DE69212334T2 - Verfahren zur bestimmung der sod-aktivität unter verwendung einer autoxydablen zusammensetzung, diesbezüglicher testsatz, autoxydable zusammensetzungen und deren herstellungsverfahren - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der sod-aktivität unter verwendung einer autoxydablen zusammensetzung, diesbezüglicher testsatz, autoxydable zusammensetzungen und deren herstellungsverfahren

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Messung der Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität.
  • Mehr im einzelnen betrifft sie ein neues Verfahren zur Messung der SOD-Aktivität, insbesondere in biologischen Proben, mit Hilfe nachstehend definierter, autooxidierbarer Verbindungen, Testsätzte oder Kits zur Durchführung dieses Verfahrens und neue Verbindungen, die in diesem Verfahren verwendet werden können, sowie deren Herstellung.
  • Die Gewebe aerober Organismen und insbesondere jene des menschlichen Organismus sind der Ort der kontinuierlichen Produktion von Superoxidionen O&sub2;.&supmin;, die vom Zellatmungszyklus sowie von zahlreichen wesentlichen metabolischen Wegen stammen.
  • Diese Produktion von Superoxidionen nimmt stark zu, wenn diese Organismen einem "Oxidationsstreß" toxikologischen Ursprungs (Hyperoxie, Bestrahlung, insbesondere Intoxikation durch freie Radikale erzeugende Xenobiotika) oder physiopathologischen Ursprungs (Entzündungen, Ischämie, insbesondere post-ischämische Reperfusion) ausgesetzt sind.
  • Es ist wissenschaftlich allgemein anerkannt, daß Superoxidionen sehr toxisch sind, wohingegen die dieser Toxizität zugrundeliegenden Mechanismen kontroversiell bleiben (Literaturstelle 1).
  • Um sich gegen die schädlichen Wirkungen von Superoxidionen zu schützen, besitzen die aeroben Organismen Enzymsysteme, die Superoxid-Dismutasen (SOD), die den Abbau von Superoxidionen gemäß der folgenden Dismutationsreaktion katalysieren:
    • 2 O&sub2;.&supmin; + 2 H&spplus; T H&sub2;O&sub2; + O&sub2;
  • In Anbetracht der schützenden Hauptrolle dieser Dismutationsreaktion gegenüber der Toxizität von Superoxidionen konditioniert die katalytische Aktivität von intra- und extrazellulären SOD das Überleben der Gewebe eines aeroben Organismus (Literaturstellen 2 bis 5).
  • Die Messung der SOD-Aktivität ist daher von größtem Interesse sowohl für biologische Forscher als auch klinische Chemielaboratorien, vorausgesetzt, daß sie mit Hilfe eines empfindlichen, spezifischen, raschen und wenig komplexen Verfahrens durchgeführt werden kann.
  • Zahlreiche Verfahren zur Messung der SOD-Aktivität wurden veröffentlicht und kritisiert (Literaturstellen 6 bis 10), es wird jedoch allgemein eingeräumt, daß es noch immer keinen zufriedenstellenden Kompromiß zwischen der Durchführbarkeit und Komplexität bestehender Verfahren gibt, da die Messung der SOD- Aktivität zwei Hauptprobleme aufwirft, die keines der bisher veröffentlichten Verfahren auf einfache Weise lösen konnte.
  • Das erste Problem ist jenes der spontanen Zersetzung des einzigartigen Substrats, des Superoxidions, die bei einem pH von etwa 7 sehr rasch ist, und die, wenn auch stark verlangsamt, bei pH 9 signifikant bleibt, einem pH, jenseits dessen bestimmte Typen natürlicher SOD rasch inaktiviert werden. Das Erhalten einer stationären Konzentration, die ausreichend stabil ist, erfordert daher die Anwesenheit einer dynamischen Superoxidionen- Quelle in der Meßlösung.
  • Elektrolytische Quellen erfordern eine komplexe Ausrüstung und eine Vorextraktion des SOD-Katalysators, was in der klinischen Chemie verboten ist.
  • Photochemische Quellen, wie Riboflavin, führen zu Verfahren, die nicht-standardisierbar und komplex durchzuführen sind.
  • Enzymatische Quellen, wie Xanthinoxidase, erfordern unmittelbar vor der Verwendung herzustellende Lösungen. Sie sind teuer, eine Quelle von Artefakten und schwer zu automatisieren.
  • Rein chemische Quellen beschränken sich auf autooxidierbare Verbindungen, wie 6-Hydroxydopamin, Pyrogallol, Hydroxylamin oder Sulfitionen, deren Autooxidation allgemein durch die SOD inhibiert wird.
  • Diese chemischen Reagentien ergeben selten genaue und empfindliche Ergebnisse bei biologischen Rohextrakten, und sie erfordern die Herstellung einer anaeroben Lösung des Reagens unmittelbar vor der Verwendung; daher ist ihre Verwendung schwer zu automatisieren.
  • Das zweite Problem betrifft die Tatsache, daß es schwierig ist, unter Berücksichtigung der Konzentrationen und der zulässigen pH-Werte unter den Bedingungen einer Messung der SOD-Aktivität, das Verschwinden des Superoxid-O&sub2;.&supmin;-Substrats als Funktion der Zeit oder das Auftreten von seinen Dismutationsprodukten, oxygeniertem H&sub2;O&sub2; (Wasserstoffperoxid) und Sauerstoff, direkt zu messen ("Direktmessung").
  • Das einzige "direkte" spektrophotometrische Verfahren ist jenes von MARKLUND (Literaturstellen 11 und 12), das die Geschwindigkeit des Verschwindens der Superoxidionen bei pH 9,5 mißt, wodurch die Messung aller natürlichen SOD unmöglich wird.
  • Dieses Verfahren erfordert ein schnelles Spektrophotometer. Die hohen Konzentrationen an Superoxidionen und die Wellenlänge (250 nm), die verwendet werden, machen das Verfahren weniger genau, wodurch der Experimentator mehrere Messungen vornehmen muß, um einen Mittelwert zu erhalten. Außerdem ist es notwendig, Katalase zuzusetzen, um eine Inaktivierung von SOD-Cu/Zn zu vermeiden, und es muß vor jeder Messung wieder eine neue Kaliumsuperoxid-Lösung hergestellt werden.
  • Dieses direkte spektrophotometrische Verfahren ist daher heikel in der Durchführung, und es scheint nicht möglich zu sein, es signifikant zu verbessern.
  • Daraus ergibt sich, daß die populären Verfahren, d.h. die am häufigsten verwendeten, allgemein indirekt sind: sie basieren auf der Konkurrenz zwischen der SOD-Aktivität, die gemessen werden soll, und der Reaktion der Superoxidionen mit einem chromogenen Fänger, wie Eisen(III)-cytochrom c oder Tetrazoliumnitroblau (TNB), deren Reaktionsprodukt durch sichtbare UV-Spektrophotometrie gemessen werden kann. Auch ein chemoluminiszenter Fänger, wie Luminol oder Lucigenin, kann mit größerer Empfindlichkeit bei der Messung verwendet werden, die Probleme von Interferenzen und der Verfügbarkeit von Instrumenten schließen jedoch die Verwendung derartiger Verfahren durch ein nicht-spezialisiertes Labor aus.
  • Zusätzlich zur häufig unzureichenden Spezifität chromogener Reagentien gegenüber Superoxidionen ist der Hauptnachteil von Konkurrenzmessungen, daß sie eine Linearisierung der Inhibierungswerte (durch SOD) an 5 oder 6 Probenentnahmen mit zunehmenden Verdünnungen erfordern.
  • Schließlich ist eine bestimmte Anzahl von Immunmessungen von SOD-Cu/Zn oder SOD-Mn bekannt.
  • Bestimmte sind sehr empfindlich, beziehen sich jedoch nicht auf die enzymatische Aktivität der Probe, die insbesondere vom gegebenenfalls vorliegenden Inaktivierungsgrad des Enzyms abhängig ist. Außerdem dauert ihre Durchführung sehr lange, und sie sind relativ komplex.
  • Meßartefakte und die Herabsetzung der Zählfrequenz bei der Messung sind eng mit allen den meisten Laboratorien zugänglichen spektrophotometrischen Verfahren verbunden, wodurch die Anforderungen von Forschungslaboratorien nicht erfüllt werden und die Unvereinbarkeit mit den Standardisierungsvorschriften der klinischen Chemie bestehenbleibt.
  • Bei Verwendung der sichtbaren UV-Spektrophotometrie scheint es schwierig, wenn nicht unmöglich, ein Meßverfahren zu entwickeln, das gleichzeitig empfindlich, spezifischer, einfacher und leichter durchführbar ist als bestehende Verfahren, ohne auf eine kinetische Verfolgung einer durch die SOD-Aktivität aktivierten Reaktion anstelle einer durch die SOD-Aktivität inhibierten Reaktion oder ein "direktes" Verfahren zurückzugreifen.
  • In dieser Hinsicht unterscheidet sich ein neueres Verfahren (Literaturstellen 13 und 14) unter Verwendung von einem autooxidierbaren Färbemittel, Hämatoxylin, insofern von anderen, als es eine Aktivierung der Autooxidation des Reagens durch die SOD- Aktivität ausnützt.
  • Tatsächlich kommt es bei pH > 6,5 zu einer Autooxidation von Hämatoxylin (Literaturstelle 13). Die Autooxidationsgeschwindigkeit steigt um einen Faktor von etwa 100 zwischen pH 7 und 9. Die SOD inhibiert diese Autooxidation bei pH < 8,1, wohingegen sie sie bei pH 8,1 aktiviert. Diese Feststellung führte zur Entwicklung einer Messung auf der Basis einer spektrophotometrischen Verfolgung der Hämatein-Bildung bei 560 nm, die durch SOD bei alkalischem pH beschleunigt wird. Die Durchführung dieses Verfahrens ist wegen der Instabilität des Reagens heikel, und sie bleibt abhängig von einer Herstellungsphase der Probe (Dialyse) zur Eliminierung der Interferenzen aufgrund der Anwesenheit von Reduktionsverbindungen, wie beispielsweise Glutathion.
  • Außerdem beschränken die geringe Empfindlichkeit der Messung (bei pH > 8,1), die teilweise mit der Zersetzung des gemessenen Oxidationsproduktes, des Hämateins, aber auch mit der Anwesenheit von zwei potentiellen Oxidationsstellen (Catecholen) verbunden ist, das Interesse und die Verwendung dieses Verfahrens.
  • Schließlich hat das Hämatoxylin-Verfahren, auch wenn es von bestimmtem Interesse ist, einschränkende Nachteile, die seine allgemeine Verwendung zur Messung der SOD-Aktivität, insbesondere in biologischen Proben, nicht ermöglichen.
  • Die vorliegende Erfindung hat insbesondere die Ziele:
  • - ein Reagens vorzusehen, dessen Autooxidationsprodukt während der Messung stabil ist;
  • - die Meßempfindlichkeit in bezug auf ein Hämatoxylin verwendendes Verfahren (unter Bedingungen der Aktivierung der Autooxidation) zu erhöhen;
  • - die gegebenenfalls auftretenden, wahrscheinlichsten Interferenzen, wie jene, die mit der Anwesenheit von Mercaptanen, wie beispielsweise Glutathion, verbunden sind, zu eliminieren;
  • - ein Verfahren vorzusehen, bei dem ein Reaktionsmedium mit einem pH von kleiner oder gleich 9 verwendet wird, um eine Messung der Aktivität bekannter SOD ohne das Risiko einer raschen Inaktivierung zu ermöglichen.
  • Diese Ziele werden gemäß der Erfindung erreicht, bei der nachstehend definierte, chemische Reagentien verwendet werden, welche die Eigenschaft der Autooxidation in einer oxygenierten Lösung haben, um zu einem chromophoren Produkt zu führen, dessen Kinetik des Auftretens in Anwesenheit eines Katalysators vom SOD-Typ erhöht wird.
  • Die Struktur dieser Reagentien ist insbesondere durch einen aromatischen Ring mit Catechol-Funktion gekennzeichnet, welcher durch einen dazwischenliegenden tert.Benzylkohlenstoff mit einem aromatischen Ring verbunden ist, der durch eine Elektronendonator-Gruppe substituiert ist.
  • Das Autooxidationsprodukt dieser Reagentien weist eine Absorptionswellenlänge auf, die von jener, die das Reagens selbst charakterisiert, sehr verschieden ist.
  • Daher liefert die Erfindung ein Verfahren unter Verwendung dieser Reagentien, das die Messung der SOD-Aktivität jedes Katalysators in einem wässerigen Medium mit Hilfe einer einzigen Absorptionsmessung im UV/sichtbaren Bereich ermöglicht, und dessen Einfachheit der Durchführung jener vorstehend beschriebener, anderer spektrophotometrischer Verfahren eindeutig überlegen ist.
  • Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Stabilisierung einer Mutterlauge nachstehend definierter chemischer Reagentien mit Hilfe von Bor-Derivaten, insbesondere Borsäure und ihren Derivaten, wie Phenylborsäure.
  • Außerdem liefert die Erfindung ein Verfahren zur Messung der SOD-Aktivität vom oben beschriebenen Typ in Anwesenheit von Mercaptanen unter Verwendung eines raschen Reagens mit Thiol- Gruppen, das die Eliminierung entsprechender Interferenzen, insbesondere jener, die auf die Anwesenheit von Glutathion oder Albumin in der Probe zurückzuführen sind, ermöglicht.
  • Gemäß einem ihrer Aspekte hat die Erfindung ein Verfahren zur Messung der Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität in einem flüssigen Medium zum Gegenstand, bei welchem Verfahren die Aktivierung der Autooxidation eines Reagens durch die SOD-Aktivität verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist:
  • worin
  • entweder: n = 1 oder 2; R¹ = -OR&sup4; oder -NR&sup5;R&sup6;; R² = Wasserstoff, -OR&sup4;, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder auch -CH&sub2;- oder -CH&sub2;-CH&sub2;-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß mit dem Phenyl-Substituenten in meta-Stellung in bezug auf R¹; und R³ = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder -OR&sup4; (mit der Maßgabe, daß R² von -OR&sup4; verschieden ist); wobei R&sup4; = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); R&sup5; = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), -CH&sub2;COOH, -C&sub6;H&sub5;COOH oder -C&sub6;H&sub5;SO&sub3;H; und R&sup6; = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder -CH&sub2;COOH;
  • oder: n = 1; R¹ = -OR&sup4; (wobei R&sup4; wie vorstehend definiert ist); R² = -CH&sub2;-O-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß des Sauerstoffatoms mit dem Phenyl-Substituenten in meta- Stellung in bezug auf R¹; und R³ = Wasserstoff oder -OR&sup4; (wobei R&sup4; wie vorstehend definiert ist).
  • Die Verbindung der obigen allgemeinen Formel (I), worin n = 1, R¹ = -OH, R² = -CH&sub2;-O- und R³ = -OH, ist Brazilin, das ein im Handel erhältliches Produkt ist.
  • Die anderen Verbindungen der oben definierten allgemeinen Formel (I) können gemäß nachstehend allgemein beschriebenen Verfahren, allgemein aus kommerziellen Produkten, hergestellt werden.
  • Dennoch werden die Verbindungen, worin R&sup5; die Bedeutung -C&sub6;H&sub5;COOH oder -C&sub6;H&sub5;SO&sub3;H hat, aus Synthon vom Typ p-Bromphenylaminophenyl, das geeignet substituiert ist, erhalten. Synthon wird gemäß dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt.
  • p-Nitrophenol wird mit einem Chloressigsäurester alkyliert. Das erhaltene Derivat wird verseift, dann mit p-Bromanilin amidiert. Das entsprechende Amid wird einer Smiles-Reaktion (Literaturstelle 15) unterworfen, wobei das entsprechende Diphenylamin-Derivat erhalten wird. Letzteres wird reduziert, diazotiert und auf geeignete Weise substituiert, wobei das gewünschte Synthon erhalten wird.
    • Allgemeines Syntheseverfahren von Verbindungen der Serie I (n = 1 oder 2, R¹ = -OR&sup4; oder -NR&sup5;R&sup6;, R² = Wasserstoff oder Alkyl, und R³ = Wasserstoff oder Alkyl):
  • 5,6-Dihydroxyindan-1-on oder 6,7-Dihydroxy-1-tetralon (hergestellt aus Veratrol), zweckmäßig geschützt durch eine Alkyl- oder Aralkyl-Gruppe, wie beispielsweise eine Methyl- oder Benzyl-Gruppe, oder durch eine Gruppe vom Silyl-Typ, wie beispielsweise eine tert. Butyldimethylsilyl-Gruppe, wird entweder direkt oder nach vorheriger Mono- oder Bisalkylierung (der &alpha;-Stellung der Keton-Funktion) mit einem Alkylierungsmittel, wie beispielsweise Methyljodid, mit einem Organomagnesium-Reagens, das Phenylbromid entspricht, in para-Stellung substituiert durch eine oxygenierte Gruppe, wie beispielsweise eine Methoxy-Gruppe, oder eine Stickstoff-Gruppe, wie beispielsweise eine Dimethylamino-Gruppe, behandelt.
  • Die so erhaltenen Zwischenverbindungen werden reduziert, dann entschützt, wobei die Verbindungen der Serie 1 erhalten werden.
  • Das folgende Reaktionsschema veranschaulicht dieses Verfahren.
  • i: R¹PhMgBr (R¹ in para-Stellung)
  • ii: Reduktion, dann Entschützen
  • iii: Base, R²X
  • iiii: Base, R³X
  • P: Schutzgruppe
    • Allgemeines Syntheseverfahren von Verbindungen der Serie II (n = 1 oder 2, R¹ = -OR&sup4; oder -NR&sup5;R&sup6;, R² = Wasserstoff oder Alkyl, und R³ = -OR&sup4;):
  • Diese Verbindungen werden durch Hydratisierung von Alkenen, Zwischenverbindungen der Synthese von Verbindungen der Serie I, nach Hydroborierung und Oxidation erhalten; dann werden die so erhaltenen Alkohole gegebenenfalls mit einem Alkylhalogenid, wie beispielsweise Methyljodid, alkyliert und schließlich entschützt.
  • Das folgende Reaktionsschema veranschaulicht dieses Verfahren:
  • i: 1) BH&sub3;; 2) H&sub2;O&sub2;, NaOH
  • ii: Entschützen
  • iii: Base, R&sup4;X
  • P: Schutzgruppe
    • Allgemeines Syntheseverfahren von Verbindungen der Serie III (n = 1 oder 2, R¹ = -OR&sup4; oder -NR&sup5;R&sup6;, und R² = -CH&sub2;- oder -CH&sub2;CH&sub2;-, wobei durch den Zusammenschluß mit dem Phenyl-Substituenten in meta-Stellung in bezug auf R ein Ring gebildet wird):
  • Zur Synthese dieser Verbindungen wird das Produkt der Crotonisierung zwischen 3,4-Dihydroxybenzaldeyhd, geeignet geschützt, und Tetral-1-on oder Indan-1-on, zweckmäßig substituiert, entweder direkt oder indirekt (nach Herstellung des höheren Homologs mit Hilfe eines Cyclopropan-Derivats) durch katalytische Hydrierung zum entsprechenden gesättigten Derivat reduziert. Letzteres wird in Anwesenheit von Polyphosphorsäure cyclisiert, und das so erhaltene Alken wird reduziert, dann entschützt, wobei die gewünschte Verbindung der Serie III erhalten wird.
  • Das folgende Reaktionsschema veranschaulicht dieses Verfahren:
  • i: H&spplus;
  • ii: Reduktion (oder Herstellung des überlegenen Homologs, dann Reduktion)
  • iii: Polyphosphorsäure
  • iiii: Reduktion
  • iiiii: Entschützen
  • P: Schutzgruppe
    • Allgemeines Syntheseverfahren von Verbindungen der Serie IV (n = 1, R¹ = -OH, R² = -CH&sub2;-O-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß des Sauerstoffatoms mit dem Phenyl-Substituenten in meta-Stellung in bezug auf R¹, und R³ = Wasserstoff oder -OR&sup4;):
  • Diese Verbindungen konnten aus Brazilin gemäß dem folgenden Reaktionsschema synthetisiert werden: Brazilin 1/Rückfluß
  • In diesem Schema:
  • - bedeutet Bn eine Schutzgruppe von OH-Phenolen, wie eine Benzyl-Gruppe,
  • - ist R&sup4; X' ein Alkylierungsmittel.
  • Nach dem Schützen der 3-Hydroxyphenole beispielsweise in Form von Benzylether wird die tertiäre Alkohol-Gruppe z.B. in Form von Phenylthionocarbonat eliminiert oder auch mit Hilfe von beispielsweise Methyljodid alkyliert. Das gewünschte Produkt wird nach dem Entschützen durch katalytische Hydrierung, insbesondere in Anwesenheit von Palladium-auf-Kohle, gleichzeitig mit einer Reduktion im Fall von Brazilan erhalten.
  • Die Beispiele 9 und 10 des folgenden Versuchsteils veranschaulichen die Herstellung von Verbindungen dieses Typs.
    • Allgemeines Syntheseverfahren von Verbindungen der Serie V (n = 1, R¹ = -O-Alkyl, R² = -CH&sub2;-O-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß des Sauerstoffatoms mit dem Phenyl-Substituenten in meta-Stellung in bezug auf R¹, und R³ = Wasserstoff oder -OR&sup4;):
  • Brazilin oder eines seiner Derivate, worin R¹ = OH, und R³ von OH verschieden ist, wird an seinen beiden Catecholhydroxylen durch eine Methylen-Brücke geschützt, beispielsweise mit Formaldehyd. Das erhaltene Derivat wird an seinem nicht-geschützten Hydroxyl mit einem Alkylierungsmittel, wie beispielsweise einem Alkylhalogenid, alkyliert, dann in einem sauren Medium entschützt.
  • Beispiel 11 des folgenden Versuchsteils veranschaulicht die Herstellung einer Verbindung dieses Typs, worin R¹ = -O-Methyl, und R³ = -OR&sup4;, wobei R&sup4; = Wasserstoff.
  • Alle Derivate von Brazilin der Serie IV und V werden durch chemische Modifikation ihrer Hydroxyl-Gruppen erhalten. Die durchgeführten Modifikationen ermöglichen die Modulation der Empfindlichkeit der Messung der SOD-Aktivität.
  • Da die Messung der SOD-Aktivität in einem Medium durchgeführt werden muß, das eine oder mehrere Verbindungen enthält, die eine oder mehrere Thiol-Gruppen umfassen, wie insbesondere einem biologischen Medium, kann das Reduktionsvermögen dieser letzteren Interferenzen hervorrufen, die zweckmäßig zu eliminieren sind.
  • Derartige Interferenzen können leicht vermieden werden, indem dem Medium, in dem die Messung durchgeführt wird, zumindest ein Reagens zugesetzt wird, das aus Verbindungen vom Typ Pyridinium und Chinolinium ausgewählt wird, deren Verwendung als "Mercaptan-Fänger" Gegenstand des am 29. November 1991 unter dem Namen BIOXYTECH eingereichten und unter der Nr. 2 684 375 veröffentlichten FR-Patents mit dem Titel: "Réactifs piegéurs de mercaptans, leur préparation et leurs applications" (Mercaptan- Fänger-Reagentien, ihre Herstellung und ihre Verwendungen) ist.
  • Diese Reagentien erfüllen die folgenden Kriterien:
  • - Spezifität gegenüber Mercaptanen unter den verwendeten Betriebsbedingungen,
  • - rasche Reaktion,
  • - keine Interferenz mit den anderen Reagehtien, die bei der Messung der SOD-Aktivität verwendet werden.
  • Mehr im einzelnen betrifft die Erfindung gemäß einem ihrer anderen Aspekte ein Verfahren zur Messung der Superoxid- Dismutase (SOD)-Aktivität in einem flüssigen Medium, das ein oder mehrere Mercaptane enthält, insbesondere einem biologischen Medium, bei welchem Verfahren die Aktivierung der Autooxidation eines Reagens durch die SOD-Aktivität verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens eine Verbindung der oben definierten allgemeinen Formel (I) ist, und daß das Medium außerdem eine zum vollständigen Abfangen der Mercaptane durch S-Alkylierung geeignete Menge zumindest einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) enthält:
  • worin Z Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), Benzyl, p-Nitrobenzyl, Phenyl, o,p-Dinitrophenyl, -CH&sub2;COOH oder -CH2-CH&sub2;-COOH; Z&sup4; = Wasserstoff, und Z&sup5; = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), oder Z&sup4; und Z&sup5; zusammen mit den beiden dazwischenliegenden Kohlenstoffatomen einen Phenylring bilden; X = Halogenid, Sulfonat, Fluorsulfonat, Phosphonat, Tetrafluorborat oder Tosylat; und entweder Z² = Vinyl, und Z³ = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) (2-Vinyl- Verbindungen), oder Z³ = Vinyl, und Z² = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) (4-Vinyl-Verbindungen).
  • "Sulfonat" bedeutet ein Anion der allgemeinen Formel R-SO&sub3;&supmin;, worin R beispielsweise Trifluormethyl bedeutet.
  • Diese Verbindungen sind teilweise bekannt oder können analog zu Verfahren, die für die Synthese bekannter Verbindungen verwendet werden, hergestellt werden.
  • Daher können die 2-Vinyl-Verbindungen wie folgt synthetisiert werden.
  • Das Ausgangs-Derivat (substituiertes Pyridin oder Chinolin) wird dem Comins-Verfahren (Literaturstelle 16) mit Hilfe von Vinylmagnesiumbromid unterworfen. Die so erhaltene Verbindung wird beispielsweise mit Tetrachlor-1,4-benzochinon (p-Chloranil) oder Schwefel S&sub8; oxidiert. Die Alkylierung des heterocyclischen Stickstoffs wird mit Hilfe eines Alkylierungsmittels, beispielsweise Trimethyloxoniumtetrafluorborat, Methylsulfat, Benzylbromid, Fluordinitrobenzol, Natriumjodacetat oder Natrium-3- brompyruvat, ausgewählt gemäß der Bedeutung von Z¹, durchgeführt.
  • Beispiel 12 des folgenden Versuchsteils veranschaulicht die Herstellung einer Verbindung dieses Typs.
  • Ferner können die 4-Vinyl-Verbindungen wie folgt synthetisiert werden.
  • Der entsprechende heterocyclische Aldehyd (Aldehyd-Funktion, -CHO, in Stellung 4) wird einer Wittig-Reaktion, beispielsweise mit Triphenylmethylphosphoniumbromid, oder einer Peterson-Reaktion, beispielsweise mit Chlormethyltrimethylsilan, unterworfen. Die Alkylierung des heterocyclischen Stickstoffs wird mit Hilfe eines Alkylierungsmittels, beispielsweise Trimethyloxoniumtetrafluorborat, Methylsulfat, Benzylbromid, Fluordinitrobenzol, Natriumjodacetat oder Natrium-4-brompyruvat, ausgewählt gemäß der Bedeutung von Z¹, durchgeführt.
  • Beispiel 13 des folgenden Versuchsteils veranschaulicht die Herstellung einer Verbindung dieses Typs.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren, da es insbesondere zumindest einen oben definierten "Mercaptan-Fänger" verwendet, ermöglicht die Messung der SOD-Aktivität mit jedem Katalysator in einem wässerigen Medium mit Hilfe einer einzigen Absorptionsmessung im UV/sichtbaren Bereich, deren Einfachheit der Durchführung jener früher beschriebener Spektrophotometrie-Verfahren eindeutig überlegen ist.
  • Dieses neue Meßverfahren ist daher ein Werkzeug der Wahl für allgemeine biologische sowie klinische chemische Forschungen, insbesondere zur Erstellung von Meßtestsätzen oder -Kits.
  • Im letzteren Fall kann diese Messung zu medizinischen Informationen führen, die bei physiopathologischen Zuständen, wie Erkrankungen entzündlichen oder ischämischen Ursprungs, Schockzuständen, infektiösen Zuständen, systemischen Erkrankungen und Autoimmunkrankheiten, Tumoren, Fehlernährungszuständen, mit der Alterung verbundenen Krankheiten, degenerativen Affektionen, hämolytischen Anämien und Syndromen der Intoxikation durch Umweltschadstoffe oder Medikamente nützlich sind.
  • Human-Proben, an denen dieses Verfahren verwendet werden kann, sind insbesondere Erythrozyten, Blutplasma, Plättchen, weiße Blutkörperchen, die Synovialflüssigkeit, die Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, Urin oder jeder Gewebe-Extrakt.
  • Außerdem kann dieses Meßverfahren vorgenommen werden, um pharmakokinetische Untersuchungen durchzuführen, die zur Entwicklung und Verwendung neuer Medikamente mit SOD-Aktivität notwendig sind.
  • Dieses Meßverfahren kann auch zur Qualitätskontrolle kosmetischer oder pharmazeutischer Zubereitungen mit SOD-Aktivität verwendet werden.
  • Allgemein kann dieses Meßverfahren von Forschern an jeder biologischen Probe oder jeder künstlichen Lösung, die wahrscheinlich eine SOD-Aktivität aufweist, verwendet werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform basiert das Verfahren zur Messung der Superoxid-Dismutase-Aktivität einer insbesondere biologischen Probe auf einer spektrophotometrischen Messung der Autooxidationsgeschwindigkeit einer Verbindung der obigen allgemeinen Formel (I) in Abwesenheit und in Anwesenheit der Probe.
  • Mehr im einzelnen betrifft die Erfindung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Messung der Superoxid- Dismutase (SOD)-Aktivität in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen die Schritte umfaßt, die bestehen aus:
  • 1) Bestimmen der maximalen Autooxidationsgeschwindigkeit Vs einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Anwesenheit der Probe mittels der Entwicklung des Absorptionsvermögens als Funktion der Zeit bei einer Wellenlänge, die das Auftreten des Autooxidationsprodukts der verwendeten Verbindung der allgemeinen Formel (I) charakterisiert, in einem Reaktionsmedium, das auf einen pH-Wert von 8,0 bis 9,0 gepuffert wird, wobei die Reaktion durch den Zusatz einer aliquoten Menge einer Mutterlauge der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ausgelöst wird;
  • 2) Bestimmen der maximalen Autooxidationsgeschwindigkeit Vc derselben Verbindung unter denselben Bedingungen in Abwesenheit der Probe; und
  • 3) Bestimmen der SOD-Aktivität der Probe mittels der erhaltenen Geschwindigkeiten Vs und Vc und einer unter denselben Betriebsbedingungen festgelegten Eichkurve.
  • Das Reaktionsmedium besteht vorteilhaft aus einem Amin- Puffer, wie beispielsweise 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (AMPD), der 0,1 mM Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) enthält und die Fixierung des pH auf einem Wert im Bereich von 8,0 bis 9,0 bei der Meßtemperatur, beispielsweise durch den Zusatz von Soda oder Salzsäure gemäß der Beschaffenheit des betreffenden Puffers, ermöglicht.
  • Das Reaktionsmedium muß bei der Arbeitstemperatur äquilibriert und bei dieser Temperatur mit Luft gesättigt werden.
  • Die gewählte Arbeitstemperatur, beispielsweise 37ºC, muß während der Messungen konstant gehalten werden.
  • Die Reaktion wird durch den Zusatz einer aliquoten Menge einer Mutterlauge einer der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in einer wässerigen Lösung oder in einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Acetonitril, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, oder auch in einer Mischung eines derartigen organischen Lösungsmittels mit destilliertem Wasser zur Reaktionsmischung (mit oder ohne SOD) ausgelöst.
  • Um eine unmittelbar vor der Verwendung herzustellende Zubereitung dieser Mutterlauge oder eine anaerobe Zubereitung derselben zu erhalten, kann die Mutterlauge in Anwesenheit eines Bor-Derivats, wie beispielsweise Borsäure, erzeugt werden, welches das Erhalten einer Lösung des Reagens ermöglicht, die während einer von den entsprechenden Konzentration des Reagens und des Bor-Derivats, der entsprechenden Beschaffenheit des Reagens und dieses Derivats sowie den Lagerbedingungen der Mutterlauge des Reagens abhängigen Dauer stabil ist. Daher ist eine Lösung des nachstehend beschriebenen (Beispiel 7) Reagens BXT01050, die in einer Borsäure enthaltenden 50:50 (V/V) Mischung von Dimethylsulfoxid/destilliertem Wasser derart hergestellt wird, daß das Verhältnis der Konzentrationen von Borsäure und Reagens 150 beträgt, zumindest ein Monat lang stabil, wenn die Lösung zwischen 0 und 8ºC aufbewahrt wird.
  • Nach der Homogenisierung der Lösung wird die Entwicklung des Absorptionsvermögens als Funktion der Zeit bei der das Auftreten des Autooxidationsprodukts charakterisierenden Wellenlänge des Reagens aufgezeichnet (beispielsweise 525 nm für das Reagens BXT01050 und 539 nm für Brazilin), um die maximale Autooxidationsgeschwindigkeit zu bestimmen.
  • Die Bestimmung der SOD-Aktivität in einer biologischen Probe kann durchgeführt werden, indem das Vehältnis oder die Differenz der in Anwesenheit (Vs) und in Abwesenheit (Vc) der Probe gemessenen Geschwindigkeiten bestimmt werden.
  • Dieses Verhältnis oder diese Differenz kann beispielsweise auf der Ordinate einer Eichkurve aufgetragen werden, die unter denselben Betriebsbedingungen beispielsweise gemäß einem SOD- Standard festgelegt wurde.
  • Diese Eichkurve kann gezeichnet werden, indem sie als Funktion der Konzentration des verwendeten Standards die Variation des Verhältnisses oder der Differenz der in Anwesenheit (Vs) und in Abwesenheit (Vc) dieses Standards gemessenen Geschwindigkeiten darstellt.
  • Das Verhältnis Vs/Vc variiert mit der SOD-Konzentration gemäß einer Hyperbelfunktion vom Typ y = 1+x/(ax+b), worin x die SOD-Konzentration bedeutet, und a und b Konstanten sind. Der Kehrwert der Differenz der Geschwindigkeiten als Funktion des Kehrwerts der SOD-Konzentration ist eine der möglichen Linearisierungen.
  • Gemäß der Intensität der zu messenden SOD-Aktivität kann die Meßempfindlichkeit im verwendeten pH-Bereich (8,0 bis 9,0) eingestellt werden, indem beispielsweise einer oder mehrere der folgenden Parameter modifiziert werden: Konzentration der ausgewählten Verbindung der allgemeinen Formel (I), Konzentration des Puffers und Meßtemperatur
  • Die Autooxidationsgeschwindigkeit des verwendeten Reagens kann auch variiert werden, indem die Konzentration eines Bor- Derivats im Reaktionsmedium variiert wird.
  • Das Vorliegen von Verbindungen, die mit der Messung interferieren, in einer insbesondere biologischen Probe manifestiert sich am häufigsten durch eine Verringerung der in Anwesenheit der Probe gemessen Geschwindigkeit in bezug auf die in ihrer Abwesenheit gemessene.
  • Im Fall von Interferenzen, die mit der Anwesenheit von Mercaptanen verbunden sind, wie beispielsweise Glutathion, ist daher die Einführung eines "Mercaptan-Fänger-Reagens", wie oben definiert, in das Reaktionsmedium erforderlich.
  • Daher wird beispielsweise 1,4,6-Trimethyl-2-vinylpyridiniumtetrafluorborat (Verbindung von Beispiel 12) bei einer Konzentration, die fünfmal höher ist als jene von Glutation, zur Messung der SOD-Aktivität in einem Erythrozyten-Lysat eingeschlossen.
  • Wenn das Vorliegen einer Verbindung, die eine Artefakt- Aktivierung der Autooxidation der Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder chromogenen Verbindung bewirken kann, in einer insbesondere biologischen Probe vermutet wird, kann eine wie nachstehend beschriebene Kombination, die eine unter Inhibierungsbedingungen der Autooxidation durchgeführte, zweite Messung involviert, vorgenommen werden.
  • Im Fall einer Untersuchung insbesondere biologischer Medien mit schwacher SOD-Aktivität können ebenso die Meßempfindlichkeit und -präzision erhöht werden, indem die unter den Bedingungen der Aktivierung der Autooxidation durchgeführte Messung mit einer unter Inhibierungsbedingungen der Autooxidation vorgenommenen Messung kombiniert wird.
  • Daher betrifft die Erfindung auch ein Verfahren vom oben beschriebenen Typ, dadurch gekennzeichnet, daß es auch eine unter Inhibierungsbedingungen der Autooxidation vorgenommene Messung umfaßt.
  • Das für diese zweite Messung verwendete Reaktionsmedium unterscheidet sich vom vorstehend beschriebenen Medium durch die Verwendung eines Puffers bei einem pH im Bereich von 7,2 bis 7,8, insbesondere eines Phosphat-Puffers, der beispielsweise aus einer adäquaten Mischung von Kaliumdihydrogenphosphat und Dikaliumhydrogenphosphat besteht, wobei alle anderen Bedingungen gleich sind.
  • Unter diesen Betriebsbedingungen wird die maximale Autooxidationsgeschwindigkeit der verwendeten Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Abwesenheit (V'c) und in Anwesenheit (V's) der Probe gemessen. Die Bestimmung der SOD-Aktivität in der Probe wird dann durch (Vs - Vc - V's + V'c) erhalten.
  • Wie vorstehend kann der erhaltene Wert auf die Ordinate einer Eichkurve aufgetragen werden, welche unter denselben Versuchsbedingungen festgelegt wurde, und welche die Variation von (Vs - Vc - V's + V'c) als Funktion der Konzentration des verwendeten Standards angibt.
  • Das neue erfindungsgemäße Meßverfahren, bei dem als Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) verwendet wird, ist aufgrund seines Prinzips ein spezifisches Meßverfahren der SOD- Aktivität. Es ist empfindlich, schnell und einfach durchzuführen, und außerdem kann es gänzlich automatisiert werden; daher ist es zur Behandlung großer Probenserien geeignet, wie dies in der klinischen Chemie der Fall sein kann.
  • Ferner werden die Interferenzen, die mit der Anwesenheit von Mercaptanen verbunden sind und häufig bei biologischen Proben angetroffen werden, durch die Verwendung zumindest eines "Mercaptan-Fänger-Reagens", wie oben definiert, ohne andere ergänzende Behandlungsphase der Probe leicht eliminiert.
  • Schließlich verleihen die stark modulierbaren Betriebsbedingungen diesem Meßverfahren einen Verwendungsspielraum, der eine Anpassung an insbesondere biologische, äußerst unterschiedliche Proben und daher eine Berücksichtigung der bestimmten gegebenenfalls vorliegenden Anforderungen bestimmter Anwender, wie dies in der Forschung der Fall ist, ermöglicht.
  • Zur Erläuterung werden im folgenden Versuchsteil Anwendungsbeispiele des neuen Verfahrens zur Messung der SOD-Aktivität mit Hilfe von sieben Verbindungen der allgemeinen Formel (I) im Fall eines Erythrozyten-Lysats angegeben.
  • Die Erfindung betrifft auch einen Testsatz oder Kit für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung der SOD-Aktivität.
  • Dieser Testsatz oder Kit umfaßt im wesentlichen als Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie oben definiert.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt der Testsatz oder Kit für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung der SOD-Aktivität außerdem eine oder mehrere Mercaptan-Fänger-Verbindungen der allgemeinen Formel (II), wie oben definiert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung auch einen Testsatz oder Kit für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung der SOD-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen umfaßt:
  • - eine Verbindung der allgemeinen Formel (1) in sauer Lösung oder als Pulver,
  • - eine oder mehrere Mercaptan-Fänger-Verbindungen der allgemeinen Formel (II) in Lösung oder als Pulver, und
  • - einen Puffer auf der Basis von AMPD, der in einem pH-Bereich von 8,0 bis 9,0 puffert.
  • Ferner betrifft die Erfindung Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wie vorstehend definiert, mit der Maßgabe, daß, wenn n = 1, und R² = -CH&sub2;-O-, R¹ und R³ nicht gleichzeitig -OR&sup4; sein können, wobei R&sup4; = Wasserstoff.
  • Die beigeschlossenen Figuren zeigen Eichkurven zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von sechs verschiedenen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß der in den Beispielen 14 bis 19 bzw. 21 des folgenden Versuchsteils beschriebenen Betriebsweise.
  • Die Eichkurven wurden gemäß zwei verschiedenen Methoden erhalten, die hier als Beispiele angegeben sind, nämlich:
    • Erste Methode:
  • - Auftragen des Kehrwerts der "SOD-Konzentration", ausgedrückt in ml/E (E = Einheit der SOD-Aktivität), auf der Abszisse, und
  • - Auftragen des Kehrwerts von Vs-Vc, wobei Vs und Vc wie vorstehend definiert sind, ausgedrückt in min/&Delta;Abs. (&Delta;abs. = Variation des Absorptionsvermögens), auf der Ordinate.
    • Zweite Methode:
  • - Auftragen der "SOD-Konzentration", ausgedrückt in E/ml (E = Einheit der SOD-Aktivität), auf der Abszisse, und
  • - Auftragen des Verhältnisses Vs/Vc, wobei Vs und Vc wie vorstehend definiert sind, auf der Ordinate.
  • Mehr im einzelnen:
  • - zeigt Fig.1 die Eichkurve der Verbindung BXT01041, die gemäß der ersten Methode erhalten wurde;
  • - zeigt Fig.2 die Eichkurve der Verbindung BXT01048, die gemäß der ersten Methode erhalten wurde;
  • - zeigt Fig.3 die Eichkurve der Verbindung BXT01049, die gemäß der ersten Methode erhalten wurde;
  • - zeigt Fig.4 die Eichkurve der Verbindung BXT01050, die gemäß der ersten Methode erhalten wurde;
  • - zeigt Fig.5 die Eichkurve von Brazilin, die gemäß der ersten Methode erhalten wurde;
  • - zeigt Fig.6 die Eichkurve von Brazilan, die gemäß der ersten Methode erhalten wurde; und
  • - zeigt Fig.7 die Eichkurve der Verbindung BXT01050, die gemäß der zweiten Methode erhalten wurde.
    • VERSUCHSTEIL I. Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
  • Alle Reaktionen werden unter einer inerten Stickstoffatmosphäre durchgeführt, wenn nichts anderen angegeben ist.
  • Die Massenspektren (MS) werden auf einer R10-10B-Vorrichtung von Nermag aufgezeichnet. Das verwendete Ionisationsverfahren ist entweder Elektronenstoß (EI) bei 70 eV oder chemische Ionisation (CI), wenn nichts anderes angegeben ist.
  • Die ¹H-NMR-Spektren werden auf einer Vorrichtung vom Typ Gemini-200 von VARIAN aufgezeichnet. Die chemischen Verdrängungen sind in ppm in bezug auf Tetramethylsilan ausgedrückt. Die Multiplizitäten werden wie folgt ausgedrückt: "s" für Singulett; "d" für Dublett; "t" für Triplett; und "m" für Multiplett.
  • Die Schmelzpunkte (Fp.) werden mit einer Vorrichtung von Gallenkamp aufgezeichnet und sind unkorrigiert angegeben. Die Umkristallisationslösungsmittel sind in Klammern angeführt.
    • A. Verbindungen der Serie I Beispiel 1: Herstellung von 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)- indan (BXT01041) 5,6-Dimethoxy-3-(4-methoxyphenyl)-inden
  • Einer Suspension von 0,24 g (10 mmol) Magnesium in 5 ml wasserfreiem THF wird eine kleine Portion 4-Bromanisol zugesetzt. Die Mischung wird leicht erwärmt, um die Reaktion zu initiieren, dann werden 1,87 g (10 mmol), der Rest, des Brom-Derivats in Lösung in 5 ml THF während 15 min tropfenweise zugesetzt. Nach 1 h am Rückfluß ist das Magnesium verschwunden. Die so erhaltene Mischung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt und eine Lösung von 1,92 g (10 mmol) 5,6-Dimethoxyindan-1-on in 10 ml wasserfreiem THF zugesetzt. Die erhaltene braune Lösung wird 20 h lang unter diesen Bedingungen gerührt, dann durch den Zusatz einer gesättigten NH&sub4;Cl-Lösung hydrolysiert. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels werden 3,43 g eines gelben Öls erhalten, das in 5 ml Eisessig aufgenommen wird. Die Lösung wird 15 min lang bei Umgebungstemperatur gerührt, dann 15 min lang auf 70ºC erhitzt. Die auf 0ºC abgekühlte Lösung wird langsam in 50 ml einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung gegossen. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingedampft. 2,84 g des so erhaltenen Rohprodukts werden durch Chromatographie gereinigt, wobei mit einer 1:3 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird, um 1,97 g (70 %) eines weißen Feststoffs zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 111,0-112,0ºC (EtOAc/Hexan 1:3).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 3,62 (d, J=2,16 Hz, 2H); 4,05 (s, 3H); 4,08 (s, 3H); 4,12 (s, 3H); 6,58 (t, J=2,16 Hz, 1H); 7,19 (d, J=8, 67 Hz, 2H); 7,29 (s, 1H); 7,32 (s, 1H) ; 7,72 (d, J=8,67 Hz, 2H).
  • MS (EI): 282 (100), 267 (55), 251 (19), 181 (24), 165 (35), 152 (51), 84 (53).
    • 5,6-Dimethoxy-1-(4-methoxyphenyl)-indan
  • Eine Lösung von 1,5 g (5,32 mol) 5,6-Dimethoxy-3-(4- methoxyphenyl)-inden in 60 ml Ethanol wird in einem Autoklaven in Anwesenheit von 25 mg 10 % Palladium-auf-Kohle unter 5 bar Wasserstoff 1,5 h lang hydriert. Nach der Filtration des Katalysators werden durch das Abdampfen des Lösungsmittels 1,5 g (100 %) eines Öls erhalten, das sich progressiv verfestigt.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,99 (m, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,90 (m, 2H); 3,72 (s, 3H); 3,79 (s, 3H) ; 3,87 (s, 3M) ; 4,24 (t, J=7,97 Hz, 1H); 6,48 (s, 1H); 6,82 (s, 1H); 6,84 (d, J=8,70 Hz, 2H); 7,50 (d, J=8,70 Hz, 2H).
  • MS (EI): 284 (100), 269 (26), 253 (59), 241 (17), 177 (21), 165 (35), 152 (28), 115 (26), 84 (25), 77 (26).
    • 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)-indan
  • Einer Lösung von 500 mg (0,86 mol) des oben erhaltenen Phenylindans in 2 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gekühlt auf -70ºC, wird eine Lösung von BBr&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2; (1,0 M, 3,1 ml, 3,1 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene rote Lösung wird wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 0,5 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von Eiswasser und EtOAc gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt, dann 2 x mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 480 mg eines gelben Öls erhalten werden, das chromatographiert wird (Eluierungsmittel: 1:1 EtOAc-Hexan), um 400 mg (93 %) der erwarteten Verbindung als weißen Feststoff zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 1,90 (m, 1H); 2,41 (m, 1H); 2,79 (m, 2H); 4,08 (t, J=7,97 Hz, 1H); 6,39 (s, 1H); 6,75 (s, 1H); 6,77 (d, J=8, 70 Hz, 2H) ; 6, 98 (d, J=8, 70 Hz, 2H) ; 7,77 (s, breit, 3H).
  • MS (EI): 242 (100), 225 (61).
    • Beispiel 2: Herstellung von 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)- 2,2-dimethylindan (BXT01045) 5,6-Dimethoxy-2-methylindan-1-on und 5,6-Dimethoxy-2-dimethylindan-1-on
  • Eine Mischung von Lithiumdiisopropylamid (LDA, 1,5 M in Cyclohexan, 7,5 ml, 11,3 mol) und 15 ml wasserfreiem THF wird auf -78ºC gekühlt. Dieser wird eine Lösung von 1,92 g (10 mol) 5,6-Dimethoxyindan-1-on in 5 ml THF tropfenweise zugesetzt. Die Mischung wird 30 min lang bei -78ºC gerührt. 0,93 ml (15 mol) Methyljodid werden zugesetzt. Nach 30 min bei -78ºC wird die Lösung wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 4 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Lösung wird erneut auf -78º C gekühlt und dieselbe LDA-Menge wie vorher tropfenweise zugesetzt. Nach 30 min werden 0,93 ml (15 mol) MeI zugesetzt. Sie wird 30 min lang bei -78ºC, dann 4 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird durch den Zusatz einer gesättigten wässerigen NH&sub4;Cl-Lösung hydrolysiert. Sie wird mit EtOAc extrahiert. Die organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockenen eingedampft, wobei 2,23 g eines gelben Feststoffs erhalten werden. Durch Chromatographie unter Verwendung einer 1:9 EtOAc/Hexan-Mischung als Eluierungsmittel werden 1,35 g (61 %) 5,6-Dimethoxy-2,2-dimethylindan-1-on und 0,43 g (21 %) 5,6-Dimethoxy-2-methylindan-1-on erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften von 5,6-Dimethoxy-2,2-dimethylindan-1-on:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,64 (s, 6H); 2,85 (s, 2H) ; 3,85 (s, 3H); 3,91 (s, 3H) ; 6,80 (s, 1H) ; 7,12 (s, 1H).
  • Fp. 134,0-134,5ºC (EtOH).
  • Physikalische Eigenschaften von 5,6-Dimethoxy-2-methylindan-1-on:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,22 (d, J=7,41 Hz, 3H); 2,63 (m,2H); 3,23 (dd, 3J=9,24-16,85 Hz, 1H); 3,84 (s, 3H); 3,90 (s, 3H); 6,81 (s, 1H); 7,11 (s, 1H).
  • Fp. 106,0-106,5ºC (EtOH).
    • 1-Hydroxy-5,6-dimethoxy-1-(4-methoxydhenyl-2,2-dimethylindan
  • Einer Suspension von 72 mg (3 mol) Magnesium in 6 ml wasserfreiem THF wird eine kleine Portion 4-Bromanisol zugesetzt. Die Mischung wird aufleichten Rückfluß erwärmt, um die Reaktion zu initiieren, dann werden 0,56 g (3 mol), der Rest, des Brom- Derivats in Lösung in 5 ml THF während 15 min tropfenweise zugesetzt. Nach 1 h am Rückfluß ist das Magnesium verbraucht. 0,66 g (3 mol) 5,6-Dimethoxy-2,2-dimethylindan-1-on werden in kleinen Portionen zugesetzt. Die Lösung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt, dann 4 h lang auf Rückfluß erhitzt. 10 ml einer gesättigten wässerigen NH&sub4;Cl-Lösung werden bei 0ºC zugesetzt. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft, wobei 1,20 g eines gelben Öls erhalten werden. Reinigung durch Chromatographie (Eluierungsmittel: 1:5 EtOAc/Hexan) ermöglicht die Isolierung von 0,65 g (66 %) des erwarteten Produkts.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : 0,62 (s, 3H); 1,13 (s, 3H); 2,60 (d, J=15,10 Hz, 1H); 2,86 (d, J=15, 10 Hz, 1H) ; 3,77 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 3,91 (s, 1H); 6,71 (s, 1H); 6,79 (s, 1H) ; 6,83 (d, J=9,00 Hz, 2H) ; 7,19 (d, 3=9,00 Hz, 2H).
    • 5,6-Dimethyl-(4-methoxydhenyl)-2,2-dimethylindan
  • 1,40 g (36,7 mmol) Natriumborhydrid und 0,82 g (6,1 mmol) Aluminiumtrichlorid werden einer Lösung von 0,39 g (1,25 mmol) des oben hergestellten Produkts in 15 ml wasserfreiem THF zugesetzt. Die Mischung wird auf Rückfluß erhitzt. Sie färbt sich sofort rosa, dann rot und wird schließlich farblos. Nach 20 h am Rückfluß wird die Reaktionsmischung in eine Mischung von 20 g Eis und 5 ml 1N HCl gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei ein farbloses Öl erhalten wird. Eine Chromatographie, wobei mit einer 1:10 EtOAc-Hexan-Mischung eluiert wird, ergibt 0,39 g (66 %) des erwarteten Produkts.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 0,63 (s, 3H); 1,19 (s, 3H); 2,72 (s, 2H); 3,74 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,87 (s, 3H); 3,91 (s, 1H) ; 6,56 (s, 1H); 6,78 (s, 1H); 6,83 (d, J=8,86 Hz, 2H); 6, 98 (d, J=8,86 Hz, 2H).
    • 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxydhenyl)-2,2-dimethylindan
  • Einer Lösung von 0,39 g (1,25 mol) des oben erhaltenen Derivats in 2 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gekühlt auf -70ºC, wird eine Lösung von BBr&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2; (1,0 M, 4,86 ml, 4,86 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene rote Lösung wird wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 1 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von Eiswasser und EtOAc gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt, dann 2 x mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 410 mg eines leicht roten Öls erhalten werden, das chromatographiert wird (Eluierungsmittel: 1:1 EtOAc-Hexan), um 0,29 g (86 %) der erwarteten Verbindung zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6) : 0,71 (s, 3H); 1,17 (s, 3H); 2,60 (s, 2H); 3,80 (s, 1H); 6,46 (s, 1H); 6,12 (s, 1H); 6,75 (d, J=8,74 Hz, 2H); 6,89 (d, J=8,74 Hz, 2H).
  • MS (EI): 270 (87), 227 (100), 107 (16).
    • Beispiel 3: Herstellung von 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)-2- methylindan (BXT01048) 5,6-Dimethvl-3-(4-methoxyphenyl)-2-methylinden
  • Einer Suspension von 42 mg (1,750 mmol) Magnesium in 5 ml wasserfreiem THF wird eine kleine Portion 4-Bromanisol zugesetzt. Die Mischung wird aufleichten Rückfluß erwärmt, um die Reaktion zu initiieren, dann werden 330 mg (1,75 mol), der Rest, des Brom-Derivats in Lösung in 5 ml THF während 15 min tropfenweise zugesetzt. Nach 1 h am Rückfluß ist das Magnesium verbraucht. Die so erhaltene Mischung wird auf Umgebungstemperatur abgekühlt, dann eine Lösung von 300 mg (1,46 mol) 5,6-Di- methoxy-2-methylindan-1-on in 5 ml THF zugesetzt. Die erhaltene braune Lösung wird 18 h lang gerührt, dann durch den Zusatz einer gesättigten wässerigen NH&sub4;Cl-Lösung hydrolysiert. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels werden 0,54 g eines gelben Öls erhalten, das in 2 ml Eisessig aufgenommen wird. Die erhaltene Lösung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die auf 0ºC gekühlte Lösung wird langsam in 50 ml einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung gegossen. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wird mit einer gesättigten wässerigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. 530 mg des so erhaltenen Rohprodukts werden durch Chromatographie gereinigt, wobei mit einer 1:9 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird, um 0,25 g (58 %) eines farblosen Öls zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,09 (s, 3H); 3,35 (s, 2H); 3,82 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 6,78 (s, 1H); 7,00 (d, J=8,70 Hz, 2H); 7,04 (s, 1H); 7,33 (d, J=8,70 Hz, 2H).
    • 5,6-Dimethoxy-1-(4-methoxyphenyl-2-methylindan
  • Eine Lösung von 240 mg (0,81 mmol) des obigen Phenylindens in 5 ml EtOAc wird unter etwa 10&sup6; Pa (10 atm) Wasserstoff in Anwesenheit von 20 mg 10 % Palladium-auf-Kohle 2 h lang hydriert. Der Katalysator wird abfutriert, dann das Filtrat zur Trockene eingedampft, wobei 0,24 g (99 %) des erwarteten Produkts erhalten werden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 0,69 (d, J=6,96 Hz, 3H); 2,58 (dd, J=6,96- 14,30 Hz, 1H); 2,80 (m, 1H); 2,96 (dd, J=7,04-14,30 Hz, 1H); 3,75 (s, 3H); 3,77 (s, 3H); 3,88 (s, 3H); 4,25 (d, J=7,68 Hz, 1H); 6, 63 (s, 1H); 6,80 (d, J=8,78 Hz, 2H); 6,81 (s, 1H); 6,88 (d, J=8,78 Hz, 2H).
  • SM (EI): 298 (100), 283 (25), 267 (44), 252 (7); 238 (12), 167 (42), 149 (42), 135 (33); 84 (62).
    • 5,6-Dihydroxy-(4-hydroxyphenyl)-2-methylindan
  • Einer Lösung von 0,23 g (0,77 mol) des oben erhaltenen Phenylindans in 2 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gekühlt auf -70ºC, wird eine Lösung von BBr&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2; (1,0 M, 3,0 ml, 3,0 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene rote Lösung wird wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 0,5 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von Eiswasser und EtOAc gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt, dann 2 x mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,20 g eines gelben Öls erhalten werden, das chromatographiert wird (Eluierungsmittel: 1:1 EtOAc-Hexan), um 0,18 g (91 %) der erwarteten Verbindung zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 0,63 (d, J=6,96 Hz, 3H); 2,45 (dd, J=7,32-14,22 Hz, 1H); 2,68 (m, 1H); 2,84 (dd, J=7,04-14,22 Hz, 1H); 4,13 (d, J=7,42 Hz, 1H); 6,50 (s, 1H); 6,73 (m, 5H); 7,53 (s, 1H); 7,55 (s, 1H); 8,06 (s, 1H).
  • MS (EI): 256 (100), 241 (23), 239 (46), 227 (27).
    • Beispiel 4: Herstellung von 1-(4-Dimethylaminophenyl)-5,6-dihydroxyindan (BXT01049) 5,6-Dihydroxyindan-1-on
  • 3,13 g (16,3 mol) 5,6-Dimethylindan-1-on werden in 10 ml Dichlormethan, getrocknet auf einem 3A-Sieb, gelöst. Dieser hellgelben Lösung wird bei -70ºC eine Lösung von Bortribromid in Dichlormethan (1 M, 28 ml, 28 mmol) tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsmedium ändert die Farbe auf bordeaux. Die Temperatur des Mediums wird wieder auf Umgebungstemperatur geführt, dann die Lösung 2 h 30 min lang gerührt. Das Reaktionsmedium wird in 50 g Eis gegossen, dann mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft.
  • 2,3 g (87 %) des Rohprodukts werden als solches für den nachfolgenden Schritt verwendet.
    • 5,6-Di-(tert.butyldimethylsilyloxy)-indan-1-on
  • Einer Lösung von 2 g (12,2 mol) des vorstehend beschriebenen 5,6-Dihydroxyindan-1-ons in 40 ml DMF, getrocknet auf einem 3A-Sieb, gekühlt auf 0ºC, werden 7,35 g (49,8 mol) tert.Butyldimethylsilylchlorid und 3,82 g (56,1 mol) Imidazol zugesetzt. Die Temperatur wird 10 min lang bei 0ºC, dann 16 h lang bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Produkt wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie mit 8:2 Hexan/Ethylacetat als Eluierungsmittel gereinigt und in Form von 415 g (94 %) eines beigen Feststoffs erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 0,195 (s, 6H); 0,205 (s, 6H); 0,92 (s, 18H); 2,60 (t, J=7,63 Hz, 2H); 2,95 (t, J=7,63 Hz, 2H); 6,85 (s, 1H) ; 7,15 (s, 1H).
    • 5,6-Di-(tert.butyldimethylsilyloxy)-3-(4-dimethylaminophenyl)- inden
  • 124 mg (5,1 mmol) Magnesium werden mit 1 ml THF bedeckt, destilliert und unter Rühren auf 60ºC erhitzt. Eine Lösung von 1,02 g (5,1 mol) 4-Brom-N,N-dimethylanilin in 5 ml destilliertem THF wird 20 min lang tropfenweise zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 1 h lang auf Rückfluß von THF erhitzt. Dieser gelbgrünen Lösung wird eine Lösung von 2 g (5,1 mol) 5,6-Di- (tert.butyldimethylsilyloxy)-indan-1-on in 10 ml destilliertem THF tropfenweise während 5 min bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Das Medium wird 20 h lang auf Rückfluß gebracht. Die Reaktionsmischung mit violetter Färbung wird durch eine gesättigte wässerige Ammoniumchlorid-Lösung hydrolysiert, dann mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie mit 9:1 Hexan/Ethylacetat als Eluierungsmittel gereinigt und in Form von 0,9 g (36 %) eines Öls erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 0,16 (s, 12H); 0,95 (s, 18H) ; 2,94 (s, 6H); 3,50 (d, J=2,03 Hz, 2H); 6,30 (t, J=2,03 Hz, 1H); 6,75 (m, 2H); 6,95 (s, 1H); 7,08 (s, 1H); 7,45 (d, J=7,85 Hz, 2H).
    • 5,6-Di-(tert.butyldimethylsilyloxy)-1-(4-dimethylaminophenyl)- indan
  • Eine Lösung von 0,9 g (1,82 mol) der obigen Verbindung in 10 ml Methanol und 2 ml Aceton wird in Anwesenheit von 60 mg 10 % Palladium-auf-Kohle bei Umgebungstemperatur unter einem Wasserstoff-Druck von etwa 5 × 10&sup5; Pa (5 bar) 3 h lang gerührt. Die Suspension wird filtriert, dann das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie mit 9:1 Hexan/Ethylacetat als Eluierungsmittel gereinigt und in Form von 0,64 g (71 %) eines hellbeigen Feststoffs erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 0,08 (s, 6H); 0,18 (s, 6H); 0,90 (s, 9H); 0,95 (s, 9H); 1,90 (m, 2H); 2,45 (m, 2H); 2,90 (s, 6H); 4,17 (t, J=8,07 Hz, 1H); 6,4 (s, 1H); 6,7 cm, 2H) ; 7,05 (m, 2H); 7,20 (s, 1H).
    • 5,6-Dihydroxy-1-(4-dimethylaminophenyl)-indan
  • 0,56 g (1,12 mol) des oben erhaltenen Produkts werden in 5 ml destilliertem THF gelöst, dann wird eine molare Lösung von 2,26 ml (2,26 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid in THF unter Rühren und bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Das Rühren wird 1 h lang bei dieser Temperatur fortgesetzt. Nach dem Zusatz von Wasser wird das Produkt mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Das gewünschte Produkt wird durch eine zweifache Chromatographie gereinigt:
  • 1. Reinigung: Eluierungsmittel: 6:4 Hexan-Ethylacetat
  • 2. Reinigung: Eluierungsmittel: 95:5 Dichlormethan-Methanol
  • Das gewünschte Produkt wird in Form von 190 mg (62 %) eines malvenfarbenen Öls erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,96 cm, 2H); 2,44 (m, 2H); 2,89 (s, 6H); 4,1 (t, J=7,2 Hz, 1H); 6,4 (s, 1H); 6,73 (d, J=6,7 Hz, 2H); 6,77 (s, 1H) ; 7,05 (d, J=6,7 Hz, 2H).
  • MS (EI): 269 (100), 254 (10), 240 (9), 225 (28), 77 (10).
  • HPLC (Hochleistungs-Flüssigchromatographie): (Umkehrphasen-RP18- Säule; Länge: 15 cm; Eluierungsmittel: 94:6 Dichlormethan- Methanol; Durchsatz: 1 mllmin, Beobachtungswellenlänge: 254 nm); Retentionszeit: 2,37 min; Reinheit 99,1 %.
    • B. Verbindungen der Serie II Beispiel 5: Herstellung von 2,5,6-Trihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)-indan (BXT01035) 2-Hydroxy-5,6-dimethoxy-1-(4-methoxyphenyl-1-indan
  • Einer Lösung von 1,0 g (3,55 mol) 5,6-Dimethoxy-3-(4- methoxyphenyl)-inden in 10 ml wasserfreiem THF wurde bei 0ºC eine 1 M Lösung von 4,26 ml (4,26 mmol) BH&sub3;.THF während 15 min zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird 1 h lang bei der gleichen, dann 4 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird auf 0ºC gekühlt, und 3,5 ml Wasser werden tropfenweise, dann 7 ml 10 % NaOH zugesetzt. Anschließend werden 7 ml einer 30 % gesättigten wässerigen H&sub2;O&sub2;-Lösung zugesetzt, und die Mischung wird 2 h lang gerührt. Die Mischung wird mit 50 ml EtOAc extrahiert. Die organische Phase wird mit 10 ml Wasser gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Durch das Abdampfen des Lösungsmittels werden 1,16 g eines weißen Feststoffs erhalten, der durch Chromatographie gereinigt wird, wobei mit einer 1:3 EtOAc/ Hexan-Mischung eluiert wird, um 0,97 g (91 %) des erwarteten Produkts als weißen Feststoff zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 128,0-129,0ºC (AcEOt/Hexan = 1:4).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,96 (d, J=4,68 Hz, 1H, austauschbar mit D&sub2;O); 2,84 (dd, J=6,79-15,39 Hz, 1H); 3,21 (dd, J=6,92-15,39 Hz, 1H); 3,73 (s, 3H); 3,79 (s, 3H); 3,87 (s, 3H); 4,05 (d, J=6,23 Hz, 1H); 4,39 (m, 1H); 6,46 (s, 1H); 6,81 (s, 1H); 6,87 (d, J=8,64 Hz, 2H); 7,07 (d, J=8,64 Hz, 2H).
  • MS (EI): 300 (100), 282 (18), 257 (27), 239 (5), 165 (7), 121 (15).
    • 2,5,6-Trihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)-indan
  • 2,67 g (10,0 mmol) Aluminiumtribromid werden mit 24 ml Ethanthiol gemischt. 300 mg (1,0 mmol) des obigen Phenylindans werden auf einmal zugesetzt. Nach 62 h bei Umgebungstemperatur ist das Ethanthiol verdampft, dann wird der Rückstand mit 15 ml Wasser bei 0ºC behandelt. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über NA&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 250 mg eines gelben Öls erhalten werden. Eine Reinigung durch Chromatographie, wobei eine 1:1 EtOAc/Hexan-Mischung als Eluierungsmittel verwendet wird, ergibt 140 mg (54 %) des erwarteten Produkts als weißen Feststoff.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 2,68 (dd, J=6,31-15,02 Hz, 1H); 3,06 (dd, J=6,59-15,30 Hz, 1H); 3,90 (d, J=6,53 Hz, 1H); 4,20 (d, J=5,28 Hz, 1H); 4,29 (m, 1H); 6,30 (s, 1H); 6,68 (s, 1H); 6,76 (d, J=8,47 Hz, 2H); 6,96 (d, J=8,47 Hz, 2H); 7,57 (2, 1H); 7,63 (s, 1H); 8,18 (s, 1H).
  • MS (EI): 258 (100), 240 (40), 229 (13), 215 (39), 183 (27), 165 (32), 107 (46), 77 (28).
    • Beispiel 6: Herstellung von 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)-2- methoxyindan (BXT01040) 5,6-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-inden
  • Einer Lösung von 0,60 g (2,23 mmol) 5,6-Dimethoxy-3-(4- methoxyphenyl)-inden in 2 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gekühlt auf -70ºC, wird eine Lösung von BBr&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2; (1,0 M, 9,60 ml, 9,60 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene rote Lösung wird wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 1 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von Eiswasser und EtOAc gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt, dann 2 x mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,62 g eines roten Feststoffs erhalten werden, der direkt im nachfolgenden Schritt verwendet wird.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 3,28 (d, J=2,10 Hz, 2H); 6,31 (t, J=2,10 Hz, 1H); 6,88 (d, J=8,45 Hz, 2H); 7,03 (s, 1H); 7,07 (s, 1H); 7,44 (d, J=8,45 Hz, 2H); 7,72 (s breit, 2H); 8,53 (s breit, 1H).
  • MS (EI): 240 (96), 222 (7), 194 (32), 181 (15), 165 (27), 152 (14), 43 (100).
    • 5,6-Dibenzyloxy-1-(4-benzyloxyphenyl)-inden
  • 0,62 g des Rohprodukts vom vorhergehenden Schritt werden in 8 ml Aceton gelöst. 1,85 g (13,38 mmol) K&sub2;CO&sub3; und 1,73 g (10,0 mol) Benzylbromid werden diesem zugesetzt. Die Mischung wird 18 h lang auf Rückfluß erhitzt. Der Feststoff wird filtriert, dann das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird direkt chromatographiert, wobei mit einer 1:5 EtOAc/Hexan- Mischung eluiert wird, um 0,82 g des erwarteten Produkts zu ergeben, das direkt im nachfolgenden Schritt verwendet wird.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 3,36 (d, J=1,83 Hz, 2H); 5,11 (s, 2H); 5,13 (s, 2H); 5,17 (s, 2H); 6,37 (t, J=1,83 Hz, 1H); 7,01 (d, 3=8,72 Hz, 2H); 7,17 (s, 1H); 7,25-7,60 (m, 18H).
    • 5,6-Dibenyloxy-1-(4-benzyloxyphenyl)-2-hydroxyindan
  • Einer Lösung von 0,82 g (1,61 mmol) des obigen Phenylindens in 8 ml wasserfreiem THF wird bei Umgebungstemperatur eine 1,0 M Lösung von 3,20 ml (3,20 mmol) BH&sub3;.THF während 15 min zugesetzt. Die erhaltene Lösung wird 3,5 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird auf 0ºC gekühlt, und 3,5 ml Wasser werden tropfenweise, dann 7 ml 10 % NaOH zugesetzt. Anschließend werden 7 ml einer 30 % gesättigten wässerigen H&sub2;O&sub2;-Lösung zugesetzt, und die Mischung wird 2 h lang gerührt. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Durch das Abdampfen des Lösungsmittels werden 0,95 g eines farblosen Öls erhalten, das durch chromatographie gereinigt wird, wobei mit einer 1:4 EtOAc/ Hexan-Mischung eluiert wird, um 0,46 g (54 %) des erwarteten Produkts als weißen Feststoff zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,02 (s, breit, austauschbar mit D&sub2;O, 1H);
  • 2,81 (dd, J=7,00-15,26 Hz, 1H); 3,17 (dd, J=6,64-15,26 Hz, 1H); 4,03 (d, 3=6,28 Hz, 1H); 4,34 (m, 1H); 5,01 (s, 2H); 5,06 (s, 2H); 5,15 (s, 2H): 6,57 (s, 1H); 6,86 (s, 1H); 6,92 (d, J=8,72 Hz, 2H); 7,40 (d, J=8,72 Hz, 2H); 7,24-7,50 (m, 15H).
  • MS (CI, NH&sub3;): 546 (MNH&sub4;&spplus;).
    • 5,6-Dibenzyloxy-1-(4-benzyloxyphenyl-2-methoxyindan
  • 0,26 g (0,49 mmol) des obigen Alkohols werden mit 0,11 g (1,97 mmol) pulverförmiger Pottasche gemischt. 3 ml DMSO, unmittelbar gefolgt von 0,14 g (9,85 mol) Methyljodid, werden zugesetzt. Die Mischung wird 3 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. 5 ml Wasser werden zugesetzt. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft, wobei ein gelbes Öl erhalten wird. Die Reinigung dieses Öls durch Chromatographie (Eluierungsmittel: 1:9 EtOAc/Hexan) ergibt 0,26 g (97 %) des erwarteten Produkts.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,85 (dd, J=7,01-15,35 Hz, 1H); 3,23 (dd, J=6,78-15,35 Hz, 1H); 3,38 (s, 3H); 4,04 (m, 1H) ; 4,12 (d, J=6,25 Hz, 1H); 5,03 (s, 2H); 5,08 (s, 2H); 5,14 (s, 2H); 6,60 (s, 1H); 6,88 (s, 1H); 6,93 (d, J=8,64 Hz, 2H); 7,10 (d, J=8,64 Hz, 2H); 7,30-7,60 (m, 15H).
    • 5,6-Dihydroxy-1-(4-hydroxyphenyl-2-methoxyindan
  • Eine Lösung von 0,26 g (0,48 mol) der obigen Verbindung in 10 ml EtOAc wird unter etwa 10&sup5; Pa (1 atm) in Anwesenheit von 10 mg 10 % Palladium-auf-Kohle hydriert. Die Reaktion wird nach 12 h beendet. Der Katalysator wird filtriert, dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft, wobei ein gelbes Öl erhalten wird. Dieses Rohprodukt wird durch Chromatographie (Eluierungsmittel: 1:4 EtOAc/Hexan) gereinigt, um 92 mg (71 %) des erwarteten Produkts als weißen Feststoff zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 2,68 (dd, J=6,15-15,62 Hz, 1H); 3,15 (dd, J=6,25-15,62 Hz, 1H); 3,24 (s, 3H); 4,01 (m, 1H); 4,04 (d, J=6,25 Hz, 1H); 6,29 (s, 1H); 6,10 (s, 1H); 6,76 (d, J=8,24 Hz, 2H); 6,98 (d, J=8,24 Hz, 2H), 1,62 (s breit, 2H); 8,17 (5 breit, 1H).
  • MS (EI): 272 (100), 240 (81), 227 (18).
    • C. Verbindungen der Serie III Beispiel 7: Herstellung von 5,6,6a,11b-Tetrahydro-3,9,10-trihydroxybenzo[c]fluoren (BXT01050) 2-(3,4-Dimethoxybenzyliden)-6-methoxy-1-tetralon
  • 7,04 g (40 mmol) 6-Methoxy-1-tetralon und 6,44 g (40 mmol) 3,4-Dimethoxybenzaldehyd werden mit 100 ml absolutem Ethanol gemischt. Es wird 0,5 h lang gerührt, um die Reagentien maximal zu lösen. Die Einführung von gasförmigem Chlorwasserstoff wird begonnen. Es wird eine exotherme Reaktion festgestellt, die das vollständige Lösen aller Reagentien ermöglicht. Von Zeit zu Zeit wird der Ballon mit einem Eisbad abgekühlt, damit die Temperatur 80ºC nicht überschreitet. Auf diese Weise ist die Lösung nach 1 h mit Chlorwasserstoff gesättigt, wobei eine intensive rote Farbe erhalten wird. Diese Mischung wird 2 h lang bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von 400 ml Wasser und 40 ml 3N wässerigem NaOH gegossen. Sie wird 3 h lang bei Umgebungstemperatur heftig gerührt. Der ausgefällte Feststoff wird auf Sinterglas futriert, mit Wasser gewaschen und schließlich im Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet, wobei 12,35 g (95 %) eines Feststoffs erhalten werden. Eine geringe Menge an Produkt wird in einer 1:2 EtOAc/Hexan-Mischung umkristallisiert.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,89 (t, J=6,96 Hz, 2H); 3,12 (dt, J=1,70- 6,96 Hz, 2H), 3,85 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 3,90 (s, 3H); 6,68 (d, J=2,48 Hz, 1H); 6,85 (dd, J=2,48-8,67 Hz, 1H); 6,88 (d, J=8,14 Hz, 1H); 6,95 (d, J=1,64 Hz, 1H); 7,04 (dd, 3=1,64- 8, 14 Hz, 1H); 7,78 (s, 1H) ; 8,08 (d, J=8, 67 Hz, 1H).
  • MS (EI): 324 (87), 323 (100), 309 (38), 293 (39), 281 (11).
  • Fp. 109,0-110,0ºC (EtOAc/Hexan = 1:2).
    • 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-6-methoxy-1-tetralon
  • Einer Lösung von 35,0 g (0,107 mol) der obigen Mischung in 550 ml EtOAc werden 2,0 g 10 % Palladium-auf-Kohle zugesetzt. Die Mischung wird unter etwa 2 × 10&sup5; Pa (2 atm) Wasserstoff 1 h lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft, wobei 38,4 g eines Rohprodukts erhalten werden, das heiß in 100 ml EtOAc gelöst wird. 130 ml Hexan werden zugesetzt. 23,56 g der gebildeten Kristalle werden filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert, wobei mit einer 1:4 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird, um 6,03 g des erwarteten reinen Produkts zu ergeben.
  • Ausbeute: 29,59 g (84 %).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 101,0-102,0ºC (EtOAc/Hexan = 1:2).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,67-1,83 (m, 1H); 2,00-2,14 (m, 1H); 2,51-2,72 (m, 2H); 2,84-2,96 (m, 2H); 3,34-3,48 (m, 1H); 3,82 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 6,64 (d, J=2,36 Hz, 1H); 6,74-6,84 (m, 4H); 8,02 (d, 3=8,74 Hz, 1H).
  • MS (EI): 326 (35), 175 (9), 151 (100), 107 (13), 91 (17), 17 (11).
    • 5,6-Dihydro-3,9.10-trimethoxybenzo[c]fluoren
  • 15,0 g Polyphosphorsäure werden mit 1,04 g (3,2 mol) des oben erhaltenen Tetralons gemischt, dann 4 h lang auf 80 bis 90ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen der Mischung auf Umgebungstemperatur werden 10 g Eiswasser und 20 ml EtOAc zugesetzt. Die organische Phase wird abgetrennt und die wässerige Phase mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaHCO&sub3;-Lösung, dann mit gesättigtem NaCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,91 g eines Feststoffs erhalten werden, der durch Chromatographie gereinigt wird, wobei mit einer 1:6 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird. 0,61 g des erwarteten Produkts und 0,24 g des Ausgangsprodukts werden erhalten. Die Ausbeute dieser Reaktion in bezug auf das verbrauchte Produkt beträgt 81 %.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,59 (t, J=7,77 Hz, 2H); 2,89 (t, J=7,77 Hz, 2H); 3,39 (s, 2H); 3,84 (s, 3H); 3,90 (s, 3H); 3,94 (s, 3H); 6,84 (m, 2H); 7,08 (s, 1H); 7,38 (s, 1H); 7,72 (d, J=9,24 Hz, 1H).
  • Fp. 146,5 - 147,0ºC (EtOAc/Hexan = 1:4).
  • MS (EI): 308 (100), 293 (14), 277 (38), 202 (24), 176 (33), 165 (11), 152 (21).
    • 5,6,6a,11b-Tetrahydro-3,9,10-trimethoxybenzo[c]-fluoren
  • Einer Lösung von 0,90 g (2,92 mmol) des obigen Produkts in 30 ml EtOAc werden 0,15 g 10 % Palladium-auf-Kohle zugesetzt. Die Mischung wird unter einem Druck von ungefähr 8 × 10&sup5; Pa (8 atm) Wasserstoff etwa 5 h lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft, wobei 0,90 g (99 %) des erwarteten Produkts erhalten werden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 77,0-79,0ºC (EtOAc/Hexan = 1:4).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,45-1,65 (m, 1H); 1,66-1,80 (m, 1H); 2,75 (dd, J=6,96-15,10 Hz, 1H) ; 2,68-2,87 (m, 3H); 3,15 (dd, J=6,96-15,10 Hz, 1H); 3,79 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 4,21 (d, J=6,68 Hz, 1H); 6,66 (d, J=2,64 Hz, 1H); 6,76 (s, 1H); 6,78 (s, 1H); 6,83 (dd, J=2,64-8,38 Hz, 1H); 7,33 (d, J=8,38 Hz, 1H).
  • MS (EI): 310 (100), 295 (23) , 279 (46), 267 (15), 189 (24), 121 (23).
    • 5,6,6a,11b-Tetrahydro-3,9,10-trihydroxybenzo[c]fluoren
  • Einer Lösung von 0,57 g (1,84 mmol) der oben erhaltenen Verbindung in 4 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gekühlt auf -70ºC, wird eine Lösung von BBr&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2; (1,0 M, 6,5 ml, 6,5 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene rote Lösung wird wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 0,5 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von Eiswasser und EtOAc gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt, dann 2 x mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,50 g eines gelben Öls erhalten werden. Die Chromatographie von 0,28 g dieses Öls (Eluierungsmittel: 1:1 EtOAc/Hexan) ermöglicht die Isolierung von 0,24 g (87 %) der erwarteten Verbindung.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 1,46 (m, 1H); 1,61 (m, 1H); 2,46-2,81 (m, 4H); 3,01 (dd, J=7,00-14,98 Hz, 1H); 4,05 (d, 3=6,68 Hz, 1H); 6,54 (d, J=2,54 Hz, 1H) ; 6,66 (s, 1H); 6,68 (3, 1H); 6,71 (dd, J=2,54-8,34 Hz, 1H); 7,18 (d, J=8,34 Hz, 1H); 7,50 (s breit, 2H); 7,83 (s breit, 1H).
  • MS (EI): 268 (82), 251 (31), 240 (100), 161 (21), 145 (26), 77 (30).
    • Beispiel 8: Herstellung von 5,6,6a,7,8,12b-Hexahydro-2,3,10-trihydroxybenzo[c]phenanthren (BXT01051) 2'-(3,4-Dimethoxyphenyl)-tetral-6-methoxy-2-spiro-1'-cyclopropan-1-on
  • Einer Mischung von 4,40 g (20 mmol) Trimethylsulfoxonium und Natriumhydrid (80 % in Mineralöl, 0,80 g, 20 mol) werden 10 ml DMSO zugesetzt. Die Mischung wird 1,5 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. 30 ml DMSO werden zugesetzt, dann wird in kleinen Portionen 2-(3,4-Dimethoxybenzyliden)-6-methoxy-1- tetralon, oben beschrieben, während 15 min zugesetzt. Die Mischung wird 18 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und dann durch den Zusatz von 50 ml einer gesättigten wässerigen NH&sub4;Cl- Lösung hydrolysiert. Die Mischung wird mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 7,0 g eines farblosen Öls erhalten werden. Die Reinigung dieses Öls durch Chromatographie, wobei mit einer 1:4 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird, ergibt 5,41 g (85 %) des gewünschten Produkts.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,26 (dd, J=4,24-7,08 Hz, 1H); 1,68 (m, 1H); 1,85 (m, 2H); 2,70 (m, 2H); 2, 94 (dd, J=7,08-8,24 Hz, 1H); 3,83 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 6,64 (d, J=2,52 Hz, 1H); 6,17 (m, 3H); 6,82 (dd, J=2,52-8,50 Hz, 1H); 8,00 (d, 3=8,72 Hz, 1H).
  • MS (EI): 338 (100), 323 (12), 200 (20), 176 (19), 151 (73), 91 (29), 77 (51).
    • 2-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)-6-methoxy-1-tetralon
  • Eine Lösung von 1,0 g (2,96 mol) des oben erhaltenen Cyclopropan-Derivats und 300 mg p-Toluolsulfonsäure in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; wird 5 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Dann wird diese Lösung mit einer gesättigten wässerigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 1,05 g eines gelben Öls erhalten wurden. Die Reinigung dieses Produkts durch Chromatographie (Eluierungsmittel: 1:4 EtOAc/Hexan) ergibt 0,57 g eines Feststoffs, der eine Mischung der beiden Alken-Isomere ist.
  • 0,53 g dieser letzteren Mischung werden in 15 ml EtOAc aufgenomen. Die Lösung wird in Anwesenheit von 50 mg 10 % Palladium-auf-Kohle unter einem Druck von etwa 2 × 10&sup5; Pa (2 bar) Wasserstoff 1 h lang hydriert. Der Katalysator wird filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 0,53 g (57 %) des erwarteten Produkts erhalten werden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,80 (m, 2H); 2,24 (m, 2K); 2,42 (m, 1H), 2,66 (m, 2K); 2,92 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,82 (s, 3H); 3,84 (s, 3H); 6,64 (d, J=2,36 Hz, 1H); 6,77 (m, 3H); 6,79 (dd, J=2,36-8,80 Hz, 1H); 7,97 (d, J=8,72 Hz, 1H).
  • MS (EI): 340 (2,5), 176 (100), 164 (16), 151 (12).
    • 5,6,7,8-Tetrahydro-2,3,10-trimethoxybenzo[c]phenanthren
  • 8 g Polyphosphorsäure werden mit 0,41 g (1,21 mmol) des oben erhaltenen Tetralons gemischt, dann 2,5 h lang auf 80 bis 90ºC erhitzt. Nach dem Erhitzen der Mischung auf Umgebungstemperatur werden 20 g Eiswasser und 20 ml EtOAc zugesetzt. Die organische Phase wird dekantiert und die wässerige Phase mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaHCO&sub3;-Lösung, dann mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,38 g eines Feststoffs erhalten werden, der durch Chromatographie gereinigt wird, wobei mit einer 1:9 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird. 0,19 g (49 %) des erwarteten Produkts werden erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,31 (m, 4H); 2,66 (m, 4H); 3,80 (s, 3H); 3,82 (s, 3H); 3,89 (s, 3H); 6,77 (m, 3H); 7,08 (s, 1H); 7,44 (d, J=8,42 Hz, 1H).
  • MS (EI): 322 (100), 307 (10), 291 (19), 189 (18), 161 (18).
    • 5,6,6a,7,8,12b-Hexahydro-2,3,10-trimethoxybenzo[c]phenanthren
  • Einer Lösung von 170 mg (0,50 mol) des obigen Produkts in 10 ml EtOAc werden 20 mg 10 % Palladium-auf-Kohle zugesetzt. Die Mischung wird unter einem Druck von etwa 8 × 10&sup5; Pa (8 atm) 2,5 h lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei ein Öl erhalten wird. Dieses Öl wird durch Chromatographie gereinigt, wobei mit einer 1:9 EtOAc/Hexan-Mischung eluiert wird, um 150 mg (88 %) des gewünschten Produkts zu ergeben.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,53 (m, 2H); 1,81 (m, 1H); 2,00 (m, 1H); 2,32 (m, 1H); 2,75 (m, 4H); 3,77 (s, 3H); 3,78 (s, 3H); 3,81 (1H, verdeckt durch OMe); 3,85 (s, 3H); 6,65 (m, 4H); 6,99 (d, J=9,16 Hz, 1H).
  • MS (EI): 314 (100), 309 (5), 296 (33), 293 (37), 203 (36), 189 (86), 173 (39).
    • 5,6,6a,7,8,12b-Hexahydro-2,3,10-trihydroxybenzo[c]phenanthren
  • Einer Lösung von 150 mg (0,37 mol) des oben erhaltenen Derivats in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gekühlt auf -70ºC, wird eine Lösung von BBr&sub3; in CH&sub2;Cl&sub2; (1,0 M, 1,5 ml, 1,5 mmol) tropfenweise zugesetzt. Die erhaltene rote Lösung wird wieder auf Umgebungstemperatur erwärmt und 0,5 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird in eine Mischung von Eiswasser und EtOAc gegossen. Die wässerige Phase wird mit NaCl gesättigt, dann 2 x mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 0,18 g eines gelben Öls erhalten werden. Die Chromatographie dieses Öls (Eluierungsmittel: 1:1 EtOAc/Hexan) ermöglicht die Isolierung von 91 mg (87 %) der erwarteten Verbindung.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (Aceton-d6): 1, 53 (m, 2H); 1,90 (m, 2H); 2,32 (m, 1H); 2,75 (m; 4H); 3,67 (d, J=4,76 Hz, 1H); 6,48 (s, 1H); 6,55 (s, 1H), 6,59 (m, 2H); 6,88 (d, J=8,88 Hz, 1H); 7,51 (s breit, 2H); 7,95 (s breit, 1H).
  • MS (EI): 282 (100), 265 (16), 254 (53), 175 (26), 161 (36), 115 (31), 91 (22), 77 (24).
    • D. Verbindungen der Serie IV Beispiel 9: Herstellung von 3-O-Methylbrazilin 5',6',7-Tri-O-benzylbrazilin
  • Eine Lösung von 304 mg (1,0 mol) Brazilinmonohydrat (ALDRICH) in 2,5 ml Aceton, enthaltend 0,4 ml (3,36 mol) Benzylbromid (JANSSEN) und 1,06 g (7,68 mmol) wasserfreies Kaliumcarbonat (OSI), unter einer inerten Atmosphäre wird 15 h lang auf Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung hat eine violette Farbe. 5 ml einer 0,5N Soda-Lösung werden zugesetzt, und die so erhaltene Lösung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsmedium wird 2 x mit je 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2 x mit je 5 ml Wasser gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 gereinigt (Eluierungsmittel = 3:1 EtOAc/Hexan).
  • Ausbeute = 530 mg (95,3 %).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;):
  • 2,45 (s, 1H); 2,83 (d, 1H, J=16,0 Hz); 3, 18 (d, 1H, J=16,0 Hz); 3,78 (d, 1H, J=11,3 Hz); 4,02 (d, 1H, J=11,3 Hz); 4,09 (s, 1H); 5,04 (s, 2H); 5,09 (s, 2H); 5,11 (s, 2H); 6,55 (d, 1H, J=2, 6 Hz); 6,71 (dd, 1H, J=2,6-8,5 Hz); 6,80 (s, 1H); 6,88 (s, 1H; 7,17 (d, 1H, J=8,5 Hz); 7,42 (m, 15H).
  • MS (EI): (M&spplus;) = 556(2), 466(1), 181(2), 108(3), 91(100).
    • 5',6'-7-Tri-O-benzyl-3-O-methylbrazilin
  • In eine Lösung von 530 mg (0,95 mol) 5',6'-7-Tri-O- benzylbrazilin in 4 ml trockenem DMSO werden 210 mg (3,80 mol) pulverförmige Pottasche unter einer inerten Atmosphäre bei Umgebungstemperatur eingebracht. 0,12 ml (1,90 mol) Methyljodid werden dann dem Reaktionsmedium zugesetzt, das 30 min lang unter diesen Bedingungen gerührt wird. Nach dem Zusatz von 5 ml Wasser wird die Lösung mit 15 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 gereinigt (Eluierungsmittel = 2:1 Hexan/EtOAc).
  • Ausbeute 510 mg (94 %).
  • Das Produkt wird in einer 3:1 Hexan/EtOAc-Mischung umkristallisiert.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 99,5-100,5ºC.
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;):
  • 2,70 (d, 1H, J=15,8 Hz); 3,22 (d, 1H, J=15,8 Hz); 3,38 (s, 3H); 3,67 (d, 1H, J=11,9 Hz) ; 4,20 (s, 1H) ; 4,26 (d, 1H, J=11,9 Hz), 5,03 (s, 2H); 5,07 (s, 2H); 5,11 (s, 2H); 6,54 (d, 1H, J=2,6 Hz); 6,68 (dd, 1H, J=2,6-8,5 Hz); 6,78 (s, 1H); 6,88 (s, 1H); 7,17 (d, 1H, J=8,5 Hz); 7,42 (m, 15H).
  • MS (EI): (M&spplus;) = 570(45), (M&spplus;-91) = 479(12), 91(100).
    • 3-O-Methylbrazilin
  • Eine Lösung von 160 mg (0,28 mol) 5',6',7-Tri-O-benzyl-3- O-methylbrazilin in einer 5:2 EtOAc/MeOH-Mischung, enthaltend 20 mg 10 % Palladium-auf-Kohle, wird 15 min lang mit einem Wasserstoffstrom gespült. Die Suspension wird 5 h lang bei Umgebungstemperatur unter Rühren hydriert. Dann wird sie unter einer inerten Atmosphäre filtriert. Das Lösungsmittel wid unter vermindertem Druck abgedampft. Das gewünschte Produkt kristallisiert progressiv.
  • Ausbeute = 81 mg (96 %).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;COCD&sub3;):
  • 2,68 (d, 1H, J=15,6 Hz); 3,08 (d, 1H, J=15,6 Hz); 3,28 (s, 3H); 3,52 (d, 1H, J=12,1 Hz); 4,03 (s, 1H); 4,24 (d, 1H, J=12,1 Hz); 6,28 (d, 1H, J=2,5 Hz); 6,48 (dd, 1H, J=2,5-8,5 Hz); 6,64 (s, 1H); 6,71 (s, 1H); 7,18 (d, 1H, J=8,5 Hz); 7, 79 (s, 1H); 7,85 (s, 1H); 8,43 (s, 1H).
  • MS (EI): 300(5), 268(4), 110(6), 84(41), 66(49).
    • Beispiel 10: Herstellung von Brazilan (R¹ = OH; R² = -CH&sub2;-O-; R³ = H) 5',6',7-Tri-O-benzyl-3-O-phenyloxythionocarbonylbrazilin
  • Einer Lösung von 280 mg (0,50 mmol) 5',6',7-Tri-O-benzylbrazilin in 3 ml THF, gekühlt auf -78ºC, wird unter Stickstoff und unter Rühren eine Methyllithium-Lösung (0,4 ml einer 1,6 M Lösung in Cyclohexan, JANSSEN) tropfenweise zugesetzt. Das Rühren wird 10 min lang bei dieser Temperatur fortgesetzt, dann 1 h lang bei Umgebungstemperatur. Die Reaktionsmischung wird erneut auf -78ºC gekühlt, und 0,21 ml (0,75 mmol) Phenylchlorthionocarbonat (ALDRICH) werden tropfenweise zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf Umgebungstemperatur zurückkehren gelassen und 1 h lang gerührt. Eine Hydrolyse wird mit Hilfe von Ammoniumchlorid durchgeführt, dann das Produkt 2 x mit je 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2 x mit je 10 ml einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Das so erhaltene gelbe Öl wird auf einer Kieselerde- Säule MERCK F254 chromatographiert. Das gewünschte Produkt, das mit einer 1:5 Ether/Hexan-Mischung eluiert wird, wird mit einer Ausbeute von 83 % (280 mg eines farblosen Feststoffs) erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;):
  • 3,51 (d, 1H, J = 16,50 Hz); 3,71 (d, 1H, J = 16,50 Hz); 3,75 (d, 1H, J = 12,17 Hz); 4,58 (s, 1H); 5,05 (s, 4H); 5,09 (s, 2H); 5,27 (d, 1H, J = 12,17 Hz); 6,57 (d, 1H, J = 2,56 Hz); 6,69 (dd, 1H, J = 2,56-8,45 Hz); 6,78 (s, 1H); 6,88 (s, 1H); 7,06 (d, 2H, 3 = 7,30 Hz); 1,19 (d, 1H, J = 8,45 Hz) ; 7,24- 7,46 (m, 18H).
  • MS (EI): (M&spplus;-PhOC(OH)=S)=538(3) ; 447(1,5); 419(3); 91(100); 60(80).
    • 5',6',7-Tri-O-benzylanhydrobrazilin
  • Eine Lösung von 100 mg (0,15 mol) des oben erhaltenen Thionocarbonats in 3 ml trockenem Toluol wird 2 h lang auf Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel der so erhaltenen, leicht gelblichen Lösung wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 gereinigt und mit einer 1:5 Ether/Hexan-Mischung eluiert. 64 mg des gewünschten Produkts werden in einer Ausbeute von 82 % erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 142-144ºC (Ethylacetat/Hexan = 1:4).
  • ¹H-NMR (200 MHz&sub1; CDCl&sub3;):
  • 3,30 (s, 2H); 5,05 (s, 2H); 5,12 (s, 2H); 5,17 (s, 2H); 5,21 (s, 2H); 6,58 (s, 1H); 6,60 (dd, 1H, J = 2,50-8,41 Hz); 7,13 (s, 1H); 7,30-7,50 (m, 17H).
  • MS (EI): 538(12), 447(3), 419(6), 91(100).
    • Brazilan
  • Eine Lösung von 92 mg (0,17 mol) des obigen Derivats in 5 ml Ethylacetat wird in Anwesenheit von 30 mg 10 % Palladiumauf-Kohle (ALDRICH) unter einem Druck von etwa 8 × 10&sup5; Pa (8 bar) 3 h lang bei Umgebungstemperatur hydriert. Die Suspension wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft. Das gewünschte Produkt wird nach Reinigung durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 mit 1:1 Ether/Hexan als Eluierungsmittel erhalten. Ausbeute = 69 %.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;CCOCD&sub3;):
  • 2,47 (dd, 1H, J = 2,38-15,46 Hz); 2,80 (m, 1H); 3,03 (dd, 1H, J = 7,32-15,46 Hz); 3,47 (t, 1H, J = 10,62 Hz); 4,02 (dd, 1H, J = 4,48-10,62 Hz); 4,06 (d, 1H, 3 = 7,34 Hz); 6,25 (d, 1H, 3 = 2,52 Hz); 6,45 (dd, 1H, J = 2,52-8,34 Hz); 6,67 (s, 1H); 6,80 (s, 1H); 7,20 (d, 1H, J = 8,34 Hz); 7,55 (s, 1H); 7,61 (s, 1H); 8,15 (s, 1H).
  • MS (EI): 270(100), 253(31), 240(18), 205(22), 161(39), 115(25), 101(24).
    • E. Verbindungen der Serie V Beispiel 11: Herstellung von 7-O-Methylbrazilin 5',6'-O-Methylbrazinlin
  • Eine Lösung von 145 mg (2,5 mmol) wasserfreiem Kaliumfluorid (JANSSEN) und 152 mg (0,5 mol) Brazilinmonohydrat (ALDRICH) in 1 ml Dimethylformamid wird erhitzt und unter Stickstoff bei 120 ºC gerührt. 39 µl (0,55 mmol) Dibrommethan (JANSSEN) werden zugesetzt. Nach 18 h Rühren bei dieser Temperatur wird die Reaktionsmischung auf 0ºC gekühlt, und 4 ml Wasser werden zugesetzt. Die Mischung wird 2 x mit je 5 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit Wasser, dann mit einer gesättigten wässerigen Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Das gewünschte Produkt wird nach Reinigung durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 (Eluierungsmittel 1:1 Ethylacetat/Hexan) erhalten.
  • Ausbeute: 42 %.
  • Das Produkt wird in einer 1:1 Ethylacetat/Hexan-Mischung umkristallisiert.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp. 264,5ºC (Zersetzung).
  • ¹H-NMR (200 MHz, DMSO d&sub6;):
  • 2,81 (d, 1H, J = 16,3 Hz); 2,86 (d, 1H, J = 16,3 Hz); 3,64 (d, 1H, J = 11,8 Hz); 3,82 (d, 1H, J = 11,8 Hz); 3,88 (s, 1H); 5,36 (s, 1H); 5,91 (s, 1H); 5,93 (s, 1H) ; 6,18 (d, 1H, J = 2,4 Hz); 6,40 (dd, 1H, J = 2,4-8,2 Hz); 6,74 (s, 1H) 6,87 (s, 1H); 7,22 (d, 1H, J = 8,20 Hz); 9,26 (s, 1H).
  • MS (EI): 298(100), 280(62), 279(79), 241(28), 149(58).
    • 7-O-Methyl-5',6'-O-methylenbrazilin
  • Einer Lösung von 79 mg (0,27 mol) 5',6'-O-Methylenbrazilin in 2 ml Aceton werden 183 mg (1,33 mmol) Kaliumcarbonat (OSI) und 35 µl (0,53 mmol) Methyljodid (LANCASTER) zugesetzt. Die Mischung wird unter Stickstoff 24 h lang unter Rühren auf Rückfluß erhitzt. Dann wird die Suspension nach der Rückkehr auf Umgebungstemperatur filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft und das gewünschte Produkt nach Reinigung durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 (Eluierungsmittel = 1:4 Ethylacetat/Hexan) erhalten. Ausbeute: 65 %.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;):
  • 2,58 (s, 1H); 2,80 (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,17 (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,76 (s, 3H); 3,79 (d, 1H, J = 11,8 Hz); 4,00 (d, 1H, J = 16,45 Hz); 4,04 (s, 1H); 5,86 (m, 2H); 6,48 (d, 1H, J = 2,4 Hz); 6,62 (dd, 1H, J = 2,4-8,2 Hz); 6,68 (s, 1H); 6,72 (s, 1H); 7,24 (d, 1H, J = 8,20 Hz).
    • 7-O-Methylbrazilin
  • Einer Lösung von 50 mg (0,16 mmol) 7-O-Methyl-5',6'-O- methylenbrazilin in 2 ml Methylenchlorid wird tropfenweise unter Stickstoff und Rühren eine Bortrichlorid-Lösung (0,25 ml einer 1 M Lösung in Methylenchlorid, 0,25 mol) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 20 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. 60 µl absolutes Methanol werden langsam zugesetzt, dann wird das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird in 5 ml Ethylacetat aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Das gewünschte Produkt wird nach Reinigung durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 (Eluierungsmittel 1:1 Ethylacetat/Hexan) erhalten. Ausbeute: 44 %.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;COCD&sub3;):
  • 2,80 (d, 1H, J = 16,5 Hz); 3,00 (d, 1H, J = 16,50 Hz); 3,70 (s et d, 4H); 3,93 (d, 1H, J = 11,30 Hz); 3,98 (s, 1H); 4,48 (s, 1H); 6,37 (d, 1H, J = 2,4 Hz); 6,56 (dd, 1H, J = 2,4- 8,30 Hz); 6,63 (s, 1H); 6,77 (s, 1H); 7,26 (d, 1H, J = 8,30 Hz); 7,59 (s, 1H); 7,64 (s, 1H).
  • MS (EI): 300(100), 282(59), 281(63), 243(45), 176(13), 165(10), 141(20).
    • II. Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II) (Mercaptan-Fänger-Reagentien" Beispiel 12: Herstellung von 1,4,6-Trimethyl-2-vinylpyridiniumtetrafluorborat 4,6-Dimethyl-2-vinylpyridin
  • Einer Lösung von 20 g (0,186 mol) 2,4-Dimethylpyridin (LANCASTER) in 200 ml frisch destilliertem THF, gekühlt auf -20ºC und unter einer inerten Atmosphäre, werden 29,12 g (0,186 mol) Benzoylchlorid (JANSSEN) in 100 ml THF zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 20 min lang bei dieser Temperatur gerührt. Dann wird Vinylmagnesiumbromid (186 ml einer 1,0 M Lösung in THF) zugesetzt und die Lösung 0,5 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand in 300 ml tert.Butylmethylether aufgenommen. Nach dem Waschen des Reaktionsmediums mit einer gesättigten NH&sub4;Cl-Lösung wird die organische Phase über MgSO&sub4; getrocknet und das gewünschte Produkt durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 (Eluierungsmittel = 9:1 Hexan/EtOAc) gereinigt.
  • Ausbeute 39,5 g (83 %), farbloses Öl.
  • Das obige Produkt wird in 500 ml Toluol aufgenommen, und 41,7 g (0,169 mol) p-Chloranil (Tetrachlor-1,4-benzochinon) werden zugesetzt, dann 2 h lang auf Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsmedium wird unter vermindertem Druck konzentriert, dann werden 260 ml einer 2N Soda-Lösung zugesetzt. Das Produkt wird mit 300 ml tert.Butylmethylether extrahiert und durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 (Eluierungsmittel = 9:1 Hexan/EtOAc) gereinigt.
  • Ausbeute = 11,1 g (54,2 %), blaßgelbes Öl.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;COCD&sub3;):
  • 2,20 (s, 3H); 2,50 (s, 3H); 5,25-5,45 (dd, 2H, J = 11,9- 18,7 Hz); 6,60-6,90 (m, 3H).
  • MS (CI, NH&sub3;): MH&spplus; = 134 (100).
    • 1,4,6-Trimethyl-2-vinylpyridiniumtetraflourborat
  • Einer Lösung von 0,61 g (4,13 × 10 mol) 4,6-Dimethyl-2- vinylpyridin in 4,0 ml Methylenchlorid unter einer inerten Atmosphäre werden auf einmal 0,50 g (3,76 × 10&supmin;³ mol) Trimethyloxoniumtetrafluorborat zugesetzt. Die Suspension wird 2 h lang bei 25ºC umsetzen gelassen. Die Suspension wird filtriert und das Produkt im Vakuum getrocknet.
  • Ausbeute = 0,162 g (18 %), weiße Kristalle.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;COCD&sub3;):
  • 2,60 (s, 3H); 2,85 (s, 3H); 4,20 (s, 3H); 6,00 (d, 1H, J=12,8 Hz); 6,25 (d, 1H, J=19,2 Hz); 7,27 (dd, 1H, J=12,8- 19,2 Hz); 7,82 (s, 1H); 7,95 (s, 1H).
  • MS (EI): (M&spplus;) 148(10); 147(18); 133(34); 121(100); 106(25); 91(31); 77(52); 49(77).
  • Mikroanalyse:
  • Berechnet: C 51,10; 14 6,00; N 6,00 %
  • Gefunden: C 49,80; 14 6,08; N 5,96 %.
    • Beispiel 13: Herstellung von 1-Methyl-4-vinylchinoliniumtetrafluorborat 4-Vinylchinolin
  • Eine Lösung von 5 g (3,18 × 10&supmin;² mol) 4-Chinolincarboxaldeyhd in 32 ml Benzol unter einer inerten Atmosphäre, enthaltend 26 g (6,36 × 10&supmin;² mol) Triphenylmethylphosphoniumjodid, wird zu 96 ml einer 5N Soda-Lösung zugesetzt. Das Zweiphasen-System wird 30 min lang bei 45ºC gerührt. Nach Dekantieren wird die wässerige Phase 3 x mit je 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und 2 x mit je 30 ml einer 1N HCl-Lösung gewaschen, dann wird die wässerige Phase mit NaHCO&sub3; neutralisiert und 3 x mit je 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet. Das gewünschte Produkt wird durch Chromatographie auf einer Kieselerde-Säule MERCK F254 (Eluierungsmittel = 8:2 Cyclohexan/EtOAc) gereinigt.
  • Ausbeute: 2,8 g (60 %).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;):
  • 5,60 (d, 1H, J=10 Hz); 5,95 (d, 1H, J=14 Hz); 7,30-7,55 (m, 4H); 7,60-7,75 (t, 1H, J=4 Hz); 8,07 (t, 2H, J=6 Hz); 8,85 (d, 1H, J=4 Hz).
    • 1-Methyl-4-vinylchinoliniumtetrafluorborat
  • Einer Lösung von 0,72 g (4,64 × 10&supmin;³ mol) 4-Vinylchinolin in einer 2,5:1 Acetonitril/Aceton-Mischung werden unter einer inerten Atmosphäre auf einmal 1,58 g (10,7 × 10&supmin;³ mol) Trimethyloxoniumtetrafluorborat zugesetzt. Die Suspenion wird 1 h lang bei 25ºC reagieren gelassen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft, der Rückstand in 25 ml 2-Propanol aufgenomen, dann 30 min lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach dem Zusatz von 25 ml Ethylether wird die Suspension filtriert. Das gewünschte Produkt wird im Vakuum getrocknet.
  • Ausbeute = 0,93 g (60,4 %).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • ¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;COCD&sub3;):
  • 4,30 (s, 3H); 6,25 (d, 1H, J=12,5 Hz); 6,65 (d, 1H, J=17,5 Hz); 7,85-8,00 (dd, 1H, J=12,5-17,5 Hz); 8,10 (d, 1H, J=7 Hz); 8,35 (m, 2H); 8,57 (d, 1H, J=10 Kz); 8,72 (d, 1H, J=10 Hz); 9,35 (d, 1H, J=7 Hz)
  • MS (FAB) Glycerin-NOBA: positive Ionen M&spplus; = 170 (100) negative Ionen M&supmin; = 87 (100).
  • FAB = schneller Atombeschuß (Fast Atom Bombardement).
  • NOBA = m-Nitrobenzylalkohol.
  • Mikroanalyse:
  • Berechnet: C 56,00; 14 4,60; N 5,40 %
  • Gefunden: C 55,56; H 4,35; N 4,12 %.
    • III. Anwendungsbeispiele
  • Die nachstehend beschriebenen Betriebsprotokolle sind Anwendungsbeispiele des Meßverfahrens unter Verwendung der Reagentien BXT01041 (in Beispiel 1 beschrieben), BXT01048 (in Beispiel 3 beschrieben), BXT01049 (in Beispiel 4 beschrieben), BXT01050 (in Beispiel 7 beschrieben), Brazilin (kommerzielles Produkt), Brazilan (Verbindung von Beispiel 10) bzw. 3-0-Methylbrazilin (Verbindung von Beispiel 9) zur Messung der SOD-Aktivität in einem Erythrozyten-Lysat.
    • Beispiel 14: Meßverfahren unter Verwendung des Reagens BXT01041
  • Ein Analysenkoffer, der die nachstehend beschriebenen Reagentien enthält, wird verwendet. Dieser Reagentien-Koffer muß bei einer Temperatur zwischen 0 und 4ºC gelagert werden.
    • Beschreibung der Reagentien
  • R1: 2 × 10&supmin;³ M Lösung von BXT01041 in einer 50/50 (V/V) DMSO/H&sub2;O-Mischung, enthaltend 0,15 M Borsäure. (Während der Messungen zwischen 0 und 4ºC zu lagern; stabil zumindest 1 Monat nach Herstellung unter den oben angegebenen Lagerbedingungen).
  • R2: 5 × 10&supmin;² M Lösung von 1,4,6-Trimethyl-2-vinylpyridiniumtetrafluorborat in DMSO, enthaltend 25 % (M/V) Ethylenglykol. (Während der Messungen zwischen 0 und 4ºC zu lagern; stabil zumindest 1 Monat nach Herstellung).
  • E: 62,5/37,5 (V/V) absolutes Ethanol/Chloroform. (Zwischen 0 und 4ºC zur Herstellung der Probe zu lagern).
  • T: 0,05 M AMPD/HCl-Puffer, pH 8,8, enthaltend 0,1 mM DTPA. (Vor den Messungen in Luft bei 37ºC äquilibrieren lassen).
    • Herstellung der Probe
  • Zumindest 100 µl Vollblut werden bei 4ºC und 3000 UpM 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird eliminiert. Der Erythrozyten-Rückstand wird mit einer 0,9 % Natriumchlorid-Lösung (auf zwischen 0 und 4ºC gekühlt) gewaschen, dann bei 4ºC und 3000 UpM 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird eliminiert. Der Erythrozyten-Rückstand wird im Vierfachen seines Volumens an destillierem Wasser, gekühlt auf zwischen 0 und 4ºC, aufgenommen und gemischt.
  • Zu 125 µl dieses Erythrozyten-Lysats, 1/5, werden einerseits und zu 125 µl destilliertem Wasser andererseits 200 µl der Mischung E (gekühlt auf zwischen 0 und 4ºC) zugesetzt. Jede der Lösungen wird gut gemischt und bei 4ºC und 3000 UpM 10 min lang zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand dient zur Messung für die Probe (ohne Hämoglobin) bzw. für die Kontrolle.
  • Die Überstände müssen für die Messungen bei zwischen 0 und 4ºC gelagert werden.
    • Meßverfahren
  • Die Messungen werden bei 37ºC in einem Spektrophotometer durchgeführt, dessen Meßküvetten wärmestabilisiert sind.
  • Die jeder Messung entsprechende Reaktionsmischung wird unmittelbar vor der Verwendung gemäß den in nachstehender Tabelle angegebenen Mengen für 1 ml Küvetten hergestellt.
  • Jede Reaktion wird durch den Zusatz von 10 µl des Reagens R1 ausgelöst. Nach der Homogenisierung des Mediums wird die Entwicklung des Absorptionsvermögens sofort aufgezeichnet und während 1 min und 30 s verfolgt.
  • Die Messung des Absorptionsvermögens wird bei 501 nm in Küvetten mit einem optischen Weg von 1 cm gegen Luft durchgeführt.
  • Für jede Messung muß das in nachstehender Tabelle definierte Reaktionsmedium vor dem Zusatz des Reagens R1 1 min lang bei 37ºC inkubiert werden.
  • (*) destilliertes Wasser, das demselben Extraktionsverfahren unterworfen wurde wie das Erythrozyten-Lysat
  • Für jede Messung wird die maximale Autooxidationsgeschwindigkeit, ausgedrückt in Einheiten des Absorptionsvermögens pro Minute, bestimmt, indem der zeitliche Verlauf des Absorptionsvermögens (bis zu einer Zeit t = 30 s) untersucht wird. Dieser Verlauf entspricht einer Autooxidationsphase des Reagens BXT01041, die linear sein muß.
    • Ergebnisse
  • Wenn Vc und Vs die jeweiligen Geschwindigkeiten der Kontrolle bzw. der Probe sind, wird die SOD-Aktivität derselben mit Hilfe der Gleichung der in Fig.1 angegebenen Eichgeraden berechnet, die Variationen des Kehrwerts der Differenz (Vs - Vc), ausgedrückt in min/Variation des Absorptionsvermögens (min/&Delta;Abs.), als Funktion des Kehrwerts der SOD-Konzentration, ausgedrückt in ml/E, zeigt. Diese Gerade ermöglicht die Bestimmung des Werts der Abszisse, der einem experimentell gemessenen Wert der Ordinate entspricht.
  • Dann wird der Kehrwert dieser Abszisse mit dem Verdünnungsfaktor D multipliziert.
  • Dann werden die Ergebnisse in Einheiten der SOD-Aktivität pro ml der Probe ausgedrückt, gemäß:
  • Einheiten SOD-Aktivität = 1/{0,026 × [1/(Vs-Vc)] - 0,075} × D
  • Die in dieser Methode definierte Einheit E der SOD-Aktivität hat den einzigartigen Vorteil, daß sie angesichts der Abwesenheit von wenig stabilen Protein- oder Enzym-Reagentien, wie Xanthinoxidase, einen invariablen Bezug liefert.
  • Die Verwendung dieser Einheit ist äußerst empfehlenswert, der Anwender kann jedoch eine gereinigte SOD, mit der er vorher eine Eichkurve festgelegt hat, in einen Massewert umrechnen. Eine derartige Masseberechnung wird durch den Prozentsatz von in der Zubereitung vorliegendem inaktiven Enzym stark beeinträchtigt.
  • Die Ergebnisse können auch beispielsweise in E/ml Vollblut oder E/mg Erythrozyten-Proteine ausgedrückt werden.
    • Anmerkungen
  • Die Kontrolle des Meßverfahrens kann durch die Messung der SOD-Aktivität in einem Erythrozyten-Lysat, das wie oben beschrieben hergestellt und bei -70ºC gelagert wurde, in Form von aliquoten Mengen durchgeführt werden, die als Kontrolle dienen sollen. Die SOD-Aktivität derartiger aliquoter Mengen ist zumindest 6 Monate lang bei -70ºC stabil.
  • Die Messung muß an einer unmittelbar vor der Verwendung aufgetauten aliquoten Menge durchgeführt werden.
    • Beispiel 15: Meßverfahren unter Verwendung des Reagens BXT01048
  • Identisch mit Beispiel 14, ausgenommen daß:
  • - in R1 das Reagens BXT01041 durch das Reagens BXT01048 ersetzt wird;
  • - die Entwicklung des Absorptionsvermögens bei 505 nm verfolgt wird.
  • Die beigeschlossene Fig.2 zeigt Variationen des Kehrwerts der Differenz (Vs-Vc), ausgedrückt in min/Variation des Absorptionsvermögens (min/&Delta;Abs.)&sub1; als Funktion des Kehrwerts der SOD- Konzentration, ausgedrückt in ml/E, in diesem Beispiel.
  • Einheiten SOD-Aktivität = 1/{0,028 × [1/(Vs-Vc)] - 0,077} × D
    • Beispiel 16: Meßverfahren unter Verwendung des Reagens BXT01049
  • Identisch mit Beispiel 14, ausgenommen daß:
  • - R1 durch R3 ersetzt wird, das wie folgt definiert ist:
  • 2 × 10&supmin;³ M Lösung von BXT01049 in einer 50/50 (V/V) DMSO/H&sub2;O-Mischung, enthaltend 0,1 M Borsäure;
  • - die Entwicklung des Absorptionsvermögens bei 522 nm während 1 min verfolgt wird.
  • Die beigeschlossene Fig.3 zeigt Variationen des Kehrwerts der Differenz (Vs-Vc), ausgedrückt in min/Variation des Absorptionsvermögens (min/&Delta;Abs.), als Funktion des Kehrwerts der SOD- Konzentration, ausgedrückt in ml/E, in diesem Beispiel. Einheiten SOD-Aktivität 1/{0,023 × [1/(Vs-Vc)] - 0,063} × D
    • Beispiel 17: Meßverfahren unter Verwendung des Reagens BXT01050 Identisch mit Beispiel 14, ausgenommen daß:
  • - R1 durch R4 ersetzt wird, das wie folgt definiert ist:
  • 2 × 10 M Lösung von BXT01050 in einer 50/50 (V/V) DMSO/H&sub2;O-Mischung, enthaltend 0,3 M Borsäure;
  • - die Entwicklung des Absorptionsvermögens bei 525 nm während 1 min verfolgt wird.
  • Die beigeschlossene Fig.4 zeigt Variationen des Kehrwerts der Differenz (Vs-Vc), ausgedrückt in min/Variation des Absorptionsvermögens (min/&Delta;Abs.), als Funktion des Kehrwerts der SOD- Konzentration, ausgedrückt in ml/E, in diesem Beispiel. Einheiten SOD-Aktivität = 1/{0,070 × [1/(Vs-Vc)] - 0,102} × D
    • Beispiel 18: Meßverfahren unter Verwendung von Brazilin
  • Ein mit dem in Beispiel 14 verwendeten identischer Analysenkoffer wird verwendet, außer daß in R1 das Reagens BXT01041 durch Brazilin ersetzt wird.
  • Das Erythrozyten-Lysat wird wie in Beispiel 14 beschrieben erhalten.
  • Zu 125 µl dieses Erythrozyten-Lysats, 1/5, werden 200 µl der Mischung E (gekühlt auf zwischen 0 und 4 ºC) zugesetzt. Es wird gemischt und bei 4ºC und 3000 UpM 10 min lang zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand, ohne Hämoglobin, dient zur Messung (er muß für die Messungen bei 4ºC aufbewahrt werden).
  • Das Meßverfahren ist gleich wie in Beispiel 14, außer daß die Messung des Absorptionsverrnögens bei 539 nm anstelle von 501 nm durchgeführt wird, und die "Leerprobe" durch 50 % (V/V) Ethanol in destilliertem Wasser ersetzt wird.
    • Ergebnisse
  • Unter den Bedingungen dieser Messung entspricht eine Einheit der SOD-Aktivität (E) einer Zunahme der Bildung von Brazilein (Autooxidationsprodukt von Brazilin) von 0,5 µmol × 1 min in bezug auf die Kontrolle.
  • Die beigeschlossene Fig.5 zeigt Variationen des Kehrwerts der Differenz (Vs-Vc), ausgedrückt in min/Variation des Absorptionsvermögens (min/&Delta;Abs.), als Funktion des Kehrwerts der SOD- Konzentration, ausgedrückt in ml/E, in diesem Beispiel. Einheiten SOD-Aktivität = 1/{0,034 × [1/(Vs-Vc)] - 0,065} × D
    • Beispiel 19: Meßverfahren unter Verwendung von Brazilan
  • Der verwendete Analysenkoffer enthält dieselben Reagentien wie jener in Beispiel 14, außer daß das Reagens BXT01041 durch Brazilan ersetzt wird.
    • Herstellung der Probe
  • Wie in Beispiel 18.
    • Meßverfahren
  • Es wird wie in Beispiel 18 vorgegangen, außer daß diese Reaktion durch den Zusatz von 10 µl Reagens R1, enthaltend Brazilan anstelle von Brazilin, ausgelöst wird, und die Entwicklung des Absorptionsvermögens während 1 min bei 520 nm anstelle von 1 min 30 bei 539 nm verfolgt wird.
    • Ergebnisse
  • Die beigeschlossene Fig.6 zeigt Variationen des Kehrwerts der Differenz (Vs-Vc), ausgedrückt in min/Variation des Absorptionsvermögens (min/&Delta;Abs.), als Funktion des Kehrwerts der SOD- Konzentration, ausgedrückt in ml/E, in diesem Beispiel. Einheiten SOD-Aktivität = 1/{0,069 × [1/(Vs-Vc)] - 0,077} × D
    • Beispiel 20: Meßverfahren unter Verwendung von 3-O-Methylbrazilin
  • Der verwendete Analysenkoffer enthält dieselben Reagentien wie in Beispiel 14, außer daß das Reagens BXT01041 durch 3-O-Methylbrazilin ersetzt wird.
    • Herstellung der Probe
  • Die Herstellung der Probe ist identisch mit der in Beispiel 18 beschriebenen.
    • Meßverfahren
  • Die Messungen des Absorptionsvermögens werden bei 541 nm durchgeführt. Abgesehen davon ist das Meßverfahren identisch mit dem in Beispiel 18 beschriebenen.
    • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse werden identisch mit den in Beispiel 18 beschriebenen mit Hilfe einer für 3-O-Methylbrazilin spezifischen Eichkurve ausgedrückt.
    • Beispiel 21: Anderes Meßverfahren unter Verwendung des Reagens BXT01050
  • Es wird ein Analysenkoffer verwendet, der die oben beschriebenen Reagentien enthält. Dieser Analysenkoffer muß bei einer Temperatur zwischen 0 und 4ºC gelagert werden.
    • Beschreibung der Reagentien
  • S1: 0,66 × 10&supmin;³ M Lösung von BXT01050 in 3,2 × 10&supmin;² M HCl, enthaltend 0,5 mM DTPA und 2,5 % absolutes Ethanol. (Während der Messungen zwischen 0 und 4ºC aufzubewahren; zumindest 1 Monat nach Herstellung unter den oben angegebenen Lagerbedingungen stabil).
  • S2: 3,33 × 10&supmin;² M Lösung von Trifluormethylsulfonat oder 1,4,6-Trimethyl-2-vinylpyridiniumtetrafluorborat in DMSO, enthaltend 25 % (M/V) Ethylenglykol. (Während der Messungen zwischen 0 und 4ºC aufzubewahren; zumindest 1 Monat nach Herstellung stabil).
  • S3: 0,055 M AMPD/HCl-Puffer, pH = 8,8 (bei 37ºC), enthaltend 3,33 mM Borsäure und 0,11 mM DTPA. (Vor den Messungen in Luft bei 37ºC äquilibrieren lassen).
    • Herstellung der Probe
  • Identisch mit Beispiel 14.
    • Meßverfahren
  • Identisch mit Beispiel 17, ausgenommen daß:
  • - jede Reaktion durch den Zusatz von 30 µl Reagens S1 ausgelöst wird;
  • - das Reaktionsmedium unmittelbar vor der Verwendung auf folgende Weise hergestellt wird:
  • (*) destilliertes Wasser, das demselben Extraktionsverfahren unterworfen wurde wie das Erythrozyten-Lysat
    • Ergebnisse
  • Die SOD-Aktivität der Probe wird aus dem Verhältnis Vs/Vc erhalten, dessen Variation mit der SOD-Konzentration (ausgedrückt in Einheiten der SOD-Aktivität) durch die folgende Gleichung angegeben wird:
  • Vs/Vc = 1 + [SOD]/(0,073 × [SOD] + 0,93)
  • Unter den Bedingungen dieser Messung entspricht eine Einheit der SOD-Aktivität einem Vs/Vc-Verhältnis von 2 und wird als SOD-525-Einheit bezeichnet (da die Entwicklung des Absorptionsvermögens bei 525 nm verfolgt wird, wie in Beispiel 17).
  • Die beigeschlossene Fig.7 zeigt die Variation des Vs/Vc- Verhältnisses als Funktion der SOD-Konzentration, ausgedrückt in SOD-525-Einheiten/ml, in diesem Beispiel.
  • Einheiten SOD-Aktivität = [0,93 × (1-Vs/Vc)J/[0,073×(Vs/Vc-1)-1]×D.
    • LITERATURSTELLEN
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Claims (13)

1. Verfahren zur Messung der Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität in einem flüssigen Medium, bei welchem die Aktivierung der Autooxidation eines Reagens durch durch die SOD-Aktivität verwendet wird,
dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist:
worin
entweder: n = 1 oder 2; R¹ = -OR&sup4; oder -NR&sup5;R&sup6;; R² = Wasserstoff, -OR&sup4;, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder auch -CH&sub2;- oder -CH&sub2;-CH&sub2;-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß mit dem Phenyl-Substituenten in meta-Stellung in bezug auf R¹; R³ = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder -OR&sup4; (mit der Maßgabe, daß R² von -OR&sup4; verschieden ist);
R&sup4; = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen);
R&sup5; = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen),
-CH&sub2;COOH, -C&sub6;H&sub5;COOH oder -C&sub6;H&sub5;SO&sub3;H; und R = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder -CH&sub2;COOH;
oder: n = 1; R¹ = -OR&sup4; (wobei R wie vorstehend definiert ist); R² = -CH&sub2;-O-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß des Sauerstoffatoms mit dem Phenyl-Substituenten in meta- Stellung in bezug auf R¹ ; R³ = Wasserstoff oder -OR&sup4; (wobei R&sup4; wie vorstehend definiert ist);
und daß das Verfahren auf einer spektrophotometrischen Messung der Autooxidationsgeschwindigkeit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Abwesenheit und in Anwesenheit einer zu messenden Probe basiert.
2. Verfahren zur Messung der Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität in einem flüssigen Medium, das ein oder mehrere Mercaptane enthält, insbesondere einem biologischen Medium, bei welchem Verfahren die Aktivierung der Autooxidation eines Reagens durch durch die SOD-Aktivität verwendet wird,
dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, ist,
daß das Medium außerdem eine zum vollständigen Abfangen der Mercaptane durch S-Alkylierung geeignete Menge zumindest einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) enthält:
worin Z¹ = Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), Benzyl, p-Nitrobenzyl, Phenyl, o,p-Dinitrophenyl, -CH&sub2;COOH oder -CH&sub2;-CH&sub2;-COOH; Z&sup4; = Wasserstoff, und Z&sup5; = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), oder Z&sup4; und Z&sup5; zusammen mit den beiden dazwischenliegenden Kohlenstoffatomen einen Phenylring bilden; X = Halogenid, Sulfonat, Fluorsulfonat, Phosphonat, Tetrafluorborat oder Tosylat; und entweder Z² = Vinyl, und Z³ = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), oder Z³ = Vinyl, und Z² = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen);
und daß das Verfahren auf einer spektrophotometrischen Messung der Autooxidationsgeschwindigkeit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Abwesenheit und in Anwesenheit einer zu messenden Probe basiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (II) X = Trifluormethylsulfonat.
4. Verfahren zur Messung der Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen die Schritte umfaßt, die bestehen aus:
1) Bestimmen der maximalen Autooxidationsgeschwindigkeit Vs einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Anwesenheit einer Probe mittels der Entwicklung des Absorptionsvermögens als Funktion der Zeit bei einer Wellenlänge, die das Auftreten des Autooxidationsprodukts der verwendeten Verbindung der allgemeinen Formel (I) charakterisiert, in einem Reaktionsmedium, das auf einen pH-Wert von 8,0 bis 9,0 gepuffert wird, wobei die Reaktion durch den Zusatz einer aliquoten Menge einer Mutterlauge der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ausgelöst wird;
2) Bestimmen der maximalen Autooxidationsgeschwindigkeit Vc derselben Verbindung unter denselben Bedingungen in Abwesenheit der Probe; und
3) Bestimmen der SOD-Aktivität der Probe mittels der erhaltenen Geschwindigkeiten Vs und Vc und einer unter denselben Betriebsbedingungen festgelegten Eichkurve.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es den Zusatz eines Bor-Derivats, insbesondere von Borsäure, zur Modulation der Autooxidationsgeschwindigkeit der Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit der unter den Aktivierungsbedingungen der Autooxidation der Verbindung der allgemeinen Formel (I) durchgeführten Messung eine unter Inhibierungsbedingungen dieser Autooxidation vorgenommene Messung in einem pH-Bereich von 7,2 bis 7,8 kombiniert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dädurch gekennzeichnet, daß die verwendete Verbindung der allgemeinen Formel (I) 5,6,6a,11b-Tetrahydro-3,9,10-trihydroxybenzo[c]fluoren ist.
8. Testsatz oder Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen als Reagens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfaßt.
9. Testsatz oder Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem eine oder mehrere Mercaptan-Fänger-Verbindungen der allgemeinen Formel (II) umfaßt.
10. Testsatz oder Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen umfaßt:
eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) in sauer Lösung oder als Pulver,
eine oder mehrere Mercaptan-Fänger-Verbindungen der allgemeinen Formel (II) in Lösung oder als Pulver, und
einen Puffer auf der Basis von AMPD, der in einem pH-Bereich von 8,0 bis 9,0 puffert.
11. Verbindung der allgemeinen Formel (I), worin R¹ und R² wie in Anspruch 1 definiert sind, mit der Maßgabe, daß, wenn n = 1, und R² = -CH&sub2;-O-, R¹ und R³ nicht gleichzeitig -OR&sup4; sein können, wobei R&sup4; = Wasserstoff.
12. Verbindung der allgemeinen Formel (I):
worin n = 1 oder 2; R¹ oder -NR&sup5;R&sup6;; R² = Wasserstoff, -OR&sup4;, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder auch -CH&sub2;- oder -CH&sub2;-CH&sub2;-, zur Bildung eines Rings durch den Zusammenschluß mit dem Phenyl-Substituenten in meta-Stellung in bezug auf R¹; R³ = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder -OR&sup4; (mit der Maßgabe, daß R² von -OR&sup4; verschieden ist);
R&sup4; = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen);
R&sup5; = Wasserstoff oder Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen),
-CH&sub2;COOH, -C&sub6;H&sub5;COOH oder -C&sub6;H&sub5;SO&sub3;H; und R&sup6; = Wasserstoff, Alkyl (mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder -CH&sub2;COOH.
13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), worin n = 1, R¹ = OH, R² = -CH&sub2;-O-, und R³ Wasserstoff oder Brazilan, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen die Schritte umfaßt, die bestehen aus:
Schützen des Brazilins an seinen phenolischen Hydroxylen,
Transformieren des alkoholischen Hydroxyls in eine Gruppe, die seine Eliminierung ermöglicht, und
Reduzieren und Entschützen des erhaltenen Produkts.
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