DE69334042T2

DE69334042T2 - Diagnostisches Gerät

Info

Publication number: DE69334042T2
Application number: DE1993634042
Authority: DE
Inventors: Kenneth Francis San Diego Buechler
Original assignee: Biosite Inc
Current assignee: Alere San Diego Inc
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-20
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2013-05-21
Also published as: DE69334042D1; ATE219967T1; WO1993024231A1; EP0596104A1; JPH06509424A; JP3451088B2; US5458852A; EP1175940A1; DE69332072T2; CA2113198A1; DE69332072D1; EP0596104B1; EP1733792A1; AU4596593A; EP1175940B1; CA2113198C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen zum Durchführen von Nachweisverfahren, so genannten Assays, einschließlich qualitativen, semiquantitativen und quantitativen Bestimmungen von ein oder mehr Analyten in einem einzigen Testformat. Im Gegensatz zu Assay-Vorrichtungen des Stands der Technik erfordern die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtungen nicht die Verwendung von saugfähigen Materialien, wie Papier oder Membranen. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung stützen sich auf die Verwendung von festgelegten Oberflächen, einschließlich gerillten Oberflächen, und Kapillarität allein oder in verschiedenen Kombinationen, um die Testreagenzien zu bewegen. Die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtungen geben Mittel für die gesteuerte, zeitlich festgelegte Bewegung von Reagenzien innerhalb der Vorrichtung an die Hand und erfordern keine präzisen Pipettierschritte. Die Konzepte und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind bei der Durchführung von Immunassays von Umwelt- und Gewerbefluiden wie Wasser und von biologischen Fluiden und Erzeugnissen wie Urin, Blut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit und Fruchtwasser und dergleichen besonders brauchbar.
Hintergrund der Erfindung
Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche vereinfachte Testsysteme zum schnellen Detektieren des Vorhandenseins eines interessierenden Zielliganden in biologischen, Umwelt- und Gewerbefluiden entwickelt. In einer ihrer einfachsten Formen erfordern diese Assay-Systeme und -Vorrichtungen für gewöhnlich die Kombination eines Testreagens, das mit dem Zielliganden reagieren kann, um eine visuelle Reaktion zu liefern, und ein Saugpapier oder eine Membran, durch welche die Testreagenzien strömen. Für die saugfähigen Materialien der Vorrichtungen werden häufig Papiererzeugnisse, Glasfasern und Nylon verwendet. In bestimmten Fällen wird der Teil des Saugelements, der die Testreagenzien enthält, entweder physikalisch oder durch Kapillarität mit der Probe in Kontakt gebracht, die den Zielliganden enthält. Der Kontakt kann auf vielerlei Weise hergestellt werden. Am häufigsten lässt man eine wässrige Probe ein poröses oder saugfähiges Element, wie poröses Polyethylen oder Polypropylen oder Membranen, durch Kapillarität durch den Teil des porösen oder saugfähigen Elements durchfließen, der die Testreagenzien enthält. In anderen Fällen werden die Testreagenzien außerhalb der Testvorrichtung vorgemischt und dann dem saugfähigen Element der Vorrichtung zugegeben, um schließlich ein Signal zu erzeugen.
US 4,426,451 offenbart eine Assay-Vorrichtung nach dem Oberbegriff von Anspruch 1.
Handelsübliche diagnostische Erzeugnisse setzen eine Konzentrierungszonenmethodologie ein. Bei diesen Erzeugnissen, beispielsweise ICON^R (Hybritech Incorporated), TESTPACK^TM (Abbott Laboratories) oder ACCULEVEL^R (Syva Corporation) enthält die Vorrichtung eine immunsorbierende oder anlagernde Zone innerhalb eines porösen Elements, an der ein Element eines spezifischen Bindungspaars immobilisiert wird. Die Oberfläche des porösen Elements kann auch behandelt werden, um ein oder mehrere Elemente eines Signalentwicklungssystems zu enthalten. Bei diesen Vorrichtungen gibt es eine Flüssigkeit absorbierende Zone, die zum Saugen von Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone, zum Absorbieren der flüssigen Probe und Reagenzien und zum Steuern der Rate, bei der die Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone gesaugt wird, dient. Die Flüssigkeit absorbierende Zone ist entweder ein zusätzliches Volumen des porösen Elements außerhalb der immunsorbierenden Zone oder ein saugfähiges Material in Kapillarverbindung mit der immunsorbierenden Zone. Viele handelsüblichen Vorrichtungen und Assay-Systeme erfordern auch einen Waschschritt, bei dem die immunsorbierende Zone frei von einem nicht spezifisch gebundenem Signalgenerator gewaschen wird, so dass das Vorhandensein bzw. die Menge des Zielliganden in der Probe durch Prüfen des porösen Elements auf ein Signal an der entsprechenden Zone ermittelt werden kann.
Die hierin beschriebenen Vorrichtungen verwenden keine saugfähigen oder porösen Materialien wie Membranen und dergleichen als Substrate für die Immobilisierung von Reagenzien oder zur Steuerung des Strömens der Reagenzien durch die Vorrichtung. Ein Nachteil von zum Beispiel Membranen bei diagnostischen Vorrichtungen ist, dass sowohl in mikroskopischer als auch makroskopischer Größenordnung die Erzeugung von Membranen nicht leicht reproduzierbar ist. Dies kann zu diagnostischen Vorrichtungen führen, die verschiedene Eigenschaften der nicht spezifischen Bindungs- und Flusseigenschaften aufweisen. Die so genannten Time Gates oder Zeitgatter dieser Erfindung können aber in Membranen eingebettet oder in Vorrichtungen mit Membranen verwendet werden. Membranen sind sehr anfällig für nicht spezifische Bindung, die die Empfindlichkeitsgrenze des Assay anheben kann. Bei immunochromatographischen Assay-Formaten, wie sie beispielsweise in den U.S. Pat. Nr. 4,879,215, 4,945,205 und 4,960,691 beschrieben werden, erfordert die Verwendung von Membranen als Diagnoseelement ein gleichmäßiges Strömen von Reagenzien durch die Membran. Das Problem ungleichmäßigen Strömens von Assay-Reagenzien bei immunochromatographischen Assays wurde in den U.S. Patenten 4,756,828, 4,757,004 und 4,883,688 angegangen, die hiermit durch Erwähnung Bestandteil dieser Anmeldung werden. Diese Patente lehren, dass das Abwandeln der Längskante des saugfähigen Materials die Form der vorrückenden Front steuert. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung umgehen diese membranbedingten Probleme durch die Verwendung von festgelegten Oberflächen, einschließlich gerillten Oberflächen, von Kapillarität, Zeitgattern, neuartigen Kapillarmitteln, einschließlich Kanälen, und neuartigen Flüssigkeitsströmungssteuermitteln allein oder in verschiedenen Kombinationen, die allesamt aus nicht absorbierenden Materialien gefertigt sind. In einer bevorzugten Ausführung dieser Erfindung besteht der Kapillarkanal des Diagnoseelements aus Nuten, die senkrecht zur Strömung der Assay-Reagenzien sind. Die Herstellung von gerillten Oberflächen kann durch Spritzgießen verwirklicht werden und kann hinreichend reproduzierbar sein, um das Steuern des Strömens von Reagenzien durch die Vorrichtung vorzusehen.
Neben den Beschränkungen der Assay-Vorrichtungen und Systeme des Stands der Technik, einschließlich der Beschränkungen der Verwendung saugfähiger Membranen als Träger für Probe und Reagenzien, erfordern Assay-Vorrichtungen im Allgemeinen zahlreiche Schritte, einschließlich kritischer Pipettierschritte, die durch relativ erfahrene Bediener in einer Laborumgebung ausgeführt werden müssen. Dementsprechend besteht Bedarf nach einstufigen Assay-Vorrichtungen und -Systemen, die neben dem Steuern des Strömens der Reagenzien in der Vorrichtung die Zeitpunkte des Strömens von Reagenzien bei spezifischen Bereichen der Vorrichtung steuern. Daneben besteht Bedarf nach Assay-Vorrichtungen, die keine kritischen Pipettierschritte erfordern, aber dennoch semiquantitative und quantitative Bestimmungen durchführen. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung erfüllen diese und andere Anforderungen durch Vorstellen von Vorrichtungen, die keine präzise Pipettierung der Probe erfordern, die keine saugfähigen Elemente verwenden, die als Zeitgatter bezeichnete neuartige Elemente für die gesteuerte Bewegung von Reagenzien in der Vorrichtung aufweisen und die quantitative Assays ermöglichen können.
Erfindungsgemäß wird eine Assay-Vorrichtung zum Detektieren mindestens eines Zielliganden in einer Fluidprobe an die Hand gegeben, wobei die Assay-Vorrichtung umfasst: a. einen Probenzugabebehälter; b. ein Zeitgatter für das Verzögern des Strömens von Fluid; und c. ein Diagnoseelement mit einem Rezeptor daran für den Zielliganden zum Immobilisieren des mindestens einen Zielliganden in mindestens einer Zone, wobei die Assay-Vorrichtung so ausgelegt und angeordnet ist, dass die Fluidprobe von dem Probenzugabebehälter zu dem Zeitgatter zu dem Diagnoseelement strömt, und dadurch gekennzeichnet, dass das Zeitgatter mindestens eine hydrophobe Zone umfasst, die ein Strömen zu der mindestens einen Zone verzögert, bis die hydrophobe Zone durch Binden einer Komponente oder von Komponenten in dem zum Zeitgatter vordringenden Fluid ausreichend hydrophil gemacht ist.
Begriffserläuterung
Bei der Interpretation der Ansprüche und Beschreibung haben die folgenden Begriffen die nachstehend genannten Bedeutungen.

Zielligand – der Bindungspartner an einem oder mehreren Rezeptoren.
Ligand – Bindungspartner an einem Ligandenrezeptor.
Ligandenanalog – ein chemisches Derivat des Zielliganden, das entweder kovalent oder nicht kovalent an einer anderen Spezies gebunden werden kann, zum Beispiel am Signalentwicklungselement. Ligandenanalog und Zielligand können gleich sein und können beide fähig sein, am Rezeptor anzubinden.
Ligandenanalogkonjugat – ein Konjugat aus einem Ligandenanalog und einem Signalentwicklungselement;
Signalentwicklungsphase – die Phase, die die Materialien enthält, die das Signalentwicklungselement zum Entwickeln eines Signals einbeziehen, z.B. eine Enzymsubstratlösung.
Rezeptor – chemische oder biochemische Spezies, die mit Zielliganden, typischerweise einem Antikörper, einem Bindungsfragment, einer komplementären Nucleotidsequenz oder einem Chelat, reagieren oder an diesem anbinden kann, aber ein Ligand sein kann, wenn der Assay dafür ausgelegt ist, einen Zielliganden zu detektieren, der ein Rezeptor ist. Rezeptoren können auch Enzyme oder chemische Reagenzien umfassen, die speziell mit dem Zielliganden reagieren.
Ligandenrezeptorkonjugat – ein Konjugat aus einem Ligandenrezeptor und einem Signalentwicklungselement.
Signalentwicklungselement – das Element, das direkt oder indirekt ein visuell oder instrumentell detektierbares Signal als Resultat des Assay-Prozesses bewirkt. Rezeptoren und Ligandenanaloge können entweder kovalent oder nicht kovalent an dem Signalentwicklungselement gebunden sein, um ein Konjugat zu bilden. Das Element des Ligandenanalogkonjugats oder des Rezeptorkonjugats, das in Verbindung mit der Signalentwicklungsphase das detektierbare Signal entwickelt, z.B. ein Enzym.
Reaktionsgemisch – das Gemisch einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den Zielliganden enthält, und der Reagenzien zum Ermitteln des Vorhandenseins oder der Menge des Zielliganden in der Probe, zum Beispiel des Ligandenanalogkonjugats oder des Rezeptorkonjugats. Das Reaktionsgemisch, so wie es hier verwendet wird, kann eine proteinartige Komponente, die das Ziel sein kann, eine Komponente der Probe oder den Zusatz (z.B. Serumalbumin, Gelatine, Milchproteine) enthalten.
Ligandenkomplement – ein spezialisierter Ligand, der beim Markieren von Ligandenanalogkonjugaten, Rezeptoren, Ligandenanalogkonstrukten oder Signalentwicklungselementen verwendet wird.
Ligandenkomplementrezeptor – ein Rezeptor für Ligandenkomplement.
Ligandenanalog-Ligandenkomplement-Konjugat – ein Konjugat bestehend aus einem Ligandenanalog, einem Ligandenkomplement und einem Signalentwicklungselement.
Anlagerungsleistungsfähigkeit – die Bindungsleistungsfähigkeit der Komponente oder Komponenten in dem Reaktionsgemisch, beispielsweise des Ligandenanalogkonjugats oder des Rezeptorkonjugats, an der Anlagerungszone des Diagnoseelements.
Anlagerungszone – der Bereich an dem Diagnoseelement, der mindestens eine Komponente des Reaktionsgemisches bindet, beispielsweise das Ligandenanalogkonjugat oder das Rezeptorkonjugat.
Kapillarität – der Zustand der Kapillarität oder das Aufweisen von Kapillarwirkung. Kapillarität kann durch die feste Oberfläche oder die flüssige Oberfläche oder beide beeinflusst werden.
Biosensor – eine elektrochemische, optische, elektrooptische oder akustische/mechanische Vorrichtung, die zum Messen des Vorhandenseins oder der Menge von Zielliganden dient. Zum Beispiel nutzen elektrochemische Biosensoren potenziometrische und amperometrische Messungen, optische Biosensoren nutzen Absorbanz, Fluoreszenz, Lumineszenz und abfallende Wellen.

Akustische/mechanische Biosensoren nutzen piezoelektrische Kristallresonanz, akustische Oberflächenwellen, Feldeffekttransistoren, chemische Feldeffekttransistoren und Enzymfeldeffekttransistoren. Biosensoren können ebenfalls Änderungen der physikalischen Eigenschaften von Lösungen detektieren, in denen Rezeptorbindungsvorgänge stattfinden. Biosensoren können zum Beispiel Änderungen des Grads der Agglutination von Latexpartikeln bei Binden von Antigen detektieren oder können Änderungen der Viskosität von Lösungen als Reaktion auf Rezeptorbindungsvorgänge detektieren.
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine teilweise schematische, perspektivische Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
1a ist eine teilweise schematische, perspektivische explodierte Ansicht der Vorrichtung, die das Detail im Bereich des Probenzugabebehälters, der Probenreaktionsbarriere, der Reaktionskammer, des Zeitgatters und des Anfangs des Diagnoseelements zeigt.
1b ist eine teilweise schematische, perspektivische explodierte Ansicht der Vorrichtung, die das Detail im Bereich des optionalen Reagensbehälters, des Probenzugabebehälters, der Probenreaktionsbarriere, der Reaktionskammer, des Zeitgatters und des Anfangs des Diagnoseelements zeigt.
1c ist eine teilweise schematische, perspektivische explodierte Ansicht der Vorrichtung, die das Detail im Bereich des optionalen Reagensbehälters in Fluidkontakt mit dem Probenzugabebehälter und der Reaktionskammer zeigt.
1d ist eine teilweise schematische, perspektivische freigeschnittene Ansicht des Strömungsteuerungsmittels.
2 ist eine teilweise schematische, perspektivische Ansicht einer zweiten erfindungsgemäßen Vorrichtung, die zum Zugeben von vorgemischten Reaktionsgemischen verwendet werden kann.
3 ist eine teilweise schematische Draufsicht auf das Diagnoseelement, die einige mögliche Anordnungen von Anlagerungszonen zeigt.
4 ist eine teilweise schematische, perspektivische Ansicht eines Behälters für verbrauchtes Reagens.
5 ist eine teilweise schematische Ansicht von Ausführungen dieser Vorrichtungen, die säulenförmig sind oder gebogene gegenüberliegende Flächen aufweisen.
6 ist eine Draufsicht auf Zeitgatter.
7 zeigt typische Maße für ein bevorzugtes Zeitgatter.
8 ist eine Draufsicht auf sequentielle Zeitgatter.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die Assay-Vorrichtungen, Assay-Systeme und Vorrichtungskomponenten dieser Erfindung umfassen mindestens zwei gegenüberliegende Flächen, die eine Kapillarstrecke voneinander entfernt angeordnet sind, wovon mindestens eine mindestens einen Zielliganden oder ein Konjugat in einer Menge immobilisieren kann, die mit dem Vorhandensein oder der Menge des Zielliganden in der Probe aus einer Fluidprobe in einer Zone für gesteuerte Fluidbewegung zu, durch oder weg von der Zone in Beziehung steht. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungskomponenten können in herkömmliche Assay-Vorrichtungen mit Membranen integriert werden oder können in den erfindungsgemäßen hierin beschriebenen und beanspruchten membranlosen Vorrichtungen verwendet werden. Diese Komponenten umfassen Strömungssteuerungselemente, Messelemente, Zeitgatter, Elemente zum Eliminieren von Pipettierschritten und im Allgemeinen Elemente für die gesteuerte Strömung, Zeitsteuerung, Zufuhr, Inkubation, Trennung, Waschung und andere Schritte des Assay-Prozesses.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf diagnostische Testvorrichtungen zum Ermitteln des Vorhandenseins oder der Menge von mindestens einem Zielliganden gerichtet. 1 zeigt eine bevorzugte Ausführung einer Vorrichtung 10 gemäß der Erfindung. Im Allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Vorrichtungen Dicken von etwa 2 mm bis 15 mm, Längen von etwa 3 cm bis 10 cm und Breiten von etwa 1 cm bis 4 cm. Die Maße können abhängig vom jeweiligen Zweck des Assay angepasst werden. Eine in 1 gezeigte Vorrichtung dieser Erfindung zeigt allgemein einige Merkmale der erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Teile von Vorrichtungen, die hierin offenbart und beansprucht werden. Die Vorrichtung 10 umfasst verschiedene Elemente, eine Probenzugabezone 1, einen Probenzugabebehälter 2, eine Probenreaktionsbarriere 3, eine Reaktionskammer 4, ein Zeitgatter 5, ein Diagnoseelement 6 und einen Behälter 7 für verbrauchtes Reagens. Die Vorrichtungen bestehen aus Kapillarkanälen, die ausgebildet werden, wenn ein oberes Element 8 auf das untere Element 9 bei einer Kapillarstrecke voneinander entfernt gesetzt wird, und die die Reagenzien und die Probe in der ganzen Vorrichtung bewegen. Das obere und das untere Element können gekoppelt, die verschiedenen Kammern abgedichtet und die Kapillaren durch eine Reihe von Verfahren gebildet werden, einschließlich aber nicht ausschließlich Kleben, Ultraschallschweißen, Vernieten und dergleichen. Die Elemente der Vorrichtung können in verschiedenen Kombinationen mit dem Diagnoseelement 6 verwendet werden, um eine Vielzahl von erwünschten Funktionen zu verwirklichen. Wie ein Fachmann erkennen wird, können diese Elemente kombiniert werden, um ein- oder mehrstufige Assays auszuführen. Die Vorrichtungen 10 können auch bei der Bildung von Reaktionsgemischen für den Assay-Prozess verwendet werden. Die Vorrichtung 20 in 2 kann verwendet werden, um vorgemischte Reaktionsgemische zur Erzeugung eines Signals, das das Vorhandensein oder die Menge des Zielliganden betrifft, zuzugeben.
Eine optionale Reagenskammer 17 kann wie in 1b und 1c dargestellt in die Vorrichtung 10 oder 20 integriert werden. Die Vorrichtungen 10 und 20 können auch mit einem optionalen Fluidsteuermittel 18, das in 1d gezeigt wird, verwendet werden.
Die Merkmale umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt: 1) Diagnoseelemente, die nicht aus saugfähigen Materialien bestehen, wie Membranen, 2) Mittel zum Steuern des Volumens der Probe oder des Reaktionsgemisches, 3) Zeitgatter, 4) neuartige Kapillarmittel, die hierin als Finger bezeichnet werden, und 5) neuartige Strömungssteuermittel, die hierin manchmal als „Spalt" bezeichnet werden, und 6) einen Behälter für verbrauchtes Reagens, der ein Zurückströmen von Reagenzien verhindert. Der Fachmann wird erkennen, dass diese Elemente einzeln neuartig und nicht nahe liegend sind und in verschiedenen Kombinationen in Diagnosevorrichtungen integriert und mit anderen Elementen verwendet werden können, die dem Fachmann bekannt sind, um neuartige und nicht nahe liegende Diagnosetestvorrichtungen und bisher nicht erreichte Vorteile zu verwirklichen.
Jedes der Elemente der Vorrichtungen 10 und 20 wird einzeln beschrieben, dann folgen repräsentative Beschreibungen der erfindungsgemäßen Vorrichtungen.
Probenzugabezone
Unter Bezug auf 1 und 2 ist die Probenzugabezone 1 der Vorrichtungen 10 und 20 der Bereich, in dem die Probe in die Vorrichtung eingebracht wird. Die Probenzugabezone 1 kann eine Öffnung verschiedener Konfigurationen sein, d.h. rund, länglich, quadratisch und dergleichen, oder die Zone kann eine Mulde in der Vorrichtung sein.
Probenzugabebehälter
Unter Bezug auf 1 und 2 ist der Probenzugabebehälter 2 ein Element der Vorrichtung, das die Probe aufnimmt. Unter Bezug nun auf 1 sollte das Volumen des Probenzugabebehälters 2 mindestens das Volumen der Reaktionskammer 4 oder mehr sein. Der Probenzugabebehälter 2 kann ein Kapillarraum sein oder er kann eine offene Mulde sein. Ferner kann ein Filterelement in oder an dem Probenzugabebehälter 2 platziert werden, um suspendierte Partikel aus der Probe zu filtern oder Blutkörperchen aus Blut zu filtern, so dass sich Plasma weiter durch die Vorrichtung bewegen kann. In einer bevorzugten Ausführung ist das Volumen oder die Kapazität des Probenzugabebehälters 2 um das 1- bis 5-fache größer als das Volumen der Reaktionskammer 4. Im Allgemeinen wählt man ein Volumen oder eine Kapazität dieses Behälters 2 so, dass bei Verwenden der überschüssigen Probe zum Waschen des Diagnoseelements 6 dann genügend Volumen der Probe erforderlich ist, um ungebundene Reagenzien aus dem Diagnoseelement 6, die durch den Assay-Prozess entstehen, gründlich zu entfernen. Dieser Behälter 2 kann auch bestimmte getrocknete Reagenzien enthalten, die in dem Assay-Prozess verwendet werden. Zum Beispiel kann ein grenzflächenaktiver Stoff in diesem Behälter 2 getrocknet werden, der sich dann auflöst, wenn die Probe zugegeben wird. Der grenzflächenaktive Stoff in der Probe würde die Bewegung der Probe und des Reaktionsgemisches durch die Vorrichtung durch Absenken der Oberflächenspannung der Flüssigkeit unterstützen. Der Probenzugabebehälter 2 steht allgemein in direktem Fluidkontakt mit der Probenreaktionsbarriere 3 (1) oder dem Diagnoseelement 6 (2).
Probenreaktionsbarriere
Wie in 1 dargestellt trennt die Probenreaktionsbarriere 3 die Probe in dem Probenzugabebehälter 2 von dem Reaktionsgemisch in der Reaktionskammer 4. Die Probenreaktionsbarriere ist erwünscht, da sie der Vorrichtung die Fähigkeit zur Bildung eines exakten Reaktionsgemischvolumens verleiht. Ein exaktes Volumen des Reaktionsgemisches ist allgemein für Assays erforderlich, bei denen semiquantitative oder quantitative Ergebnisse erwünscht sind. Somit ist ein präziser Pipettierschritt der Probe zur Vorrichtung nicht erforderlich, da die Probenreaktionsbarriere eine Reaktionskammer exakten Volumens bildet, in die die Probe strömen kann. Die Probenreaktionsbarriere 3 ist erwünscht, da Reaktionen, die in der Reaktionskammer 4 stattfinden, bevorzugt von der überschüssigen Probe in dem Probenzugabebehälter 2 getrennt werden sollten. Die Probenreaktionsbarriere 3 umfasst eine schmale Kapillare, die allgemein von etwa 0,01 mm bis 0,2 mm reicht, und die Oberflächen der Kapillare können glatt sein oder eine einzige Nut oder eine Reihe von Nuten aufweisen, die parallel oder senkrecht zur Strömung der Probe sind. In einer bevorzugten Ausführung der Probenreaktionsbarriere 3 werden nun unter Verweis auf 1a Nute 12, die parallel zur Strömung der Probe sind, an einer Oberfläche der Vorrichtung bei einem Kapillarabstand, zum Beispiel 0,02 mm bis 0,1 mm, von der anderen Oberfläche integriert. Das Volumen der Probe, die die Probenreaktionsbarriere 3 (1a) füllt, sollte bei einem Minimum von etwa 0,01 % bis 10% des Volumens der Reaktionskammer 4 gehalten werden, so dass die Reagenzien der Reaktionskammer nicht signifikant zurück in die Probe in dem Probenzugabebehälter 2 diffundieren. D.h. die Diffusion des Reaktionsgemisches zurück in die überschüssige Probe sollte minimal gehalten werden, damit die in dem Reaktionsgemisch eintretenden chemischen oder biochemischen Reaktionen nicht wesentlich von der überschüssigen Probe in dem Probenzugabebehälter 2 beeinflusst werden. Nuttiefen können von etwa 0,01 mm bis 0,5 mm und bevorzugt von etwa 0,05 mm bis 0,2 mm reichen. Wird mehr als eine Nut für dieses Element verwendet, liegt die Anzahl an Nuten in diesem Element typischerweise bei 10 bis 500 Nuten pro cm und bevorzugt bei etwa 20 bis 200 Nuten pro cm. Eine Probe von dem Probenzugabebehälter 2 strömt durch Kapillarwirkung über die Nuten 12 und dann in die Reaktionskammer 4. In einer weiteren bevorzugten Ausführung sind die Nuten, die nachstehend als „Finger" 16 bezeichnet werden, in der Wand der Reaktionskammer 4 in Fluidkontakt mit den Nuten 12 oder dem Kapillarraum der Probenreaktionsbarriere 3 positioniert. Diese Finger 16 sind typischerweise 0,5 mm bis 2 mm breit, bevorzugt 1 mm bis 1,5 mm breit und typischerweise 0,1 mm bis 1,5 mm tief, bevorzugt etwa 0,2 mm bis 1 mm tief. Die Finger 16 in der Wand der Reaktionskammer 4 unterstützen das kapillare Strömen der Probe in die Reaktionskammer 4. D.h. die Finger lassen Fluid von einer Kapillare, in der die Kapillarität relativ hoch ist, zu einer Kapillare, in der die Kapillarität niedriger ist, bewegen. Somit ist die Kapillare an der Probenreaktionsbarriere allgemein schmäler und weist eine größere Kapillarität als die Kapillare oder der Raum der Reaktionskammer auf. Diese Kapillaritätsdifferenz kann bewirken, dass das Strömen von Probe oder Fluid in der Vorrichtung in der Probenreaktionsbarrierenkapillare stoppt. Vermutlich brechen die Finger die Oberflächenspannung des Fluids an der Grenzfläche der beiden Kapillaren oder Räume auf und veranlassen dadurch das Fluid, sich in eine Kapillare oder einen Raum niedrigerer Kapillarität zu bewegen.
Man kann verstehen, dass die Nützlichkeit der Finger auf jeden Teil der Vorrichtung ausgedehnt werden kann, bei dem Fluid von hoher Kapillarität zu niedriger Kapillarität strömen muss. In der Praxis ist dies für gewöhnlich der Fall, wenn die Richtung des Fluidströmens von einer schmalen Kapillare (höherer Kapillarität) zu einer breiteren Kapillare (niedrigerer Kapillarität) erfolgt. Die obere Oberfläche der Probenreaktionsbarriere kann ebenfalls zum Immobilisieren von im Assay-Prozess verwendeten Reagenzien verwendet werden, so dass die Probe über die Probenreaktionsbarriere strömt, die Reagenzien auflöst und sich in die Reaktionskammer bewegt. Die Bewegung der Probe und der Reagenzien in die Reaktionskammer kann als Mischmittel dienen.
Reaktionskammer
Unter Bezug nun auf 1 bewegt sich die Probe von der Probenreaktionsbarriere 3 in die Reaktionskammer 4. Die Reagenzien der Vorrichtung 10 werden bevorzugt in die Reaktionskammer 4 gegeben, zum Beispiel als getrocknete oder lyophilisierte Pulver, so dass sich bei Eindringen der Probe in die Reaktionskammer 4 die Reagenzien schnell zur ursprünglichen Konzentration lösen. Das Volumen der Reaktionskammer 4 ist das Volumen der Probe, die das Reaktionsgemisch bildet. Die Reaktionskammer kann an 2 Seiten, zum Beispiel durch Ultraschallschweißen des oberen und unteren Elements, abgedichtet werden. Somit erfordert die Zufuhr der Probe zu der Vorrichtung 10 an der Probenzugabezone 1 keinen präzisen Pipettierschritt zur Bildung des Volumens des Reaktionsgemisches. Mischmerkmale, die das Reaktionsgemisch mischen, können ebenfalls in Verbindung mit dem Reaktionskammerelement 4 integriert werden, wie sie zum Beispiel in dem U.S. Pat. Anm. Ser. Nr. 711,621, eingereicht am 5. Juni 1991, beschrieben werden, das hiermit durch Erwähnung Bestandteil dieser Anmeldung wird. Die Probe füllt die Reaktionskammer 4 aufgrund von Kapillarkräften und möglicherweise auch wegen des durch die Probe in dem Probenzugabebehälter 2 ausgeübten hydrostatischen Drucks. Der Boden der Reaktionskammer 4 kann glatt sein oder aus einer gerillten Oberfläche bestehen, um zur Bewegung der Probe in die Reaktionskammer 4 beizutragen. Das Volumen der Reaktionskammer 4 und dadurch des Reaktionsgemisches kann jedes Volumen sein, das die Reagenzien aufnimmt und die erwünschte Empfindlichkeit des Assay liefert. Die Form der Reaktionskammer 4 sollte so sein, dass die Bewegung des Reaktionsgemisches von der Reaktionskammer 4 nicht unruhig ist und dass keine Wirbel infolge der Bewegung aus der Reaktionskammer 4 heraus gebildet werden. Eine bevorzugte Form der Reaktionskammer 4 wird in 1 gezeigt. Die Tiefe der Reaktionskammer 4 sollte proportional zur Breite der Kammer sein, um das erwünschte Reaktionsgemischvolumen aufzunehmen. Die Tiefe der Reaktionskammer kann von etwa 0,05 mm bis 10 mm und bevorzugt von 0,1 mm bis 0,6 mm reichen. Um ein bestimmtes Volumen der Reaktionskammer aufzunehmen, sollten die Länge und die Breite der Reaktionskammer angepasst und die Tiefe so schmal wie praktikabel gehalten werden. Die Reaktionskammer 4 steht mit der Probenreaktionsbarriere 3 und dem Diagnoseelement 6 bzw. dem Zeitgatter 5 in direktem Fluidkontakt. Ferner kann die Reaktionskammer 4 auch in direktem Fluidkontakt mit einem optionalen Reagensbehälter 17 stehen, wie er in 1b und 1c gezeigt wird.
Eine bevorzugte Ausführung der Reaktionskammer nutzt eine Rampe, die sich vom Boden der Reaktionskammer zur Oberfläche des Diagnoseelements erstreckt. Die Rampe minimiert oder verhindert Mischen und Wirbelbildung des Reaktionsgemisches mit der Probe an der Grenzfläche des Reaktionskammer und des Diagnoseelements, wenn sich das Fluid durch die Vorrichtung bewegt. Somit erlaubt die Rampe einen gleichmäßigen Übergang des Fluids aus der Reaktionskammer heraus und auf das Diagnoseelement. Die Länge der Rampe sollte für jede Tiefe der Reaktionskammer optimiert werden, im Allgemeinen weist die Rampe aber einen Winkel von 25 bis 45 Grad zum Boden der Reaktionskammer auf.
Zeitgatter
Unter Bezug auf 1a hält das Zeitgatter 5 das Reaktionsgemisch in der Reaktionskammer 4 eine vorgegebene Zeitdauer lang. Das Konzept des Zeitgatters besteht darin, dass eine überwiegend wässrige Lösung nicht durch eine ausreichend hydrophobe Zone dringen kann, bis die hydrophobe Zone ausreichend hydrophil gemacht wird. Weiterhin wird die hydrophobe Zone durch die Bindung einer Komponente in der wässrigen Lösung an der hydrophoben Zone hydrophil gemacht. Die ausreichend hydrophobe Zone befindet sich allgemein in einem kapillaren Raum. Die Antriebskraft für die Fluidbewegung über oder durch das Zeitgatter kann entweder die Kapillarität des Raums oder der von der Probe ausgeübte hydrostatische Druck oder eine Kombination dieser beiden Kräfte sein. Die Zeitdauer, die zum Halten des Reaktionsgemisches in der Reaktionskammer 4 erforderlich ist, ist relativ zum Assay-Prozess, so dass die Reaktionen, die in der Reaktionskammer 4 infolge des Assay-Prozesses eintreten, das Vorhandensein oder die Menge des Zielliganden in der Probe wiedergeben. Somit verzögert das Zeitgatter 5 das Strömen des Reaktionsgemisches auf das Diagnoseelement 6. Das Zeitgatter 5 verzögert das Strömen des Reaktionsgemisches nach dem Prinzip, dass eine hydrophile Flüssigkeit, beispielsweise eine wässrige Lösung, oder eine Flüssigkeit, die eine Dielektrizitätskonstante von mindestens 40 aufweist, nicht eine ausreichend hydrophobe Barriere in einem Kapillarkanal passieren kann. Bei der Auslegung und beim Bau eines Zeitgatters kann man mit einer hydrophoben Oberfläche beginnen, wie sie sich auf nativen Kunststoffen und Elastomeren (Polyethylen, Polypropylen, Polystyren, Polyacrylate, Siliconelastomere und dergleichen) oder Siliconchipoberflächen oder Metallflächen – entweder glatt, gerillt oder strukturiert – finden, und es wird eine Kapillare durch eine gegenüberliegende Oberfläche gebildet, die von hydrophober oder hydrophiler Art und glatt, gerillt oder strukturiert sein kann. Die hydrophobe(n) Oberfläche(n) in der Kapillare hat/haben eine mikroskopische Flächengröße, an welcher Komponenten binden können, die allgemein in einer überwiegend wässrigen Lösung lösbar sind. Der hydrophile Charakter und die Konzentration der Komponente(n) in dem Reaktionsgemisch und die Gesamtflächengröße des Zeitgatters beeinflussen die Mechanik des Zeitgatters. Die Zeitdauer, über die das Zeitgatter 5 das Reaktionsgemisch hält, steht mit der Rate der Bindung einer Komponente/von Komponenten aus dem Reaktionsgemisch an der hydrophoben Barriere in Verbindung. Die Bindung der Komponente(n) aus dem Reaktionsgemisch verändert die hydrophobe Barriere zu einer Zone, die ausreichend hydrophil ist, über die oder durch die das Reaktionsgemisch strömen kann. Das Erzeugen der ausreichend hydrophilen Oberfläche lässt das Fluid dann strömen, als ob das Zeitgatter gar nicht in der Vorrichtung gewesen wäre. Somit wird ein Fluidströmen durch den Rest der Vorrichtung nicht beeinträchtigt, sobald das Zeitgatter hydrophil gemacht ist. Andere beschriebene Vorrichtungen, die Fluidverzögerungsmittel enthalten, zum Beispiel in den U.S. Patenten Nr. 4,426,451 und 4,963,498, erfordern eine externe Manipulation der Vorrichtung zum Starten des Fluidströmens oder Nutzen der kapillaren Behinderungen zum Verlangsamen des Fluidstroms. In diesem letzteren Fall beeinflusst die zum Verzögern des Fluidströmens verwendete kapillare Behinderung das Fluidströmen durch den Rest der Vorrichtung.
In einer bevorzugten Ausführung kann das Zeitgatter 5 zum Beispiel aus Latexpartikeln 15 (1a, nicht maßstabsgetreu gezeichnet), beispielsweise Polystyrenlatexen mit Durchmessern zwischen etwa 0,01 μm und 10 μm, oder hydrophoben Polymeren, beispielsweise Polypropylen, Polyethylen, Polyestern und dergleichen, bestehen, die in der entsprechenden Zone, in die sich das Reaktionsgemisch bewegen muss, an der Vorrichtung eingebracht werden. In einer anderen bevorzugten Ausführung kann das Zeitgatter durch Anbringen einer hydrophoben Chemikalie, beispielsweise einer Tinte oder ein langkettigen Fettsäure, oder eines hydrophoben Abziehbilds an der gewünschten Zone erzeugt werden. Die hydrophobe Chemikalie bzw. das Abziehbild ist im Allgemeinen in dem Reaktionsgemisch nicht löslich oder schlecht löslich. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführung kann das Zeitgatter auch durch Ändern einer hydrophilen Oberfläche zu einer hydrophoben Oberfläche gebildet werden. Zum Beispiel kann eine durch Plasmabehandlung hydrophil gemachte hydrophobe Oberfläche durch Anwendung von Lösungsmitteln, UV-Licht oder Wärme und dergleichen zurück in eine hydrophobe Oberfläche verwandelt werden. Diese Behandlungen können ein Ändern der Molekülstruktur der hydrophilen plasmamodifizierten Fläche zurück in eine hydrophobe Form bewirken.
Die Komponente(n) in dem Reaktionsgemisch, die an der hydrophoben Zone anbindet/anbinden, können verschiedene Proteine, Polypeptide, Polymere oder Detergenzien sein. Ein bevorzugtes Protein ist Rinderserumalbumin. Die durch das Zeitgatter 5 vorgesehene Zeitverzögerung hängt von der Konzentration der Komponente(n) in dem Reaktionsgemisch, beispielsweise Rinderserumalbumin, ab, das an der hydrophoben Zone anbindet, zum Beispiel der durch die Latexpartikel 15 vorgesehenen Fläche. Eine andere bevorzugte Ausführung des Zeitgatters 5 nützt Polyelektrolyte, die hydrophob sind und unter der Einwirkung der Pufferkapazität des Reaktionsgemisches hydrophil werden. Das Zeitgatter 5 würde zum Beispiel aus Polyacrylsäure bestehen, das in seiner protonierten Form hydrophob ist. Das Reaktionsgemisch würde, wenn es über dem pK_a der Polyacrylsäure gepuffert ist, die Säuregruppen deprotonieren, und das hydrophile Salz des Polymers bilden. In diesem Fall steht die Zeitverzögerung mit der Masse des Polyelektrolyts und dem pH und der Pufferkapazität des Reaktionsgemisches in Beziehung.
Die Geometrie oder Form des Zeitgatters kann die Fläche des Zeitgatters beeinflussen, über oder durch die das Fluid strömen wird. D.h. das Zeitgatter kann so ausgelegt werden, dass es das Strömen von Flüssigkeit durch eine spezifische Fläche des Zeitgatters lenkt. Durch Lenken des Fluids, so dass es durch eine festgelegte Fläche des Zeitgatters strömt, wird die Reproduzierbarkeit der Zeitverzögerung verbessert. 6 zeigt repräsentative Geometrien der Zeitgatter. Wie zum Beispiel in 6, Zeitgatter a–d, gezeigt wird, haben die Zeitgatter V-Formen in ihre Auslegung integriert und im Einzelnen ist die Länge des Zeitgatters (definiert als die Strecke, über oder durch die das Fluid fließen muss, um das Zeitgatter zu passieren) an der Spitze des V kleiner als in dem Körper des Zeitgatters. Somit fließt das Fluid in einer bevorzugten Betriebsart dort über oder durch das Zeitgatter, wo die Länge am kürzesten ist, wodurch der Fluidstrom in einheitlicher Weise durch das Zeitgatter geleitet wird. Allgemein wird die Lenkbarkeit des Fluidstroms über oder durch die Zeitgatter durch entgegengesetzte Pfeile in
6 wiedergegeben. In einer bevorzugten Ausführung ist die Ausrichtung der Zeitgatter b, c und d von 6 so, dass das Fluid statt die V-Form den flachen Teil des Zeitgatters zuerst berührt. Die bevorzugte Strömungsrichtung wird für die Zeitgatter b, c und d von 6 mit anderen Worten durch den Pfeil nach oben wiedergegeben. In Fällen, da das Zeitgatter einfach eine Linie ist, wie zum Beispiel in 6, Zeitgatter e und f ersichtlich, kann die Strecke des Strömens von Fluid über oder durch das Zeitgatter an einem beliebigen Punkt an dem Zeitgatter erfolgen. Somit sind die Zeitgatter bevorzugt, die Geometrien aufweisen, die das Strömen von Fluid über oder durch eine einheitliche Fläche des Zeitgatters lenken. Zum Beispiel erreichen Zeitgatter mit Längen, die von etwa 1,3 mm bis zu 0,13 mm reichen, Verzögerungszeiten von jeweils etwa 0,3 min bis 5,5 min, wenn die Entfernung zwischen den Flächen etwa 0,018 mm beträgt. Wenn das Zeitgatter V-förmig ist, weist die Länge des Zeitgatters an der Spitze des V kleinere Maße als die Länge des Zeitgatters am verbleibenden Teil des V auf; d.h. die Arme des V sollten eine Länge aufweisen, die grob gesagt 2 bis 5 mal länger als die Länge der V-Spitze ist, wie zum Beispiel 7, Zeitgatter a, veranschaulicht. 7, Zeitgatter b, zeigt, dass verglichen mit dem Rest des Zeitgatters nur ein kleiner Bereich des Zeitgatters an der Spitze des V über- oder durchquert wird. Das Zeitgatter sollte die Breite der Kapillare oder des Raums überspannen, so dass die gesamte Fluidfront in Berührung mit dem Zeitgatter kommt. Wenn das Zeitgatter zum Beispiel nicht so breit wie das Diagnoseelement wäre, dann würde die Fluidfront das Zeitgatter umgehen. Somit sollte das Zeitgatter während des Verzögerungszeitraums das Fluid in dem Raum „abdichten".
Unter Bezug auf 1 kann ein Fachmann erkennen, dass jede Vorrichtung 10 ein oder mehrere Zeitgatter enthalten könnte, um die erwünschte Funktion der Vorrichtung zu verwirklichen. 8 zeigt einige Beispiele der Anordnung mehrerer Zeitgatter von 6 nacheinander. Wie zum Beispiel im nächsten Abschnitt – Optionale Reagenskammern -erläutert wird, würden bei Ausführen eines Immunassay mit sequentieller Zugabe durch die Vorrichtung dann zwei Zeitgatter das Ausführen von zwei sequentiellen Inkubationsschritten durch die Vorrichtung vor der Bewegung des Reaktionsgemisches zu dem Diagnoseelement erlauben. In einem anderen Beispiel würde, wenn eine Inkubation des Reaktionsgemisches an der Anlagerungszone bzw. den Anlagerungszonen des Diagnoseelements/der Diagnoseelemente 6 erforderlich wäre, dann ein/mehrere Zeitgatter unmittelbar hinter die Anlagerungszone(n) gesetzt. Diese Verwendung des Zeitgatters kann sich in Fällen ergeben, da eine schlechte Bindungsleistungsfähigkeit der Komponente in dem Reaktionsgemisch an der Anlagerungszone des Diagnoseelements vorherrschen würde.
Eine andere Anwendung des Zeitgatters umfasst das Platzieren eines Zeitgatters an einer Oberfläche, die nicht Teil eines Kapillarraums ist. Das Zeitgatter kann zum Beispiel an einer hydrophile Oberfläche angebracht werden, die allein ohne einen Kapillarraum ein Bewegen von Flüssigkeiten zulässt. Dies ist allgemein der Fall, wenn ein erhebliches Volumen an Flüssigkeit auf eine Oberfläche gegeben wird und dieses sich aufgrund von Oberflächenspannung und aufgrund des hydrostatischen Drucks der den Meniskus nach außen schiebenden Flüssigkeit verteilt. Das Zeitgatter würde dann zum Verzögern des Vorbewegens der Fluidfront dienen, da die hydrostatische Natur der Oberfläche des Zeitgatters die Bewegung von Flüssigkeit stoppen würde. Wenn der Meniskus der sich vorbewegenden Flüssigkeit das Zeitgatter berührt, bindet die Komponente bzw. die Komponenten in der Flüssigkeit an dem Zeitgatter an, um eine ausreichend hydrophile Oberfläche für ein fortgesetztes Vorbewegen der Flüssigkeit auf der Oberfläche zu erzeugen.
Eine noch weitere Ausführung des Zeitgatters umfasst das Positionieren eines Zeitgatters vor einer Membrane, die zum Anlagern eines Konjugats oder Rezeptors verwendet wird. In einer noch anderen Ausführung des Zeitgatters kann das Zeitgatter aus hydrophoben Oberflächen in einer Membran bestehen. In diesen Fällen ist die hydrophobe Membran vor der Position der Membran positioniert, die das Konjugat oder den Rezeptor fängt, und kann nach einer Reaktionskammer oder einem Teil der Membran positioniert sein, wo Reagenzien des Assay platziert oder eingebettet sind und wo die Reagenzien über eine festgelegte Zeitdauer inkubieren. Das Zeitgatter in der Membran kann durch Anwenden von Rohlatexpartikeln in der Membran bei einer geeigneten Feststoffkonzentration, die von etwa 0,01 % bis 10% reicht, gebildet werden. Die Größe der Latexpartikel sollte etwas geringer als die Porengröße der Membran sein, damit der Latex in der Membran eingebettet wird. Die Dichte des Latex in der Membran am Zeitgatter sollte gleichmäßig sein, so dass das Reaktionsgemisch das Zeitgatter nicht umgeht. Die zum Erzeugen eines Zeitgatters für eine Membran mit einer Porengröße von 1 μm verwendete Latexgröße kann zum Beispiel zwischen 0,05 und 0,2 μm liegen. Da die Verteilung der Porengrößen in den Membranen breit schwankt, muss die tatsächliche verwendete Latexgröße durch Experimentieren herausgefunden werden. Die hydrophobe Natur der für das Zeitgatter verwendeten Membran kann auch durch Plasmabehandlung oder durch Behandlung der Membran mit hydrophoben Chemikalien oder Polymeren, die an der Membran adsorbieren, gebildet werden. Ein Fachmann kann erkennen, dass die hierin beschriebene Lehre der erfindungsgemäßen Merkmale des Zeitgatters zur Konstruktion von Zeitgattern in einer Vielzahl von Diagnosevorrichtungen eingesetzt werden können, die Membranen nutzen. D.h. zum Beispiel in den U.S. Patenten 4,435,504, 4,727,019, 4,857,453, 4,877,586 und 4,916,056 und... beschriebenen Vorrichtungen, die hiermit durch Erwähnung Bestandteil dieser Anmeldung werden, können ein Zeitgatter zum Beispiel vor der Membran oder in der Membran enthalten, die das Konjugat oder den Rezeptor anlagert.
Optionale Reagenskammern
Unter Bezug auf 1b und 1c ist die optionale Reagenskammer 17 für das Einbringen von Reagenzien in den Assay-Prozess brauchbar. Im Allgemeinen kann die optionale Reagenskammer 17 mittels einer Probenreaktionsbarriere 3 oder einer Öffnung in direktem Fluidkontakt mit dem Probenzugabebehälter 2 oder mittels einer Probenreaktionsbarriere 3 oder Öffnung mit der Reaktionskammer 4 oder dem Diagnoseelement 6 in direktem Fluidkontakt stehen. 1b zeigt beispielsweise die optionale Reagenskammer 17 in direktem Fluidkontakt mit der Reaktionskammer 4. Das Strömen des eingeleiteten Reagens kann durch ein Zeitgatter 5a gesteuert werden, und Finger 16 können bei der Bewegung der Reagenzien in die Reaktionskammer 4 mitwirken. Unter Bezug nun auf 1c würden zum Beispiel, wenn durch die Vorrichtung ein Immunassay mit sequentieller Zugabe ausgeführt würde, dann zwei Zeitgatter 5 und 5a und Finger 16 könnten bei der Bewegung von Reagenzien in die Reaktionskammer 4 mitwirken. Unter Bezug nun auf 1c würden zum Beispiel, wenn von der Vorrichtung ein Immunassay mit sequentieller Zugabe ausgeführt würde, dann zwei Zeitgatter 5 und 5a das Durchführen von zwei sequentiellen Inkubationsschritten in der optionalen Reagenskammer 17 und dann in der Reaktionskammer 4 durch die Vorrichtung vor der Bewegung des Reaktionsgemisches an das Diagnoseelement 6 zulassen. D.h. eine Probe würde durch die Probenzugabezone 1 an dem Probenzugabebehälter 2 angelegt werden und die Probe strömt über die Probenreaktionsbarriere 3 und mit Hilfe der Finger 16 in die optionale Reagenskammer 17, wo der erste Satz von Reaktionen eintreten würde. Das Zeitgatter 5a würde nach der entsprechenden Zeitdauer die Reagenzien über die Probenreaktionsbarriere 3a und mit Hilfe der Finger 16a in die Reaktionskammer 4 strömen lassen, wo der nächste Satz an Reaktionen erfolgen würde. Nach der entsprechenden Zeitdauer lässt das Zeitgatter 5 das Strömen von Reaktionsgemisch auf das Diagnoseelement 6 zu.
Fluidsteuermittel
Unter Bezug auf 1d ist das optionale Fluidsteuermittel 18 zum Steuern des Strömens des Reaktionsgemisches in die Vorrichtung ausgelegt. Im Einzelnen veranlasst das optionale Fluidsteuermittel 18 das Volumen des Reaktionsgemisches, über die Anlagerungszone des Diagnoseelements 6 bei einer Geschwindigkeit zu strömen, die ein optimales Anlagern von Reagenzien an der Anlagerungszone erlaubt. Nachdem das Volumen des Reaktionsgemisches über die Anlagerungszone strömt, kann die Strömungsgeschwindigkeit der überschüssigen Reagenzien erhöht werden. Die unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeit der Reagenzien in der Vorrichtung wird durch Konstruieren eines Spalts 18 zwischen den Oberflächen des Kapillarraums 19 des Diagnoseelements 6 verwirklicht. Die Größe des Spalts 18 ist größer als der Kapillarraum 19 des Diagnoseelements 6. Der Spalt 18 folgt im Allgemeinen der Anlagerungszone oder der Zone, in der die Strömungsgeschwindigkeit gesenkt werden muss. Der Spalt 18 in dem Diagnoseelement 6 hat somit ein zugeordnetes Volumen. Das Volumen des Spalts 18 wird durch Kapillarwirkung mit dem Reaktionsgemisch gefüllt, wenn es sich durch die Vorrichtung bewegt. Da der Spalt 18 nach der Anlagerungszone größer als der Kapillarraum 19 des Diagnoseelements 6 ist, führt ein Abfall des Kapillardrucks zu Beginn des Spalts 18 zu einer Abnahme der Strömungsgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches in den Spalt 18 und daher zu einer Abnahme der Strömungsgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches über der Anlagerungszone. Das Verändern der Größe des Spalts 18 ändert die Kapillarität des Spalts und somit das Strömen des Reaktionsgemisches über die Anlagerungszone. Bei Immunassays., die einen Waschschritt zum Entfernen von nicht gebundenen Reagenzien aus dem Diagnoseelement 6 erfordern, ist es allgemein erwünscht, dass die Strömungsgeschwindigkeit der Waschlösung über dem Diagnoseelement 6 schneller als die Strömungsgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches über dem Diagnoseelement 6 ist, da dies die Zeit des Assay verkürzt. Die Form des Spalts kann viele Formen einnehmen. Wie in 1d gezeigt wird, hat der Spalt quadratische Ecken, der Spalt kann aber als Trapezoid oder Dreieck geformt sein, was die Strömungsgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches während des Strömens in den Spalt ändern würde. Ein Fachmann kann auch erkennen, dass bei bestimmten Immunassays ein Waschschritt nicht erforderlich ist.
Die Steuerung der Strömungsgeschwindigkeit der Reagenzien in der Vorrichtung kann auch dazu genutzt werden, das Eintreten chemischer Reaktionen in einer Zone der Vorrichtung zuzulassen, bevor die Reagenzien sich zu einem anderen Bereich der Vorrichtung bewegen, wo das Ausmaß der Reaktion der Reagenzien überwacht wird oder eine weitere Reaktion stattfinden kann. Zum Beispiel könnten mehrere Fluidsteuermittel in eine Vorrichtung zur Verwendung bei Immunassays integriert werden, wo eine sequentielle Zugabe und Inkubation von Reagenzien erforderlich ist. D.h. die Probe kommt mit den ersten Reagenzien in Kontakt und die Zeit für die Reaktion der Probe und der ersten Reagenzien wird durch einen ersten Spalt gesteuert. Wenn der erste Spalt mit Fluid gefüllt ist, strömt das Reaktionsgemisch weiter zu den zweiten Reagenzien, zu welchem Zeitpunkt eine zusätzliche chemische Reaktion anschließend stattfinden kann. Die zur Beendigung dieser zweiten Reaktion erforderliche Zeit kann vor einem weiteren Strömen des Reaktionsgemisches entlang des Diagnoseelements ebenfalls durch einen zweiten Spalt gesteuert werden. Chemische und biochemische Reaktionen finden ebenfalls in dem Volumen des Spalts, zum Beispiel durch Immobilisieren von Reagenzien in dem Spalt, statt.
Diagnoseelement
Unter Bezug auf 1 und 2 wird das Diagnoseelement 6 durch gegenüberliegende Flächen gebildet, die bei einem Kapillarabstand getrennt sind, durch welchen das Reaktionsgemisch strömt und an dem eine oder mehrere Anlagerungszonen platziert sind. Die Anlagerungszonen bestehen aus Reagenzien, beispielsweise Rezeptoren oder Vorrichtungen wie Biosensoren, die mit einer oder mit mehreren Komponenten aus dem Reaktionsgemisch binden oder reagieren. Die Bindung der Reagenzien aus dem Reaktionsgemisch an den Anlagerungszonen des Diagnoseelements 6 steht mit dem Vorhandensein oder der Menge des Zielliganden in der Probe in Beziehung. Es können ein oder mehrere Rezeptoren oder Biosensoren an das Diagnoseelement 6 gegeben werden, um das Vorhandensein oder die Menge von einem oder mehr Zielliganden zu messen. Die Rezeptoren oder Biosensoren können in gesonderte Zonen an dem Diagnoseelement 6 gesetzt werden oder sie können homogen oder heterogen über der Oberfläche verteilt werden. Rezeptoren oder andere chemische Reagenzien, zum Beispiel ein Rezeptor an dem Signalgenerator, können ebenfalls an dem Diagnoseelement 6 immobilisiert werden, um dem Bediener zu bestätigen, dass die Reagenzien des Reaktionsgemisches brauchbar sind und dass das Reaktionsgemisch die Zonen der Rezeptoren oder Biosensoren passiert hat. Ein einzelner Rezeptor oder Biosensor kann über den Großteil des Diagnoseelements 6 so gesetzt werden, dass bei Strömen des Reaktionsgemisches durch das Diagnoseelement 6 die Komponenten aus dem Reaktionsgemisch an der Oberfläche des Diagnoseelements 6 in chromatographischer Weise anbinden. Somit würde der Abstand, bei dem die Komponente des Reaktionsgemisches anbindet, mit der Konzentration des Zielliganden in der Probe in Beziehung stehen. Die Reagenzien, beispielsweise Rezeptoren, werden an der Oberfläche des Diagnoseelements 6 durch kovalente Bindungen oder durch Adsorption immobilisiert. Eine bevorzugte Ausführung besteht darin, rezeptorbeschichtete Latexpartikel, zum Beispiel mit Durchmessern, die von etwa 0,1 μm bis 5 μm reichen, zu immobilisieren. Ferner können auch als „Nanopartikel" bezeichnete Partikel mit Rezeptor beschichtet werden, und die sich ergebenden Nanopartikel können durch Adsorption oder kovalente Bindungen an dem Diagnoseelement immobilisiert werden. Nanopartikel bestehen im Allgemeinen aus Siliciumdioxid, Zirconiumoxid, Aluminiumoxid, Titanoxid, Cerdioxid, Metallsolen und Polystyren und dergleichen, und die Partikelgrößen reichen von etwa 1 nm bis zu 100 nm. Der Vorteil der Verwendung von Nanopartikeln ist, dass der Flächeninhalt des die Nanopartikel beschichtenden Proteins als Funktion des Feststoffgehalts im Verhältnis zu größeren Latexpartikeln drastisch vergrößert wird.
Die Oberflächen des Diagnoseelements 6 würden das Anbinden der rezeptorbeschichteten Nanopartikel oder Latexpartikel an dem Diagnoseelement 6 erlauben. In einer bevorzugten Ausführung binden die Rezeptoren durch elektrostatische Wasserstoffbindung und/oder hydrophobe Wechselwirkungen an der Oberfläche des Diagnoseelements an. Elektrostatische Wasserstoffbindung und hydrophobe Wechselwirkungen werden zum Beispiel in Biochemistry 20, 3096 (1981) und Biochemistry 29, 7133 (1990) erläutert. Das Diagnoseelement 6 kann zum Beispiel mit einem Plasma behandelt werden, um Carbonsäuregruppen an der Oberfläche zu bilden. Die rezeptorbeschichteten Latexpartikel werden bevorzugt in einer schwachen Salzlösung, zum Beispiel 1–20 mM, und bei einem pH, der unter dem isoelektrischen Punkt des Rezeptors liegt, an dem Diagnoseelement 6 angebracht. Somit führt der negative Charakter der Carbonsäuregruppen an dem Diagnoseelement 6 und der positive Ladungscharakter des Rezeptorlatex zu einer verbesserten elektrostatischen Stabilisierung des Latex an dem Diagnoseelement 6. In einer anderen bevorzugten Ausführung sind Latexpartikel oder Nanopartikel, die mit Rezeptor beschichtet sein können oder ein Zeitgatter bilden können, an einer nicht saugfähigen Oberfläche gefangen. Die Mikrostruktur der nicht saugfähigen Oberfläche ist so strukturiert, dass die Partikel an der Oberfläche oder in den Schichten der Mikrostruktur gefangen werden, wobei sie etwas bilden, was allgemein als „Nanokomposit" bezeichnet wird. Es können auch Magnetfelder zum Immobilisieren von Partikeln verwendet werden, die durch das Magnetfeld angezogen werden. Diese Arten von Oberflächen, die allgemein als „nanostrukturierte Materialien" bezeichnet werden, werden zum Beispiel in Chemical and Engineering News 70, 18–24 (1992) beschrieben, was hierdurch durch Erwähnung Bestandteil der Anmeldung wird.
In einer weiteren Ausführung des Diagnoseelements ist nun unter Bezug auf 5 das Diagnoseelement 6 eine zylinderförmige Fläche, die aus Nuten bestehen kann. Wenn das Diagnoseelement aus Nuten besteht, verlaufen die Nute allgemein senkrecht zur Strömung des Reaktionsgemisches. Um das Diagnoseelement wird durch einen runden Schlauch, der allgemein transparent ist, ein Kapillarraum gebildet; dadurch sind die Oberfläche des Diagnoseelements und die gegenüberliegende Oberfläche des Schlauchs bei einem Kapillarabstand beabstandet. Die gebildete Kapillare lässt das Strömen des Reaktionsgemisches über das runde Diagnoseelement 6 zu. Allgemein würde sich das Reaktionsgemisch gegen die Schwerkraft nach oben oder mit der Schwerkraft nach unten durch den zylinderförmigen Kapillarraum bewegen. Die Anlagerungszonen des runden Diagnoseelements 6 können in gesonderte Zonen oder über die gesamte Länge des Diagnoseelements 6 angebracht werden. Die Anlagerungszonen können auch den Durchmesser des Diagnoseelements 6 umkreisen oder können nur an einem Radius des Diagnoseelements 6 angebracht werden. Das Reaktionsgemisch kann durch den Schlauch 8 dem Diagnoseelement 6 zugeführt werden. Ferner kann das Zylindervolumen des Schlauchs 8 als Reaktionskammer 4 genutzt werden, und eine scheibenförmige Probenreaktionsbarriere 3 mit Nuten an ihrem Umfang kann ebenfalls eingesetzt werden, um die Reaktionskammer 4 und den Probenzugabebehälter 2 zu bilden. Aus dieser Erläuterung kann nun unter Bezug auf 1 und 2 ein Fachmann ebenfalls erkennen, dass das flache Diagnoseelement 6 auch gebogen sein könnte, so dass die Krümmung ein Kreisradius ist.
Ein Fachmann kann erkennen, dass verschiedene Mittel zur Detektion von Signal an der Anlagerungszone des Diagnoseelements verwendet werden können. Bei Verwendung von Biosensoren, zum Beispiel eines piezoelektrischen Kristalls, wäre der piezoelektrische Kristall, an den ein Rezeptor immobilisiert würde, die Anlagerungszone, und die von dem anbindenden Zielliganden erzeugte Reaktion würde allgemein durch ein elektrisches Signal wiedergegeben. Andere Arten von Detektionsmittel umfassen visuelle und instrumentelle Mittel, beispielsweise spektrophotometrische Verfahren und Reflexionsgradverfahren, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Merkmale des Diagnoseelements lassen verbesserte Anlagerungsleistungsfähigkeit an Flächen zu, über die ein Reaktionsgemisch strömt, und es können verschiedene Mittel zur Detektion von einem Fachmann eingesetzt werden.
Die Oberflächen der Kapillaren in der Vorrichtung sind im Allgemeinen hydrophil, um ein Strömen der Probe und des Reaktionsgemisches durch die Vorrichtung zu erlauben. In einer bevorzugten Ausführung ist die dem Diagnoseelement 6 gegenüberliegende Oberfläche hydrophob, so dass das Reaktionsgemisch diese Oberfläche abstößt. Das Abstoßen des Reaktionsgemisches zu der dem Diagnoseelement 6 gegenüberliegenden Oberfläche zwingt das Reaktionsgemisch, insbesondere die Proteinkonjugate, zu der Oberfläche, an der eine Anlagerung eintritt, wodurch die Anlagerungsleistungsfähigkeit der Komponenten des Reaktionsgemisches an der Anlagerungszone verbessert wird. Die dem Diagnoseelement gegenüberliegenden hydrophoben Oberflächen können dazu neigen, hydrophil zu werden, wenn das Reaktionsgemisch weiter durch das Diagnoseelement strömt, da verschiedene Komponenten, die in der Probe oder dem Reaktionsgemisch endogen oder exogen vorhanden sein können, beispielsweise Proteine oder Polymere, an der hydrophoben Oberfläche anbinden. Eine dem Diagnoseelement gegenüberliegende bevorzugte hydrophobe Oberfläche kann aus Teflon bestehen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Teflonoberflächen Proteine mangelhaft binden. Somit würde die dem Diagnoseelement gegenüberliegende Teflonfläche nicht hydrophil werden, wie dies bei Oberflächen der Fall wäre, die zum Beispiel aus Polystyren, Polyacrylat, Polycarbonat und dergleichen bestehen, wenn das Reaktionsgemisch durch das Diagnoseelement strömt.
In einer anderen bevorzugten Ausführung ist das Diagnoseelement 6 hydrophil, aber die Bereiche neben dem Diagnoseelement 6 sind hydrophob, so dass die Reagenzien des Assay nur durch die hydrophilen Bereiche des Diagnoseelements geleitet werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass verschiedene Techniken verwendet werden können, um ein hydrophiles Diagnoseelement oder eine hydrophile Zone auszubilden, wie zum Beispiel Plasmabehandlung von hydrophoben Oberflächen mit Hilfe von Masken, die die Oberflächen mit Ausnahme des Diagnoseelements gegenüber der Behandlung schützen, oder durch Anbringen von hydrophoben Klebstoffen an hydrophilen Oberflächen zur Ausbildung eines Diagnoseelements oder durch die Verwendung von viskösen hydrophoben Verbindungen, beispielsweise ein Öl oder ein Fett. In einer anderen bevorzugten Ausführung kann die Kapillarität des Diagnoseelements durch Ultraschallschweißen gebildet werden. Die Grenzen des Diagnoseelements werden durch die Energieleiter diktiert, die zum Bilden der mit Ultraschall behandelten Schweißnaht verwendet werden.
Die Oberflächen des Diagnoseelements 6 oder der anderen Komponenten der Vorrichtung können glatt oder gerillt oder gerillt und glatt sein. Auch können verschiedene strukturierte Oberflächen allein oder in Kombination mit glatten oder gerillten Oberflächen eingesetzt werden. Es können Oberflächen eingesetzt werden, die zum Beispiel aus Stangen, Nuten, Pyramiden und dergleichen, die als Vorsprünge bezeichnet werden, oder aus Löchern, Schlitzen, Waffelmustern und dergleichen, die als Vertiefungen bezeichnet werden, bestehen. Die strukturierten Geometrien können in Reihen geordnet, versetzt oder völlig wahllos sein, und es können unterschiedliche Geometrien kombiniert werden, um die erwünschten Oberflächeneigenschaften zu erzielen. Die Vertiefungen oder Vorsprünge der strukturierten Geometrien können von etwa 1 nm bis zu 0,5 mm und bevorzugt von etwa 10 nm bis zu 0,3 mm reichen. Der Abstand zwischen den verschiedenen Vertiefungen und Vorsprüngen kann von etwa 1 nm bis zu 0,5 mm und bevorzugt von etwa 2 nm bis zu 0,3 mm reichen.
In einer in 1 und 2 gezeigten bevorzugten Betriebsart ist eine Oberfläche des Diagnoseelements 6 gerillt und die Nuten sind senkrecht zur Strömung des Reaktionsgemisches, und die gegenüberliegende Oberfläche ist glatt. In einer anderen Ausführung ist eine Oberfläche des Diagnoseelements 6 an der Anlagerungszone gerillt und die Bereiche neben der Anlagerungszone sind glatt. Die gegenüberliegende Oberfläche des Diagnoseelements 6 kann glatt oder gerillt sein, zum Beispiel greifen die Nuten jeder Oberfläche ineinander. Die Positionierung der Nuten des Diagnoseelements senkrecht zum Strömen des Reaktionsgemisches ist vorteilhaft, da das Strömen des Reaktionsgemisches durch das Diagnoseelement 6 in organisierter Weise erfolgt, wobei eine einzelne, gerade Front von den Nuten in dem Kapillarraum diktiert wird. Wenn ferner eine Oberfläche in großer Nähe, zum Beispiel 1 μm bis 100 μm, zu den Spitzen der Nuten ist, dann kann die Anlagerungsleistungsfähigkeit der Komponenten aus dem Reaktionsgemisch verbessert werden. Die Verbesserung der Anlagerungsleistungsfähigkeit an den Anlagerungszonen in gerillten Diagnoseelementen kann gegenüber Elementen mit glatter Oberfläche mit der Bewegung des Reaktionsgemisches in dem Kapillarraum in Verbindung stehen; d.h. bei der gerillten Oberfläche wird das Reaktionsgemisch gezwungen, sich über die Spitze der Nut und in das Tal der nächsten Nut zu bewegen. Dadurch würde eine feiner gerillte Oberfläche, d.h. mit mehr Nuten pro cm, eine bessere Anlagerungsleistungsfähigkeit als eine gröber gerillte Oberfläche bieten. Das Reaktionsgemisch wird somit näher zur Oberfläche des gerillten Diagnoseelements getrieben, als wenn beide Oberflächen glatt wären. Ferner reduziert die starke Nähe zu den Oberflächen das Volumen des Hauptteils des Reaktionsgemisches über der gerillten Oberfläche des Diagnoseelements und reduziert daher den Diffusionsabstand der Komponenten, die an dem Diagnoseelement binden. Die Nähe der Oberflächen des Diagnoseelements sollte das Volumen des Reaktionsgemisches in dem Diagnoseelement an der Anlagerungszone minimieren, ohne das kapillare Strömen durch das Element zu blockieren. Die Anlagerung zum Beispiel des Komplexes von Zielligand Ligandenrezeptorkonjugat an der Anlagerungszone kann einer Leistungsfähigkeit von 100% nahe kommen, wenn die Nähe der Oberflächen optimiert ist. Die Anlagerung nahezu des gesamten Ligandenrezeptorkonjugats, das durch den Zielliganden gebunden ist, ist sehr erwünscht, da eine größere Empfindlichkeit des Assay als Funktion des Probenvolumens erreicht werden kann. Andere Vorteile der verbesserten Anlagerungsleistungsfähigkeit sind, dass weniger Reagenzien verwendet werden, da das Probenvolumen geringer ist, die Assay-Vorrichtung aufgrund des kleineren Probenvolumens miniaturisiert werden kann und die Reproduzierbarkeit des Assay-Ergebnisses verbessert wird, weil Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches durch die Anlagerungszonen weniger oder keine Wirkung auf das Anlagern der markierten Konjugate haben werden.
Der Kapillarraum kann auf vielerlei Weise ausgebildet werden, zum Beispiel durch maschinelles Bearbeiten der Oberflächen auf geeignete Toleranzen oder durch Verwenden von Unterlegscheiben zwischen den Oberflächen. In einer bevorzugten Ausführung bildet Ultraschallschweißen der Oberflächen die Kapillarität. In diesem Fall wird der Kapillarraum durch die Energieleiter gebildet und der Abstand zwischen den Oberflächen ist eine Funktion der Größe des Energieleiters, der Schweißenergie, der Dauer der Energieausübung und des während des Schweißens ausgeübten Drucks. Die Oberflächen des Diagnoseelements können parallel oder nicht parallel sein. In letzterem Fall ist die Strömungsgeschwindigkeit der Reagenzien durch das Diagnoseelement nicht über die gesamte Länge gleichmäßig. Eine bevorzugte Ausführung besteht darin, die Oberflächen des Diagnoseelements in etwa parallel zu halten. Die Oberflächen des Diagnoseelements können aus Materialien wie Kunststoffen gefertigt werden, die gefräst oder spritzgegossen werden können, zum Beispiel Polystyren, Polycarbonat, Polyacrylat und dergleichen, oder aus Oberflächen aus Kupfer-, Silber- und Goldfilmen, auf denen verschiedene langkettige Alkanthiole adsorbiert sind, wie in J.Am.Chem.Soc. 1992, 114, 1990–1995 und in den Literaturangaben darin beschrieben wird. In diesem letzteren Beispiel können die Thiolgruppen, die nach außen ausgerichtet sind, zum kovalenten Immobilisieren von Proteinen, Rezeptoren oder verschiedenen Molekülen oder Biomolekülen verwendet werden, die angelagerte Maleimid- oder Alkylhalidgruppen aufweisen und zum Binden von Komponenten aus dem Reaktionsgemisch zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge des Zielliganden verwendet werden.
Unter Bezug auf 3a und 3b können die Immobilisierungszonen eines oder mehrerer Rezeptoren und die Platzierung der Biosensoren an der Anlagerungszone 17 an dem Diagnoseelement 6 viele Formen annehmen. Wenn zum Beispiel der Zielligand in der Probe sehr niedrig konzentriert ist, dann würde man wünschen, dass das gesamte Reaktionsgemisch über die Zone des immobilisierten Rezeptors oder Biosensors strömt, um das beste Signal aus dem vorhandenen Volumen des Reaktionsgemisches zu erhalten. In diesem Fall könnte die Platzierung der Reagenzien oder Biosensoren an dem Diagnoseelement 6 an den Anlagerungszonen 17 zum Beispiel der in 3a gezeigten ähneln. Wenn der Zielligand in der Probe hoch konzentriert ist und die Empfindlichkeit des analytischen Verfahrens kein Thema ist, dann könnte die Platzierung der Rezeptoren oder Biosensoren an den Anlagerungszonen 17 zum Beispiel der in 3b ähneln. Ein Fachmann kann erkennen, dass die Platzierung von Rezeptoren oder Biosensoren an dem Diagnoseelement eine Funktion der Empfindlichkeitsanforderungen des analytischen Verfahrens ist.
Ein oder mehrere Diagnoseelemente können eine Vorrichtung umfassen. Das Reaktionsgemisch kann bei einer Vorrichtung mit mehreren Diagnoseelementen eingesetzt werden. Ferner kann die Probe bei der Vorrichtung eingesetzt und dann in verschiedene Reaktionskammern geteilt werden, jede mit separaten Diagnoseelementen. Die Anlagerungszone können verschiedene geometrische Symbole oder Buchstaben zur Anzeige eines Codes sein, wenn die Probe für den Zielliganden positiv oder negativ ist. Ein Fachmann wird die nützlichen Kombinationen der Elemente dieser Erfindung erkennen.
Das Diagnoseelement kann auch so ausgelegt werden, dass es einen semiquantitativen oder quantitativen Assay ausführt, wie zum Beispiel in Clinical Chemistry (1992) 39, 619–624 beschrieben wird, wobei hierin lediglich durch Verweis darauf hingewiesen wird. Dieses Format nutzt eine konkurrierende Bindung von Antigen und Antigenmarker zusammen mit einer Festphasenmembran. Die Verbesserung besteht darin, dass die Verwendung des hierin für das oben erwähnte Verfahren beschriebenen Diagnoseelements ein kleineres Probenvolumen und verbesserte Bindungsleistungsfähigkeit an der Festphasenfläche erfordern würde.
Andere Diagnoseelemente als Kapillaren
Die hierin beschriebene erfindungsgemäße Lehre der Adsorption von Proteinen, insbesondere von Rezeptoren an Kunststoffflächen, kann zur Adsorption von Rezeptoren an vielen Kunststoffflächen eingesetzt werden, die nicht Teil einer Kapillare sind. Nanopartikel und Latexpartikel, die mit Rezeptoren beschichtet sind, können ebenfalls an Oberflächen vieler Arten von Immunassay-Vorrichtungen angebracht werden, wie zum Beispiel „Messlatten". Messlatten werden allgemein als Festphase verwendet, an die als Ergebnis des Assay-Prozesses zum Beispiel das Ligandenrezeptorkonjugat gebunden ist. Messlatten enthalten im Allgemeinen Membranen; ein Nachteil bei der Verwendung von Membranen in Messlatten ist aber die Schwierigkeit, den ungebundenen Ligandenrezeptor von der Membran zu waschen. Dadurch besteht eine Verbesserung der Verwendung von Messlatten darin, dass rezeptorbeschichteter Latex oder Nanopartikel direkt an einer Kunststoffoberfläche der Messlatte immobilisiert werden. Das Entfernen eines ungebundenen Ligandenkonjugats von der Kunststofffläche ist somit effizienter als das Entfernen von einer Membran.
Behälter für verbrauchtes Reagens
Unter Bezug auf 1 und 2 nimmt der Behälter 7 für verbrauchtes Reagens das Reaktionsgemisch, andere Reagenzien und überschüssige Probe von dem Diagnoseelement 6 auf. Das Volumen des Behälters 7 für verbrauchtes Reagens ist mindestens das Volumen der Probe und der zusätzlichen Reagenzien, die in die Vorrichtung gegeben werden bzw. in ihr sind. Der Behälter 7 für verbrauchtes Reagens kann viele Formen annehmen, wobei ein absorbierendes, beispielsweise ein saugfähiges Material aus Nitrocellulose, porösem Polyethylen oder Polypropylen und dergleichen verwendet wird, oder der Behälter für verbrauchtes Reagens kann aus einer Reihe von Kapillarnuten bestehen. Im Fall von Nuten in dem Behälter 7 für verbrauchtes Reagens können die Kapillarnuten so ausgelegt sein, dass sie verschiedene Kapillardrücke aufweisen, um die Reagenzien durch die Vorrichtung zu ziehen oder um das Aufnehmen der Reagenzien ohne kapillares Ziehen zu erlauben und zu verhindern, dass die Reagenzien rückwärts durch die Vorrichtung strömen. Die Größe und Menge der gerillten Kapillaren bestimmen das Volumen und die Kapillarität des Behälters 7 für verwendetes Reagens. In einer in 4 gezeigten bevorzugten Ausführung stehen die Finger 52 am Ende des Diagnoseelements 6 in Fluidkontakt mit einem Kapillarraum 55, und der Kapillarraum 55 steht in Fluidkontakt mit einem gerillten oder strukturierten Kapillarraum 56. Die Tiefe der Nute oder der strukturierten Oberfläche kann zum Beispiel etwa 0,1 mm bis 0,6 mm, bevorzugt etwa 0,3 mm bis 0,5 mm betragen, und die Dichte kann von etwa 5 bis 75 Nuten pro cm und bevorzugt von etwa 10 bis 50 Nuten pro cm betragen. Unter Bezug auf 4 bewegen sich die Reagenzien der Vorrichtung zu den Fingern 52 am Ende des Diagnoseelements 51 und in den Kapillarkanal 55. Die Reagenzien füllen den Kapillarraum 55 entweder teilweise oder vollständig und kommen dann in Kontakt mit der gerillten oder strukturierten Oberfläche 56. Die Breite des Kapillarraums 55 beträgt allgemein etwa 1 mm bis 3 mm und die Tiefe liegt allgemein bei etwa 0,1 mm bis 2 mm. Die Länge des Kapillarraums 55 sollte ausreichend sein, um in Fluidkontakt mit der gerillten oder strukturierten Oberfläche 56 zu stehen. Die gerillte oder strukturierte Oberfläche 56 zieht die Reagenzien abhängig von der Zufuhrgeschwindigkeit der Reagenzien in den Kapillarraum 55 teilweise oder vollständig aus dem Kapillarkanal 55 aus dem Diagnoseelement 6. Wenn das Einströmen von Reagenzien in die Vorrichtung beendet ist, weist die gerillte oder strukturierte Oberfläche 56 eine größere Kapillarität als der Kapillarkanal 55 auf, und die Reagenzien werden durch die gerillte oder strukturierte Oberfläche 56 aus dem Kapillarkanal 55 entfernt. Ferner ist das umgekehrte Strömen der Reagenzien von der gerillten oder strukturierten Oberfläche nicht bevorzugt, weil die Kapillarität in der gerillten oder strukturierten Oberfläche 56 die Reagenzien hält und ihr Rückwärtsströmen verhindert. Ein Fachmann kann aus diesen erfindungsgemäßen Merkmalen erkennen, dass die Anordnung der Nute oder eines Behälters für verbrauchtes Reagens in der Vorrichtung für eine Vielzahl erwünschter Ziele hin ausgelegt werden kann.
Beschreibung der einstufigen Assay-Vorrichtung
Die Elemente der Vorrichtung, die einzeln beschrieben wurden, können in verschiedenerlei Weise zusammengebaut werden, um die erwünschte Funktion zu erreichen. Der Begriff „einstufig" impliziert, dass eine manuelle Handlung erforderlich ist, um das Assay-Ergebnis zu erzielen, zum Beispiel ist das Zugeben einer Probe in die Vorrichtung eine Stufe. Wenn die Vorrichtung einen einstufigen Assay ausführt, der sowohl eine zeitgesteuerte Inkubation von Reagenzien als auch einen Waschschritt erfordert, ist die Waschlösung überschüssige Probe und die Assay-Vorrichtung ist mit den Elementen in Fluidverbindung gebaut, wobei sie den Probenzugabebehälter, die Probenreaktionsbarriere, die Reaktionskammer, das Zeitgatter, das Diagnoseelement und den Behälter für verbrauchtes Reagens wie in 1 dargestellt verwendet. Die Vorrichtungen sind allgemein etwa 3 cm bis 10 cm lang, 1 cm bis 4 cm breit und etwa 2 mm bis 15 mm dick. Typischerweise wird ein oberes Element mit glatten Oberflächen auf ein unteres Element gesetzt, das eine Oberfläche aufweist, auf welche die oben erwähnten Elemente gebaut sind. Die Beziehung der Elemente ist wie in 1 gezeigt. Die zum Ausführen des Assay erforderlichen Reagenzien werden immobilisiert oder in die jeweiligen Elemente gegeben. Die Oberflächen werden bei eine Kapillarabstand getrennt zusammengebracht und dabei werden die Bereiche des Probenzugabebehälters, der Probenreaktionsbarriere, der Reaktionskammer, des Zeitgatters, des Diagnoseelements, des Spalts und des Behälters für verbrauchtes Reagens allesamt gebildet und können gemeinsam funktionieren. Ferner werden die Oberflächen so zusammengebracht, dass sich die gegenüberliegenden Oberflächen berühren, um den Probenzugabebehälter, die Reaktionskammer und den Behälter für verbrauchtes Reagens zu bilden und abzudichten.
Bei der Ausführung eines qualitativen, nicht konkurrierenden Assay an einem oder mehreren Zielliganden werden die Signal erzeugenden Reagenzien, die zum Beispiel einen Rezeptor spezifisch für den Zielliganden, der an einem kolloidalen Metall wie Gold oder Selensol adsorbiert ist, umfassen, auf die Probenreaktionsbarriere oder in die Reaktionskammer in getrockneter oder lyophilisierter Form gegeben. Ein anderer Rezeptor für jeden Zielliganden wird an die Oberfläche des Diagnoseelements an der Anlagerungszone immobilisiert. Das Zeitgatter wird im Allgemeinen an dem Diagnoseelement zwischen der Reaktionskammer und den Anlagerungszonen durch die Platzierung von zum Beispiel einer tensidfreien Polystyrensuspension an der Vorrichtung in einer Menge, die die erwünschte Inkubationszeit diktiert, positioniert. Die Inkubationszeit ist meist die Zeitdauer, die die Reaktionen benötigen, um zu einer wesentlichen Gleichgewichtsbindung zu kommen. Der Assay wird dann durch Zugabe einer Probe zu dem Probenzugabebehälter der Vorrichtung ausgeführt. Die Probe bewegt sich mit Hilfe der Finger über die Probenreaktionsbarriere in die Reaktionskammer und löst die Reagenzien in der Reaktionskammer auf, um das Reaktionsgemisch zu bilden. Das Reaktionsgemisch inkubiert über die durch das Zeitgatter diktierte Zeitdauer. Die überschüssige Probe, die in dem Probenzugabebehälter verbleibt, und das Reaktionsgemisch in der Reaktionskammer stehen in Fluidverbindung, stehen aber aufgrund der Probenreaktionsbarriere in keiner wesentlichen chemischen Verbindung. Somit bildet die Reaktionskammer das Volumen des Reaktionsgemisches. Das Reaktionsgemisch bewegt sich dann an dem Zeitgatter vorbei und auf das Diagnoseelement und über die Anlagerungszonen. Der in dem Reaktionsgemisch gebildete Komplex aus Rezeptorkonjugat und Zielligand bindet an dem jeweiligen Rezeptor an der Anlagerungszone an, wenn das Reaktionsgemisch über die Anlagerungszonen strömt. Das Reaktionsgemisch kann auch über eine positive Kontrollzone strömen, die zum Beispiel ein immobilisierter Rezeptor zu dem Signalentwicklungselement sein kann. Wenn das Reaktionsgemisch mit Hilfe der Finger durch das Diagnoseelement und in den Behälter für verbrauchtes Reagens strömt, strömt die überschüssige Probe hinter das Reaktionsgemisch und mischt sich im Allgemeinen nicht wesentlich mit dem Reaktionsgemisch. Die überschüssige Probe bewegt sich auf das Diagnoseelement und entfernt das Rezeptorkonjugat, das sich nicht an der Anlagerungszone gebunden hat. Wenn ausreichend überschüssige Probe das Diagnoseelement wäscht, kann das Signal an den Anlagerungszonen visuell oder instrumentell interpretiert werden. Unter Bezug auf 1d bewegt sich das Reaktionsgemisch in einer bevorzugten Betriebsart der obigen Beschreibung auf das Diagnoseelement 6 über die Anlagerungszone oder -zonen, und dann strömt das Reaktionsgemisch weiter in einen Kapillarspalt 18. Der Kapillarspalt 18 weist im Allgemeinen eine geringere Kapillarität als das Diagnoseelement 6 auf. Der Kapillarraum 19 des Diagnoseelements 6 ist allgemein kleiner als der Kapillarraum des Spalts 18. Das Volumen des Kapillarspalts 18 nähert sich allgemein dem Volumen des Reaktionsgemisches, so dass sich der Kapillarspalt 18 langsam mit dem Reaktionsgemisch füllt und nach dem Füllen die Kapillarität des verbleibenden Teils des Diagnoseelements 6 oder des Behälters für verbrauchtes Reagens größer als die Kapillarität des Spalts 18 ist, was zu einer erhöhten Strömungsgeschwindigkeit zum Waschen des Diagnoseelements 6 führt. Ein Fachmann kann erkennen, dass der Spalt 18 in dem oberen Element 8 oder in dem unteren Element 9 oder in einer Kombination beider Elemente 8 und 9 ausgebildet sein kann.
Wenn die Vorrichtung einen einstufigen Assay ausführt, der keinen zeitgesteuerten Inkubationsschritt erfordert, aber einen Waschschritt mit sich bringt, bei dem die Waschlösung überschüssige Probe ist, ist die Assay-Vorrichtung mit den Elementen in Fluidverbindung gebaut, wobei der Probenzugabebehälter, die Probenreaktionsbarriere, die Reaktionskammer, das Diagnoseelement und der Behälter für das verbrauchte Reagens verwendet werden. Die Assay-Reagenzien werden wie vorstehend beschrieben für den nicht konkurrierenden qualitativen Assay verwendet. Die Assay-Vorrichtung ohne das Zeitgatter erlaubt ein Strömen des Reaktionsgemisches auf das Diagnoseelement ohne verlängerte Inkubationszeit. Das Kapillarströmen des Reaktionsgemisches und der überschüssigen Probe sind wie vorstehend beschrieben.
Die optionale Reagenskammer ist bei der Vorrichtung, die einen einstufigen Assay mit der Einbringung eines zusätzlichen Assay-Reagens in oder nach dem Reaktionsgemisch oder der Einbringung einer Waschlösung, die hinter das Reaktionsgemisch durch die Vorrichtung strömt, in der Vorrichtung integriert. Die optionale Reagenskammer kann mit einem beliebigen Element der Vorrichtung in Fluidkontakt stehen und steht im Allgemeinen mit der Reaktionskammer in Fluidkontakt. Bei Fluidkontakt mit zum Beispiel der Reaktionskammer können die optionale Reagenskammer und die Reaktionskammer durch ein Zeitgatter getrennt sein. In der optionalen Reagenskammer können verschiedene Reagenzien getrocknet oder lyophilisiert werden, beispielsweise Detergenzien für einen Waschschritt oder Reagenzien, die dem Diagnoseelement nach dem Reaktionsgemisch nacheinander geliefert werden.
Im Fall des Ausführens von einstufigen, nicht konkurrierenden quantitativen Assays können die Reagenzien, die vorstehend für die nicht konkurrierende, qualitative Assay beschrieben wurden, Anwendung finden. Die Vorrichtung besteht aus den Elementen Probenzugabebehälter, Probenzugabebarriere, Reaktionskammer, Zeitgatter, Diagnoseelement und Behälter für gebrauchtes Reagens. In diesem Fall ist die Anlagerungszone des Diagnoseelements im Allgemeinen das gesamte Diagnoseelement. D.h. die Anlagerungszone ist eine Länge des Diagnoseelements, an die das Rezeptorkonjugat bindet. Das Rezeptorkonkugat bindet entlang der Länge der Anlagerungszone proportional zur Menge an Zielligandem in der Probe. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist aufgrund der hohen Leistungsfähigkeit beim Anlagern der Reagenzien, beispielsweise dem Binden eines Komplexes aus Zielligand und aus Rezeptorkonjugat an einem immobilisierten Rezeptor an dem Zielliganden an der Anlagerungszone, und da die Bewegung des Reaktionsgemisches über das Diagnoseelement mit einer scharfen Front abläuft, für diesen quantitativen Assay bevorzugt. Die Rezeptoren an der Anlagerungszone werden nacheinander mit dem Komplex aus Zielligand und Rezeptorkonjugat gesättigt, wenn das Reaktionsgemisch sich über die Länge der Anlagerungszone bewegt. Die Länge des Diagnoseelements, die gebundenes Konjugat enthält, bestimmt dann die Konzentration des Zielliganden. Der Fachmann wird das Format dieser Art von Immunassay als quantitativen immunochromatographischen Assay erkennen, wie er in den U.S. Pat. Nr. 4,883,688 und 4,945,205 erläutert wird, welche hiermit durch Erwähnung übernommen werden.
Im Fall der einen einstufigen, qualitativen, konkurrierenden Assay ausführenden Vorrichtung, der sowohl eine zeitgesteuerte Inkubation von Reagenzien als auch einen Waschschritt umfasst, und wobei die Waschlösung überschüssige Probe ist, ist die Assay-Vorrichtung mit den Elementen in Fluidverbindung gebaut, wobei der Probenzugabebehälter, die Probenreaktionsbarriere, die Reaktionskammer, das Zeitgatter, das Diagnoseelement und der Behälter für verbrauchtes Reagens verwendet werden. Bei Ausführen eines qualitativen, konkurrierenden Assay an einem oder mehreren Zielliganden besteht das Konjugat zum Beispiel aus einem Ligandenanalog gekoppelt an ein Signalentwicklungselement, beispielsweise ein Gold- oder Selensol. Das Konjugat und der Rezeptor für jeden Zielliganden werden in getrockneter oder lyophilisierter Form in Mengen in die Reaktionskammer gegeben, die durch die U.S. Pat. Nr. 5,028,535 und 5,089,391 gelehrt werden, die hiermit durch Erwähnung Bestandteil werden. Ein anderer Rezeptor für jeden Zielliganden wird an die Oberfläche des Diagnoseelements an der Anlagerungszone immobilisiert. Das Zeitgatter ist im Allgemeinen zwischen der Reaktionskammer und den Anlagerungszonen an dem Diagnoseelement positioniert, wie vorstehend beschrieben wird. Die Inkubationszeit ist für gewöhnlich die Zeitdauer, die die Reaktionen benötigen, um zu einer wesentlichen Gleichgewichtsbindung zu kommen. Der Assay wird dann durch Zugabe von Probe zur Vorrichtung ausgeführt. Die Probe bewegt sich über die Probenreaktionsbarriere und in die Reaktionskammer, löst die Reagenzien auf, um das Reaktionsgemisch zu bilden, und inkubiert über die Zeitdauer, die von dem Zeitgatter vorgegeben wird. Die überschüssige Probe und das Reaktionsgemisch stehen in Fluidverbindung, aber wegen der Probenreaktionsbarriere nicht in wesentlicher chemischer Verbindung. Das Reaktionsgemisch bewegt sich dann auf das Diagnoseelement und über die Anlagerungszonen. Das Ligandenanalogkonjugat bindet an dem jeweiligen Rezeptor bzw. Rezeptoren an der Anlagerungszone bzw. den Anlagerungszonen an. Wenn das Reaktionsgemisch über das Diagnoseelement und in den Behälter für verbrauchtes Reagens strömt, strömt die überschüssige Probe hinter das Reaktionsgemisch und mischt sich im Allgemeinen nicht wesentlich mit dem Reaktionsgemisch. Die überschüssige Probe bewegt sich auf das Diagnoseelement und entfernt die Konjugate, die nicht an der Anlagerungszone bzw. an den Anlagerungszonen binden. Wenn ausreichend überschüssige Probe das Diagnoseelement wäscht, können die Ergebnisse an den Anlagerungszonen visuell oder instrumentell interpretiert werden. In einer bevorzugten Betriebsart bewegt sich das Reaktionsgemisch auf das Diagnoseelement, über die Anlagerungszone oder -zonen, und dann strömt das Reaktionsgemisch weiter in einen Kapillarspalt. Der Kapillarspalt weist eine geringere Kapillarität als das Diagnoseelement auf. Das Volumen des Kapillarspalts nähert sich allgemein dem Volumen des Reaktionsgemisches, so dass sich der Kapillarspalt langsam mit dem Reaktionsgemisch füllt und nach dem Füllen die Kapillarität des verbleibenden Teils des Diagnoseelements oder des Behälters für verbrauchtes Reagens größer ist, was zu einer erhöhten Strömungsgeschwindigkeit der überschüssigen Probe zum Waschen des Diagnoseelements führt.
In einer anderen Ausgestaltung des einstufigen konkurrierenden Assay besteht das Reaktionsgemisch aus einem Ligandenanalog-Ligandenkomplement-Konjugat zu jedem Zielliganden und an Latexpartikeln adsorbierten Rezeptoren mit Durchmessern von zum Beispiel 0,1 μm bis 5 μm zu jedem Zielliganden in geeigneten Mengen, wie sie zum Beispiel durch die U.S. Pat. Nr. 5,028,535 und 5,089,391 gelehrt werden. Das Ligandenkomplement an dem Konjugat kann ein chemisches oder biochemisches sein, das nicht an den Rezeptoren für die Zielliganden bindet. Der Assay wird durch Zugabe von Probe zu jeder Vorrichtung gestartet. Die Probe füllt die Reaktionskammer und wird eine Zeit lang inkubiert, was es den Reagenzien erlaubt, zu einer wesentlichen Gleichgewichtsbindung zu kommen. Das Reaktionsgemisch strömt über das Zeitgatter und auf oder in ein Filterelement, um zu verhindern, dass Ligandenanalog-Ligandenkomplement-Konjugate, die an ihren jeweiligen Rezeptorlatexen gebunden haben, auf das Diagnoseelement gelangen. Typische Filterelemente können aus Nitrocellulose, Cellulose, Nylon und porösem Polyproplyen oder Polyethylen und dergleichen bestehen. Somit gelangt nur das Ligandenanalog-Ligandenkomplement-Konjugat, das nicht durch den Rezeptorlatex gebunden wurde, auf das Diagnoseelement. Der Rezeptor zum Ligandenkomplement des Konjugats wird auf dem Diagnoseelement an der Anlagerungszone immobilisiert und bindet das Konjugat. Ein Waschschritt ist nicht unbedingt erforderlich, da der Filter das an Latex gebundene Konjugat entfernt; die überschüssige Probe oder eine Waschlösung aus der optionalen Reagenskammer kann aber zum Waschen des Diagnoseelements verwendet werden.
Im Fall eines einstufigen quantitativen, konkurrierenden Assay wird der Rezeptor zu dem Ligandenanalogkonjugat oder dem Ligandenkomplement des Konjugats an das Diagnoseelement immobilisiert, wie vorstehend für den einstufigen quantitativen, nicht konkurrierenden Assay beschrieben wurde. Somit wird die Konzentration des Zielliganden in der Probe durch die Strecke der Migration auf dem Diagnoseelement des Konjugats sichtbar gemacht. In einer anderen Betriebsart könnte durch Binden des markierten Konjugats, beispielsweise des Ligandenanalog-Ligandenkomplement-Konjugats, an aufeinander folgende getrennte Anlagerungszonen des Rezeptors an dem Diagnoseelement ein quantitativer Assay durchgeführt werden. Das quantitative Ergebnis wird durch Erschöpfung des Konjugats bei Strömen des Reaktionsgemisches durch die Anlagerungszonen des Diagnoseelements verwirklicht.
Die Vorrichtung als Diagnoseelement
Das Diagnoseelement der Vorrichtung kann mit einem Probenzugabemittel eingesetzt werden, um einen Trennschritt für gebundene und ungebundene Konjugate auszuführen. Ein Beispiel dieser Art von Vorrichtung, die ein Probenzugabemittel, ein Diagnoseelement und einen Behälter für verbrauchtes Reagens aufweist, wird in 2 dargestellt. Im Fall eines nicht konkurrierenden Assay wird zum Beispiel mindestens ein Rezeptorkonjugat in einem geeigneten Gefäß mit einer Probe inkubiert, von der vermutet wird, dass sie mindestens einen Zielliganden enthält, und dieses Reaktionsgemisch wird an der Probenzugabezone der Vorrichtung aufgebracht. Das Reaktionsgemisch strömt dann auf das Diagnoseelement und über die Anlagerungszone eines zum Beispiel immobilisierten Rezeptors zum Zielliganden. Wenn der Zielligand in der Probe vorhanden ist, bindet der Zielliganden-Rezeptorkonkugat-Komplex an dem Rezeptor an der Anlagerungszone. Wenn das Signalentwicklungselement ein Enzym ist, dann wird als Nächstes entweder ein Substrat für das Enzym, das eine visuelle Farbe erzeugt, oder eine Waschlösung gefolgt von einem Substrat der Vorrichtung zugegeben. Überschüssige Reagenzien strömen zu dem Behälter für das verbrauchte Reagens. Das Vorhandensein oder die Menge jedes Zielliganden in der Probe wird dann entweder visuell oder instrumentell bestimmt.
Im Fall eines konkurrierenden Immunassay, wie er zum Beispiel von U.S. Pat. Nr. 5,028,535 und 5,089,391 gelehrt wird, die hiermit durch Erwähnung Bestandteil werden, kann das Diagnoseelement zum Trennen gebundener und ungebundener Ligandenanalog-Konjugate verwendet werden, so dass zum Beispiel die ungebundenen Ligandenanalog-Konjugate an den Rezeptoren des Diagnoseelements proportional zum Vorhandensein oder zur Menge des Zielliganden in der Probe binden.
Ein Fachmann kann erkennen, dass alle Formate von Immunassays oder Genprobenassays, die einen Trennschritt für freie und gebundene Konjugate oder die Trennung freier von gebundenen Reagenzien erfordern, was anschließend zur Fähigkeit führt, ein Signal zu detektieren, die erfindungsgemäßen Merkmale des Diagnoseelements nutzen können. Ein Fachmann wird auch erkennen, dass die erfindungsgemäßen Elemente dieser Erfindung, nämlich die Finger, die Probenreaktionsbarriere, die Reaktionskammer, das Zeitgatter, das Diagnoseelement, das Fluidsteuermittel und der Behälter für verbrauchtes Reagens separat oder in verschiedenen Kombinationen und in Verbindung mit anderen hier nicht beschriebenen Vorrichtungen verwendet werden können. Zum Beispiel können die Probenreaktionsbarriere mit Fingern und die Reaktionskammer in Verbindung mit Vorrichtungen verwendet werden, die poröse Elemente enthalten, beispielsweise Membranen zum Zuführen präziser Reagensvolumina zu dem porösen Element. Das Zeitgatter kann ebenfalls in die vorstehend erwähnten Vorrichtungen integriert werden oder das Zeitgatter kann allein in Verbindung mit Vorrichtungen verwendet werden, die poröse Elemente enthalten. Das Fluidsteuermittel kann ebenfalls in Vorrichtungen eingesetzt werden, die poröse Elemente enthalten, um die Strömungsgeschwindigkeit von Reagenzien durch das poröse Element zu steuern.
Experimentelle Vorgehensweisen
Beispiel 1
Erzeugung eines anti-βhCG-Antikörper-Kolloidalgoldkonjugats
Kolloidales Gold mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 45 nm wurde nach dem Verfahren von Frens, Nature, Physical Sciences, 241, 20 (1973) erzeugt. Das Kolloidalgoldkonjugat wurde zunächst durch Zugeben von 5,6 ml von 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,58, tropfenweise bei schnellem Rühren zu 50 ml kolloidalem Gold erzeugt. Monoklonaler Anti-β-Unterheit-Antikörper zu hCG (Applied Biotech, San Diego, CA; 1 ml von 4,79 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,02% Natriumazid, pH 7) wurde dem kolloidalen Gold in einem Bolus bei schnellem Rühren zugegeben. Nach vollständigem Mischen wurde das Rühren eingestellt und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Polyethylenglykol (mittlere relative Molekülmasse = 20.000) wurde als 1 %-ige Lösung zu der kolloidalen Goldlösung zugegeben (0,58 ml) und die Lösung wurde gemischt. Die kolloidale Goldlösung wurde Zentrifugieren bei 27.000 g und 5°C über 20 min. unterzogen. Der Überstand wurde entfernt und jedes Pellet wurde durch Resuspension und Zentrifugieren mit 35 ml von 10 mM Kaliumphosphat, 2 mM Kaliumborat, 0,01 % Polyethylenglykol (mittlere relative Molekülmasse = 20.000), pH 7, zweimal gewaschen. Nach der abschließenden Zentrifugierung wurde der Pellet in 0,5 ml der Waschpufferlösung resuspendiert. Das Goldkonjugat wurde für den Assay von hCG in eine gepufferte Lösung verdünnt, die 10 mg/ml Rinderserumalbumin bei pH 8 enthielt.
Beispiel 2
Erzeugung eines Anti-αhCG-Antikörper-Latex
Tensidfreie Polystyrenpartikel (Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR; 0,106 ml von 9,4% Trockenmasse, 0,4 μm) wurden während Verwirbelung zu monoklonalem α-Subeinheit-hCG-Antikörper (Applied Biotech, San Diego, CA; 0,89 ml von 6,3 mg/ml in 0,1 M 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure (MES), pH 5,5) zugegeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur 15 min. lang inkubiert. Die Suspension wurde Zentrifugieren zum Pelletisieren der Latexpartikel unterzogen. Das Pellet wurde durch Zentrifugieren und Resuspension des Pellets mit 10 mM MES, 0,1 mg/ml Trehalose, pH 5,5, dreimal gewaschen. Das Endpellet wurde in der Waschpufferlösung bei einer Feststoffkonzentration von 1 % resuspendiert.
Beispiel 3
Erzeugung eines Ziegen-Antimaus-Latex
Tensidfreie Polystyrenpartikel (Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR; 0,11 ml von 9,4% Trockenmasse, 0,6 μm) wurden während Verwirbelung zu Ziegen-IgG-Antikörper gegen Maus-IgK (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; 0,89 ml von 0,34 mg/ml in 0,1 M MES, pH 5) zugegeben und die Suspension wurde bei 45°C 2 Stunden lang inkubiert. Die Suspension wurde Zentrifugieren zum Pelletisieren der Latexpartikel unterzogen. Das Pellet wurde durch Zentrifugieren und Resuspension des Pellets mit 10 mM MES, 0,2 mg/ml Trehalose, pH 5,5, dreimal gewaschen. Das Endpellet wurde in der Waschpufferlösung bei einer Feststoffkonzentration von 1 resuspendiert.
Beispiel 4
Erzeugung der einstufigen Vorrichtung für einen qualitativen hCG-Assay
Es wurde eine einstufige Vorrichtung aus Kunststoff mit einem Probenzugabebehälter von 80 bis 100 μl, einer Reaktionskammer von 20 μl und einem Behälter für verbrauchtes Reagens mit 40 μl gebaut. Diese Vorrichtung ist für das Verwenden von Proben von etwa 20 μl bis 100 μl ausgelegt, die Reaktionskammer ist aber bei 20 μl festgelegt. Wenn ein größeres Reaktionsgemischvolumen für den erwünschten Assay erforderlich ist, dann würde die Reaktionskammer auf dieses Volumen vergrößert werden und der Probenzugabebehälter würde etwa das zwei- bis vierfache des Volumens des Reaktionskammervolumens haben. Die Vorrichtungen wurden plasmabehandelt, um funktionelle Gruppen aufzupfropfen, die eine hydrophile Oberfläche erzeugen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Plasmabehandlung des Kunststoffs in einer gesteuerten Atmosphäre eines spezifischen Gases in einem Hochfrequenzfeld erfolgt. Das Gas ionisiert, was freie Radikale erzeugt, die mit der Oberfläche reagieren. Der Probenzugabebehälter wurde als Trapezoid mit den Maßen 14 mm und 7 mm für die parallelen Seiten und 7 mm für die anderen Seiten mit einer Tiefe von 0,49 mm geformt. Der Probenzugabebehälter war neben der Probenreaktionsbarriere. Die Probenzugabebarriere war 1,5 mm lang und 7 mm breit, einschließlich der parallel zur Strömung der Probe bei einer Dichte von 50 Nuten pro cm und einer Tiefe von 0,1 mm verlaufenden Nuten. Bei Probenvolumina, die größer als 20 bis 80 μl sind, könnte die Breite der Reaktionsbarriere und dadurch der Reaktionskammer vergrößert werden, um die erwünschte Strömungsgeschwindigkeit zu gestatten, die Nutengröße bzw. -dichte könnte aber wie angegeben bleiben. Die Finger in den Wänden der Reaktionskammer und dem Behälter für verbrauchtes Reagens waren 1 mm breit und 0,4 mm tief, mit 7 Fingern in jeder Wand der Reaktionskammer und des Behälters für verbrauchtes Reagens. Das Reaktionskammervolumen betrug 20 μl. Die Reaktionskammer war als Trapezoid mit den Maßen 7 mm und 3,5 mm für die parallelen Seiten und 7,1 mm für die anderen Seiten, mit Tiefen von 0,56 mm für eine 20 μl große Reaktionskammer geformt. Das Diagnoseelement war etwa 2,5 cm lang, 2 mm breit und 1 mm vom Unterteil der Vorrichtung, wobei es Nuten enthielt, die senkrecht zum Strömen des Reaktionsgemisches bei einer Dichte von 100 Nuten pro cm und einer Tiefe von 0,05 mm verliefen. Im Fall eines Zeitgatters an dem Diagnoseelement war das Zeitgatter an dem Diagnoseelement unmittelbar neben der Reaktionskammer positioniert. Die Breite des Diagnoseelements konnte vergrößert werden, um das Strömen des Reaktionsgemisches auf die erwünschte Geschwindigkeit an den Anlagerungszonen vorbei anzuheben. Der Anti-αhCG-Antikörperlatex (1 μl) und der Ziegen-Antimaus-Latex (1 μl) wurden bei einem Abstand von etwa 1,5 cm an dem Diagnoseelement der Vorrichtungen aufgebracht. Das Anti-βhCG-Antikörper-Kolloidalgold-Konjugat (10 μl) wurde in die Mulde der Reaktionskammer pipettiert. Die Vorrichtungen wurden etwa 15 min. unter Vakuum gesetzt, um die Reagenzien zu trocknen. Der Behälter für verbrauchtes Reagens hatte die Form eines Trapezoids mit den Maßen 7 mm und 15 mm für die parallelen Seiten und 8 mm für die anderen Seiten, mit einer Tiefe von 0,5 mm. Unter Bezug auf 4 bewegte sich in einer bevorzugten Ausführung (beste Betriebsart) des Behälters für verbrauchtes Reagens das Reaktionsgemisch von dem Diagnoseelement 6 unterstützt durch Finger 52 (1 mm breit und 0,4 mm tief, mit 7 Fingern) zu einem Kapillarraum 55 (1,25 mm lang, 27,5 mm breit und 0,48 mm tief) und dann in eine gerillte Kapillarstruktur (13,6 mm lang, 25,4 mm breit, 0,61 mm tief, mit einer Dichte von 16 Nuten pro cm). Die Außenwände und die obere Fläche der Wände des Probenzugabebehälters und der Reaktionskammer wiesen eine dünne Beschichtung aus Siliconfett auf, um das Austreten von Reagenzien aus dem Behälter und der Kammer der zusammengebauten Vorrichtung zu verhindern. Die Kapillarräume in den Vorrichtungen wurden dann durch Setzen einer transparenten Kunststoffpolycarbonatfolie oben auf die Vorrichtung gebildet. Die Kunststofffolie wurde mit Klammern an der gegenüberliegenden Oberfläche gehalten. Die transparente Kunststofffolie hatte eine Probenöffnung über dem Probenzugabebehälter zum Einbringen von Probe.
Beispiel 5
Qualitativer einstufiger Assay für hCG
Die in Beispiel 4 beschriebenen Vorrichtungen wurden für den qualitativen einstufigen Assay für hCG verwendet. Die Assay-Zeiten für die Vorrichtungen ohne die Zeitgatter betrugen etwa 5 bis 10 min. Eine Urinlösung (60 μl), die 0, 50, 200 und 500 mlU hCG/ml enthielt, wurde dem Probenbehälter der Vorrichtung zugegeben. Die Probe bewegte sich in die Reaktionskammer, löste das Kolloidalgoldkonjugat auf und das Reaktionsgemisch bewegte sich auf das Diagnoseelement über die Anti-hCG-Latex- und Ziegen-Antimaus-IgG-Latex-Anlagerungszonen. Das Reaktionsgemisch bewegte sich in den Behälter für das verbrauchte Reagens und die überschüssige Probe wusch das Diagnoseelement. Die Farbdichte der Anlagerungszonen für hCG wurde instrumentell mit Hilfe eines Minolta Chroma Meter CR 241 bei 540 nm gemessen. An den Anlagerungszonen für hCG war bei Proben, die hCG enthielten, eine rote Farbe sichtbar, und bei der Probe ohne hCG war diese nicht sichtbar. Die ΔE*-Werte für die 0, 50, 200 und 500 mlU/ml waren 0, 7,78, 12,95 bzw. 20,96 und bei den positiven Kontrollzonen (Ziegen-Antimaus-IgG) wurde ein unverkennbarer roter Balken mit einem ΔE* von etwa 35 beobachtet.
Beispiel 6
Qualitativer einstufiger Assay für hCG unter Verwendung eines Zeitgatters
Es wurden wie in Beispiel 4 beschrieben Vorrichtungen unter Zugabe des Zeitgatters erzeugt. Das Zeitgatter wurde an dem Diagnoseelement gebildet, das mit dem Reaktionsgemisch in der Reaktionskammer in Kontakt steht. Das Zeitgatter wurde durch Zugeben von 1 μl von 2% Trockenmasse von tensidfreiem sulfatierten Latex, 1,0 μm (Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR) erzeugt. Die anderen Reagenslatexe und das Goldkonjugat wurden ebenfalls den Vorrichtungen zugegeben und wie in Beispiel 5 beschrieben getrocknet. Es wurden transparente Kunststofffolien auf die Vorrichtungen gegeben, und die Probe (etwa 60 μl), die 0, 50, 200 und 500 mlU hCG/ml enthielt, wurde den Vorrichtungen zugegeben. Die Probe bewegte sich in die Reaktionskammer, löste das kolloidale Goldkonjugat auf und das Reaktionsgemisch verblieb etwa 8 bis 10 min. in der Reaktionskammer, wohingegen in Vorrichtungen ohne Zeitgatter das Reaktionsgemisch 5 sek. bis 15 sek. in der Reaktionskammer verblieb. Die proteinhaltigen Bestandteile des Reaktionsgemisches, die in der Probe vorhanden sein können und die als Komponente des Reaktionsgemisches zugegeben wurde, nämlich Rinderserumalbumin, banden an die Latexpartikel des Zeitgatters und änderte die hydrophobe Oberfläche des Zeitgatters in eine hydrophile Oberfläche. Andere Proteine wie Gelatine, Serumalbumine, Immunglobuline, Enzyme und dergleichen sowie Polypeptide und hydrophile Polymere funktionieren ebenfalls so, dass sie an der hydrophoben Zone anbinden. Die allmähliche Umwandlung der hydrophoben Oberfläche zu einer hydrophilen Oberfläche, die sich durch Binden der proteinhaltigen Komponenten des Reaktionsgemisches an den Latexpartikeln ergab, ließ das Reaktionsgemisch über die Fläche des Zeitgatters strömen. Bei Kontrollexperimenten, bei denen Protein, nämlich Rinderserumalbumin, nicht dem Reaktionsgemisch zugegeben wurde, erfolgte während der Zeit (5 Stunden) des Experiments kein Strömen des Reaktionsgemisches über das Zeitgatter und auf das Diagnoseelement. Dieses Kontrollexperiment zeigte, dass die Urinprobe allein nicht ausreichend Protein oder Bestandteile enthält, die an dem aufgebrachten Latex des Zeitgatters binden, um eine Änderung des hydrophoben Charakters des Zeitgatters zuzulassen. Falls die Komponenten in der Probe nur verwendet werden sollten, um die Umwandlung des hydrophoben Zeitgatters in ein hydrophiles zu bewirken, damit das Reaktionsgemisch strömen kann, dann müsste man die Masse und die Gesamtfläche des an dem Zeitgatter angebrachten Latex so weit senken, dass ein Strömen des Reaktionsgemisches über das Zeitgatter in einer geeigneten Zeitdauer möglich würde. Das Reaktionsgemisch bewegte sich dann auf das Diagnoseelement über die Anti-hCG-Latex- und Ziegen-Antimaus-IgG-Latex-Anlagerungszonen. Das Reaktionsgemisch bewegte sich in den Behälter für verbrauchtes Reagens und die überschüssige Probe wusch das Diagnoseelement. Die Farbdichte der Anlagerungszonen für hCG wurde instrumentell mit Hilfe eines Minolta Chroma Meter CR 241 gemessen. An den Anlagerungszonen für hCG war bei Proben, die hCG enthielten, eine rote Farbe sichtbar, und bei der Probe ohne hCG war diese nicht sichtbar. Die ΔE*-Werte für die 0, 50, 200 und 500 mlU/ml waren 0, 6,51, 13,14 bzw. 18,19. An den Ziegen-Antimaus-IgG-Anlagerungszonen jeder Vorrichtung war ein roter Balken sichtbar.
Beispiel 7
Qualitativer einstufiger Assay für hCG unter Verwendung eines Strömungssteuermittels
Es wurden wie in Beispiel 4 beschrieben Vorrichtungen unter Zugabe des optionalen Strömungssteuermittels erzeugt. Das optionale Strömungssteuermittel bzw. der „Spalt" wurde hinter der Anlagerungszone für hCG-Goldkonjugat an dem Diagnoseelement positioniert. Der Spalt zwischen den beiden Flächen betrug 0,38 mm, die Länge des Spalts betrug 13,2 mm und die Breite des Spalts an dem oberen Element betrug 9 mm; die nutzbare Breite des Spalts war aber die Breite des Diagnoseelements (2 mm). Dieses Spaltvolumen über dem Diagnoseelement betrug etwa 10 μl, was in diesem Fall das halbe Volumen der Reaktionskammer war. Die Anti-hCG- und die Ziegen-Antimaus-Latexe und das Goldkonjugat wurden der Vorrichtung zugegeben und wie in Beispiel 5 beschrieben getrocknet. Es wurden transparente Kunststofffolien aus Polycarbonat mit einem Spalt in einer Oberfläche auf die Vorrichtungen gegeben, wobei der Spalt dem Diagnoseelement zugewandt war. Eine Probe (etwa 60 μl), die 0 und 200 mlU hCG/ml enthielt, wurde den Vorrichtungen zugegeben. Die Probe bewegte sich in die Reaktionskammer, löste das kolloidale Goldkonjugat auf und das Reaktionsgemisch bewegte sich dann auf das Diagnoseelement über den Anti-hCG-Latex. Das Reaktionsgemisch drang dann in den Spalt ein, der sich unmittelbar hinter der Anlagerungszone des Anti-hCG-Latex befand. Die Strömungsgeschwindigkeit über der Anlagerungszone verlangsamte sich, während sich das Reaktionsgemisch über die Anlagerungszone bewegte und den Spalt füllte. Die Zeit, die die 10 μl Reaktionsgemisch zum Füllen des Spalts benötigten, betrug etwa 12 min. bis 16 min., wohingegen bei Vorrichtungen ohne das optionale Strömungssteuermittel die Zeiten, die das Reaktionsgemisch zum Strömen über die Anlagerungszone benötigte, bei etwa 1 min. bis 3 min. lagen. Als das Reaktionsgemisch den Spalt gefüllt hatte, bewegte sich das Reaktionsgemisch dann in die schmale Kapillare des Diagnoseelements und über die Ziegen-Antimaus-Anlagerungszone. Das Reaktionsgemisch bewegte sich in den Behälter für verbrauchtes Reagens und die überschüssige Probe wusch das Diagnoseelement. Die Farbdichte der Anlagerungszonen für hCG wurde instrumentell mit Hilfe eines Minolta Chroma Meter CR 241 gemessen. An den Anlagerungszonen für hCG war bei Proben, die hCG enthielten, eine rote Farbe sichtbar, und bei der Probe ohne hCG war diese nicht sichtbar. Die ΔE*-Werte für die 0 und 200 mlU/ml waren 0 und 16,12. Der ΔE*-Wert für die hCG-Anlagerungszone für die Vorrichtung ohne das Strömungssteuermittel betrug für die 200 mlU/ml Probe 16,32. An den Ziegen-Antimaus-IgG-Anlagerungszonen jeder Vorrichtung war ein roter Balken sichtbar.
Beispiel 8
Erzeugung des Diagnoseelements für mehrstufige Assays
Es wurde eine Vorrichtung gebaut, die einen Probenzugabebehälter und ein Diagnoseelement enthielt. Die Vorrichtungen wurden plasmabehandelt, um funktionelle Gruppen aufzupfropfen, die eine hydrophile Oberfläche erzeugen. Der Probenzugabebehälter hatte die Maße 12 mm lang, 6 mm breit und 0,05 mm tief. Das Diagnoseelement war etwa 5,5 cm lang, 1,3 mm breit und 1 mm vom Unterteil der Vorrichtung und wies Nuten auf, die senkrecht zum Strömen des Reaktionsgemisches bei einer dichte von 100 Nuten pro cm und einer Tiefe von 0,05 mm verliefen. Im Fall von qualitativen Assays wurde der Antikörperlatex (1 μl) auf das Diagnoseelement aufgebracht, wobei er die gesamte Breite und 1 cm Länge des Diagnoseelements bedeckte. Im Fall eines immunochromatographischen Assay wurde der Antikörperlatex (6 μl) auf die gesamte Breite und Länge des Diagnoseelements aufgebracht. Die Vorrichtungen wurden etwa 1 Stunde lang unter Vakuum gesetzt, um die Reagenzien zu trocknen. Die Kapillarräume in der Vorrichtung wurden dann durch Setzen einer transparenten Kunststoffpolystyrenfolie oben auf die Vorrichtung gebildet. Die Kunststofffolie wurde mit Klammern an der gegenüberliegenden Oberfläche gehalten.
Beispiel 9
Assay für hCG unter Verwendung des Diagnoseelements
Das in Beispiel 8 beschriebene Diagnoseelement wurde für den Assay von hCG verwendet. Urinproben (20 μl), die 0, 50, 200 und 500 mlU hCG/ml enthielten, wurden in Röhrchen gegeben, die Anti-βhCG-Antikörper-Kolloidalgoldkonjugat (2 μl) enthielten. Die Röhrchen wurden verwirbelt und die Reaktionsgemische wurden 5 min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsgemische (20 μl) wurden in 10 μl großen aliquoten Teilen auf den Probenzugabebehälter der Vorrichtung aufgebracht. Das Reaktionsgemisch strömte von dem Probenbehälter auf das Diagnoseelement und über die Anlagerungszone. Ein absorbierender Stoff am Ende der Anlagerungszone bewegte das verbrauchte Reagens aus dem Diagnoseelement. Die Farbdichte der Anlagerungszonen für hCG wurde instrumentell mit Hilfe eines Minolta Chroma Meter CR 241 gemessen. An den Anlagerungszonen für hCG war bei Proben, die hCG enthielten, eine rote Farbe sichtbar, und bei der Probe ohne hCG war diese nicht sichtbar. Die ΔE*-Werte für die 0, 50, 250 und 500 mlU/ml waren 0,00, 1,24, 3,16 bzw. 5,56.
Beispiel 10
Synthese von Meta-Nitrophencyclidin
Einer eisgekühlten Lösung von Phencyclidin-Hydrochlorid (5 g, 1,8 × 10^–2 Mol) in konzentrierter Schwefelsäure (9 ml) wurden tropfenweise und mit Rühren rauchende Salpetersäure (2 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eiswasserbad 1 Stunde lang gerührt und dann auf zerstoßenes Eis/Wasser geschüttet. Das Gemisch wurde mit 10N Natriumhydroxid (50 ml) auf pH12 alkalisch gemacht und mit Diethylether (2 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und unter Vakuum verdampft. Die Rückstände wurden mit Methylalkohol (20 ml) behandelt und auf einem Heißwasserbad (80°C) erhitzt, bis sich die Substanz auflöste. Der Kolben wurde mit Aluminiumfolie (Produkt ist lichtempfindlich) abgedeckt und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei ein gelber Feststoff niederschlug. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet, um 3,0 g (58%) m-Nitrophencyclidin als feine gelbe Kristalle zu erhalten, die vor Licht geschützt wurden: Schmelzpunkt 81–82°C.
Beispiel 11
Synthese von Meta-Aminophencyclidin
Einer Rührlösung aus m-Nitrophencyclidin (3,0 g, 10,4 × 10^–3 Mol) in Methylalkohol (150 ml) wurden unter einem Argonstrom 10% Palladadiumcarbon (0,5 g) gefolgt von Ammoniumformiat (4,0 g, 6,3 × 10^–2 Mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, woraufhin der Katalysator durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft wurde. Die Rückstände wurden mit 1N Kaliumhydroxidlösung (30 ml) behandelt und mit Diethylether (2 × Mol 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und unter Vakuum verdampft. Die Rückstände wurden in Hexan (20 ml) aufgelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei ein weißer Feststoff niederschlug. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet, um 1,4 g (52%) m-Aminophencyclidin zu erhalten: Schmelzpunkt 121–122°C.
Beispiel 12
Synthese von Acetylthiopropionsäure
Einer gerührten Lösung aus 3-Mercaptoproprionsäure (7 ml, 0,08 Mol) und Imidazol (5,4 g, 0,08 Mol) in Tetrahydrofuran (THF, 700 ml) wurde tropfenweise 15 Minuten lang unter Argon eine Lösung aus 1-Acetylimidazol (9,6 g, 0,087 Mol) in THF (100 ml) zugegeben. Die Lösung ließ man weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur rühren, woraufhin das THF in vacuo entfernt wurde. Die Rückstände wurden mit eiskaltem Wasser (18 ml) behandelt und die sich ergebende Lösung mit eiskaltem konzentrierten HCl (14,5 ml) auf pH 1,5–2 sauer eingestellt. Das Gemisch wurde mit Wasser (2 × 50 ml) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Das restliche grobe gelbe ölige Feststoffprodukt (10,5 g) wurde aus Chloroformhexan rekristallisiert, um 4,8 g (41 % Ausbeute) Acetylthiopropionsäure als weißen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 44–45°C zu erhalten.
Beispiel 13
Synthese von Meta-Acetylthiopropionamid-Phencyclidin
Einer gerührten Lösung aus m-Aminophencyclidin (1,4 g, 5,4 × 10^–3 Mol) und Acetylthiopropionsäure (0,87 g, 5,8 × 10^–3 Mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (7 ml) wurde Dicyclohexylcarbodiimid (1,19 g, 5,8 × 10^–3 Mol) zugegeben. Der Kolben wurde mit Argon gespült und die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde aus unlöslichem Dicyclohexylurea gefiltert und unter Vakuum verdampft. Der restliche Feststoff wurde aus Chloroform/Hexan rekristallisiert, um 1,5 g (71 %) m-Acetylthiopropionamid-Phencyclidin als weißen kristallinen Feststoff zu erhalten: Schmelzpunkt 152–4°C.
Beispiel 14
Synthese von Meta-3-Mercaptoproprionamid-Phencyclidin
Meta-Acetylthiopropionamid-Phencyclidin (0,01 g, 2,57 × 10^–5 Mol) wurde in 1,29 ml 0,12M Kaliumcarbonat in 80% Methanol/20% Wasser (V/V) ausgelöst. Die Lösung saß 5 min. bei Raumtemperatur und dann wurden 0,2 ml 0,5 M Kaliumphosphat, pH7, unmittelbar zugegeben und die Lösung wurde mit Hydrochlorsäure (1N) auf pH 7–7,5 eingestellt. Die Titelverbindung in Lösung wurde, so wie sie war, verwendet, um mit BSA-SMCC zu reagieren.
Beispiel 15
Erzeugung von Phencyclidin-Analog gebunden an Rinderserumalbumin (BSA-PCP)
Rinderserumalbumin (BSA, 3,5 ml von 20 mg/ml) wurde durch Zugabe einer Lösung von 6,7 mg SMCC in 0,3 ml Acetonitril und Rühren der Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur bei Beibehalten des pH zwischen 7 und 7,5 mit 1N Kaliumhydroxid mit Succinimidyl 4-(N-maleidiomethyl)-cyclo-hexan-1-carboxylat (SMCC, Pierce Chemical Co.) reagiert. Das Protein wurde durch Gelfiltrationschromatographie in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0, von unreagierten Verbindungen getrennt. Das Meta-3-mercaptoproprionamid-Phencyclidin (0,2 ml von 13 mM) wurde dem BSA-Maleimid (2 ml bei 8,2 mg/ml) zugegeben und die Lösung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann dreimal gegen 1.000 ml von 10 mM MES, pH 5,5, dialysiert. Gewonnen wurden 1,8 ml BSA-PCP bei 8 mg/ml.
Beispiel 16
Erzeugung von Phencyclidin-Analog-Kolloidalgoldkonjugat
Eine Lösung (4,7 ml), die BSA (22 mg) und BSA-PCP (5,6 mg) in 10 mM MES, pH 5,5 enthielt, wurde kolloidalem Gold (105 ml) in 10 mM MES, pH 5,5, in einem Bolus mit schnellem Rühren zugegeben. Nach Fertigmischen wurde das Rühren eingestellt und die Lösung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Das Kolloidgoldkonjugat wurde Diafiltration gegen 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Kaliumborat, pH 7, unter Verwendung einer Tangentialströmvorrichtung (Sartorius Easy Flow, relativer Molekülmassenrest war 100.000) unterzogen, um BSA und BSA-PCP zu entfernen, die nicht an dem kolloidalen Gold gebunden waren. Das Goldkonjugat wurde für den Assay von PCP in eine gepufferte Lösung verdünnt, die 10 mg/ml Rinderserumalbumin bei pH 7,5 enthielt.
Beispiel 17
Erzeugung von Anti-Phencyclidin-Antikörperlatex
Tensidfreie Polystyrenpartikel (Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR; 0,074 ml von 9,4% Trockenmasse, 0,4 μm) wurden unter Verwirbeln zu Anti-Phencyclidin-Monoklonalantikörper (0,926 ml von 5,86 mg/ml in 0,1 M MES, pH 5) zugegeben und die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 45°C inkubiert. Die Suspension wurde Zentrifugieren unterworfen, um die Latexpartikel zu pelletieren. Das Pellet wurde durch Zentrifugieren und Resuspension des Pellets mit 10 mM MES, 0,1 mg/ml Trehalose, pH 5,5 dreimal gewaschen. Das Endpellet wurde in der Waschpufferlösung bei einer Feststoffkonzentration von 1 % resuspendiert.
Beispiel 18
Erzeugung von lateximmobilisiertem, affinitätsgereinigten Ziegen-IgG-Antikörper gegen das Fc-Fragment von Maus-IgG (Ziegen-Antimaus-Fc-Latex)
Affinitätsgereinigte Ziegen-Antimaus-(Fc(Immunosearch) und Polystyren-Latexpartikel (sulfatiert, 1,07 μm) (Interfacial Dynamics) wurden separat bei 45°C eine Stunde lang inkubiert, wobei die Antikörperlösung mit 0,1 M 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure bei pH 5,5 gepuffert wurde. Während des Verwirbelns der Antikörperlösung wurde die Suspension aus Latexpartikeln der Antikörperlösung zugegeben, so dass die Endkonzentration der Antikörper 0,3 mg/ml betrug und die Lösung 1 % Latextrockenmasse enthielt. Die Suspension wurde vor dem Zentrifugieren der Suspension zum Pelletisieren der Latexpartikel 2 Stunden lang bei 45°C inkubiert. Das Latexpellet wurde in 1 % Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Zentrifugieren zum Pelletisieren des Latex wurde das Pellet durch Resuspension in PBS und Zentrifugieren dreimal gewaschen. Das Endpellet wurde in PBS, das 0,1 % Natriumazid bei pH 7,0 enthielt, bei einer Latexkonzentration von 1 % Feststoffen resuspendiert.
Beispiel 19
Assay für Phencyclidin unter Verwendung des Diagnoseelements
Das in Beispiel 8 beschriebene Diagnoseelement wurde für den Assay von Phencyclidin (PCP) verwendet. Urinproben (133 μl), die 0, 100, 200 und 300 ng/ml PCP enthielten, wurden den Röhren zugegeben, die eine lyophilisierte Pufferzusammensetzung (die 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchlorid und 10 mg/ml BSA, pH 8 enthielt) enthielten, und es wurde Phencyclidin-Analog-Kolloidalgoldkonjugat (4 μl) zugegeben und die Lösung wurde verwirbelt. Jedem Röhrchen wurde Anti-PCP-Antikörper (2,8 μl von 0,1 mg/ml) zugegeben und die Lösungen wurden verwirbelt und bei Raumtemperatur 5 min. lang inkubiert. Ziegen-Antimaus-Fc-Latex (50 ml einer 1%-Suspension) wurden den Röhrchen zugegeben, die Röhrchen wurden verwirbelt und bei Raumtemperatur 10 min. lang inkubiert. Die Lösungen wurden dann gefiltert, um den Komplex des PCP-Analog-GOldkonjugat:Anti-PCP-Antikörper:Ziegen-Antimaus-Latex aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Gelman Acrodis^R 3 Spritzenfilters (0,45 μm) zu entfernen. Die Filtrate der Reaktionsgemische (20 μl) wurde wie in Beispiel 8 beschrieben auf die Diagnoseelemente aufgebracht. Das Reaktionsgemisch strömte von dem Probenbehälter auf das Diagnoseelement und über die Anlagerungszone. Ein 1 cm nach der Anlagerungszone angeordnetes saugfähiges Textilgewebe entfernte das verbrauchte Reagens aus dem Diagnoseelement. Die Farbdichte der Anlagerungszonen wurde instrumentell mit Hilfe eines Minolta Chroma Meter CR 241 gemessen. Die ΔE*-Werte für die 0, 100, 200 und 300 ng/ml Proben waren 0,69, 9,28, 14,04 bzw. 21,6.
Wenngleich die vorstehende Erfindung recht eingehend veranschaulichend und beispielhaft beschrieben wurde, versteht sich, dass gewisse Änderungen oder Abwandlungen innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche vorgenommen werden können. Hinweise auf „bevorzugte" Ausführungen, wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf die besten Arten der Umsetzung der Erfindung.

Claims

Assay-Vorrichtung (10) zum Detektieren mindestens eines Zielliganden in einer Fluidprobe, wobei die Assay-Vorrichtung umfasst: a. einen Probenzugabebehälter (2); b. ein Zeitgatter (5) für das Verzögern des Strömens von Fluid; und c. ein Diagnoseelement (6) mit einem Rezeptor daran für den Zielliganden zum Immobilisieren des mindestens einen Zielliganden in mindestens einer Zone, wobei die Assay-Vorrichtung so ausgelegt und angeordnet ist, dass die Fluidprobe von dem Probenzugabebehälter zu dem Zeitgatter zu dem Diagnoseelement strömt, und dadurch gekennzeichnet, dass das Zeitgatter mindestens eine hydrophobe Zone umfasst, die ein Strömen zu der mindestens einen Zone verzögert, bis die hydrophobe Zone durch Binden einer Komponente oder von Komponenten in dem zum Zeitgatter vordringenden Fluid ausreichend hydrophil gemacht ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1, welche weiterhin eine Reaktionskammer (4) zwischen dem Probenzugabebehälter und dem Zeitgatter umfasst, wobei die Reaktionskammer Reagenzien zum Bilden eines Reaktionsgemisches bei Erhalt eines Volumens der Fluidprobe umfasst.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 2, welche weiterhin eine Probenreaktionsbarriere zwischen dem Probenzugabebehälter und der Reaktionskammer umfasst, wobei die Barriere eine größere Kapillarität als die Reaktionskammer aufweist, wobei Fluid der Kapillarkraft folgend von der Probenreaktionsbarriere zur Reaktionskammer strömt.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, welche weiterhin einen Behälter für verbrauchte Reagenzien mit einem stromabwärts des Diagnoseelements angeordneten Kapillarraum umfasst, wobei Fluid der Kapillarkraft folgend von dem Diagnoseelement zu dem Behälter für verbrauchte Reagenzien strömt.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, welche weiterhin eine in der Reaktionskammer angeordnete Wand umfasst, die senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht zur Richtung des Strömens von Fluid durch die Reaktionskammer ist, wobei die Wand einen oder mehrere Finger umfasst.
Assay-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe Zone des Zeitgatters hydrophobe Polyelektrolyte umfasst.
Assay-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass das Zeitgatter V-förmig ist.
Assay-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass das Diagnoseelement durchsichtig ist.
Assay-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass das Diagnoseelement Latexpartikel umfasst, die darauf den Rezeptor für den Zielliganden umfassen.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Latexpartikel einen Durchmesser zwischen 0,01 μm und 10 μm aufweisen.
Assay-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe Zone des Zeitgatters Latexpartikel umfasst.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Latexpartikel einen Durchmesser zwischen 0,01 μm und 10 μm aufweisen.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass das Zeitgatter mindestens eine Nut umfasst.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut parallel zur Richtung des Strömens der Fluidprobe ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut senkrecht zur Richtung des Strömens der Fluidprobe ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer 0,05 mm bis 10 mm tief ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer eine Rampe umfasst.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Rampe im Verhältnis zum Boden der Reaktionskammer bei einem Winkel zwischen 25 Grad und 45 Grad vorliegt.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenreaktionsbarriere mindestens eine Nut umfasst.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut senkrecht zur Richtung des Strömens der Fluidprobe ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut parallel zur Richtung des Strömens der Fluidprobe ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut 0,01 mm bis 0,5 mm tief ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut 0,5 mm bis 2 mm breit ist.
Assay-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Diagnoseelement mindestens eine Nut umfasst.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut parallel zur Richtung des Strömens der Fluidprobe ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut senkrecht zur Richtung des Strömens der Fluidprobe ist.
Assay-Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nut eine von mehreren Nuten ist, die zwischen 1 nm und 0,5 mm von einander beabstandet sind.