DE69429647T2 - Umkehrung des Phänotyps transformierter Zellen durch Transkriptionsfaktor IRF-1 - Google Patents

Umkehrung des Phänotyps transformierter Zellen durch Transkriptionsfaktor IRF-1

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Transkriptionsfaktors Interferon-Regulationsfaktor-1 (IRF-1) oder von Nukleinsäuren, welche die kodierende Information für IRF-1 enthalten, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Reversion des Phänotyps von Tumorzellen oder Zellen, welche einen transformierten Phänotyp zeigen.
  • Interferon-Regulationsfaktor-1 (IRF-1), ein transkriptionaler Aktivator, und IRF- 2, dessen antagonistischer Repressor, wurden als Regulatoren von Typ I-Interferon (IFN) und IFN-induzierbaren Genen identifiziert. Es wurde bereits gezeigt, daß IRF-1 eine anti-onkogene Aktivität in NIH 3T3-Zellen zeigt, welche durch Überexpression von IRF-2 transformiert sind. In der Tat wurden, wenn das IRF-2-Gen in NIH 3T3- Zellen überexprimiert wurde, die Zellen transformiert und zeigten erhöhte Tumorgenizität bei nackten Mäusen. Dieser transformierte Phänotyp wurde jedoch durch gleichzeitige Überexpression des IRF-1-Gens revertiert (Harada et al., Science 259, 971-974, 1993). Es ist gezeigt worden, daß das humane IRF-1-Gen eine Genkartenposition auf Chromosom 5q31.1 aufweist, einer Region, die bei Patienten mit Leukämie oder präleukämischen myelodysplastischen Syndromen häufig deletiert ist (Willman et al., Science 259, 968-971, 1993).
  • In der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß die Reversion des transformierten Phänotyps durch IRF-1 nicht auf Zellen beschränkt ist, welche durch seinen natürlichen Antagonisten, IRF-2, transformiert wurden, sondern auch in Zellen, die Onkogene exprimieren, erzielt werden kann. So macht es diese Erfindung möglich, den transformierten Phänotyp allgemeiner in Tumorzellen zur Reversion zu bringen. IRF-1 und Nukleinsäuren, die für IRF-1 kodieren, können in der Krebstherapie, insbesondere in der Gentherapie, angewandt werden.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, welche die kodierende Information für den Interferon-Regulationsfaktor-1 (IRF-1) enthält, oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, welche durch die Reversion des Phänotyps von transformierten Zellen, die das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren, behandelbar ist. Transformierte Zellen oder Tumorzellen sind Zellen, welche durch signifikante Veränderungen in ihren Wachstumseigenschaften im Vergleich zu normalen Zellen charakterisiert sind (Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., New York, 1986, S. 1039-1046). Es ist darüber hinaus bevorzugt, daß die Zellen durch eine fehlende oder unzulängliche Tumorsuppressorgen-Expression gekennzeichnet sind. Vorteilhafterweise ist die Nukleinsäure in einen Expressionsvektor inkorporiert. Dies kann beispielsweise ein viraler Vektor sein, vorzugsweise ein retroviraler Vektor, z. B. pDG. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Gentransfer einer Nukleinsäure, welche die kodierende Information für den Interferon-Regulationsfaktor-1 (IRF-1) enthält, oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon in transformierte Zellen oder Tumorzellen. Als Gentransfer-Vehikel kann ein geeignetes Retrovirus eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül jedoch mit einem Konjugat komplexiert, wobei das Konjugat aus einem endosomolytischen Agens und einem DNA-bindenden Agens besteht (siehe unten). Vorzugsweise ist das endosomolytische Agens ein inaktiviertes Adenovirus und das DNA-bindende Agens ist Polylysin. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Nukleinsäure, welche die kodierende Information für IRF-1 enthält, oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Krebstherapie, wobei die Krebszellen des Krebses das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren, insbesondere wenn die pharmazeutische Zusammensetzung für die Gentherapie von Krebs geeignet ist. Diese Nukleinsäure kann auch regulatorische Sequenzen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die kodierende Information für IRF-1 in ein Nukleinsäuremolekül inkorporiert, welches mit einem Konjugat komplexiert ist, wobei das Konjugat aus einem endosomolytischen Agens und einem DNA-bindenden Agens besteht. Vorzugsweise ist das endosomolytische Agens ein inaktiviertes Adenovirus oder adenovirale Partikel. Vorzugsweise ist das DNA-bindende Agens Polylysin. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von IRF-1-Polypeptid oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Krebstherapie, wobei die Krebszellen des Krebses das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren. Der IRF-1 der vorliegenden Erfindung stammt vorzugsweise aus derselben Spezies wie die transformierten Zellen oder Krebszellen, welche behandelt werden sollen. Falls humane Zellen behandelt werden sollen, ist der IRF-1 vorzugsweise Human-IRF-1. Der Fachmann weiß aus dem Stand der Technik, wie Nukleinsäuremoleküle herzustellen sind, welche die kodierende Information für IRF- 1, beispielsweise IRF-1 aus der Maus (Miyamoto et al., Cell 54, 903-913, 1988) oder dem Menschen (Maruyama et al., Nucl. Acids Res. 17, 3292, 1989; EP 0359998), enthalten. Er weiß ferner, wie Nukleinsäuremoleküle herzustellen sind, die für Varianten oder Fragmente kodieren, und Verfahren zum Testen, ob solche Varianten oder Fragmente immer noch die biologische Aktivität des Ausgangsmoleküls aufweisen. Somit werden solche Varianten und Fragmente ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Der geschulte Fachmann kennt ferner Verfahren aus dem Stand der Technik zur Integration der kodierenden Information für IRF-1 in Nukleinsäuren, welche zur Expression des Gens in der Lage sind, und zur Einführung solcher Nukleinsäuremoleküle in Zellen auf solche Weise, daß das IRF-1- Gen in den Zielzellen exprimiert wird. Detailliertere Beispiele, wie die vorliegende Erfindung ausgeführt werden kann, werden im folgenden beschrieben.
  • Der Erfinder der vorliegenden Erfindung versuchte den Phänotyp von Rat-1- Rattenzellen, transformiert durch entweder das c-myc-Gen oder das fos8-Gen, zur Reversion zu bringen. Diese beiden Gene sind wohlbekannte Onkogene und deren Eigenschaften wurden gut untersucht (Shiroki et al., Mol. Cell. Biol. 6, 4379-4386, 1986; Nakabeppu et al., Mol Cell Biol 13, 4157-4166, 1993). Ein Retrovirus, pDGIRF1, welches nach einer Infektion Maus-IRF-1 exprimiert, wurde bereits konstruiert (Harada et ei, Science 259, 971-974, 1993). Die c-myc-transformierte 3Y1-Zelle oder fos8-transformierte Rat-1A-Zelle, als RmycY1 bzw. Rat-1A(FosB) bezeichnet, zeigen beide verankerungsunabhängiges Wachstum und erhöhte Tumorgenizität bei Ratten oder nackten Mäusen (Shiroki et al, Mol. Cell. Biol. 6, 4379-4386, 1986; Nakabeppu et al., Mol. Cel. Biol. 13, 4157-4166, 1993). 5 · 10&sup5; der jeweiligen Zellen wurden mit dem pDGIRF-1-Virus bei der Multiplizität der Infektion (MOl) von 10 unter Anwendung genau des von Harada et al. angewandten Verfahrens infiziert und anschließend grenzverdünnt, um einzelne Klone zu erhalten. Nach 1 oder 2 Wochen haben diese Zellklone den transformierten Phänotyp verloren. In der Tat haben diese viral infizierten Zellen ihre Morphologie geändert, welche von den ursprünglichen Rat-1-Zellen nicht unterscheidbar ist (Fig. 1, 2), und ihr tumorgenes Potential bei nackten Mäusen verloren (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu wurde bei einer ähnlichen Infektion des Kontrollretrovirus pGD keine solche Veränderung beobachtet (Fig. 1, 2). Somit weisen diese Beobachtungen eindeutig auf die allgemeine Funktion von IRF-1 als Tumorsuppressor in Zellen hin, die durch mindestens zwei verschiedene Onkogene transformiert wurden. Wir beobachteten auch, daß die in diesen revertierten Zellen exprimierten Niveaus der OnkogenmRNAs im wesentlichen gleich dem der ursprünglichen transformierten Zellen blieben. Somit ist die beobachtete phänotypische Reversion der Zellen als Ergebnis der IRF-1-Genexpression nicht auf die Inhibierung der Promotoren zurückzuführen, welche für die Onkogen-Expression genutzt wurden. Die Resultate legen nahe, daß einige der Krebszellen entweder vollständig, wie hier gezeigt, oder partiell hinsichtlich ihres Phänotyps supprimiert werden können. Somit kann die vorliegende Erfindung sehr wichtig sein für die zukünftige Entwicklung des IRF-1-Gens als aussichtsreiches Tumorsuppressorgen für die Gentherapie von Krebs, insbesondere für Krebsarten, welche aktivierte Onkogene enthalten oder durch eine fehlende oder unzulängliche Tumorsuppressorgen-Expression gekennzeichnet sind. Es kann auch betont werden, daß der IRF-1-Gentransfer nicht nur durch das gegenwärtig eingesetzte Retrovirus erzielt werden kann, sondern auch auf andere Weise, d. h., die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung des IRF-1-exprimierenden Retrovirus beschränkt, vielmehr weist sie auf die allgemeine Bedeutung des IRF-1- Gentransfers für die Suppression von Tumorzellen hin. Überblicksartikel über Gentransfer-Systeme und klinische Protokolle, welche zur Verwendung für die vorliegende Erfindung adaptiert werden können, sind in der Literatur zu finden (Morgan et Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62, 191-217, 1993; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem. 208, 211-225; 1992).
  • Ein Gentransfer-System, welches vorteilhaft in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, wurde kürzlich entwickelt (Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8850-8854, 1991; Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6, 247-252, 1992a; Zatloukal et al., Ann. New York Med. Sct 660, 136-153, 1992; Cotten et al., Proc. Natl. Acad. SoL USA 89, 6094-6098, 1992; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6099-6103, 1992; Curiel et al., Human Gene Therepy 3, 147-154, 1992b). Es basiert auf der Eigenschaft von Adenoviren, den Inhalt von Endosomen freizusetzen, nachdem sie durch Rezeptor-vermittelte Endocytose inkorporiert wurden. Die Verwendung von Adenoviren erhöht die Effizienz des Gentransfers, da sie den lysosomalen Abbau von ins Innere gebrachter DNA umgeht. Das Adenovirus kann durch Konjugation mit Polylysin modifiziert werden. Nachdem Polylysin unter physiologischen Bedingungen kationisch ist, kann das resultierende Konjugat DNA, beispielsweise DNA, die für IRF-1 kodiert, durch elektrostatische Wechselwirkungen komplexieren. Die Adenovirus-Polylysin-Konjugate können eingesetzt werden, um DNA zusammen mit Transferrin-Polylysin-Konjugaten zu komplexieren, was zu ternären Adenovirus-Polylysin/Transferrin-Polylysin/DNA- Komplexen führt (Wagner et al., 10c. cit., 1992). Solche Komplexe können an Rezeptoren binden, die für Adenoviren und/oder Transferrin spezifisch sind, und werden anschließend internalisiert. Nach der Endocytose verursacht das Adenovirus das Aufbrechen der endosomalen Membran und dessen Inhalt wird in das Cytoplasma freigesetzt. Die für IRF-1 kodierende DNA kann in den Zellkern eintreten, wo IRF-1 hauptsächlich durch episomal lokalisierte DNA exprimiert wird. TABELLE 1: Wachstumseigenschaften von RmycY1- und Rat 1A(FosB)-Zellen, die IRF-1 überexprimieren
  • Zellen (5 · 10&sup5;) wurden mit 1,3%igem Methylcellulosegel, gelöst in Kulturmedium, gemischt und damit ein Agarosebett, bestehend aus 0,53% Agarose und Kulturmedium, überschichtet (Harada et al., Science 259, 971-974, 1993). Vier bis sechs Wochen alten nackten Mäusen (BALB/c nu/nu) wurden subkutan auf beiden Flanken 2 · 10&sup6; Zellen injiziert und Tumore wurden wie von Harada et al. beschrieben beurteilt.
    • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1: Phänotypisch revertierte, c-myc-transformierte 3Y1-Zellen nach retroviraler Einführung von IRF-1. Die Zellen wurden alle in Dulbeccos Modified Eagle Medium, enthaltend 10% fötales Kalbserum, photographiert (Vergrößerung 100x). 3Y1-c-myc; c-myc-transformierte 3Y1-Zellen (RmycY1), 3Y1; untransformierte 3Y1- Rattenzellen, myc-l RF1-1 und myc-IRF1-2; pGDIRF1-infizierte RmycY1-Zellklone, myc-C-1 und myc-C-2; mit Kontrollvirus pGD (Harada et al., Science 259, 971-974, 1993) infizierte RmycY1-Zellklone.
  • Fig. 2: Phänotypisch revertierte, fos8-transformierte Rat-1A-Zellen nach retroviraler Einführung von IRF 1. Die Zellen wurden alle in Dulbeccos Modified Eagle Medium, enthaltend 10% fötales Kalbserum, photographiert (Vergrößerung 100x). Rat-1A-FosB; fos8-transformierte Rat-1A-Zellen (Rat-1A(FosB)), Rat-1A; untransformierte Rat-1A-Zellen, Fos B-IRF-1 und Fos B-IRF1-2; pGDIRF1-infizierte Rat-1A(FosB)-Zellklone, Fos B-C-1 und Fos B-C-2; pGD-infizierte Rat-1A(FosB)- Zellklone.
    • BEISPIEL
  • Ein Retrovirus, pDGIRF1, welches nach einer Infektion Maus-IRF-1 exprimiert, wurde wie bereits beschrieben (Harada et aL, Science 259, 971-974, 1993) konstruiert. Für diesen Zweck wurde Maus-IRF-1-cDNA (Miyamoto et al., Cell 54, 903-913, 1988) in den pGD-Vektor (Daley et al., Science 247, 824, 1990) inseriert. Mit den DNA-Konstrukten wurden xv2-Zellen transformiert (Mann et al., Cell 33, 153, 1983), welche anschließend einen hohen Virustiter (~ 10&sup6; Kolonie-bildende Einheiten pro ml), wie nachgewiesen durch die Fähigkeit, NIH 3T3-Zellen neo-Resistenz zu verleihen, in das Kulturmedium freisetzten. Die Expression des IRF-1-Proteins wurde durch Gelretentions-Analyse bestätigt. Die c-myc-transformierte 3Y1-Zelle oder fos8-transformierte Rat-1A-Zelle, als RmycY1 bzw. Rat-1A(FosB) bezeichnet, zeigen beide verankerungsunabhängiges Wachstum und erhöhte Tumorgenizität bei Ratten oder nackten Mäusen (Shiroki et al., Mol. Cell. Biol. 6, 4379-4386, 1986; Nakabeppu et al, Mol. Cell. Biol. 13, 41574166, 1993). 5 · 10&sup5; der jeweiligen Zellen wurden mit dem pDGIRF-1-Virus bei der Multiplizität der Infektion (MOl) von 10 unter Anwendung genau des von Harada et al., angewandten Verfahrens infiziert und anschließend grenzverdünnt, um einzelne Klone zu erhalten. Morphologische Untersuchungen und Tumorgenizitätstests (nackte Mäuse als Modell) wurden nach Standardverfahren durchgeführt. Nach 1 oder 2 Wochen haben diese Zellklone den transformierten Phänotyp verloren.

Claims (22)

1. Verwendung einer Nukleinsäure, welche die kodierende Information für den Interferon-Regulationsfaktor 1 (IRF-1) enthält, oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, welche durch die Reversion des Phänotyps von Zellen, die das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren, behandelbar ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zellen durch eine fehlende oder unzulängliche Tumorsuppressorgen-Expression gekennzeichnet sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleinsäure in einen Vektor inkorporiert ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Vektor ein Expressionsvektor ist.
5. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Vektor ein viraler Vektor ist.
6. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleinsäure in ein Gentransfer-Vehikel inkorporiert ist.
7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Gentransfer-Vehikel ein Retrovirus ist.
8. Verwendung nach Anspruch 7, worin das Retrovirus pDGIRF-1 ist.
9. Verwendung nach Anspruch 6, worin die Nukleinsäure mit einem Konjugat komplexiert ist, wobei das Konjugat aus einem endosomolytischen Agens und einem DNA-bindenden Agens besteht.
10. Verwendung nach Anspruch 9, worin das endosomolytische Agens ein inaktiviertes Adenovirus ist.
11. Verwendung nach Anspruch 9, worin das DNA-bindende Agens Polylysin ist.
12. Verwendung einer Nukleinsäure, welche die kodierende Information für IRF-1 enthält, oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Krebstherapie, wobei die Krebszellen des Krebses das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren.
13. Verwendung nach Anspruch 12, worin die pharmazeutische Zusammensetzung für die Gentherapie von Krebs bestimmt ist, wobei die Krebszellen des Krebses das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin die Nukleinsäure in ein Gentransfer-Vehikel inkorporiert ist.
15. Verwendung nach Anspruch 14, worin das Gentransfer-Vehikel ein Virus ist.
16. Verwendung nach Anspruch 15, worin das Virus ein Retrovirus ist.
17. Verwendung nach Anspruch 16, worin das Retrovirus pDGIRF-1 ist.
18. Verwendung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Nukleinsäure mit einem Konjugat komplexiert ist, wobei das Konjugat aus einem endosomolytischen Agens und einem DNA-bindenden Agens besteht.
19. Verwendung nach Anspruch 18, worin das endosomolytische Agens ein inaktiviertes Adenovirus ist.
20. Verwendung nach Anspruch 18, worin das DNA-bindende Agens Polylysin ist.
21. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 20, worin die Krebszellen durch eine fehlende oder unzulängliche Tumorsuppressorgen-Expression gekennzeichnet sind.
22. Verwendung von IRF-1 oder einer biologisch aktiven Variante oder eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Krebstherapie, wobei die Krebszellen des Krebses das Onkogen c-myc oder fosB exprimieren.
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