DE69201472T2

DE69201472T2 - Verhinderung der von Osteoklasten verursachten Knochenresorption durch Verwendung von substituierten Phenylderivaten.

Info

Publication number: DE69201472T2
Application number: DE69201472T
Authority: DE
Inventors: Melissa S Egbertson; Robert J Gould; George D Hartman
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1991-08-09
Filing date: 1992-08-05
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2012-08-06
Also published as: CA2075612A1; JPH0656663A; EP0528587A1; EP0528587B1; JPH0747537B2; US5204350A; DE69201472D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine Anwendung zur Hemmung der Knochenresorption, die durch die Wirkung einer Klasse von Zellen ausgelöst wird, die als Osteoklasten bekannt sind und Verbindungen umfaßt, die mit den Osteoklasten um die Osteoklasten-Aktivitätsstellung konkurrieren.
Osteoklasten sind vielkernige Zellen mit einem Durchmesser bis zu 400 um, die in Vertebraten mineralisiertes Gewebe (hauptsächlich Calciumcarbonat und Calciumphosphat) resorbieren. Sie sind aktiv bewegliche Zellen, die entlang der Knochenoberfläche wandern. Sie können an Knochen binden, die notwendigen Hilfsstoffe und Protease sezernieren und dadurch die eigentliche Resorption von mineralisiertem Gewebe aus dem Knochen verursachen.
Erfindungsgemäß werden N-Heterocycloalkyl-substituierte Phenylderivate zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Knochenresorptionsaktivität von Säuger-Osteoklasten verwendet. Diese Verbindungen besitzen die allgemeine Strukturformel
worin
n eine ganze Zahl von 0 bis 6 bedeutet;
Y ausgewählt wird aus
O,
SO&sub2;,
-CONH-,
-NHCO-,
CH&sub2; oder
O
-C-;
R¹ für ein unsubstituiertes oder substituiertes gesättigtes mono- oder polycyclisches heterocyclisches Ringsystem steht, das 1, 2 oder 3 Heteroatome aufweist, worin die genannten Heteroatome ausgewählt sind aus O, N oder S und worin die genannten Substituenten unabhängig ausgewählt sind aus R²;
R² für folgendes steht:
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,
Aryl-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,
Hydroxy-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,
C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyloxy-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,
Carboxy-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,
Oxo,
Halogen,
CF&sub3;,
C&sub0;&submin;&sub4;-Alkylamino-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl oder
C&sub0;&submin;&sub4;-Dialkylamino-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl;
R³ für folgendes steht:
Wasserstoff,
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,
Hydroxy-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,
C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyloxy-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,
Carboxy-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,
Halogen oder
CF&sub3;;
R&sup4; für folgendes steht:
Wasserstoff,
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,
Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl oder
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylcarbonyloxymethyl; und
R&sup5; für folgendes steht:
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,
Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl oder
Heterocyclyl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,
und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind diejenigen, die anhand der allgemeinen nachfolgend gezeigten Strukturformel definiert sind
worin
n eine ganze Zahl von 0 bis 6 bedeutet;
Y ausgewählt wird aus
O,
-NHCO-,
-CONH- oder
CH&sub2;;
R¹ für ein unsubstituiertes oder substituiertes 5- oder 6gliedriges heterocyclisches Ringsystem steht, das 1, 2 oder 3 Heteroatome aufweist, worin die genannten Heteroatome unabhängig ausgewählt sind aus O und N und worin die genannten Substituenten für C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Aryl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy oder Oxo stehen,
R² und R³ unabhängig für
Wasserstoff,
C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,
Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,
Hydroxy-C&sub0;&submin;&sub2;-alkyl,
C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-C&sub0;&submin;&sub2;-alkyl
Carboxy-C&sub0;&submin;&sub3;-alkyl stehen oder
Oxo stehen;
R&sup4; für
H oder
C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl steht;
und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.
Eine mehr bevorzugte erfindungsgemäße Gruppe von Verbindungen sind diejenigen, die die allgemeine nachstehend gezeigte Strukturformel besitzen
worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet;
y ausgewählt ist aus O, -NHCO-, -CONH- oder CH&sub2;;
R¹ für einen unsubstituierten oder substituierten 5- oder 6gliedrigen heterocyclischen Ring steht, der 1 oder 2 Heteroatome aufweist, worin das genannte Heteroatom für N steht, und worin die genannten Substituenten C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, Hydroxy oder Oxo bedeuten; und
R² für C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl steht;
und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.
Die Verbindungen sind zur Behandlung von Geflugel und Säugern einschließlich des Menschen geeignet.
Die derzeitigen Hauptknochenerkrankungen von allgemeinem Interesse sind Osteoporose, maligne Hypercalcämie, Osteopenie aufgrund von Knochenmetastasen, Paradontal-Erkrankung, Hyperparathyroidismus, periartikuläre Erosionen bei rheumatoider Arthritis, Paget-Krankheit, Osteopenie, ausgelöst durcg eine Immobilisierung, und Glucocorticoid-Behandlung.
Alle diese Zustände sind gekennzeichnet durch einen Knochenverlust, der sich aus einem Ungleichgewicht zwischen Knochenresorption (Abbau) und Knochenbildung entwickelt, das während des ganzen Lebens mit einer Geschwindigkeit von etwa 14 % pro Jahr im Durchschnitt anhält. Jedoch unterscheidet sich die Geschwindigkeit des Knochenumsatzes von Ort zu Ort, beispielsweise ist sie in dem Trabekelknochen der Wirbel und den Alveolarknochen in den Kiefern höher als in den Kortizes der langen Knochen. Der potentielle Knochenverlust ist direkt an den Umsatz gekoppelt und kann in den Wirbeln unmittelbar im Anschluß an die Menopause über 5 % pro Jahr betragen, ein Zustand, der zu einem erhöhten Frakturrisiko führt.
Derzeit leben in den USA 20 Millionen Menschen mit nachweisbaren Frakturen der Wirbel aufgrund von Osteoporose. Zusätzlich kommen 250 000 Hüftfrakturen pro Jahr vor, die der Osteoporose zugeschrieben werden und mit einer 12%igen Mortalitätsrate innerhalb der ersten 2 Jahre einhergehen. 30 % der Patienten sind nach dem Bruch auf ein Pflegeheim angewiesen.
Sämtliche oben aufgeführten Zustände würden von einer Behandlung mit Mitteln profitieren, die die Knochenresorption hemmen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Säugern bereitgestellt, die an einem Knochenzustand leiden, der durch eine verstärkte Knochenresorption verursacht oder ausgelöst worden ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen einschließlich der pharmazeutisch verträglichen Salze davon hemmen die Aktivität der Säuger-Osteoklasten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Bezeichnung "pharmazeutisch verträgliche Salze" soll nichttoxische Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnen, die im allgemeinen durch Umsetzung der freien Base mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Beispielhafte Salze umfassen die folgenden Salze:
Acetat
Benzolsulfonat
Benzoat
Bicarbonat
Bisulfat
Bitartrat
Borat
Bromid
Calcium-EDTA
Camsylat
Carbonat
Chlorid
Clavulanat
Citrat
Dihydrochlorid
Edetat
Edisylat
Estolat
Esylat
Fumarat
Gluceptat
Gluconat
Glutamat
Glycollylarsanilat
Hexylresorcinat
Hydrabamin
Hydrobromid
Hydrochlorid
Hydroxynaphthoat
Iodid
Isothionat
Lactat
Lactobionat
Laurat
Malat
Maleat
Mandelat
Mesylat
Methylbromid
Methylnitrat
Methylsulfat
Mucat
Napsylat
Nitrat
Oleat
Oxalat
Pamoat
Palmitat
Pantothenat
Phosphat/Diphosphat
Polygalacturonat
Salicylat
Stearat
Subacetat
Succinat
Tannat
Tartrat
Teoclat
Tosylat
Triethiodid
Valerat
Zusätzlich eingeschlossen sind geeignete Kationen, wie Alkalimetall- und Erdalkalimetallkationen.
Die Bezeichnung "pharmakologisch wirksame Menge" soll diejenige Menge eines Arzneimittels oder pharmazeutischen Mittels bezeichnen, die eine biologische oder medikamentöse Reaktion eines Gewebes, Systems oder eines Tieres, das von einem Forscher oder Kliniker untersucht wird, hervorruft.
Die Bezeichnung "Knochenresorptionsaktivität" soll den Prozeß bezeichnen, durch den die Osteoklasten Knochenmineralien solubilisieren und die Aktivität von Enzymen verstärken, die die Knochenmatrix abbauen.
Die Bezeichnung "Alkyl" soll gradkettiges oder verzweigtes Alkan, Alken oder Alkin bezeichnen, mit einem oder mehreren Graden einer Nichtsättigung an irgendeiner Position.
In den Schemata und Beispielen nachstehend besitzen verschiedene Reagenzsymbole die folgenden Bedeutungen:
Die Bezeichnung "Oxo" soll - - bedeuten.
Die Bezeichnung "Heterocyclyl" soll ein 5- oder 6gliedriges mono- oder polycyclisches Ringsystem bezeichnen, das 1, 2, 3 oder 4 Heteroatome, ausgewählt aus O, N oder S, enthält.
Die Bezeichnung "Halogen" soll F, Cl, Br oder I bedeuten.
Die Bezeichnung "Aryl" soll Phenyl oder Benzyl bedeuten.
BOC: t-Butoxycarbonyl
Pd-C: Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator
DMF: Dimethylformamid
DMSO: Dimethylsulfoxid
CBZ: Carbobenzyloxy
EtOAc: Ethylacetat
THF: Tetrahydrofuran
HOAc: Essigsäure
CHCl&sub3;: Chloroform
MeOH: Methanol
CH&sub3;CN: Acetonitril
TFA: Trifluoressigsäure
BOP: Benzotriazol-4-yl-oxy-tris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorphosphat
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in solchen oralen Dosierungsformen, wie Tabletten, Kapseln (die jeweils Formulierungen zur verzögerten oder zeitlich festgelegten Freisetzung umfassen), Pillen, Pulver, Granulate, Elixiere, Tinkturen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen, verabreicht werden. Gleichermaßen können sie auch in einer intravenösen (Bolus oder Infusion), intraperitonealen, subkutanen oder intramuskulären Form verabreicht werden, die alle Anwendungsformen anwenden, die einem Fachmann mit den üblichen Kenntnissen gut bekannt sind.
Der Dosierungsplan, der bei den erfindungsgemäßen Verbindungen angewendet wird, wird gemäß einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich von Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, Schwere des zu behandelnden Zustandes, des Verabreichungsweges, der Nieren- und Leberfunktion des Patienten und einschließlich der bestimmten Verbindung oder des Salzes davon, die eingesetzt werden. Ein Arzt oder Tierarzt mit den üblichen Kenntnissen kann leicht die wirksame Menge des Arzneimittels, die zur Prävention, Gegensteuerung oder zum Stillstand des Fortschrittes des Zustandes erforderlich ist, bestimmen und verschreiben.
Die erfindungsgemäßen oralen Dosierungen liegen, wenn sie für die angegebenen Wirkungen verwendet werden, im Bereich zwischen etwa 0,01 mg pro kg Körpergewicht pro Tag (mg/kg/Tag) bis etwa 100 mg/kg/Tag und vorzugsweise im Bereich zwischen 1,0-100 mg/kg/Tag und am meisten bevorzugt im Bereich zwischen 1,0 bis 20 mg/kg/Tag. Intravenös liegen die am meisten bevorzugten Dosen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 mg/kg/min bei konstanter Infusionsgeschwindigkeit. Zweckmäßigerweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer einzigen täglichen Dosis verabreicht werden, oder die gesamte Tagesdosis kann in aufgeteilten Dosen von 2-, 3- oder 4mal täglich verabreicht werden. Außerdem können die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen in intranasaler Form über die topische Anwendung von geeigneten intranasalen Vehikeln oder über transdermale Routen unter Anwendung derjenigen Formen von transdermalen Hautpflastern, die dem Fachmann mit den in dieser Technik üblichen Kenntnissen gut bekannt sind, verabreicht werden. Um in Form eines transdermalen Abgabesystems verabreicht zu werden, erfolgt die Dosisverabreichung während des gesamten Dosierungsplanes natürlich kontinuierlich statt stufenweise.
Bei der erfindungsgemäßen Anwendung können die hier aus führlich beschriebenen Verbindungen den aktiven Bestandteil bilden und werden typischerweise in einem Gemisch zusammen mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen oder Trägerstoffen (msgesamt hier als "Träger"- Materialien bezeichnet) verabreicht, die zweckmäßigerweise im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsform ausgewählt werden, d.h. als orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen, die mit den herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken im Einklang stehen.
Beispielsweise kann die aktive Arzneimittelkomponente zur oralen Verabreichung in Form als Tablette oder Kapsel mit einem oralen nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen inerten Trägerstoff kombiniert werden, wie Lactose, Stärke, Saccharose, Glucose, Methylcellulose, Magnesiumstearat, Calciumphosphat, Calciumsulfat, Mannit, Sorbit und dergleichen. Zur oralen Verabreichung in flüssiger Form kann die orale Arzneimittelkomponente mit irgendeinem oralen nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen inerten Trägerstoff kombiniert werden, wie Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen. Außerdem können, wenn gewünscht oder wenn notwendig, auch geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallshilfen und Farbstoffe in das Gemisch eingearbeitet werden. Geeignete Bindemittel umfassen Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie Glucose oder beta-Lactose, Maissüßstoffe, natürliche und synthetische Gummen, wie Akaziengummi, Tragacanth oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dergleichen. Die in diesen Dosierungsformen verwendeten Gleitmittel umfassen Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen. Zerfallshilfen umfassen ohne Einschränkung Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Form von Liposom-Abgabesystemen verabreicht werden, wie in Form kleiner unilamellarer Vesikel, großer unilamellarer Vesikel und als multilamellare Vesikel. Liposome können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, wie Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch unter Verwendung monoklonaler Antikörper als individuelle Träger, an die die Verbindungsmoleküle gekuppelt sind, verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch mit löslichen Polymeren als auf ein Ziel einstellbare Arzneimittelträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, ein Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxid- Polylysin, substituiert mit Palmitoylresten, umfassen. Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren gekoppelt werden, die zum Erzielen einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneimittels geeignet sind, beispielsweise mit Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymeren von Polymilchsäure und Polyglycolsäure, Poly-epsilon-Caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoestern, Polyacetalen, Polydihydropyranen, Polycyanoacrylaten und vernetzten oder amphipathischen Blockcopolymeren von Hydrogelen.
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen wurden gemäß den Verfahren der folgenden Schemata und Beispiele hergestellt, wobei die geeigneten Materialien verwendet werden, und werden anhand der folgenden speziellen Beispiele weiter erläutert. Die am meisten bevorzugten Verbindungen sind irgendwelche oder sämtliche von denjenigen, die in diesen Beispielen speziell aufgeführt sind. Diese Verbindungen sollen jedoch nicht dazu gedacht sein, die einzige Gattung, die als erfindungsgemäß betrachtet wird, darzustellen. Irgendeine Kombination der Verbindungen oder ihrer Gruppierungen kann selbst eine Gattung bilden. Die folgenden Beispielen geben ferner ausführliche Angaben zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen. Fachleute verstehen leicht, daß bekannte Variationen der Bedingungen und Verfahren der folgenden präparativen Verfahren angewendet werden können, um diese Verbindungen herzustellen. Sämtliche Temperaturen sind, wenn nicht anders angegeben, in ºC angegeben. SCHEMA 1

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel dient Erläuterungszwecken und als Referenz für die anschließenden Beispielen, die die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen beschreiben.

2-5-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(3-t-butylaminopropyloxy)-phenyl]-propionsäure (1-2)

Verbindung 1-1, 0,4 g, 1,1 mmol, wurde in t-Butylamin (20 ml) und Acetonitril (20 ml) 3 Tage lang unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgelöst und mit Ether extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde sodann auf pH 4-5 angesäuert, und es bildete sich ein Niederschlag. Der Feststoff wurde gesammelt und getrocknet, so daß sich 1-2 ergab.
Rf = 0,8 in 9:1 EtOH/NH&sub4;OH, Ninhydrin-Anfärbung.
300 MHz ¹H NMR (D&sub2;O + NaOH)δ 7,4 (bs, 2H), 7,2 (bs, 4H), 6,85 (d, J = 8,55, 2H), 5,2 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 5,0 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 4,3 (dd, J = 4,0, 9,6 Hz, 1H), 4,0 (bs, 2H), 3,2 (dd, J = 4,0, 13,6 Hz, 1H), 2,8 (dd, J = 9,6 Hz, 13,6 Hz, 1H), 2,65 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,8 (m, 2H), 1,09 (s, 9H), Massenspektr. (FAB) m/e = 429 (m + 1)
C-, H-, N-Analyse C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub5; 0,65 H&sub2;O
MW = 440,244 berechnet C = 65,47, H = 7,62, N = 6,36
gefunden C = 65,52, H = 7,54, N = 6,27

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel dient Erläuterungszwecken und als Referenz für die anschließenden Beispiele, die die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen beschreiben.

2-S-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(3-chlorpropyloxy-phenyl-propionsäure (1-1)

N-CBZ-Tyrosin (3 g, 9,9 mmol) (Bachem Chemical Supply, California) wurde in DMF aufgelöst und mit NaH (50%ige Dispersion in Öl, 0,95 g, 19,8 mmol) 1 Stunde lang behandelt. Anschließend wurde 1,3-Bromchlorpropan (1 ml, 9,9 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch 16 Stunden lang gerührt. DMF wurde in vacuo entfernt und der Rückstand in Wasser aufgelöst, auf pH 3 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Schicht wurde mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Die Säulenchromatographie (SiO&sub2;, 97:3:1 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/HOAc), ergab 1-1 als gelbes Öl.
Rf = 0,3 in 97:3:1 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/HOAc, Ninhydrin-Anfärbung.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,3 (bs, 5H), 7,03 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 6,8 (d, J = 8,3, 2H), 5,2 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,05 (bs, 2H), 4,65 (m, 1H), 4,05 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,73 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,1 (m, 2H), 2,2 (m, 2H). BEISPIEL 3
2-5-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(3-N-pyrolidinylpropyloxy)-phenyl]-propionsäure (1-4)
Die 3tägige Behandlung von Verbindung 1-1 mit Pyrrolidin in CH&sub3;CN unter Rückfluß lieferte rohes 1-4. Dieses wurde durch Flash-Chromotagraphie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 9:1:1 EtOH/H&sub2;O/NH&sub4;OH eluiert wurde, um reines 1-4 zu ergeben (Rf = 0,81, Ninhydrin-Anfärbung).
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,3 (bs, 5H), 7,0 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 6,7 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,5 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 5,0 15 (bs, 2H), 4,5 (m, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,75 (bs, 1H), 3,4 (m, 2H), 3,18 (t, J = 8,5 Hz, 2H), 3,1 (bs, 2H), 2,8 (bs, 1H), 2,2-1,8 (m, 6H).
C-, H-, N-Analyse C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub0;N&sub2;O&sub5; 0,25CH&sub2;Cl&sub2;
berechnet C, 65,05; H, 6,87; N, 6,26
gefunden C, 65,28; H, 6,78; N, 6,27.

BEISPIEL 4

2-S-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(4-piperazinyl)- butyloxyphenyl]-propionsäure (1-7)

Die Behandlung von N-CBZ-L-Tyrosin mit Natriumhydrid in DMF und anschließend mit 1,4-Dibrombutan, wie zur Herstellung von 1-1 beschrieben, lieferte das entsprechende Butyl-Analogon. Die 3tägige Behandlung von diesem mit 1,4-Piperazin in rückflußkochendem Acetonitril ergab rohes 1-7 als Niederschlag aus dem Reaktionsgemisch. Die Reinigung durch Reversephase-HPLC ergab reines 1-7.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 7,3 (m, 5H), 7,23 (d, 2H), 6,83 (d, 2H), 5,0 (bs, 2H), 4,35 (dd, 1H), 4,0 (t, 2H), 3,6 (bs, 8H), 3,1 (dd, 1H), 2,85 (dd, 1H), 2,00-1,8 (m, 4H). C-, H-, N-Analyse C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub5; 1,2H&sub2;O
MW = 491,206
berechnet: C, 63,57; H, 7,67; N, 8,56
gefunden: C, 63,33; H, 7,28; N, 8,55. BEISPIEL 5

2-S-(N-Benzyloxycarbonyl)-3-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)- propyloxyphenyl]-propansäure (1-9)

Die Behandlung von 1-1 mit N-Methylpiperazin, wie für 1-2 beschrieben, ergab rohes 1-9. Dieses wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 9:1:1 C&sub2;H&sub5;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH eluiert wurde, so daß sich reines 1-9 als TFA-Salz ergab.
¹H NMR (300 MHz, D&sub2;O) δ 7,5 (3H, m), 7,4 (2H, d), 7,0 (2H, d), 5,18 (1H, d), 5,05 (1H, d), 4,5 (1H, m), 4,2 (2H, t), 3,8 (8H, s), 3,6 (2H, t), 3,3 (1H, m), 3,1 (3H, s), 3,0 (1H, m), 2,4 (2H, m).
Analyse für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub3;N&sub3;O&sub5; 2,3CF&sub3;CO&sub2;H
berechnet: C, 49,52; H, 4,96; N, 5,85
gefunden: C, 49,42; H, 4,98; N, 6,01. BEISPIEL 6
2-S-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(4-piperazin-1-yl)pentyloxyphenyl]-propionsäure (1-11)
1-10 (0,658 g, 1,42 mmol) wurde in 30 ml CH&sub3;CN aufgelöst, und 1,4-Piperazin (1,22 g, 14,16 mmol) wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 4 Tage lang gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand trocken auf eine Kieselgelsäule gepackt und mit 18:1:1 C&sub2;H&sub5;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH eluiert, so daß sich reines 1-11 als farbloser Feststoff ergab.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 1,52 (4H, m), 1,77 (2H, m), 2,40 (2H, t), 2,59 (4H, m), 2,80-2,94 (1H, m), 3,01-3,12 (5H, m), 3,94 (2H, m), 4,21 (1H, m), 6,76 (2H, d), 7,09 (2H, d).
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub5; 1,2H&sub2;O
berechnet: C, 63,57; H, 7,67; N, 8,56
gefunden: C, 63,33; H, 7,28; N, 8,55.

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel dient Erläuterungszwecken und als Referenz für die folgenden Beispiele, die die Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen beschreiben.

2-S-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(6-N-t-butyloxycarbonylaminohexyloxy)-phenyl]-propionsäure (2-1)

N-CBZ-L-Tyrosin (15,0 g, 0,045 mol) wurde in 75 ml DMF aufgelöst und bei 0-10 ºC zu einer Suspension von Natriumhydrid (2,16 g, 0,09 mol) in (-SOUTH-) gegeben. Die resultierende Suspension wurde bei 0-10 ºC 1,0 Stunden lang gerührt, und anschließend wurde 6-(N-t-Butyloxycarbonylamino)-hexylbromid (12,6 g, 0,045 mol) in 25 ml DMF tropfenweise bei 0-5 ºC zugegeben, und das klare dunkle Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.
Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in EtOAc aufgenommen, und dieses wurde mit 10 % KHSO&sub4;-Lösung angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel entfernt, so daß sich ein Öl ergab. Dieses wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 98:2:1 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/HOAc eluiert wurde, so daß sich 2-1 als klares Öl ergab.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 1,45 (15H, m), 1,75 (2H, m), 2,80-3,15 (6H, m), 3,91 (2H, t), 4,38 (1H, m), 4,95 (6H, m), 6,79 (2H, d), 7,10 (2H, d), 7,28 (5H, m).

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel dient Erläuterungszwecken, da es in den folgenden Beispielen, die die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen beschreiben, als Referenz genannt wird.

2-5-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(6-aminohexyloxy-phenyl]- propionsäure-Hydrochlorid (2-2)

Verbindung 2-1 (51,4 mg, 0,1 mmol) wurde in 20 ml EtOAc aufgelöst und unter N&sub2; auf -20 ºC abgekühlt. HCl-Gas wurde 10 Minuten lang durch diese Lösung hindurchgeleitet, während die Temperatur auf -5ºC anstieg. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Stopfen verschlossen und bei 0 bis -5 ºC 1 Stunde lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand mit Ether verrieben, so daß sich 2-2 als farbloser Feststoff ergab. Rf = 0,4 (SiO&sub2;, 9:1:1 EtOH/NH&sub4;OH/H&sub2;O).
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 1,45 (6H, m), 1,73 (4H, m), 2,90 (3H, m), 3,13 (1H, m), 3,95 (2H, m), 4,30 (1H, bs), 6,77 (2H, d), 7,10 (2H, d), 7,32 (4H, m).
Analyse für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub1;N&sub2;O&sub5;Cl 0,5H&sub2;O
berechnet: C, 60,05; H, 7,01; N, 6,09
gefunden: C, 60,08; H, 7,06; N, 6,09.

BEISPIEL 9

2-S-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4-(8-N-t-butyloxycarbonylaminooctyloxy)-phenyl]-propionsäure (2-5)

N-CBZ-L-Tyrosin H&sub2;O (1,5 g, 4,29 mmol) wurde in EtOAc/CH&sub2;Cl aufgelöst, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde in DMF aufgelöst und mit NaH (50%ige Dispersion in Öl, 0,43 g, 8,96 mmol) 1 Stunde lang behandelt. N-BOC-8-Amino-1-bromoctan (1,33 g, 4,34 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 16 Stunden lang gerührt. DMF wurde in vacuo entfernt, der Rückstand in Wasser aufgelöst, auf pH 3 angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc-Schichten wurden vereinigt, getrocknet und konzentriert. Die Säulenchromatographie (SiO&sub2;, 97:3:1 CHCl&sub3;/MeOH/HOAc) ergab 2-5.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 7,3 (m, 5H), 7,1 (d, 2H), 6,78 (d, 2H), 5,0 (2g, 2H), 4,38 (dd, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,13 (dd, 1H), 3,0 (t, 2H), 2,85 (dd, 1H), 1,75 (m, 2H), 1m4 (s, 9H), 1,35 (m, 3H), 1,3 (bs, 7H). SCHEMA 2 Dioxan Oxalyl BEISPIEL 10

2-(4-N-t-Butyloxycarbonylpiperidin-4-yl)-ethanol (2-10)

4-Piperidin-2-ethanol (erhältlich von Aldrich) (130 g, 1,0 mol) wurde in 700 ml Dioxan aufgelöst, auf 0 ºC abgekühlt und mit 3 N NaOH (336 ml, 1,0 mol) und Di-t-Butylcarbonat (221,8 g, 1,0 mol) behandelt. Das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit Ether extrahiert. Die etherischen Schichten wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft, so daß sich 2-10 ergab.
Rf = 0,37 in 1:1 EtOAc/Hexanen, Ninhydrin-Anfärbung.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 4,07 (bs, 2H), 3,7 (bs, 2H), 2,7 (t, J = 12,5 Hz, 2H), 1,8-1,6 (m, 6H), 1,51 (s, 9H), 1,1 (ddd, J = 4,3, 12,5, 12 Hz, 2H). BEISPIEL 11

DMSO, Oxalylchlorid Carbomethoxymethylentriphenylphosphoran

Methyl-4-(4-N-t-Butyloxycarbonylpiperidin-4-yl)- but-2-enoat (2-11)

Oxalylchlorid (55,8 ml, 0,64 mol) wurde in 1 l CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst und unter N&sub2; auf -78 ºC abgekühlt. DMSO (54,2 ml, 0,76 mol) wurde tropfenweise hinzugegeben. Nach Beendigung der Gasentwicklung wurde 2-10 (102,5 g, 0,45 mol), aufgelöst in 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;, im Verlauf von 20 Minuten zugegeben. Nach Rühren für weitere 20 Minuten wurde Triethylainin (213 ml, 1,53 mol) tropfenweise hinzugegeben und das Kältebad entfernt. Nach 1 1/2 Stunden zeigte TLC, daß das Ausgangsmaterial verschwunden war. Carbomethoxytriphenylphosphoran (179 g, 0,536 mol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit 300 ml Et&sub2;O verdünnt, einmal mit 800 ml H&sub2;O, zweimal mit 300 ml 10 % KHSO&sub4;-Lösung, anschließend einmal mit 300 ml Salzlösung extrahiert. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Säulenchromatographie (SiO&sub2;, 5 % EtOAc/Hexane) ergab reines 2-11.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 6,9 (ddd, J = 15,6, 7,6, 7,6 Hz, 1H), 5,8 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 4,0 (bs, 2H), 3,7 (s, 3H), 2,6 (t, J = 12,6 Hz, 2H), 2,1 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,7-1,4 (m, 3H), 1,4 (s, 9H), 1,1 (m, 2H). BEISPIEL 12

4-(4-N-t-Butyloxycarbonylpiperidin-4-yl)butylbromid (2-12)

Verbindung 2-11 (36,2 g, 0,128 mol) wurde in 500 ml EtOAc aufgelöst. 10 % Palladium-auf-Kohle (10 g) wurde als Aufschlämmung in EtOAc zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter H&sub2; belassen (unter einem Luftballon). Das Reaktionsgemisch wurde über Solka-Floc filtriert, der Kuchen mit EtOAc gewaschen und das Ethylacetat eingedampft, so daß sich 4-(-N-t-Butyloxycarbonylpiperidin-4-yl)-butanoat ergab. TLC Rf = 0,69 in 30 % EtOAc/Hexane.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 4,0 (bs, 2H), 3,6 (s, 3H), 2,60 (t, J = 12,3 Hz, 2H), 2,20 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,6 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,40 (m, 1H), 1,20 (m, 2H), 1,0 (m, 2H).
Der Butanoatester (45,3 g, 0,159 mol) wurde in CH&sub3;OH aufgelöst und über Nacht mit 1 N NaOH (500 ml, 0,5 mol) behandelt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt, Wasser wurde zugegeben, die Lösung mit Ether gewaschen und anschließend mit 10%iger KHSO&sub4;-Lösung angesäuert. Die wäßrige Schicht wurde mit Ether gewaschen, die etherischen Schichten wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, so daß sich die entsprechende Säure als klares Öl ergab.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 4,0 (bs, 2H), 2,6 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 1,6 (bs, 4H), 1,4 (s, 9H), 1,3-0,9 (9H).
Diese Säure (20,4 g, 0,077 mol) wurde mit Boran (BH&sub3;/THF, 235 ml, 235 mmol) in THF bei 0 ºC 1 Stunde lang behandelt. NaOH (1N, 250 ml) wurde tropfenweise hinzugegeben und die Lösung über Nacht gerührt. Das Reaktionsgeinisch wurde konzentriert, um THF zu entfernen, mit Ether extrahiert, die etherischen Extrakte wurden vereinigt, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft, so daß sich der entsprechende Alkohol als farbloses Öl ergab.
Rf = 0,7 in 2:1 Ethylacetat/Hexane.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 4,1 (bs, 2H), 3,6 (t, 2H), 2,65 (t, 2H), 2,1 (bs, 1H), 1,65 (bs, 2H), 1,55 (m, 2H), 1,4 (s, 9H), 1,35 (m, 3H), 1,25 (m, 2H), 1,1 (m, 2H).
Dieser Alkohol (19,7 g, 76,5 mmo1) wurde in THF aufgelöst und mit Triphenylphosphin (23,1 g, 88 mmol) behandelt und auf 0 ºC abgekühlt. Tetrabromkohlenstoff (29,8 g, 89,9 mmol) wurde aufeinmal hinzugeben, das Kältebad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Zusätzliches Triphenylphosphin (11,71 g) und Kohlenstofftetrabromid (14,9 g) wurden zugegeben, um die Reaktion bis zur Vollständigkeit voranzutreiben. Das Gemisch wurde filtriert und die Flüssigkeit mit Ether verdünnt und erneut filtriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde die resultierende Flüssigkeit auf SiO&sub2; adsorbiert und mit 5 % EtOAc/Hexanen eluiert, so daß sich 2-12 als klares farbloses Öl ergab.
Rf = 0,6 in 1:4 Ethylacetat/Hexane
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 4,1 (bs, 2H), 3,4 (t, 2H), 2,65 (t, 2H), 1,85 (m, 2H), 1,65 (bd, 2H), 1,4 (s, 9H), 1,35 (m, 2H), 1,3 (m, 3H), 1,1 (m, 2H). BEISPIEL 13

2-5-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4- (4-N-t-butyloxycarbonylpiperidin-4-yl-butyloxy)- phenyl]-propionsäure (2-13)

N-CBZ-L-Tyrosin wurde mit 2-12, wie für die Verbindungen 2-5 in Beispiel 9 gelehrt, alkyliert, um 2-13 bereitzustellen.
Rf = 0,15 in 97:3:1 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/HOAc, Iod-Anfärbung.
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 7,2 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,1 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,0 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 6,8 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 5,2 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,1 (s, 2H), 4,6 (m, 1H), 4,01 (bd, 2H), 3,92 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,7 (m, 2H), 2,65 (bt, 7H), 1,75-1,4 (m, 7H), 1,45 (s, 9H), 1,3 (m, 2H), 1,1 (m, 2H). BEISPIEL 14

2-5-(N-Benzyloxycarbonylamino)-3-[4(4-piperidin-4-yl- butyloxy)-phenyl]-propionsäure (2-14)

Verbindung 2-13 wurde, wie für Verbindung 2-2 in Beispiel 8 gelehrt, von der Schutzgruppe befreit. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst und mit Ethylacetat extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde zur Trockene konzentriert, eingedampft, und der Rückstand wurde chromatographiert (SiO&sub2;, 9:1:1 EtOH/H&sub2;O/NH&sub4;OH). Ein kleiner Teil wurde sodann noch durch HPLC gereinigt und als TFA-Salz isoliert.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 7,3 (m, 5H), 7,1 (d, 2H), 6,8 (d, 2H), 5,0 (g, 2H), 2,93 (t, 2H), 2,85 (dd, 1H), 1,92 (bd, 2H), 1,75 (m, 2H), 1,6-1,45 (m, 3H), 1,35 (m, 4H).
Massen-Spektrum (FAB) m/e = 455 (m + 1). SCHEMA 3 BEISPIEL 15

2-S-Amino-3-[4-(4-N-t-butyloxycarbonyl- piperidin-4-yl)-butyloxyphenyl]-propionsäure (5-1)

2-13 (2,0 g) wurde in 100 ml EtOH aufgelöst und mit 0,2 g 10 % Pd/C beschickt. Diese Suspension wurde über Nacht unter Ballondruck hydriert. Die Entfernung des Lösungsmittels lieferte 5-1 als farblosen Feststoff.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 0,97-1,12 (2H, m), 1,20-1,54 (14H, m), 1,72 (4H, m), 2,71 (2H, m), 2,90-3,00 (1H, m), 3,22 (1H, dd), 3,30 (1H, m), 3,71 (1H, m), 3,95-4,10 (4H, m), 6,88 (2H, 15 d), 7,21 (2H,d). BEISPIEL 16

2-5-(Pentanoylamino)-3-[4-(4-N-t-butyloxycarbonylpiperidin-4-yl)-butyloxyphenyl]propansäure (5-2)

5-1 (1,05 g, 2,5 mmol) wurde zu einer kalten Lösung von 1 N NaOH (2,5 ml) in 20 ml H&sub2;O gegeben und bei 0-10º 5 Minuten lang gerührt, so daß sich eine klare Lösung ergab. Anschließend wurde Pentanoylchlorid (0,332 g, 2,75 mmol) tropfenweise zugegeben, gefolgt von NaHCO&sub3; (0,231 g, 2,75 mmol), und das resultierende Gemisch wurde kräftig 1 Stunde lang bei 0-10º gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit H&sub2;O (75 ml) verdünnt, mit 10 % KHSO&sub4; auf pH 2-3 angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Dieser Extrakt wurde filtriert, mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel entfernt, so daß sich ein Öl ergab. Dieses wurde durch Flash-Chromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 97:3:1 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/HOAc eluiert wurde, um reines 5-2 als klares Öl zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 0,90 (3H, t), 1,20-1,62 (16H, m), 1,72 (2H, m), 2,14 (2H, m), 2,30 (8H, m), 2,65-2,90 (4H, m), 3,30 (1H, m), 3,93 (2H, m), 4,61 (1H, m), 6,81 (2H, d), 7,12 (2H, d). BEISPIEL 17

2-5-(Pentanoylamino)-3-[4-(4-piperidinylbutyloxy)-phenyl]-propionsäurehvdrochlorid (5-3)

5-2 (0,449 g) wurde in 30 ml EtOAc aufgelöst und mit HCl-Gas bei -10º, wie für 2-2 beschrieben, behandelt. Der resultierende Feststoff wurde mit 40 ml Et&sub2;O behandelt, so daß sich reines 5-3 als farbloser Feststoff ergab.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 0,85 (3H, t), 1,19 (2H, m), 1,30- 1,65 (9H, m), 1,73 (2H, m), 1,95 (2H, m), 2,15 (2H, m), 2,80- 3,02 (3H, m), 3,14 (1H, dd), 3,30-3,40 (3H, m), 3,95 (2H, t), 4,61 (1H, m), 6,82 (2H, d), 7,13 (2H, d).
Analyse für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub4; HCl 0,75H&sub2;O
berechnet: C = 60,77, H = 8,54, N = 6,16
gefunden: C = 60,97, H = 8,39, N = 6,06. BEISPIEL 18

2-5-(Hexanoylainino)-3-[4-(4-N-t-butyloxycarbonylpiperidin-4-yl)-butyloxyphenyl)- propionsäure (5-4)

5-1 (0,41 g) wurde mit Hexanoylchlorid (0,21 ml, 1,50 mmol), wie für 5-2 beschrieben, behandelt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie über Kieselgel gereinigt, wobei mit 97:3:1 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/HOAc eluiert wurde, um reines 5-4 zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 0,85 (3H, t), 0,97-1,35 (8H, m), 1,37-1,53 (12H, m), 1,60-1,80 (4H, m), 2,13 (2H, t), 2,80 (2H, m), 2,85 (1H, m), 3,12 (1H, dd), 3,90 (2H, t), 4,04 (2H, d), 4,62 (1H, m), 6,80 (2H, d), 7,12 (2H, d). BEISPIEL 19

2-8-(Hexanoylamino)-3-[4-(4-piperidin-4-ylbutyloxy)-phenyl]-propionsäure (5-5)

5-4 (0,199 g) wurde in 25 ml EtOAc aufgelöst und mit HCl-Gas, wie für Verbindung 2-2 beschrieben, behandelt, um reines 5-5 zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, CD&sub3;OD) δ 0,84 (3H, t), 1,08-1,20 (4H, m), 1,35 (4H, m), 1,52 (4H, m), 1,77 (2H, m), 1,92 (2H, d), 2,16 (2H, t), 2,80-3,2 (3H, m), 3,15 (1H, dd), 3,40-3,52 (2H, m), 3,92 (2H, t), 4,61 (1H, m), 6,81 (2H, d), 7,13 (2H, d).
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub9;N&sub2;O&sub6;F&sub3; 0, 55 H&sub2;O 0, 30TFA
berechnet: C = 55,39, H = 7,06, N = 4,86
gefunden: C = 55,38, H = 7,03, N = 4,85.
Schutzgruppen zum Testen als Alternative, die bei der erfindungsgemäßen Herstellung verwendet werden können, umfassen Benzylester, Cyclohexylester, 4-Nitrobenzylester, t-Butylester, 4-Pyridylmethylester, Benzyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, O-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)-2-propyloxycarbonyl und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl.
Abgesehen von diesen Verbindungen, die vorstehend speziell aufgeführt worden sind, sind in tabellarischer Form nachstehend zusätzliche Verbindungen angegeben. Diese Verbindungen werden unter Verwendung der Synthesewege und -verfahren, die in den obigen Schemata und Beispielen und den gut bekannten Variationen davon, die Fachleuten gut bekannt sind und die kein ungebührliches Experimentieren erfordern, synthetisiert. Sämtliche, in den Tabellen nachstehend aufgeführten Variablen beziehen sich auf die folgende Grundstruktur:
Die zur Messung der Osteoklasten-Hemmaktivität der Verbindungen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet worden sind, eingesetzten Testverfahren werden nachstehend beschrieben.

BEISPIEL 20

Sind Osteoklasten mit der Knochenresorption beschäftigt, verursachen sie buchstäblich die Bildung von Löchern in der Knochenoberfläche, auf die sie einwirken. Darum ist es beim Testen der Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Osteoklasten zu hemmen, nützlich, die Fähigkeit von Osteoklasten zu messen, diese Resorptionslöcher auszuhöhlen, wenn die hemmende Verbindung vorhanden ist.
Aufeinanderfolgende Querschnitte (4,4 x 4,4 x 0,2 mm) eines Oberschenkelknochens vom Rind wurden aus der Diaphyse mit einer Diamantsäge mit niedriger Geschwindigkeit (Isomet, Buehler, Ltd, Lake Bluff, IL) durch das Verfahren von Arnett und Dempter, Endocrinology 120:602-608, herausgeschnitten.
Vor der Inkubation mit Osteoklasten wurden die Scheiben in 0,1 ml Komplettinedium 199 auf einer Platte mit 48 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) über Nacht in Gegenwart des Doppelten der gewünschten Dosis der zu testenden Verbindung inkubiert.
Die Osteoklasten wurden aus den langen Knochen von 1 bis 3 Tage alten Ratten (Sprague-Dawley) isoliert, wobei die Verfahren, die von Chambers et al., J. Cell Sci. 66:383-399, verwendet wurden, übernommen wurden.
Femora, Tibiae, und Humeri wurden mit Skalpellklingen gespalten und in 2-5 ml Medium 199 (GIBCO, New York) klein geschnitten. Die resultierende Suspension wurde vorsichtig pipettiert (60mal mit einer Pipette mit weiter Öffnung) und anschließend auf Petrischalen (Costar) oder Knochenscheiben (0,1 ml pro Scheibe) aliquotiert. Die Zellen wurden 30-40 Minuten bei 37 ºC in feuchter CO&sub2;-Luft absetzen gelassen, bevor sie vorsichtig gewaschen und in unverdünntem Inkubationsmedium reinkubiert wurden. Die Osteoklasten-Ausbeuten variierten von 300 bis 1400 pro Ratte und umfaßten typischerweise 1 % oder weniger der gesamten Zellpopulation.
Die Osteoklasten wurden am Tag der Isolierung und einen Tag nach der Inkubation durch Phasen-Kontrast-Mikroskopie (Nikon Diaphot) gezählt. Die gesamten zusammenhängenden Zellen wurden 50-70 Stunden nach der Isolierung mit einem Coulter- Zähler (Modell ZM, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL) gezählt. Die Zellanzahl der Kontrollen variierte von 3,352 x 10&sup4; bis 2,322 x 10&sup5; pro Vertiefung. Das Zählen der mononuklearen Zellen zum Zeitpunkt der Isolierung war aufgrund der Matrix und des Zellabfalls, die nicht vollständig entfernt werden konnten, nicht praktisch.
Knochenscheiben, die den Osteoklasten 20 Stunden lang nach der Isolierung ausgesetzt worden waren, wurden zum Anfärben durch Ultraschall (zweimal, 15 s, Branson) in 0,25 M Ammoniumhydroxid vor der Fixierung (20 Minuten) in 2,5 % Glutaraldehyd, 0,1 M Cacodylat, pH 7,4 (EM Supplies, Fort Washington, PA) behandelt. Die Proben wurden in Ethanol (40, 70 und 100 %, 5 Minuten) dehydriert und 2 Stunden lang luftgetrocknet und anschließend 4 Minuten lang mit filtriertein 1%igen Toluidinblau und 1 % Borax (Sigma, St. Louis, MO) angefärbt. Die zum Zählen der Osteoklasten verwendeten Proben wurden wie zuvor ohne Ultraschall mit Ammoniumhydroxid behandelt. Die für die Elektronenraster-Mikroskopie bearbeiteten Prbben wurden nicht luftgetrocknet, sondern 40 Minuten lang mit 1:1 Ethanol-Peldri 11 (Ted Pella, Inc., Redding, CA) infiltriert. Nach der Inkubation in 100 % Peldri 11 wurden die verfestigten Proben über Nacht evakuiert, um das Peldri 11 zu sublimieren. Die Scheiben wurden kreisförmig mit Gold schattiert (DV-502A, Denton Vacuum, Cherry Hill, NJ) und sodann auf einen JEOL JSM 840 bei 3 KV Beschleunigungsspannung getestet.
Morphologie und Motilität von lebenden osteoklasten wurde analysiert, indem die Phasen-Kontrastbilder (Nikon, NY) in Realzeit auf 3/4-in.-Videobänder mit einer automatischen Videokamera (Modell VO 580H, Sony) aufgenommen wurde.
Ein Fluoreszenzmikroskop (Microphot, Nikon) wurde für die Reflektionslicht-Mikroskopie umgebaut, indem eine λ/4-Platte zwischen den Kreuzpolarisatoren im epi-Modus angeordnet wurde. In Fluoreszenzobjektive mit langer Reichweite mit einstellbaren Korrekturringe (10x, 20x, Nikon) wurden drehbare λ/4-Platten (Polaroid Corp., MA) eingepaßt, die als Frontelemente montiert wurden. Die Korrekturringe waren notwendige 20x-Objektive und höher, um das Vorhandensein der λ/4-Platte und das Fehlen eines Deckglases zu korrigieren. Die Deckgläser wurden nicht verwendet, um die Streureflexionen unterhalb der λ/4-Platte auszuschalten.
Zwischen Objektfrontlinse und λ/4-Platte wurde Immersionsöl (Nikon) gegeben, um die Reflexionen an dieser Grenzfläche zu minimieren. Das Öl wurde nicht zwischen Objektiv und Probenkörper gegeben.
Die Knochenscheiben wurden auf Resorptionshöhlen abgetastet, indem die λ/4-Platte von 0-45º bezüglich der Polarisationsebene bei Epi-Wolfram-Beleuchtung gedreht wurde. Alternativ wurde eine Hg-Beleuchtung (HBO 100 W, Nikon) mit der λ/4-Platte verwendet, die in einem Winkel von 45º montiert war, während abwechselnd die angef ärbten Bilder anhand der Transmissions-Hellfeld-Mikroskopie mit einem NCB-10-Filter (Nikon) beobachtet wurden.
Die Quantifizierung der resorbierten Bereiche der Knochenscheiben, die anhand des Hellfeldes, RLM und SEM, geprüft worden waren, wurde durch digitale Bildverarbeitung (Magiscan 2A, Joyce Loebl, New York) der Videobilder (Newvicon oder SIT, Dage-MTI, Inc., Michigan City, IN), die durch einen digitalen NTSC/PAL-Standardkonverter (CEL P156, James Grunder und Assoc., Inc., Mission, KS) geleitet wurden, erreicht.
Die Osteoklasten wurden für die Immunfluoreszenz bearbeitet, indem die Deckgläser kurz in Puffer S (60 mM Pipes, pH 6,9, 25 mM Hepes, 10 mM EGTA und 2 mM MgCl&sub2;) bei 37 ºC gespült wurden und anschließend 2 Minuten lang in Puffer S + 10 % Formaldehyd, pH 7,0 fixiert wurden. Die Zellen wurden in Puffer S + 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert und anschließend gespült. Die Prüfkörper wurden in einem passenden Antikörper oder Rhodamin-Phalloidin (Molecular probes, Eugene, OR) und anschließend in Fluorescein-Ziegen- Antikaninchen-Antikörper (Cappel) inkubiert (30 Minuten).
Der Knochenscheibentest wird angewendet, um die Wirkung der Verbindung von Interesse auf die Aktivität von aus den langen Knochen von Ratten isolierten Osteoklasten zu prüfen.
Die Anzahl der Resorptionslöcher, die durch die Osteoklasten nach 1 Tag auf den aufeinanderfolgenden Querschnitten des Rinder-Oberschenkelknochens gebildet worden waren, wurde zunächst mit Kontrollproben anhand des Verfahrens von Arnett und Dempster verglichen, Endocrinology 120:602-608, und anschließend als Funktion der Konzentration der Verbindung von Interesse aufgezeichnet. Dies ist in Fig. 1 gezeigt.
Die Zulässigkeit der Extrapolation der Daten aus diesem Test zur Brauchbarkeit und Verwendung bei Säuger-Krankheitszuständen (einschließlich des Menschen) wird durch die Lehre gestützt, die bei Sato, M., et al., Journal of Bone and Mineral Research, Bd. 5, Nr. 1, 1990, gefunden wird. Dieser Artikel lehrt, daß bestimmte Bisphosphonate klinisch verwendet worden sind und anscheinend zur Behandlung der Paget- Krankheit, der m alignen Hypercalcemie, von Osteoklasten- Läsionen, die durch Knochenmetastasen erzeugt werden, und von Knochenverlust aufgrund von Immobilisierung oder Sexualhormon-Defizienz geeignet sind. Dieselben Bisphosphonate werden sodann in dem Resorptionslochtest, der vorstehend beschrieben worden ist, getestet, um die Korrelation zwischen ihrer bekannten Brauchbarkeit und dem positiven Testverhalten zu bestätigen.
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf die bestimmten bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben und erläutert worden ist, schätzen es Fachleute, daß verschiedene Änderungen, Modifikationen und Substitutionen daran vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können wirksame Dosen außer den bevorzugten Dosen, wie sie zuvor vorgestellt worden sind, als Folge der Schwankungen in der Reaktion des Säugers, der wegen ernster Knochenstörungen, die durch die Resorption verursacht worden sind, oder für weitere Anzeichen für die vorstehend aufgeführten erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt wird, verwendbar sein. Gleichermaßen können die speziellen pharmakologischen Reaktionen, die beobachtet werden, je nach der bestimmten aktiven Verbindung, die ausgewählt worden ist, oder in Abhängigkeit davon, ob pharmazeutische Trägerstoffe vorhanden sind sowie in Abhängigkeit des Formulierungstyps und der eingesetzten Verabreichungsart beobachtet werden, und solche erwarteten Variationen oder Unterschiede in den Ergebnissen werden als im Einklang stehend mit den Aufgaben und den Praktiken der Erfindung betrachtet. Darum wird beabsichtigt, daß die Erfindung nur durch den Umfang der Patentansprüche, die folgen, eingeschränkt wird und daß solche Patentansprüche so großzügig wie es sinnvoll ist interpretiert werden.

Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Formel

worin

n eine ganze Zahl von 0 bis 6 bedeutet;

Y für

O,

SO&sub2;,

-CONH-,

-NHCO-,

CH&sub2; oder

- - steht;

R¹ für

ein unsubstituiertes oder substituiertes gesättigtes mono- oder polycyclisches heterocyclisches Ringsystem steht, das 1, 2 oder 3 Heteroatome aufweist, worin die genannten Heteroatome ausgewählt werden aus O, N oder S und worin die genannten Substituenten unabhängig ausgewählt werden aus R²;

R² für folgendes steht:

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,

Aryl-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,

Hydroxy-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,

C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,

Carboxy-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl,

Oxo,

Halogen,

CF&sub3;,

C&sub0;&submin;&sub6;-Alkylamino-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl oder

C&sub0;&submin;&sub6;-Dialkylamino-C&sub0;&submin;&sub6;-alkyl;

R³ für folgendes steht:

Wasserstoff,

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,

Hydroxy-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,

C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,

Carboxy-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,

Halogen oder

CF&sub3;;

R&sup4; für folgendes steht:

Wasserstoff,

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,

Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl oder

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylcarbonyloxymethyl; und

R&sup5; für folgendes steht:

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,

Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl oder

Heterocyclyl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,

oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Knochenresorptionsaktivität von Säuger-Osteoklasten.

2. Verwendung einer Verbindung der Formel

worin

n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet;

Y ausgewählt wird aus

O,

-NHCO-,

-CONH- oder

CH&sub2;;

R¹ für

einen unsubstituierten oder substituierten 5- oder 6gliedrigen heterocyclischen Ring steht, der 1 oder 2 Heteroatome aufweist, worin die genannten Heteroatome unabhängig ausgewählt werden aus O und N und worin die genannten Substituenten für C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Aryl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy oder Oxo stehen,

R² und R³ unabhängig für

Wasserstoff,

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,

Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl,

Hydroxy-C&sub0;&submin;&sub2;-alkyl,

C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-C&sub0;&submin;&sub2;-alkyl oder

Carboxy-C&sub0;&submin;&sub3;-alkyl stehen; und

R&sup4; für

H oder

C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl steht;

3. Verwendung einer Verbindung der Formel

worin

n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet;

Y ausgewählt wird aus

O,

-NHCO-,

-CONH- oder

CH&sub2;;

R¹ für

einen unsubstituierten oder substituierten 5- oder 6gliedrigen heterocyclischen Ring steht, der 1 oder 2 Heteroatome aufweist, worin das genannte Heteroatom für N steht und worin die genannten Substituenten C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, Hydroxy oder Oxo bedeuten; und

R² für

C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl,

Aryl-C&sub0;&submin;&sub4;-alkyl steht;

zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Knochenresorptionsaktivität von Säuger-Osteoklasten.

4. Verwendung einer Verbindung der Formel

worin

n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet;

Y ein frei wählbarer Substituent ist, der sofern vorhanden, für O steht;

R¹ für

einen unsubstituierten oder substituierten 5- oder 6gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring steht, der 1 oder 2 Heteroatome aufweist, worin das genannte Heteroatom für N steht und der genannte Substituent für Alkyl steht; und

R² für

Alkyl,

Phenyl oder

Phenylalkyl steht,

5. Verwendung einer Verbindung der Formel

worin

n eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeutet;

Y ein freiwählbarer Substituent ist, der, sofern vorhanden, für O steht;

R¹ für

unsubstituierte oder substituierte 5- oder 6gliedrige gesättigte heterocyclische Ringe steht, die 1 oder 2 Heteroatome aufweisen, worin das genannte Heteroatom für N steht und der genannte Substituent Alkyl bedeutet; und

R² für Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Benzyl steht, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Knochenresorptionsaktivität von Säuger-Osteoklasten.

6. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die genannte Verbindung

ist.

7. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die genannte Verbindung

ist.