DE69025370T2

DE69025370T2 - Gerät und Verfahren zur Trennung oder Messung von zu untersuchenden Teilchen in einer Flüssigkeitsprobe

Info

Publication number: DE69025370T2
Application number: DE69025370T
Authority: DE
Inventors: Junichi Yamayoshi; Yoshito Yoneyama; Naoki Yuguchi
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1989-10-04
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2010-10-05
Also published as: EP0421406A2; EP0421406A3; DE69025370D1; EP0421406B1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Gerät und ein Verfahren zum individuellen Separieren zu untersuchender Partikel in einer fluiden Probe, in der feine Partikel wie beispielsweise Zellen oder dergleichen, suspendiert sind; sie betrifft außerdem ein Gerät und ein Verfahren zum Messen der separierten individuellen Partikel mit Hilfe eines optischen Verfahrens oder dergleichen.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Derzeit ist allgemein ein Verfahren zum individuellen Separieren einer großen Anzahl von Partikeln in einem partikel-suspendierenden Fluid, beispielsweise einer Blutprobe oder dergleichen, in Form eines Mantelstromverfahrens allgemein bekannt, wie es in Fig. 14 dargestellt ist. Bei diesem Verfahren werden ein Teilchen-Suspensionsfluid und ein Mantelfluid durch zugehörige Druckvorrichtungen unter Druck gesetzt, und das Teilchen-Suspensionsfluid strömt in einen Zustand, in welchem es von dem Mantelfluid umgeben ist. Das Teilchen-Suspensionsfluid wird hydrodynamisch in einen schmalen Strom umgesetzt, und die Partikel werden separiert, um einzeln in einer Reihe zu strömen.
Eine Apparatur zum Analysieren oder zur Probenentnahme von Zellen, in der eine Probe wie z.B. eine Blutprobe oder dergleichen aufbereitet wird und die jeweiligen nach dem Mantelstromverfahren separierten Zellen in der Probe nach einem optischen Verfahren oder dergleichen gemessen werden, wurde in der Praxis unter der Bezeichnung Strömungs-Cytometer oder Zellen-Sortierer eingesetzt.
Fig. 14 zeigt ein Beispiel für den Aufbau eines Strömungs-Cytometers, welches Messenergie, beispielsweise einen Lichtstrahl von einer Lichtquelle 24, auf einzelne Zellen strahlt, die durch das Mantelstromverfahren separiert wurden und innerhalb einer Strömungszelle in Form einer Reihe strömen, und welches photometrisch eine optische Reaktion der Zellen aufgrund deren Bestrahlung mit Licht vornimmt, beispielsweise Streulicht und Fluoreszenz, die von den Zellen abgegeben werden, mit Hilfe von Detektoren 25 und 26 erfaßt. Eine Signalverarbeitungseinheit 29 berechnet Art, Größe und dergleichen der analysierten Partikel abhängig von einem Ausgangssignal der Photometrie.
Das Grundprinzip des Zellen-Sortierers ist z.B. in den US-Patenten 3 380 584, 3 710 933 und 3 826 364 erläutert. Fig. 15 zeigt ein Beispiel für den Grundaufbau eines Zellen-Sortierers. Ein zellensuspendierendes Fluid, beispielsweise Blut oder dergleichen, wird von einer externen Druckerzeugungseinrichtung in eine Düse eingeleitet, und innerhalb der Düse wird nach dem Mantelstromverfahren eine laminare Strömung erzeugt, die sich im wesentlichen aus dem Zellensuspendierfluid zusammensetzt. Ein Strahlstrom des Zellensuspendierfluids mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 15-20 µm wird durch eine Öffnung (die einen Durchmesser von 70-100 µm aufweist) am Düsenausgang in die Luft ausgetragen. Auf den in die Luft ausgetragenen Strahlstrom wird an einer Stelle, die etwa 100-200 µm vom Vorderende der Düse entfernt ist, Anregungslicht aus einer Lichtquelle 24 projiziert. Wenn das Anregungslicht auf eine Zelle projiziert wird, welche zuvor einer Fluoreszenz-Anfärbung unterzogen wurde, werden von der Zelle Streulicht und Fluoreszenz abgegeben, die von den Detektoren 25 und 26 detektiert und in elektrische Signale umgewandelt werden. Da die Düse von einem Vibrator 21 mit einer Frequenz von etwa 40 kHz (Kilohertz) durch die Steuerung einer Vibratorschaltung 27 in Vibration versetzt wird, wird der von der Öffnung ausgetragene Strahlstrom an einer Stelle, die einige Millimeter tiefer liegt als das vordere Düsenende, in gleichförmige Flüssigkeitströpfchen umgewandelt. Abhängig davon, ob ein von der Zelle detektiertes Signal vorbestimmte Bedingungen erfüllt oder nicht, wird das Signal von einer Signalverarbeitungseinheit 29 an eine Aufladeschaltung 28 gesendet, von der ein Aufladesignal synchron mit der Tröpfchenbildung an die Düse gegeben wird, um ein Flüssigkeitströpfchen etwas aufzuladen. Während das die gewünschte Zelle enthaltende, aufgeladene Flüssigkeitströpfchen zwischen zwei Elektroden 22 und 23, die ein starkes elektrisches Feld erzeugen, hindurchläuft, wird das Flüssigkeitströpfchen durch die statische Elektrizität abhängig von der Art in der Richtung nach rechts oder nach links abgelenkt und verteilt und wird in getrennten Teströhrchen gesammelt.
Da bei dem Mantelstromverfahren, wie es bei dem oben erläuterten Strömungs- Zytometer oder Zellen-Sortierer eingesetzt wird, das Zellensuspendierfluid und das Mantelfluid der Düse zugeführt werden, indem die jeweiligen Fluide durch Druckerzeugungssysteme unter Druck gesetzt werden, werden Rohrleitungen und Druckerzeuger, beispielsweise Pumpen oder dergleichen, für diesen Zweck benötigt. Folglich hat dieses Verfahren den Nachteil, daß es eine große Apparatur und ein kompliziertes Steuersystem benötigt.
Bei dem Mantelstromverfahren bestimmt sich der Strömungsdurchsatz durch die Druckkräfte für das Zellensuspendierfluid und das Mantelfluid, und das Zeitintervall für die Separierung der Partikel bestimmt sich durch den Strömungsdurchsatz und den Grad der Verdünnung des Zellensuspendierfluids. Es ist schwierig, das Zeitintervall, d.h. die für die Separierung vorgesehene Zeit, in einem großen Bereich frei einzustellen. Das Verfahren hat außerdem den Nachteil, daß eine gewisse Zeit nach der Bildung des Stroms bis zum Beginn der Separierung und von dem Anhalten des Stroms bis zum Aufhören der Separierung benötigt wird, so daß die Probe daher ungenutzt strömt.
Ferner ist es schwierig, eine kleine Apparatur vorzusehen, und es ist schwierig, mehrere Apparaturen in großer Dichte parallel anzuordnen, um die Verarbeitungskapazität zu erhöhen.
Ein Gerät der im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannten Art ist aus der US-A- 3 380 584 bzw. der US-A-4 318 483 bekannt. Danach besteht das Prinzip der Tröpfchenerzeugung aus dem individuelle Partikel enthaltenden Probenfluid darin, das Fluid über eine Düse auszutragen, um so durch ein Fluiddrucksystem eine Strömung zu erzeugen, und in die Strömung mit Hilfe eines entsprechenden Wandlers elastische oder akustische Schwingungsenergie einzubringen, um Tröpfchen der Fluidenprobe abzutrennen. In anderen Worten, es ist der Druck durch das Fluiddrucksystem, der einen Fluidaustrag durch eine Düse veranlaßt, wobei das Fluiddrucksystem relativ unhandlich ist.

Offenbarung der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein billiges und kompaktes Gerät der im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannten Art anzugeben, welches in der Lage ist, zu untersuchende Partikel ohne Einsatz von Druckerzeugungsmechanismen zu messen, welches das Separieren von zu untersuchenden Partikeln mit freier Zeitsteuerung sowie Start und Beendigung des Meßvorgangs ohne Zeitverzögerung durchführt, während die Menge an verbrauchter Probe weitestgehend verringert wird, wobei das Gerät eine hohe Verarbeitungskapazität besitzt, wenn Düsen parallel angeordnet werden. Außerdem soll ein vorteilhaftes Verfahren zum Betreiben dieses Geräts angegeben werden.
Bezüglich des Geräts wird dieses Ziel erreicht durch die Merkmale des Anspruchs 1. Bezüglich des Verfahrens wird das Ziel erreicht durch die Merkmale des Anspruchs 7. Vorteilhafte Weiterentwicklungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figuren 1-4 sind Diagramme, die die Konfiguration einer ersten Ausführungsform der Erfindung zeigen;
Fig. 5 ist ein Diagramm, welches die Konfiguration einer zweiten Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Figuren 6 und 7 sind Diagramme, die die Konfiguration einer dritten Ausführungsform der Erfindung zeigen;
Fig. 8 ist ein Diagramm, welches die Konfiguration einer vierten Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Figuren 9 und 10 sind Diagramme, die die Konfiguration einer fünften Ausführungsform der Erfindung zeigen;
Fig. 11 ist ein Blockdiagramm eines Steuersystems;
Fig. 12 ist ein Diagramm der Konfiguration einer sechsten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 13 ist ein Blockdiagramm eines Steuersystems, welches bei der sechsten Ausführungsform eingesetzt wird;
Fig. 14 ist ein Diagramm zum Erläutern des Mantelstromverfahrens;
Fig. 15 ist ein Diagramm, welches die Konfiguration eines herkömmlichen Beispiels zeigt.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen detailliert erläutert. Figuren 1-4 sind Diagramme, welche die Konfiguration einer ersten Ausführungsform der Erfindung zeigen.
In Fig. 1 enthält eine Düse 1 einen Behälter mit rechteckigem Querschnitt von etwa 50 µm x 50 µm zur Aufnahme eines Zellensuspendierfluids, in welchem als zu untersuchende partikeldienende Zellen suspendiert sind. Ein Ende der Düse 1 ist zur Bildung einer Öffnung geöffnet. Die Düse wird allgemein nach einem Verfahren hergestellt, bei dem auf einem Substrat durch Ätzen oder einen Photoresist-Prozeß eine feine Nut gebildet wird und anschließend an dem Substrat ein Flachstück angeklebt wird. Die Fertigung der Düse ist natürlich nicht auf dieses Verfahren beschränkt, der Querschnitt der Düse kann eine Größe besitzen, die sich für die Größe der zu untersuchenden Partikel, die ein Meßobjekt darstellen, eignet. Bei der vorliegenden Ausführungsform ist das Meßobjekt Blut. Da die Größen der verschiedenen Blutkörperchen in dem Blut etwa 5 µm-30 µm betragen, wurde die Größe der Düse auf 50 µm x 50 µm eingestellt, was etwas mehr ist als die maximale Blutzellengröße.
Eine Zuführöffnung 2 zum sequentiellen Einspeisen des Zellensuspendierfluids in die Düse 1 ist mit einem Abschnitt in der Nähe des Ausgangs der Düse 1 verbunden. Ein Heizelement 3 befindet sich im Inneren der Düse, die im aktuellen Fall eine Heizvorrichtung ist. Die Elektrode des Heizelements 3 ist mit einer (unten noch zu beschreibenden) Steuerschaltung verbunden. Das Heizelement 3 kann sich außerhalb der Düse befinden und das Innere der Düse erwärmen. Das Heizelement 3 ist nicht auf eine Heizvorrichtung beschränkt, sondern kann auch eine Einrichtung zum Erzeugen von Wärmeenergie sein, welche die Energie zum Austragen von Flüssigkeitströpfchen ist. Sie kann das Erwärmen beispielsweise dadurch vornehmen, daß ein wärmeabsorbierendes Element mit elektromagnetischer Energie beaufschlagt wird, beispielsweise Laserlicht oder dergleichen. Ein Wärmeabstrahlelement 4 befindet sich außerhalb der Düse 1 und verhindert, daß die Temperatur der Düse 1 durch Wärmeleitung von der Heizvorrichtung ansteigt.
Eine Laserlichtquelle 7 dient als Energieerzeugungseinrichtung für die Messung. Detektoren 5 und 6, beispielsweise Photoelektronenvervielfacher oder dergleichen, weisen eine optische Reaktion eines Partikels nach, die durch Bestrahlung mit Licht hervorgerufen wird. Die Laserlichtquelle 7 ist so angeordnet, daß die optische Achse O des von der Laserlichtquelle 7 abgegebenen Laserlichts die Achse I des Wegs kreuzt, entlang dem die aus der Öffnung der Düse 1 ausgetragenen Flüssigkeitströpfchen laufen. Der Detektor 5 ist auf der optischen Achse des Laserlichts angeordnet. Eine (nicht gezeigte) Sammellinse und ein (nicht gezeigter) Strahlstopper zum Verhindern, daß der Laserstrahl direkt in den Detektor 5 eintritt, sind vor dem Detektor 5 auf der optischen Achse angeordnet, um ein optisches Dunkelfeldsystem zu bilden. Somit wird von dem Detektor 5 nur das Licht erfaßt, welches in Vorwärtsrichtung des optischen Wegs streut. Der Detektor 6 ist in einer Richtung senkrecht sowohl zu der optischen Achse O des Laserlichts als auch zu der Achse I der Flüssigkeitströpfchen-Austragung angeordnet. Eine (nicht gezeigte) Sammellinse und ein wellenlängenselektives Filter 15 zum Durchlassen lediglich der Fluoreszenz- Wellenlänge sind vor dem Detektor 6 angeordnet. Damit wird nur die von dem wellenlängenselektiven Filter 15 ausgewählte Fluoreszenz von dem Detektor 6 photometrisch erfaßt. Falls ein Meßparameter in Seitenrichtungen gestreutes Licht benötigt wird, kann noch ein weiterer Detektor in einer von der optischen Achse O abweichenden Richtung angeordnet werden.
Der Betrieb des oben beschriebenen Aufbaus wird im folgenden erläutert.
Es wird eine Blutprobe oder dergleichen vorbereitet, die ausreichend gelöst und bei Bedarf mit einem fluoreszierenden Mittel angefärbt ist. Die Probe wird über die Einlaßöffnung 2 in die Düse 1 eingebracht, so daß die Düse 1 mit der Probe gefüllt ist, wie in Fig. 1 gezeigt ist.
Im folgenden wird die Steuerung durch ein in Fig. 11 gezeigtes Steuersystem im einzelnen beschrieben. Jedes der in Fig. 11 in Blockform dargestellten Elemente ist an sich bekannt, und sein spezieller Aufbau ist zur Ausführungsform der Erfindung oder bezüglich der Offenbarung der besten Weise der Ausführung der Erfindung nicht kritisch. Wenn eine Ein-Aus-Generatorschaltung 32 die in der Düse 1 vorhandene Heizvorrichtung 3 treibt und erwärmt, wird dadurch sofort in dem Zellensuspendierfluid enthaltenes Wasser erwärmt und verdampft, wodurch eine Blase 8 entsteht, wie dies in Fig. 2 gezeigt ist. Da das Volumen des Fluids sich plötzlich durch die verdampfte Menge ausdehnt, wird eine Zelle S in der Nähe der Öffnung der Düse 1 aus der Öffnung der Düse 1 ausgetragen, aufgrund des durch die Ausdehnung verursachten Stoßes, und die die Zelle S enthaltende Zellensuspendierflüssigkeit wird aus der Düse 1 ausgetragen, wie es in Fig. 3 dargestellt ist. Die Ausdehnung der Blase 8 setzt sich zunächst fort und dehnt sich so lange aus, bis sie abkühlt und beginnt, sich zusammenzuziehen, wobei eine Zugkraft auf das von der Öffnung ausgetragene Zellensuspendierfluid durch die Volumenverkleinerung des Fluids ausgeübt wird. Dadurch wird das die Zelle S enthaltende Zellensuspendierfluid, welches aus der Öffnung nach außen getragen wird, in ein Flüssigkeitströpfchen umgewandelt, welches gemäß Fig. 4 in die Luft fliegt. Das Grundprinzip des Austragvorgangs wird z.B. in den US-Patenten 4 723 129 und 4 740 796 beschrieben. Das Zellensuspendierfluid wird von der Einlaßöffnung 2 durch Kapillarkräfte in der ausgetragenen Menge nachgeführt, und es wird wieder der in Fig. 1 gezeigte Zustand eingenommen. Da die Zufuhr des Zellensuspendierfluids durch die Kapillarwirkung spontan erfolgt, wird ein Druckerzeugungsmechanismus wie im Stand der Technik nicht benötigt.
Die oben beschriebene Erzeugung und Beseitigung der Blase erfolgt innerhalb sehr kurzer Zeit entsprechend einer Abtastfrequenz, die in einer Abtast-Synchronisierschaltung 31 nach Fig. 11 bereitgestellt wird. Es ist möglich, kontinuierlich mehrere 1000 Flüssigkeitströpfchen pro Sekunde maximal abzugeben. Daher besteht die Möglichkeit, mit hoher Geschwindigkeit eine große Anzahl von Zellen zu separieren.
Die Größe der Öffnung und die Kapazität der Heizvorrichtung sind derart eingestellt, daß die aus der Düse ausgetragenen Flüssigkeitströpfchen Durchmesser von etwa 50 µm-80 µm besitzen. Die Verdünnung des Artikelsuspendier-Fluids ist so eingestellt, daß lediglich ein einzelner Partikel in jedem der ausgetragenen Flüssigkeitströpfchen enthalten ist. Wenn jedes Flüssigkeitströpfchen einen Detektierabschnitt kreuzt, auf den Meßenergie, beispielsweise ein Laserstrahl, projiziert wird, wird eine optische Reaktion hervorgerufen, d.h. gestreutes Licht und Fluoreszenz aufgrund einer zuvor mit einem fluoreszierenden Mittel angefärbten Zelle in dem Flüssigkeitströpfchen Die optische Reaktion wird von einem Detektiersystem 33 nachgewiesen, welches Detektoren 5 und 6 enthält. Das Detektiersystem 33 empfängt Daten von den Detektoren lediglich während der Abgabe des Flüssigkeitströpfchens entsprechend einem Zeitsteuersignal von der Abtastsynchronisierschaltung 31.
Ausgangssignale des Detektiersystems 33 werden sukzessive in einer Datenspeichereinheit 34 abgespeichert. Eine Signalverarbeitungseinheit 35 übernimmt die Analyse der Partikel, beispielsweise die Bestimmung der Partikel-Art, der Eigenschaften der Partikel und dergleichen, aus den Daten, die für eine große Anzahl von Partikeln erhalten wurden, indem von einer statistischen Analyse Gebrauch gemacht wird, beispielsweise einem Histogramm, einem Cytogramm und dergleichen. Da verschiedene Arten spezieller Berechnungsmethoden umfangreich bekannt sind, kann auf deren Erläuterung verzichtet werden. Die Ergebnisse der Analyse werden auf einem Kathodenstrahlröhren-Monitor dargestellt, über einen Drucker ausgedruckt oder dergleichen.
Bei dem erfindungsgemäßen Gerät kann der zeitliche Ablauf für die Separierung der Partikel in einem breiten Bereich von Zeitspannen frei eingestellt werden. Dieses Merkmal steht im Gegensatz zu der bekannten Vorrichtung, die das Mantelstromverfahren benutzt. Folglich ist es bevorzugt, die Abtastfrequenz derart einzustellen, daß die am besten geeignete Geschwindigkeit im Hinblick auf verschiedene Bedingungen gegeben ist, beispielsweise die geforderte Verarbeitungsgeschwindigkeit, die Menge der Wärmeerzeugung und die Haltbarkeit der Düse und dergleichen. Die Düse wird nicht nur mit einer konstanten Frequenz kontinuierlich betrieben, sondern kann auch so betrieben werden, daß die Frequenz geändert wird, oder daß eine intermittierende Frequenz benutzt wird. Da außerdem die erfindungsgemäße Vorrichtung ohne Zeitverzögerung starten und anhalten kann, was ebenfalls im Gegensatz zu der das Mantelstromverfahren benutzenden herkömmlichen Apparatur steht, werden weder Zeit noch Proben verschwendet.
Fig. 5 ist ein Diagramm, welches den Aufbau der zweiten Ausführungsform der Erfindung zeigt. In Fig. 5 sind Bauteile, die mit denen in Fig. 1 identisch oder äquivalent sind, mit entsprechenden Bezugszeichen versehen.
Die vorliegende Ausführungsform hat eine Besonderheit insofern, als der Detektierabschnitt, auf den der von der Lichtquelle 7 kommende Laserstrahl projiziert wird, dichter an der Öffnung der Düse 1 liegt. Das heißt, bei der vorhergehenden Ausführungsform erfolgt die optische Messung dadurch, daß das Laserlicht auf die Zelle gestrahlt wird, wenn diese einen Zustand einnimmt, in welchem das Zellensuspendierfluid ausgetragen und in ein Flüssigkeitströpfchen umgewandelt wird. Im Gegensatz dazu wird bei der vorliegenden Ausführungsform das Laserlicht auf eine Stelle projiziert, die unmittelbar hinter der Stelle des Austragens des Zellensuspendierfluids liegt, wenn dieses noch nicht zu einem Flüssigkeitströpfchen umgewandelt ist, wie Fig. 5 zeigt.
Figuren 6 und 7 sind Diagramme, die die Konfiguration einer dritten Ausführungsform darstellen, die weiter vereinfacht ist. In diesen Figuren sind Bauteile, die mit denen der vorausgehenden Diagramme identisch oder äquivalent sind, mit gleichen Bezugszeichen versehen.
Das Zellensuspendierfluid wird einer Düse 1 zugeführt, die an einem Ende eine Zuführöffnung und am anderen Ende eine Austragöffnung besitzt, und jedes eine Zelle enthaltende Flüssigkeitströpfchen wird von der Austragöffnung der Düse durch Erwärmung mit Hilfe der Heizvorrichtung 3 ausgetragen. Da die optische Messung des ausgetragenen Flüssigkeitströpfchens identisch ist mit der ersten und der zweiten Ausführungsform, wird ihre Erklärung weggelassen.
Fig. 8 ist ein Diagramm, welches den Aufbau einer vierten Ausführungsform der Erfindung zeigt. In Fig. 8 sind Komponenten, die mit den in den vorausgehenden Diagrammen dargestellten Komponenten identisch oder äquivalent sind, mit gleichen Bezugszeichen versehen.
Eine aus einem transparenten Material hergestellte Zelle 9 ist an dem vorderen Endabschnitt der Düse 1 angeordnet. Der Weg innerhalb der Zelle 9 ist an der Seite der Düse verjüngt und besitzt einen verengten Rohrabschnitt, so daß die Probenzellen einzeln in einer Reihe strömen.
Von der Lichtquelle 7 wird ein Lichtstrahl auf die Zelle 9 projiziert, und von den Detektoren 5 und 6 wird Streulicht und Fluoreszenz seitens eines Partikeis photometrisch aufgenommen, der einen Detektierabschnitt durchläuft, welcher sich in dem schmalen Rohrabschnitt innerhalb der Zelle 9 befindet, auf den der Lichtstrahl projiziert wird.
Wenn aufgrund der Erwärmung durch die Heizvorrichtung 3 eine Blase 8 erzeugt wird, wird das Zellensuspendierfluid innerhalb der Düse 1 durch das vergrößerte Volumen zusammengedrückt. Hierdurch laufen die Probenzellen eine nach der anderen durch den verengten Rohrabschnitt innerhalb der Zelle 9 und werden aus der Öffnung ausgestoßen.
Wenngleich ein oder mehrere Zellen den Detektierabschnitt in der Zelle 9 sukzessive mit Hilfe eines einzigen Erwärmungsvorgangs passieren können, ist es möglich, die photometrische Messung für jede Testzelle vorzunehmen, so lange die Zellen einzeln in einer Reihe strömen.
Bei der vorliegenden Ausführungsform erfolgt die optische Messung nicht dann, wenn die Zelle in die Luft ausgestoßen wird, sondern erfolgt durch Bestrahlen von Licht in einem Zustand, in welchem die Probenzelle innerhalb der transparenten Zelle fließt. Damit wird die optische Messung nicht beeinflußt durch Schwankungen im Brechungsindex des die Zelle umgebenden Suspendierfluids und auch nicht durch die diffuse Reflektion an der Oberfläche des Flüssigkeitströpfchens, und man kann stets einen stabilen Meßwert erhalten.
Als nächstes wird eine fünfte Ausführungsform der Erfindung anhand der Figuren 9 und 10 erläutert. In diesen Figuren sind solche Komponenten, die mit denjenigen der früheren Ausführungsbeispiele äquivalent oder identisch sind, mit gleichen Bezugszeichen versehen.
In den Figuren 9 und 10 ist eine feste transparente Glasplatte 16 bezüglich der Entladungsachse I der Düse 1 gekippt angeordnet. Der von der Laserlichtquelle 7 limitierte Laserstrahl fällt von der Rückseite her auf die Glasplatte 16. Die Entladungsachse I der Düse 1 und die optische Achse O des Laserlichts sind so angeordnet, daß sie sich in der Laserglasplatte 16 kreuzen. Der Detektor 5 ist auf der optischen Achse des Laserlichts angeordnet. Eine (nicht gezeigte) Sammellinse und ein (nicht gezeigter) Strahlstopper zum Verhindern, daß der Laserstrahl direkt in den Detektor 5 eintritt, sind vor dem Detektor 5 auf der optischen Achse angeordnet. Die Sammellinse und der Strahlstopper bilden ein optisches Doublefeldsystem, so daß Streulicht in Vorwärtsrichtungen der optischen Achse aufgrund eines an einer Meßstelle auf der Glasplatte 16 befindlichen Partikels S, auf die der Laserstrahl projiziert wird, durch den Detektor 5 einer photometrischen Messung unterzogen wird. Der Detektor 6 ist in einer Richtung angeordnet, die sowohl die optische Achse O des Laserlichts als auch die Achse I der Flüssigkeitströpfchen-Ausstoßung kreuzt. Eine (nicht gezeigte) Sammellinse und ein wellenlängenselektives Filter 15 befinden sich vor dem Detektor 6, so daß an der Meßstelle von dem Partikel S emittierte Fluoreszenz von dem Detektor 6 selektiv photometrisch gemessen wird.
Von der Öffnung ausgetragene Flüssigkeitströpfchen kollidieren mit der Glasplatte 16 aus einer schrägen Richtung, haften an der Glasplatte 16 und bewegen sich auf der Glasplatte 16 aufgrund der Ausstoßenergie. Wenn eine Zelle in dem Fluid die Meßstelle, auf die der Laserstrahl von der Rückseite der Glasplatte 16 her projiziert wird, passiert, werden von der Zelle Streulicht und Fluoreszenz erzeugt, deren Stärken von dem Detektiersystem mit den Detektoren 5 und 6 nachgewiesen werden. Die Flüssigkeitströpfchen werden von der Öffnung der Düse 1 sukzessive ausgestoßen, und jede Zelle wird an der Meßstelle gemessen. Die gemessenen Zellen werden von nachfolgend ausgestoßenen Flüssigkeitströpfchen fortgestoßen.
Da die vorliegende Ausführungsform nicht einen solchen Aufbau besitzt, bei dem der Laserstrahl direkt auf fliegende Flüssigkeitströpfchen projiziert wird, sondern die Messung so vornimmt, daß sequentiell Zellenpartikel durch den Meßbereich hindurchgeschickt werden, während sie dazu gebracht werden, an der feststehenden Glasplatte haften zu bleiben, werden folgende Effekte erzielt:
Erstens: Da die Zellenpartikel an der feststehenden Glasplatte haften bleiben, läßt sich eine Messung stets an einer festen Stelle durchführen. Demzufolge gibt es nur eine geringe Abweichung der Stelle des Partikels an der Detektier-Stelle, so daß eine stabilere Messung erfolgen kann.
Zweitens: Bei einem Aufbau, bei dem der Laserstrahl direkt auf ein fliegendes Flüssigkeitströpfchen projiziert wird, erfolgt diffuse Reflektion an der Oberfläche des Flüssigkeitströpfchens, welches eine unregelmäßige Oberflächenform besitzt, was den Wert der photometrischen Messung für den Zellenpartikel in dem Flüssigkeitströpfchen abträglich beeinflussen kann. Da im Gegensatz dazu die vorliegende Ausführungsform einen solchen Aufbau besitzt, daß der Laserstrahl von der Rückseite der transparenten Glasplatte her projiziert wird und ein Zellenpartikel in der an der Glasplatte haftenden Flüssigkeit gemessen wird, tritt keine diffuse Reflektion auf. Folglich ist es möglich, eine Messung durchzuführen, die im wesentlichen genauso zuverlässig ist, als würden die Partikel innerhalb einer Strömungszelle gemessen.
Fig. 12 ist ein Diagramm, welches den Aufbau einer sechsten Ausführungsform der Erfindung zeigt. Da eine Düse zur Aufnahme des Zellensuspendierfluids und zum Ausstoßen von Flüssigkeitströpfchen einen sehr kleinen Querschnitt und einen Aufbau aufweist, der durch einfache Prozesse erreicht werden kann, beispielsweise durch Ätzen und dergleichen, können mehrere Düsen in einfacher Weise in hoher Dichte parallel zueinander angeordnet werden.
In Fig. 12 ist eine Mehrzahl von Düsen in radialer Richtung um einen vorbestimmten Detektierabschnitt in der optischen Achse des Laserlichts angeordnet. Nach Fig. 12 enthält eine Düseneinheit 12 mehrere (fünf) Düsen mit dem in Fig. 1 gezeigten Aufbau in paralleler Anordnung. Die Anzahl der Düsen ist natürlich nicht auf fünf beschränkt. Die Düseneinheit kann z.B. dadurch erhalten werden, daß man mehrere feine Nuten durch Ätzen auf einem Substrat ausbildet und dann ein Flachstück an dem Substrat befestigt.
Außerdem ist eine Zuführöffnung 12 für das Zellensuspendierfluid sowie eine Öffnung 13 der Düseneinheit 11 dargestellt. Jede Düse kann auch den Aufbau nach Fig. 6 besitzen.
Da jede Düse nahezu radial um den Detektierabschnitt, auf den der Laserstrahl projiziert wird, angeordnet ist, durchlaufen die nacheinander von den jeweiligen Düsen ausgestoßenen Flüssigkeitströpfchen notwendigerweise den gleichen Detektierabschnitt. Folglich wird nur ein einziges optisches System für die Messung benötigt. Wenn eine Glasplatte an dem Detektierabschnitt angeordnet ist und die Messung erfolgt, nachdem Flüssigkeitströpfchen auf sie aufgetroffen sind, wie dies bei der fünften Ausführungsform der Fall ist, wird die Zuverlässigkeit der Messung weiter erhöht.
Innerhalb der so aufgebauten Düseneinheiten angeordnete Heizvorrichtungen werden sequentiell und zeitlich seriell von einem in Fig. 13 dargestellten Steuersystem angesteuert, und Flüssigkeitströpfchen werden sequentiell aus den Öffnungen der jeweiligen Düsen ausgestoßen. Das in Fig. 13 gezeigte Steuersystem ist mit dem Steuersystem aus Fig. 11 identisch, ausgenommen die Anzahl der Düsen. In Fig. 13 treibt die Ein-Aus-Generatorschaltung 32 zeitlich nacheinander die Heizvorrichtung jeder Düse gemäß der Abtastfrequenz, die von der Abtast-Synchronisierschaltung 31 erzeugt wird. Die Abtastfrequenz kann ein Mehrfaches der Grenzfrequenz der vorausgehenden Ausführungsformen, die eine einzige Düse besitzen, betragen. Dies deshalb, weil die Mehrzahl von Düsen zeitlich seriell angesteuert werden können und damit die Zeitspanne zum Treiben jeder Düse um ein Mehrfaches kleiner wird, als die Zeitspanne beim Treiben einer einzigen Düse. Dadurch ist es möglich, die Meßgeschwindigkeit heraufzusetzen.
Wenn die Temperatur der Meßzellen ansteigt, verringert sich die Treiberlast für jede Düse, und die Menge der Wärmeerzeugung wird deshalb reduziert, indem die Abtastfrequenz niedrig eingestellt oder die Anzahl der Düsen erhöht wird. Damit ist es möglich, abträgliche Einflüsse auf die Zellen durch einen Temperaturanstieg der Düsen zu verringern. Die Erhöhung der Wärmekapazität der Wärmeabstrahlelemente ist ebenfalls wirksam bei der Unterdrückung des Temperaturanstiegs.
Ausgangssignale von Streulicht und Fluoreszenz, die von dem Detektiersystem 33 photometrisch erfaßt werden, werden mit Gatter-Signalen von der Abtast-Synchronisierschaltung 31 erfaßt und separat in der Datenspeichereinheit für jedes von der Düse ausgestoßene Flüssigkeitströpfchen gespeichert. Das heißt: selbst wenn die Arten der den jeweiligen Düsen zugeführten Zellensuspendierfluide sich voneinander unterscheiden, werden Meßdaten so gespeichert, daß jede Art in einem einzelnen Meßvorgang unterschieden werden kann. Die selbe Art von zu untersuchenden Objekten kann natürlich parallel gemessen werden.
Da eine große Anzahl von Düsen sequentiell und zeitlich nacheinander getrieben wird, um sukzessive Partikel auszustoßen, ist es bei dieser Ausführungsform möglich, die Verarbeitungskapazität stark zu steigern.
Da außerdem die Düsen zeitlich seriell betrieben werden, läßt sich die Treiberlast für jede Zelle verringern. Dadurch ist es möglich, einen Temperaturanstieg der Düsen zu unterdrücken und die Haltbarkeit der Düsen zu erhöhen.
Da außerdem die Düsen mit sehr hoher Dichte parallel angeordnet sind, läßt sich eine kompakte Apparatur schaffen. Da ferner nur ein einziges photometrisches System ungeachtet der Anzahl von Düsen benötigt wird, hat die folgende Ausführungsform auch im Hinblick auf Kosten und Raumbedarf Vorteile:
Obschon die oben beschriebenen Ausführungsformen Anwendung bei einem sog. Strömungs-Cytometer zum Analysieren von Partikeln durch Photometrie finden, kann die vorliegende Erfindung auch bei einem Zellensortierer eingesetzt werden, indem ein Sortiermechanismus bereitgestellt wird, wie er in Fig. 15 gezeigt ist. Da in diesem Fall das Zellensuspendierfluid in Flüssigkeitströpfchen umgewandelt werden kann, ohne einen Vibrator oder druckerzeugende Einrichtungen zu verwenden, kann man eine sehr kompakte und billige Apparatur erhalten.
Außerdem kann die vorliegende Erfindung bei jeder Art von Vorrichtung eingesetzt werden, die Fluideproben behandelt, in denen zu untersuchende Partikel suspendiert sind, wie es z.B. bei einer Apparatur zum Messen von Feinstaubteilchen, einer Apparatur zum Messen von industriestaub und dergleichen der Fall ist, zusätzlich zu den Vorrichtungen zum Analysieren von Feinpartikeln auf dem Gebiet der Biologie, beispielsweise Blutzellen und dergleichen, wie es bei den oben beschriebenen Ausführungsformen der Fall ist.
Bei den oben beschriebenen Ausführungsformen sind Verfahren dargestellt, bei denen zum Austragen jedes jeweils einem zu untersuchenden Partikel enthaltenden Flüssigkeitströpfchen eine Blase erzeugt wird, durch thermische Energie, und ein Flüssigkeitströpfchen aufgrund des Stoßes ausgetragen wird, der durch die Expansion der Blase hervorgerufen wird. Allerdings kann man auch ein anderes Verfahren benutzen, bei dem ein Flüssigkeitströpfchen ausgestoßen wird aufgrund eines Stoßes, der durch eine mechanische Änderung des Volumens hervorgerufen wird, indem man einen Vibrator einsetzt, beispielsweise ein piezoelektrisches Element oder dergleichen. Auch in diesem Fall ist es möglich, eine sog. On-Demand- Ausstoßsteuerung durchzuführen, die ein Fluid nach Maßgabe eines willkürlichen Ausstoß-Zeitsteuersignals austreibt, wie es bei den oben beschriebenen Ausführungsformen der Fall ist, die von einer Blase Gebrauch machen.
Obschon die oben beschriebenen Ausführungsformen den grundlegenden Typ eines optischen Systems zum Messen von Partikeln zeigen, können zum Erzielen einer noch genaueren Messung verschiedene verbesserte Typen eingesetzt werden. Wenn z.B. das optische Strahlungssystem in Form eines optischen Abtastsystems eingesetzt wird, um eine optische Hochgeschwindigkeitsabtastung des Meßbereichs vorzunehmen, besteht die Möglichkeit, die Toleranz für die Lageabweichung der zu untersuchenden Partikel weiter heraufzusetzen. Ein akusto-optischer Deflektor (AOD), ein Drehspiegel, ein Schwingspiegel oder dergleichen lassen sich als Abtasteinrichtung verwenden. Wenn ein Feldsensor als Photosensor verwendet wird, beispielsweise ein CCD-Bauelement, ist es möglich, Bildinformationen von zu untersuchenden Partikeln aufzunehmen, was die Menge an Analyseinformation heraufsetzt.

Claims

1. Gerät zum Messen von zu untersuchenden Partikeln (S), die in einer fluiden Probe suspendiert sind, umfassend:

- eine Separiereinrichtung (1, 2, 3) zum Separieren einzelner Partikel in der fluiden Probe, und

- einen Detektor (5, 6) zum Nachweis der einzelnen Partikel, wobei die Separiereinrichtung umfaßt

- eine Düse (1) zum Empfangen und Austragen der fluiden Probe, wobei die Düse einen Einspeisdurchlaß (2) und einen Austragdurchlaß, die zur Bildung eines direkten Strömungsweges hierzwischen miteinander verbunden sind, aufweist, und

- eine Energieerzeugungseinrichtung (3) zum Zuführen von Energie zu der fluiden Probe, um aus dieser beim Verlassen des Düsenaustragsdurchlasses Tropfen, die einzelne Partikel enthalten, zu erzeugen,

dadurch gekennzeichnet, daß

- die Energieerzeugungseinrichtung eine Wärmeenergie erzeugende Quelle (3) zum Erzeugen von Blasen in der fluiden Probe umfaßt, um dieselbe in Form einzelne Partikel enthaltener Tropfen aus der Düse auszutragen.

2. Gerät nach Anspruch 1, bei dem

- die Wärmeenergieerzeugungsquelle (3) vom direkten Strömungsweg entfernt (im Blindrohr der Düse in Figuren 1 bis 5, sowie 9 und 10) angeordnet ist.

3. Gerät nach Anspruch 1, bei dem ein Wärme abstrahlendes Glied (4) außerhalb der Düse angeordnet ist.

4. Gerät nach Anspruch 1, bei dem die Wärmeenergieerzeugungsquelle einen Heizer aufweist.

5. Gerät nach Anspruch 4, bei dem der Heizer innerhalb der Düse vorgesehen ist.

6. Gerät nach Anspruch 1, bei dem mehrere Düsen vorgesehen sind.

7. Verfahren zum Betreiben des Gerätes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die zu messenden Partikel Zellen sind.