DE69229777T3

DE69229777T3 - Konfokales abbildungssystem für sichtbares und uv-licht

Info

Publication number: DE69229777T3
Application number: DE69229777T
Authority: DE
Inventors: Allison Christyne Okemos BLITON; David Eldon Rochester CLAPHAM; James Donald Gordonsville LECHLEITER
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1991-04-10
Filing date: 1992-04-08
Publication date: 2010-12-30
Anticipated expiration: 2012-04-09
Also published as: JPH06506538A; DE69229777T2; CA2106296C; DE69229777D1; EP0579724B2; EP0579724A4; EP0579724A1; WO1992018850A1; CA2106296A1; EP0579724B1; JP3280969B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein konfokale Mikroskopie und im spezielleren ein konfokales Rastermikroskop, das mit sichtbarem und UV-Licht einsetzbar ist.
Fluoreszenzlicht-Mikroskopie findet in der biologischen Forschung und medizinischen Diagnose weitverbreitet Anwendung. Es sorgt für die Selektivität, die notwendig ist, damit spezifische Komponenten einer Zelle oder von Gewebe sichtbar gemacht werden können und die räumliche Organisation solcher Komponenten bestimmt werden kann. Konfokale Mikroskopie arbeitet so, daß diese Beleuchtung und Detektion auf einen einzigen Punkt in der Probe beschränkt wird. Das wird typischerweise unter Verwendung räumlicher Filter (üblicherweise Stiftlöcher) in den optischen Wegen des Objektivs und des Kondensors erreicht, und ein vollständiges Bild wird aufgebaut, indem nacheinander alle Punkte im Sichtfeld abgetastet werden.
Ein spezielles konfokales Mikroskop wird im U.S.-Patent Nr. 5.032.720 gezeigt. Das Mikroskop erzeugt einen kleinen (vorzugsweise beugungsbegrenzten) Punkt auf einer Probe, tastet den Punkt über die Probe in einem Rastermuster ab und erzeugt ein elektrisches Signal, das zur Intensität von Licht proportional ist, das aus dem Bereich des Punkts austritt und gesammelt wird. Das elektrische Signal wird zu einem Computer übermittelt, der eine visuelle Anzeige auf dem Monitor erzeugen kann.
Der optische Zug zwischen der Quelle (oder dem Detektor) und der Probe umfaßt eine Fokussierungsoptik, um den Punkt zu bilden, und Abtastelemente, um den Strahl in zwei orthogonale Richtungen abzutasten, um das Rastermuster auf der Probe zu bilden. Das aus der Probe austretende Licht geht einen Rückweg entlang zu einem Detektor, der das elektrische Signal erzeugt. Eine Öffnung in Form einer Irisblende ist vor dem Detektor angeordnet und blockiert Licht, das aus Punkten ausstrahlt, die räumlich vom Strahlenpunkt versetzt sind.
Zubehör für ein konfokales Mikroskop zur Verwendung in Kombination mit einem herkömmlichen Mikroskop wird unter dem Markennamen MRC-500 und MrC-500 von Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA, verkauft. Das resultierende konfokale Mikroskop stellt einen sichtbaren Erregerstrahl bereit und erfühlt Fluoreszenz im sichtbaren Strahl.
Die vorliegende Erfindung stellt ein konfokales Rastermikroskop bereit, das fähig ist, für UV-Erregung zu sorgen; selbiges ist auch der US-A-4893008 zu entnehmen. Gemäß vorliegender Erfindung korrigiert der optische Zug jedoch im wesentlichen Abtast- und Fokussierungsfehler über den Wellenlängenbereich, der UV- und sichtbare Wellenlängen umfaßt. Achromatische Korrektur an sich ist bekannt – siehe beispielsweise US-A-3598471 .
Kurz zusammengefaßt umfaßt das konfokale Rastermikroskop gemäß vorliegender Erfindung eine UV-Erregerquelle und UV-durchlässige Abtast- und Abbildungsoptik. Das UV-Licht wird einen Hinweg entlang gelenkt und zu einem kleinen Punkt in einer Probenebene fokussiert. Aus dem Bereich des Punktes ausstrahlendes Licht wird einen Rückweg entlang gelenkt und detektiert. Licht, das aus Stellen ausstrahlt, die aus dem Punkt räumlich verschoben sind, wird von der Detektoröffnung abgewiesen. Der Strahlenpunkt wird im Rastermuster über die Probe abgetastet. Wenn das zurückkehrende Licht sichtbar ist (wie beispielsweise, wenn es erwünscht ist, sichtbare Fluoreszenz zu detektieren,) wird der optische Zug sowohl für sichtbares als auch für UV-Licht konfokal gemacht. Das ermöglicht es auch, für gleichzeitige Erregung im UV- und im sichtbaren Bereich zu sorgen.
Um das zu erreichen, werden die Linsen im gemeinsamen Wegabschnitt des optischen Zugs bezüglich chromatisch herbeigeführter Abtastfehler korrigiert. Eine UV-Linse ist im UV-Hinweg vorgesehen, um Fokussierungsfehler aufgrund longitudinaler chromatischer (sichtbarer/UV-) Aberration auszugleichen. Zu diesem Zweck können Extra-Linsen in dem UV-Hinweg vorgesehen sein. Das Trennen der Korrektur von Abtastfehlern und Fokussierungsfehlern macht es einfach, verschiedene Objektive unterzubringen, bei denen der Grad der longitudinalen chromatischen Aberration variiert.
Ein weiteres Verständnis der _{Beschaffenheit} und der Vorteile der vorliegenden Erfindung kann unter Bezugnahme auf die weiteren Abschnitte der Beschreibung und der Zeichnungen gewonnen werden, in denen:
die 1A und 1B vereinfachte optische Schemata eines konfokalen Mikroskops nach dem Stand der Technik sind;
1C eine optische Skizze ist, die den richtigen konfokalen Betrieb zeigt;
2 ein vereinfachtes optisches Schema einer invertierenden Mikroskop-Ausführungsform (d. h. ein Mikroskop mit umgekehrter Darstellung der Objekte) gemäß vorliegender Erfindung ist;
die 3 und 4 optische Schemata eines Okulars erster Generation und einer Adapterlinse für die invertierende Ausführungsform des Mikroskops sind;
5 ein optisches Schema eines Okulars erster Generation für eine aufrechte Mikroskop-Ausführungsform (d. h. ein Mikroskop mit aufrechter Darstellung der Objekte) gemäß vorliegender Erfindung ist;
6 ein optisches Schema eines 6,25-fach-Okulars zweiter Generation für die invertierende Ausführungsform des Mikroskops ist;
die 7A und 7B optische Schemata eines 8-fach-Okulars zweiter Generation und einer Adapterlinse für die invertierende Ausführungsform des Mikroskops sind;
8 ein optisches Schema eines 8-fach-Okulars zweiter Generation für die aufrechte Ausführungsform des Mikroskops ist;
die 9A–E optische Skizzen sind, die die Wirkung und die Korrektur von Fokussierungsfehlern veranschaulichen;
die 10A–C optische Skizzen sind, die die Wirkung und Korrektur von Abtastfehlern veranschaulichen;
11 Diagramme zeigt, die die Wirkung und Korrektur von Feldkrümmung veranschaulichen
die 12A–C Diagramme sind, die die Wirkung und Korrektur von Feldkrümmung und Vergrößerungsfehlern veranschaulichen; und
die 13A und 13B Diagramme der Intensität über das Feld zeigen.
Visuelles konfokales Mikroskop nach dem Stand der Technik
1A ist ein vereinfachtes optisches Schema eines konfokalen Rastermikroskops 10 nach dem Stand der Technik. Das spezielle, hier erörterte konfokale Mikroskop nach dem Stand der Technik und das konfokale Mikroskop, wie gemäß vorliegender Erfindung modifiziert, ist ein Bio-Rad MRC-600-Zusatzgerät, das in Kombination mit einem herkömmlichen Mikroskop verwendet wird. Der Begriff ”Mikroskop” wird typischerweise so verwendet, daß damit das konfokale Rastermikroskop gemeint ist, das aus dieser Kombination resultiert.
Das Mikroskop arbeitet so, daß es einen sichtbaren Lichtstrahl zu einem Punkt in einer Probenebene 15 fokussiert und Licht (reflektiertes Licht und Fluoreszenz) detektiert, das aus dem Punkt in der Probenebene ausstrahlt. Zu diesem Zweck umfaßt das Mikroskop eine Quelle 20 sichtbaren Lichts, wie einen Argonionenlaser, dessen Strahl entlang eines Hinwegs durch einen optischen Zug gelenkt wird, der einen Strahlenspalter 22, eine Abtastoptik 25, ein Okular 27, eine Adapterlinse 30 eine Unendlichkeitskorrekturlinse 32 (die als Telonlinse 32 bezeichnet wird) und ein Objektiv 35 umfaßt. Der Strahlenspalter 22 besteht aus einem dichroitischen Material, das den sichtbaren Erregerstrahl reflektiert, aber Licht im Bereich der Wellenlängen, die für die Fluoreszenz von der Probe charakteristisch sind, durchläßt. Das Objektiv und das Okular fokussieren den Strahl, so daß nominal ein kleiner Punkt in der Probenebene gebildet wird.
Aus dem Bereich des Punktes austretendes Licht wandert einen Rückweg entlang, bis es den Strahlenspalter 22 erreicht, durch den es hindurchgeht und zu einem Detektor 37a, wie einer Elektronenvervielfacherröhre (PMT) gelenkt wird. Eine Öffnung 40a, vorzugsweise eine Irisblende (variabler Durchmesser 0,7–7,0 mm), ist vor dem Detektor angeordnet. Ein dichroitischer Strahlenspalter 42 kann im ausschließlichen Rückweg angeordnet sein, um Licht in einem Wellenlängenbereich zum Detektor 37a und Licht in einem anderen Wellenlängenbereich zu einem zweiten Detektor 37b und einer zugeordneten Öffnung 40b zu lenken.
Der optische Weg von der Abtastoptikanordnung zum Detektor ist durch eine Anzahl von Umlenk-Planspiegeln gefaltet, um für eine relativ lange Weglänge zu sorgen. Die Abtastoptik umfaßt ein Paar durch Galvanometer angetriebene Planspiegel mit Relaisoptik, vorzugsweise ein Paar einander zugewandter konkaver Spiegel dazwischen. Der erste Abstastspiegel tastet den Strahl in einer Ebene senkrecht zu jener der Figur ab, während der zweite Abtastspiegel den Strahl in der Ebene der Figur abtastet. Im Schema wird nur der zweite Abtastspiegel gezeigt.
Der letzte Abtastspiegel ist nahe der vorderen Fokalebene des Okulars angeordnet, so daß die Strahlen unabhängig vom Abtastwinkel im allgemeinen parallel zur optischen Achse vom Okular zur Adapterlinse wandern. Der ausgerichtete Laserstrahl ist zur hinteren Fokalebene des Okulars fokussiert; das Mikroskop ist so in bezug auf die konfokale Zusatzeinrichtung angeordnet, daß die vordere Fokalebene der Adapterlinse mit der hinteren Fokalebene des Okulars zusammenfällt.
Die im speziellen dargestellte Ausführungsform dient für ein invertierendes Mikroskop, wo der optische Weg zwischen dem Okular und dem Objektiv länger ist als die Distanz, für die die Okulare und Objektive normalerweise konstruiert sind. Eine zusätzliche Detailansicht wird in 1B gezeigt. Die meisten Objektive sind so korrigiert, daß sie hereinkommendes Licht so aufnehmen, als käme es von einer 160 mm entfernten Punktquelle. Die Telonlinse 32 kooperiert mit dem Objektiv, so daß die Kombination aus den beiden bezüglich hereinkommenden parallelen Lichts korrigiert wird (d. h. unendlich korrigiert wird). Auf komplementäre Weise kooperiert die Adapterlinse (die im wesentlichen ein 160 mm Achromat ist) mit dem Okular, um paralleles Licht bereitzustellen. So arbeiten die Adapterlinse 30 und die Telonlinse 32 als eine Art einer Relaisoptik zusammen. Bei einer aufrechten Mikroskop-Ausführungsform (nicht dargestellt) fehlen die Adapterlinse und die Telonlinse.
Es ist manchmal zweckmäßig, die stromauf gelegenen Elemente (Okular und möglicherweise Adapterlinse) als Einheit zu betrachten und die stromab gelegenen Elemente (möglicherweise Telonlinse und Objektiv) als Einheit zu betrachten. Die Verwendung eines Okulars, eines langen Rückwegs und eines parallelgerichteten zurückführenden Strahls ermöglicht es, einen konfokalen Betrieb ohne räumliche Stiftloch-Filter zu erreichen.
Für die Erörterung ist es zweckmäßig, die optischen Wege in eine Anzahl von Segmenten zu unterteilen. Der Begriff ”Nur-Hinweg” bezeichnet das Wegsegment von der Lichtquelle zum Strahlenspalter 22, über das nur Erregungslicht geht. Der Begriff ”gemeinsames Wegsegment” bezeichnet das Wegsegment zwischen dem Strahlenspalter und der Probenebene, über das Licht in beide Richtungen geht. Der Begriff ”Nur-Rückweg” bezeichnet das Wegsegment zwischen dem Strahlenspalter und dem Detektor, über das nur Licht geht, das von der Probe zurückkehrt. Mit der Bezeichnung Vorderfläche einer Linse ist jene Oberfläche gemeint, auf die das Licht auf dem Hinweg zuerst auftrifft, während mit Rückfläche jene Oberfläche gemeint ist, auf die das Licht auf dem Rückweg zuerst auftrifft.
Konfokaler Betrieb
1C zeigt, wie Licht, das aus dem Bereich des Strahlenpunktes in Probenebene 15 ausgesandt wird, durch das optische System den Rückweg entlang geht und zum Detektor gelangt. Die Figur zeigt auch, wie Licht, das aus Punkten in einem Paar Ebenen 15u und 15d divergiert, die stromauf bzw. stromab von der Probenebene versetzt sind, von der. Öffnung abgewiesen wird. Die Probenebene 15 ist als durchgehende Linie gezeichnet, und das aus einem Punkt in Ebene 15 ausgesandte Licht ist als durchgehende Linien gezeigt. Die Ebenen 15u und 15d sind als zwei unterschiedlich strichlierte Linien gezeichnet, und das aus diesen Ebenen austretende Licht ist entsprechend gezeichnet. Wie zu sehen ist, wird das aus der stromab gelegenen Ebene 15d austretende Licht durch die Linsen neu fokussiert und divergiert, während das aus der stromauf gelegenen Ebene 15u austretende Licht divergiert, wenn es die Linsen verläßt. In beiden Fällen divergieren die Strahlen bereits stark, wenn sie die Öffnungsebene erreichen, und werden von der Öffnung weitgehend zurückgewiesen.
Die obige Beschreibung bedarf einer kleinen Ergänzung. In dem Ausmaß, in dem Licht aus der Probenebene durch die Optik parallelgerichtet ist, wird Licht, das aus einer Ebene ein wenig stromab (nicht so weit stromab wie Ebene 15d) austritt, tatsächlich in die Öffnung fokussiert. Das bedeutet, daß das den Detektor erreichende Licht eine kleine Komponente umfaßt, die mit dem Erregungslicht nicht konfokal ist. Die Wirkung kann vermieden werden, indem eine lange Linse (beispielsweise 1.000 mm) im Nur-Rückweg angeordnet wird, so daß sie den parallelgerichteten (konfokalen) Strahl in die Öffnung fokussiert und bewirkt, daß das von etwas stromab kommende Licht divergiert, wenn es die Öffnung erreicht. Das wird nachstehend detaillierter erörtert.
Konfokale UV-Mikroskop-Ausführungsformen
2 ist ein vereinfachtes optisches Schema eines konfokalen Mikroskops 50, das gemäß vorliegender Erfindung so modifiziert ist, daß für die Erregung sowohl sichtbares als auch UV-Licht verwendet werden können. Elemente, die jenen in 1A gleichen, haben die gleichen Bezugszahlen, entsprechende Elemente, die modifiziert sind, haben apostrophierte Bezugszahlen, und Elemente, die kein Gegenstück in 1A aufweisen, haben andere Bezugszahlen. Wie oben, ist die Ausführungsform eines invertierenden Mikroskops dargestellt.
Der konfokale Betrieb, wie in Verbindung mit dem visuellen Mikroskop nach dem Stand der Technik beschrieben, erstreckt sich nicht automatisch in den Bereich der UV-Erregung, um so weniger dann, wenn es erwünscht ist, auch für Erregung im sichtbaren Bereich zu sorgen. Das erste offensichtliche Problem besteht darin, daß das Okular 27 kein UV-Licht durchläßt und die Adapterlinse 30 es nur schlecht durchläßt. Wenn die Linsen jedoch UV-Licht durchlassen, muß eine Anzahl von Aberrationen korrigiert werden, damit ein angemessener Betrieb erfolgen kann. Die Konstruktionsdetails sowohl für invertierende als auch aufrechte Mikroskope sind nachstehend beschrieben (und an entsprechender Stelle veranschaulicht).
Ein UV-Laser 55 stellt einen UV-Strahl bereit, der durch einen Strahlenkombinator 57 (der ein dichroitischer Reflektor für sichtbares/UV-Licht ist) mit dem sichtbaren Strahl vom sichtbaren Laser 20 kombiniert wird. Ein (5-facher) fokussierender UV-Strahlen-Expander 60, Umlenkspiegel 62 und eine UV-Korrekturlinse 65 sind zwischen UV-Laser 55 und Strahlenkombinator 57 angeordnet. In dem Ausmaß, in dem der Strahlenspalter 22 UV-Licht nicht reflektiert, muß er so modifiziert werden, daß er sowohl die sichtbaren als auch die UV-Laserstrahlen reflektiert, aber die sichtbare Fluoreszenz durchläßt. Das Mikroskop wird weiters modifiziert, indem es mit einem/einer speziell konstruierten Okular 27' und Adapterlinse 30' versehen wird, die nachstehend beschrieben werden. Die Eigenschaften von Strahlenspalter 42 können in Hinblick auf die zu trennenden sichtbaren Wellenlänge gewählt werden.
Der fokussierende UV-Strahlen-Expander 60 sorgt für eine Vergrößerung, die es ermöglicht, die hintere Öffnung des Objektivs ausreichend zu füllen, um für maximale Auflösung zu sorgen. Die Verwendung eines konfokalen Mikroskops verringert die geringste detektierbare Distanz zwischen den Punkten auf das 0,707-fache der kleinsten durch ein herkömmliches Mikroskop detektierbaren Distanz. Der Einsatz von UV-Erregung verbessert die Auflösung in bezug auf jene, die mit sichtbarer Erregung erzielbar ist, aufgrund der kürzeren Wellenlänge.
Ein Expander 67 für sichtbare Strahlen ist vorzugsweise zwischen dem sichtbaren Laser 20 und dem Strahlen-Kombinator 57 angeordnet und sorgt für die 1,5- bis 2-fache Vergrößerung, wodurch es ermöglicht wird, daß der sichtbare Erregungsstrahl die hintere Öffnung des Objektivs füllt. Das ist notwendig, da das UV-Okular 27' eine geringere Vergrößerung aufweist als das sichtbare Okular 27 (etwa 6,4-fach gegenüber 8-fach). In Anbetracht der verringerten Vergrößerung wird darauf geachtet, den minimalen Öffnungsdurchmesser von 0,7 mm auf 0,5 mm zu verringern.
UV-Korrekturlinse 65 ist vorzugsweise eine 500 mm-Linse, die das UV-Erregungslicht zu einem Punkt vor dem Okular fokussiert, von dem aus es divergiert. Wie oben angeführt, ist das sichtbare Erregungslicht im allgemeinen parallelgerichtet, bis es das Okular erreicht. Es wird dafür gesorgt, daß das UV-Licht divergiert, um die longitudinalen chromatischen Aberrationseffekte in den stromab gelegenen Linsenelementen zu korrigieren. Wie nachstehend detaillierter erörtert werden wird, gibt es chromatische Abtasteffekte, die im Okular und der Adapterlinse korrigiert werden müssen, und ihre Korrektur macht es tendenziell schwierig, longitudinale chromatische Aberration ebenfalls zu korrigieren.
Die Position der UV-Korrekturlinse entlang der optischen Achse kann entweder allein oder in Verbindung mit der Refokussierung des Strahlenexpanders eingestellt werden, um eine Einstellung bezüglich der unterschiedlichen Ausmaße longitudinaler chromatischer Aberration in unterschiedlichen Objektiven durchzuführen, während angemessenes Füllen der hinteren Öffnung des Objektivs beibehalten wird. Das ist eine relativ notwendige Option, da die objektiven chromatischen Aberrationen im UV- Bereich beträchtlich variieren und die Größen der hinteren Öffnungen mit unterschiedlichen Objektiven beträchtlich variieren.
Konstruktionen von Linsen erster Generation
Die 3 und 4 sind optische Schemata einer Konstruktion erster Generation für Okular 27' und UV-Adapterlinse 30' für die Ausführungsform des invertierenden Mikroskops. Die geometrischen und optischen Parameter für diese Linsen sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die Oberflächen sind entlang der Richtung der Laserstrahlen numeriert, und die Abmessungen sind, wenn nicht anders angegeben, in mm angeführt. Die chromatische Korrektur erfolgte in bezug auf die folgenden Konstruktions-Wellenlängen: 330 nm, 464 nm, 560 nm und 656 nm. Die Linsenkonstruktion erfolgte unter Einsatz der Konstruktionsanalyse-Software für optische Systeme OPTEC (PC-Version), die von SCIOPT Enterprises, San Jose, CA, USA, erhältlich ist.
5 ist ein optisches Schema einer Konstruktion erster Generation für das Okular, bezeichnet mit 27'', für die Ausführungsform eines aufrechten Mikroskops. Die geometrischen und optischen Parameter für diese Linse sind in Tabelle 3 dargelegt.
Die Konstruktionskriterien für das Okular (allein für die aufrechte Ausführungsform oder in Kombination mit der Adapterlinse für die invertierende Ausführungsform) können wie folgt zusammengefaßt werden. Das Okular (oder die Kombination) ist für die herkömmlichen monochromatischen Aberrationen (sphärische Aberration, Koma, Astigmatismus, Verzerrung) für jede Wellenlänge der Konstruktion für Licht, das in beide Richtungen wandert, gut korrigiert. Wie oben angeführt, wird der UV-Brennpunkt durch die Fokussierungslinse 65 und den Fokussierungsstrahlenexpander 60 korrigiert, obwohl das Okular (oder die Kombination) bezüglich der longitudinalen chromatischen Aberration für sichtbare Wellenlänge konstruiert ist. Das Okular (oder die Kombination) wird jedoch chromatisch korrigiert, um Abtastfehler zu minimieren, wie nachstehend erörtert. Die Feldkrümmung wird minimiert und für verschiedene Farben für ein sichtbares Objekt in der Unendlichkeit und für ein endliches UV-Objekt übereingestimmt, das sich 195 mm vor der Vorderfläche des Okulars befindet. Die vordere Fokallänge ist ausreichend lange, um zu verhindern, daß das Okular während der Einstellung den Abtastspiegelmotor berührt.
Die spezielle Linsenkonstruktion unterlag auch einer Anzahl weniger komplexer Einschränkungen. Beispielsweise mußten die Gläser erschwinglich und relativ leicht zu qualitativ hochwertigen Linsen verarbeitbar sein. Weiters mußte die Linse normale Labortemperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen und das Einwirken von UV- und sichtbarer Laserstrahlung aushalten. Quarzglas- und Kalziumfluorid wurden als Linsenmaterialien ausgewählt, weil sie UV-Licht hindurchlassen, unter normalen Laborbedingungen einigermaßen widerstandsfähig sind, bei längerer UV-Lichteinwirkung (unter 200 mW Leistung) nicht trübe werden und ausreichend unterschiedliche Streuungseigenschaften aufweisen, um chromatische Korrekturen mit nicht allzu schwer erreichbaren Linsenoberflächenkrümmungen zuzulassen.
Bei der Konstruktion erster Generation haben die Kalziumfluoridlinsenelemente alle die gleiche Gestalt und sind als Lagerware von Janos Technology, Inc., Townshend, Vermont, in der gewünschten Qualität (1% Toleranzen auf Krümmung und Dicke) erhältlich. Es wurde jedoch angenommen, daß Verbesserungen in den monochromatischen Aberrationen (mit Kosten) erreicht werden könnten, indem die Symmetrie-Erfordernisse an die Kalziumfluorid-Linsenelemente erleichtert und sie nach Kundenwunsch geschliffen würden. Das erfolgte in einer Reihe von Konstruktionen zweiter Generation.
Linsenkonstruktionen zweiter Generation
Es wurde eine Anzahl von Konstruktionen zweiter Generation entwickelt, die sich von der Konstruktion erster Generation folgendermaßen unterscheiden. Zunächst unterliegen sie nicht der Einschränkung, daß die Kalziumfluoridelemente eine bestimmte Gestalt haben. Zweitens ist die Reihenfolge der letzten beiden Elemente des Okulars umgedreht, so daß keines der Kalziumfluoridelemente (die etwas feuchtigkeitsempfindlich sind) der Atmosphäre ausgesetzt ist. Demgemäß ist die Adapterlinse mit einem zusätzlichen Quarzelement versehen, um die chromatischen Aberrationen zu reduzieren und das Kalziumfluoridelement einzuschließen. Diese Konstruktionen zweiter Generation umfassen 6,25-fache und 8-fache Okulare und Adapter (derselbe Adapter für beide) für die Ausführungsform eines invertierenden Mikroskops und ein 8-fach-Okular für das aufrechte Mikroskop.
6 ist ein optisches Schema des 6,25-fach-Okulars für die Ausführungsform eines invertierenden Mikroskops. Die geometrischen und optischen Parameter für diese Linse sind in Tabelle 4 dargelegt. Oberfläche 1 ist die Position des Abtastspiegels und die vordere Fokalebene des Okulars. Oberfläche 14 ist die Ebene, wo das Okular den Strahl fokussiert, was der vorderen Fokalebene der Adapterlinse entspricht (in Tabelle 4 nicht enthalten – die gleichen Parameter wie Adapterlinse für 8-fach-Okular). Oberflächen wie 1 und 14 sind Ebenen in Luft und sind aus Gründen der Zweckmäßigkeit mit einem Radius von 100.000 mm angenommen.
Die 7A und 7B sind optische Schemata des 8-fach-Okulars und der Adapterlinse für die Ausführungsform des invertierenden Mikroskops. Die geometrischen und Mikroskop-Parameter für diese Linsen sind in Tabelle 5 dargelegt. Oberfläche 1 ist die Position des Abtastspiegels und der vorderen Fokalebene des Okulars. Oberfläche 14 ist die Ebene, wo das Okular den Strahl fokussiert, was der vorderen Fokalebene der Adapterlinse entspricht. Oberfläche 21 befindet sich nahe der hinteren Objektivöffnung.
8 ist ein optisches Schema des 8-fach-Okulars für die Ausführungsform des aufrechten Mikroskops. Die geometrischen und Mikroskop-Parameter für diese Linse sind in Tabelle 6 dargelegt. Oberfläche 1 ist die Position des Abtastspiegels und der vorderen Fokalebene des Okulars. Oberfläche 14 ist die Ebene, wo das Okular den Strahl fokussiert. Oberfläche 15 befindet sich nahe der hinteren Objektivöffnung.
Fokussierungsfehler
Die 9A–E sind optische Skizzen, die die Fokussierungsfehler zeigen, die durch longitudinale chromatische Aberration verursacht werden, sowie die Art, wie dieses Problem gehandhabt wird.
9A zeigt, wie die longitudinale chromatische Aberration in den Linsen Fokussierungsfehler hervorruft. Das wird im Kontext der Ausführungsform des invertierenden Mikroskops veranschaulicht, aber das Problem und die Lösung sind bei der Ausführungsform des aufrechten Mikroskops die gleichen. Im spezielleren wird ein hereinkommender parallelgerichteter UV-Erregungsstrahl in gepunkteten Linien als zu einem Brennpunkt in einer Ebene 15u kommend gezeigt, stromaufwärts versetzt von der Ebene 15, in der ein hereinkommender Strahl sichtbaren Lichts fokussiert würde. Das sichtbare Licht, das von Punkten in Ebene 15 divergiert, wird durch die Linsen parallelgerichtet und werde den Detektor erreichen. Das aus Ebene 15u (wo der UV-Strahl fokussiert wird) ausgestrahlte sichtbare Licht wird bei der Rückkehr nicht durch die Linsen parallelgerichtet und divergiert, bevor es den Detektor erreicht. Wie oben erwähnt, ist es wünschenswert, durch die Verwendung von Fokussierungstrahlexpander 60 und UV-Korrekturlinse 65 die longitudinale chromatische Aberration auszugleichen.
9B zeigt, wie die UV-Korrekturlinse 65 bewirkt, daß der UV-Erregungsstrahl (in strichlierten Linien gezeichnet) in derselben Ebene 15 fokussiert, aus der austretendes sichtbares Licht (in durchgehenden Linien gezeichnet) durch die Linsen parallelgerichtet und detektiert wird. Das wird erreicht, indem der UV-Strahl zu einem Brennpunkt vor dem Okular 27' gebracht wird, woraufhin der UV-Strahl divergiert, wenn er auf die Linsen trifft. Die Linsen werden nicht bezüglich longitudinaler chromatischer Aberration aus dem UV-Bereich korrigiert und so wird das UV-Licht in Ebene 15 fokussiert. Es sollte angemerkt werden, daß das dargestellte sichtbare Licht gleichermaßen dem sichtbaren Erregungsstrahl entsprechen könnte.
Die 9C–E zeigen, wie der Fokussierungsstrahlexpander 57 und die UV-Korrekturlinse 60 eingestellt werden können, um die Position des UV-Brennpunkts zu variieren und die Strahlenvergrößerung zu erhöhen, um das Füllen der hinteren Öffnung des Objektivs zu erhöhen. 9C zeigt die Situation, wo Strahlenexpander 57 einen expandierten parallelgerichteten Strahl bereitstellt. 9D zeigt, wie es durch Einstellen des Strahlenexpanders, um einen divergierenden Strahl bereitzustellen, möglich ist, die Position des UV-Brennpunkts zu ändern. 9E zeigt, wie eine stärkere Linse verwendet werden kann, um die Position des UV-Brennpunkts in eine verwendbare Position zu bringen.
Abtastfehler
Die 10A–C sind optische Skizzen, die die Abtastfehler zeigen, die durch chromatische Fehler verursachten Abtastfehler sowie die Art zeigen, wie mit diesem Problem umgegangen wird.
10A zeigt, wie die chromatischen Effekte in den Linsen das konfokale Abtasten beeinflussen. Dieses Problem unterscheidet sich von dem longitudinaler (Fokussierungs-)Fehler, von denen angenommen wird, daß sie wie oben beschrieben gelöst werden. Das wird im Kontext der Ausführungsform des invertierenden Mikroskops veranschaulicht, aber das Problem ist bei der Ausführungsform des aufrechten Mikroskops das gleiche. Für den konfokalen Betrieb muß das zurückkehrende sichtbare Licht (als durchgehende Linie gezeichnet), das aus der UV-Erregung resultiert (als strichlierte Linie gezeichnet), den gleichen Weg entlang gehen, wenn es auf die Abtastoptik trifft, die das Erregungslicht entlanggeht, wenn es die Abtastoptik verläßt. Wie in der Figur gezeigt, wird diese Bedingung erfüllt, aber bei großen Abtastwinkeln wird das sichtbare Licht aufgrund der chromatischen Effekte in den Linsen von einem Punkt gesammelt, der seitlich aus dem Punkt maximaler UV-Erregung versetzt ist. Diese Art von Abtastfehler führt zu einem deutlichen Abfall der Intensität über das Bildbetrachtungsfeld.
10B ist eine optische Skizze, die zeigt, wie die Abtastfehler für das invertierende Mikroskop korrigiert werden. Das wird erreicht, indem die Bedingung aufgestellt wird, daß das UV- und das sichtbare Licht von einem Objektpunkt 80 durch Okular 27' und Adapterlinse 30' an einem achromatischen Bildpunkt 82 fokussiert werden, wobei der Objektpunkt der Position des letzten Abtastspiegels entspricht und der Bildpunkt einem Punkt nahe der Mitte der Telon-Objektiv-Kombination entspricht. Bei der Konstruktion der ersten Generation ist der Objektpunkt etwa 18 mm von der Vorderfläche des Okulars entfernt, und der achromatische Bildpunkt ist 167,3 mm von der Rückfläche der Adapterlinse entfernt. Bei der Konstruktion mit 6,25-facher Vergrößerung der zweiten Generation sind die entsprechenden Distanzen etwa 13,5 mm und 148,2 mm. Bei der 8-fach-Konstruktion der zweiten Generation sind die entsprechenden Distanzen etwa 21,2 mm und 151,5 mm.
Es ist anzumerken, daß diese chromatische Korrektur nicht vollständig mit einer Korrektur der longitudinalen chromatischen Aberration kompatibel ist, die, wie oben erörtert, statt dessen durch die UV-Korrekturlinse und den Fokussierungsstrahlexpander bewältigt wird. Diese Optimierung erfolgt im speziellen auf folgende Weise. Das Okular wird so korrigiert, daß (a) sichtbare Farben und paralleles UV-Licht in Rückwärtsrichtung auf den selben Punkt fokussieren, und (b) alle Farben parallelen sichtbaren Lichts in Vorwärtsrichtung zur selben Ebene für kleine und große Abtastwinkel fokussieren. Die Adapterlinse wird für große und kleine Abtastwinkel so optimiert, daß (a) paralleles UV- und sichtbares Licht in der Vorwärtsrichtung achromatisch an Bildpunkt 82 fokussiert werden und (b) paralleles sichtbares Licht, das rückwärts in die Adapterlinse geht, zu einer gemeinsamen vorderen Fokalebene fokussiert wird (die sich zwischen der Adapterlinse und dem Okular befindet). Weiters ist das System für alle Farbensichtbaren Lichts im wesentlichen achromatisch.
10C ist eine optische Skizze, die zeigt, wie Abtastfehler für das aufrechte Mikroskop korrigiert werden. Das wird erreicht, indem die Bedingung aufgestellt wird, daß UV-und sichtbares Licht von einem Objektpunkt 85 durch das mit 27'' bezeichnete Okular an Bildpunkt 87 fokussiert werden, wobei der Objektpunkt der Position des letzten Abtastspiegels entspricht und der Bildpunkt einem Punkt nahe dem Mittelpunkt des Objektivs entspricht. Bei der Konstruktion erster Generation ist der Objektpunkt 32 mm von der Vorderfläche des Okulars entfernt, und der achromatische Bildpunkt ist 178,25 mm von der Rückfläche des Okulars entfernt. Bei der Konstruktion mit 8-facher Vergrößerung der zweiten Generation sind die entsprechenden Distanzen etwa 27,3 mm und 160 mm.
Bei jeder speziellen Konstruktion erreichen die verschiedenen Wellenlängen, die aus Punkt 80 (oder 85) ausgesandt werden, nicht präzise im selben Punkt 82 (oder 87) einen Brennpunkt, da diese Einschränkung eine der vielen ist, die bei einem Optimierungsvorgang beachtet werden müssen. Daher ist relativ zu einer Bezugswellenlänge jede bestimmte Wellenlänge durch einen chromatischen Abtastfokusfehler Δf gekennzeichnet, der die longitudinale Trennung zwischen dem Brennpunkt der speziellen Wellenlänge und jenem für die Bezugswellenlänge entspricht.
Tabelle 7 zeigt die chromatischen Abtastfokusfehler (Δf) für 330 nm und 656 nm in bezug auf die Position für 494 nm (per Definition 0) für vier Okulare. Das erste (Okular Nr. 1), das für Vergleichszwecke verwendet wird, ist ein Vier-Element-Quarzglas-Okular, das für monochromatische Aberrationen optimiert ist, nicht aber für chromatische Abtastaberration. Die anderen drei sind das 6,5-fach-Okular erster Generation sowie das 6,25-fach und das 8-fach-Okular zweiter Generation, alle für das invertierende Mikroskop.
Jede Okularkonstruktion wurde mit einer 160 mm-Linsen-Konstruktion im OPTEC-Programm kombiniert, und Strahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen wurden entlang Abtastlinien durch die Optik verfolgt. Der chromatische Abtastfokusfehler (Δf) wurde unter Einsatz der 494 nm-Bezugswellenlänge bestimmt. Δf betrug bei UV-Wellenlängen mit dem unkorrigierten Quarzglas-Okular mehr als 1 Zoll und wurde auf einige Millimeter verringert, indem die Okulare gemäß vorliegender Erfindung korrigiert wurden. Tabelle 8 zeigt Δf für weitere Wellenlängen mit dem 6,25-fachen Okular.
Dünnlinsengleichungen prognostizieren, daß bei maximaler Auflösung ein 8-fach-Okular 25% weniger chromatische Korrektur erfordert als für das 6-fach-Okular erforderlich ist. Der chromatische Fehler wurde jedoch durch das Konstruieren eines 6,5-fach-Okulars mit längerer Fokallänge (vergleiche Okulare Nr. 2 und Nr. 3 in Tabelle 8) mehr als halbiert. Die 8-fache Konstruktion erforderte stärke Oberflächenkrümmungen, um die gleiche chromatische Korrektur wie bei der 6-fachen zu erreichen, wodurch monochromatische Aberrationen auf inakzeptabel große Werte erhöht wurden. Daher wurde die chromatische Korrektur für das 8-fach-Okular notwendigerweise reduziert. Okular Nr. 3 (6,5-fach) hatte das geringste Ausmaß an chromatischer Aberration, war jedoch durch beträchtliche Verzerrung beeinträchtigt und wurde neu konstruiert, was Okular Nr. 4 (6,25-fach) ergab. Bei Okular Nr. 4 wurde bei der chromatischen Korrektur einer solcher Kompromiß erreicht, daß die monochromatischen Korrekturen optimiert wurden.
Die Korrektur bezüglich chromatischer Abtastfokusfehler scheint auch bei der Ausführungsform des invertierenden Mikroskops primär im Okular erzielbar zu sein. Tatsächlich wiesen einige Tests darauf hin, daß ein im Handel angebotener sichtbarer Achromat mit 160 mm, der auch UV-Licht durchließ, etwas besser funktionierte als die Adapterlinse erster Generation, und im allgemeinen ebenso gut wie die Adapterlinse zweiter Generation.
Feldkrümmung und Vergrößerungsfehler
Bei der Feldkrümmung handelt es sich typischerweise um die Aberration, deren Korrektur am schwierigsten ist, und ein gewisses Restausmaß ist oft akzeptabel. Beispielsweise wäre, wenn man davon ausgeht, daß alle Wellenlängen dem gleichen Ausmaß an Feldkrümmung unterliegen, das Ergebnis das, daß die Probenebene keine Ebene, sondern eine leicht gekrümmte Oberfläche ist. Im Grund genommen wäre das kein Problem, da leicht gekrümmte Abschnitte im allgemeinen die gleichen nützlichen Informationen liefern wie vollkommen ebene.
Das echte Problem entsteht jedoch dann, wenn nicht alle Wellenlängen dem gleichen Ausmaß an Feldkrümmung unterliegen. In einem solchen Fall wäre die UV-Erregung bei Punkten, die aus der Mitte des Feldes versetzt sind, nicht mit der sichtbaren Fluoreszenz konfokal. Statt dessen wäre das sichtbare Licht, das den Detektor erreicht, jenes, das von einem Punkt ausgesandt wird, der vom fokussierten Strahlenpunkt entfernt ist, und hätte daher eine viel geringere Intensität. Dabei handelt es sich um das gleiche Problem, das auftritt, wenn longitudinale Fokussierungsfehler nicht korrigiert werden, mit der Ausnahme, daß das Ergebnis nicht über das gesamte Feld gleich ist, sondern sich mit zunehmendem Abstand von der Mitte des Feldes verstärkt.
Demgemäß wird das Problem so bewältigt, daß ein gewisses Ausmaß an Feldkrümmung akzeptiert und vorrangig darauf geachtet wird, daß ein Feld erzielt wird, das für die UV- und die sichtbaren Wellenlängen ähnlich geformt ist.
11 zeigt berechnete Kurven der Feldkrümmung für Okular Nr. 1 (obere drei Linien) und Okular Nr. 3 (untere drei Linien), jeweils kombiniert mit einer theoretischen 160 mm-Adapterlinse und einem theoretischen Objektiv. Ebenfalls gezeigt werden Kurven für das Objektiv allein (drei beinahe zusammenfallende Linien). Die Feldkrümmung auf der Probenebene wurde berechnet, indem Lichtstrahlen in zunehmenden Abtastwinkeln durch theoretische Dicklinsenmodelle verfolgt wurden (wobei das OPTEC-Programm zum Einsatz kam). Mit zunehmendem Abtastwinkel wurde die Effektivwertposition des Objektivbrennpunkts in axialer und radialer Richtung aufgezeichnet und aufgetragen. Um den vollen optischen Zug zu modellieren, wurde ein theoretisches unendlichkeitskorrigiertes. 10-fach-Objektiv (achromatisch im sichtbaren Licht, aber mit einer gewissen verbleibenden chromatischen Aberration im UV-Bereich) aus Kalziumfluorid und Quarzglas konstruiert. Eine 160 mm-Linse mit ähnlichen chromatischen Eigenschaften wurde ebenfalls konstruiert. Strahlen wurden durch das optische System in drei Wellenlängen verfolgt: rot (656 nm), blau (488 nm) und UV (330 nm). Chromatische Korrekturen im Okular aus Kalziumfluorid/Quarzglas verringerten die lateralen Vergrößerungsfehler, Δy, ebenso wie Feldkrümmungsfehler, Δz, im Vergleich zu Fehlern, die durch das unkorrigierte Quarzglas-Okular verursacht wurden, dramatisch.
Die 12A–C sind Kurven, die die berechnete Feldkrümmungs- und Vergrößerungsfehler nahe dem Rand des Sichtfeldes für das Mikroskop mit einem 100-fach Objektiv, einem 40-fach Objektiv und einem 10-fach Objektiv zeigen. Die vertikale Achse stellt die Position des Punktes entlang der Strahlenrichtung dar. Die horizontale Achse stellt die Position des Punktes in Querrichtung dar.
Die drei Reihen Plus-Signale stellen Messungen dar, die mit rot (oben), blau und UV (unten) für das Vier-Element-Quarzglas-Objektiv gemacht wurden. Messungen für jede der drei Wellenlängen in einem bestimmten Abtastwinkel sind gruppiert. Die vertikale Trennung zwischen Punkten stellt einen Feldkrümmungsfehler zwischen Wellenlängen in diesem Winkel dar; die horizontale Trennung stellt einen Vergrößerungsfehler dar.
Die vier Reihen Rauten stellen Messungen dar, die mit dem korrigierten 6-5,-fach Sechs-Element-Okular für UV (oben) und rot, blau und grün (darunter gruppiert) gemacht wurden. Wie festzustellen ist, sind die Feldkrümmung und die Vergrößerungsfehler beim korrigierten Okular viel kleiner. Die Vergrößerungsfehler dominieren die Feldkrümmungsfehler für das 100-fach-Objektiv, während für das 10-fach-Objektiv das Gegenteil gilt. Beim 40-fach-Objektiv sind die Fehler vergleichbar.
Gesamtintensitätsprofil
Konfokale Abschnitte wurden durch den Mittelpunkt einer dicken Scheibe Fluoresceinfarbstoff gesammelt, durch blaues oder UV-Licht erregt, wobei ein 40-faches Olympus-Objektiv verwendet wurde. Die Kurven wurden an ein Profil des fluoreszierenden Bildes angepaßt, das durch die Mitte des Feldes gezeichnet wurde. Die Kurven wurden leicht verschoben, um ihre Peaks übereinanderzulegen. (Peak-Verschiebung wurde durch geringfügige Spiegelausrichtungsdifferenzen verursacht.) Ein vollständiges Sichtfeld hatte 768 Pixel. 13A zeigt die Fluoreszenzfeldhelligkeit mit UV- oder sichtbarer Erregung für das chromatisch korrigierte Okular Nr. 3 (Kurven a.v und a.uv) sowie das chromatisch unkorrigierte Okular Nr. 1 (Kurven b.v und b.uv). Wie festzustellen ist, wurde die Bildintensität über das Feld mit dem chromatisch korrigierten Okular dramatisch verbessert. 13B zeigt Daten, die unter Einsatz von Okular Nr. und 100-fach, 40-fach und 10-fach Olympus-Objektiv gesammelt wurden. Wie zu sehen ist, verbesserte sich die Feldintensität mit zunehmender Objektivleistung.
Fokussierungslinse im Detektorweg
Wie oben angedeutet, kann die Sammeleffizienz verbessert werden, indem eine Linse im Detektorweg angeordnet wird. Parallelgerichtetes Erregungslaserlicht geht durch das Okular und das Objektiv und fokussiert zu einem Erregungspunkt. Fluorophore werden im Bereich um den Erregungspunkt gemäß der Intensitätsverteilung einer dreidimensionalen beugungsbegrenzten Point-spread-Funktion (psf) angeregt. Licht wird durch das Objektiv gemäß ebendiesem Intensitätsprofil gesammelt, was zu einer etwas engeren konfokalen psf führt, die in etwa symmetrisch um den Erregungspunkt ist. In einem einfachen konfokalen Stiftloch-Mikroskop ist der Mittelpunkt des psf-Bildes am Stiftloch fokussiert, und Licht von Ebenen oberhalb und unterhalb des Objektivbrennpunkts wird beinahe symmetrisch zurückgewiesen. Beim speziellen oben beschriebenen Mikroskop wird Licht vom Mittelpunkt des psf-Bildes bis zu Unendlichkeit fokussiert, und als Folge wird Licht von Ebenen oberhalb und unterhalb des Objektiv-Brennpunkts asymmetrisch zurückgewiesen.
Das Radius des Strahls an der konfokalen Öffnung wurde unter Einsatz von Dünnlinsengleichungen für Licht berechnet, das von verschiedenen Punkten entlang der optischen Achse nahe dem Erregungspunkt ausgesandt wurde. Der Anteil der Intensität, die von jedem Punkt gesammelt wurde, wurde für die Öffnung in bezug auf die Breite des parallelgerichteten Strahls mit der Gleichung I: (rp/rΔ)² berechnet, worin rp, der Radius des Stiftlochs, auf den Radius des parallelgerichteten Strahls vom Erregungspunkt eingestellt wurde und rΔ der Radius des divergierenden oder konvergierenden Lichts am Stiftloch von Punkten außerhalb des Brennpunkts war. Werte über 1 wurden auf 1 abgerundet (was anzeigt, daß das gesamte Licht an der PMT gesammelt wurde). Es wurde festgestellt, daß der Mittelpunkt der resultierenden Stiftlochsammelfunktion (pcf) am Mittelpunkt der psf vorbei die optische Achse entlang verschoben wurde. Wenn das Stiftloch geöffnet oder geschlossen wurde, erweiterte oder verengte sich die pcf um ihren Mittelpunkt. Der Lichtstrahl vom Mittelpunkt der pcf war am Stiftloch fokussiert. Bei einem 40-fach Objektiv war festzustellen, daß der optische Querschnitt bei Verwendung eines 6-fach Okulars mehr als doppelt so breit war als der Querschnitt von einem 10-fach Okular, wenn das gesamte Licht vom maximal erregten Punkt in der Mitte der psf gesammelt wurde.
Das Stiftloch kann auch als räumliche Abtastvorrichtung betrachtet werden. Um eine theoretische Auflösung zu erzielen, muß die pcf zumindest die halbe Breite der theoretischen Auflösung haben, um dem Nyquist-Abtast-Kriterium zu entsprechen. Die pcf hat im allgemeinen eine andere Gestalt als die psf, mit denn Ergebnis, daß in radialer Richtung ein kleineres Stiftloch als in axialer Richtung verwendet werden muß, um maximale Auflösung zu erzielen. Wenn die Stiftlochgröße verringert wird, um eine theoretische axiale Auflösung zu erreichen, verengt sich die pcf um ihren Mittelpunkt, und ein großer Abschnitt des erregten Lichts von der psf wird zurückgewiesen.
Dünnlinsengleichungen wurden eingesetzt, um die Vergrößerung der psf in radialer Richtung am Stiftloch zu berechnen. Es wurde festgestellt, daß die theoretische laterale Auflösung in dieser Konfiguration mit einem 10-fach-Okular, nicht jedoch mit einem 6-fach-Okular erreichbar war. Ähnliche Berechnungen wurden für 100-fach, 40-fach, 20-fach und 10-fach Okulare durchgeführt. Das 10-fach-Okular-Modell konnte für alle außer dem 10-fach Objektiv die theoretische axiale und radiale Auflösung erreichen (jedoch nicht bei optimaler Leistung). Die 8-fach-Okular-Auflöseleistung war beim 40-fach Objektiv marginal und beim 10-fach Objektiv unzureichend. Das 6-fach-Okular erzielte nur mit dem 100-fach Objektiv die theoretische Auflösung.
Um dieses Auflösungsproblem zu lösen, wurde eine 1.000 mm-Linse zwischen dem dichroitischen Spiegel und dem Stiftloch angeordnet, um ausgerichtetes Licht von der Mitte des Erregungspunktes zum Stiftloch zu fokussieren. Bei diesem Ansatz wurde der Mittelpunkt der axialen pcf zum Mittelpunkt der axialen psf verschoben, wodurch das Stiftloch auf jede Größe reduziert werden und dennoch Licht vom maximal erregten Punkt in der Probe gesammelt werden könnte.
Bei kleinen Öffnungen erhöht die Verwendung der Langlinsen-Verstärkungen die gesammelte Lichtintensität um etwa 40%. Sammeln des Lichts außerhalb des Brennpunkts ist nicht ein solches Problem wie die Zurückweisung eines Teils des Lichts im Brennpunkt, weil die Öffnung kleiner ist als die Breite des zurückkehrenden ausgerichteten Strahls. Die Wirkung besteht schlußendlich darin, daß die Lichtintensität bei kleinen Öffnungen erhöht wird, während die Auflösung beibehalten oder verstärkt wird. Dank der zugrundeliegenden Mikroskopkonstruktion, die das Okular und einen langen Rückweg umfaßt, wird der Vorteil der Verwendung einer Irisblende anstelle eines Stiftlochs auch dann beibehalten, wenn die lange Linse in den Nur-Rückweg eingesetzt wird.
Die einzelne Linse verringerte jedoch bei einigen Objektiv/Okular-Kombinationen die laterale Vergrößerung des psf FWHM am Stiftloch unter 0,5 mm (eine praktische Grenze für die variable Öffnung). Die einzelne Linse wurde daraufhin durch eine Zwei-Linsen-Optik ersetzt, die so konstruiert war, daß sie das psf-Bild zur Öffnung fokussiert und die laterale FWHM des Bilds bei allen Objektiven auf eine Größe über 0,5 mm vergrößert. Es wird erwartet, daß es diese Konstruktion ermöglicht, daß die chromatisch korrigierte 6-fach-Okular-Konstruktion verwendet wird, um die theoretische konfokale Auflösung zu erzielen.
Schlußfolgerung
Als Schlußfolgerung kann gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung eine wirtschaftliche und wirksame Technik bereitstellt, um die Vorteile der konfokalen Rastermikroskopie in den UV-Bereich auszudehnen.
Oben erfolgte zwar eine vollständige Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, es können jedoch verschiedene Modifikationen, alternative Konstruktionen und Äquivalente eingesetzt werden. Beispielsweise könnten, während der Rückweg wie gezeigt mit einem einzigen Strahlenspalter und zwei Detektoren versehen ist, ein zweiter Strahlenspalter und ein dritter Detektor zugegeben werden, um die UV-Leistung des Mikroskops umfassender zu nutzen. Weiters könnte, während das Objektiv bei der Ausführungsform des invertierenden Mikroskops in Kombination mit einer Telonlinse gezeigt wurde, ein unendlichkeitskorrigiertes Objektiv ohne Telonlinse verwendet werden.

Daher sollten die obige Beschreibung und die Darstellungen nicht so interpretiert werden, daß sie den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken, der durch die beiliegenden Ansprüche definiert ist. TABELLE 1 – OKULAR ERSTER GENERATION FÜR INVERTIERENDES MIKROSKOP

Oberfläche	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung	Randdicke
1	–66.331
		7.00	Quarzglas	25.4	5.467
2	–30.597
		0.00	Luft	25.4	6.532
3	23.266
		9.54	CaF2	25.4	1.996
4	–23.266
		0.00	Luft	25.4	0.958
5	–30.070
		2.00	Quarzglas	25.4	7.509
6	15.388
		1.00	Luft	17.4	2.077
7	23.266
		9.54	CaF2	25.4	1.996
8	–23.266
		1.50	Luft	25.4	1.186
9	–16.052
		1.50	Quarzglas	21.4	8.942
10	25.710
		0.00	Luft	25.4	0.416
11	23.266
		9.54	CaF2	25.4	1.996
12	–23.266

EFL = 38,59 mm FFL = 22,4 mm
Abstand vom Abtastspiegel zur Oberfläche Nr. 1 = 18 mm
Vergrößerung 250/38,59 = 6,5-fach
Mindestöffnung = 12 mm
maximaler Röhrendurchmesser = 30 mm TABELLE 2 – ADAPTERLINSE ERSTER GENERATION FÜR INVERTIERENDES MIKROSKOP

Oberfläche Randdicke	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung
1	37.211
		6.40	CaF2	25.4	1.931
2	–37.211
		0.134	Luft	25.4	0.00
3	–37.259
		2.50	Quarzglas	25.4	5.548
4	120.112

EFL = 134,4 mm FFL = 137,3 mm BFL = 123,5 mm
Abstand vom Okular zur Oberfläche Nr. 1 = 155,30 mm
Abstand der Oberfläche Nr. 4 zur Telonlinse = 167,30 mm TABELLE 3 – OKULAR ERSTER GENERATION FÜR AUFRECHTES MIKROSKOP

Oberfläche	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung	Randdicke
1	–90.609
		7.00	Quarzglas	25.4	5.467
2	–41.788
		0.00	Luft	25.4	6.532
3	23.266
		9.54	CaF2	25.4	1.996
4	–23.266
		0.00	Luft	25.4	0.958
5	–28.449
		2.00	Quarzglas	25.4	7.509
6	19.287
		1.00	Luft	17.4	2.077
7	23.266
		9.54	CaF2	25.4	1.996
8	–23.266
		1.50	Luft	25.4	1.186
9	–16.113
		1.50	Quarzglas	21.4	8.942
10	22.175
		0.00	Luft	25.4	0.416
11	23.266
		9.54	CaF2	25.4	1.996
12	–23.266

EFL = 38,82 mm FFL = 22,75 mm BFL = 18,24 mm
Abstand vom Abtastspiegel zur Oberfläche Nr. 1 = 32 mm
Abstand von der Oberfläche Nr. 12 zum Objektiv = 178,25 mm
Vergrößerung = 250/38,82 = 6,4-fach
Mindestöffnung = 12 mm
maximaler Röhrendurchmesser = 30 mm TABELLE 4 – 6,25-FACH OKULAR ZWEITER GENERATION FÜR INVERTIERENDES MIKROSKOP

Oberfläche	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung	Randdicke
1	100000.000
		23.805	Luft	25.4	23.652
2	–527.977
		4.000	Quarzglas	25.4	6.475
3	35.895
		0.000	Luft	25.4	0.686
4	23.490
		10.500	CaF2	23.0	3.020
5	–17.021
		0.000	Luft	23.0	0.466
6	–18.510
		2.000	Quarzglas	23.0	9.262
7	26.400
		0.000	Luft	25.4	0.682
8	22.449
		9.540	CaF2	25.4	3.991
	–50.869
		0.000	Luft	25.4	3.386
10	46.320
		9.540	CaF2	25.4	4.596
11	–27.035
		1.500	Luft	25.4	0.965
12	–17.279
		3.000	Quarzglas	21.4	4.584
13	–39.099
		25.615	Luft	25.4	27.735
14	100000.000

TABELLE 5 8-FACH OKULAR ZWEITER GENERATION UND ADAPTER FÜR INVERTIERENDES MIKROSKOP

Oberfläche	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung	Randdicke
1	100000.000
		21.201	Luft	25.4	19.943
2	–64.724
		7.000	Quarzglas	25.4	6.800
3	–56.024
		0.000	Luft	25.4	6.458
4	18.630
		10.000	CaF2	25.4	1.127
8	–22.758
		0.440	Luft	25.4	0.109
6	–20.660
		2.000	Quarzglas	25.4	8.352
7	20.517
		1.000	Luft	17.6	1.096
8	39.746
		9.540	CaF2	25.4	4.981
9	–33.820
		0.000	Luft	25.4	5.754
10	26.229
		9.540	CaF2	25.4	5.138
11	–72.437
		1.700	Luft	25.4	0.409
12	–22.471
		2.000	Quarzglas	20.3	3.628
13	–103.178
		12.021	Luft	25.4	12.806
14	100000.000
		148.896	Luft	–25.4	149.199
15	405.219

TABELLE 5 – 8-FACH OKULAR ZWEITER GENERATION UND ADAPTER FÜR INVERTIERENDES MIKROSKOP

Oberfläche	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung	Randdicke
		3.000	Quarzglas	25.4	4.336
16	53.314
		0.063	Luft	25.4	0.000
17	55.550
		7.000	CaF2	25.4	4.545
18	–82.494
		0.000	Luft	25.4	1.032
19	1672.767
		4.000	Quarzglas	25.4	4.052
20	–805.477
		151.452	Luft	25.4	151.352
21	100000.000

TABELLE 6 – 8-FACH OKULAR ZWEITER GENERATION FÜR AUFRECHTES MIKROSKOP

Oberfläche	Radius	Dicke in der Mitte	Material	Maximale Öffnung	Randdicke
1	100000.000
		27.290	Luft	25.4	26.213
2	–69.162
		7.000	Quarzglas	25.4	6.908
3	–64.215
		0.000	Luft	25.4	6.268
4	18.610
		10.000	CaF2	25.4	1.127
5	–22.758
		0.600	Luft	25.4	0.371
6	–19.983
		2.000	Quarzglas	25.4	8.212
7	21.556
		1.000	Luft	18.6	0.974
	39.746
		9.540	CaF2	25.4	4.981
9	–33.820
		0.000	Luft	25.4	5.755
10	26.229
		9.540	CaF2	25.4	5.138
11	–72.437
		1.700	Luft	25.4	0.447
12	–21.655
		2.000	Quarzglas	19.7	3.341
13	–78.532
		12.180	Luft	25.4	13.215
14	100000.000
		160.000	Luft	25.4	0
15	100000.000

TABELLE 7 – CHROMATISCHER ABTASTFEHLER (Δf) für VIER OKULARE

Wellenlänge (nm)	QuarzglasOkular Nr. 1 Δf (mm)	8-fach-Okular Nr. 2 Δf (mm)	6,5-fach Okular Nr. 3 Δf (mm)	6,25-fach Okular Nr. 4 Δf (mm)
330	–29.77	–9.09	–3.28	–4.22
494	0	0	0	0
656	9.53	1.38	–0.76	–0.21

TABELLE 8 – CHROMATISCHER ABTASTFEHLER FÜR 6,25-FACH OKULAR

Wellenlänge (nm)	Δf (mm)
656	–0.21
540	0.13
494	0
488	–0.05
450	–1.01
351	–3.19
330	–4.22

Claims

Konfokales Rastermikroskop (50), umfassend: UV-Quellenmittel (55) zum Bereitstellen eines UV-Strahls; einen Detektor (37a) für sichtbares Licht; Mittel (40a) zum Begrenzen der wirksamen Größe des Detektors; Mittel, um den UV-Strahl einen Hinweg von der Quelle zu einem Probenbereich (15) entlang zu lenken, wobei der Hinweg ein erstes (62, 65) und ein zweites (22, 25, 27', 30', 32, 35) Segment umfaßt; Mittel, um sichtbares Licht einen Rückweg vom Probenbereich (15) zum Detektor (37a) für sichtbares Licht entlang zu lenken, wobei der Rückweg das zweite (22, 25, 27', 30', 32, 35) Segment und ein drittes (42, 40a) Segment umfaßt; Fokussierungsmittel (27, 27'', 30', 32, 35) im zweiten Segment, um den UV-Strahl zu einem kleinen Punkt im Probenbereich zu fokussieren; Abtastmittel (25) im zweiten Segment, um den Winkel zu variieren, in dem der UV-Strahl auf das Fokussierungsmittel (27', 27'', 30', 32, 35) auftrifft, so daß die Position des Punkts im Probenbereich variiert wird; wobei das Fokussierungsmittel achromatisch korrigiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Fokussierungsmittel bezüglich chromatischer Abtastfehler korrigiert ist, so daß, wenn UV-Licht das Abtastmittel (25) in einem bestimmten Winkel verläßt und an einer bestimmten Position im Probenbereich (15) fokussiert wird, sichtbares Licht, das aus der bestimmten Position austritt, im gleichen Winkel auf das Abtastmittel (25) trifft.
Konfokales Rastermikroskop nach Anspruch 1, worin: das Fokussierungsmittel (27', 27'') zwischen sichtbarem und UV-Licht nicht longitudinal achromatisch ist; sichtbares Licht, das vom Punkt stammt, ausgerichtet wird, wenn es das Fokussierungmittel (27', 27'') verläßt; und das erste Segment Mittel (60, 65) umfaßt, die darin angeordnet sind, um zu bewirken, daß der UV-Strahl divergiert, wenn er auf das Fokussierungmittel trifft.
Konfokales Rastermikroskop nach Anspruch 1, worin das Fokussierungsmittel ein Okular (27, 27'') und ein Objektiv (35) umfaßt.
Konfokales Rastermikroskop nach Anspruch 1, worin das Fokussierungsmittel ein Okular (27'), eine Adapterlinse (30'), eine Telonlinse (32) und ein Objektiv (35) umfaßt.
Konfokales Rastermikroskop nach Anspruch 1, worin das Mittel zum Begrenzen der wirksamen Größe des Detektors eine Irisblende (40a) umfaßt
Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, worin ein erster Abschnitt (27', 27'') des Fokussierungsmittels zwischen einem finiten Objektpunkt (80, 85) und einem finiten Bildpunkt (82, 87) chromatisch bezüglich sichtbarem und UV-Licht korrigiert ist.
Konfokales Mikroskop nach Anspruch 6, worin sich der finite Objektpunkt nahe dem Abtastmittel befindet und der finite Bildpunkt an oder nahe einem zweiten Abschnitt des Fokussierungsmittels befindet.
Konfokales Rastermikroskop nach Anspruch 1, weiters umfassend eine Quelle für sichtbares Licht (20), die mit dem UV-Quellenmittel (55) konfokal ist.