DE69414572T2

DE69414572T2 - Immortalisierung von dendritischen zellen mit dem v-myc onkogen

Info

Publication number: DE69414572T2
Application number: DE69414572T
Authority: DE
Inventors: Francesca I-20133 Milano Granucci
Original assignee: BIOTOP Sas di Rita Cassarin
Current assignee: BIOTOP Sas di Rita Cassarin
Priority date: 1993-05-31
Filing date: 1994-05-26
Publication date: 1999-07-29
Anticipated expiration: 2014-05-27
Also published as: EP0701604B1; HU9503414D0; ATE173294T1; AU6929994A; GR3029374T3; US5856180A; DE69414572D1; ITMI931118A0; AU686636B2; WO1994028113A1; JP3834059B2; US6156307A; JPH09500523A; DK0701604T3; KR100353220B1; ZA943782B; IT1264516B1; ES2126118T3; ITMI931118A1; EP0701604A1

Description

Die Erfindung betrifft immortalisierte dendritische Zellen, ein Verfahren zu deren Herstellung aus Primär-Kulturen und ihre Verwendung zur Aktivierung von T-Lymphocyten in antigenspezifischer Weise, in vivo oder in vitro.
Die antigenspezifische Immunantwort ist ein Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen T,B-Lymphocyten und antigenaufweisenden Zellen (APCs). Die Art der Immunantwort, die durch das Antigen hervorgerufen wird (zellvermittelte cytotoxische oder humoral-Reaktion) und die Erzeugung eines Immungedächtnisses werden durch die Wechselwirkung zwischen diesen Zellen und ihren Produkten an den Stellen, wo diese Wechselwirkungen auftreten und durch die Natur des Antigens selbst beeinflußt. Es wird angenommen, daß die Aktivierung und Unterdrückung auch ein Ergebnis der vorstehend erwähnten Variablen ist, das, falls nicht gesteuert, zu Autoimmunerkrankungen und einer Toleranz-Induktion führen kann.
Dendritische Zellen (DC), die zuerst von Steinuran und Cohn 1973 (J. Exp. Med. 137: 1142, 1973) beschrieben wurden, sind eine Population von breitverteilten Leukocyten, die eine Schlüsselrolle im Immunsystem spielen (Steinuran R. M. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 271-296; Romani N. et al., 1992, Spinger Semin. Immunopathol. 13: 265), vorausgesetzt, daß sie: i) hochspezialisiert bei der Antigenpräsentation sind, ii) die prinzipiellen Aktivatoren von ruhenden T-Zellen in vitro sind (Inaba M. D. et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 858; Croft M. et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1431), iii) die Hauptquelle für immunogene Epitope für spezifische T-Zell-Klone nach einer Verabreichung von Antigen in vivo sind (Inaba K. et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 631; Crowley M. et al., 1990, J. Exp. Med. 172 : 383) und iiii) die potentesten Initiatoren für primäre T-Zell-vermittelte Reaktionen in vivo sind (Lechler R. I. et al., 1982, J. Exp. Med. 155: 31).
In verschiedenen Untersuchungen wurde vorgeschlagen, daß DC native T-Zellen bereitstellen mit sämtlichen notwendigen Signalen, die für die Aktivierung und Proliferation benötigt werden (Steinuran R. M. und Romani N, wie vorstehend genannt). Diese Signale werden erzeugt durch die Wechselwirkung von Komplexen von größeren histokompatiblen Komplex (MHC)-Molekülen und antigenen Peptiden mit dem T-Zell-Rezeptor (Davis M. et al., 1988, Nature 334: 395) und durch die Beteiligung von hochstimulatorischen Molekülen, einschließlich der Bindung von B7/BB1-Molekülen an Antigen aufweisende Zellen (APC) an CD28-Rezeptor oder an die T-Zell-Oberfläche (Young J. W. et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 229, Nabavi N. et al., 1992, Nature 360: 266). Das erste Signal allein ruft Effektorfunktionen lediglich an aktivierten T-Zellen hervor und ist nicht geeignet naive oder ruhende T-Zellen zu stimulieren, die in Abwesenheit von co-stimulatorischen Signalen eine Periode ohne Reaktion eingehen können (Inaba K. et al., 1985, Science 229: 475; Mueller D. L. et al. 1989, J. Immunol. 142: 2617; Tan P. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 165). Die Expression des co-stimulatorischen Moleküls B7/BB1 an DC-Populationen wurde kürzlich berichtet und als kritisch für DC-angetriebene primäre T-Zell-Reaktionen dargestellt (Larsen C. P. et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1; Symington F. W. et al., 1993, J. Immunol. 150: 1286; Liu Y. et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2855).
Das Verständnis des Mechanismus, der den potenten stimulatorischen Fähigkeiten von DC unterliegt, könnte erklären, wie T-Zellen primiert werden und wie die Immunantwort initiiert wird. Mit diesem Wissen könnte man versuchen die Immunantworten in sehr frühen Stufen zu manipulieren und einen Weg zur Induktion einer Immunität oder Toleranz bereitzustellen. Jedoch war eine wesentliche Begrenzung bei der Untersuchung der DC-Biologie die geringe Anzahl von Zellen, die aus jeglichem Gewebe erhältlich war, da bisher keine stabilen Zell-Linien, die klar ähnlich den DC waren, erhalten wurden.
Es wurden drei verschiedene Gewebe als Hauptquellen für DC angewendet: die Milz der Maus, die Epidermis, worin DC als Langerhans-Zellen bekannt sind und menschliches Blut. In jedem Falle bilden DC eine winzige Fraktion des Ausgangsgewebes; sie stellen etwa 1% der rohen Milz- (Steinuran R. M. et al., 1979, J. Exp. Med. 149: 1) oder Epidermis- (Schuler G. et al., 1985, J. Exp. Med. 161: 526; Romani N. et al., 1989, J. Invest. Dermatol. 93: 600), -Zellsuspensionen und 0,1-1% von mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (Freudenthal P. S. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7698) dar. Kürzlich haben Inaba und Mitarbeiter ein Verfahren zur Erzeugung von DC aus peripherem Blut und Knochenmark-Vorläufern beschrieben, jedoch endet die Zellproliferation innerhalb 1 bis 3 Wochen (1992, J. Exp. Med. 175: 1157).
Ein unterschiedlicher Versuch ist die Erzeugung von DC-Zell-Linien aus Primär- Kulturen und die Bereitstellung eines Verfahrens, das die Immortalisierung von DC ermöglicht. Gegenwärtig besteht jedoch ein Bedürfnis nach einem wirksamen Verfahren zur Einführung von genetischem Material in DC und zu deren Befähigung, das genetische Material, das sie üblicherweise nicht exprimieren, zu exprimieren.
Diesbezüglich erfolglose Versuche wurden durchgeführt von Komatsubare et al., (Microbiol. Immunol. 32(8), 869-875, 1988) die V-SRC und Ha-RAS Onkogene in dendritische Zellen der Maus einführten: jedoch zeigten immortalisierte dendritische Zellen nicht die Charakteristika dendritischer Zellen.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde nunmehr ein Verfahren zur Erzielung von Zell-Linien mit den phenotypischen und funktionellen Charakteristika von Leukocyten gefunden, das geeignet ist Zellen des Immunsystems antigene Peptide anzubieten und spezifische Immunantworten in vivo und in vitro zu induzieren. Insbesondere betrifft die Erfindung die Immortalisierung von Antigen präsentierenden Zellen (APC), wie die dendritischen Zellen (DC), durch Einführen von exogenem genetischem Material, das durch diese Zellen normalerweise nicht exprimiert wird, das geeignet ist ein undefiniertes Zellwachstum (Immortalisation) in den transfektierten oder infizierten Zellen zu erzeugen, ohne deren APC-Funktion zu beeinflussen.
Das exogene genetische Material ist in die immortalisierten APC gemäß der Erfindung eingeführt und sie exprimieren es.
Das zur Immortalisierung von APC und insbesondere DC geeignete genetische Material umfaßt das v-myc-Onkogen.
Daß das v-myc-Onkogen umfassende genetische Material kann eingeführt werden in
- Vektoren
- Expressionsvektoren
- DNA, die sich von den ursprünglichen viralen oder retroviralen Genomen unterscheidet,
- Vektoren, die genetische Marker für die Selektion von Zellen enthalten, in die das genetische Material eingeführt wurde.
Im allgemeinen ist die spezifische Reihenfolge, in der die verschiedenen Elemente miteinander verbunden werden, nicht kritisch, so daß die flankierenden Regionen zuerst an ein Replikationssystem, das einen Marker oder andere Regionen, wie Enhancer, transkriptionelle regulatorische Regionen oder dergleichen umfaßt, vor der Einführung des Gens, gebunden werden können. Das Verfahren, bei dem die verschiedenen Fragmente zusammengebracht werden, hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, die abhängen von der Leichtigkeit der Konstruktion, der Wahl der Restriktionsstellen, der Verwendung der Selektionsmethoden, der Verfügbarkeit spezieller Fragmente und dergleichen, die sich letztlich aus dem fachmännischen Wissen ergeben.
Das v-myc-Onkogen ermöglicht die Immortalisierung von APC direkt aus Primär- Kulturen, in denen DC eine Populationsminorität darstellt, ohne daß es notwendig ist spezielle Selektionsmethoden anzuwenden.
Vorzugsweise erhält man den Retroviral-Vektor durch Co-Transfektion von zwei Retroviren, wobei mindestens einer davon das v-myc-Onkogen enthält.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung enthält das exogene genetische Material ein retrovirales Onkogen von Vögeln, fusioniert mit einer kodierenden retroviralen Sequenz der Maus; insbesondere ist das von Vögeln stammende Onkogen ein mutiertes v-myc-Gen, fusioniert mit einem Teil des env-Proteins, das hergeleitet ist von dem Retrovirus MH&sub2; des Vogels (T. Graf et al., Biochim. Biophys. Acta, 516, 269-299, 1982) und von dem AKR-Retrovirus der Maus (R. Risser et al., Ann. Rev. Genet., 17, 85-121, 1983 und in "RNA Tumor Viruses", R. Weiss et al. 2nd ed. Cold Spring Harbor, 1985). Insbesondere werden, wie in Fig. 1a dargestellt, die MH&sub2;- und AKR-Retroviren in Mäuse- Makrophagen co-transfektiert, wie beschrieben von Righi et al., Oncogene, 4, 223-230, 1989. Man erhält eine Zell-Linie, die einen Retrovirus-Komplex (3RV) erzeugt, der Zellen des gleichen Typs immortalisieren kann (Righi et al., Eur. J. Immunol. 19, 1443-1448).
Durch Infektion von Makrophagen des Gehirns mit diesem Retrovirus-Komplex erhält man die Zell-Linie N11, die ihrerseits das Virus VN11 erzeugt (Righi et al., Oncogene, 6, 103-111, 1991), das geeignet ist Makrophagen zu immortalisieren (L. Pirami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7543-7547, 1991). Die N11-Zell-Linie wurde nach dem Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, UK, am 12. 05. 1993 unter der Zugangsnummer 93051207 hinterlegt.
Das VN11-Virus kann verwendet werden, um dendritische Zellen direkt zu immortalisieren oder es kann in einen Vektor geklont werden, der geeignet ist "packaging"- Zell-Linien zu transfektieren, die retrovirale Vektoren produzieren, die ihrerseits geeignet sind dendritische Zellen zu transfektieren.
Die Transfektion letzterer kann erzielt werden durch Co-Kultivation dendritischer Zellen mit "packaging"-Zellen. Beispiele für "packaging"-Zell-Linien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind die psi2-Zell-Linie, beschrieben in "Experimental Manipulation of gene expression" M. Inouy (ed.), 155-173, 1983 und in R. Hann et al., Cell, 33, 153-159, 1983; ein äquivalentes Derivat der psi2-Zell-Linie, bezeichnet als psi am, wird von R. Clone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 0349-6353 beschrieben und ist hinterlegt bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD-USA; Zugangsnummer CRL 8859).
Das vorzugsweise erfindungsgemäß zur Transfektion verwendete genetische Material enthält das mutierte v-mycMH2-Gen, fusioniert mit einem Teil der envAKR- Retroviralsequenz der Maus (EMBL Database, Zugangsnummer Z 26309).
Die beschriebene Verfahrensweise zur Immortalisierung von APC, die dieses spezielle rekombinante Onkogen verwenden, kann auf jegliche anderen zellulären oder retroviralen Onkogene ausgeweitet werden.
Da Gene unter Verwendung eines retroviralen Vektors in DC eingeführt werden können, können sie "auf" der retroviralen Vektorsteuerung sein (bzw. ihr unterliegen); in einem derartigen Fall wird das interessierende Gen von einem retroviralen Promotor transkribiert. Ein Promotor wird als eine spezifische Nukleotidsequenz beschrieben, die von einer Anzahl von Transkriptionsfaktoren erkannt wird, um RNA-Polymerasekomplexen die Initiierung der RNA-Synthese zu ermöglichen. Retrovirale Vektoren können so ausgestaltet werden, daß sie andere Promotorelemente (zusätzlich zu dem Promotor des rekombinanten Retrovirus) aufweisen, die verantwortlich sind für die Transkription des Gens. Beispielsweise ist es möglich den Vektor zu modifizieren durch Einführen eines zusätzlichen Promotors, der durch äußere Faktoren moduliert ist, wodurch die Steuerung des Ausmaßes des Polypeptids ermöglicht wird, das durch die DC erzeugt wird durch Zusatz dieser externen Faktoren zu der Kultur.
Die Einarbeitung dieses Promotors oder eines anderen Promotors, der durch äußere Signale beeinflußt wird, ermöglicht es auch die Erzeugung des Polypeptids durch die konstruierte DC zu steuern.
Die Zell-Linien, die durch Einführung von exogenem genetischem Material erhalten werden, und die einen Teil der Erfindung darstellen, haben zusätzlich zu anderen Eigenschaften die Charakteristika von APC und die Fähigkeit Zellen des Immunsystems, wie T-Lymphocyten, zu aktivieren.
Bevorzugte APC sind DC. Gemäß der vorstehenden Beschreibung, wurde das exogene genetische Material in DC eingeführt; für die erfindungsgemäßen Zwecke umfaßt DC das DC von Knochenmark, peripherem Blut, Blut der Chorda (cord blood), Epidermis (Langerhans-Zellen), follikulare und interstitiale DC von germinalen Zentren und interdigitatierenden DC der lymphoiden Organe. Der Ursprung des Gewebes stellt keine Einschränkung der Erfindung dar.
Das in diese Zellen eingeführte genetische Material verleiht den DC die Immortalisierung (unlimitiertes Zellwachstum) und kann derart modifiziert werden, daß das Produkt verändert und/oder seine Expression entweder grundsätzlich oder nach Aktivierung induzierbar ist. Das Produkt eines derartigen genetischen Materials kann jegliches Polypeptid sein, das in der Zell-Membran sekretiert oder verankert wird, wie ein Antigen oder ein verwandtes Peptid, ein Lymphokin oder Membranprotein.
Zusätzlich kann das vorstehend beschriebene genetische Material auch in andere Zell-Typen eingeführt werden, die geeignet sind das Immunsystem zu aktivieren, wie beispielsweise Makrophagen oder in Zellen, die normalerweise nicht geeignet sind das Immunsystem zu aktivieren, die modifiziert oder induziert wurden, um einen derartigen Effekt zu ergeben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Induzierung des Immunsystems eines Organismus zur Erzeugung einer spezifischen vorbestimmten Immunantwort unter Verwendung der Zell-Linien, die einen Gegenstand der Erfindung darstellen.
Die erfindungsgemäßen Zell-Linien können in vitro mit jeglicher Art von Antigen beladen und dann mit den folgenden Vorteilen verwendet werden:
1) Sie können T-Lymphocyten ex vivo aktivieren. Die Co-Kultur von naiven oder Antigen-spezifischen T-Lymphocyten mit der mit Antigen beladenen DC-Zell-Linie (als Antigen präsentierende Zellen) kann zum Primieren und zur Expansion der Antigenspezifischen T-Lymphocyten führen. Dies ist von speziellem Interesse für solche Antigene, die entweder in vivo keine schützende Immunantwort geben (beispielsweise Tumor-Antigene oder Pathogene wie Viren, Fungi und intracelluläre Parasiten) oder die aufgrund ihrer unerwünschten Nebenreaktionen nicht in vivo eingesetzt werden können. Antigen-spezifische T-Lymphocyten, aktiviert und expandiert in vitro unter Verwendung von DC-Zell-Linien können in den ursprünglichen Organismus (adoptiver Transfer) wieder eingeführt werden und ergeben die gewünschte Immunantwort.
2) Sie können direkt in vivo verwendet werden, um die gewünschten Antigenspezifischen T-Lymphocyten des Wirtes zu aktivieren. Diese Art von Zell-Vaccination kann äußerst brauchbar sein, wenn die Einführung des Antigens in den Organismus nicht erwünscht ist oder wenn das Pathogen bereits in dem Organismus vorhanden ist oder wenn das hergestellte Antigen (Peptid-MHC-Komplex) geeigneter ist zur Vaccination im Vergleich mit dem gesamten löslichen Pathogen.
3) Sie können ein immologisches Gedächtnis erzeugen, da sie jungfräuliche T- Zellen primieren sowie auch Gedächtnis-T-Zellen in vivo induzieren können; dies ist besonders wichtig bei der Zell-Vaccination. In dieser Hinsicht können sie als natürliche Adjuvantien betrachtet werden.
4) Sie können mit Antigenen beladen werden, die mit jeglichen MHC-Molekülen entweder der Klasse I oder der Klasse II assoziiert sein können, je nach der Art der gewünschten Immunantwort. Tatsächlich können Gene, die für antigene Determinanten von Pathogenen, wie Viren oder intracellulären Bakterien kodieren, in DC-Zell-Linien transfektiert werden und ihre Produkte können primär mit MHC-Molekülen der Klasse I assoziiert werden; andererseits könnte DC-Zell-Linien auch mit gereinigten oder rekombinanten Proteinen von Pathogenen beladen werden, wie Viren oder intrazellulären Bakterien und primär mit MHC-Molekülen der Klasse II assoziiert werden; auf diese Weise ist es möglich je nach der Art der Beladung der DC-Zell-Linien die Immunantwort (Zellvermittelt oder Antikörper-vermittelt) durch Injektion jeglicher Art von vorbeladener DC- Zell-Linie zu steuern.
5) Sie können verwendet werden, um Antigen-spezifische Immunantworten gegen Antigene zu induzieren, die von nicht-MHC-Antigenen der Klasse I oder Klasse II abhängen, wie im Falle der CD1-Familie.
6) Sie können zur Induktion spezifischer T-Helferzell-Teilmengen, wie die TH1- oder TH2-Teilmengen in solchen Fällen verwendet werden, wo das Immunsystem nicht fähig ist die gewünschte Antwort zu entwickeln.
7) Sie können mit Genen modifiziert werden, die Produkte exprimieren können, die geeignet sind die Immunantwort zu modulieren, wie cytokine Gene. Diese Gene können sich unter der Kontrolle von Promotor/Enhancer-Elementen befinden, die durch spezifische signalisierende Wege, gefolgt von der Interaktion zwischen Membran-Rezeptoren und Liganden induziert werden können.
8) Sie können modifiziert werden, um sie dem Menschen einzuführen, wenn man sie beispielsweise abhängig von einem Faktor oder Kulturbedingungen oder einem Molekül macht, das in Säugern normalerweise nicht vorhanden ist.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1a:
Herstellungsschema des retroviralen Vektors MIB-psi2-N11.
Fig. 1b:
Partielle Restriktionskarte des retroviralen Vektors MIB-psi-N11 und Northern-Blot- Analyse der CB1-Zell-Linie gemäß der Erfindung unter Anwendung einer spezifischen Probe für das Gen v-myc-MH&sub2; des Vogels:
A) CB1-Zellen;
B) positive Kontrolle.
Virale Transkripte von genomischer und sub-genomischer Größe werden durch die Pfeile angezeigt.
Fig. 2:
a) FACS-Analyse von CB1 und D2SC/1 dendritischen Zell-Klonen und Anwendung einer Reihe von Antikörpern und verglichen mit frischen dendritischen Zellen, wie in der Literatur beschrieben.
b) Immunohistochemische Analyse von CB1-Zellen unter Verwendung von 2A1 (A)- und M342(a)-Antikörpern und verglichen mit den relativen Kontrollen (B) bzw. (D).
Fig. 3:
Wachstumskurve eines immortalisierten DC-Klons.
Fig. 4:
a) MLR-Assay;
b) Antigen-spezifisches T-Lymphocyten-Aktivierungs-Assay.
Fig. 5:
Kontaktsensibilität (CS), Induktion durch CB1-Zellen, modifiziert mit FITC(a) oder DNBS(b).

Genaue Beschreibung der Erfindung

Aus Primär-Gewebskulturen in denen APC nur eine geringe Fraktion des Ausgangsmaterials darstellt, ist es möglich, exogenes genetisches Material, das geeignet ist kontinuierliche Zell-Linien von funktionellem APC und insbesondere funktionellen DCs in APC und insbesondere in DCs umzuwandeln (für erfindungsgemäße Zwecke umfaßt DCs DC aus Knochenmark, peripherem Blut, Chorda-Blut (cord blood), Epidermis (Langerhans- Zellen), follikularen und interstitialen DC von germinalen Zentren und interdigitierende DC von den Lymphoidorganen). Primäre Kulturen können aus Suspensionen von Milzzellen erhalten werden. Die Kulturen sind typischerweise heterogene Gemische vieler Zelltypen, von denen jede induziert werden kann eine begrenzte Anzahl von Generationen zu replizieren. Primärzellen sind somit unterscheidbar von Zell-Linien, die als Ergebnis einer Transformation von Vorläufern (Ahnen) und/oder Mutation, resultierend in einem kontinuierlichen oder undefinierten Wachstum in Kultur, immortalisiert worden sind. Nach etwa 3 Wochen und ohne jegliche Art von Selektion ist es möglich proliferierende Zellen zu isolieren und kontinuierliche Zell-Linie einzurichten, die weiter geklont werden können.
Die Immortalisierung wird mit genetischem Material erzielt, das aus einem RNA- oder DNA-Aufbau besteht, das, um eine Transformationsfähigkeit zu erzielen, mindestens ein Onkogen einbezieht, das aus viralen oder zellulären Genomen oder chromosomaler DNA von Säugern oder Vögeln stammen kann. Im allgemeinen führt die Infektion einer geeigneten Zielzelle mit einem akut onkogenen Retrovirus zu einer onkogenen Transformation. Zwar ist der Mechanismus der zur Onkogenese führt, nicht vollständig klar, jedoch wurde eine Vielzahl von viralen Onkogenen oder v-oncs sowie deren Zell-Homologe, bekannt als Proto- Onkogene oder c-oncs, katalogisiert. Es wurden verschiedene Mechanismen vorgeschlagen, durch die c-oncs-Transformationseigenschaften annehmen, einschließlich der Steuerung durch starke virale Promotoren, Genkopie-Vervielfältigung, Addition von viralen Enhancer- Sequenzen, Umlagerung und Mutation. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen Onkogene jegliches genomische Material oder Materialien, die im wesentlichen homolog zu onkogenen Sequenzen sind, die geeignet sind ein primäres APC zu transformieren. Als Beispiele für potentielle transformierende genomische Materialien sind eine Liste von Onkogenen, bereitgestellt von Bishop et al., in Weiss et al., eds., RNA Tumor Viruses, Volume 1 (Cold Spring Harbor Laboratory, NY 1984), S. 1004-1005 und Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., vol. II, (Benjamin Cummings, Menlo Park, CA) S. 1037. Einbezogen sind die bekannten Onkogene, wie src, yes, abl, fps, fes, erbB, fms, ros, kit, mos, raf, H-ras, K-ras, sis, myc, myb, fos, ski und erbA. Einige onkogene Produkte scheinen Homologe von Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren zu sein oder sind nukleare Proteine, wobei diese Effekte durch Zusatz von deren Produkten zur Zell-Kultur mimykrisiert werden können. Viele Onkogene können aus öffentlichen Sammlungen von hinterlegten biologischen Materialien erhalten werden.
Eine Kombination verschiedener Retroviren, einschließlich Hybrid-Retroviren, erzeugt durch spontane Rekombination in vitro oder Retroviren, in denen Gene verschmolzen und Fusionsprodukte erzeugt werden, können ebenfalls zur Immortalisierung von Zellen verwendet werden. Diese Ereignisse können erzielt werden durch Infektion von Myeloid- Zellen mit Retroviren nach den beschriebenen Verfahrensweisen (Righi et al., 1989, Oncogene: 4, 233-230; Blasi E. et al., Nature: 318, 667-669 (1985)) und nasch dem Mechanismus beschrieben in "Weiss et al., eds. RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985."
Eine Begrenzung dieser Produkte wird durch die Tatsache angegeben, daß das transduzierte genetische Material nicht charakterisiert ist und sobald in die Zielzelle eingeführt eine virale Nachkommenschaft erzeugen könnte. Dies sind unerwünschte Merkmale, insbesondere wenn die erhaltenen Zell-Linien in einen Organismus injiziert werden sollen.
Durch die Erfindung können diese Probleme ausgeräumt werden: insbesondere wurde eines der Proviren, die geeignet zur Immortalisierung von DC-Zellen in vitro sind, molekular in einen Lambda-Phagen geklont. Das Insert, das das gesamte virale Genom plus die flankierenden Regionen enthielt, die sich von der Maus ableiten, von der das Provirus ursprünglich geklont wurde, wurde dann in ein pUC 18 subgeklont. Brauchbare Plasmidvektoren zur Vermehrung der retroviralen genetischen Elemente in bakteriellen Wirten vor der Transfektion werden hergestellt durch Insertion einer retroviralen DNA- Sequenz, die die vorstehend beschriebenen Elemente kodiert, in einen Vektor, der ein oder mehrere phenotypische selektierbare Marker und einen Replikationsursprung für bakterielle Wirte einbeziehen könnte, wie E. coli, obwohl wahlweise auch andere angewendet werden können. So kann ein geeigneter Säuger/bakterieller Schaukelvektor einen selektierbaren Marker und bakteriellen Ursprung für die Replikation, hergeleitet von handelsüblichen Plasmiden, die genetische Elemente des bekannten Klonungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten, umfassen. Das resultierende rekombinante Retrovirus wäre somit geeignet zur Integration in die chromosomale DNA einer infizierten Wirtszelle, würde jedoch, einmal integriert, ungeeignet zur Replikation zur Lieferung von infizierenden Viren sein, falls nicht die Zelle, in die es eingeführt wurde, eine weitere provirale Insertion enthält, die funktionell aktive transagierende virale Proteine enthält. Das Plasmid p316 wurde in psi-Zellen (packaging Zell-Linie) (Mann et al., Cell. 33: 153 (1983)), die einen liminierten Ecotropismus verleihen, transfektiert. Die Transfektion kann durchgeführt werden nach jeglicher zweckmäßigen Verfahrensweise, wie Mikroinjektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-ausgefällte DNA-Transfektion und Elektroporation (vgl. Bonerji, J. et al., Cell 33, 729-740 (1983); Graham F. L. und Van der Eb A. J., Virology, 52-456-467 (1983) und Potter H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161-7165 (1984)). Die viralen Teilchen, die durch die transfektierte packaging Zell-Linie erzeugt werden, können DC mit einem liminierten Tropismus infizieren, der ihre in vitro Proliferation induziert und die Isolierung der Zell-Linien von diesen Derivaten ermöglicht.
Die infizierten DC werden durch diese defekten Retroviren immortalisiert, sie werden jedoch nicht weiter propagiert. Retroviren, die zur Anwendung gemäß der Erfindung angepaßt werden sollen, können von zahlreichen Vogel- oder Säuger-Wirten stammen. Jedoch stellt ein Erfordernis für die Anwendung dar, daß das Virus geeignet ist Zellen zu infizieren, die die Rezipienten von dem neuen genetischen Material sein sollen, das unter Verwendung der retroviralen Vektoren transduziert werden soll. Beispiele für Retroviren umfassen Retroviren von Vögeln, wie das Erythroblastosevirus des Vogels (AMV), das Leukosevirus des Vogels (ALV), das Myeloblastosevirus des Vogels (ABV), das Sarkomvirus des Vogels (ASV), das Fujinamisarkomvirus (FuSV), das Milznekrosevirus (SNV) und das Roussarkomvirus (RSV); das Leukämievirus des Rindes (BLV); Retroviren der Katze, wie das Leukämievirus der Katze (FeLV), oder das Sarkomvirus der Katze (FeSV); Retroviren der Maus, wie das Leukämievirus der Maus (MuLV), das Mammatumorvirus der Maus (MMTV) und das Sarkomvirus der Maus (MSV); das Sarkomvirus der Ratte (RaSV); und Retroviren der Primaten, wie T-Zell-lymphotrope Viren 1 und 2 des Menschen (HTLV-1,2) und das Sarkomvirus des Affen (SSV). Es sind zahlreiche andere geeignete Retroviren dem Fachmann bekannt. Eine Taxonomie von Retroviren wird angegeben von Teich in Weiss et al., eds., RNA Tumor Viruses, 2d ed., Vol. 2 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1985) S. 1-16. Der begrenzte Ecotropismus der Retroviren kann überwunden werden durch Anwendung des geklonten Viral-Genoms, das in Target-Zellen durch Elektroporation, Protoplast-Zellfusion oder Calciumphosphat-Ausfällung transfektiert werden kann.
Beispielsweise können die den Gegenstand der Erfindung darstellenden Zell-Linien hergestellt werden durch Infektion von unselektierten DC mit dem mutierten Onkogen v- mycMH&sub2; des Vogels (Graf T., Biochim. Biophys. Acta, 516, 269-299, 1982), fusioniert mit einem Teil der retroviralen envAKR-Maus-Sequenz (Risser R. et al., Ann. Rev. Genet. 17, 85-121, 1983). Diese Sequenz findet sich in der von Makrophagen hergeleiteten Zell-Linie N11, produzierend das VN11-Virus (Righi et al., Oncogene, 6, 103-111, 1991), das geeignet ist Makrophagen zu immortalisieren (Pirami L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7543-7547, 1991). Die Zell-Linie N11 wurde nach dem Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, GB, am 12. Mai 1993 unter der Zugangsnummer 93051207 hinterlegt.
Das VN11-Virus kann direkt zur Immortalisierung dendritischer Zellen verwendet werden oder es kann in einen Vektor geklont werden, der in "packaging"-Zell-Linien transfektiert werden kann.
Dendritische Zellen können dann durch Co-Kultivieren mit diesen "packaging"- Zellen oder mit überstehenden Flüssigkeiten von diesen packaging-Zellen infiziert werden. Beispielsweise erhielt man einen retroviralen Vektor, bezeichnet als MIB-psi2-N11, durch Transfektion in die psi-Zell-Linie des Genoms des VN11-Virus, geklont in einen geeigneten Plasmid-Vektor, zusammen mit dem Neogen, abgeleitet von dem TN5- Transposon.
Der Plasmid-Vektor kann erhalten werden nach der üblichen Methode, z. B. durch Einführen von HindIII-EcoRi-Fragmenten der DNA-Bibliothek von N11-Zellen in pUC18, Transformation von HB101 E. coli-Zellen mit den erhaltenen Konstruktionen und anschließendes Screening durch Hybridisierung mit einer markierten Probe, die sich von einem Fragment des myc-MH2-Gens ableitet.
DC können auch mit dem MIB-psi2-N11-Retroviral-Vektor infiziert werden oder sie können mit den viralen Erzeuger-psi-Zellen (psi2 N11) co-kultiviert werden. Gemäß einem Beispiel für die Verfahrensweise der co-Kultur kann die das Virus produzierende psi-Linie mit Mitomycin C bei 5 Mikrogramm pro ml bei etwa 37ºC während etwa 2 Stunden in RPMI 1640 ohne Serum behandelt werden. psi-Zellen wurden mit Mitomycin C auf einer 10 cm-Schale behandelt und mehrfach mit DME gewaschen. Die Suspension der Milzzellen wurde anschließend auf diese Schale geimpft und etwa 24 Stunden belassen; die Milzzellen wurden dann durch vorsichtiges Pipettieren gewonnen und in eine unterschiedliche Petrischale eingebracht.

Retrovirale Vektoren

Details über die Konstruktion eines retroviralen Vektors sind enthalten in Mulligan R. C., Construction of Highly Transmissable Mammalian Cloning Vehicles Derived from Murine Retroviruses, In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann R. et al., Cell. 33: 153-159 (1983); Williams D. A. et al., Nature, 310: 476-480 (1984)).
Auf die Lehre dieser Veröffentlichungen wird hier Bezug genommen.
Die von Mulligan und Mitarbeitern beschriebene psi2-Zell-Linie wurde erzeugt durch Transfektion von NIH 3T3 Fibroblasten mit pMOV-psi, das ein ecotropisches Moloney-Mäuse-Leukämievirus (Mo-MuLV)-Klon ist. pMOV-psi exprimiert alle viralen Genprodukte außer einer Sequenz, die zur Einkapselung des viralen Genoms nötig sind. Darüber hinaus exprimiert pMOV-psi ein ecotropes virales Umhüllungs-Glycoprotein, das einen Rezeptor erkennt, der lediglich auf Zellen der Maus (und nahe verwandter Nager) vorhanden ist.
Eine weitere Zell-Linie ist die NIH-psi am, ein modifiziertes pMov-Psi-Genom, bei dem das ecotrope Umhüllungs-Glycoprotein ersetzt wurde durch eine Umhüllungssequenz, die sich von dem amphotropen Virus 4070A ableitet, unter Bildung einer Zell-Linie, die ein rekombinantes Virus mit einem breiteren amphotropen Wirtsbereich erzeugt.
Zusätzlich kann das das virale Genom enthaltende Plasmid vor der Transfektion in die packaging-psi-Zell-Linie modifiziert werden mit einem exogenen genetischen Material einer anderen Spezies und anschließend in DC eingeführt werden. Das introduzierte genetische Material kann ein genetischer Marker oder Selektionsgene, die für intrazelluläre membrangebundene oder sekretierte Polypeptide kodieren, was darüber hinaus die Identifizierung und Selektion der immortalisierten DC-Zellen erlauben würde.
Das genetische Material kann auch regulierende Sequenzen oder Sequenzen, die geeignet sind mRNA-Produkte zu stabilisieren, wie die 3'-untranslatierten Regionen einiger Messenger-RNAs oder Intronregionen, enthalten. Der bereitgestellte dominante selektierbare Marker kann beispielsweise jeder antibiotisch resistente Phenotyp, wie Neo (G418 Resistenz), Hygro (Hygromycin-Resistenz) oder gpt (Mycophenolsäure-Resistenz) sein, Gene, die verwendet werden können, vorausgesetzt, daß ein geeigneter Donator als Quelle für die zu immortalisierenden DC gewählt wird; derartige selektierbare Marker sind unter den Forschern weit verbreitet erhältlich. Ein weiteres geeignetes genomes Material, das in den Vektor eingeführt werden kann, ist jegliches Genprodukt mit einem Wert oder Brauchbarkeit, abhängig von der Umgebung in die es translatiert wird, beispielsweise virale, bakterielle oder Tumorzell-Antigene, oder biologisch aktive Moleküle, wie Antigenerzeugende Polypeptide, Cytokine, Hormone, Wachstumsfaktoren, sowie ihre Rezeptoren, oder Homologe der vorstehenden oder jeglicher Polypeptide, die eine Gewebsspezifität haben.
Insbesondere können auch Gene, die für Protein-Antigene oder Peptide, die sich von diesen Antigenen ableiten, kodieren, sowie sekretierte Lymphokine oder Membran- Proteine, wie MHC-Polypeptide ebenfalls in den ursprünglichen MIBpsi2-N11-Vektor eingeführt werden.
Unter Verwendung des MIBpsi2-N11-Vektors wurden verschiedene DC-Klone immortalisiert und zwei davon, bezeichnet als CB1 und D2SC/1 wurden genau gekennzeichnet und als ein Beispiel angegeben. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Fibroblast-Zell-Linie, die als Beschickerschicht für (in Co-Kultivierung mit) DC verwendet wird, eine Psi am-Linie, die das VN11-Virus erzeugt.
Milzzeh-Suspensionen von Neugeborenen DBA/2 (CB1-Zellen) oder BALB/C (D2SC/1-Zellen)-Mäusen wurden mit dem retroviralen Vektor MIBpsi2-N11 infiziert und etwa zwei bis vier Wochen nach der Infektion wurden die Foci untersucht und proliferierende Zellen, die sich von den anhaftenden Aggregaten abhoben, wurden geklont; charakteristischerweise zeigen diese Zellen folienähnliche Vorsprünge mit einer starken Motilität, die andere Leukocyten nicht zeigen. Die geschätzte Verdoppelungszeit der immortalisierten Zell-Linien beträgt etwa 20 Stunden.
Es wurden zwei Klone, bezeichnet als CB1 und D2SC/1 genauer charakterisiert, 1 auch durch Antikörper, die spezifisch für Oberflächen- oder intracelluläre Marker sind.
Im Falle von Linien, die sich von dendritischen Zellen ableiten, können die Antikörper N418, die das CDIIc-Molekül erkennen (Metlay et al., J. Exp. Med. 171, 1753- 1771 (1990)) M342 (Agger et al., J. Leukoc. Biol. 52, 34-42 (1992)) und 2A1 (Inaba et al., J. Exp. Med. 175, 1157-1167 (1992)) verwendet werden. Die Verwendung dieser Antikörper, sowie vieler anderer erkennender anderer spezifischer Marker zeigt, daß CD- Linien viele der Charakteristika aufweisen, die für Langerhans-Zellen (De Paufilis et al., J. Invest. Dermatol. 93, 60-69 (1989)) und für DC (Inaba K. et al., J. Exp. Med. 176, 1963- 1702 (1992)) berichtet wurden.
Die stimulierende Aktivität von DC ist partiell verbunden mit der Anwesenheit des Membran-Proteins B7/BB1, das auf verschiedenen APC-Typen identifiziert wurde (Linsley P. S. et al., J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991); Linsley P. S. et al., Science 257, 792-795 (1992)) und wird als wesentlich für die Induzierung der Proliferation jungfräulicher T- Lymphocyten in MLR-Assays (Mixed Lymphocyte Reaction) und bei der Induzierung einer Antigen-spezifischen proliferativen Antwort in Lymphocyten, die den CD4-Marker exprimieren (Larsen C. P. et al., J. Exp. Med. 176, 1215-1220 (1992)) angesehen. Es ist beispielsweise möglich die Expression von B7/BB1 durch Strömungs-Cytofluorimetrie zu messen. Das Ergebnis zeigt, daß in den DC-Klonen das B7/BB1-Gen konstitutiv exprimiert ist.
Die stimulatorische Wirkung von DC in einem primären MLR (Steinuran R. M. et al., J. Exp. Med. 157, 613-617 (1983)) ist ein typisches Charakteristikum für diese Zellen. Die CB1-Zell-Linie hat eine stimulierende Wirkung bei der Induktion einer primären proliferativen Antwort in Lymphocyten in vitro bei einer allogenen Reaktion vom MLR-Typ.
Ein weiteres funktionelles Charakteristikum von DC besteht in der Fähigkeit auf antigenspezifische Weise sowohl T-Lymphocyten, aktiviert durch den ersten Kontakt mit dem Antigen als auch jungfräuliche T-Lymphocyten zu stimulieren (Romani N. et al., J. Exp. Med. 169, 1169-1178 (1989)); de Brujin M. L. H. et al., Eur. J. Immunol. 22, 2347- 2352 (1992); Croft M., J. Exp. Med. 1765, 1431-1437 (1992)).
Die erfindungsgemäßen Zell-Linien können auch verwendet werden, um eine primäre Antigen-spezifische Antwort in vivo zu induzieren, ohne Hilfe von Adjuvantien. Die DC können in vivo nach der in vitro Bereitstellung des Antigens verabreicht werden.
Sie sind geeignet ein natives Antigen herzustellen und zu präsentieren, wie Myoglobin des Walspermas an ein T-Klon, der für dieses Antigen spezifisch ist.
Die DCs können auch zellvermittelte Antworten, wie die Kontaktsensibilität in (Sullivan S. et al., Immunol. 137, 2460-2467 (1986)), die Pfropfabweisung von allogenen Transplantaten (Lechler R. I. et al., J. Exp. Med. 155, 31 (1982); Larsen C. P. et al., J. Exp. Med. 172, 1483 (1990)), die Aktivierung von MHC restriktiven T-Lymphocyten (Inaba K. et al., 172, 631 (1990)) und durch T-Lymphocyten vermittelte Antikörper (Sornasse et al., J. Exp. Med 175, 15-21 (1992)) induzieren.
Die Kontaktsensibilität (CS) ist eine spezielle Art von verzögerter Immunantwort, die auftritt, wenn der Organismus auf epikutanem Niveau immunisiert ist und anschließend eine Stimulierung mit dem reaktiven Hapten erfährt (Sullivan S. et al., J. Immunol. 137, 2460-2467). Es ist möglich CS darzustellen, selbst wenn Langerhans-Zellen oder DC in vitro mit dem Hapten konjugiert sind und anschließend in einen syngenen Organismus injiziert werden (Macatonia S. E., Immunology 59, 509-514 (1986)). Die CB1-Zellen, die FITC oder DNBS ausgesetzt wurden und dann s. c. in native syngene Mäuse injiziert wurden, können eine Primärantwort des CS-Typs hervorrufen. Die Antwort wird als Schwellung des Mäuseohrs gemessen, in das die Zellen injiziert wurden; 10000 Zellen genügen, um eine CS- Antwort zu induzieren.
Diese Antwort ist Antigen spezifisch, da nicht behandelte CB1-Zellen keine Induktion erzeugen können. Daher sind CB1-Zellen geeignet in vivo die Aktivierung von jungfräulichen T-Lymphocyten zu induzieren. Die erfindungsgemäßen Zell-Linien weisen verschiedene Vorteile auf, die sie besonders wertvoll machen.
Beispielsweise können CB1-Zellen verwendet werden, um ex vivo Antigenspezifische T-Lymphocyten zu stimulieren. Ein weiteres Beispiel ist die Möglichkeit diese Zellen in einen Organismus einzuführen, um T-Lymphocyten in vivo zu stimulieren. Das Antigen kann gleichzeitig oder getrennt verabreicht werden oder im Falle von Pathogenen schon in dem Organismus vorhanden sein. Ein weiterer Vorteil von CB1-Zellen liegt darin, daß das Antigen in vitro vor der Einführung der Zellen in vivo beladen werden kann, wodurch eine wesentlich begrenztere Anzahl an Antigen ermöglicht wird oder die in vitro Verarbeitung des Antigens ermöglicht wird, ohne daß es notwendig ist es in vivo als lösliches Protein zu injizieren.
Ein weiterer Vorteil dieser Zell-Linien liegt darin, daß sie verwendet werden können, eine Immunantwort zu induzieren, die sich von der unterscheidet, die durch direkte Injektion des Antigens allein oder zusammen mit einem oder mehreren Adjuvantien erhalten wird; insbesondere können diese Zell-Linien verwendet werden, um T-Helfer-Lymphocyten Untergruppen zu induzieren, wie die TH1- und TH2-Subpopulationen.
Das molekulare Klonen des Provirus hat den Vorteil, daß es Modifikationen durch genetische Konstruktion ermöglicht und als retroviraler Vektor verwendet werden kann.
Die erfindungsgemäßen Zell-Linien können zur Isolierung von Komponenten oder Produkten eingesetzt werden, die üblicherweise nicht erhalten werden können, aufgrund des limitierten Anteils an APC, insbesondere DC in Organen, in denen diese Zellen festgestellt wurden.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Die in den Beispielen verwendeten Zellen sind entweder handelsüblich oder werden in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Die Zellen wurden allgemein in RPMI kultiviert, das 2mM β-Mercaptoethanol, 10% durch Hitze inaktiviertes Kälberserum enthielt und bei 37ºC in feuchter Atmosphäre mit einem Gehalt von 5% CO&sub2; gehalten wurde.

Rekombinante DNA-Methoden

Falls verfügbar, wurden Reagentien analytischen Grades verwendet. Falls nicht anders angegeben, wurden flüssige und feste Kulturmedien hergestellt nach Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. (1982), im folgenden als "Maniatis" bezeichnet.

Immunologische Analysetechniken

Es wurden Reagentien analytischen Grades verwendet. Falls nicht anders angegeben, wurden die Medien für die Zellkulturen, die Puffer und Waschlösungen sowie die anderen verwendeten Methoden durchgeführt nach Coligan J. E. et al., "Current Protocols in Immunology" 1992 (J. Wiley and Sons Inc.; Media, PA-USA), im folgenden als "Coligan" bezeichnet.

Beispiel 1

Eine genome DNA-Bibliothek der N 11-Zell-Linie in pUC 18-Plasmid wurde nach bekannten Methoden hergestellt (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. (1982)). Die Methoden für das Screening der Bibliothek und für die Herstellung der Proben durch Nick-Translation sind bekannt und in Maniatis et al. beschrieben. Das Ligationsprodukt der genomen DNA-Fragmente, erzeugt durch Digestieren mit HindIII und EcoRI und eingeführt in linearisiertes pUC18-Plasmid nach den gleichen Methoden, die zur Transformation von bakteriellen Zellen des HB101 E. coli Stammes verwendet wurden, ergaben die Möglichkeit zur Einarbeitung von hexogenem genetischem Material (Maniatis).
Die Zellen wurden dann in ein festes LB-Agar-Medium eingebracht, das Ampicillin in einer derartigen Verdünnung enthielt, daß einzelne Kolonien voneinander isoliert werden konnten.
Nach 18 Stunden Wachstum bei 37ºC wurden die Kolonien auf Nitrocellulose weiter übertragen (Schleicher und Schuell Co.). Die Filter wurden getrocknet, gewaschen und unter Vakuum bei 70ºC (Maniatis) getrocknet. Die Prehybridisierung, Hybridisierung mit einer markierten Probe, abgeleitet von einem myc-MH&sub2;-Genfragment, enthalten in dem pMH2Hd-Plasmid, wurden nach Maniatis durchgeführt.
Nach einer geeigneten Wäsche wurden die Filter getrocknet und mit Röntgenstrahlenfilmen belichtet, die nach 12-24 Stunden entwickelt wurden. Nach diesem Screening wurden die Kolonien, die sich auf zwei Filtern in identischer Position befanden, isoliert und auf LB-Agar-Medium aufgebracht, das Ampicillin enthielt, so daß Kolonien erhalten wurden, die sich bestimmt von einer einzelnen transformierten Zelle herleiteten.
Diese Kolonien wurden anschließend einem zweiten Selektionszyklus unterworfen, der gleich dem zuerst beschriebenen war. Praktisch alle Kolonien ergaben ein positives Signal in dem zweiten Screening-Zyklus. Eine davon wurde für weitere Untersuchungen verwendet und als p316 bezeichnet.
Die Probe wurde vollständig nach Sanger unter Verwendung üblicher Reagentien und den Anweisungen des Herstellers sequenziert.

Beispiel 2 - Herstellung einer den retroviralen Vektor MIB-psi2-N11 produzierenden Linie

Das Virus VN11-Genom, geklont in Plasmid p316, wurde mit dem Neogen, das sich von Transposon TN5 ableitete und Widerstandsfähigkeit gegen das Neomycinanaloge G418 zeigte, in die Zell-Linie psi co-transfektiert. Diese Linie ist geeignet infektiöse Viralteilchen bei Transformation mit einem exogenen genetischen Material zu bilden, das Informationen in trans für den Einschluß des RNA, erzeugt in dem viralen Teilchen, enthält. Die transformierten Klone wurden zunächst nach der Wachstumskapazität in Anwesenheit von G418-Antibiotikum und anschließend auf die Anwesenheit der genomischen RNA, kodiert durch das VN11 Pro-Virus unter Verwendung einer für das v-myc-MH2-Gen spezifischen Probe, selektiert. Der so erhaltene retrovirale Vektor wurde als MIBH-psi2-N11 bezeichnet.

Beispiel 3 - Erzeugung von dendritischen Zell-Linien

Suspensionen von Milzzellen wurden aus neugeborenen DBA/2- oder BALB/C- Mäusen (Charles River, Italien) durch Lyse von Erytroid-Zellen in Ammoniumchlorid um Erythrocyten nach bekannten Methoden zu entfernen (Caligan) bereitet: Die Zellen wurden dann in RPMI-1640 (Sigma), supplementiert mit 10% FCS (GIBCO), Glutamin, Penicillin, Streptomycin und 0,5 mM β-Mercaptoethanol suspendiert und mit einer Dichte von 106/ml in 35 mm Petri-Schalen platt aufgetragen. Die Immortalisierung wurde mit dem MIB-psi2- N11 retroviralem Vektor durchgeführt durch Filtrieren an einer 0,22 u sterilen Einheit (Nalgene) der überstehenden Flüssigkeit, die nach 24 Stunden subkonfluenter Kultur der viralen Erzeuger-Zell-Linie, verdünnt 1 : 1 mit vollständigem Medium, enthaltend 10 ug/ml Polybren (Sigma) durchgeführt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;- Inkubator wurde das halbe Volumen an frischem Medium zugesetzt und dann wurde regelmäßig zweimal die Woche gewechselt. Während der ersten Woche nach der Infektion wurden die Zellen mit 10% L929.6C-konditioniertem Medium gefüttert, reduziert auf 5 in den folgenden zwei Wochen und anschließend allmählich eliminiert.
Etwa 20-30 Tage nach der Infektion wurden zahlreiche Foci von sich teilenden Zellen in den Petri-Schalen festgestellt. Es wurde davon ausgegangen, daß sich die Zell-Linie nach 20 Passagen etabliert hatte. Nach der Stabilisierung wurden diese Linien in eine Platte mit 96 Vertiefungen unter limitierter Verdünnung eingebracht und geklont.

Beispiel 4 - Northern-Blot-Analyse

Die Northern-Blot-Analyse von mRNAs von CB1-Zellen und einer positiven Kontrolle wurde durchgeführt unter Verwendung einer spezifischen myc-MH2-Probe, die vorstehend beschrieben wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7546, 1991). Die myc MH2 3'-Probe wurde einer Küken-Genom-Bibliothek entnommen und sie stellt das 3'-Gebiet des myc-Gens des Vogels dar, das mit myc-Genen der Maus nicht kreuz-hybridisiert.

Beispiel 5 - Immunhistologische Analyse der dendritischen Zell-Linien

Die Klone CB1 und D2SC/1 wurden detaillierter charakterisiert mit Antikörpern, die spezifisch für Oberflächenmarker sind oder intracellular in den dendritischen Zellen, wie die N418 anti, CD11c und anti B7-Antikörper. Diese Antikörper wurden in den vorstehend genannten Literaturstellen beschrieben und wurden mit Biotin unter Anwendung üblicher Methoden markiert (Coligan). Kurz wurden 10&sup6;-Zellen bei Raumtemperatur während 15 Minuten in PBS, das 10% nicht-immunes Mäuse- oder Rattenserum enthielt, inkubiert. Diese Lösung wurde dann mit dem primären Antikörper, markiert mit Biotin in PBS, enthaltend 0,1% Gew./Vol. BSA (Sigman) substituiert und die Probe wurde 30 Minuten bei 4ºC inkubiert; die Zellen wurden dann dreimal mit PBS, enthaltend 0,1% Gew./Vol. BSA (PBS/BSA) gewaschen und 30 Minuten bei 4ºC mit einer PBS/BSA-Lösung, enthaltend Streptavidin/Phycoeritrin (Boehringer) nach den Anweisungen des Herstellers inkubiert.
Die Zellen wurden anschließend durch Laserpulsströmung cytofluorimetrisch analysiert (FACSort, Beckton & Dickinson); die toten Zellen wurden mittels der Datenanalyse entfernt, wobei sie mit Propidiumiodid vorbehandelt wurden. Vergleich von veröffentlichten dendritischen Milzzell-Oberflächenmarkern mit den CB1- und D2SC/1-Zell-Linien - Fortsetzung -
- negativ
± < 10%
+ 10-50%
++ 50-90%
+++ > 90%
++++ 100%, mittel > 50x über Hintergrund
n. d. nicht festgestellt
AP H-2 untergebundene Antigenpräsentation
* zwei Populationen
Agger R., Crowley M. T. and Witmer-Pack M. D. 1990, Intern. Rev. Immunol. 6: 89-101, Crowley M., Inaba K., Witmer-Pack M. und Steinman R. M. 1989, Cellular Immunology 118: 108-125,
Vremec D., Zorbas M., Scollay R., Saunders D. J., Ardavin C. F., Wu L. und Shortman K. 1992, J. Exp. Med. 176: 47-58.

Beispiel 6 - Immunhistochemische Analyse

Zur Analyse von intracellulären Markern wurden die CB1-Zellen wie vorstehend auf sterilen Gläsern gezüchtet und dann in Aceton während 2 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden dann mit dem ersten Antikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur in PBS, enthaltend 1% nicht-immunes Mäuseserum, inkubiert, dreimal mit PBS/BSA gewaschen und anschließend mit Peroxidase-markierten Mäuseantikörpern gegen Ratten-Igs (2A1-Antikörper) oder gegen Hamster-Igs (M342-Antikörper) inkubiert. Die Zellen wurden dann in Anwesenheit von Diaminobenzidin inkubiert, um ihre positive Natur zu bewerten.

Beispiel 7 - Analyse der stimulatorischen Wirkung von CB1-Zellen in vitro

Der gemischte Lymphocyten-Reaktions-Assay (MLR) wurde durchgeführt unter Anwendung einer Milzzellsuspension, erhalten, wie vorstehend beschrieben, aus allogenen C57BL/6-Mäusen. Dendritische CB1-Zellen oder die Makrophagen-Zell-Linie MT2/1 (P. Ricciardi-Castagnoli et al., 1992. Res. Immunol. 143, 101-106) wurden als stimulierende Zellen durch Vorbehandlung mit 25 ug/ml Mitomycin C während 20 Minuten bei 37ºC in Polystyrol-Teströhrchen verwendet. Nach dem Waschen wurden die stimulierenden Zellen mit vollständigem Medium gewaschen und auf Platten mit 96 Vertiefungen bei abnehmender Dosierung zusammen mit 30000 Zellen/ml von T-Zellen, die von C57BL/6-Mäusen stammten, aufgebracht. Die Zellen wurden in Anwesenheit des kompletten Mediums, das 2 uCi/ml 3H-TdR enthielt, co-kultiviert. Man erhielt T-Zellen aus der Milzzellsuspension durch Reinigung an Nylon-Membran. Die Zellen wurden 72 Stunden unter den vorstehend angegebenen Bedingungen inkubiert, an Glasfilter filtriert und die eingearbeitete Radioaktivität wurde durch einen Flüssigkeits-Scintillations-Zähler (Betaplate, LKB-Wallac) gemessen.
Das Präsentationsassay des Antigens wurde durchgeführt unter Anwendung von sich verringernden Dosierungen, beginnend mit 0,5 uM Walsperma-Myoglobin (SpWMb) bei 10000 Zellen APC (CB1), voraktiviert mit 100 U/ml IFN/γ oder 200 ug/ml mrGM/CSF. Das voraktivierte APC wurde dann mit 10000 Zellen T-T-Hybridoma 13.26.8 der Maus (erhalten von Dr. A. Livingstone, Basel Institut for Immunology, Basel, CH) in flachbödigen Platten mit 96 Vertiefungen co-kultiviert. Nach 24 stündigem Wachstum in Iscove (Sigma)- Medium, das Antibiotika, Glutamin und Betamercaptoethanol, wie vorstehend erwähnt, und 5 % fötales Rinderserum enthielt, wurden 100 ul überstehende Flüssigkeit aus jeder Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen überführt, die Zellen der IL-2-Dependent HT.2-Linie enthielten und im Assay untersucht auf den IL-2-Gehalt nach der beschriebenen Methode (Coligan) unter Verwendung eines kalorimetrischen Assays, basierend auf MTT (Sigma).

Beispiel 8 - Analyse der Fähigkeit von CB1-Zellen T-abhängige Antworten in vivo zu induzieren

CB1-Zellen wurden mit 200 ug/ml FITC (Sigma) oder mit 1 mg/ml DNB5 (2,4- Dinitrobenzolsulfonsäure, Eastman Kodak) 30 Minuten bei 37ºG derivatisiert nach der Methode, beschrieben von Macatonia S. E. et al., Immunology 59, 509-514, 10000 Zellen wurden in ein Volumen von 250 ul HBSS (Sigma) subkutan in den Rücken von syngenen Mäusen injiziert. Nach 5 Tagen wurden Mäuse, injiziert mit derivatisierten Zellen oder mit nicht-derivatisierten Zellen als Kontrolle mit 25 ug FITC oder mit 15 ug DNFB (2,4-Dinitro- 1-fluorbenzol, Sigma) an beiden Seiten jedes Ohres behandelt. Die Ohrdicke wurde mit einem Mikrometer unmittelbar vor der Behandlung und 24, 48 und 72 Stunden nachher gemessen.

Beispiel 9 - Möglichkeit MHC-Varianten von dendritischen Zellen, Deletionsmutanten in den MHC-Genen, zu erhalten

Kultivierte Zellen wurden durch Gammastrahlen mutagenisiert mit Dosierungen im Bereich von 300 bis 1000 rad aus einer Cäsiumquelle und negativ mit Antikörpern vom anti- MHC-Molekültyp I und II selektiert und mit Komplement behandelt.
Nach der Methode, beschrieben von Moretta et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1654-1658, 1987) ist es möglich durch Cytofluorimetrie negative (oder doppelt negative) Varianten für die Expression von MHC-Genen, erhalten nach der Bestrahlung, zu selektieren.
Nach dieser Verfahrensweise war es möglich MHC (negative) dendritische Zell- Linien zu erhalten, die anschließend mit den gewünschten (MHC)-Genen der Klasse I oder II transfektiert werden können. Beispielsweise wurde ein Plasmid, enthaltend die cDNA des Neogens in dendritische Zellen durch Lypofektin transfektiert; zu diesem Zweck wurden 1 · 10&sup6; Zellen in 2 ml Kulturmedium, zu dem eine Lösung, enthaltend 5 ug DNA in 50 ul Kulturmedium zugesetzt war, eingebracht: Nach 16 Stunden wurden 2 ml weiteres Kulturmedium zugesetzt und die Inkubation wurde weitere 48 Stunden durchgeführt, bevor die Selektion der Transfektanten begann.

Brauchbarkeit

Durch die Erfindung werden Möglichkeiten zur Aktivierung von T-Lymphocyten in Antigen-spezifischer Weise sowohl in vivo als auch in vitro bereitgestellt.
Beispielsweise ist es möglich T-Zellen aus dem Organismus zu entfernen, diese spezifisch für ein gewisses Antigen zu stimulieren und sie erneut in den gleichen Organismus einzuführen, um eine Immunantwort auf dieses Antigen zu provozieren. Außerdem können die erfindungsgemäß Zell-Linien mit einem vorgegebenen Antigen sensibilisiert und dann erneut in einen MHC kompatiblen Organismus eingeführt werden. Insbesondere ist die Erfindung geeignet für solche Fälle, in denen die Antigenreinigung schwierig oder kostspielig ist, in Fällen, bei denen der Organismus bei dem eine Immunantwort hervorgerufen werden soll, gefährlich zu handhaben ist oder wenn die Vaccination mit dem gleichen Organismus Nebeneffekte ergibt und darüber hinaus in solchen Fällen, wo es im allgemeinen schwierig ist eine wirksame und langanhaltende Immunantwort zu vermitteln.

Claims

1. Immortalisierte dendritische Zellen, erhältlich durch Transfektion mit einem das v-myc Onkogen enthaltenden retroviralen Vektor.

2. Immortalisierte dendritische Zellen nach Anspruch 1, wobei der retrovirale Vektor durch Cotransfektion von zwei Retroviren erhalten wird, von denen mindestens einer das v-myc Onkogen enthält.

3. Immortalisierte dendritische Zellen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das v-myc Onkogen mit einem Teil fusioniert ist, das für ein retrovirales Glycoprotein codiert.

4. Immortalisierte dendritische Zellen nach Anspruch 3, wobei der onkogenische retrovirale Vektor aus der murinen Makrophagen-Zellinie N11 erhalten wird, die bei ECACC unter der Nr. 93051207 hinterlegt wurde.

5. Immortalisierte dendritische Zellen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der onkogenische retrovirale Vektor aus "Verpackungs"-Zellinien stammt.

6. Immortalisierte dendritische Zellen nach Anspruch 5, wobei der onkogenische retrovirale Vektor aus psi2-Zellen stammt, die mit dem VN11- Virus der N11-Zellinie transfiziert wurde.

7. Immortalisierte dendritische Zellen nach einem der vorstehenden Ansprüche, die dendritische Zellen aus Knochenmark, peripherem Blut, Epidermis (Langerhans-Zellen), follikulären und intestinalen dendritischen Zellen aus germinalen Zentren und ineinandergreifenden DC der lymphoiden Organe sind.

8. Verfahren zur Immortalisierung dendritischer Zellen, umfassend die Transfektion primärer Kulturen von dendritischen Zellen mit einem retroviralen Vektor, der das v-myc Onkogen enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der onkogenische retrovirale Vektor aus der murinen Makrophagen-N11-Zellinie erhalten wird, die bei ECACC unter der Nr. 93051207 hinterlegt wurde.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Transfektion durch Cokultivierung dendritischer Zellen mit "Verpackungs"-Zellinien erzielt wird, die mit dem von der N11-Zellinie produzierten VN11-Virus transfiziert wurden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die "Verpackungs"-Zellinie die psi2-Linie ist.

12. Verwendung dendritischer Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Aktivierung von T-Zellen des Immunsystems auf Antigen-spezifische und MHC-beschränkte Weise.

13. Verwendung dendritischer Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur anschließenden Transfektion mit spezifischen MHC-Genen zur Aktivierung von T-Zellen des Immunsystems auf Antigen-spezifische und MHC- beschränkte Weise.