DE69222710T2

DE69222710T2 - Verfahren zum Nachweis von DNS-Basen mit Verwendung von Fluoreszenz

Info

Publication number: DE69222710T2
Application number: DE69222710T
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi Hayakawa; Shiguru Hosoi
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1991-07-23
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2012-07-24
Also published as: US5260029A; EP0526112A2; DE69222710D1; JPH0526810A; EP0526112B1; EP0526112A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fluoreszenzverfahren zum Nachweis eines feinen Partikels, besonders auf ein Fluoreszenzverfahren zum Nachweis einer Base (Nukleotid), die ein Gen bildet.
Desoxyribonukleinsäure, kurz DNS, ist aus Basen als primärer Komponente, Zucker und Phosphorsäure zusammengesetzt und in einer Doppelhelixstruktur angeordnet, die die genetische Information enthält. Die genetische Information liegt in jedem der DNS-Fragmente in Form einer Basensequenz vor. Ein Strang von Genen befindet sich in der Zelle eines Organismus. Bei niederen Lebewesen, z.B. bei einem Mikroorganismus, gibt es einige Tausend Basenpaare, während es bei einem höher entwickelten Tier mit sehr viel mehr genetischer Information einige hundert Millionen bis zwei Milliarden und neunhundert Millionen Basenpaare sind.
Die genetische Information der DNS ist durch eine Folge von Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) bestimmt, welches Basen (Nukleotide) sind, die eine Nukleinsäure bilden. Deshalb ist die Erforschung der Folge dieser Basen deshalb der Schlussel zur Entwicklung von Gentechnologie und medizinischer Wissenschaft.
Es ist bekannt, daß jede der vorgenannten Basen spezifische Fluoreszenz produziert, und es ist üblich, die Base aufgrund der produzierten Fluoreszenz zu identifizieren. Ein Nachweis der auf diese Weise produzierten Fluoreszenz kann vorzugsweise mittels eines hochsensitiven Detektors wie zum Beispiel einer Fotomultiplierröhre durchgeführt werden.
Eine Publikation mit dem Titel "Chemical Physics Letters" ("Schriften über chemikalische Physik") (1990), Band 174, Seiten 552 bis 557 offenbart eine Anordnung zum Nachweis von Fluoreszenz, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist. Ein anregendes Licht von einer Lichtquelle 62 wird in eine Durchflußzelle 61 gestrahlt, wobei die Richtung C, in der das anregende Licht gestrahlt wird, rechtwinklig zur Richtung A&sub1; ist, in der feine Partikel in die Durchflußzelle 61 gebracht werden. Die in der Richtung von D emittierende Fluoreszenz wird von einer Fotomultiplierröhre 63 nachgewiesen, wobei die Richtung D sowohl rechtwinklig zur Rich tung A&sub1; als auch zur Richtung C der Strahlung des anregenden Lichts ist.
Die oben genannte Anordnung ist aber nicht in der Lage, die Fluoreszenz eines feinen Partikels, z.B. der Base eines Gens, genau und effizient nachzuweisen. Weil ein einzelnes DNS-Fragment eine extrem große Anzahl von Basen hat, ist jede Base extrem klein und die von jeder Base produzierte Fluoreszenz extrem gering. Deshalb ist es schwierig, die Art der Base mittels des Nachweises der Fluoreszenz zu identifizieren, die nur fur eine extrem kurze Zeit stattfindet, wenn der anregende Lichtstrahl durch den feinen Partikel dringt.
Während es die Zeit verlängern kann, während der die Fluoreszenz produziert wird, und die Effizienz des Fluoreszenznachweises verbessern kann, wenn der anregende Lichtstrahl Uber den Bereich der feinen Partikel in Stromrichtung gestrahlt wird, entsteht ein Problem, daß nämlich das Verarbeiten der gesammelten Daten schwierig wird, weil sequentiell eingebrachte feine Partikel gleichzeitig nachgewiesen werden. Die konventionelle Anordnung hat den weiteren Nachteil, daß nur die in einer Richtung produzierte Fluoreszenz nachgewiesen werden kann, was sehr wenig effizient ist.
US-A-4,173,415 und US-A-4,867,559 offenbaren Anordnungen ähnlich den oben diskutierten.
Angesichts des Vorangegangenen ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine Anordnung, die den Nachweis von Fluoreszenz, die von kontinuierlich zugeführten feinen Partikeln produziert wird, mit Genauigkeit und exzellenter Effizienz sicherstellt.
Nach der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Nachweis von Fluoreszenz, die von einem feinen Partikel produziert ist, mit
einem Zuführmittel zum Zuführen feiner Partikel in einer Richtung,
einem Strahlungsmittel zum Strahlen eines anregenden Lichtstrahls auf die feinen Partikel, und
einem Nachweismittel zum Nachweis von Fluoreszenz, die von den feinen Partikeln produziert ist, gekennzeichnet durch ein Blasmittel zum Blasen der feinen Partikel, um sie sich in einer Richtung mit einer höheren Geschwindigkeit bewegen zu lassen als der, unter der die feinen Partikel vom Zuführmittel zugeführt werden, wobei das Strahlungsmittel eine optische Achse in Ausrichtung mit der Richtung hat, in der die feinen Partikel vom Blasmittel bewegt werden, und wobei das Nachweismittel mit einer Durchbohrung versehen ist, durch die das anregende Licht und die vom Blasmittel bewegten feinen Partikel passieren, wodurch das Nachweismittel Fluoreszenz nachweist, die von dem anregenden Licht angeregt ist, wenn die feinen Partikel vom Blasmittel bewegt werden.
Die Richtung, in der die feinen Partikel durch das Blasmittel bewegt werden, kann entweder im wesentlichen rechtwinklig oder im wesentlichen parallel zur Richtung sein, in der die feinen Partikel durch das Zuführmittel geführt werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das vom Zuführmittel zugeführte feine Partikel in die Durchbohrung des Nachweismittels durch das Blasmittel eingeführt, und das feine Partikel wird in Bestrahlung gehalten, während es sich in der Durchbohrung aufhält. Dadurch wird die Fluoreszenz-Produktionszeit verlängert, und die so produzierte Fluoreszenz kann durch die auf dem inneren Umfang der Durchbohrung vorgesehene Licht-nachweisende Fläche aufgenommen werden.
Die besonderen Merkmale und Vorteile der Erfindung ebenso wie andere Ziele werden aus der folgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen deutlich, in denen:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht ist, die eine konventionelle Anordnung zum Nachweis von Fluoreszenz feiner Partikel zeigt;
Fig. 2 eine perspektivische Ansicht ist, die eine Anordnung zum Nachweis von Fluoreszenz feiner Partikel nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 3 ein erläuterndes Diagramm zur Beschreibung eines wesentlichen Abschnitts einer Durchflußzelle ist, die in der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
Fig. 4 ein Querschnitt ist, der eine Beziehung zwischen einem Durchflußverstärker, einer Lichtführung und einer hohlen Fotomultiplierröhre zeigt;
Fig. 5 ein Querschnitt ist, der die in der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendete hohle Fotomultiplierröhre zeigt;
Fig. 6 ein Querschnitt ist, der ein anderes Beispiel eines Fotodetektors zeigt; und
Fig. 7A und 7B eine perspektivische Ansicht bzw. eine Draufsicht ist, die eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
Ein Fluoreszenz-Nachweisgerät für feine Partikel nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 2 dargestellt. Das Gerät weist eine einzelne Moleküle kontinuierlich fangende Flußzelle 10 auf, einen Durchflußverstärker 20, der einen Gasstrahl zum Blasen feiner Partikel produziert, ein Lichtführungsteil 30, das so angeordnet ist, daß es ein anregendes Licht koaxial mit dem Durchflußverstärker 20 emittiert, sowie einen hohlen Fotomultiplier 40, der eine sich axial erstreckende Durchbohrung 41 hat und so angeordnet ist, daß die Durchbohrung 41 in koaxialem Verhältnis mit dem Durchflußverstärker 20 steht. Der hohle Fotomultiplier 40 dient als Fotodetektor. Die Tropfrichtung A&sub1; der feinen Partikel aus der Durchflußzelle 10 ist rechtwinklig sowohl zur Gasstrahlrichtung B auf dem Durchflußverstärker 20 als auch zur Richtung C einer optischen Achse des anregenden Lichts. Eine Lichtquelle (nicht dargestellt) ist mit dem lichtführenden Teil 30 verbunden.
Die Durchflußzelle 10 hat zwei Überschall-Fangstellen 12, die eingebettet zwischen dreigeteilten Durchflußzellen- Blocks 11 sind. Wie in Fig. 3 dargestellt, hat jede Überschall-Fangstelle 12 ein piezoelektrisches Element 13, das mit einem piezoelektrischen Treiberstromkreis durch Drähte 14 verbunden ist. Die Durchflußzelle 10 hat einen Fließpfad, durch den eine mit feinen Partikeln dispergierte Flüssigkeit fließen kann. Die piezoelektrischen Elemente 13 bilden eine stehende Welle im Inneren des Flußpfades, wodurch Flüssigkeitstropfen produziert und fallen gelassen werden.
Fig. 4 illustriert einen Zustand, in dem die Feinpartikel- Tropfen aus der Durchflußzelle 10 getropft werden. Der Durchflußverstärker 20, das Lichtführungsteil 30 und der hohle Fotomultiplier 40 sind in axialer Ausrichtung miteinander in einer Richtung rechtwinklig zur Feinpartikel- Tropfrichtung A&sub1; angeordnet. Das Lichtführungsteil 30 ist koaxial innerhalb des Durchflußverstärkers 20 angeordnet. Eine Fotokathode 42 ist über den gesamten inneren Umfang der Durchbohrung des hohlen Fotomultipliers 40 vorgesehen. Eine erste Dynode 43 ist der Fotokathode 42 im wesentlichen gegenüberliegend vorgesehen. Die getropften Feinpartikel-Tropfen sind in Richtung des Innenraums der Durchbohrung 41 des hohlen Fotomultipliers 40 aufgrund des Gasstrahls gerichtet, der vom Durchflußverstärker 20 produziert wird. Das feine Partikel wird mit einer höheren Geschwindigkeit als die Tropfgeschwindigkeit in der Richtung von A&sub2; mit derselben wie die Gasausstoßrichtung B bewegt. Zu dieser Zeit wird das feine Partikel, das von der Endfläche 31 des Lichtführungsteils 30 emittiert wird, in Besrahlung durch das anregende Licht gehalten und dadurch Fluoreszenz produziert. Weil die Produktion der Fluoreszenz im Innenraum des Fotomultipliers 40 stattfindet, strahlt der größte Teil der Fluoreszenz auf die Fotokathode 42, um so Fotoelektronen zu produzieren. Deshalb kann der Fluoreszenznachweis mit hoher Effizienz durchgeführt werden.
Fig. 5 zeigt eine innere Anordnung des hohlen Fotomultipliers 40. Wie dargestellt, ist die Fotokathode 42 auf dem gesamten inneren Umfang eines Bereichs kleineren Durchmessers der Durchbohrung 41 vorgesehen. Die erste Dynode 43 ist der Fotokathode 42 im wesentlichen gegenübeliegend vorgesehen, und die zweite Dynode ist zum Aufnehmen der Sekundärelektronen vorgesehen, die von der ersten Dynode 43 emittiert werden. Ähnlich sind eine passende Anzahl von Dynodenstufen in Folge in axialer Richtung des Fotomultipliers 40 angeordnet. Eine Anode 45 ist vorgesehen, um die von der Dynode der letzten Stufe emittierten Elektronen aufzunehmen. Das Ausgangssignal der Anode 45 wird durch einen Verstärker 46 verstärkt und an einem Ausgangsanschluß (OUT) abgeleitet. Auf diese Weise werden die in Abhängigkeit von der Fluoreszenz des feinen Partikels produzierten Fotoelektronen sukzessive durch eine Anzahl von Dynoden 43, 44 vervielfältigt und am Ausgangsanschluß (OUT) abgenommen.
Nach der oben beschriebenen Ausführungsform stimmt die Richtung A&sub2;, in der das feine Partikel sich vorwärtsbewegt, mit der Richtung C der optischen Achse des anregenden Lichts überein, so daß die feinen Partikel durch den konvergierten anregenden Lichtstrahl über eine lange Zeitperiode angeregt werden können. Außerdem kann der Nachweis des Fluoreszenz mit hoher Effizienz erreicht werden, weil die von den feinen Partikeln ausstrahlende Fluoreszenz im Innern der Durchbohrung 41 des hohlen Fotomultipliers 40 produziert wird und deshalb die Fluoreszenz beinahe perfekt auf die Fotokathode 42 strahlt. Auf diese Weise kann von einem feinen Partikel, wie zum Beispiel einer Base, die ein Gen formt, ausgestrahlte extrem geringe Fluoreszenz nachgewiesen werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mit Bezug auf Fig. 7A und 7B beschrieben. In dieser Ausführungsform sind die Feinpartikel-zuführende Richtung und die optische Achse des anregenden Lichts im wesentlichen parallel zueinander gesetzt. Genauer sind eine einzelne Moleküle kontinuierlich fangende Durchflußzelle 10 und eine optische Faser oder ein lichtführendes Teil 30 innerhalb eines zylindrischen Teils 70 parallel zueinander angeordnet. Um die aus der Durchflußzelle 10 zugeführten feinen Partikel in einen fotondetektierenden Zylinder 50 mit höherer Geschwindigkeit einzuführen, wird Luft in den Innenraum des zylindrischen Teils 70 geblasen. Zwei Sätze von Fotodetektoren 40a&sub1; bis 40a&sub8; und 40b&sub1; bis 40b&sub8; sind am äußeren Umfang des fotodetektierenden Zylinders 50 vorgesehen. Die Fotodetektoren 40a&sub1; bis 40a&sub8; oder 40b&sub1; bis 40b&sub8; sind unter gleichen Winkeln zueinander angeordnet. Eine Anzahl von sechs oder acht Fotodetektoren in dem Satz ist zu bevorzugen.
Während die vorliegende Erfindung mit Bezug auf eine be sondere Ausführungsart beschrieben worden ist, läßt sich für den Fachmann erkennen, daß eine Vielzahl von Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden kann, ohne vom Bereich der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel können Bubblejetdüsen, die in Tintenstrahldruckern Verwendung finden, anstatt der Ultraschall-Fangstellen zur Benutzung in einer einzelne Moleküle kontinuierlich fangende Durchflußzelle verwendet werden. Zwei oder drei hohle Fotomultiplier 40 können zusammen in Serie gekoppelt werden, um einen zwei- oder dreistufigen hohlen Multiplier zu erzeugen, mit dem die Nachweiseffizienz weiter verbessert werden kann. Einen Wellenlängenfilter in der öffnung der Durchbohrung 41 vorzusehen, kann dem Nachweis von Rauschen vorbeugen, das durch Streuung des anregenden Lichts erzeugt ist.
Darüber hinaus kann in Linie mit dem hohlen Fotomultiplier 40 ein Fotomultiplier des in Fig. 6 dargestellten Typs verwendet werden. Der hier gezeigte Fotomultiplier hat eine Fotokathode 42 auf einer inneren bogenförmigen Fläche des Fotomultipliers. Eine lichtreflektierende Membran 48 ist teilweise auf dem inneren Umfang der Durchbohrung 41 der Fotokathode 42 gegenüberliegend vorgesehen. Der dargestellte Fotomultiplier in Fig. 6 ist bezüglich seiner Einfachheit der inneren Anordnung vorteilhaft. Auch Halbleitergeräte können als Fotodetektoren verwendet werden.
Wie beschrieben, wird entsprechend der vorliegenden Erfindung das feine Partikel, das sich im Inneren des Fotomultipliers vorwärtsbewegt, in Bestrahlung durch das anregende Licht gehalten. Deshalb kann die Zeitdauer, während der die Fluoreszenz produziert wird, verlängert werden. Außerdem kann unter Verwendung des hohlen Multipliers mit einer auf dem gesamten inneren Umfang der Durchbohrung gebildeten Nachweisfläche Fluoreszenz in jeder Richtung gefangen werden. Entsprechend kann Fluoreszenz von sukzessive zugeführten feinen Partikeln, wie zum Beispiel DNS-Basen, mit hoher Genauigkeit und exzellenter Effizienz produziert werden.

Claims

1. Eine Vorrichtung zum Nachweis von Fluoreszenz, die von einem feinen Partikel produziert ist, mit

einem Zuführmittel (10) zum Zuführen feiner Partikel in einer Richtung,

einem Strahlungsmittel (30) zum Strahlen eines anregenden Lichtstrahls auf die feinen Partikel und

einem Nachweismittel (40) zum Nachweis von Fluoreszenz, die von den feinen Partikeln produziert ist,

gekennzeichnet durch ein Blasmittel (20) zum Blasen der feinen Partikel, um sie sich in einer Richtung mit einer höheren Geschwindigkeit bewegen zu lassen als der, mit der die feinen Partikel vom Zuführmittel zugeführt werden, wobei das Strahlungsmittel eine optische Achse in Ausrichtung mit der Richtung hat, in der die feinen Partikel vom Blasmittel bewegt werden, und wobei das Nachweismittel (40) mit einer Durchbohrung (41) versehen ist, durch die das anregende Licht und die vom Blasmittel bewegten feinen Partikel passieren, wodurch das Nachweismittel Fluoreszenz nachweist, die von dem anregenden Licht angeregt ist, wenn die feinen Partikel vom Blasmittel bewegt werden.

2. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Richtung, in der die feinen Partikel vom Blasmittel (20) bewegt werden, im wesentlichen rechtwinklig zur Richtung ist, in der die feinen Partikel vom Zuführmittel (10) zugeführt werden.

3. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Richtung, in der die feinen Partikel vom Blasmittel (20) bewegt werden, im wesentlichen parallel zur Richtung ist, in der die feinen Partikel vom Zuführmittel (10) zugeführt werden.

4. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Nachweismittel (40) einen hohlen Fotomultiplier, in dem eine Durchbohrung (41) durch einen inneren Umfang begrenzt ist, eine auf dem inneren Umfang der Durchbohrung gebildete Fotokathode, eine Anzahl von Dynoden (43, 44) sowie eine Anode (45) aufweist, wobei der Fotomultiplier in einer Orientierung angeordnet ist, so daß die vom Blasmittel bewegten feinen Partikel durch die Durchbohrung (41) passieren.

5. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Nachweismittel (40) einen Fotomultipier, bei dem die Durchbohrung (41) von einem inneren Umfang begrenzt ist, ein auf einem Teil des inneren Umfangs der Durchbohrung gebildetes reflektierendes Teil (48) zum Reflektieren von Licht, eine zum Aufnehmen des vom reflektierenden Teil reflektierten Lichts angeordnete Fotokathode (42), eine Anzahl von Dynoden (43, 44) sowie eine Anode (45) aufweist, wobei der Fotomultiplier in einer Orientierung angeordnet ist, so daß die vom Blasmittel bewegten feinen Partikel durch die Durchbohrung passieren.

6. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Nachweismittel einen lichtaufnehmenden Zylinder (50), durch den die vom Blasmittel bewegten feinen Partikel passieren, sowie eine Anzahl von Lichtdetektoren (40a, 40b) aufweist, die auf dem Umfang des lichtaufnehmenden Zylinders angeordnet sind.

7. Die Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei sechs Lichtdetektoren (40a&sub1; bis 40a&sub6;, 40b&sub1; bis 40b&sub6;) in gleichem Winkel zueinander auf dem Umfang des lichtaufnehmenden Zylinders angeordnet sind.

8. Die Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei acht Lichtdetektoren (40a&sub1; bis 40a&sub8;, 40b&sub1; bis 40b&sub8;) in gleichem Winkel zueinander auf dem Umfang des lichtaufnehmenen Zylinders angeordnet sind.

9. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Zuführmittel (10) DNS-Fragmente während des Separierens in Basen zuführt.