DE69418307T2

DE69418307T2 - Verhütung und behandlung von zytomegalovirus mittels aminopeptidase

Info

Publication number: DE69418307T2
Application number: DE69418307T
Authority: DE
Inventors: Terrence Giugni; Erna Moeller; Cecilia Soederberg; John A. Zaia
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1999-11-04
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: GR3030462T3; JPH08506106A; CA2154346A1; WO1994016724A1; DE69418307D1; ATE179613T1; AU5999194A; DK0680333T3; EP0680333A1; EP0680333B1; AU681115B2; US6511662B1; ES2131188T3

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Aminopeptidasen (AP), vorzugsweise Human- Aminopeptidase N (APN), und Antikörpern gegen diese zur Diagnose, Verhütung und Behandlung von Human-Cytomegalovirus (CMV)-Infektionen.
Human-Cytomegalovirus ist für eine signifikante Morbidität und Sterblichkeit bei Gruppen mit geschwächter Immunabwehr, d. h., Neugeborene, Empfänger von Organtransplantaten, AIDS-Patienten, verantwortlich (1-3). Die Behandlung ist eingeschränkt, da die frühen Ereignisse der CMV-Infektion, welche Zellbindung und Penetration beinhalten, weitgehend unbekannt sind (4). Mindestens vier verschiedene Zelloberflächenproteine, (ein) 30-34-K-Protein(e) (5-7), ein 92,5-K-Protein (8), ein heparin-bindendes Protein (9) und ein Klasse I-Humanleukozyten-Antigen (10) wurden als für die Virusbindung von Bedeutung nahegelegt.
Es wurde kürzlich berichtet, daß CD13 (Human-Aminopeptidase N, APN) auf Blutzellen exprimiert wird, welche in vitro für eine HCMV-Infektion anfällig sind (11, 12, 13).
APN ist eine Metalloprotease, welche auf apikalen Oberflächen von Epithelzellen vorhanden ist (14-17). Es wurde berichtet, daß sie ein bindendes Protein für bestimmte Coronaviren darstellt (18, 19).
CD4 ist ein T-Zell-Rezeptor für das HIV-Virion-Oberflächenglykoprotein gp 120, welches auch zur Oberfläche von HIV-infizierten Zellen wandert. Es wurden lösliche Formen von CD4 für die Zirkulation im Blut entwickelt, um sowohl HIV als auch infizierte T-Zellen zu binden und somit zu verhindern, daß das Virus neue T-Zellen infiziert. Siehe z. B. Research News, 1559-1560 (1989).
Wir haben festgestellt, daß AP, einschließlich Aminopeptidase N und Fragmente davon, für die CMV-Infektion von Bedeutung sind. Sie ist überraschenderweise sowohl auf CMV-Virionen als auch auf der Zelloberfläche vorhanden und vermittelt (ein) kritische(s) Ereignis(se) der Infektion. Es ist somit möglich, die Infektion von Zellen durch CMV zu bekämpfen, indem die AP-Stelle entweder auf den Zellen oder den Virionen oder auf beiden blockiert wird, beispielsweise durch Verabreichung von AP oder eines Fragments davon, eines Antikörpers gegen AP oder ein wirksames Fragment davon oder eines AP-Inhibitors.
Das Verfahren zur Verhütung oder Behandlung von Human-Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion umfaßt die Verabreichung einer Menge einer Aminopeptidase, eines Fragments einer Aminopeptidase, eines Inhibitors einer Aminopeptidase und/oder eines Antikörpers gegen eine Aminopeptidase, welche therapeutisch wirksam ist, um eine solche Verhütung oder Behandlung zu ergeben, an einen Patienten, der dessen bedarf.
Die Aminopeptidase ist vorzugsweise Human-Aminopeptidase N, insbesondere in zellfreier Form.
Ein Aspekt der Erfindung umfaßt die Neutralisierung oder Vermittlung von CMV- Infektion durch die Verwendung eines AP-Antikörpers, um CMV aus Körperflüssigkeiten wie Blutprodukten und aus Knochenmark durch Bindung an die Virionen zu entfernen. Knochenmarkstransplantat (KMT)-Empfänger können Knochenmark oder Blutprodukte erhalten, welche durch Behandlung mit freiem oder immobilisiertem Antikörper gegen AP oder freie oder immobilisierte wasserlösliche AP (sAP), verknüpft mit einem festen Träger, gereinigt wurden, um sowohl CMV-Virionen zu entfernen als auch Zellen, welche für eine CMV-Infektion anfällig sind und so die CMV-Infektion beherbergen und übertragen könnten. Solche Zellen bilden eine relativ kleine Subpopulation und könnten schließlich durch Differenzierung gesunder Stammzellen ersetzt werden.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Entdeckung, daß sAP eine CMV-Infektion inhibiert oder neutralisiert. sAP übt so die Funktion eines antiviralen Agens aus. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden sAP oder verkürzte Formen davon, welche die Domäne enthalten, welche nach der Bindung von CMV an die Zelle die Infektion vermittelt, von außen einem Patienten verabreicht oder als Polypeptid von den Zellen eines CMV-Patienten exprimiert. In ähnlicher Weise könnten AP oder verkürzte Formen davon prophylaktisch vor der Infektion verabreicht werden. Beispielsweise könnte eine vorbeugende AP-Therapie für die Behandlung von Patientenpopulationen wie AIDS-Patienten, Empfänger von Knochenmarkstransplantaten oder Organtransplantaten mit einem Risiko für CMV-Erkrankung vorgesehen werden. Das Verfahren ist ähnlich dem bisher für Ganciclovir angewandten (20).
Die Erfindung betrifft auch die Verabreichung von Antikörpern gegen Aminopeptidasen und die Verabreichung von Enzym-Inhibitoren von Aminopeptidase sowie von Kombinationen einer Aminopeptidase und eines Antikörpers dagegen oder eines Enzym- Inhibitors davon.
Die Erfindung wird lediglich zur Erläuterung unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen beschrieben, worin:
Fig. 1. Inhibierung einer CMV-Towne-Stamm (RC256)-Infektion von HL734-Zellen durch U71, einen APN-spezifischen monoklonalen Antikörper. Die HL734-Zellen waren nicht infiziert (a) oder mit dem CMV-Stamm RC256, welcher das bakterielle β-Galactosidase-Gen kodiert, infiziert in Abwesenheit (b) oder Anwesenheit eines APN-spezifischen Antikörpers (c), von Kontroll-Maus-Aszites (d) oder eines polyklonalen Antikörpers gegen den epidermaler- Wachstumsfaktor-Rezeptor (e).
Verfahren. Humanembryo-Lungenfibroblasten (HL734), gezüchtet in 96-Mulden- Platten, wurden mit CMV RC256 in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Antikörper infiziert. Die Zellen wurden mit RC256 bei einer MOI = 1 2 h lang bei 4ºC inkubiert, gewaschen und 16 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden in 1%igem phosphatgepuffertem Glutaraldehyd 15 Minuten lang fixiert, gewaschen und einem Assay hinsichtlich der Expression von β-Galactosidase durch Inkubation mit Bluo-Gal (430 ug/ml) (Gibco/BRL) für 16 h bei 37ºC unterworfen. Ein APN-spezifischer Antikörper (U71), Kontroll-Maus-Aszites oder ein Kaninchenserum gegen humanen epidermaler-Wachstumsfaktor-Rezeptor wurden während der Inkubation von Zellen mit Virus zugegeben. Die infizierten Zellen wurden durch die Anwesenheit von ausgefallenem blauem Substrat in Zytoplasma von Zellen, mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, nachgewiesen.
Fig. 2. Vermögen zur Inhibierung einer Infektion durch Verbindungen, welche mit Human-Aminopeptidase N wechselwirken. Tafel a: HL734-Zellen wurden mit dem CMV- Stamm RC256 in Anwesenheit von Reihenverdünnungen von entweder U71 ( ) oder Kontroll- Maus-Aszites ( ) infiziert. Die Infektion wurde quantitativ bestimmt durch spektralphotometrische Messung der Spaltung von p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid durch β-Gal. Tafel b: HL734 wurden mit dem CMV-Stamm AD169 ( ) oder mit Semliki-Forest-Virus (SFV) ( ) in Anwesenheit zunehmender Konzentration an Bestatin infiziert. Die Infektion wurde quantitativ bestimmt durch Immunozytochemie unter Einsatz eines Antikörpers gegen das mIE-Protein von CMV oder eines Immunserums gegen SFV und Zählung der infizierten Zellen. Tafel c: Die Bindung von ³&sup5;S-HCMV an MRC-5-Zellen in Anwesenheit von Maus-IgG (O) oder Antikörper gegen APN ( ). Tafel d: Die Aminopeptidase N-Aktivität auf der Oberfläche von HL734- ( ), NIH-3T3- ( ), hAPN-3T3- ( ) oder hAPNMUT-3T3 (Δ) -Zellen, ausgedrückt als optische Dichte des Reaktionsprodukts p-Nitroanilid.
Verfahren. Die Infektion von HL734 mit CMV RC256 wurde wie in Fig. 1 beschrieben in Gegenwart von Reihenverdünnungen von entweder U71 oder Kontroll-Maus- Aszites durchgeführt. Die Zellen wurden gewaschen, mit Glutaraldehyd fixiert und einem Assay hinsichtlich β-Gal-Expression unterworfen durch Inkubation mit p-Nitrophenyl-β-D- galactopyranosid (1 mg/ml), und die Bildung von p-Nitrophenol wurde spektralphotometrisch bei 410 nm gemessen. Zur Messung der Wirkung von Aminopeptidase-Inhibitoren auf die virale Infektion wurden HL734 mit zunehmenden Konzentrationen an Bestatin 1 h lang bei 37ºC vorinkubiert, mit dem CMV-Stamm AD169 bei einer MOI = 1 oder mit SFV bei einer MOI = 30 1 h lang bei 37ºC infiziert, gewaschen und 6 h lang bei 37ºC in frischen Medien inkubiert. Nach der Fixierung in eiskaltem Aceton/Methanol (1/1) wurden CMV-Kernantigene mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen das 72K-CMV-mIE-Protein (NEW/Dupont, Inc.), gefolgt von einem phycoerythrin-markierten F(ab')&sub2;-Fragment von Anti-Maus-Kaninchen- IgG (Dakopatts, Inc.), nachgewiesen. Mit SFV infizierte Zellen wurden durch Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Immunserums gegen SFV, gefolgt von einem rhodaminkonjugierten Anti-Kaninchen-Ziegen-IgG (Biosystems, Inc.), nachgewiesen. Die Bindung von HCMV an MRC-5-Zellen erfolgte durch Inkubation einer zunehmenden Konzentration an ³&sup5;S-HCMV mit MRC-5-Zellen für 2 h bei 4ºC. Die Inkubation wurde in Anwesenheit von Maus-IgG (Sigma, Inc.) oder L138 (Becton Dickinson, Inc.) in einer Konzentration von 16 ug/ml durchgeführt. Die Zellen wurden fünfmal mit hepes-gepufferter Salzlösung gewaschen, mit 0,5 M NaOH solubilisiert und zellassoziierte ³&sup5;S-markierte Virionen wurden quantitativ durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Aminopeptidase-Aktivität auf intakten Zellen wurde gemessen durch Ausplattieren von 1-5 · 10&sup4;-Zellen in 96-Mulden-Platten, Inkubation über Nacht in frischen Medien und anschließende Inkubation mit Alanin-p-nitroanilid (6 mM) bei 37ºC. Zu verschiedenen Zeiten wurde das freigesetzte freie p-Nitroanilid spektralphotometrisch bei 410 nm gemessen. Die Aminopeptidase-Aktivität wurde auf die Zellzahl normalisiert, welche mit dem BCA-Protein-Assay gemessen wurde (Pierce). Alle Messungen wurden als Dreifachbestimmungen durchgeführt.
Fig. 3. Inhibierung der CMV-Infektion von HL734-Zellen mit Antikörpern gegen Human-CD13 (HAPN).
Monoschicht-Kulturen von HL734-Zellen wurden mit HCMV AD169 in Anwesenheit von einem von elf verschiedenen APN-spezifischen Antikörpern 2 h lang bei 4ºC infiziert und die Zellen wurden gewaschen und in vollständigem Medium über Nacht bei 37ºC inkubiert. Der Nachweis infizierter Zellen erfolgte mittels Assay hinsichtlich der Expression von HCMV- mIE wie bezüglich Fig. 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind als ausgefüllte Balken dargestellt. Das Experiment wurde wiederholt unter 1-stündiger Vorinkubation der Zellen mit den Antikörpern in den im folgenden angegebenen Konzentrationen bei 4ºC und Entfernung von überschüssigem Antikörper durch Waschen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 als unausgefüllte Balken dargestellt.
Die folgenden APN-spezifischen monoklonalen Antikörper wurden in den angegebenen Konzentrationen eingesetzt:
(1) WM15; 105 ug IgG/ml (erhalten von E. Favoloro, Westmead Hosp. N. S. W., Australien)
(2) MY7; 100 ug IgG/ml (erhalten von J. D. Griffin, Dana Faber Cancer Inst., Boston, USA)
(3) 43E6; 220 ug IgG/ml
(4) 46A11; 320 ug IgG/ml (beide erhalten von H. J. Buhring, Medizinische Klinik II, Tübingen, Deutschland)
(5) 72a; 770 ug IgG/ml (erhalten von R. F. Todd, University of Michigan Med. Centre Ann. Arbor, Mich.)
(6) MCS-2; 1 mg IgG/ml (erhalten von K. Sagawa, Kurume University, Japan)
(7) 22A5; 13,2 mg Protein/ml (erhalten von M. A. Horton, St. Bartholomews Hosp., London, UK)
(8) 3D8; 3 mg Protein/ml (erhalten von A. E. Koch, Northwestern Univ. Med. School, Chicago)
(9) RMAG-6; 1,9 mg IgG/ml (erhalten von P. J. O'Connell, Royal Melbourne Hosp. Victoria, Australien)
(10) L138; 22 ug IgG/ml (= Anti-LeuM7, erhalten von Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien)
(11) WM47; 90 ug IgG/ml (erhalten von Dakopatts, Glostrup, Dänemark)
Es wird ersichtlich sein, daß eine Vorinkubation der Zellen mit dem APN-spezifischen Antikörper, gefolgt von Waschen, in einer sehr geringen Auswirkung auf die Inhibierung von HCMV-Infektion resultierte; MY7 und 46A11 besaßen eine inhibierende Wirkung von 15% bzw. 20% im Vergleich zu einer 60-90%igen Verminderung, wenn irgendwelche der APN- spezifischen Antikörper in dem Virus-Impfgut während der Infektion eingeschlossen waren.
Fig. 4. Anfälligkeit für in vitro-CMV-Infektion von Human-Fibroblasten und Mauszellen, die Human-APN exprimieren. Ursprüngliche NIH-3T3-Mauszellen (Felder a und b), transfizierte NIH-3T3-Zellen, die hohe Niveaus an nativer Human-APN (hAPN-3T3) (Felder c und d) oder Mutanten-Human-APN (hAPNMUT-3T3; 15, 21), der 39 Aminosäuren an den Positionen 360-399 fehlen, einschließlich der zink-bindenden Stelle an den Positionen 388- 392, welche für die Enzymaktivität notwendig ist, (Felder e und f) exprimieren, und Human- HL734 (Felder g und h) waren nicht infiziert (Felder a, c, e und g) oder mit CMV RC256 infiziert (Felder b, d, f und h). Die Infektion wurde durchgeführt und nachgewiesen wie in der Legende zu Fig. 1 beschrieben.
Fig. 5. Neutralisierung von HCMV AD169. HCMV AD169 wurde mit Antikörpern mit Spezifität für HAPN, L138 ( ), für ein Human-Fibroblastenoberflächenantigen IB10 ( ), für Maus-IgG ( ) oder für HCMV-gB (7-5) ( , als positive Kontrolle), immobilisiert auf Protein A- Sepharose CL-4B, oder mit Protein A-Sepharose allein als Kontrolle (40 ul einer 50%igen Aufschlämmung, zugegeben auf ein Endvolumen von 300 ul, Pharmacia/LKB, Uppsala, Schweden) in Bindungspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA) vorinkubiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 4ºC unter kontinuierlicher mechanischer Bewegung wurden die Protein A-Sepharose/Antikörper-Komplexe durch zweiminütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge pelletiert. Der Überstand wurde eingesetzt, um Monoschichten von HL734-Zellen durch zweistündige Inkubation bei 4ºC anzuimpfen, gewaschen und bei 37ºC über Nacht mit vollständigem Medium inkubiert. Die Menge an Virus, welche nach Präzipitation mit Antikörper in dem Überstand verblieb, wurde nachgewiesen durch Bestimmung der Anzahl von Zellen, welche das mIE-Protein exprimierten, und Normalisierung ihres Werts auf die Werte, welche für die Protein A-Sepharose-Kontrolle erhalten wurden.
Der HAPN-spezifische Antikörper (L138) eliminierte HCMV in dosisabhängiger Weise, wohingegen gleiche Mengen von Maus-IgG oder des für das HFF-Oberflächenantigen (1B10) spezifischen Antikörpers keine Auswirkung auf die Infektionsfähigkeit des HCMV hatten, wie in Tafel A gezeigt. Wie in Tafel B gezeigt, eliminierte der Anti-HAPN-Antikörper HCMV aus der Lösung mit einem ED50-Wert von 7,1 ug/ml im Vergleich zu 760 ug/ml für den HCMV-gB-spezifischen Antikörper.
Fig. 6. Inhibierung der HCMV-Infektion durch Vorinkubation von Virus oder Zellen mit Aminopeptidase-Inhibitoren.
Vorinkubation mit Zellen: HL734-Zellen wurden mit Bestatin (3,5 mM) oder 2,2'- Dipyridyl (5,4 mM) eine Stunde lang bei 4ºC inkubiert, gewaschen, 2 h lang bei 4ºC mit HCMV AD169 inkubiert, gewaschen, 16 bis 18 h lang bei 37ºC in vollständigen Medien inkubiert und einem Assay hinsichtlich HCMV-Infektion unterworfen wie in der Legende zu Fig. 1 beschrieben. Die Assay-Ergebnisse sind dargestellt als V = unbehandelte Zellen, infiziert mit unbehandeltem Virus, B = Vorinkubation mit Bestatin, D = Vorinkubation mit 2,2'-Dipyridyl.
Vorinkubation mit Virus: Ein Impfgut von HCMV wurde mit Bestatin oder 2,2'-Dipyridyl 1 h lang bei 4ºC inkubiert und durch Fraktionierung auf einer PD-10-Säule von dem freien Wirkstoff abgetrennt, und das Eluat wurde zur Animpfung von HL734-Zellen wie in der Legende zu Fig. 1 verwendet. Die Infektion von HL734-Zellen und der Assay hinsichtlich HCMV-Infektion waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind dargestellt als V/C = Virus, vorinkubiert ohne Wirkstoff und fraktioniert über eine PD-10-Säule (Bio Rad, Richmond, Kalifornien), B/C = Virus, vorinkubiert mit Bestatin, DIC = Virus, vorinkubiert mit 2,2'-Dipyridyl.
Coinkubation: HL734-Zellen wurden auch infiziert mit HCMV in Gegenwart von Bestatin oder 2,2'-Dipyridyl (coinkubiert), wie in der Legende zu Fig. 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind dargestellt als V = unbehandelte Zellen, infiziert mit unbehandeltem Virus, B = Inkubation in Gegenwart von Bestatin, D = Inkubation in Gegenwart von 2,2-Dipyridyl.
Bestatin und 2,2'-Dipyridyl inhibierten bei Inkubation mit Zellen vor der Infektion in einer Konzentration, welche eine 75-80%ige Inhibierung bei Inkubation mit den Zellen während der Animpfung mit dem Virus ergab, (Fig. 6, Coinkubation, Säule B und D) die Infektion um 50% (Fig. 6, Vorinkubation mit Zellen, Säule B und D). Die Inkubation des Virus-Impfguts mit den Inhibitoren führte ebenfalls zu einer 50%igen Verminderung der Infektivität des Virus (Fig. 6, Vorinkubation mit Virus, Säulen B/C und D/C). Die Fraktionierung von HCMV über eine PD-10-Säule hatte keine Auswirkung auf dessen Infektionsfähigkeit (Fig. 6, Vorinkubation mit Virus, man vergleiche Säule V mit Säule V/C). Es ist somit ersichtlich, daß AP-Inhibitoren die HCMV-Infektion durch Wechselwirkung mit sowohl dem Virus als auch den Wirtszellen blockieren und daß die Wirkung der Inhibitoren additiv ist, wenn sie sowohl mit dem Virus als auch mit der Wirtszelle inkubiert werden.
Diese Erfindung betrifft somit eine Reihe von Aspekten der Beteiligung von Aminopeptidasen bei der Human-CMV-Infektion. Antikörper gegen AP blockieren die Bindung von CMV-Virionen an anfällige Zellen, indem sie an CMV-Virionen binden und diese damit neutralisieren. CMV-resistente Maus-Fibroblasten werden anfällig für eine CMV-Infektion nach Transfektion mit komplementärer DNA, welche für Human-APN kodiert. Maus-Fibroblasten, welche mit Mutanten-APN, der die enzymatische Domäne fehlt, transfiziert wurden, sind jedoch ebenfalls anfällig für eine CMV-Infektion. Somit scheint Zelloberflächen-APN die CMV- Infektion zu vermitteln, die enzymatische Domäne der an der Zelloberfläche exprimierten APN ist jedoch für die Infektion nicht erforderlich. Überraschenderweise blockieren jedoch Verbindungen, welche die Aminopeptidase-Aktivität inhibieren, die CMV-Infektion vollständig.
Zur Untersuchung der Rolle, welche APN bei der frühen Wechselwirkung von CMV mit Human-Fibroblasten spielt, wurden die Zellstämme HL734 und MRC-5 Virus in Gegenwart der APN-spezifischen monoklonalen Antikörper U71 und U81 (erhalten von D. Bourel, Centre Regional de Transfusion, Sanguine, Rennes, Frankreich), WM47 oder L138 ausgesetzt.
Wie in Fig. 1 gezeigt, schützte U71 HL734 vor Infektion mit CMV RC256, einer rekombinanten Form des CMV-Towne-Stamms, welche für das β-Galactosidase (β-Gal)-Gen in Verknüpfung mit einem frühen CMV-Promotor kodiert (22). Kein Schutz wurde beobachtet in Zellen, welche mit Kontroll-Maus-Aszites, Maus-IgG oder mit Antikörpern gegen den epidermaler-Wachstumsfaktor-Rezeptor (Anti-EGFR), der bekanntermaßen auf der Oberfläche dieser Fibroblasten vorhanden ist, behandelt wurden. Die Dosis-Antwort-Kurve der CMV-Inhibierung durch U71 zeigte an, daß die Inhibierung direkt proportional zur Menge des eingesetzten Anti-APN-Antikörpers war (siehe Fig. 2a). TABELLE 1 - Wirkung von monoklonalen Anti-APN-Antikörpern und Aminopeptidase- Inhibitoren auf die CMV-Infektion
a Die Inhibierung von CMV-Infektion wurde bestimmt, wie in der Beschreibung von Fig. 2 beschrieben.
b Die Inhibierung von Semliki-Forest-Virus (SFV)-Infektion wurde bestimmt, wie in der Beschreibung von Fig. 2 beschrieben.
c Die Inhibierung von enzymatischer Aktivität wurde unter Verwendung des Substrats Alanin-p-nitroanilid gemessen, wie in der Beschreibung von Fig. 2 beschrieben.
d Chemische Inhibitoren wurden in den Konzentrationen getestet, welche eine maximale Inhibierung ohne Toxizität für die Zellen ergaben: Actinonin, 5,45 mM; Bestatin, 4,35 mM; 1,10-Phenanthrolin, 0,45 mM; 2,2'-Dipyridyl, 3,74 mM. Die 50%-Inhibierungsdosis, in millimolarer Konzentration angegeben, ist in Klammern aufgeführt. Antikörper wurden bei einer Konzentration getestet, die eine maximale Wirkung ergab: U71, 1,8 mg Protein/ml; U81, 2 mg Protein/ml; WM47, 20 ug IgG/ml; L138 3,7 ug IgG/ml. + = > 50 Inhibierung im Vergleich zur Maus-IgG-Kontrolle; - = keine Inhibierung.
e ND = nicht durchgeführt.
Zur Untersuchung, ob die enzymatische Aktivität von APN für die CMV-Infektion erforderlich ist, wurden vier verschiedene Aminopeptidase-Inhibitoren, Actinonin, Bestatin, 2,2'-Dipyridyl und 1,10-Phenanthrolin, hinsichtlich ihrer Wirkung auf die enzymatische Aktivität und CMV- Infektion beurteilt. Bestatin und Actinonin sind kompetitive Inhibitoren von Aminopeptidasen, und 1,10-Phenanthrolin und 2,2'-Dipyridyl inhibieren die Aminopeptidase-Aktivität durch Bildung eines Chelats mit Zink, welches für die Enzymfunktion erforderlich ist. Diese Verbindungen wurden in Konzentrationen eingesetzt, von denen gezeigt worden war, daß sie APN in Zellen inhibieren, wobei Alanin-p-nitroanilid als Substrat eingesetzt wurde (siehe Tabelle 1). Die Toxizität dieser Substanzen, gemessen durch Trypanblau-Aufnahme in Zellen, welche mit den Inhibitoren behandelt worden waren, betrug weniger als 10% in den höchsten eingesetzten Konzentrationen (Daten nicht gezeigt). Wie in Fig. 2b gezeigt, inhibierte Bestatin die CMV-Infektion in einer 50%-Inhibierungskonzentration von 2,5 mM. Wie in Tabelle 1 gezeigt, inhibierten Actinonin, 1,10-Phenanthrolin und 2,2'-Dipyridyl eine CMV- Infektion mit 50%-Inhibierungsdosen von 3,3, 0,25 bzw. 2,8 mM, was weiter nahelegt, daß APN an der CMV-Infektion beteiligt ist.
Die Wirkung von APN-spezifischen Antikörpern auf die Bindung von 35S-markierten CMV-Virionen auf MRC-5-Zellen wurde analysiert. Die Inkubation von Zellen mit zunehmender Konzentration an Virionen führte zu erhöhter Bindung von CMV an die Zellen (siehe Fig. 2c).
Falls die Bindung in Anwesenheit von Kontroll-Maus-IgG erfolgte, gab es keine Auswirkung auf die Bindung (Fig. 2c). Jedoch resultierte die Bindung in Gegenwart eines APN- spezifischen Antikörpers (L138) in einer Verringerung der CMV-Bindung (siehe Fig. 2c). Zur Bestätigung der überlegenen Wirkung einer Blockade von APN auf den Virionen statt auf den Zellen wurden 11 Anti-APN-Antikörper (a) mit Fibroblastenzellen und CMV coinkubiert und (b) mit Zellen vorinkubiert, welche anschließend mit CMV inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. In einem weiteren Experiment wurde gezeigt, daß, obwohl die Blockierung der Virion-APN effektiver ist als die Blockierung der Zell-APN, eine Coinkubation, bei welcher der Antikörper sowohl die Zell-APN als auch die Virion-APN kontaktiert, am effektivsten ist. Dies kommt natürlich der Situation bei einer antiviralen Therapie am nächsten.
Zur weiteren Untersuchung der Bedeutung von APN und deren enzymatischer Aktivität während der CMV-Infektion wurden Mauszellen (NIH-3T3) mit DNA für hAPN (hAPN- 3T3) oder für eine verkürzte Form des Proteins, der 39 Aminosäuren aus einem Bereich fehlen, welcher die aktive Stelle enthält, (hAPMUT-3T3) transfiziert. Die Anwesenheit von Oberflächen-hAPN wurde auf den humanen Zellen und auf den transfizierten NIH-3T3-Zellen mittels Durchflußzytometrie-Analysen unter Verwendung von APN-spezifischen monoklonalen Antikörpern bestätigt (Daten nicht gezeigt). Zur Bestätigung des APN-Aktivitätsniveaus in diesen Zellen wurden sie hinsichtlich des Vermögens zur Spaltung des Aminopeptidase- Substrats Alanin-p-nitroanilid untersucht. Enzymatische Aktivität war in den hAPN-3T3- und HL734-Zellen vorhanden, jedoch nicht in den ursprünglichen NIH-3T3-Zellen oder in hAPMUT-3T3-Zellen (siehe Fig. 2d). Alle Zellen wurden dann mit CMV RC256 herausgefordert, β-Gal, der Marker für Virusinfektion, wurde in einer größeren Anzahl derjenigen Zellen beobachtet, welche hAPN exprimierten (siehe Fig. 3). Ursprüngliche Zellen zeigten im Vergleich zu den APN-exprimierenden Zellen wenig oder keine Expression von CMV- kodierten Genen (vergleiche Fig. 3b und 3d/3f). Gleichermaßen lag bei einer Bewertung der Expression des 72K-"major immediate early" (mIE)-Proteins von CMV eine stark erhöhte Expression in den transfizierten Zellen vor (siehe Tabelle 2). Somit erlaubt die Expression von hAPN auf Mauszellen die Infektion der Zellen durch HCMV. Von Bedeutung ist, daß die Virusinfektion bei einer größeren Zahl von Zellen, welche die verkürzte Form von APN exprimierten, beobachtet wurde als bei denjenigen mit unmodifizierter hAPN (siehe Tabelle 2). Die Infektion dieser Zellen, welche die verkürzte Form von hAPN exprimierten, mit CMV resultierte in einer 50fachen Zunahme an CMV-infizierten Zellen im Vergleich zu den hAPN nicht exprimierenden NIH-3T3-Zellen, was eine 5fache Zunahme gegenüber Zellen darstellt, welche mit nativer hAPN transfiziert wurden. Tabelle 2 - HCMV-Gen-Expression in Mauszell-Transfektanten
a Der Prozentsatz aller Zellen, welche das 72-kD-mIE-Antigen von HCMV exprimierten, wurde 1, 3 oder 7 Tage nach Infektion mit AD169 bestimmt. Monoschichten von HL734-Zellen wurden bei einer MOI = 12 h lang bei 4ºC angeimpft, gewaschen und in frischen Medien inkubiert. An den Tagen 1, 3 und 7 nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und hinsichtlich der Expression von HCMV-mIE-Antigen einem Assay unterworfen. Die Expression von mIE- Kernantigen wurde nach Fixierung in Methanol/Aceton durch Inkubation mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen das 72-kD-HCMV-mIE-Protein (NEN-DuPont, Boston, MA oder Biosoft, Paris, Frankreich), gefolgt von einem FITC-markierten (F(ab')&sub2;-Fragment von Anti-Maus-Kaninchen-IgG (Dakopatts), nachgewiesen. Infizierte Zellen wurden mit Hilfe eines Nikon-Mikroskops nachgewiesen, das mit einer epi-Beleuchtungsoptik ausgerüstet war. Die Anzahl der HCMV-Antigen-positiven Zellen wurde gezählt und als Prozentsatz der gesamten Zellen dargestellt.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß die enzymatische Aktivität dieses Moleküls für die Infektion nicht essentiell ist und daß die verkürzte Form von APN, welche in den hAPNMUT- 3T3-Zellen exprimiert wird, die Anfälligkeit einer Zelle für CMV-Infektion in einem größeren Ausmaß erhöht als die native Form (vgl. Fig. 3d und 3f und siehe Tabelle 2).
Die Mutantenform von hAPN, hAPNMUT-3T3, wurde wie folgt erhalten. Die Human- hAPN-cDNA vollständiger Länge, subkloniert in dem Plasmid pBluescript, wurde mit der Restriktionsendonuklease BstEll verdaut, welche ein internes 117-Basenpaar (bp)- Restriktionsfragment aus der cDNA ausschnitt, sonst jedoch nirgends in der cDNA oder im Vektor schnitt. Das deletierte Fragment von 39 Aminosäuren (Positionen 360-399) umfaßte die kodierende Sequenz für das zink-bindende Motiv (HExxH) an Aminosäurepositionen (388- 392), welche bekanntermaßen für die enzymatische Aktivität erforderlich sind (17). DNA, der die deletierten Sequenzen fehlten, wurde korrekt religiert und mittels Calciumphosphat-Fällung in NIH-3T3-Zellen transfiziert (21). Die Anwesenheit von hAPN auf der Zelloberfläche wurde bestätigt durch Immunofärbung mittels monoklonaler Antikörper und Durchflußzytometrie- Analyse.
Die Erfindung umfaßt somit insbesondere die Verwendung einer Aminopeptidase, der die für die Aminopeptidase-Aktivität verantwortliche Stelle fehlt, während sie die HCMV- bindende Aktivität behält, im Verfahren der Erfindung. So kann Human-Aminopeptidase N, der mindestens die Aminosäuren an den Positionen 388 bis 392 fehlen, eingesetzt werden, insbesondere Human-Aminopeptidase N, der die Aminosäuren an den Positionen 360 bis 399 fehlen.
Diese Experimente haben gezeigt, daß die CMV-Infektion von Fibroblasten sowie die Bindung von Virionen an diese Zellen durch verschiedene monoklonale Antikörper gegen APN sowie durch Inhibitoren der APN-Aktivität inhibiert werden kann. Jedoch inhibieren bestimmte dieser APN-spezifischen monoklonalen Antikörper die hAPN-Aktivität nicht. Ferner trat bei Mauszellen, welche hAPN exprimierten, und bei Zellen, bei denen die enzymatische Stelle deletiert worden war, im Vergleich zu den ursprünglichen Mauszellen eine erhöhte CMV- Infektion auf. Es scheint, daß die enzymatisch aktive Stelle von zell-exprimierter APN weder für die Anti-APN-Inhibierung der CMV-Infektion noch für die Infektion von APN-exprimierenden Mauszellen essentiell ist. Die APN-inhibierenden Verbindungen, welche die Infektion blockierten, könnten durch Änderung der Konformation des APN-Moleküls wirken und so einen Bereich ändern, welcher für die Infektion von Bedeutung ist, oder durch Wechselwirkung mit der virus-assoziierten APN (siehe Fig. 6). Diese Daten legen nahe, daß eine Nicht- Enzym-Domäne von zell-exprimierter APN für die CMV-Infektion von Fibroblasten von Bedeutung ist.
Das Vermögen von Anti-APN-Antikörpern, an APN auf den Virionen zu binden, erlaubt den Einsatz von immobilisierten Antikörpern zur Entfernung von CMV-Virionen aus Medien wie z. B. Blutprodukten oder Knochenmark. Eine Demonstration davon ist in Fig. 5 zu sehen.
Lösliche AP ist zur Verwendung in der Praxis dieser Erfindung bevorzugt und kann auf bekannte Weise hergestellt werden. Beispielsweise wird lösliche Aminopeptidase N erhalten durch Reinigung aus Mauszellen, welche Human-APN exprimieren. Dies kann mit einer Modifikation der Methodik von Danielsen und Cowell (Danielsen, E. M. und Cowell, G. M. J. Biochem. Biophys. Methods 8: 41-47 (1983)) durchgeführt werden.
Peptide, welche verschiedenen Domänen von Human-APN entsprechen, werden erhalten durch (1) proteolytische Verdauungen von löslicher hAPN, gefolgt von HPLC- Reinigung der Peptide, (2) Expression von verschiedenen Bereichen von hAPN in E. coli durch rekombinante DNA-Methoden (diese in E. coli exprimierten Peptide können durch HPLC gereinigt werden) und (3) Synthese synthetischer Peptide.
Tabelle 3 demonstriert, daß lösliche Leucin-Aminopeptidasen vom Schwein die CMV- Infektion in vitro blockieren. Tabelle 3 - Vermögen löslicher Aminopeptidasen zur Blockierung von CMV-Infektiona
a MRC-5-Zellen, ausplattiert in 96-Mulden-Platten, wurden mit RC256 in Anwesenheit oder Abwesenheit löslicher Schweine-Aminopeptidasen (SAP) infiziert. Die Zellen wurden mit Virus plus SAP 2 h lang bei 4ºC inkubiert, gewaschen und 18 h mit frischen Medien bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden mit 1%igem Glutaraldehyd fixiert und einem Assay hinsichtlich Expression von β-Galactosidase durch Inkubation mit Blue-Gal (430 ug/ml) für 16 h bei 37ºC unterworfen. Infizierte Zellen wurden durch Anwesenheit von ausgefallenem blauem Substrat, mittels Lichtmikroskopie beobachtet, nachgewiesen. Die Anzahl der Zellen, welche unter jeder Bedingung infiziert waren, wurde normalisiert auf Zellen, welche in Abwesenheit jeglicher Aminopeptidase infiziert wurden.
b Zytosolische SAP = zytosolische Leucin-Aminopeptidase vom Schwein, erhalten von Sigma Chemical Co., Inc. (Katalog Nr. L-9875)
c Mikrosomale SAP = mikrosomale Leucin-Aminopeptidase vom Schwein, erhalten von Sigma Chemical Co., Inc. (Katalog Nr. L-5006).
d ND = nicht durchgeführt.
Wie Tabelle 3 zeigt, ist sAPN ein antivirales Agens, das sich zur Verhütung oder Behandlung von CMV-assoziierten Krankheiten eignet.
Es wurde auch festgestellt, daß eine Vorinkubation von Zellen mit Antikörpern gegen hAPN, gefolgt von ausgiebigem Waschen, die CMV-Infektion nicht blockiert, wohingegen eine Vorinkubation des Virus mit Antikörpern gegen hAPN, jedoch nicht mit Antikörpern gegen andere Zelloberflächenmarker, die Infektion blockiert. Ferner können hAPN-negative humane Zellen mit CMV transfiziert werden und die Infektion durch Wechselwirkung der Virionen mit Antikörper gegen hAPN blockiert werden. Dies legt nahe, daß hAPN kein einfacher Rezeptor für CMV ist, wie von Söderberg et al. (11-13) nahegelegt, und die hAPN auf der Oberfläche des Virions mindestens teilweise für die CMV-Infektion von Bedeutung ist. Wie durch die Expression von hAPN in Mauszellen und die Wirkung von sAP auf die CMV-Infektion in Fibroblasten angezeigt, spielen jedoch zellassoziierte Aminopeptidasen eine wichtige Rolle bei der CMV-Infektion. In der Tat kann bei den sogenannten "Capping/Stripping"-Experimenten APN von der Oberfläche der hAPN-positiven Zellen entfernt werden und die Zellen werden dann bei Kontakt mit CMV nicht infiziert.
Die Erfindung umfaßt auch die Diagnose von CMV-Infektionen mittels Immunoassay zur Bestimmung der Anwesenheit von entweder Anti-CMV-Antikörpern oder CMV-Virionen in einer Probe einer Körperflüssigkeit wie Blut oder Plasma. Es ist überraschend, daß Anti-CMV- Antikörper gegen APN auf CMV-Virionen gebildet werden, da man hätte erwarten können, daß die APN in Anbetracht ihrer Expression auf Humanzellen nicht als fremd erkannt würde. Nichtsdestoweniger existieren solche Antikörper in Patienten, die mit CMV infiziert sind, und können einen Hinweis auf CMV-Infektion geben, obwohl der Nachweis solcher Antikörper normalerweise nur einen unterstützenden Hinweis auf eine CMV-Infektion liefern wird, da andere Formen von APN, zum Beispiel durch eine Autoimmunantwort, die Antikörper ausgelöst haben könnten.
Die Erfindung umfaßt so die folgenden Verfahren zur Verwendung bei der Diagnose von CMV-Infektion oder daraus resultierenden Wirkungen:
1) Nachweis oder Bestimmung der Anwesenheit, Menge oder Qualität von Anti-APN- Antikörpern durch einen Immunoassay unter Verwendung einer Aminopeptidase oder eines Fragments davon als Bindungspartner für die Antikörper;
2) Nachweis oder Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von CMV-Virionen durch einen Immunoassay unter Verwendung löslicher Aminopeptidase oder eines Antikörpers gegen eine Aminopeptidase als Bindungspartner für die Virionen;
3) Isolierung von Zellen, welche APN exprimieren, unter Verwendung eines Antikörpers gegen APN als Bindungspartner für die APN, gefolgt von Nachweis oder Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von CMV-Virionen in den isolierten Zellen.
Die Anwesenheit oder Menge von CMV-Virionen kann bestimmt werden durch Lyse der Zellen und Amplifizierung der darin enthaltenen Nukleinsäuren mittels PCR oder anderer Techniken unter Verwendung von Primern, welche für Virion-Nukleinsäuren spezifisch sind.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen diagnostischen Kit bereit zur Verwendung bei der Diagnose von CMV-Infektion mittels Immunoassay zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Anti-APN-Antikörpern oder von CMV-Virionen in einer Probe, umfassend freie oder immobilisierte Aminopeptidase oder ein Fragment davon als Bindungspartner für Anti-APN-Antikörper und/oder einen freien oder immobilisierten Antikörper gegen Aminopeptidase oder lösliche oder immobilisierte APN als Bindungspartner für Aminopeptidase auf den Virionen, wobei der Kit Markierungsmittel umfaßt, welche die Bestimmung der Anwesenheit oder Menge der Anti-APN-Antikörper oder CMV-Virionen in der zu untersuchenden Probe erlauben.
Es kann jede Form von Immunoassay eingesetzt werden, insbesondere kompetitive Bindungsassays und Sandwich-Assays. In jedem Fall wird es erforderlich sein, eine der Komponenten des Assays zu markieren, um den Nachweis eines positiven Ergebnisses zu ermöglichen. In einem kompetitiven Bindungsassay wird ein Bindungspartner für den zu untersuchenden Analyten immobilisiert sein und eine bekannte Menge einer markierten Form jenes Analyten wird mit dem in der Probe um Stellen auf dem Bindungspartner konkurrieren, so daß die Menge an Markierung, entweder immobilisiert oder frei belassen, einen Hinweis auf die Menge des Analyten in der Probe gibt. In einem Sandwich-Assay wird ein Bindungspartner für den Analyten immobilisiert sein und eine markierte Form des Bindungspartners oder ein anderer Bindungspartner für den Analyten wird zugegeben werden, um an den Analyten zu binden und diesen zu markieren. Somit werden in beiden Fällen markierte Formen von entweder AP oder Anti-AP erforderlich sein. Wenn Anti-AP markiert werden soll, ist es jedoch auch möglich, eine sekundäre Markierung mit einem markierten sekundären Antikörper einzusetzen, welcher spezifisch für den Anti-AP ist. Geeignete Markierungen schließen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Moleküle oder kolloidale Metalle ein. Die Immobilisierung kann durch Verknüpfung mit üblichen Platten, Mikrotiter-Mulden, Stäben zum Eintauchen oder Teilchen geschehen.

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Claims

1. Verwendung einer Aminopeptidase, eines Fragments einer Aminopeptidase, eines Inhibitors einer Aminopeptidase und/oder eines Antikörpers gegen eine Aminopeptidase zur Herstellung eines Medikaments zur Anwendung bei der Verhütung oder Behandlung einer Human-Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Aminopeptidase Human-Aminopeptidase N (hAPN) ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Aminopeptidase zellfreie Aminopeptidase in wasserlöslicher oder immobilisierter Form ist.

4. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin dem Fragment einer Aminopeptidase diejenige Stelle fehlt, welche für die Aminopeptidase-Aktivität verantwortlich ist, während die HCMV-bindende Aktivität erhalten geblieben ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Aminopeptidase Human-Aminopeptidase N ist, der mindestens die Aminosäuren an den Positionen 388-392 fehlen.

6. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Aminopeptidase Human-Aminopeptidase N ist, der mindestens die Aminosäuren an den Positionen 360-399 fehlen.

7. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Verhütung oder Behandlung von Human-Cytomegalovirus (HMCV) umfaßt, daß einem Patienten, der dessen bedarf, nacheinander oder gleichzeitig

(i) eine Aminopeptidase oder ein Fragment einer Aminopeptidase und

(ii) ein Enzym-Inhibitor von Aminopeptidase

verabreicht wird.

8. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Verhütung oder Behandlung von Human-Cytomegalovirus (HMCV) umfaßt, daß einem Patienten, der dessen bedarf, nacheinander oder gleichzeitig

(i) ein Antikörper gegen eine Aminopeptidase und

(ii) ein Enzym-Inhibitor einer Aminopeptidase

verabreicht wird, wobei der Antikörper und der Enzym-Inhibitor in einer therapeutisch wirksamen Menge, um eine solche Verhütung oder Behandlung zu ergeben, verabreicht werden.

9. Ein in vitro-Verfahren zur Entfernung von CMV-Virionen oder CMV-infizierten, hAPN- positiven Zellen aus Körperflüssigkeiten, Blutprodukten oder Knochenmark durch die Behandlung der Körperflüssigkeiten, Blutprodukte oder des Knochenmarks mit einem Antikörper gegen eine Aminopeptidase oder ein CMV-bindendes Fragment davon in wasserlöslicher oder immobilisierter Form, wobei die CMV-Virionen oder CMV- infizierten, hAPN-positiven Zellen teilweise oder vollständig aus den Körperflüssigkeiten, Blutprodukten oder dem Knochenmark auf selektive Weise entfernt werden können.

10. Ein in vitro-Verfahren zur Entfernung von CMV-Virionen oder CMV-infizierten, hAPN- positiven Zellen aus Körperflüssigkeiten, Blutprodukten oder Knochenmark durch die Behandlung der Körperflüssigkeiten, Blutprodukte oder des Knochenmarks mit zellfreier Aminopeptidase oder Fragmenten davon in wasserlöslicher oder immobilisierter Form, wobei die CMV-Virionen oder CMV-infizierten, hAPN-positiven Zellen teilweise oder vollständig aus den Körperflüssigkeiten, Blutprodukten oder dem Knochenmark auf selektive Weise entfernt werden können.

11. Verfahren zum Nachweis von Anti-APN-Antikörpern in einer Probe von einem Patienten, worin die Anwesenheit, Menge oder Qualität von Anti-APN-Antikörpern in der Probe nachgewiesen oder bestimmt wird durch einen Immunoassay unter Verwendung einer Aminopeptidase oder eines Fragments davon als Bindungspartner für die Antikörper.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Probe eine Körperflüssigkeitsprobe ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 zur Diagnose von CMV-Infektion oder deren Folgen.

14. Verfahren zur Diagnose von CMV-Infektion, worin die Anwesenheit oder Menge von CMV-Virionen nachgewiesen oder bestimmt wird durch einen Immunoassay unter Verwendung eines Antikörpers gegen eine Aminopeptidase oder von löslicher Aminopeptidase als Bindungspartner für die Virionen.

15. Verfahren zur Diagnose von CMV-Infektion, worin APN-exprimierende Zellen unter Verwendung eines Antikörpers gegen eine Aminopeptidase als Bindungspartner für die APN isoliert werden und anschließend die Anwesenheit oder Menge von CMV- Virionen in den Zellen nachgewiesen oder bestimmt wird.

16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 15, worin die Aminopeptidase Human-Aminopeptidase N ist.

17. Diagnostischer Kit für die Diagnose von CMV-Infektion mittels Immunoassay zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Anti-APN-Antikörpern oder CMV- Virionen in einer Probe, umfassend freie oder immobilisierte Aminopeptidase oder ein Fragment davon als Bindungspartner für Anti-APN-Antikörper und/oder einen freien oder immobilisierten Antikörper gegen Aminopeptidase oder lösliche oder immobilisierte APN als Bindungspartner für Aminopeptidase auf den Virionen, wobei der Kit Markierungsmittel umfaßt, welche die Bestimmung der Anwesenheit oder Menge der Anti-APN-Antikörper oder CMV-Virionen in der Probe erlauben.

18. Produkt, enthaltend eine Aminopeptidase und/oder ein Fragment einer Aminopeptidase und einen Inhibitor einer Aminopeptidase als kombiniertes Präparat für die gleichzeitige, separate oder nacheinander erfolgende Anwendung bei der Verhütung oder Behandlung einer Human-Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion.

19. Produkt, enthaltend einen Inhibitor einer Aminopeptidase und/oder einen Antikörper gegen eine Aminopeptidase als kombiniertes Präparat für die gleichzeitige, separate oder nacheinander erfolgende Anwendung bei der Verhütung oder Behandlung einer Human-Cytomegalovirus (HMCV)-Infektion.