DE69432724T2

DE69432724T2 - HST-2 Mutein, dafür kodierende DNS und Herstellung

Info

Publication number: DE69432724T2
Application number: DE69432724T
Authority: DE
Inventors: Koji Toyono-gun Yoshimura; Kaori Toyonaka Ishimaru; Koichi Sakyou-ku Igarashi; Masaaki Nerima-ku Tereda
Original assignee: National Cancer Center Japan; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; National Cancer Center Japan
Priority date: 1993-02-12
Filing date: 1994-02-11
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-02-12
Also published as: EP0613946A2; DE69432724D1; ATE241698T1; EP0613946B1; US5679550A; CA2115522A1; EP0613946A3; US6013784A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Polypeptids mit der Aktivität eines heparinbindenden sekretorischen Transformingfaktors 2 (im folgenden in dieser Beschreibung auch kurz als hst-2 bezeichnet), wie wachstumsfördernde Wirkung auf Tierzellen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombocytopeniesymptomen bei einem Säuger.
Hintergrund der Erfindunq
Gruppen von Zellwachstumsfaktoren, die zur Familie der heparinbindenden Wachstumsfaktoren (HBGF) gehören, zeigen untereinander Homologie bezüglich der Aminosäuresequenzen und sind gewöhnlich durch eine starke heparinbindende Aktivität gekennzeichnet. Die Zellwachstumsfaktoren, die zu dieser Familie gehören, umfassen sauren und basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF und bFGF), hst-1, INT2, FGF5 und Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF). Von diesen Zellwachstumsfaktoren wird berichtet, dass FGF eine Wirkung auf verschiedene Zellen hat und insbesondere eine wachstumsfördernde Wirkung und eine differenzierungsfördernde Wirkung auf Mesodermzellen hat [Gospodarowicz et al., J. Cell. Physiol., supplt., 5, 15 (1987)]. FGF wurde auch für die Anwendung auf Medikamente zur Förderung der Wundheilung oder zur Reparatur des Herzmuskels oder des Nervengewebes nach Ischämie untersucht.
Das hst-1-Gen ist ein Transforming-Gen, das durch ein Fokussierungsverfahren identifiziert wird, und sein Produkt hat in vivo genauso wie FGF eine zellwachstumsfördernde Wirkung und eine Angiogenese-induzierende Wirkung (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 3-218398: Europäisches Patent Veröffentlichungsnum mer 421455). Ein hst-2-Gen wurde durch ein DNA-Blot-Hybridisierungsverfahren als ein Gen identifiziert, das eine hohe Homologie mit dem hst-l-Gen aufweist [Sakamoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 965 (1988)]. Dasselbe Gen wurde auch als FGF6-Gen beschrieben [Marics I. et al., Oncogene, 4, 335 (1989), und Coulier F. et al., Oncogene 6(4), 1433 (1991)]. Sie berichten auch, dass das FGF6-Gen drei in-frame-ATG-Codons codiert, die in der Lage sind, die Translation von drei Peptiden mit 175, 198 bzw. 208 Resten einzuleiten. Weiterhin gingen die Erfinder der vorliegenden Erfindung davon aus, dass hst-2 tatsächlich biologische Aktivität hat und ein neuartiger Wachstumsfaktor ist, der zur HST-Familie gehört, da Fibroblasten mit eingeführtem hst-2-Gen auf Nacktmäusen Tumoren bildeten [Naito et al., Jpn. J. Cancer Res. Abstr., 500 (1989)]. Daher wurde auch erwartet, dass Produkte der hst-2-Gene auf Medikamente als Förderer der Wundheilung oder zur Reparatur des Herzmuskels nach Herzischämie und des Nervengewebes nach Hirnischämie anwendbar sind.
Um die Untersuchung des hst-2-Proteins zu fördern, ist es notwendig, das Protein in großen Mengen und in hoher Reinheit zu erhalten. In Oncogene, 5, 823 (1990), berichteten de Lapeyriere et al., dass das Protein mit der wachstumsfördernden Wirkung auf die Tierzellen möglicherweise in den Muskeln oder in den Hoden lokalisiert ist. Die Leukämiezelllinie HEL [Martin und Papayannopoulou, 216, 1223 (1982)] oder CMK [Sato et al., British Journal of Hematology, 72, 184 (1989)], die das Peptid möglicherweise produziert, wurde beschrieben. Die Isolierung und Reinigung des Proteins aus solchen Quellen ist kompliziert, und das gewünschte Protein wurde bisher nur in kleinen Mengen erhalten. Dementsprechend gibt es den ernsthaften Wunsch nach einem Verfahren zur Gewinnung des hst-2-Proteins in großen Mengen und in hoher Reinheit.
Die Nucleotidsequenz des hst-2-Gens wurde vor kurzem beschrieben [S. Iida et al., Oncogene, 7, 303 (1992), und Europäisches Patent Veröffentlichungsnummer 421 455], und diese Berichte geben auch die daraus abgeleiteten konstituierenden Aminosäuren an. Ein Verfahren zur Herstellung von hst-2 unter Verwendung von Rekombinationstechnik wurde jedoch nicht beschrieben.
Obwohl einige der Eigenschaften und die biologische Aktivität von hst-2 erst noch zu untersuchen sind, wurde, wie oben beschrieben, die Anwendung von hst-2 auf Medikamente und Reagentien allgemein erwartet. Wie oben beschrieben ist, war es jedoch bisher unmöglich, ausreichende Mengen von hst-2 zu erhalten, was die Untersuchung und Entwicklung behindert hat.
Kurzbeschreibung der Erfindunq
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde hst-2 so modifiziert, dass es durch Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik ohne nachteilige Auswirkungen auf seine Aktivität mikrobiologisch in großen Mengen produziert werden kann. Es wird davon ausgegangen, dass diese Modifikation möglicherweise nicht nur zu einer Erhöhung des Produktionsvermögens von hst-2 in Zellen, sondern auch zu Erhöhungen der Stabilität und der Zellwachstumsaktivität pro Molekül hst-2 und zu einer weiteren Aktivierung einer unbekannten biologischen Aktivität führt.
Die Erfinder haben Muteingene hergestellt, denen zum Teil hst-2-Gene fehlen, und exprimierten die Muteingene in Mikroorganismen durch DNA-Rekombinationstechniken, um eine intensive Untersuchung von Erhöhungen des Produktionsvermögens von hst-2 in Zellen und der Aktivität und von Veränderungen der biologischen Aktivität durchzuführen, und entdeckten so hergestellte Polypeptide, die diesen Zwecken dienen. Eine weitere Untersuchung auf der Grundlage dieser Ergebnisse führte zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit:

(1) Verwendung eines Polypeptids mit der Aktivität eines heparinbindenden sekretorischen Transformingfaktors 2 (hst-2) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombocytopeniesymptomen;
(2) Verwendung gemäß (1), wobei das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz darstellt:
oder ein Fragment davon darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 5; n = 1: SEQ ID NO: 6);
(3) Verwendung gemäß (2), wobei Y
(n = 0: SEQ ID NO: 7; n = 1: SEQ ID NO: 8) oder ein Fragment davon darstellt;
(4) Verwendung gemäß (1), wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt wird:
oder ein Fragment davon darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 1; n = 1: SEQ ID NO: 2); im folgenden zuweilen als Polypeptid (I) abgekürzt;
(5) Verwendung gemäß (4), wobei X
darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 1; n = 1: SEQ ID NO: 2);
(6) Verwendung gemäß (4), wobei X Gly darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 3; n = 1: SEQ ID NO: 4);
(7) Verwendung gemäß (4), wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 hat;
(8) Verwendung gemäß (4), wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 hat;
(9) Verwendung, wie sie in den obigen Abschnitten (1) bis (8) definiert ist, wobei das Medikament weiterhin ein Krebsmedikament umfasst;
(10) ein Chemotherapeutikum, das ein Polypeptid mit hst-2-Aktivität, wie es in den obigen Abschnitten (1) bis (8) definiert ist, und ein Krebsmedikament umfasst;
(11) das Chemotherapeutikum gemäß (10), das ein Gemisch aus dem Polypeptid, wie es in den obigen Abschnitten (1) bis (8) definiert ist, und dem Krebsmedikament umfasst;
(12) ein Kit mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, das getrennte Zubereitungen des Polypeptids, wie es in den obigen Abschnitten (1) bis (8) definiert ist, und eines Krebsmedikaments umfasst; und
(13) die Verwendung eines Polypeptids mit hst-2-Aktivität, wie es in den obigen Abschnitten (1) bis (8) definiert ist, zusammen mit einem Krebsmedikament zur Herstellung eines Chemotherapeutikums.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6), die von einem codierenden Bereich von hst-2 abgeleitet ist, der eine Leitsequenz enthält, die ein offenes Leseraster von hst-2-cDNA bildet;
2 zeigt eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2), die der cDNA entspricht, die das in Beispiel 1 erhaltene N38 (SEQ ID NO: 1) codiert. Der erste Rest, Met, der dem Startcodon ATG entspricht, wurde während der Produktion durch Prozessierung entfernt;
3 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pTB1545 zeigt;
4 zeigt eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) des in Beispiel 2 erhaltenen N63;
5 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pTB1547 zeigt;
6 zeigt ein Elutionsmuster, das in Beispiel 3 erhalten wurde;
7 zeigt Elektrophoresemuster von SDS-PAGE, die in Beispiel 3 erhalten wurden;
8 zeigt ein Elutionsmuster, das in Beispiel 3 erhalten wurde;
9 zeigt Ergebnisse der DNA-Syntheseinduktionswirkung auf Maus-BALB/c-3T3-Zellen, die in Beispiel 6 erhalten wurden;
10 zeigt Ergebnisse des Tests der Aktivität im Sinne einer Förderung des Zellwachstums von Megakaryocyten-Vorläufern, die in Beispiel 9 erhalten wurden;
11 zeigt Ergebnisse des Tests der Aktivität im Sinne einer Förderung des Zellwachstums, die in Beispiel 10 erhalten wurden; und
12 zeigt Ergebnisse des Tests der Aktivität im Sinne einer Förderung des Zellwachstums, die in Beispiel 10 erhalten wurden.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
hst-2 ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die als ganzes Molekül 208 Aminosäuren umfasst (SEQ ID NO: 6), wobei Met, das dem in 1 gezeigten N-terminalen Startcodon entspricht, als Aminosäurerest Nr. 1 genommen wird. In dieser Beschreibung werden die konstituierenden Aminosäuren von hst-2 durch die Nummern der Aminosäurereste gemäß dieser Sequenz (EP-A-0 488 196) (SEQ ID NO: 6) angegeben. Weiterhin ist "hst-2-Polypeptid" in der vorliegenden Beschreibung ein allgemeiner Ausdruck für Polypeptide mit hst-2-Aktivität. Zu den Polypeptiden gehören das Polypeptid mit der SEQ ID NO: 6 und ein Fragment davon.
Zu den oben definierten Polypeptiden (I) gehört auch ein Derivat, bei dem das Fragment mit der durch X dargestellten Sequenz wenigstens eine Aminosäure vom C-Terminus seiner Aminosäuresequenz aufweist und das hst-2-Aktivität hat. Das Fragment umfasst den C-terminalen Aminosäurerest Gly. Von diesen sind vorzugsweise 1 bis 25 aufeinanderfolgende Aminosäuren vom N-Terminus der Aminosäuresequenz deletiert.
Sie können jedoch auch in einem zentralen Teil oder auf der carboxyterminalen Seite der durch X dargestellten Aminosäuresequenz deletiert sein, solange das Polypeptid hst-2-Aktivität aufweist.
Andererseits kann es sich bei dem Polypeptid mit hst-2-Aktivität (hst-2-Polypeptid), das zur Herstellung des Medikaments zur Förderung einer Erhöhung der Zahl der Blutplättchen verwendet wird, um irgendwelche Deletionsmuteine handeln, und insbesondere Deletionsmuteine mit 38 bis 63 Aminosäureresten sind zu bevorzugen.
Die chemische Struktur der hst-2-Polypeptide umfasst das oben definierte Polypeptid (I), das in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie Arbeitsschritten und Reagentien in Herstellungs- und Reinigungsschritten, variieren kann. Zum Beispiel werden die hst-2-Polypeptide zuweilen als Salze erhalten, wie Salze von anorganischen Säuren (zum Beispiel Hydrochloride und Phosphate), Salze von organischen Säuren (zum Beispiel Acetate und Trifluoracetate) und Salze von Basen (zum Beispiel Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Calciumsalze und Magnesiumsalze, sowie Ammoniumsalze).
Weiterhin kann es sich bei den hst-2-Polypeptiden um Derivate handeln, an die Zuckerketten, Lipide und Acetylgruppen addiert sind.
Die hst-2-Polypeptide umfassen jeden Typ von Polypeptiden, solange sie hst-2-Aktivität aufweisen oder sich in vivo leicht in den aktiven Typ umwandeln lassen.
Die biologische Aktivität der hst-2-Polypeptide kann zum Beispiel bestimmt werden, indem man die Stimulation der DNA-Synthese von Maus-BALB/c-3T3-Zellen auf der Basis der Aufnahme von Tritiumthymidin ([3H]-Thymidin) gemäß dem Verfahren von Sasada et al. [Mol. Cell Biol., 8, 588-594 (1988)] misst, indem man die Wachstumsförderung der Gefäßendothelzellen gemäß dem Verfahren von Tada et al. [Journal of Immunological Methods, 93, 157 (1986)] misst oder indem man die Angiogenese auf der Vogelembryo-Allantois gemäß dem Verfahren von Auerbach [Developmental Biology, 41, 391 (1974)] misst.
Der Expressionsvektor, der die DNA mit der für die hst-2-Polypeptide codierenden Nucleotidsequenz enthält, kann zum Beispiel nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden

(i) RNA, die für ein hst-2-Protein codiert, wird isoliert;
(ii) einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) wird gegen die RNA synthetisiert, und anschließend erfolgt die Synthese von doppelsträngiger DNA;
(iii) die komplementäre DNA wird in ein Plasmid eingeführt;
(iv) eine Wirtszelle wird mit dem so erhaltenen rekombinanten Plasmid transformiert;
(v) nach der Kultivierung der so erhaltenen Transformante wird das Plasmid, das die gewünschte DNA enthält, nach einem geeigneten Verfahren, wie Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung einer DNA-Sonde, aus der Transformante isoliert;
(vi) die gewünschte klonierte DNA wird aus dem Plasmid ausgeschnitten;
(vii) eine Deletion, die diesen Zweck erfüllt, wird mit der klonierten DNA durchgeführt;
(viii) in manchen Fällen wird ein Oligonucleotid, das ein ATG-Codon enthält, daran gebunden; und
(ix) die resultierende DNA wird stromabwärts eines Promotors in einen Vektor ligiert.

Die oben genannte RNA, die für hst-2 codiert, kann erhalten werden aus den Muskeln oder den Hoden (de Lapeyriere et al., siehe oben), in denen das hst-2-Protein möglicherweise lokalisiert ist, aus dem Leukämiezellstamm HEL (Martin und Papayannopoulou, siehe oben), in dem das Peptid nach allgemeinem Dafürhalten produziert wird, oder aus NIH3T3-Transformanten mit humanen hst-2-Genen [Europäisches Patent Veröffentlichungsnummer 488 196 oder Iida et al., Oncogene, 7, 303 (1992)].
Zu den Verfahren zur Herstellung der RNA aus den humanen Organen und Zellen gehört das Guanidinthiocyanat-Verfahren [J.M. Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294 (1979)].
Unter Verwendung der so erhaltenen RNA als Matrize wird cDNA synthetisiert. Die cDNA wird zum Beispiel in den λ-Phagen-Vektor λgt10 [T.V. Huynh et al., DNA Cloning, A Practical Approach, S. 79, IRL Press Oxford (1985)] eingeführt, zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Watson und Jackson [C.J. Watson und J.F. Jackson, DNA Cloning, A Practical Approach, 5. 49, IRL Press Oxford (1985)], und Escherichia coli, wie C600 und Hf1A [T.V. Huynh et al., loc. cit.], wird damit infiziert, wodurch eine cDNA-Bibliothek hergestellt werden kann.
Aus der so erhaltenen cDNA-Bibliothek werden nach bekannten Verfahren gewünschte Klone selektiert, zum Beispiel nach dem Plaque-Hybridisierungsverfahren [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 320, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] und dem DNA-Nucleotid-Sequenzbestimmungsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560 (1977), und Nucl. Acids Res., 9, 309 (1981)].
Dann werden die Phagenklone entnommen, und Phagen-DNA wird extrahiert, zum Beispiel nach dem Verfahren von Davis et al. [Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1980)]. Ihr cDNA-Anteil wird mit einem Restriktionsenzym herausgeschnitten und zur bequemen Verwendung in ein Plasmid, wie pUC13, eingeführt.
Das Plasmid mit der DNA, die die Nucleotidsequenz enthält, die für das oben genannte klonierte hst-2 codiert, kann so, wie sie ist, oder, falls gewünscht, nach Abbau mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
Das klonierte Gen kann stromabwärts eines Promotors in einen für die Expression geeigneten Vektor ligiert werden, wodurch man einen Expressionsvektor erhält.
Um die hst-2-Polypeptide, die das Polypeptid (I) enthalten, herzustellen, kann neben anderen herkömmlichen DNA-Rekombinationstechniken ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden. Ortsgerichtete Mutagenese ist wohlbekannt und wird in R. F. Lather und J. P. Lecoq, Genetic Engineering, S. 31–50, Academic Press (1983), beschrieben. Auf ein Oligonucleotid gerichtete Mutagenese ist in M. Smith und S. Gillam, Genetic Engineering: Principles and Methods, Vol. 3, S. 1–32, Plenum Press (1981), beschrieben.
Um ein Strukturgen herzustellen, das für das Polypeptid (I) codiert, wird zum Beispiel (a) einzelsträngige DNA, die einen einzelnen Strang eines Strukturgens von hst-2 umfasst, mit einem mutanten Oligonucleotidprimer hybridisiert, (b) der Primer wird mit DNA-Polymerase unter Bildung eines mutanten Heteroduplex verlängert, und (c) der mutante Heteroduplex wird dupliziert.
Die Größe des Oligonucleotidprimers wird gemäß den Bedingungen, die für eine stabile Hybridisierung des Primers mit einem Genbereich, in den die Mutation eingeführt wird, notwendig sind, oder gemäß der Beschränkung der zur Zeit verfügbaren Oligonucleotid-Syntheseverfahren bestimmt. Faktoren (die Gesamtgröße und die Größe eines Teils, das eine Mutationsstelle umgeht), die bei der Gestaltung eines Oligonucleotids, das bei der auf das Oligonucleotid gerichteten Mutagenese verwendet wird, zu berücksichtigen sind, werden von M. Smith und S. Gillam, loc. cit., beschrieben. Im Allgemeinen ist die gesamte Länge des Nucleotids so groß, dass eine stabile und ausschließliche Hybridisierung an der Mutationsstelle optimiert wird, und die Verlängerungen von der Mutationsstelle bis zum 5'- und 3'-Ende haben eine ausreichende Größe, um die Edition der Mutation durch die Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase zu vermeiden. Das für die Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Oligonucleotid enthält gewöhnlich 12 bis 24 Nucleotide, vorzugsweise 14 bis 20 Nucleotide und besonders bevorzugt 14 bis 18 Nucleotide. Gewöhnlich enthalten diese wenigstens 3 Nucleotide auf der 3'-terminalen Seite einer Mutationsstelle.
Wenn ein hst-2-Polypeptid erhalten werden soll, bei dem wenigstens eine hst-2-konstituierende Aminosäure deletiert ist, werden je nach dem Teil, in dem die konstituierende Aminosäure deletiert wird, drei Verfahren zur Herstellung eines mutagenisierten hst-2-Gens in Betracht gezogen. Das erste erfolgt durch eine Deletion vom Aminoterminus von hst-2 her, das zweite erfolgt durch eine Deletion vom zentralen Teil von hst-2 her, und das dritte erfolgt durch eine Deletion vom Carboxyterminus von hst-2 her.
Wenn der Aminoterminus deletiert wird, wird ein zu deletierendes Codon eines Gens, das für den Carboxyterminus einer Aminosäuresequenz codiert, durch die Verwendung einer ortsgerichteten Mutagenese zum Startcodon ATG, das für Met codiert, mutagenisiert, und auf der 5'-terminalen Seite des Codons wird zur leichten Ligierung mit einem Promotor eine Erkennungsstelle für ein geeignetes Restriktionsenzym gebildet, oder das ATG des Oligonucleotids wird auf ein geeignetes Leseraster eingestellt, um das Oligonucleotid mit dem Gen zu ligieren, dessen Aminoterminus mit einem Restriktionsenzym deletiert ist. Gemäß diesen Verfahren wird das mutagenisierte Gen für das Polypeptid (I) hergestellt, indem man ein Codon eines Gens mutagenisiert, das für einen Rest des 38. Ser bis zum 63. Ala der SEQ ID NO: 6 codiert.
Wenn der zentrale Teil der Aminosäuresequenz deletiert wird, können Erkennungsstellen für ein einziges Restriktionsenzym auf der 5'- und 3'-terminalen Seite eines Gens, das für die zu deletierende Aminosäuresequenz codiert, gebildet werden, wobei man ortsgerichtete Mutagenese verwendet, und diese Stellen werden mit einem Enzym gespalten, um den für die Sequenz codierenden Teil zu entfernen. Die Ligierung beider resultierenden Fragmente liefert ein Gen, das hst-2 codiert, bei dem die gewünschte(n) Aminosäure(n) deletiert ist (sind). Selbstverständlich sollte eine durch die Spaltung mit dem Restriktionsenzym verursachte Abweichung des Leserasters vermieden werden.
Wenn die Aminosäuresequenz auf der carboxyterminalen Seite deletiert wird, wird ein zu deletierendes Codon eines Gens, das für die Aminosäure(n) auf der aminoterminalen Seite in der Aminosäuresequenz codiert, durch ortsgerichtete Mutagenese zu einem Stopcodon mutagenisiert.
Obwohl den hst-2-Polypeptiden einschließlich des Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindung die konstituierenden Aminosäuren von hst-2 fehlen, wie es oben beschrieben ist, kann wenigstens eine Aminosäure dieser konstituierenden Aminosäuren weiter durch eine andere Aminosäure substituiert sein, solange das Mutein hst-2-Aktivität hat.
Beispiele für die konstituierenden Aminosäuren vor der Substitution (zu substituierende Aminosäuren) sind beliebige Cystein-Aminosäuren und andere Aminosäuren als Cystein (zum Beispiel Asparaginsäure und Arginin).
Wenn die zu substituierende Aminosäure zum Beispiel Cystein ist, sind neutrale Aminosäuren als Aminosäuren, die an ihrer Stelle verwendet werden (substituierende Aminosäuren) bevorzugt. Beispiele für die neutralen Aminosäuren sind Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Trypto phan, Serin, Threonin und Methionin. Insbesondere Serin und Threonin sind bevorzugt.
Wenn die zu substituierende Aminosäure irgendeine andere als Cystein ist, werden Aminosäuren, die sich von der zu substituierenden Aminosäure unterscheiden, zum Beispiel in der Hydrophilie, Hydrophobie oder elektrischen Ladung, als substituierende Aminosäuren gewählt. Insbesondere wenn die zu substituierende Aminosäure Asparaginsäure ist, umfassen die substituierenden Aminosäuren Asparagin, Threonin, Valin, Phenylalanin und Arginin. Insbesondere Asparagin und Arginin sind bevorzugt.
Wenn die zu substituierende Aminosäure Arginin ist, umfassen die substituierenden Aminosäuren Glutamin, Threonin, Leucin, Phenylalanin und Asparaginsäure. Insbesondere Glutamin ist bevorzugt.
Wenn die hst-2-Polypeptide einschließlich Polypeptid (I) durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden, können mehrere Mutationen in die DNA-Sequenz eingeführt werden. Es können nämlich beliebige Codons ausgewählt werden, solange es sich um DNA-Codons handelt, die den Aminosäuren entsprechen.
Wenn die konstituierende Aminosäure zum Beispiel eine andere Aminosäure als Cystein ist, die durch eine andere Aminosäure substituiert wird, so dass man ein Mutein erhält, wird ein mutagenisiertes hst-2-Gen nach einem Verfahren hergestellt, bei dem ein Codon in derselben Weise wie bei Cystein mit einem Oligonucleotidprimer mutagenisiert wird. Die Gestaltung des Oligonucleotidprimers variiert jedoch natürlich, je nachdem, welche Aminosäure mutagenisiert ist.
Der Primer wird mit einem einzelsträngigen Phagen, wie M13, in den ein einzelner Strang eines hst-2-Gens kloniert wird [Yanisch-Perror, C. Vieira und J. Messing, Gene, 33 (103–119) (1985), und J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20–78 (1983)], fd [R. Herrman et al., Mol. Gen. Genet., 177, 231 (1980)] oder ϕX174 [M. Smith und S. Gillam, Genetic Engineering, Vol. 3, 5. 1–32, Plenum Press (1981)] hybridisiert. Der Phage kann sowohl Sense- als auch Antisense-Ketten des Gens übertragen. Wenn der Phage die Antisense-Kette überträgt, ist der Primer wegen der Degeneration des Codons möglicherweise nicht derselbe wie bei einem Bereich der Sense-Kette, zusätzlich zu einem zu mutagenisierenden Codon. Ähnlich gilt: Wenn der Phage die Sense-Kette überträgt, ist der Primer möglicherweise nicht zu dem Bereich der Sense-Kette komplementär, zusätzlich zu einem zu mutagenisierenden Codon, das eine Paarung mit dem zu deletierenden Codon bildet. Für die Hybridisierung verwendete Bedingungen werden von M. Smith und S. Gillam, loc. cit., beschrieben. Die Temperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 0 bis 70°C und allgemeiner von 10 bis 50°C. Nach der Hybridisierung wird der Primer auf der Phagen-DNA durch Reaktion mit E.-coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Reverse Transcriptase oder eine andere geeignete DNA-Polymerase verlängert. Die resultierende doppelsträngige DNA wird durch Behandlung mit einer DNA-Ligase, wie T4-DNA-Ligase, in eine ringförmige doppelsträngige DNA umgewandelt. Ein DNA-Molekül, das einen einzelsträngigen Bereich enthält, kann durch Behandlung mit S1-Endonuclease gespalten werden.
Der resultierende mutagenisierte Heteroduplex wird verwendet, um kompetente Wirtsorganismen und Zellen zu transformieren. Eine Duplizierung des Heteroduplex mit den Wirten erzeugt Nachkommen beider Ketten. Nach der Duplizierung werden mutante Gene aus den Nachkommen mutanter Ketten isoliert und in geeignete Vektoren eingesetzt, die für die Transformation geeigneter Wirtsorganismen und Zellen verwendet werden.
Dann wird Phagen-DNA, die mutagenisierte Gene überträgt, isoliert und in ein Plasmid eingeführt.
Zu den Plasmiden, in die die DNA eingeführt wird, gehören zum Beispiel die Plasmide pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene, 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene, 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)], die von E, coli abgeleitet sind, und das Plasmid pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication, 112, 6678 (1983)], das von Bacillus subtilis abgeleitet ist. Es kann jedoch auch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es in dem Wirt replizierbar ist und gehalten werden kann.
Zu den Verfahren zur Einführung der DNA in das Plasmid gehört zum Beispiel das Verfahren, das T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 239, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), beschrieben ist.
Das klonierte Gen wird stromabwärts eines Promotors in einen für die Expression geeigneten Vektor ligiert, wodurch ein Expressionsvektor erhalten werden kann.
Beispiele für die Vektoren zur Herstellung von rekombinanten Vektoren sind die Plasmide pBR322 (oben gezeigt), pBR325 (oben gezeigt), pUC12 (oben gezeigt) und pUC13 (oben gezeigt), die von E. coli abgeleitet sind, und die Plasmide pUB110, pTP5 und pC194, die von Bacillus subtilis abgeleitet sind, von Hefe abgeleitete Plasmide (zum Beispiel pSH19 und pSH15), Bakteriophagen, wie λ-Phage, und Tierviren, wie Retroviren und Vaccinia-Viren.
Das Gen kann ATG als Translations-Startcodon an seinem 5'-Terminus und TAA, TGA oder TAG als Translations-Stopcodon an seinem 3'-Terminus aufweisen. Weiterhin ist ein Promotor stromaufwärts davon ligiert und operabel damit verknüpft, um das Gen zu exprimieren. Der in dieser Erfindung verwendete Promotor kann ein beliebiger sein, solange er für die Expression in einem für die Genexpression ausgewählten Wirt geeignet ist.
Wenn es sich bei dem für die Transformation verwendeten Wirt zum Beispiel um Escherichia handelt, wird vorzugsweise ein trp-Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λpL-Promotor, ein Ipp-Promotor oder ein T7-Promotor verwendet. Wenn es sich bei dem Wirt um Bacillus handelt, wird vorzugsweise ein SPO1-Promotor, ein SPO2-Promotor oder ein penP-Promotor verwendet. Wenn es sich bei dem Wirt um Hefe handelt, wird vorzugsweise ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP-Promotor oder ein ADH-Promotor verwendet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirt um Escherichia und bei dem Promotor unter anderem um den trp-Promotor oder den T7-Promotor.
Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, kann ein von SV40 abgeleiteter Promotor oder ein Retrovirus-Promotor verwendet werden. Der von SV40 abgeleitete Promotor ist besonders zu bevorzugen.
Unter Verwendung des so aufgebauten DNA-haltigen Vektors wird die Transformante hergestellt.
Zu den Wirtszellen, die verwendet werden können, gehören Escherichia, Bacillus, Hefe und Tierzellen.
Beispiele für die oben beschriebene Escherichia sind E, coli K12DHI [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160 (1968)], M103 [Nucl. Acids Res., 9, 309 (1981)], JA221 [J. Mol. Biol., 120, 517 (1978)], HB101 [J. Mol. Biol., 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
Beispiele für den oben beschriebenen Bacillus sind Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)] und 207–21 [J. Biochem., 95, 87 (1984)].
Beispiele für die oben beschriebene Hefe sind Saccharomyces cerevisiae AH22R^–, NA87-11A und DKD-5D.
Als Beispiele für die Tierzellen gehören zu den vorzugsweise verwendeten Zelllinien Affenzellen COS-7 [Cell, 23, 157 (1981)], Vero, chinesische Hamsterzellen (CHO), Maus-L-Zellen und Human-FL-Zellen.
Die oben beschriebene Transformation von Escherichia erfolgt zum Beispiel nach dem in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 69, 2110 (1972), und Gene 17, 107 (1982), beschriebenen Verfahren.
Die Transformation von Bacillus erfolgt zum Beispiel nach dem in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979), beschriebenen Verfahren.
Die Transformation der Hefe wird zum Beispiel nach dem in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, 1929 (1978), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation der Tierzellen wird zum Beispiel nach dem in Virology 52, 456 (1973), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
So werden die Transformanten erhalten, indem man mit den Vektoren transformiert, die das gewünschte hst-2-Polypeptid, wie Polypeptid (I), enthalten.
Wenn bakterielle Transformanten kultiviert werden, ist als für die Kultivierung verwendetes Medium ein flüssiges Medium geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und weitere, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind, sind darin enthalten. Beispiele für die Kohlenstoffquellen sind Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Saccharose. Beispiele für die Stickstoffquellen sind anorganische oder organische Stoffe, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenschrot und Kartoffelextraktlösung. Zu den anorganischen Verbindungen gehören zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid. Weiterhin können Hefeextrakte, Vitamine und wachstumsfördernde Faktoren hinzugefügt werden.
Der pH-Wert des Mediums beträgt vorzugsweise 6 bis B.
Als Medium für die Kultur von Escherichia wird vorzugsweise zum Beispiel M9-Medium verwendet, das Glucose und Casamino Acids enthält [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431–433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Damit der Promotor effizient wirkt, kann, falls erforderlich, ein Wirkstoff wie 3-Indolylacrylsäure hinzugefügt werden.
Wenn die Escherichia-Transformanten kultiviert werden, wird die Kultur gewöhnlich 3 bis 24 Stunden lang bei 15 bis 43°C durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Bacillus-Transformanten kultiviert werden, wird die Kultur gewöhnlich 6 bis 24 Stunden lang bei 30 bis 40°C durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Hefetransformanten kultiviert werden, ist Burkholder-Minimalmedium [K. L. Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4505 (1980)] ein Beispiel für ein Medium. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Die Kultur wird gewöhnlich 24 bis 72 Stunden lang bei 20 bis 35 °C durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Tierzelltransformanten kultiviert werden, sind Beispiele für das Medium MEM-Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]. Weiterhin kann 5 bis 20% fetales Kälberserum hinzugefügt werden. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 6 bis B. Die Kultur wird gewöhnlich 15 bis 60 Stunden lang bei etwa 30 bis 40 °C durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Die gebildeten und in den oben genannten Kulturprodukten, nämlich in Zellen oder außerhalb von Zellen, akkumulierten hst-2-Polypeptide einschließlich des Polypeptids (I) können zum Beispiel nach dem folgenden Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Wenn hst-2-Polypeptide einschließlich des Polypeptids (I) aus den kultivierten Zellen extrahiert werden, werden die Zellen nach der Kultur mit in der Technik bekannten Verfahren isoliert. Dann werden die isolierten Zellen in Pufferlösungen, die Protein-Denaturierungsmittel, wie Guanidin-Hydrochlorid, enthalten, suspendiert, um die gewünschten Proteinen aus den Zellen zu eluieren. Die Zellen können auch mit einer French Press, Ultraschallbehandlung, einem Enzym wie Lysozym und/oder Gefrier-Tau-Cyclen aufgeschlossen werden, und anschließend erfolgt eine Zentrifugation, wobei man die hst-2-Polypeptide einschließlich des Polypeptids (I) erhält. Unter anderem wird vorzugsweise eine Kombination des Enzyms, wie Lysozym, und der Ultraschallbehandlung verwendet.
Zum Beispiel kann das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung durch geeignete Kombinationen von bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren aus einem Überstand gereinigt werden. Zu diesen bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren gehören Verfahren, die sich die Löslichkeit zu Nutze machen, wie Aussalzen und Fällung durch Lösungsmittel, Verfahren, die sich hauptsächlich einen Unterschied im Molekulargewicht zu Nutze machen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Verfahren, die sich einen Unterschied in der elektrischen Ladung zu Nutze machen, wie Ionenaustauschchromatographie, Verfahren, die sich eine spezifische Affinität zu Nutze machen, wie Affinitätschromatographie, Verfahren, die sich einen Unterschied in der Hydrophobie zu Nutze machen, wie Umkehrphasen-HPLC, und Verfahren, die sich einen Unterschied im isoelektrischen Punkt zu Nutze machen, wie isoelektrische Fokussierung.
Insbesondere kann der oben genannte Überstand einer Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose unterzogen werden, wodurch man in der Lage ist, Kontaminanten, wie Nucleinsäuren und saure Proteine, zu entfernen. Zum Beispiel ist es effektiv, den Überstand einer DEAE-Cellulose-Säule, die mit einem etwa neutralen Puffer wie Tris äquilibriert ist, auszusetzen und Fraktionen aufzufangen, die nicht auf der Säule adsorbiert werden. Weiterhin kann das Polypeptid (I) gereinigt werden, indem man den Überstand einer Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Carboxymethyl-(CM)-Cellulose als Träger unterzieht, damit das Polypeptid vom Träger adsorbiert werden kann, und das Polypeptid (I) unter Verwendung einer Salzlösung eluiert.
Das Polypeptid (I) kann durch Säulenchromatographie unter Verwendung von sauren harzen, wie CM-Sephadex^®, direkt aus Zellextrakten gereinigt werden. Zum Beispiel wird der Überstand einer mit einem schwach sauren Puffer (zum Beispiel Phosphatpuffer) äquilibrierten CM-Sephadex^©-Säule ausgesetzt, was eine effiziente Reinigung bewirkt. Nach dem Waschen der Säule mit demselben Puffer wird die Säule mit einem Puffer eluiert, der weiterhin ein Salz (zum Beispiel NaCl) enthält, wodurch das Polypeptid (I) eluiert werden kann. Diese Eluate können nach der Dialyse lyophilisiert werden.
Affinitätschromatographie unter Verwendung von Heparin-Sepharose als Träger kann zweckmäßigerweise auf die Muteine des Deletionstyps von hst-2 in E.-coli-Extrakt für die Reinigung des Polypeptids (I) angewendet werden. Zum Beispiel wird das oben genannte Eluat auf eine Heparin-Sepharose^®-Säule geladen, die mit einer etwa neutralen Pufferlösung, wie Tris-Puffer oder Phosphatpuffer, äquilibriert ist. Nach gründlichem Waschen wird die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert, wodurch das Polypeptid (I) gereinigt werden kann.
Insbesondere sind für die HPLC (high performance liquid chromatography) entwickelte Heparinsäulen (zum Beispiel Shodex AF-pak HR-894, Showa Denko) effektiv.
Wie bei der oben genannten Heparin-Sepharose^®-Säule wird das Eluat auf die Heparinsäule geladen, die mit einer etwa neutralen Pufferlösung äquilibriert ist. Nach gründlichem Waschen wird die Säule mit einem linearen Gradienten von NaCl eluiert. Wiederholte Cyclen dieses Säulenschrittes können verwendet werden, um eine hochgradig gereinigte Probe zu erhalten. So kann das Polypeptid (I) als hochgradig gereinigte Probe gewonnen werden.
Die so erhaltene Probe kann auch dialysiert und lyophilisiert werden, so dass man ein trockenes Pulver erhält. Weiterhin wird vorzugsweise Serumalbumin als Träger für die Lagerung zu der Probe gegeben, da so verhindert werden kann, dass die Probe von einem Behälter adsorbiert wird.
Die Coexistenz einer kleinen Menge eines Reduktionsmittels im Laufe der Reinigung oder während der Lagerung ist geeignet, um die Oxidation der Probe zu verhindern. Zu den Reduktionsmittels gehören β-Mercaptoethanol, Dithiothreit und Glutathion.
So werden Polypeptide (I) erhalten, die im Wesentlichen rein und im Wesentlichen frei von Pyrogen und Endotoxin sind. Das im Wesentlichen reine Polypeptid (I) enthält das Polypeptid (I) in einer Menge von 95 Gew.-% oder mehr als Proteingehalt und besonders bevorzugt in einer Menge von 98 Gew.-% oder mehr. Das im Wesentlichen pyrogen- und endotoxinfreie Produkt reagiert im Limulus-Lysat-Test negativ.
Die hst-2-Aktivität des so gebildeten Polypeptids kann anhand der wachstumsfördernden Wirkung auf bekannte BALB/c-3T3-Zellen bestimmt werden.
Gemäß den Zellen, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung transfiziert oder transformiert wurden, kann das Polypeptid (I) in großen Mengen auch in verschiedenen Zellen produziert werden, bei denen die hst-2-Polypeptide im Wesentlichen nur in kleinen Mengen synthetisiert werden oder überhaupt nicht synthetisiert werden, was eine vorteilhafte Ableitung des Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindung bewirkt.
Die Expressionsplasmide, die die Gene enthalten, die für die Polypeptide (I) codieren, können die Polypeptide in großen Mengen in verschiedenen Zellen produzieren, indem sie die Plasmide in die Zellen einführen. Das Polypeptid (I) kann daher in großen Mengen erhalten werden.
Das hier produzierte Polypeptid (I) hat die Aktivität, das Wachstum von Zellen wie Gefäßendothelzellen zu fördern, sowie Angiogenese-fördernde Aktivität und hat eine geringe Toxizität, so dass es als Therapeutikum, wie als Wirkstoff für die Förderungsbehandlung von Verbrennungen, Wunden und postoperativen Geweben verwendet werden kann. Außerdem können sie als Reagentien zur Förderung der Zellkultivierung verwendet werden.
Wenn das Polypeptid (I) als Wirkstoff verwendet wird, kann es warmblütigen Tieren (wie Menschen, Mäusen, Ratten, Hamstern, Kaninchen, Hunden und Katzen) unbedenklich parenteral oder oral in Pulverform so, wie es ist, oder als pharmazeutische Zusammensetzung (wie Injektionen, Tabletten, Kapseln, Lösungen und Salben) mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelhilfsstoffen und Verdünnungsmitteln verabreicht werden.
Die Injektionen werden mit herkömmlichen Verfahren hergestellt, wobei man zum Beispiel physiologische Kochsalzlösung oder wässrige Lösungen, die Glucose oder andere Hilfsmittel enthalten, verwendet. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Tabletten und Kapseln, können ebenfalls nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Wenn die Injektionen, Lösungen, Tabletten und Kapseln als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, werden sie unter aseptischen Bedingungen hergestellt.
Wenn das Polypeptid (I) als der oben beschriebene Wirkstoff verwendet wird, wird es zum Beispiel den oben genannten warmblütigen Tieren in einer geeigneten Menge verabreicht, die im Bereich von 1 ng bis 100 μg pro kg täglich liegt, wobei die Verabreichungswege und Symptome berücksichtigt werden. Die hst-2-Polypeptide werden ebenfalls in einer geeigneten Menge verwendet, die aus demselben Mengenbereich gewählt wird.
Wenn die Polypeptide weiterhin als Reagentien zur Förderung der Zellkultivierung verwendet werden, werden sie vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 10 μg pro Liter Medium und besonders bevorzugt in einer Menge von 0,1 bis 10 μg pro Liter Medium zu den Medien gegeben. Wenn das Polypeptid (I) weiterhin als Reagens zur Förderung der Kultivierung von Megakaryocyten-Vorläuferzellen verwendet wird, wird es vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 10 mg pro Liter Medium und besonders bevorzugt in einer Menge von 0,5 bis 10 mg pro Liter Medium zu den Medien gegeben.
Das Polypeptid (I) weist eine ausgezeichnete zellwachstumsfördernde Aktivität auf und ist unter sauren Bedingungen stabil, so dass es auch als Therapeutikum für Geschwüre, wie Geschwüre des Magen-Darm-Trakts, und zur Förderung der Behandlung von Verbrennungen und Wunden verwendet werden kann. Weiterhin weist es eine Megakaryocyten-wachstumsfördernde Aktivität auf. Es kann daher angewendet werden, um angeborene oder als Nebenwirkung von Chemotherapeutika auftretende Thrombocytopeniesymptome zu lindern. Das oben definierte Polypeptid mit der hst-2-Aktivität kann auch verwendet werden, um ein thrombocytenvermehrendes Mittel herzustellen. Durch die Verabreichung der throm bocytenvermehrenden Mittel kann die Zahl von Blutplättchen im peripheren Blut erhöht werden. Bei der Chemotherapie von Krebserkrankungen induziert die Verabreichung fast aller Chemotherapeutika eine Abnahme der Anzahl der Blutplättchen, was die Verabreichung der Chemotherapeutika in ausreichenden Mengen behindert. Dasselbe gilt für die Strahlentherapie. Eine Abnahme der Zahl der Blutplättchen wird 3 bis 15 Tage nach der Verabreichung der Chemotherapeutika beobachtet. Die thrombocytenvermehrenden Mittel können unmittelbar nach der Verabreichung der Chemotherapeutika oder nach der Beobachtung einer Abnahme der Zahl der Blutplättchen verabreicht werden, um die Zahl der Blutplättchen wieder zu erhöhen. Weiterhin können sie auch verabreicht werden, um die Zahl der Blutplättchen vorab zu erhöhen, indem man die thrombocytenvermehrenden Mittel vor der Verabreichung der Chemotherapeutika verabreicht.
Das thrombocytenvermehrende Mittel kann die Zahl der Blutplättchen erhöhen, so dass die durch eine Chemotherapie verminderte Zahl der Blutplättchen wieder erhöht wird, wodurch die Wirkung der Behandlung verstärkt wird und schwere Symptome bei Patienten gelindert werden.
Thrombocytenvermehrende Mittel können also als Hilfsmittel für Krebsmedikamente verwendet werden, solange das Krebswachstum nicht gefördert wird.
Beispiele für Krebsmedikamente, die als Chemotherapeutika verwendet werden, sind Alkylierungsmittel (zum Beispiel Stickstoff-Lost-N-Oxid, Cyclophosphamid, Melphalan, Carboquon, Busulfan, Nimustin-Hydrochlorid, Ranimustin und Dacarbazin), Antimetabolite (zum Beispiel Fluoruracil, Tegaful, Cytarabin, Ancitabin-Hydrochlorid, Broxuridin, Doxifluridin, Mercaptopurin, Thioinosin und Methotrexat), Antibiotika (zum Beispiel Mitomycin, Bleomycin, Daunorubicin-Hydrochlorid, Doxorubicin-Hydrochlorid, Pirarubicin-Hydrochlorid, Aclarubicin-Hydrochlorid, Neocarzinostatin und Actinomycin D), Pflanzenalkaloide (zum Beispiel Vincristinsulfat, Vindesinsulfat, Vinblastinsulfat und Etoposid), Hormonmittel (zum Beispiel Tamoxifencitrat), Platinkomplexkomponenten (zum Beispiel Carboplatin, Cisplatin) und andere (zum Beispiel Procarbazin-Hydrochlorid, Mitobronitol und Mitoxanton-Hydrochlorid).
Das Polypeptid (I) kann in großen Mengen und in hoher Reinheit erhalten werden, indem man das Gen in verschiedene Zellen einführt.

Wenn Nucleotide, Aminosäuren usw. in der Beschreibung und in den Zeichnungen mit Abkürzungen bezeichnet werden, werden die Abkürzungen, die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature festgelegt wurden, oder solche, die in der Fachwelt gewöhnlich verwendet werden, eingesetzt. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optische Isomere vorliegen können, sollen die L-Formen gemeint sein, wenn nichts anderes angegeben ist.

DNA	Desoxyribonucleinsäure
cDNA	komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A	Adenin
T	Thymin
G	Guanin
C	Cytosin
RNA	Ribonucleinsäure
dATP	Desoxyadenosintriphosphat
dTTP	Desoxythymidintriphosphat
dGTP	Desoxyguanosintriphosphat
dCTP	Desoxycytidintriphosphat
ATP	Adenosintriphosphat
Tdr	Thymidin
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure
SDS	Natriumdodecylsulfat
Gly	Glycin
Ala	Alanin
Val	Valin
Leu	Leucin

Ile	Isoleucin
Ser	Serin
Thr	Threonin
Cys	Cystein
Met	Methionin
Glu	Glutaminsäure
Asp	Asparaginsäure
Lys	Lysin
Arg	Arginin
His	Histidin
Phe	Phenylalanin
Tyr	Tyrosin
Trp	Tryptophan
Pro	Prolin
Asn	Asparagin
Gln	Glutamin

Beispiele
Die in den folgenden Beispielen erhaltenen Transformanten wurden beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) und beim National Institute of Bioscience and Human-technology (NIBH) (das frühere Fermentation Research Institute), the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt. Die Zugriffsnummern und die Hinterlegungsdaten sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
Das in Beispiel 1 erhaltene Polypeptid, bei dem Aminosäuren vom N-Terminus bis zum Aminosäurerest Nr. 38 der SEQ ID NO: 6 deletiert sind, wird N38 genannt, und seine Aminosäuresequenz ist in 2 gezeigt (SEQ ID NO: 1).
Das in Beispiel 2 erhaltene Mutein, bei dem Aminosäuren vom N-Terminus bis zum Aminosäurerest Nr. 63 von hst-2 deletiert sind, wird N63 genannt, und seine Aminosäuresequenz ist in 4 gezeigt (SEQ ID NO: 3).
Beispiel 1: Expression von N38
a) Konstruktion eines Expressionsplasmids
Das Plasmid pKOh2, das humane hst-2-cDNA enthält [Oncogene, 7, 303–309 (1992)], wurde mit SmaI-DraI gespalten, wobei man ein DNA-Fragment von 0,62 kb erhielt. Dieses Fragment wurde in die SmaI-Stelle des NdeI-PstI-Deletionsvektors von pUC18 eingesetzt, wobei man das Plasmid pTB1544 erhielt, bei dem die BamHI-Stelle hinter der DraI-Stelle angeordnet ist. Die synthetischen Oligonucleotide 5'-GGGCATATGCCTGCA-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-GGCATATGCCC-3' (SEQ ID NO: 10) wurden in die SmaI-PstI-Stellen eingesetzt, und anschließend wurde mit NdeI-BamHI gespalten, so dass man ein NdeI-BamHI-Fragment erhielt. Das oben genannte Fragment (das ein Gen enthielt, bei dem sich das Startcodon ATG vor dem CCT befindet, das für das 39. Pro codiert) wurde zwischen NdeI-BamHI des Expressionsvektors pET-3c für E, coli, der einen ϕ10-Promotor des Phagen T7 enthält [Gene, 56, 125–135 (1987)], eingesetzt, wobei man pTB1545 erhielt (3).
b) Expression der cDNA in E, coli
Ein RNA-Polymerase-Gen des Phagen T7 wurde in einen Stamm von E. coli MM294 eingeführt, wobei man λ-Phage-DE3 erhielt [F. W. Studier et al., J. Mol. Biol., 189, 113–130 (1986)], das lysogenisiert wurde. Weiterhin wurde das Plasmid pLysS, das ein Lysozym-Gen des Phagen T7 aufweist [F. W. Studier et al., loc. cit.], eingeführt, um einen Stamm von E, coli MM294(DE3)/pLysS herzustellen.
Das in (a) erhaltene, oben beschriebene Plasmid pTB1545 wurde in den Stamm E. coli MM294(DE3)/pLysS eingeführt, um E. coli MM294(DE3)/pLysS·pTB1545 (IFO 15430, FERM BP-4179) herzustellen. Die resultierenden Zellen wurden in 1 l Medium, das 10 μg/ml Chloramphenicol und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, und zu dem Zeitpunkt, als der Klett-Wert 180 erreichte, wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration von 0,1 mM erhielt. Dann wurde die Kultivierung 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und mit eisgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Dann wurden die Zellen wieder abgetrennt und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 2: Expression von N63
a) Konstruktion eines Expressionsplasmids
Das in Beispiel 1-a) erhaltene Plasmid pTB1544 wurde mit NheI-BamHI gespalten, wobei man ein DNA-Fragment von 0,46 kb erhielt. Dieses Fragment und die synthetischen Oligonucleotide 5'-TATGGGG-3' und 5'-CTAGCCCCA-3' wurden mit der 5'-terminalen Seite des oben genannten DNA-Fragments von 0,46 kb ligiert, wobei man ein NdeI-BamHI-DNA-Fragment von 0,47 kb erhielt (das ein Gen enthielt, bei dem sich das Startcodon ATG vor dem CCT befindet, das für das 64. Gly codiert). Dieses Fragment wurde zwischen NdeI-BamHI des Expressionsvek tors pET-3c für E, coli, der einen φ10-Promotor des Phagen T7 enthält (siehe oben), eingesetzt, wobei man pTB1547 erhielt (5).
b) Expression der cDNA in E. coli
Das in (a) erhaltene, oben beschriebene Plasmid pTB1547 wurde in den in Beispiel 1-b) hergestellten Stamm E, coli MM294(DE3)/pLysS eingeführt, um E. coli MM294(DE3)/pLysS·pTB1548 (IFO 15431, FERM BP-4180) herzustellen. Die resultierenden Zellen wurden in 1 l Medium, das 10 μg/ml Chloramphenicol und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, und zu dem Zeitpunkt, als der Klett-Wert 180 erreichte, wurde IPTG hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration von 0,1 mM erhielt. Dann wurde die Kultivierung 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und mit eisgekühltem PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen wieder abgetrennt und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 3: Reinigung von rekombinantem N38
a) Extraktion und Heparinsäule
Die in Beispiel 1 beschriebenen Zellen, die aus der 1-Liter-Kultur abgetrennt wurden, wurden in 25 ml eisgekühltem 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 10% Saccharose und 1 mM PMSF suspendiert, und Hühnereiweiß-Lysozym wurde hinzugefügt, was eine Konzentration von 0,5 mg/ml ergab. Nach 1 Stunde Stehen in Eis wurde die Suspension 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert und dann einer Ultraschallbehandlung (20 Sekunden, zweimal) und Zentrifugation (Sorvall, mit 18 000 U/min bei 4°C während 30 Minuten) unterzogen, wobei man einen Überstand als Zellextrakt erhielt.
25 ml des Zellextrakts wurden auf eine Säule mit Q-Sepharose^® (Pharmacia) (5 cm Durchmesser × 5 cm) geladen, die mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,5 M NaCl äquilibriert war, wodurch Nucleinsäurekomponenten in dem Extrakt entfernt wurden. Die durch die Säule fließende Lösung (Fraktionen, die nicht an die Q-Sepharose^®-Säule adsorbiert wurden: 45 ml) wurde mit Lösungen vom Waschen der Säule mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,5 M NaCl kombiniert. Diese Fraktion wurde einer HPLC-Apparatur (Gilson) ausgesetzt, die mit einer Heparinsäule, Shodex AF-paK AHR-894 (8 mm Innendurchmesser × 25 cm, Showa Denko), ausgestattet war. Die Säule wurde mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und dann mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,7 M NaCl gewaschen. Danach wurde die Säule 60 Minuten lang mit einem linearen Gradienten von 0,7 bis 2 M NaCl in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Minute eluiert.
Das Elutionsmuster ist in 6 gezeigt. In 6 geben die Zahlen auf der Ordinate die Extinktion bei 280 nm und die Konzentration von NaCl im Gradienten an, und die Zahlen auf der Abszisse geben die Nummer der Fraktion an. Die Gradientenelution wurde zum Zeitpunkt 0 gestartet. Alle 0,1 Minuten wurden Fraktionen getrennt aufgefangen. Die spezifische Aktivität des in diesen Fraktionen enthaltenen Proteins und die Menge des gewonnenen N38 sind in Tabelle 2 gezeigt. Die SDS-PAGE-Muster (12,5% Polyacrylamid-Gel) der jeweiligen Fraktionen, die Peaks ergeben, sind in 7 gezeigt.
Tabelle 2
b) Umkehr-C4-HPLC
Etwa die Hälfte (etwa 50 μg Protein) der Menge der Fraktion 22, die von der Heparin-HPLC-Säule eluiert wurde, wurde auf eine Umkehr-C4-Säule (Vydac) aufgetragen und in Gegenwart von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Acetonitril eluiert, um die Elutionsmuster zu untersuchen. Die Elution wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute während einer Gradientenzeit von 45 Minuten durchgeführt (8).
Beispiel 4: Biologische Aktivität von N38
Die Aktivität des in Beispiel 3-a) erhaltenen N38 wurde bestimmt, indem man die DNA-Synthese-Induktionsfähigkeit bei BALB/c-3T3-Zellen auf der Basis der Aufnahme von [³H]-Thymidin nach dem Verfahren von Sasada et al. [Sasada et al., Mol. Cell. Biol., 8, 588-594 (1988)] maß. Die Ergebnisse sind in der oben angegebenen Tabelle 2 gezeigt.
Beispiel 5: Aminoterminale Aminosäuresequenz
Mit 2,6 μg (etwa 130 pmol) des in Beispiel 3-b) erhaltenen gereinigten Proteins von N38 wurde die N-terminale Aminosäuresequenz analysiert, wobei man einen Gasphasen-Protein-Sequencer (Modell 473A, Applied Biosystems Inc.) verwendete. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäuresequenz des aminoterminalen Teils von N38 mit einer Sequenz übereinstimmten, die man aufgrund der Nucleotidsequenz der DNA des exprimierten Plasmids erwartete. Die Ergebnisse bewiesen, dass das vom Translations-Startcodon abgeleitete Methionin entfernt worden war.
Tabelle 3
Beispiel 6: DNA-Synthese-Induktionsaktivität von N38
Die DNA-Synthese-Induktionsaktivität des in Beispiel 3-a) erhaltenen gereinigten N38 auf Maus-BALB/c-3T3-Zellen wurde nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren untersucht, und die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. In 9 zeigen leere Kreise, ausgefüllte Kreise und ausgefüllte Dreiecke die Ergebnisse für aus Rinderhypophysen stammendes FGF, die Ergebnisse für N38 bzw. die Ergebnisse für N38 in Gegenwart von Heparin (5 μg/ml). Die in 9 gezeigten Ergebnisse offenbarten, dass N38 eine ähnliche Aktivität hat wie aus Rinderhypophysen stammendes FGF (Takara Shuzo) und dass seine Aktivität durch die Zugabe von Heparin verstärkt wird.
Beispiel 7: Transforming-Aktivität von N38
1 μg/ml N38 wurde zu Maus-BALB/c-3T3-A31-Zellen gegeben, und diese wurden kultiviert. Als Ergebnis wurde eine deutliche transformzellenartige morphologische Veränderung beobachtet. Als gleichzeitig Heparin (5 μg/ml) hinzugefügt wurde, wurde eine ähnliche Veränderung durch die Zugabe von 10 ng/ml N38 beobachtet.
Beispiel 8: Biologische Aktivität von N63
Die in Beispiel 2 beschriebenen Zellen, die aus der 10-Milliliter-Kultur abgetrennt worden waren, wurden in 0,25 ml eisgekühltem 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 10% Saccharose und 1 mM PMSF suspendiert, und Hühnereiweiß-Lysozym wurde hinzugefügt, was eine Konzentration von 0,5 mg/ml ergab. Nach 1 Stunde Stehen in Eis wurde die Suspension einer Ultraschallbehandlung (5 Sekunden, zweimal) und Zentrifugation (Kubota, gekühlte Mikrozentrifuge, mit 15 000 U/min bei 4°C während 15 Minuten) unterzogen, wobei man einen Überstand als Zellextrakt erhielt. Unter Verwendung des Zellextrakts wurde die Aktivität von N63 nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass N63 in einer Menge von 60 μg/ml als FGF-Äquivalent produziert wurde.
Beispiel 9: MK-CSF-Aktivität von N38
Knochenmarkzellen, die aus den Oberschenkelknochen von BALB/c-Mäusen (weiblich, 7 Wochen alt) gewonnen wurden, wurden in einer Menge von 2 × 10⁵ Zellen/ml in IMDM-Medium (Iscoves Modifikation von Dulbecco-Medium) (Flow), das 10% fetales Kälberserum (FCS) enthielt, suspendiert und 45 Minuten lang bei 37°C auf einer Kunststoffplatte inkubiert. Nichtadhäsive Zellen wurden abgetrennt und mit IMDM-Medium gewaschen, um das Serum zu entfernen. Diese nichtadhäsiven Knochenmarkzellen (1 × 10⁵ Zellen/ml) wurden in IMDM-Medium, das Neutridoma-sp (Boehringer Mannheim) enthielt, suspendiert, und eine 96-Napf-Flachbodenplatte (Nunc) wurde mit 200 μl/Napf der Suspension beimpft. Dann wurde N38 in verschiedenen Konzentrationen allein oder zusammen mit Heparin (20 μg/ml) hinzugefügt.
Nach 7 Tagen Kultivierung bei 37 °C wurden 50 μl 5%iges Glutaraldehyd (Wako Pure Chemical Industries) hinzugefügt, und die Platte wurde 5 Minuten lang mit 2000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu fixieren. Die Platte wurde kurz mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen, und anschließend wurde mit Acetylcholin gefärbt. Das heißt, 30 mg Acetylthiocholiniodid (Sigma) wurden in 45 ml 0,1 M Phosphatpuffer gelöst, und dann wurden zum Zeitpunkt der Verwendung 6 ml 30 mM Kupfersulfat, 3 ml 0,1 M Natriumcitrat und 6 ml 5 mM Kaliumhexacyanoferrat (III) hinzugefügt, um eine Färbelösung herzustellen. In jeden Napf wurden 200 μl der Lösung gegeben, und die Färbung wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer wurde die Zahl der Megakaryocyten unter einem umgekehrten Mikroskop bestimmt. Wie in 10 gezeigt ist, stimulierte N38 die Proliferation von Megakaryocyten-Vorläuferzellen im Maus-Knochenmark in dosisabhängiger Weise.
Beispiel 10: Wachstumsfördernde Aktivität von N38 auf Endothelzellen
Eine Linbro-Schale (Flow) wurde mit HUVE-Zellen beimpft, die in modifiziertem MCDB131 (Kurabo Industries Ltd.), das 2% FCS (MBA) enthielt, suspendiert waren, was 5 × 10³ Zellen/Napf ergab. Am nächsten Tag wurde N38 in verschiedenen Konzentrationen allein oder zusammen mit Heparin (5 μg/ml) hinzugefügt. Nach 5 Tagen wurde die Zahl der Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Eine ähnliche Operation wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Medium durch das oben genannte Medium ersetzt wurde, dem epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) zugesetzt wurde, so dass sich eine Konzentration von 10 ng/ml ergab. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
In den 11 und 12 zeigen ausgefüllte Kreise (?) und leere Kreise (o) die Ergebnisse für N38 allein bzw. die Ergebnisse für N38 in Gegenwart von Heparin (5 μg/ml). Wie in 11 gezeigt ist, bewiesen die Ergebnisse, dass N38 eine zellwachstumsfördernde Wirkung auf HUVE-Zellen hat und dass diese Aktivität durch die Zugabe von Heparin verstärkt wird. Wie in 12 gezeigt ist, offenbarten die Ergebnisse weiterhin, dass der Unterschied zwischen beiden in Bezug auf die zellwachstumsfördernde Aktivität bei 2% FCS enthaltendem modifiziertem MCDB131-Medium, das mit 10 ng/ml EGF ergänzt war, deutlicher wurde.
Zubereitungsbeispiel 1
Das in Beispiel 3 hergestellte N38 wird über Nacht gegen 50 mM Citratpuffer (pH 5,0) dialysiert, und anschließend wird eine Lösung mit einer Konzentration von 500 μg/ml hergestellt. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert, und 1 ml der resultierenden Lösung wird in jedes Gläschen gegossen, um ein Präparat für die Injektion herzustellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids mit der Aktivität eines heparinbindenden sekretorischen Transformingfaktors 2 (hst-2) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombocytopeniesymptomen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz darstellt:
oder ein Fragment davon darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 5; n = 1: SEQ ID NO: 6).
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei Y
(n = 0: SEQ ID NO: 7; n = 1: SEQ ID NO: 8) oder ein Fragment davon darstellt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt wird:
oder ein Fragment davon darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 1; n = 1: SEQ ID NO: 2).
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei X
darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 1; n = 1: SEQ ID NO: 2).
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei X Gly darstellt (n = 0: SEQ ID NO: 3; n = 1: SEQ ID NO: 4).
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 hat.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 hat.
Verwendung gemäß Anspruch 1 bis 8, wobei das Medikament weiterhin ein Krebsmedikament umfasst.
Chemotherapeutikum, das ein Polypeptid mit hst-2-Aktivität gemäß Anspruch 1 bis 8 und ein Krebsmedikament umfasst.
Chemotherapeutikum gemäß Anspruch 10, das ein Gemisch aus dem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und dem Krebsmedikament umfasst.
Kit mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, das getrennte Zubereitungen des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und eines Krebsmedikaments umfasst.
Verwendung eines Polypeptids mit hst-2-Aktivität gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 zusammen mit einem Krebsmedikament zur Herstellung eines Chemotherapeutikums.