale Krankheiten verursachen, mit Salicylsäure und Gangliosiden, d. h. einem Typ der Glycolipide, reduziert werden können.
DE 42 21 190 A1 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von einem derartigen Gangliosid aus Milch.
FR 2 692 781 bezieht sich auf kosmetische Zusammensetzungen, die Sphingomyelin oder andere Lipidkomplexe enthalten.
EP 0 493 622 A1 beschreibt eine Verbindung, die ein Glycosaminoglycan enthält, das mit einem Phospholipid oder Lipid kombiniert ist, das die pharmakologische Aktivität der Inhibierung von Krebsmetastasen hat.
Die Erfinder haben ein Material gefunden, das die Eigenschaft der Farbreaktion auf Phospholipid und Zucker mittels Dünnschicht-Chromatographie in isolierten und gereinigten Fraktionen aus Milch zeigt und haben eine Fraktion aus Phospholipid mittels wiederholtem Reinigen und Isolieren gemäß hauptsächlich den Verfahren der Fettverbindungsreinigung, einschließlich der Säulenchromatrographie, isoliert. Als Ergebnis der Strukturanalyse von diesen Fraktionen wurde zum ersten Mal bestätigt, daß ein unbekanntes Glycophospholipid in der Milch existiert.
Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein neues Glycophospholipid, insbesonders ein Glycophospholipid, worin Zucker an Glycerophospholipid gebunden ist und beabsichtigt ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Glycophospholipids zur Verfügung zu stellen.

Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein zweidimensionales NMR Spektrum des erfindungsgemäßen Glycophospholipids.
Fig. 2 zeigt ein NMR Spektrum des erfindungsgemäßen Glycophospholipids.
Fig. 3 zeigt Absorptionsspektren des erfindungsgemäßen Glycophospholipids gemäß der Fourier-Transformations-Infrarot Analyse. Die Figur A und B sind jeweils Absorptionsspektren des Standard- Phosphatidylethanolamins und des Glycophospholipids der vorliegenden Erfindung.
Fig. 4 zeigt FAB-MS Spektren des erfindungsgemäßen Glycophospholipids. M bedeutet ein repräsentatives Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Glycophospholipids. In der Figur bedeutet [M-162-162-H]&supmin; ein Fragment des Materials mit der Eliminierung von zwei Sacchariden und [M-162-H]&supmin; bedeutet ein Spektrum des Materials mit der Eliminierung von einem Saccharid und [M-H]&supmin; bedeutet ein Spektrum [TM1] eines Materials mit der Eliminierung von einem Wasserstoff.
Fig. 5 zeigt GC-MS Spektren des erfindungsgemäßen Glycophospholipids. In der Figur zeigt die obere Spalte von (a) ein Massenspektrum des abgetrennten Materials der GC- Retentionszeit von 17,949 Minuten und die untere Spalte zeigt ein Massenspektrum des 1,5-Diacetyl-2,3,4,6-tetra-O- Methylhexitol. In der Figur ist die obere Spalte von (b) das Massenspektrum des abgetrennten Materials der GC Retentionszeit von 23,361 Minuten und die untere Spalte ist das Massenspektrum von 1,5,6-tri-O-Acetyl-2,3,4-tri-O- methylhexitol.
Fig. 6 zeigt Dünnschichtchromatogramme des erfindungsgemäßen Glycophospholipids bei verschiedenen Schritten der Reinigung. In Fig. 6, bedeutet Fr. Fraktion, GPL bedeutet erfindungsgemäßes Glycophospholipid, SPM bedeutet Sphingomyelin, PC bedeutet Phosphatidylcholin, LacCer bedeutet Lactosylceramid.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Glycophospholipids zur Verfügung zu stellen, das die folgende allgemeine Formel [I] hat:
(worin R&sub1; und R&sub2; derselbe oder verschiedene gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffreste bedeuten und die zwei Galactosereste eine N-Glycosidbindung aufweisen) aus Milch oder Milchprodukt; und weiter die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften (1) bis (9) aufweist:
(1) die folgenden Protonenpeaks nachgewiesen durch Protonen- NMR: vier Peaks bei ungefähr 4,0 ppm, ein Protonenpeak bei 5,1 ppm, ein anomerer Protonenpeak bei 4,2 ppm, ein Methylprotonenpeak bei 0,9 ppm und ein Protonenpeak bei 1,5- 3,0 ppm;
(2) charakteristische Absorption bei 3500 cm&supmin;¹, 1000 cm&supmin;¹ und 1300 cm&supmin;¹ nachgewiesen durch Fourier-Transformations- Infrarotanalyse
(3) zersetzt durch Phospholipase C;
(4) Farbreaktion charakteristisch für Phospholipid unter Verwendung Dittmer-Lester-Reagenz;
(5) Freisetzen von Zucker durch β-Galactosidase;
(6) Farbreaktion charakteristisch für Zucker unter Verwendung von Oricinol-Schwefelsäure, Diphenylamin-anilin-Reagenz;
(7) aufweisend Galactose als einen konstituierenden Zucker;
(8) Färbung mit Ninhydrin;
(9) C&sub1;&sub2;&submin;&sub2;&sub0; gesättigte oder ungesättigte Fettsäure nachgewiesen durch Analyse von Methylester nach Zersetzung mit Salzsäure/Methanol;
aufweisend extrahieren mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol oder Chloroform/Methanol/Wasser, waschen mit Aceton und reinigen mit Silikagelchromatographie, nach Zersetzung von Protein in dem Milchprodukt mit einer Protease und schrittweiser Extraktion mit Methanol und Chloroform.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung des obigen Glycophospholipids aus Milch oder Milchprodukt als Startmaterial zur Verfügung zu stellen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Das erfindungsgemäße Glycophospholipid kann aus Milch oder Milchprodukt extrahiert oder gereinigt werden. Als Milchprodukte können Fettfraktionen, die aus Käsemolke, Buttermilch, etc. erhalten werden, verwendet werden. Zum Beispiel, wie in den Beispielen gezeigt, werden Protein aus Käsemolke, pulverisierter Käsemolke, Buttermilch, etc. von Protease zersetzt, daraufhin wird Methanol, Chloroform hinzugefügt, dann gerührt, um das Verbindungsfett zu extrahieren. Das Glycophospholipid kann hergestellt werden, indem derartige Fettfraktionen mit einer Mischung aus Chloroform/ Methanol oder einer Mischung aus Chloroform/Methanol/ Wasser, extrahiert werden, gefolgt von Silicagel- Chromatographie, wobei die adsorbierte Fraktion mit einem Lösungsmittel wie Chloroform/ Methanol, Chloroform/ Methanol/Essigsäure/ Wasser als mobile Phase eluiert wird, sodann zusammenfassen der Fraktionen, die die Glycophospholipidreaktion zeigen. Das so erhaltene Glycophospholipid erscheint als eine Zusammensetzung von verschiedenen Glycophospholipiden, üblicherweise mit verschiedenen aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Das erfindungsgemäße Glycophospholipid kann in diesen Formen erhalten werden. Alternativ kann das Produkt weiter gereinigt werden. Das erfindungsgemäßen Glycophospholipid wird durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben (I):
(worin R&sub1; und R&sub2; gleiche oder verschiedene, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffreste sind, A bedeutet Zucker mit N-Glycosidbindung).
Insbesondere sind in der Formel R&sub1; und R&sub2; gleiche oder verschiedene C&sub1;&sub3;&submin;&sub1;&sub7; gesättigte oder ungesättigte, gradkettige aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, zum Beispiel, zumindest eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe, die aus Tridecanyl (C13:0), Pentadecanyl (C15:0), Pentadecenyl (15:1), Heptadecanyl (C17:0), Heptadecenyl (C17:1) und Heptadecedienyl (C17:2) besteht und zum Beispiel enthält A zum Beispiel zwei Galaktosereste, die miteinander verbunden sind.
Die physikochemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Glycophospholipids werden weiter im Detail erklärt.

(1) Protonen NMR Analyse

Gemäß den bekannten Verfahren wurde das vorliegende Glycophospholipid in Hexadeuterodimethyl-sulfoxid-schwerem Wasser (98 : 2) gelöst und ein Proton-Proton zweidimensionales NMR wurde bestimmt. Das Spektrum wird in Fig. 1 gezeigt. Als Ergebnis wurde das Material als Glycerolipid mittels vier Protonen Peaks bei ungefähr 4,0 ppm und einer chemischen Verschiebung eines Protonen Peaks bei 5,1 ppm identifiziert, was für Glycerin charakteristisch ist und einer Korrelation im zweidimensionalem NMR. Das anomere Proton, das bei 4,2 ppm beobachtet wurde und die Kupplungskonstante legen die Anwesenheit einer Zuckerbindung über eine β-Bindung nahe. Die Existenz von einem Proton, das sich von cis doppelt gebundenem Wasserstoff bei 5,4 ppm, Methylproton bei 0,9 ppm und Protonen bei 1,5-3,0 ppm ableitet, sind für eine Fettsäure charakteristisch. Das eindimensionale NMR wird in Fig. 2 gezeigt.

(2) Die Reaktivität mit Phospholipase C

Das erfindungsgemäß Glycophospholipid wird mit Phospholipase C (PLC) zersetzt. Das Glycophospholipid ist erwiesener Weise Glycerophospholipid, weil es mit PLC zersetzt wird. Die Farbreaktion mit Dettmer-Lester-Reagenz, einer Phospholipid nachweisenden Reagenz, das eine blaue Farbe bildet, die für Phospholipid charakteristisch ist.

(3) FT-IR Analyse

Analyse gemäß der Fourier-Transformations-Infrarotanalys (FT-IR) beobachtet eine Adsorption bei 3500 cm&supmin;¹, was auf eine Hydroxylgruppe zurückzuführen ist, charakteristisch für Zucker und 1000 cm&supmin;¹ und 1300 cm&supmin;¹ wurde beobachtet, was auf Phosphorsäure zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde eine schwache und breite Absorption beobachtet, die auf nicht bindende Hydroxylgruppe der Phosphorsäure bei 2500-2800 cm&supmin;¹ zurückzuführen ist. Demgemäß wurde das erfindungsgemäß Glycophospholipid bestätigt, nicht als Triester aufzutreten, aber eine Dieesterstruktur der Phosphorsäure im Molekül aufweist. Das FT-IR Absorptionsmuster des erfindungsgemäß Glycophospholipids und das des Phosphatidylethanolamins (PE), das als Kontrolle gemessen wurde, wird in Fig. 3 gezeigt. Wie in der Figur gezeigt, ist das Muster des vorliegenden Glycophospholipids fast identisch zu dem Absorptionsmuster des Standard PE. Jedoch eine Absorption bei 1560 cm&supmin;¹, die für ein primäres Amin charakteristisch ist und im PE Spektrum gefunden wurde, wurde nicht bei der vorliegenden Verbindung beobachtet. Es wurde keine Absorption von Amid beobachtet. Demgemäß wird angenommen, daß der Zucker keine N-glykosidische Bindung aufweist.

(4) Zuckeranalyse

Das erfindungsgemäß Glycophospholipid wurde mit Orcinol- Schwefelsäure, Diphenylamin-Anilin-Reagenz gefärbt, das speziell mit Zucker reagiert.
Des weiteren wurde das Produkt, das mit 6 N HCL bei 100ºC für 3 Stunden behandelt wurde, zu einem Trimethylsilyl (TMS) Derivat umgewandelt und der GC/MS Analyse unterworfen. Die qualitative Analyse mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) (TLC = thin layer chromatography) des Produkts wurde durchgeführt, indem mit 0,2 N Schwefelsäure zersetzt wurde, mit 2 N Trifluoressigsäure (TFA) (TFA = trifluoroacetic acid) zersetzt wurde und die Behandlung bei 100ºC fortgeführt wurde. Das Produkt wurde zu Alditolacetat mittels Behandlung mit 0,3 N Schwefelsäure/ 90% Essigsäure bei 80ºC für 14 Stunden umgewandelt, dann wurde die GC/MS Analyse des Zuckers durchgeführt. Indem HPLC verwendet wurde, das mit gepulster amperometrischer Detektion ausgerüstet ist, wurde die qualitative Analyse des Produkts durchgeführt, indem mit 1 N TFA bei 100ºC für 1,5 Stunden behandelt wurde. All Ergebnisse der Analyse wiesen auf die Existenz von Galactose hin.
Gemäß der zuvor erwähnten Analyse ist bestätigt worden, daß alle die Zuckerbestandteile Galaktose sind.

(5) Reaktion mit Glycosidase

Sequentielle Zersetzung des Glycophospholipids wurde mit verschiedener Glycosidase versucht. Als Ergebnis wird der Zucker nur mit β-Galactosidase freigegeben. Die obigen Ergebnisse zusammen mit den obigen NMR-Daten, zeigen die Existenz der β-Bindung der Galaktose. Ein Rest der Galaktose wurde mittels Behandlung mit Glycosidase für ein Molekül des erfindungsgemäßen Glycophospholipids freigesetzt. Die folgende Analyse zeigt, daß zwei Reste der Galactose als Bindung zueinander existieren. Jedoch einer der Galactosereste wird nicht durch Glycosidase freigesetzt. Daher ist bestätigt worden, daß der Galaktoserest nicht über eine O-glycosidische Bindung zum Phospholipid bindet.

(6) FAB (FAB = Fast Atom Bobardment) Schneller Atombeschuß- MS Analyse

Das erfindungsgemäße Glycophospholipid wurde mittels Anion FAB-MS bewertet, indem Triethanolamin als Matrix verwendet wurde. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß ein Rest, der aus zwei Resten zusammengesetzt ist, der ein Molekulargewicht von 180 hat, der als Zucker angesehen wird, in dem Glycophospholipid-Molekül existiert. Der Rest wurde identifiziert zwei Galaktosen zu sein, die gemäß ihrer Zuckerzusammensetzung verbunden sind. Ein Typ des erfindungsgemäßen Glycophospholipids wurde bestätigt ein Molekulargewicht von 1067 zu haben. Das FAB-Massenspektrum wird in Fig. 4 gezeigt.

(7) Bestätigung der Bindungsstelle der Galactose

Um die Bindungsstelle von diesem Zucker zu bestimmen, wurde die Methylierungsanalyse durchgeführt. Indem das Hakomoriverfahren verwendet wird, wurde der Zucker vollständig methyliert, mit 0,5 N Schwefelsäure/ 90% Essigsäure hydrolysiert, um methylierten Zucker freizusetzen. Die frei methylierten Zucker wurden reduziert, zu Alditolen umgewandelt und die freien Hydroxylgruppen wurden mit Acetanhydrid acetyliert. Die GC/MS Analyse der resultierenden teilweise methylierten Alditolacetate wurde durchgeführt und die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt. Der Standard des Acetylderivats des teilweise methylierten Hexitols wurde der GC-MS Analyse unter denselben Bedingungen zur Identifikation unterworfen. Gemäß dem Massenspektrum wurde 1,5-Diacetyl- 2,3,4,6-tetra-Omethylhexitol beobachtet (RT 17,949 min) (Fig. 5-a). 1,5,6,7-tri-O-Acetyl-2,3,4-tri-O-methylhextol wurde beobachtet (RT 23,361 min) Fig. 5-b). Gemäß den obigen Ergebnissen hat das erfindungsgemäße Glycophospholipid zwei Galactose Moleküle, die über eine β-1,6 Bindung verbunden sind.

(8) Ethanolaminanalyse und Bestätigung des Phosphatidylethanolamin Skeletts.

Das erfindungsgemäße Glycophospholipid wird mit Ninhydrin gefärbt. Des weiteren TLC, GC-Analyse des TMS-Derivats legt nahe, daß eine Zersetzung mit starker Säure, mit 6 N Salzsäure, Ethanolamin herstellt.
Nach der Zersetzung mit starker Säure, gemäß der Colorimetrie mit Dinitrofluorbenzol, wurde die Menge des Ethanolamins bestimmt, das in dem Glycophospholipid anwesend ist.
Auf der anderen Seite wurde das erfindungsgemäße Glycophospholipid mit 0,2 N Schwefelsäure oder 0,1 N Salzsäure bei 100ºC hydrolysiert und die TLC- Analyse des Hydrolysats wurde durchgeführt. Ein Flecken mit einem RF gleich wie der des Phosphatidylethanolamin (PE) wurde detektiert, in denen der gleichen Hydrolysate des erfindungsgemäßen Glycophospholipids. Dieser Flecken war positiv auf die Dittmer-Lester Farbreaktion, positiv auf die Ninhydrinfarbreaktion und negativ auf die Orcinol- Schwefelsäure-Farbreaktion. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß dieser Fleck vom Phosphatidylethanolamin abstammt. Die obigen Ergebnisse bestätigten, daß das erfindungsgemäße Glycophospholipid ein Phosphatidylethanolaminsklett aufweist.

(9) Glycerinanalyse

Das erfindungsgemäße Glycophospholipid wurde, nachdem es mit 2 N Salzsäure bei 125ºC 48 Stunden lang zersetzt wurde, mit Natriumperiodat reagieren gelassen und das hergestellte Formaldehyd wurde mit Chromotropsäure umgesetzt und die Colorometrie des resultierenden rötlich purpurroten Materials wurde durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das Glycophospholipid ein Glycerin pro einem Molekül hat.

(10) Phosphoranalyse

Das erfindungsgemäße Glycophospholipid wurde nachdem es mit 10 N Salzsäure bei 180ºC 3 Stunden lang zersetzt wurde, mit Ammoniummolybdat reagieren gelassen und das hergestellt Ammoniummolybdophosphat wurde quantitativ bestimmt. So wurde eine Phosphorsäuregruppe bestätigt in einem Molekül des Glycophospholipids zu existieren.

(11) Fettsäureanalyse

Das erfindungsgemäße Glycophospholipid enthält Fettsäuren in seiner Struktur. Zersetzung mit 5% Salzsäure/ Methanol, gefolgt von der Gaschromatographie des hergestellten Fettsäuremethylesters, bestätigt, daß das Glycophospholipid Fettsäuren der folgenden Zusammensetzung hat. Das relative Zusammensetzungsverhältnis der unten gezeigten Fettsäure ist ein Beispiel. Das Verhältnis variiert in Abhängigkeit von der Quelle des erfindungsgemäßen Glycophospholipids, aber das meiste von ihnen sind C&sub1;&sub2;&submin;&sub2;&sub0; gesättigte oder ungesättigte gradkettige Fettsäuren.

Tabelle 1

Fettsäurezusammensetzung %

C14 : 0 1,6
C16 : 0 14,4
C16 : 1 1,9
C18 : 0 17,1
C18 : 1 52,7
C18 : 2 12,0
Das Phospholipid der folgenden Formel [II] wird als eine repräsentative Struktur mit den obigen Eigenschaften gezeigt.
Das erfindungsgemäße Glycophospholipid hat eine Struktur, worin der Zucker zum Glycerophospholipid bindet. Das Glycophospholipid besitzt die zuvor erwähnten physiologischen Funktionen. Des weiteren kann die Bindung zwischen dem Phospholipid und Zucker Funktionen zur Verfügung stellen, die kein konventionelles Phospholipid hat. Das Glycophospholipid kann als GPI-Anker oder gemäß seiner strukturellen Ähnlichkeit als sein Vorläufer dienen.
Des weiteren enthält das Phospholipid einen hydrophilen Rest, der hauptsächlich aus einer Phosphorsäuregruppe und einem hydrophoben Rest wie einer Fettsäure und der langkettigen Base des Sphingolipids in einem Molekül besteht. Das Glycophospholipid kann für Nahrungsmittel als Emulgator verwendet werden, aufgrund einer gewissen amphipatischen Eigenschaft und natürlichem Ursprungs. Das erfindungsgemäße Glycophospholipid hat eine extrem hohe hydrophile Eigenschaft als Phospholipid und wird effektiv im Wasser dispergiert, weil es Zucker in seiner Struktur aufweist. Des weiteren, weil das erfindungsgemäße Glycophospholipid ein Glycerophospholipid ist, kann die Substitution und Entfernung des Fettsäurerests relativ leicht durchgeführt werden. Demgemäß, falls das erfindungsgemäße Glycophospholipid als Emulgator verwendet wird, kann der HLB-Wert ohne weiteres geändert werden. Das gereinigte synthetische Produkt und Zusammensetzung des Glycophospholipids kann als nützliches Material wie einem Emulgator, insbesondere O/W Emulgator verwendet werden.
Gemäß den Eigenschaften als oberflächenaktives Mittel kann das Glycophospholipid auf dem Gebiet der Medizin, Lebensmittel wie auch der Kosmetika verwendet werden.
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein neues Glycophospholipid zur Verfügung, von dem erwartet wird, daß es in verschiedenen Gebieten verwendet wird, zum Beispiel als biochemisches Reagenz, einem Ausgangsmaterial für die Medizin und Lebensmittel oder als oberflächenaktives Mittel.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Glycophospholipids wird im Detail in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel stellt das Verfahren zur Wiedergewinnung des erfindungsgemäßen Glycophospholipids aus Käsemolke dar, die Phospholipid enthält.
Pulverisierte Käsemolke (3 kg) wurde in warmen Wasser (30 l) gelöst und bei 50ºC gehalten. Bacillus subtilis Protease (10 g) wurde hinzugefügt und die Reaktion wurde bei pH 8, 45ºC 15 Stunden lang ausgeführt. Nachdem das Protein zersetzt war, wurde die Reaktionsmischung auf 90ºC 10 Minuten lang erwärmt, um das Enzym zu deaktivieren. Methanol (80 l) wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Des weiteren wurde Chloroform (40 l) hinzugefügt und 30 Minuten gerührt und eine Fettverbindung wurde extrahiert. Der Extrakt wurde dann filtriert, zur Trockene konzentriert. Danach wurde eine Mischung aus Chloroform/ Methanol (2 : 1, V/V, 500 ml) hinzugefügt und bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt und filtriert. Aceton (20 l) wurde zu dem Filtrat hinzugefügt und bei 4ºC über Nacht stehen gelassen, um ein weißes Präzipitat (112 g) zu ergeben. Das Präzipitat wurde in einer geringen Mengen aus Chloroform/Methanol Mischung gelöst und auf einer Silikagel-Säule chromatographiert (schrittweise Eluierung, indem eine mobile Phase verwendet wird: (Chloroform/ Methanol/ Wasser 90 : 10 : 0, 80 : 20 : 2, 70 : 30 : 3, 60 : 40 : 4, als Volumen).
Der TLC bei jeder Reinigungsstufe wird in Fig. 6 gezeigt.
Das Glycophospholipid wurde mittels TLC entwickelt und die Flecken, die sowohl mit Orcinol-Schwefelsäure-Reagenz und Dittmer-Lester-Reagenz gefärbt sind, wurden als Glycophospholipid identifiziert. Eine derartige schrittweise Eluierung ergibt eine Fraktion, die 16,24 g an Glycophospholipid enthält. Danach wurde eine Silicagelsäulen- Chromatographie durchgeführt, in dem ein gemischtes Lösungsmittel (Chloroform/ Methanol/ Aceton/ Essigsäure/Wasser 10 : 2 : 4 : 2 : 1) als mobile Phase verwendet wurde. Bei dieser Reinigungsstufe wurden 3,20 g Glycophospholipid von ungefähr 90% Reinheit erhalten (bestimmt mittels Farbreaktion mit Orcinol-Schwefelsäure Reagenz und Dittmer-Lester Reagenz). Das gereinigte Produkt wurde einer TLC Entwicklung unterworfen, gefolgt von der Ninhydrinfarbreaktion. Als Ergebnis existiert eine Ninhydrin gefärbte Sache, die als hydrophobe Peptidverbindung angesehen wurde. Das gereinigte Produkt wurde in einem gemischten Lösungsmittel (Chloroform/Methanol 1 : 1) gelöst. Die Ninhydrin- gefärbte Sache wurde mittels Gelfiltration entfernt, indem Sephadex LH-20 verwendet wurde, um 2,28 g des Glycophospholipids zu erhalten. Dann wurde das resultierende Produkt einer Silicagelsäulen- Chromatographie unterworfen (mobile Phase: Chloroform/Methanol/ Essigsäure/ Wasser (65 : 25 : 8 : 4) und Chloroform/Methanol/ Wasser (65 : 35 : 8)), um 1,54 g an Glycophospholipid (98% Reinheit) zu erhalten. Dieses Material besitzt Eigenschaften des oben beschriebenen Glycophospholipids.

Beispiel 2

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Herstellung aus Pulver dar, das eine hohe Konzentration von Fettverbindung aus Milch enthält.
Gemäß einem Verfahren, das in der Japanischen Offenlegungsschrift 292880/1993 offenbart ist, wurde Pulver, das eine hohe Konzentration an Fettkomplex enthält, hergestellt. Das heißt, Buttermilch wurde angesäuert, um ein isoelektrisches Präzipitat zu erhalten. Nachdem das Präzipitat entfernt war, wurde eine Ultrafiltrationskonzentration durchgeführt und die resultierende Lösung wurde getrocknet, um Pulver herzustellen, das eine hohe Konzentration an Fettverbindung enthält.
Diese Pulver (100 g) wurde in Aceton (1 l) suspendiert und die resultierende Suspension wurde heftig gerührt, um das Pulver zu dispergieren. Dann wurde die Mischung bei 4ºC über Nacht stehen gelassen. Das Präzipitat wurde mittels Filtration gesammelt, dann lyophilisiert, um 33 g an weißem Pulver zu erhalten. Ein Gramm aliquoter Teil wurde in Ethanol suspendiert. Das resultierende Ethanol unlösliche Material wurde weggefiltert, das in Hexan/ Ethanol/ Essigsäure/ Wasser = 60/ 40/ 5/ 5 (5 ml) gelöst wurde und an einer Silicagelsäule chromatographiert, indem dasselbe gemischte Lösungsmittel als mobile Phase verwendet wurde (drei 80 · 500 mm Säulen kombiniert; Harz, kugelförmiges Silicagel (SIL-120-S-50, YMC; UV Detektion bei 205 nm). Jeder detektierte Peak wurde identifiziert, indem die Farbreaktion Dittmer-Lester Reagenz und Orcinol-Schwefelsäure verwendet wurde. Diese Peaks wurden gut getrennt und Glycophospholipid existiert als einzelner Peak. Eine Fraktion, die Glycophospholipid enthält, wurde gefunden und lyophilisiert, um 85 mg an weißem Pulver zu ergeben. Gemäß der Phosphoranalyse betrug der Gehalt an Phospholipid 81%. Der Gehalt an Glycophospholipid in dem Phospholipid betrug 92%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Glycophospholipids, das die folgende allgemeine Formel [I] aufweist:

(worin R&sub1; und R&sub2; dieselben oder verschiedene gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffreste bedeuten und die zwei Galactosereste eine N-Glycosidbindung aufweisen) aus Milch oder Milchprodukt; und weiter die folgenden physikalisch- chemischen Eigenschaften (1) bis (9) aufweist:

(1) die folgenden Protonenpeaks, nachgewiesen durch Protonen- NMR: vier Protonenpeaks bei ungefähr 4,0 ppm, ein Protonenpeak bei 5,1 ppm, ein anomerer Protonenpeak bei 4,2 ppm, ein Methylprotonenpeak bei 0,9 ppm und ein Protonenpeak bei 1,5-3,0 ppm;

(2) charakteristische Absorbtion bei 3500 cm&supmin;¹, 1000 cm&supmin;¹ und 1,300 cm&supmin;¹, nachgewiesen durch Fourier-Transformations- Infrarotanalyse

(3) zersetzt durch Phopholipase C;

(4) Für Phopholipid charakteristische Farbreaktion unter Verwendung von Dittmer-Lester-Reagenz;

(5) Freisetzen von Zucker durch β-Galactosidase;

(6) Für Zucker charakteristische Farbreaktion unter Verwendung von Oricinol-Schwefelsäure, Diphenylamin-Anilin-Reagenz;

(7) aufweisend Galactose als einen konstituierenden Zucker;

(8) Färbung mit Ninhydrin;

(9) C&sub1;&sub2;&submin;&sub2;&sub0; gesättigte oder ungesättigte Fettsäure nachgewiesen durch Analyse von Methylester nach Zersetzung mit Salzsäure/Methanol;

umfassend Extrahieren mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol oder Chloroform/Methanol/Wasser, Waschen mit Aceton und Reinigen mit Silikagelchromatographie, nach Zersetzung von Protein in dem Milchprodukt mit einer Protease und schrittweiser Extraktion mit Methanol und Chloroform.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin R&sub1; und R&sub2; gleich oder verschieden sind und zumindest eine Kohlenwasserstoffgruppe aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Tridecanyl (C13:0), Pentadecanyl (C15:0), Heptadecanyl (C17:0), Pentadecenyl (15:1) Heptadecenyl (C17:1) und Heptadecedienyl (C17:2) besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Glycophospholipid durch die folgende Formel [II] wiedergegeben wird:

4. Verfahren zur Herstellung eines Glycophospholipids, das die folgende allgemeine Formel [I] aufweist:

(worin R&sub1; und R&sub2; dieselben oder verschiedene gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffreste bedeuten und die zwei Galactosereste eine N-Glycosidbindung aufweisen); und weiter die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften (1) bis (9) aufweist:

(1) die folgenden Protonenpeaks nachgewiesen durch Protonen- NMR: vier Protonenpeaks bei ungefähr 4,0 ppm, ein Protonenpeak bei 5,1 ppm, ein anomerer Protonenpeak bei 4,2 ppm, ein Methylprotonenpeak bei 0,9 ppm und ein Protonenpeak bei 1,5-3,0 ppm;

(3) zersetzt durch Phopholipase C;

(5) Freisetzen von Zucker durch β-Galactosidase;

(7) aufweisend Galactose als einen konstituierenden Zucker;

(8) Färbung mit Ninhydrin;

(9) C&sub1;&sub2;&submin;&sub2;&sub0; gesättigte oder ungesättigte Fettsäure, nachgewiesen durch Analyse von Methylester nach Zersetzung mit Salzsäure/Methanol;

worin die in Aceton und Ethanol unlösliche Komponente des Pulvers, das das Gesamtfett enthält, in einem gemischten Lösungsmittel aus Hexan/Ethanol/Essigsäure/Wasser gelöst und durch Silikagelchromatographie gereinigt wird.

5. Verfahren zur Reinigung von Glycophospholipid, worin das Glycophospholipid, das in den Ansprüchen 1 oder 4 erhalten wird, in einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol gelöst und Ninhydrin-Färbe-Bestandteile darin durch Gelfiltration entfernt werden.