DE69131707T2

DE69131707T2 - Nachweis von Hepatits C mit Verwendung rekombinanter Antigene

Info

Publication number: DE69131707T2
Application number: DE69131707T
Authority: DE
Inventors: James M. Casey; Stephen H. Dailey; George J. Dawson; Suresh M. Desai; Sushil G. Devare; Robin A. Gutierrez; Richard R. Lesniewski; James Lawrence Stewart
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-08-24
Filing date: 1991-08-23
Publication date: 2000-06-08
Anticipated expiration: 2011-08-24
Also published as: ATE185605T1; AU655592B2; CA2049679A1; CA2049679C; ES2139571T3; AU8277491A; JPH04281792A; EP0472207A2; EP0472207A3; JP3354579B2; EP0472207B1; DE69131707D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf einen Assay zur Identifizierung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer Probe, der immunologisch gegenüber einem Hepatitis C-Virus Antigen reaktiv ist, und insbesondere auf einen Assay zum Nachweis eines Komplexes eines Antikörpers und eines rekombinanten Antigens, das bestimmte Regionen des HCV- Genoms repräsentiert. Rekombinante Antigene, die durch molekulares Klonen und durch Expression in einem heterologen Expressionssystem der synthetischen DNA-Sequenzen, die bestimmte antigenische Regionen des HCV-Genoms repräsentieren, abgeleitet werden, können als Reagenzien zum Nachweis von Antikörpern und Antigen in Körperflüssigkeiten von Individuen verwendet werden, die dem Hepatitis C-Virus (HCV) ausgesetzt sind.

HINTERGRUND

Die akute virale Hepatitis wird klinisch diagnostiziert durch eine wohldefinierte Reihe von Patientensymptomen, einschließlich Gelbsucht, Weichheit der Leber, und eine Erhöhung in den Serumniveaus von Alaninaminotransferase (ALT) und Aspartataminotransferase. Zusätzliche serologische Immunoassays werden im allgemeinen durchgeführt, um den spezifischen Typ des viralen Erregers zu diagnostizieren. Früher wurden Patienten, die klinische Hepatitissymptome zeigten und nicht anderweitig durch Hepatitis A, Hepatitis B, Epstein-Barr oder Cytomegalovirus infiziert waren, grundsätzlich klinisch fehlerhaft als an "non-A non-B Heptatitis (NANBH)" erkrankt diagnostiziert. Die Erkrankung kann zu chronischen Leberschäden führen.
Jeder der gut bekannten immunologisch charakterisierten Hepatitis induzierenden Viren, Hepatitis A Virus (HAV), Hepatitis B Virus (HBV), und Hepatitis D Virus (HDV) gehört zu einer unterschiedlichen Familie von Viren und hat eine unterscheidbare virale Organisation, Proteinstruktur und einen Replikationsmodus.
Versuche, den NANBH-Virus zu identifizieren über den Weg der genomischen Ähnlichkeit zu einem der bekannten Hepatitisviren haben versagt, was darauf hinweist, daß NANBH eine eigene Organisation und Struktur besitzt. [Fowler, et al., J. Med. Virol., 12: 205-213 (1983) und Weiner, et al., J. Med. Virol., 21: 239-247 (1987)].
Ein Fortschritt bei der Entwicklung von Assays, um Antikörper nachzuweisen, die spezifisch sind für NANBH wurde insbesondere durch Schwierigkeiten in der korrekten Identifizierung von Antigenen behindert, die mit NANBH assoziiert sind. Siehe, beispielsweise, Wands, J., et al., U. S. Patent 4,870,076, Wands, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 83: 6608-6612 (1986), Ohori, et al., J. Med. Virol., 12: 161-178 (1983), Bradley, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 84: 6277-6281, (1987), Akatsuka, T., et al., J. Med. Virol, 20: 43-56 (1986), Seto, B., et al., U. S. Patentanmeldung Nr. 07/234,641 (verfügbar vom U. S. Departement of Commerce National Technical Information Service, Springfield, Virginia, Nr. 89138168), Takahashi, K., et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 293 274, veröffentlicht am 30. November 1988, und Seelig, R., et al., in PCT Anmeldung PCT/EP88/00123.
Kürzlich wurde ein weiteres Hepatitis induzierendes Virus unzweifelhaft durch Houghton, M., et al., Europäische Patentanmeldung Publikationsnummer 0 318 216, 31. Mai 1989 als Hepatitis C Virus (HCV) identifiziert. Verwandte Aufsätze, die dieses Virus beschreiben, umfassen Kuo, G., et al., Science, 244: 359-361 (1989) und Choo, Q., et al., Science, 244: 362-364 (1989). Houghton, M., et al. berichtete vom Isolieren von cDNA- Sequenzen aus HCV, die Antigenen codieren, die immunologisch mit Antikörpern von Patienten reagieren, die mit NANBH infiziert sind, wodurch bewiesen wird, daß HCV einer der viralen Erreger ist, der NANBH hervorruft. Die mit HCV assoziierten cDNA- Sequenzen wurden aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus der RNA hergestellt wurde, die aus dem gepoolten Serum eines Schimpansen mit chronischer HCV-Infektion erhalten wurde. Die cDNA-Bibliothek enthielt cDNA-Sequenzen von einer geschätzten mittleren Größe von etwa 200 Basenpaaren. Die cDNA-Bibliothek wurde auf codierte Epitope untersucht, die in Klonen exprimiert wurden, die an Antikörper in Seren von Patienten binden konnten, die zuvor an NANBH erkrankt waren.
In der Europäischen Patentanmeldung beschrieben Houghton, M., et al.. ebenfalls die Herstellung von zahlreichen Superoxiddismutase Fusionspolypeptiden (SOD) und den Einsatz dieser SOD-Fusionspolypeptide, um einen HCV-Screening Assay zu entwickeln. Das komplexeste SOD-Fusionspolypeptid, das in der Europäischen Patentanmeldung beschrieben ist, wird als c100-3 bezeichnet, und wurde als folgendes enthaltend beschrieben: 154 Aminosäuren des menschlichen SOD am Aminoterminus, 5 Aminosäurereste, abgeleitet von der Expression eines synthetischen DNA-Adapters, der eine Restriktionsstelle enthält, EcoRI, 363 Aminosäuren abgeleitet von der Expression eines geklonten HCV cDNA-Fragments, und 5 Carboxylterminus Aminosäuren abgeleitet von einer MS2 Klonierungsvektornukleotidsequenz. Die DNA-Sequenz, die dieses Polypeptid codiert wurde in Hefezellen transformiert unter Verwendung eines Plasmids. Die transformierten Zellen wurden kultiviert und exprimierten ein Polypeptid mit einem molekularen Gewicht von 54,000, das durch differentielle Extraktion zu etwa 80% Reinheit gereinigt wurde.
Weitere SOD-Fusionspolypeptide, bezeichnet als SOD-NANB&sub5;&submin; &sub1;&submin;&sub1; und SOD-NANB&sub8;&sub1; wurden in rekombinanten Bakterien exprimiert. Die E. coli Fusionspolypeptide wurden durch differentielle Extraktion und durch Chromatographie unter Verwendung von Anionen- und Kationenaustauschsäulen gereinigt. Die Reinigungsverfahren waren in der Lage SOD-NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1; etwa 80% rein und SOD-NAN38 etwa 50% rein zu erzeugen.
Die rekombinanten SOD-Fusionspolypeptide, die durch Houghton, M., et al. beschrieben worden waren, wurden auf Mikrotiterkammern oder Polystyrolkügelchen aufgezogen und verwendet, um Serumproben zu untersuchen. Kurz gesagt wurden beschichtete Mikrotiterkammern mit einer Probe in einem Verdünner inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikrotiterkammern gewaschen und dann mit entweder einem radioaktiv markiertem Schaf anti-menschlichen Antikörper oder einem Maus anti-menschlichen IgG-HRP (Meerrettichperoxidase) Konjugat entwickelt. Diese Assays wurden verwendet, um sowohl "post-Akutphase-" und "chronische Phase-" HCV-Infektionen nachzuweisen.
Aufgrund der präparativen Verfahren erforderte die Spezifität des Assays den Zusatz von Hefe oder E. coli Extrakten zu den Proben, um unerwünschte immunologische Reaktionen mit jeglicher Hefe oder E. coli Antikörpern, die in der Probe vorhanden sein könnten, vorzugbeugen.
Ortho Diagnostic Systems Inc. haben einen Immunenzymassay entwickelt um Antikörper gegen HCV-Antigene nachzuweisen. Das Ortho-Assayverfahren ist ein drei-Phasentest für Serum/Plasma, der in einer Mikrokammer, beschichtet mit dem rekombinanten Hefe/Hepatitis C Virus SOD-Fusionspolypeptid c100-3, durchgeführt wird.
In dem ersten Schritt wird eine Testprobe direkt in der Testkammer verdünnt und für ein spezifizierten Zeitraum inkubiert; falls Antikörper gegen HCV-Antigene in der Probe vorhanden sind, werden Antigen-Antikörperkomplexe auf der Oberfläche der Mikrokammer gebildet. Falls keine Antikörper vorhanden sind, werden keine Komplexe gebildet und die ungebundenen- Serum oder Plasmaproteine werden in einem Waschschritt entfernt.
Im zweiten Schritt, wird anti-humanes IgG monoklonaler Mausantikörper-Peroxidase-Konjugat der Mikrokammer hinzugefügt. Das Konjugat bindet spezifisch an den Antikörperanteil der Antigen-Antikörperkomplexe. Falls Antigen-Antikörperkomplexe nicht vorhanden sind, wird das ungebundene Konjugat ebenfalls durch einen Waschschritt entfernt.
Im dritten Schritt wird ein Enzymnachweissystem bestehend aus o-Phenylendiamin 2HCl (OPD) und Wasserstoffperoxid zu der Testkammer hinzugefügt. Falls gebundenes Konjugat vorhanden ist, wird das OPD oxidiert, was zu einem gefärbten Endprodukt führt. Nach der Bildung des gefärbten Endproduktes wird verdünnte Schwefelsäure zu der Mikrokammer hinzugefügt, um die farbbildende Nachweisreaktion zu beenden.
Die Intensität des gefärbten Endproduktes wird mit einem Mirkokammerablesegerät gemessen. Der Assay kann verwendet werden, um Patientenserum und -plasma zu untersuchen.
Es ist nachgewiesen, daß HCV durch kontaminiertes Blut und Blutprodukte übertragen werden kann. Bei Transfusionspatienten werden bis zu 10% eine posttransfusionale Hepatitis erleiden. Von denen werden etwa 90% der Infektionen als HCV diagnostiziert. Die Vorbeugung der Übertragung von HCV durch Blut und Blutprodukte erfordert die verläßliche sensitive und spezifische Diagnose und prognostische Mittel, um HCV-Träger wie auch kontaminiertes Blut und Blutprodukte zu identifizieren. Daher besteht ein Bedürfnis für einen HCV-Assay der verläßliche und effiziente Reagenzien und Verfahren verwendet, um genau das Vorhandensein von HCV-Antikörpern in Proben nachzuweisen.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Erfindung liefert einen verbesserten Assay zum Nachweis des Vorhandenseins eines Antikörpers gegen ein HCV-Antigen in einer Probe, indem die Probe mit mindestens einem rekombinanten Protein in Kontakt gebracht wird, das einen bestimmten antigenischen Bereich des HCV-Genoms darstellt.
Rekombinante Antigene, die durch molekulares Klonen und durch die Expression von syntethischen DNA-Sequenzen in heterologen Wirten abgeleitet sind, werden zur Verfügung gestellt. Kurz gesagt werden synthetische DNA-Sequenzen, die die gewünschten Proteine codieren, die bestimmte antigenische Bereiche des HCV-Genoms darstellen, zur Expression in E. coli durch spezifische Codonselektion optimiert. Spezifisch werden zwei rekombinante Proteine, die drei bestimmte antigenische Bereiche des HCV-Genoms darstellen, einschließlich immunogenischer Bereiche des c100-3 Antigens und zweier zusätzlicher nicht überlappender Bereiche stromaufwärts des c100-3 Bereiches beschrieben. Beide Proteine werden als schimärische Fusionen mit dem E. coli CMP-KDO Synthetase (CKS) Gen exprimiert. Das erste Protein, exprimiert durch das Plasmid pHCV-34, stellt Aminosäuren 1-150 der HCV-Sequenz dar, und basierend auf der Analogie zu der genomischen Organisation anderer Flaviviren wurde es HCV CKS-Core genannt. Es ist zu bemerken, daß der Ausdruck pHCV-34 ebenfalls das Fusionsprotein selbst bezeichnet, und daß pHCV-34' die Bezeichnung für ein Polypeptid sein wird, das den Kernbereich von den Aminosäuren 1- 150 der HCV-Sequenz darstellt, das unter Verwendung anderer rekombinanter oder synthetischer Methodologien hergestellt ist. Andere rekombinante Methodologien würden die Herstellung von pHCV-34' einschließen, unter Verwendung unterschiedlicher Expressionssysteme. Die Methodologie für die Herstellung der synthetischen Peptide von HCV ist in der U. S. Patentanmeldung, Seriennr. 456,162, eingereicht am 22. Dezember 1989, beschrieben, die der gleichen Anmelderin gehört und die hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Das andere Protein wird durch das Plasmid pHCV-31 exprimiert und ist aus zwei nicht zusammenhängenden codierenden Bereichen zusammengesetzt, die sich in den wahrscheinlich nicht strukturellen Bereichen des HCV, bezeichnet als NS-3 und NS-4, befinden. Der erste der beiden Bereiche stellt die Aminosäuren 1192-1457 der HCV-Sequenz (bekannt als Klon 33) dar und wird exprimiert durch das Plasmid pHCV-29. Das Fusionsprotein selbst wird ebenfalls als pHCV-29 bezeichnet, und pHCV-29' soll die Bezeichnung für ein Polypeptid aus dem NS-3 Bereich sein, das die Aminosäuren 1192-1457 der HCV-Sequenz darstellt, hergestellt unter Verwendung anderer rekombinanter oder synthetischer Methodologien. Der zweite Bereich stellt die Aminosäuren 1676- 1931 der HCV-Sequenz dar und wird durch das Plasmid pHCV-23 exprimiert. Das Fusionsprotein wird als pHCV-23 und pHCV-23' bezeichnet und soll die Bezeichnung für ein Polypeptid aus dem NS4 Bereich sein, das die Aminosäuren 1676-1931 der HCV-Sequenz darstellt, hergestellt unter Verwendung anderer rekombinanter oder synthetischer Methodologien. Es wurde als Klon BCD bezeichnet, basierend auf der Strategie, die bei seiner Konstruktion verwendet wurde. Der Klon BCD stellt die Carboxylterminalen 256 Aminosäuren von c100-3 dar: die aminoterminalen 108 Aminosäuren von c100-3 sind nicht im Klon BCD dargestellt.
Das rekombinante Antigen, das durch pHCV-31 produziert wird, wird als CKS-33c-BCD bezeichnet. Das Fusionsprotein wird ebenfalls als pHCV-31 bezeichnet, und pHCV-31' bezieht sich auf das Polypeptid bestehend aus zwei nicht benachbarten codierenden Bereichen, die sich in den wahrscheinlich nicht-strukturellen Bereichen von HCV befinden, die als NS-3 und NS-4 bezeichnet werden, die die Aminosäuren von etwa 1192-1457 und von etwa 1676-1931 der HCV-Sequenz darstellen, hergestellt unter Verwendung unterschiedlicher synthetischer Rekombinationsmethodologien. Fig. 1 zeigt die Position der drei HCV Bereiche innerhalb der HCV-Genoms. Diese Antigene werden in den erfinderischen Immunoassays verwendet, um die Anwesenheit von HCV-Antikörpern in Proben nachzuweisen.
Ein Assayformat gemäß der Erfindung liefert einen Screening-Assay zur Identifizierung der Anwesenheit eines Antikörpers, der immunologisch gegenüber einem HCV Antigen reaktiv ist. Kurz gesagt wird eine flüssige Probe mit einem festen Träger inkubiert, der die beiden üblich gebundenen rekombinanten Proteine HCV pHCV-34 und pHCV-31 enthält. Schließlich wird der Antikörper-Antigenkomplex nachgewiesen. In einer Modifikation des Screening-Assays enthält der feste Träger zusätzlich das rekombinate Polypeptid c100-3.
Ein weiteres Assayformat liefert einen bestätigenden Assay für eindeutiges Nachweisen des Vorhandenseins eines Antikörpers welcher immunologisch mit HCV-Antigen reaktiv ist. Der Bestätigungstest beinhaltet synthetische Peptide oder rekombinante Antigene, die die Hauptepitope darstellen, die innerhalb der drei unterschiedlichen Bereiche des HCV-Genoms enthalten sind, wobei diese die gleichen Bereiche sind, die durch die beiden rekombinanten Proteine dargestellt sind, die in dem Screening-Assay beschrieben sind. Diese Bereiche umfassen NS4 (den c100-3 Bereich) dargestellt durch pHCV-23, NS3 (den 33c Bereich) dargestellt durch pHCV-29, und zusammen mit pHCV-23 (den c100-3 Bereich) dargestellt durch pHCV-31, und einen Bereich nahe dem 5' Ende des HCV-Genoms, von dem angenommen wird, daß er das Kern-Strukturprotein des HCVs ist (pHCV-34) Die in dem Bestätigungsassay verwendeten rekombinanten Proteine sollten eine heterologe Antigenquelle, verglichen mit der, die in dem primären Screening-Assay verwendet wird, aufweisen (z. B. sollten sie kein von E. coli abgeleitetes rekombinantes Antigen sein, noch ein rekombinantes Antigen, das teilweise aus CKS Sequenzen besteht). Kurz gesagt werden Proben, die wiederholt in primären Screening-Assays reaktiv sind, in den Bestätigungsassays erneut untersucht. Anteile, die identische Mengen der Proben enthalten, werden mit einem synthetischen Peptid oder einem rekombinanten Antigen in Kontakt gebracht, das individuell auf einen festen Träger aufgezogen ist. Abschließend wird der Antikörper-Antigenkomplex nachgewiesen. Die Seroreaktivität für Epitope innerhalb des c100-3 Bereiches des HCV-Genoms wird unter Verwendung der synthetischen Peptide sp67 und sp65 bestätigt. Das synthetische Peptid sp117 kann ebenfalls verwendet werden, um die Seroreaktivität innerhalb des c100-3 Bereiches zu bestätigen. Die Seroreaktivität für HCV-Epitope innerhalb des mutmaßlichen Kernbereiches des HCV wird durch die Verwendung des synthetischen Peptids sp75 bestätigt. Um die Seroreaktivität für HCV Epitope innerhalb des 33c Bereiches des HCV zu bestätigen, wird ein rekombinantes Antigen als ein schimärisches Protein mit Superoxiddismutase (SOD) in Hefe exprimiert. Das synthetische Peptid sp65 (das die Aminosäuren p1866-1930 der HCV-Sequenz darstellt), sp67 (das die Aminosäuren p1684-1750 darstellt), sp75 (das die Aminosäuren p1-75 darstellt) und sp117 (das die Aminosäuren p1689-1805 darstellt) sind in der U. S. Patentanmeldung Seriennr. 456,162 beschrieben, mit dem Titel "Hepatitis C Assay", eingereicht am 22. Dezember 1989, die der gleichen Anmelderin gehört und die hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird.
Ein weiteres Assayformat liefert einen Kompetitionsassay oder Neutralisationsassay, der auf die Bestätigung abzielt, daß positive Resultate nicht falsch sind, indem er die Anwesenheit eines Antikörpers identifiziert, der immunologisch gegenüber einem Antigen in einer flüssigen Probe reaktiv ist, wobei die Probe verwendet wird, um einen ersten und einen zweiten immunologisch gleichwertigen Anteil herzustellen. Der erste Anteil wird mit einem festen Träger in Kontakt gebracht, welcher ein gebundenes Polypeptid besitzt, das zumindest ein Epitop eines HCV Antigens besitzt, unter Bedingungen, die zur Komplexbildung mit dem Antikörper geeignet sind, um einen nachweisbaren Antikörper-Polypeptidkomplex zu bilden, und der zweite Anteil wird zunächst mit dem gleichen festen Träger in Kontakt gebracht, der gebundenes Polypeptid enthält. Das bevorzugte rekombinante Polypeptid ist von pHCV-23 abgeleitet.
Ein weiteres Assayformat liefert einen Immun-Tüpfel-Assay zur Identifizierung des Vorhandenseins eines Antikörpers, der immunologisch gegenüber einem anti-HCV Antigen reaktiv ist, indem gleichzeitig eine Probe mit rekombinanten Polypeptiden in Kontankt gebracht wird, die jeweils unterschiedliche Epitope eines HCV-Antigens beinhalten, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung des Antikörpers mit mindestens einem der Polypeptide geeignet sind, und das Nachweisen des Antikörperpolypeptidkomplexes durch Reaktion des Komplexes mit farbproduzierenden Reagenzien. Die bevorzugten rekombinanten Polypeptide, die verwendet werden, beinhalten jene rekombinanten Polypeptide, die von pHCV-23, pHCV-29, pHCV-31, pHCV-34 abgeleitet sind, wie auch c100-3, das als ein schimärisches Protein mit Superoxiddismutase (SOD) in Hefe exprimiert wird.
In allen Assays wird die Probe vorzugsweise verdünnt, bevor sie mit dem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, das auf einem festen Träger absorbiert ist. Proben können aus unterschiedlichen biologischen Proben wie etwa Vollblut, Serum, Plasma, zerebraler spinaler Flüssigkeit und Lymphozyt- oder Zellkulturüberständen erhalten werden. Feste Trägermaterialien können Nitrozellulosematerialien wie etwa Papier und Nitrozellulose, natürliche und synthetische polymerische Materialien, wie etwa Polyacrylamid, Polystyrol und Baumwolle, poröse Gele wie etwa Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine, und anorganische Materialien wie etwa deaktiviertes Alumina, Magnesiumsulfat und Glas einschließen. Geeignete feste Trägermaterialien können in Assays in einer Vielzahl von gut bekannten physikalischen Konfigurationen verwendet werden, einschließlich Mikrotitierkammern, Teströhrchen, Kügelchen, Strips, Membranen und Mirkopartikeln. Ein bevorzugter fester Träger für einen non-Immun-Tüpfel-Assay ist ein Polystyrolkügelchen. Ein bevorzugter fester Träger einen Immun- Tüpfel-Assay ist Nitrozellulose.
Geeignete Verfähren und Reagenzien zum Nachweis eines Antikörper-Antigenkomplexes in einem Assay der vorliegenden Verbindung sind kommerziell verfügbar oder im Fachgebiet bekannt. Repräsentative Verfahren können Nachweisreagenzien verwenden wie etwa enzymatische, radioisotopische, fluoreszierende, lumineszente oder chemilumineszente Reagenzien. Diese Reagenzien können zur Herstellung von Hapten-markierten Antihapten Nachweissystemen gemäß bekannten Verfahren verwendet werden, zum Beispiel kann ein mit Biotin markiertes Antibiotinsystem zum Nachweis eines Antikörper-Antigenkomplexes verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Assaykits, die Polypeptide beinhalten, welche mindestens ein Epitop eines HCV Antigens besitzen, das an einen festen Träger gebunden ist, wie auch die benötigten Proben-Herstellungsreagenzien, Waschreagenzien, Nachweisreagenzien und signalerzeugende Reagenzien.
Andere Aspekte und Vorteile der Erfindung werden Fachleuten nach Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich, die die Erfindung in ihrer derzeit bevorzugten Ausführungsform veranschaulicht.
E. coli Stämme, die Plasmide besitzen, die für Konstrukte der Erfindung nützlich sind, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland am 10. August 1990 unter den Zugangsnummern ATCC 68380 (pHCV-23), ATCC 68381 (pHCV-29), ATCC 68382 (pHCV-31), ATCC 68383 (pHCV-34) hinterlegt, und am 6. Nobember 1990 wurden E. coli Stämme, die Plasmide besitzen, welche für Konstrukte nützlich sind, unter den Zugangsnummern ATCC 68458 (pHCV-50), 68459 (pHCV-57), 68460 (pHCV-103), 68461 (pHCV-102), 68462 (pHCV-51), 68463 (pHCV-105), 68464 (pHCV-107), 68465 (pHCV-104), 68466 (pHCV-45), 68467 (pHCV-48), 68468 (pHCV- 49), 68469 (pHCV-58), 68470 (pHCV-101) hinterlegt.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das HCV-Genom.
Fig. 2 zeigt die Verwendung von rekombinanten Polypeptiden zur Identifizierung der Anwesenheit von Antikörpern in einem Schimpansen, der mit HCV inokuliert wurde.
Fig. 3 zeigt die Erhöhung der Sensitivität und Spezifität bei Verwendung des Screening-Assays bei Verwendung von pHCV-34 und pHCV-31 Antigenen.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids pHCV-34.
Fig. 5 zeigt die komplette DNA- und Aminosäuresequenz von pHCV-34.
Fig. 6 zeigt das Fusionsprotein pHCV-34.
Fig. 7 zeigt die Expression von pHCV-34 Proteinen in E. coli.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion des Plasmids pHCV-23.
Fig. 9 zeigt die Konstruktion des Plasmids pHCV-29.
Fig. 10 zeigt die Konstruktion des Plasmids pHCV-31.
Fig. 11 zeigt die komplette DNA- und Aminosäuresequenz von pHCV-31.
Fig. 12 zeigt das Fusionsprotein pHCV-31.
Fig. 13 zeigt die Expression von pHCV-29 in E. coli.
Fig. 14 zeigt die Expression von pHCV-23 in E. coli.
Fig. 15 zeigt die Expression von pHCV-31 in E. coli.
Fig. 16 zeigt die erhöhte Sensibilität unter Verwendung des Screening-Assays unter Verwendung des pHCV-34.
Fig. 17 zeigt die erhöhte Spezifität mit dem Screening- Assay unter Verwendung von pHCV-34 und pHCV-31.
Fig. 18 zeigt die Ergebnisse bei Hämodialysepatienten unter Verwendung der Screening- und Bestätigungsassays.
Fig. 19 zeigt den früheren Nachweis von HCV bei einem Hämodialysepatienten unter Verwendung des Screening Assays.
Fig. 20 zeigt die Ergebnisse des Screening Assays unter Verwendung von pHCV-34 und pHCV-31 an Proben von Individuen mit akuter NANBH.
Fig. 21 zeigt die Ergebnisse des Bestätigungsassays von derselben Bevölkerungsgruppe wie in Fig. 20.
Fig. 22 zeigt die Ergebnisse des Screening- und Bestätigungsassays an Individuen, die mit chronischer NANBH infiziert sind.
Fig. 23 zeigt bevorzugte Puffer, pH Bedingungen und Tüpfelkonzentrationen für den HCV Immun-Tüpfel-Assay.
Fig. 24 zeigt die Ergebnisse des HCV Immun-Tüpfelassays.
Fig. 25 zeigt das Fusionsprotein pHCV-45.
Fig. 26 zeigt die DNA- und die Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-45 exprimiert wird.
Fig. 27 zeigt die Expression von pHCV-45 in E. coli.
Fig. 28 zeigt das Fusionsprotein pHCV-48.
Fig. 29 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das von pHCV-48 exprimiert wird.
Fig. 30 zeigt die Expression von pHCV-48 in E. coli.
Fig. 31 zeigt das Fussionsprotein pHCV-51.
Fig. 32 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens exprimiert durch pHCV-51.
Fig. 33 zeigt die Expression von pHCV-51 in E. coli.
Fig. 34 zeigt das Fusionsprotein pHCV-50.
Fig. 35 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das von pHCV-50 exprimiert wird.
Fig. 36 zeigt die Expression von pHCV-50 in E. coli.
Fig. 37 zeigt das Fusionsprotein pHCV-49.
Fig. 38 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das von pHCV-49 exprimiert wird.
Fig. 39 zeigt die Expression von pHCV-49 in E. coli.
Fig. 40 zeigt einen Immunoblot von pHCV-23, pHCV-45, pHCV-48, pHCV-51, pHCV-50 und pHCV-49.
Fig. 41 zeigt die Fusionsproteine pHCV-24, pHCV-57, pHCV-58.
Fig. 42 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das von pHCV-57 exprimiert wird.
Fig. 43 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-58 exprimiert wird.
Fig. 44 zeigt die Expression von pHCV-24, pHCV-57, und pHCV-58 in E. coli.
Fig. 45 zeigt das Fusionsprotein pHCV-105.
Fig. 46 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-105 exprimiert wird.
Fig. 47 zeigt die Expression von pHCV-105 in E. coli.
Fig. 48 zeigt das Fusionsprotein pHCV-103.
Fig. 49 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das von pHCV-103 exprimiert wird.
Fig. 50 zeigt das Fusionsprotein pHCV-101.
Fig. 51 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-101 exprimiert wird.
Fig. 52 zeigt das Fusionsprotein pHCV-102.
Fig. 53 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das pHCV-102 exprimiert wird.
Fig. 54 zeigt die Expression von pHCV-102 in E. coli.
Fig. 55 zeigt das Fusionsprotein pHCV-107.
Fig. 56 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-107 exprimiert wird.
Fig. 57 zeigt das Fusionsprotein pHCV-104.
Fig. 58 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-104 exprimiert wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Assay zum Nachweis eines Antikörpers gegen ein HCV Antigen in einer Probe. Menschliches Serum oder Plasma wird vorzugsweise mit einem Probenverdünner verdünnt und wird mit einem Polystyrolkügelchen inkubiert, das mit einem rekombinanten Polypeptid beschichtet ist, das einen bestimmten antigenischen Bereich des HCV-Genoms darstellt. Falls Antikörper in der Probe vorhanden sind, werden sie einen Komplex mit dem antigenischen Polypeptid bilden und an das Polystyrolkügelchen anhaften. Nachdem sich der Komplex gebildet hat, werden ungebundene Materialien und Reagenzien durch das Waschen des Kügelchens entfernt und der Kügelchen-Antigen-Antikörperkomplex wird mit einer Lösung zur Reaktion gebracht, die mit Meerrettichperoxidase markierte Ziegen-Antikörper gegen menschliche Antikörper enthält. Dieses Peroxidaseenzym bindet dann an den Antigen-Antikörperkomplex, der bereits an das Kügelchen angeheftet ist. In einer Endreaktion wird die Meerrettichperoxidase mit o-Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid in Kontakt gebracht, was zu einer gelborangen Farbe führt. Die Intensität der Farbe ist zu der Menge von Antikörper proportional, die sich ursprünglich an das Antigen heftet, das an dem Kügelchen fixiert ist.
Die bevorzugten rekombinanten Polypeptide, die HCV antigenische Epitope besitzen, wurden aus Anteilen des HCV- Genoms gewählt, die Polypeptide codieren, die Aminosäuresequenzen besitzen, die anderen bekannten immunologisch reaktiven Mitteln ähneln und von denen festgestellt wurde, daß sie eine immunologische Reaktivität besitzen. (Die immunologische Reaktivität eines Polypeptids wurde ursprünglich identifiziert, indem das zelluläre Extrakt von E. coli Klonen, die mit cDNA Fragmenten des HCV-Genoms transformiert worden waren, mit HCV infiziertem Serum zur Reaktion gebracht wurde. Die Polypeptide, die von Klonen exprimiert wurden, welche die eingebaute cDNA enthielten, waren gegenüber Serum, von dem bekannt war, daß es Antikörper gegen HCV Antigen enthielt, immunologisch reaktiv.) Eine Analyse einer gegebenen Aminosäuresequenz liefert jedoch nur grobe Anhaltspunkte zur Vorhersage einer immunologischen Reaktivität. Es gibt keinen sicher vorhersagbaren Weg, um immunologische Aktivität sicherzustellen, ohne daß eine bestimmte Aminosäuresequenz hergestellt wird, und daß die verdächtige Sequenz in einem Assay getestet wird.
Die Verwendung von rekombinanten Polypeptiden, die bestimmte antigenische Bereiche des HCV-Genoms darstellen, um das Vorhandensein eines Antikörpers gegen ein HCV-Antigen nachzuweisen, ist in Fig. 2 gezeigt. Der Verlauf der HCV- Infektion in dem Schimpansen, Pan, wurde mit einem Assay unter Verwendung von rekombinanten c100-3 Polypeptiden und mit einem weiteren verbesserten Assay unter Verwendung der beiden rekombinanten Antigene CKS-Core (pHCV-34) und pHCV-33c-BCD (pHCV-31) verfolgt, die jeweils durch die Plasmide pHCV-34 und pHCV-31 exprimiert wurden. Der Assay, der die rekombinanten pHCV-34 und pHCV-31 Proteine verwendete, wies Plasmaantikörper drei Wochen vor dem Nachweis der Antikörpern durch den Assay nach, der c100-3 verwendete.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse einer Studie, die den Verlauf der HCV-Infektion bei Pan und bei sechs weiteren Schimpansen unter Verwendung der beiden oben beschriebenen Assays verfolgte, ist in Fig. 3 zusammengefaßt. Beide Assays ergaben negative Ergebnisse vor der Inokulation und beide zeigten das Vorhandensein von Antikörpern, nachdem das Tier mit HCV infiziert worden war. Jedoch wies beim Vergleich der beiden Assays der verbesserte Screening-Assay, der pHCV-34 und pHCV-31 verwendete, bei sechs der sieben Schimpansen die Serokonversion gegenüber HCV Antigenen zu einem früheren oder gleichwertigen Blutentnahmezeitpunkt nach. Die Daten aus diesen Schimpansenstudien zeigen klar, daß die Gesamterkennung von HCV Antikörpern bei sechs der sieben Schimpansen mit dem Assay, der die pHCV-34 und pHCV-31 Proteine verwendet, stark erhöht ist. Dieser Test ist ausreichend sensitiv, um die Serokonversion während der akuten Phase dieser Erkrankung nachzuweisen, wie sie als eine Erhöhung der ALT Niveaus bei den meisten Tieren definiert ist. Von gleicher Wichtigkeit ist das hohe Ausmaß der Spezifität des Tests, da keine vor-Inokulationsproben reaktiv waren.
Die Polypeptide, die bei der Durchführung dieser Erfindung nützlich sind, werden unter Verwendung rekombinanter Technologien produziert. Die DNA Sequenzen, die die gewünschten Polypeptide codieren, sind vorzugsweise aus Fragmenten der gesamten gewünschten Sequenz zusammengestellt. Synthetische DNA- Fragmente des HCV-Genoms können basierend auf ihren korrespondierenden Aminosäuresequenzen synthetisiert werden. Sobald die Aminosäuresequenz gewählt ist, wird sie rückübersetzt, um die komplementäre DNA-Sequenz zu ermitteln, unter Verwendung von Codons, die optimiert sind, um die Expression in dem gewählten System zu erleichtern. Die Fragmente werden im allgemeinen unter Verwendung von gut bekannten automatisierten Verfahren und Vorrichtungen hergestellt. Nachdem die komplette Sequenz hergestellt wurde, wird die gewünschte Sequenz in eine Expressionsvektor eingebaut, der in eine Wirtszelle transformiert wird. Die DNA-Sequenz wird dann durch die Wirtszelle exprimiert, um das gewünschte Polypeptid zu ergeben, das aus der Wirtszelle oder aus dem Medium, in dem die Wirtszelle kultiviert wird, gewonnen wird. Wenn kleinere Peptide unter Verwendung von rekombinanten Technologien herzustellen sind, kann es vorteilhaft sein, eine einzelne DNA-Sequenz herzustellen, die mehrere Kopien des gewünschten Polypeptids in einer vernetzten Kette enthält. Die lange Kette wird dann isoliert und die Kette wird dann in die kürzeren, gewünschten Sequenzen aufgetrennt.
Die Methodologie der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls verwendet werden, um PCR-verstärkte Gene von jedem Abschnitt des HCV-Genoms zu entwickeln, die dann ihrerseits in einer Art und Weise, die gleich jener der synthetischen Gene ist, geklont und exprimiert werden können.
Vektorsysteme, die verwendet werden können, umfassen Pflanzen-, Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugetierexpressionssysteme. Es wird bevorzugt, daß die Codons für die Expression in dem verwendeten System optimiert werden.
Ein bevorzugtes Expressionssystem verwendet ein Trägergen für ein Fusionssystem, worin die rekombinanten HCV-Proteine als ein Fusionsprotein eines E. coli Enzyms, CKS (CTP: CMP-3-Deoxymanno-octulosonatcytidylyltransferase oder CMP-KDO Synthetase) exprimiert werden. Das CKS Verfahren der Proteinsynthese ist in den U. S. Patentanmeldungen mit den Seriennummern 167,067 und 276,263, jeweils eingereicht am 11. März, 1988 und am 23. November 1988, von Bolling (EP 89 102 928.2) offenbart, die der gleichen Anmelderin gehören und die hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen werden.
Weitere Expressionssysteme können verwendet werden, einschließlich der Lambda PL Vektorsysteme, deren Eigenschaften einen starken Lambda pL Promotor, einen starke drei- Rastertranslationsterminator rrnBtl, und eine Translation, die an einem ATG Codon beginnt, beinhalten.
Bei der vorliegenden Erfindung wurden die Aminosäuresequenzen die die rekombinanten HCV-Antigene, die von Interesse sind, codieren, unter Verwendung von Codons rückübersetzt, die optimiert sind, um eine Hochniveauexpression in E. coli zu erleichtern. Die individuellen Oligonukleotide wurden durch das Verfahren der Oligonukleotid-gesteuerten doppelsträngigen Bruchstellenreparatur synthetisiert, wie beschrieben in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 883,242, eingereicht am 8. Juni 1986 von Mandecki (EP 87 109 357.1), die der gleichen Anmelderin gehört und hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Alternativ können die individuellen Oligonukleotide auf dem Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer unter Verwendung von Verfahren und Reagenzien synthetisiert werden, die vom Hersteller empfohlen sind. Die DNA-Sequenzen der individuellen Oligonukleotide wurde unter Verwendung des Sanger'schen Dideoxykettenterminationsverfahrens (Sanger et al., J. Mole, Biol., 162; 729 (1982)) bestätigt. Diese individuellen Genfragmente wurden dann aneinandergereiht und ligiert und als EcoRl-BamHl Subfragmente in dem CKS Fusionsvektor pJO200 geklont. Nach der folgenden DNA-Sequenzbestätigung durch das Sanger'sche Dideoxykettenterminationsverfahren wurden die Subfragmente mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, an Gel gereinigt, ligiert und erneut als EcoRl-BamHl Fragment im CKS Fusionsvektor pJO200 geklont. Die sich ergebenden Klone wurden kartiert ["mapped"], um ein Hybridgen zu identifizieren, das aus dem EcoRl-BamHl HCV-Fragment besteht, das an dem 3' Ende des CKS (CMP-KDO Synthetase) Gens eingefügt ist. Die unter Steuerung des lac Promotors entstehenden Fusionsproteine, bestehen aus 239 Aminosäuren des CKS Proteins, angefügt an verschiedene Bereiche des HCV.
Die Synthese, das Klonen, und die Charakterisierung der rekombinanten Polypeptide wie auch die bevorzugten Formate für Assays unter Verwendung dieser Polypeptide werden in dem folgenden Beispiel dargestellt. Beispiele 1 und 2 beschreiben jeweils die Synthese und das Klonen von CKS-Core und CKS-33-BCD. Beispiel 3 beschreibt einen Screening-Assay. Beispiel 4 beschreibt einen Bestätigungsassay. Beispiel 5 beschreibt einen kompetitiven Assay. Beispiel 6 beschreibt einen Immun-Tüpfel- Assay.

REAGENZIEN UND ENZYME

Medien wie etwa Luria-Bertani (LB) und Superbroth II (Dri Form) wurden von Gibco Laboratories Life Technologies, Inc., Madison Wisconsin bezogen. Restriktionsenzyme, Klenowfragmente der DNA-Polymerase I, T4 DNA-Ligase, T4 Polynukleotidkinase, Nukleinsäuremolekulargewichtsstandards, M13 Seguenzierungssystem, X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indonyl-β-D-galactosidase), IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktosid), Glycerin, Dithiothreitol, 4- Chlor-1-napthol wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana; oder von New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts; oder von Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland bezogen. Vorgefärbte Proteinmolekulargewichtsstandards, Acrylamid (kristallisiert, elektrophoretischer Reinheitsgrad 99%); N-N'- Methylen-bis-acrylamid (BIS); N,N,N',N',- Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von BioRad Laboratories, Richmond, California bezogen. Lysozym und Ampicillin wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri erhalten. Mit Meerrettichperoxidase (HRPO) markierte sekundäre Antikörper wurden von Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland erhalten. Seaplaque® Agarose (niedrigschmelzende Agarose) wurden von FMC Bioproducts, Rockland, Maine gekauft.
T50E100 enthielt 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA; 1X TG enthielt 100 mM Tris, pH 7,5 und 10% Glyzerin; der 2X SDS/PAGE Betriebspuffer bestand aus 15% Glyzerin, 5% SDS, 100 mM Tris Base, 1M β-Mercaptoethanol und 0,8% Bromphenolblauem Farbstoff; TBS enthielt 50 mM Tris, pH 8,0 und 150 mM Natriumchlorid; die Blockierungslösung bestand aus 5% Carnation fettfreier Trockenmilch in TBS.

WIRTSZELLKULTUREN, DNA QUELLEN UND VEKTOREN

E. coli JM103 Zellen, pUC8, pUC18, pUC19 und M13 Klonierungsvektoren wurden von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey, gekauft; Kompetente Epicuria® coli-Stämme XL1-Blue und JM109 wurden von Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Californien bezogen. RR1 Zellen wurden von Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut erhalten; und E. coli CAG456 Zellen von Dr. Carol Gross, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin. Der Vektor pRK248.clts wurde von Dr. Donald R. Helinski, University of California, San Diego, Kalifornien erhalten.

ALLGEMEINE VERFAHREN

Sämtliche Restriktionsenzymverdauungen wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Mindestens 5 Units Enzym wurden pro Mikrogramm DNA verwendet, und eine ausreichende Inkubation wurde zur kompletten Verdauung der DNA gestattet. Standardverfahren wurden zur Herstellung von Minizellysat DNA Präparaten, zur Phenol-Chloroformextraktion, zur Ethanolpräzipitation von DNA, zur Restriktionsanalyse von DNA auf Agarose, und zur niedrig-schmelzenden Agarosegelreinigung von DNA Fragmenten (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor, 1982]) angewendet. Plasmidisolationen aus E. coli Stämmen verwendeten das alkalische Lyseverfahren und das Cäsiumchlorid-ethidiumbromiddichtegradientenverfahren (Maniatis et al., sieh.e oben). Standardpuffer wurden für T4 DNA- Ligase und T4 Polynukleotidkinase (Maniatis et al., siehe oben) verwendet.

BEISPIEL 1. CKS-CORE

A. Konstruktion des Plasmids nJO200

Der Klonierungsvektor pJO200 erlaubt die Fusion von rekombinanten Proteinen an das CKS-Protein. Das Plasmid besteht aus dem Plamid pBR322 mit einem modifizierten lac Promotor, angefügt an ein KdsB Genfragment (codierend die ersten 239 der insgesamt 248 Aminosäuren der E. coli CMP-KDO Synthetase des CKS- Proteins), und einem synthetischen Linker, angefügt an das Ende des KdsB Genfragments. Der Klonierungsvektor pJO200 ist eine Modifizierung des Vektors pTB210. Der synthetische Linker umfaßt folgendes: zahlreiche Restriktionsstellen zur Insertion von Genen; Translationsstopsignale, und den trpA rho-unabhängigen transkriptionalen Terminator. Das CKS-Verfahren der Proteinsynthese wie auch die CKS-Vektoren einschließlich pTB210 sind in den U. S. Patentanmeldungen mit der Seriennummer 167,067 und 276,263 beschrieben, jeweils eingereicht am 11. März 1988 und am 23. November 1938 von Bolling (EPO 89 102 928.2), die der gleichen Anmelderin gehören und hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen werden.

B. Herstellung von HCV CKS-Core Expressionsvektoren

Sechs individuelle Nukleotide, die die Aminosäuren 1-150 des HCV-Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als ein 466 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment in dem CKS Fusionsvektor pJO200 wie in Fig. 4 gezeigt geklont. Die komplette DNA-Sequenz dieses Plasmids, bezeichnet als pHCV-34 und die gesamte Aminosäuresequenz des produzierten rekombinanten pHCV-34 Antigens ist in Fig. 5 gezeigt. Das entstehende Fusionsprotein HCV CKS-Core besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, sieben Aminosäuren, die von Linker DNA-Sequenzen beigesteuert werden, und den ersten 150 Aminosäuren des HCV wie in Fig. 6 gezeigt.
Das pHCV-34 Plasmid und das CKS Plasmid pTB210 wurden in den E. coli komplett-12 Stamm xL-1 (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relAl, lac/F', proAB, laclqZDM15, TN10) transformiert, d. h. in Zellen, die durch das Calciumchloridverfahren kompetent gemacht wurden. In diesen Konstruktionen wurde die Expression der CKS-Fusionsproteine von dem lac Promotor gesteuert und wurde durch den Zusatz von IPTG induziert. Diese Plasmide replizierten als unabhängige Elemente, waren unmobilisierbar und wurden als etwa 10-30 Kopien pro Zelle erhalten.

C. Charakerisierung von rekombinantem HCV-Core

Um nachzuweisen, daß der Klon pHCV-34 das einzigartige HCV-CKS Coreprotein exprimierte, wurde die pHCV-34/XL-1 Kultur über Nacht bei 37ºC in Wachstumsmedium gezüchtet, das aus Hefeextrakt, Tryton, Phosphatsalzen, Glukose und Ampicillin bestand. Als die Kultur eine OD600 von 1,0 erreichte, wurde IPTG hinzugefügt bis zu einer abschließenden Konzentration von 1 mM, um die Expression zu induzieren. Proben (1,5 ml) wurden in einstündigen Intervallen entfernt, und die Zellen wurden pellettiert und unter Erhalt einer OD600 von 1,0 in 2X SDS/PAGE Betriebspuffer resuspendiert. Anteile (15 ul) der hergestellten Proben wurden an doppelten 12,5% SDS/PAGE Gelen getrennt.
Ein Gel wurde in einer Lösung von 50% Methanol und 10% Essigsäure über 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, und dann mit 0,25% Coomassie blauem Farbstoff in einer Lösung von 50% Methanol und 10% Essigsäure während 30 Minuten gefärbt. Das Entfärben wurde unter Verwendung einer Lösung von 10%igem Methanol und 7%iger Essigsäure für 3-4 Stunden durchgeführt, oder jedenfalls bis ein klarer Hintergrund erhalten wurde.
Fig. 7 zeigt die Expression von pHCV-34 Proteinen in E. coli. Molekulargewichtsstandards wurden in Bahn M laufen lassen. Bahn 1 enthält das Plasmid pJO200-den CKS-Vektor ohne die HCV-Sequenz. Der Pfeil auf der linken Seite zeigt die Beweglichkeiten der Molekulargewichtsmarker von oben nach unten an: 110.000; 84.000; 47.000; 33.000; 24.000; und 16.000 Dalton. Die Pfeile auf der rechten Seite zeigen die Beweglichkeiten der rekombinanten HCV-Proteine. Bahn 2 enthält das E. coli Lysat welches das pHCV-34 exprimierende CKS-Core (Aminosäure 1 bis 150) enthält, vor der Induktion; und Bahn 3 nach 3-stündiger Induktion. Die Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante Protein pHCV-34 eine ersichtliche Mobilität aufweist, entsprechend einer molekularen Größe von 48.000 Dalton. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten Masse von 43.750 Dalton.
Proteine von dem zweiten 12,5% SDS/PAGE Gel wurden zum Durchführen eines Immunblots elektrophoretisch auf Nitrozellulose transferiert. Das Nitrozelluloseblatt, welches die transferierten Proteine enthielt, wurde mit Blockierungslösung eine Stunde lang inkubiert und über Nacht bei 4ºC mit den Seren von HCV-Patienten, die in TBS verdünnt worden waren, das E. coli K-12 Stamm XL-1 Lysat enthielt. Das Nitrozelluloseblatt wurde dreimal in TBS gewaschen, dann mit HRPO-markiertem Ziegen anti-menschlichen IgG inkubiert, in TBS verdünnt, das 10%iges fetales Kalbsserum enthielt. Die Nitrozellulose wurde dreimal mit TBS gewaschen und die Farbe wurde in TBS entwickelt, die 2 mg/ml 4-Chlor-1-Napthol, 0,02% Wasserstoffperoxid und 17% Methanol enthielt. Der Klon HCV-34 zeigte eine starkes immunreaktives Band bei 48.000 Dalton mit den Seren der HCV-Patienten. Dies zeigt, daß das Hauptprotein in dem Coomassie-gefärbten Proteingel immunreaktiv war. Normales menschliches Serum reagierte mit keiner Komponente von pHCV-34.

BEISPIEL 2. HCV CKS-33C-BCD

A. Herstellung des HCV CKS-33c-BCD Expressionsvektors

Die Konstruktion dieses rekombinanten Klons, der das HCV CKS-33-BCD Antigen exprimiert, wurde in drei Schritten, die unterhalb beschrieben sind, durchgeführt. Zunächst wurde ein Klon, der das HCV CKS-BCD Antigen exprimiert, konstruiert und als pHCV-23 bezeichnet. Zweitens wurde ein Klon, der das HCV CKS-33 Antigen produziert, konstruiert, und als pHCV-29 bezeichnet. Schließlich wurde der HCV BCD-Bereich aus pHCV-23 herausgeschnitten und in pHCV-29 inseriert, um einen Klon zu konstruieren, der das HCV CKS-33-BCD Antigen exprimiert, bezeichnet als pHCV-31.
Um das Plasmid pHCV-23 zu konstruieren, wurden dreizehn individuelle Oligonukleotide, welche die Aminosäuren 1676-1931 des HCV-Genoms darstellen, zusammenligiert und als drei getrennte EcoRl-BamHl Subfragmente in den CKS-Fusionsvektor pJO200 geklont. Nach einer folgenden DNA-Sequenzbestätigung, wurden die drei Subfragmente, bezeichnet jeweils als B, C und D, mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, Gelgereinigt, zusammenligiert, und als 781 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment im CKS-Fusionsvektor pJO200, wie in Fig. 8 gezeigt, geklont. Das sich ergebende Plasmid, bezeichnet als pHCV-23, exprimiert das HCV CKS-BCD Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-BCD Antigen besteht aus 239 Aminosäuren des CKS, sieben Aminosäuren, die durch Linker DNA-Sequenzen beigesteuert sind, 256 Aminosäuren aus dem HCV NS4 Bereich (Aminosäuren 1676-1931, und 10 zusätzliche Aminosäuren, die durch Linker DNA-Sequenzen beigesteuert werden).
Um das Plasmid pHCV-29 zu konstruieren, wurden zwölf einzelne Oligonukleotide, die die Aminosäuren 1192-1457 des HCV- Genoms darstellen, zusammenligiert und als zwei unterschiedliche EcoRl-BamHl Subfragmente in den CKS-Fusionvektor pJO200 geklont. Nach folgender DNA-Sequenzbestätigung wurden die beiden Subfragmente mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, gelgereinigt, zusammenligiert und erneut als ein 816 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment im CKS-Fusionsvektor pJO200 geklont, wie in Fig. 9 gezeigt. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV- 29, exprimiert das CKS-33 Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-33 Antigen besteht aus 239 Aminosäuren des CKS, acht Aminosäuren, die von DNA Linkersequenzen beigesteuert werden, und 266 Aminosäuren aus dem HCV NS3 Bereich (Aminosäuren 1192-1457).
Um das Plasmid pHCV-31 zu konstruieren, wurde das 781 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment von pHCV-23, das den HCV-BCD Bereich darstellt, mit Linkern adaptiert, um ein C1a1-BamH1 Fragment zu prodzuieren, das an einem Gel gereinigt wurde und in pHCV-29 an den Cla1-BamH1 Stellen wie in Fig. 10 gezeigt ligiert. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV-31, exprimiert das pHCV-31 Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Die komplette DNA-Sequenz von pHCV-31 und die komplette Aminosäuresequenz des rekombinanten HCV CKS-33-BCD Antigens, welches produziert wurde, ist in Fig. 11 gezeigt. Das HCV CKS-33-BCD Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, acht Aminosäuren, beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen, 266 Aminosäuren des HCV NS3 Bereichs (Aminosäuren 1192-1457), 2 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen, 256 Aminosäuren des HCV NS4 Bereichs (Aminosäuren 1676-1931), und 10 zusätzlichen Aminosäuren, die durch Linker DNA Sequenzen. Fig. 12 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-31 Antigens. Das pHCV-31 Plasmid wurde in E. coli K-12 Stämme XL-1 in einer Art und Weise transformiert, die ähnlich zu den pHCV-34 und CKS-pTB210 Plasmiden von Beispiel 1 ist.

B. Charakterisierung des rekombinanten HCV CKS-33-BCD

Die Charakterisierung von pHCV CDS-33-BCD wurde in einer Art und Weise durchgeführt, die ähnlich zu dem pHCV CKS-Core von Beispiel 1 ist. pHCV-23, pHCV SDS/PAGE Gele wurden für E. coli Lysate enthaltend die Plasmide pHCV-29 (Fig. 13), pHCV-23 (Fig. 14), und pHCV-31 (Fig. 15) laufen lassen, die jeweils die rekombinanten Fusionsproteine CKS-33c, CKS-BCD, und CKS-33- BCD exprimierten. Für alle drei Zahlen wurden die molekularen Gewichtsstandards in Bahn M laufen lassen, wobei die Pfeile auf der linken Seite die Beweglichkeiten der molekularen Gewichtsmarker von oben nach unten anzeigen: 110.000; 84.000; 47.000; 33.000; 24.000; und 16.000 Dalton. In Fig. 13 enthielt Bahn 1 das E. coli Lysat, das pHCV-29 enthielt, das HCV CKS-33c (Aminosäure 1192 bis 1457) exprimierte, vor der Induktion, und Bahn 2 das Lysat nach 4 stündiger Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante pHCV-29 Fusionsprotein eine sichtbare Beweglichkeit besitzt, welche einer molekularen Größe von 60000 Dalton entspricht. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 54,911.
In Fig. 14 enthielt Bahn 1 das E. coli Lysat, das pJO200- den CKS-Vektor ohne die HCV-Sequenz- enthielt. Bahn 2 enthielt pHCV-20, der das HCV CKS-B (Aminosäuren 1676 bis 1790) exprimierte. Bahn 3 enthielt das Fusionsprotein pHCV-23 (Aminosäuren 1676-1931). Diese Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante pHCV-23 Fusionsprotein eine sichtbare Beweglichkeit entsprechend einer molekularen Größe von 55.000 Dalton besitzt. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 55.070 Daltons
In Fig. 15 enthielt Bahn 1 das E. coli Lysat, das pJO200- den CKS-Vektor ohne die HCV-Sequenzen enthielt. Bahn 2 enthielt pHCV-31, der das CKS-33c-BCD Fusionsprotein exprimierte (Aminosäuren 1192 bis 1447 und 1676 bis 1931) vor der Induktion, und Bahn 3 enthielt den Vektor nach 2 stündiger Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante pHCV-31 (CKS-33c-BCD) Fusionsprotein eine sichtbare Beweglichkeit entsprechend einer molekularen Größe von 90.000 Dalton aufweist. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 82.995 Daltons.
Ein Immunoblot wurde ebenfalls an einem der SDS/PAGE Gele durchgeführt, die aus der pHCV-31/X1-1 Kultur abgeleitet worden waren. Menschliches Serum von einem mit HCV exponierten Individuum reagierte stark mit der Haupt-pHCV-31 Bande bei 90.000 Dalton. Normales menschliches Serum reagierte mit keiner Komponente der pHCV-31 (CKS-33-BCD) Präparate.

BEISPIEL 3. SCREENING ASSAY

Die Verwendung von rekombinanten Polypeptiden, die Epitope innerhalb c100-3 wie auch Epitope von anderen antigenischen Bereichen des HCV-Genoms enthalten, liefert immunologische Assays, welche eine erhöhte Sensitivität besitzen und spezifischer sein können als HCV immunologische Assays, die nur Epitope innerhalb c100-3 verwenden.
Im gegenwärtig bevorzugten Screening-Assay verwendet das Verfahren zwei von E. coli exprimierte rekombinante Proteine, CKS-Core (pHCV-34) und CKS-33-BCD (pHCV-31), welche drei unterschiedliche Bereiche des HCV-Genoms darstellen. Diese rekombinanten Polypeptide wurden gemäß den Verfahren hergestellt, die oberhalb beschrieben sind. In dem Screening- Assay werden beide rekombinanten Antigene auf das gleiche. Polystyrolkügelchen aufgezogen. In einer Abwandlung des Screening-Assays kann das Polystyrolkügelchen ebenfalls mit dem SOD-Fusionspolypeptid c100-3 beschichtet sein.
Die Polystyrolkügelchen werden zunächst mit destilliertem Wasser und Propanol gewaschen und dann mit einer Lösung inkubiert, die rekombinantes pHCV-31 enthält, das auf 0,5 bis 2,0 ug/ml verdünnt ist und pHCV-34, verdünnt auf 0,1 bis 0,5 ug/ml in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;H&sub2;O mit 0,4M NaCl und 0,0022% Triton X-100, pH 6,5. Die Kügelchen werden in der Antigenlösung über 2 Stunden (plus oder minus 10 Minuten) bei 38-42ºC inkubiert, in PBS gewaschen und in 0,1% (w/v) Triton X-100 in PBS während 60 Minuten bei 38-42ºC eingelegt. Die Kügelchen werden dann zwei mal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, mit einer Lösung von 5,0% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS während 60 Minuten bei 38-42ºC überschichtet, und einmal in PBS gewaschen. Schließlich werden die Kügelchen mit 5% (Gewicht/Volumen) Saccharose in PBS überschichtet, und unter Stickstoff oder Luft getrocknet.
Die Polystyrolkügelchen, die beschichtet sind mit pHCV-31 und pHCV-34 werden in einem Antikörpereinfangformat verwendet.
Zehn Mikroliterproben werden in die Kammern des Reaktionsträgers zusammen mit 40 ul eines Probenverdünners und den mit rekombinantem Antikörper beschichteten Kügelchen hinzugefügt. Der Probenverdünner besteht aus 10% (V/V) Rinderserum und 20% (V/V) Ziegenserum in 20 mN Trisphosphatpuffer enthaltend 0,15% (V/V) Triton X-100, 1% (G/V) BSA, 1% E. coli Lysat und 500 ug/ml oder weniger CKS-Lysa t. Wenn das rekombinante Hefe c100-3 Polypeptid verwendet wird, werden Antigkörper gegen Hefeantigene, die in einer Probe vorhanden sein können, zur Reaktion gebracht mit Hefeextrakten, die dem Probenverdünner hinzugefügt sind (üblicherweise etwa 200 ug/ml). Der Zusatz von Hefeextrakten zu dem Probenverdünner wird verwendet, um falsch positiven Resultaten vorzubeugen. Das endgültige Material wird steril gefiltert und in Plastikflaschen abgefüllt und konserviert mit 0,1% Natriumazid.
Nach einer Stunde Inkubation bei 40ºC werden die Kügelchen gewaschen und 20 ul Konjugat wird den Kammern des Reaktionsträgers hinzugefügt.
Das bevorzugte Konjugat ist Ziegen anti-menschliches IgG Meerrettichperoxidasekonjugat. Konzentriertes Konjugat wird titriert, um eine Arbeitskonzentration festzulegen. Ein zwanzigfaches Konzentrat der Arbeitskonjugatlösung wird dann hergestellt, indem das Konzentrat in Verdünner verdünnt wird. Das 20-fache Konzentrat wird steril gefiltert und in Plastikflaschen gelagert.
Der Konjugatverdünner beinhaltet 10% (V/V) Rinderserum, 10% (V/V) Ziegenserum und 0,15% Triton-X100 in 20 mM Trispuffer, pH 7,5 mit 0,01% Gentamizinsulfat, 0,01% Thimerosal und rotem Farbstoff. Das Konjugat wird steril gefiltert und in Plastikflaschen gefüllt.
Anti-HCV positive Kontrollproben werden aus Plasmaeinheiten hergestellt, die positiv sind für Antikörper gegen HCV. Der Pool der verwendeten Einheiten beinhaltet Plasma mit Antikörpern, die reaktiv sind gegen die pHCV-31 und pHCV-34. Die Einheiten werden bei 59-61ºC über 12 Stunden unter konstantem Rühren recalcifiziert und hitzeinaktiviert. Der Pool wird aufgeteilt und bei -20ºC oder bei 2-8ºC gelagert. Für jeden Ansatz positiver Kontrollprobe wird die Lagerlösung mit negativer Kontrolle verdünnt, die 0,1% Natriumazid als Konservierungsstoff beinhaltet. Das endgültige Material wird steril gefiltert und in Plastikflaschen gefüllt.
Anti-HCV negative Kontrollproben werden aus recalcifizierten menschlichen Plasma, negativ für Antikörper gegen pHCV-31 und pHCV-34 Proteine des HCV, hergestellt. Das Plasma ist ebenfalls negativ für Antikörper gegen menschliches Immunschwächevirus (HIV) und negativ für Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg). Die Einheiten waren gepoolt, und 0,1% Natriumazid wird als Konservierungsstoffe hinzugefügt. Das endgültige Material wird steril gefiltert und in Plastikflaschen gefüllt.
Nach einer Stunde Inkubation mit dem Konjugat bei 40ºC werden die Kügelchen gewaschen, dem OPD Substrat dreißig Minuten lang bei Raumtemperatur ausgesetzt, und die Reaktion wird beendet durch den Zusatz von 1N H&sub2;SO&sub4;. Die Extinktion wird abgelesen bei 492 nm.
Um eine akzeptable Spezifität zu erhalten, sollte der Schwellenwert für den Assay mindestens 5-7 Standardabweichungen über dem Extinktionswert des Mittelwertes der Normalbevölkerung liegen. Zusätzlich wurde im allgemeinen beobachtet, daß akzeptable Spezifität erreicht wird, wenn der Mittelwert der Population bei einem Proben zu Schwellenwert (S/CO, "sample to cut off") Wert von 0, 25 oder weniger läuft. Übereinstimmend mit diesen Kriterien wurde ein "preklinischer" Schwellenwert für den Screening-Assay gewählt, die meisten der angenommenen "richtig negativen" von "richtig positiven" Proben klar trennt. Der Schwellenwert wurde kalkuliert als die Summe des mittleren Extinktionswertes der positiven Kontrollprobe, multipliziert mit 0,25 und des mittleren Extinktionswertes der negativen Kontrollprobe. Der Schwellenwert kann algebraisch ausgedrückt werden als:
Schwellenwert = 0,25 Pcx + Ncx.
Das Testen kann mittels zwei Verfahren durchgeführt werden, welche im wesentlichen im Ausmaß der Automation und dem Mechanismus zum Ablesen der entstehenden Farbentwicklung in dem Assay unterschiedlich sind. Ein Verfahren wird als das manuelle oder Quantumttm Verfahren bezeichnet, da Quantum oder Quantumatic verwendet wird, um die Extinktion bei 492 nm abzulesen. Es wird auch das manuelle Verfahren genannt, da die Probenpipettierung, das Waschen und der Zusatz der Reagenzien im allgemeinen manuell durch den Techniker durchgeführt werden, unter Verwendung von geeigneten kalibrierten Pipetten, Dispensern und Waschinstrumenten. Das zweite Verfahren wird als das PPC- Verfahren bezeichnet und verwendet das automatische Abbott CommanderR system. Dieses System verwendet eine Pipettierungsvorrichtun, die als das Probenmanagement Center (SMC) bezeichnet wird und ein Wasch/Dispenser/Ablesegerät, das als das Parallel Processing Center (PPC) bezeichnet wird, beschrieben in der Abbott Veröffentlichung Nr. 17256 mit dem Titel "Simultaneous Assay for Detecting One Or More Analytes", dessen Erfinder William E. Brown, III ist. Der optische Leser, der bei dem PPC verwendet wird, hat Vorkehrungen für duale Wellenlängen, die unterschiedliche Extinktionen aus den Probenkammern messen können (Peakbande und Seitenbande). Diese Ablesungen werden durch das Rechenzentrum des Prozessors in Ergebnisse umgewandelt.

Screening-Assay Durchführung

1. Serum/Plasma von inokulierten Schimpansen

Wie zuvor beschrieben, faßt Tabelle I die Ergebnisse einer Studie zusammen, welche den Verlauf einer HCV-Infektion bei sieben Schimpansen verfolgte, unter Verwendung eines Screening-Assays welcher das c100-3 Polypeptid verwendet, und eines Screening-Assays, welcher pHCV-31 und pHCV-34 verwendete. Beide Assays ergaben negative Ergebnisse vor der Inokulation und beide Assays wiesen das Vorhandsein von Antikörpern nach, nachdem das Tier mit. HCV infiziert worden war. Jedoch beim Vergleich der beiden Assays, wies der Assay, der pHCV-31 und pHCV-34 verwendete, die Serokonversion gegen HCV Antigene zu einem früheren oder gleichzeitigen Blutentnahmezeitpunkt in sechs der sieben Schimpansen nach. Die Daten dieser Schimpansenstudie zeigen klar, daß der generelle Nachweis von HCV-Antikörpern mit dem Assay, der die pHCV-31 und pHCV-34 Proteine verwendet, stark erhöht ist. Dieser Test ist ausreichend sensitiv, um die Serokonversion während der aktuen Phase dieser Erkrankung nachzuweisen, wie als eine Erhöhung der ALT Niveaus bei den meisten Tieren definiert. Gleich wichtig ist das hohe Ausmaß der Spezifität des Testes, da keine vor- Inokulationsproben reaktiv waren.

2. Non-A, Non-B Auswahl ["panel"] II (H. Alter, NIH)

Eine Auswahl von hochgezüchteten menschlichen Seren von Dr. H. Alter, NIH, Bethesda, MD., die infektiöse HCV-Seren, negative Seren und andere Krankheitskontrollen enthielt, wurde getestet. Eine Gesamtzahl von 44 Proben war in der Auswahl vorhanden.
Sechs von sieben Seren, die bei Schimpansen "nachweislich infektiös" waren, waren sowohl beim Screening-Assay unter Verwendung von c100-3 als auch in dem Screening-Assay positiv, welcher die rekombinanten Proteine pHCV-31 und pHCV-34 verwendet. Diese sechs reaktiven Proben wurden von Individuen mit chronischer Hepatitis erhalten. Alle sechs der reaktiven Proben wurden unter Verwendung des synthetischen Peptids sp67 als positiv bestätigt. Eine Probe, die während der akuten Phase von NANB Post-Transfusionshepatitis erhalten wurde, war bei beiden Screening-Assays nicht reaktiv.
In der Gruppe markiert mit "wahrscheinlich infektiös" waren drei Proben, die von dem gleichen Posttransfusionshepatitispatienten entnommen worden waren. Die ersten beiden Akutphaseproben waren in beiden Assays negativ, aber die dritte Probe war in beiden Assays reaktiv. Die Krankheitskontrollproben und die gezüchteten negativen Kontrollen waren einheitlich negativ.
Alle sechzehn Proben, die mit beiden Screening-Assays als positiv getestet worden waren, wurden durch den sp117 Bestätigungsassay (Fig. 16) bestätigt. Zusätzlich wurden die Proben 10 und 29 in dem Screening-Assay neu nachgewiesen, der die rekombinanten pHCV-31 und pHCV-34 Antigene verwendet und sie waren im sp75 Bestätigungsassay reaktiv. Probe 39 war ursprünglich in dem S creening-Assay reaktiv, der pHCV-34 und pHCV-31 verwendet, aber nach erneutem Testen war sie negativ und konnte durch die Bestätigungsassays nicht bestätigt werden.
Zusammenfaßt identifizierten beide Screening-Assays 6 von 6 chronischen NANBH Trägern und 1 von 4 aktuen NANBH-Proben. Gepaarte Proben von einem betroffenen Spender waren in dem Screening-Assay, welcher c100-3 verwendet nicht reaktiv, aber sie waren in dem Screening-Assay mit pHCV-31 und pHCV-34 reaktiv. Somit scheint der Screening-Assay, der die rekombinanten Antigene pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, sensitiver zu sein, als der Screening-Assay der c100-3 verwendet. Keine der Krankheitskontrollproben oder gezüchteten negativen Kontrollproben waren in einem der Screening-Assays reaktiv.

3. CBER Bezugsauswahl

Eine Bezugsauswahl für Antikörper gegen Hepatitis C wurde von dem Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) erhalten. Diese Auswahl von 10 Mitgliedern besteht aus acht reaktiven Proben, verdünnt in normalem menschlichen Serum, welches negativ ist für Antikörper gegen HCV und zwei Seren, welche keine nachweisbaren Antikörper gegen HCV enthalten. Diese Auswahl wurde dem Ortho HCV EIA Assay der ersten Generation, dem Screening-Assay, der c100-3 verwendet und dem Screening-Assay, welcher pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, unterzogen. Die Assayergebnisse sind in Fig. 17 gezeigt.
Der Screening-Assay, welcher pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, wies alle sechs der HCV positiven oder grenzwertigen Probeverdünnungen nach. Die beiden nicht reaktiven Probenverdünnungen (709 und 710) scheinen weit über den Endpunkt der Antikörpernachweisbarkeit für beide Screening-Assays verdünnt zu sein. Eine markante Erhöhung wurde in den Proben zu den Schwellenwerten für drei Mitglieder bei dem Screening-Assay gezeigt, der pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, verglichen mit dem Assay, welcher c100-3 verwendet, oder dem Orthotest der ersten Generation. Alle wiederholt reaktiven Proben wurden bestätigt.

BEISPIEL 4. BESTÄTIGUNGSASSAY

Der Bestätigungsassay liefert ein Mittel zur unzweifelhaften Identifizierung der Anwesenheit eines Antikörpers, welcher immunologisch mit einem HCV Antigen reaktiv ist. Der Bestätigungsassay beinhaltet synthetische Peptide oder rekombinante Antigene, die die Hauptepitope darstellen, die innerhalb der drei unterschiedlichen Bereiche des HCV-Genoms vorkommen, die die gleichen Bereiche sind, die durch die beiden rekombinanten Antigene repräsentiert werden, die in dem Screening-Assay beschrieben sind. Rekombinante Proteine, die in dem Bestätigungsassay verwendet werden, sollten eine heterologe Antigenquelle zu jener aufweisen, die in dem primären Screening- Assay verwendet wird (z. B. sollten sie keine E. coli abgeleiteten rekombinanten Antigene sein, noch ein rekombinantes Antigen, das teilweise aus CKS Sequenzen aufgebaut ist). Proben, die im primären Screening-Assay wiederholt reaktiv sind, werden erneut in dem Bestätigungsassay untersucht. Anteile, die identische Mengen von Probe enthalten, werden mit einem synthetischen Peptid oder einem rekombinanten Antigen in Kontakt gebracht, das einzeln auf ein Polystyrolkügelchen aufgezogen ist. Die Seroreaktivität für Epitope innerhalb des c100-3 Bereiches des HCV-Genoms wird bestätigt durch Verwendung der synthetischen Peptide sp67 und sp65. Das synthetische Peptid sp117 kann ebenfalls verwendet werden, um die Seroreaktivität mit dem c100- 3 Bereich zu bestätigten. Die Seroreaktivität für HCV-Epitope innerhalb des wahrscheinlichen Corebereiches von HCV wird durch die Verwendung des synthetischen Peptids sp75 bestätigt. Um die Seroreaktivität für HCV Epitope innerhalb des 33c Bereiches von HCV zu bestätigen, wird ein rekombinantes Antigen verwendet, das als ein schimärisches Protein mit Superoxiddismutase (SOD) in Hefe exprimiert wird. Schließlich wird einer der Antikörper- Antigenkomplex nachgewiesen.
Die Assayvorschriften ähnelten den in Beispiel 3 oben beschriebenen. Die Peptide werden jeweils individuell auf Polystyrolkügelchen aufgezogen und wurden in einem Antikörpereinfangformat verwendet, ähnlich jenem, der für den Screening-Assay beschrieben ist. Zehn Mikroliter Probe werden zu den Kammern eines Reaktionsträgers hinzugefügt, zusammen mit 400 ul eines Probenverdünners und einem peptidbeschichteten Kügelchen. Nach einer Stunde Inkubation bei 40ºC werden die Kügelchen gewaschen und 200 ul Konjugat (identisch zu jenem, das in Beispiel 3 beschrieben ist) werden zu den Kammern des Reaktionsträgers hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei 40ºC werden die Kügelchen gewaschen, dem OPD-Substrat 30 Minuten bei Raumtemperatur ausgesetzt und die Reaktion wird durch den Zusatz von 1N H&sub2;SO&sub4; beendet. Die estinktion wird bei 492 nm abgelesen. Der Schwellenwert für den Peptidassay ist 4 mal der Mittelwert des Extinktionswertes der negativen Kontrollprobe.

1. Auswahl von Proben, die "Risiko" für HCV-Infektion enthalten.

Eine Gruppe von 233 Proben, 23 Hämodialysepatienten darstellend, die alle klinisch diagnostizierte NANBH haben wurden von Gary Gitnick, M. D. an der Universität von Kalifornien, Los Angeles Center for the Health Sciences, geliefert. Diese Proben, welche zunächst durch den Screening- Assay, der c100-3 verwendet, getestet wurden, wurden nachfolgend mit dem Screening-Assay getestet, der pHCV-31 und pHCV-34 verwendet. Insgesamt waren 7/23 Patienten (30,44%) in dem c100-3 Screening-Assay reaktiv, mit einer Gesamtzahl von 36 wiederholt reaktiven Proben. Zehn von 23 Patienten (43, 48%) waren gemäß dem Screening-Assay reaktiv, welcher pHCV-31 und pHCV-34 verwendete, bei einer Gesamtzahl von 70 wiederholbaren reaktiven unter den verfügbaren Proben (Fig. 18). Zwei Proben waren nicht zum Durchführen von Tests verfügbar. Alle 36 wiederholt reaktiven Proben, die mit dem c100-3 Screening-Assay nachgewiesen wurden, wurden durch synthetische Peptidbestätigungsassays bestätigt. Eine Gesamtzahl von 34 dieser 36 waren beim HCV EIA unter Verwendung von pHCV-34 und pHCV-31 wiederholt reaktiv: zwei Proben waren nicht für Tests verfügbar. Von den 36 durch den pHCV-34 und pHCV-31 verwendenden Screening-Assay zusätzlich nachgewiesenen Proben wurden 9 durch den Corepeptidbestätigungsassay (sp75) bestätigt und 27 wurden durch den SOD-33c Bestätigungsassay bestätigt.
Insgesamt zeigen diese Daten, daß der Nachweis von anti- HCV durch den Screening-Assay, der pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, zum gleichen Blutentnahmezeitpunkt oder gar bis zu 9 Monaten früher erzielt kann, verglichen mit dem c100-3 Screening- Assay. Fig. 19 zeigt den früheren Nachweis durch den Screening-Assay unter Verwendung von pHCV-34 und pHCV-31 bei einem Hämodialysepatienten.

5. Akute/chronische Non-A, Non-B Hepatitis

Eine Gruppe von Proben von Individuen mit der Diagnose einer akuten oder chronischen NANBH wurde identifiziert. Proben von Individuen mit akuten Fällen von NANBH wurden von Gary Gitnick, M. D. an der Universität von Kalifornien, Los Angeles Center for Health Sciences erhalten. Die Diagnose der akuten Hepatitis basierte auf dem Vorhandensein eines cytolytischen Syndroms (ALT Niveaus höher als 2fache des oberen normalen Grenzwerts) an mindestens 2 Serumproben für einen Zeitraum von weniger als 6 Monaten mit oder ohne anderen biologischen Unregelmäßigkeiten und klinischen Symptomen. Alle Proben waren ebenfalls negativ gegenüber IgM Antikörpern gegen Hepatitis A Virus (HAV) und waren negativ für Hepatitis B Oberflächenantigen beim Test mit kommerziell verfügbaren Tests. Proben von Fällen von chronischer NANBH wurden von zwei klinischen Fällen erhalten. Die Individuen wurden als an chronischer NANBH erkrankt basierend auf den folgenden Kriterien diagnostiziert: dauerhaft erhöhte ALT-Niveaus, Leberbiopsieergebnisse, und/oder das Fehlen von nachweisbarem HbsAg. Proben mit Biopsieergebnissen wurden weiter als entweder chronisch aktive NANBH, chronisch persistierende NANBH oder chronische NANBH mit Zirrhose charakterisiert.
Diese Proben wurden sowohl durch den c100-3 Screening- Assay und als auch den Screening-Assay unter Verwendung von pHCV-34 und pHCV-31 getestet. Der zweitgenannte Test wurde in doppelter Ausführung sowohl durch das Quantum als auch das PPC- Verfahren durchgeführt.

Außerhalb der Klinik erworbene NANBH (akut)

Der c100-3 Screening-Assay wies 2 von 10 Proben (20,00%) als wiederholt reaktiv nach, welche beide bestätigt wurden. Der Screening-Assay welcher pHCV-34 und pHCV-31 verwendete, wies diese beiden Proben und zwei weitere Proben (Fig. 20) nach. Diese beiden Proben wurden durch sp75 (siehe Fig. 21) bestätigt.

Akute Post-Transfusions NANBH

Der c100-3 Assay wies 4 von 32 Proben (12,50%) als wiederholt reaktiv nach, welche alle bestätigt wurden. Der Screening-Assay, der pHCV-34 und pHCV-31 verwendete, wies 3 von diesen 4 Proben (75%) als reaktiv nach. Die eine Probe, die fehlschlug hatte einen S/CO-Wert [Probe-zu- Schwellenwertverhältnis] von 0,95 durch den zweitgenannten Screeningtest. Diese Probe wurde durch das sp67 Peptid (Fig. 20) bestätigt. Zusätzlich wies der Screening-Assay, der pHCV-34 und pHCV-31 verwendete, 11 Proben nach, die in dem c100-3 Screening-Assay nicht reaktiv gewesen waren. Von den 9 zur Bestätigung verfügbaren Proben wurden 8 durch sp75 bestätigt, nur eine konnte nicht bestätigt werden, hatte jedoch in dem sp65 Bestätigungstest einen S/CO von 0,90 (siehe Fig. 21).

Chronische NANBH

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Populationen ist in Fig. 22 gezeigt. Insgesamt wurden 155 von 164 (94,5%) chronische NANBH Proben durch den Screening-Test nachgewiesen, der pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, unter Verwendung von entweder Quantum oder PPC. Die 155 reaktiven Proben wurden alle in unterschiedlichen Assays unter Verwendung der synthetischen Peptide basierend auf Sequenzen von entweder den c100, 33c oder Corebereichen des HCV-Genoms bestätigt. Im Gegensatz dazu waren nur 138 von 164 (84,1%) der Proben durch den c100-3 Assay positiv. Alle bis auf eine der 138 c100-3 Proben wurden durch den Screening-Assay, der pHCV-31 und pHCV-34 verwendet, als positiv nachgewiesen. Die eine abweichende Probe wurde weder durch synthetische noch durch Neutralisationsassays bestätigt. Umgekehrt gab es 17 bestätigte Proben, die nur durch den Screening-Assay als positiv getestet wurden, der pHCV-34 und pHCV-31 verwendet.
Die Ergebnisse zeigen, daß der Screening-Assay, welcher pHCV-34 und pHCV-31 verwendet, sensitiver ist als der aktuelle Test beim Nachweis von HCV positiven Individuen in chronisch infizierten NANBH Populationen.

BEISPIEL 5. Kompetitiver ASSAY

Die rekombinanten Polypeptide, welche antigenische HCV- Epitope beinhalten, sind für kompetitive Assays nützlich. Zum Durchführen eines Neutralisationsassays wird ein rekombinantes Polypeptid das Epitope innerhalb des c100-3 Bereiches darstellt, wie etwa CKS-BC (pHCV-23) löslich gemacht und mit einem Probenverdünner bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5- 50 ug/ml vermischt. Zehn Mikroliter der Probe oder verdünnter Probe werden zu einer Reaktionskammer hinzugefügt, gefolgt von 400 ul des Probenverdünners, der das rekombinante Polypeptid enthält, und, falls gewünscht, kann die Mischung für etwa fünfzehn Minuten bis zu zwei Stunden vorinkubiert werden. Ein Kügelchen welches mit dem c100-3 Antigen beschichtet ist, wird dann der Reaktionskammer hinzugefügt und über eine Stunde bei 40ºC inkubiert. Nach dem Waschen werden 20 ul eines peroxidasemarkierten Ziegen anti-menschlichen IgGs in Konjugatverdünner hinzugefügt und über eine Stunde bei 40ºC inkubiert. Nach dem Waschen wird OPD Substrat hinzugefügt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1N Schwefelsäure beendet, und die Extinktion bei 492 nm wird abgelesen.
Proben, die Antikörper gegen das c100-3 Antigen enthalten, erzeugen ein vermindertes Signal, bewirkt durch die kompetitive Bindung des Peptids an diese Antikörper in Lösung. Der Prozentsatz der kompetitiven Bindung kann berechnet werden, indem die Extinktionswerte der Probe in Anwesenheit eines rekombinanten Polypeptids mit den Extinktionswerten der Probe verglichen werden, die einem Assay in Abwesenheit eines rekombinanten Polypeptids bei der gleichen Verdünnung unterzogen werden.

BEISPIEL 6, IMMUN-TÜPFEL-ASSAY

Das Immun-Tüpfel-Assaysystem verwendet eine Auswahl von gereinigten rekombinanten Polypeptiden, die in einem Gitter auf einen festen Träger aus Nitrozellulose angebracht werden. Der vorbereitete feste Träger wird mit einer Probe in Kontakt gebracht und fängt spezifische Antikörper gegen HCV-Antigene ein. Die eingefangenen Antikörper werden durch eine konjugatspezifische Reaktion nachgewiesen. Vorzugsweise wird die konjugatspezifische Reaktion unter Verwendung eines reflektionsoptischen Versuchsaufbaus innerhalb eines Instrumentes quantifiziert, das in der U. S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/227,408, eingereicht am 2. August 1988, beschreiben wurde. Die verwandten U. S. Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/227,272, 07/227,586 und 07/227,590 beschreiben weiterhin spezifische Verfahren und Vorrichtungen, die bei der Durchführung eines Immun-Tüpfel-Assays nützlich sind. Der Assay wurde ebenfalls in der U. S. Anmeldung mit der Seriennummer 07/532,489, eingereicht 6. Juni 1990, beschrieben. Kurz gesagt wird ein auf Nitrozellulose basierendes Testkärtchen mit verschiedenen antigenischen Polypeptiden behandelt. Jedes Polypeptid ist in einer spezifischen Reaktionszone auf dem Kärtchen enthalten. Nachdem alle antigenischen Polypeptide auf der Nitrozellulose plaziert waren, werden überschüssige Bindungsstellen auf der Nitrozellulose blockiert. Das Testkärtchen wird dann mit einer Probe in Kontakt gebracht, so daß jedes antigenische Polypeptid in jeder Reaktionszone reagieren wird, falls die Probe den geeigneten Antikörper enthält. Nach der Reaktion wird das Testkärtchen gewaschen und alle Antigen-Antikörperreaktionen werden unter Verwendung geeigneter gut bekannter Reagenzien identifiziert.
Wie in den oben genannten Patentanmeldungen beschrieben, ist das gesamte Verfahren einer Automatisierung zugänglich. Die Beschreibungen dieser Anmeldungen in Bezug auf das Verfahren und die Vorrichtungen zur Durchführung eines Immun-Tüpfel-Assays werden durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.
Bei einem bevorzugten Immun-Tüpfel-Assay werden die rekombinanten Polypeptide pHCV-23, pHCV-29, pHCV-34 und c100-3 in den bevorzugen Puffern, bei den pH-Bedingungen und den Tüpfelkonzentrationen verdünnt, wie in Fig. 23 zusammengefaßt und auf ein vorgefertigtes Nitrozellulosetestkärtchen aufgegeben. Nachdem das Kärtchen über Nacht bei Raumtemperatur bei 37ºC getrocknet wurde, wird die unspezifische Bindungskapazität der Nitrozellulosephase blockiert. Die Blockierungslösung enthielt 1% Schweinegelatine, 1% enzymatisches Caseinydrolysat, 5% Tween-20, 0,1% Natriumazid, 0,5M Natriumchlorid und 20 mM Tris, pH 7,5.
Vierzig normale Spender wurden untersucht, indem das Verfahren angewendet wurde, das oben beschrieben ist. Die mittleren Reflektionsdichtewerte wurden dann für jedes der rekombinanten Proteine bestimmt Ein Schwellenwert wurde bestimmt als der negative Mittelwert plus sechs Standardabweichungen bestimmt. Die Testkärtchen wurden mit den Proben A00642 und 423 (siehe Fig. 24) inkubiert. Probe A00642 war von einem genesenden non-A, non-B Hepatitispatienten, verdünnt in negativem menschlichem Plasma von 1 : 100 bis 1 : 12800. Die andere Probe, 423, war von einem bezahlten Plasmaspender, welcher in einem Assay, der ein rekombinantes c100-3 Polypeptid verwendete, verdünnt in negativem menschlichen Plasma von etwa 1 : 40 zu 1 : 2560, positiv getestet wurde. Nach der Inkubation der Probe lieferten sequentielle Inkubationen mit einem Biotinkonjugierten Ziegen anti-menschliches Immunoglobulinspezifischen Antikörper, mit einem alkalische Phosphatasekonjugierten Kaninchen anti-Biotin spezifischen Antikörper und mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat ein gefärbtes Produkt an der Reaktionsstelle. Probe-zu-Schwellenwert-Verhältnisse (S/CO) wurden für alle rekombinanten HCV Proteine bestimmt. Jene (S/CO) Werte, die gößer oder gleich 1.0 waren, wurden als reaktiv angesehen. Die Grenzverdünnung wurde als die niedrigste Verdünnung definiert, bei der der S/CO größer gleich 1.0 war. Wie in Fig. 24 gezeigt, war jede Probe im Test für alle rekombinanten HCV Proteine positiv. Die Daten zeigen, daß die Reaktivität für die Probe A00642 mit pHCV-29 am größten war, und für die übrigen Antigene pHCV-23, c100-3 und pHCV-34 abnahm. Die Probe 423 reagierte am stärksten mit den rekombinanten Proteinen, die pHCV-29 und pHCV-34 exprimierten, und in einem niedrigeren Ausmaß auch mit pHCV-23 und c100-3.

BEISPIEL 7 HCV CKS-NS5 EXPRESSIONSVEKTOREN

A. Herstellung von HCV CKS-NS5E

Acht individuelle Oligonukleotide, welche die Aminosäuren 1932-2191 des HCV-Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als ein 793 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment in den CKS- Fusionsvektor pJO200 geklont. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV-45, exprimierte das HCV CKS-NS5E Antigen unter Steuerung des Lac Promotors. Das HCV CKS-NS5E Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, neun Aminosäuren, die durch Linker DNA-Sequenzen beigesteuert werden und 260 Aminosäuren aus dem HCV NS4/NS5 Bereich (Aminosäuren 1932-2191). Fig. 25 zeigt eine schematische Darstellung des rekombinanten Antigens, exprimiert durch pHCV-45. Fig. 26 zeigt die DNA und Aminosäuresequenz des HCV CKS-NS5E rekombinaten Antigens, produziert durch pHCV-45. Fig. 27 zeigt die Expression von pHCV-45 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat enthaltend pHCV-45, das HCV CKS-NS5E Antigen exprimiert (Aminosäuren 1932-2191), vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthielten das Lysat nach jeweils zwei und vier Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-45 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit entsprechend einer molekularen Größe von 55.000 Dalton aufweist. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 57.597 Dalton.

B. Herstellung von HCV CKS-NS5F

Elf individuelle Oligonukleotide, die die Aminosäuren 2188-2481 des HCV Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als ein 895 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment in den CKS- Fusionsvektor pJO200 geklont. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV-48, exprimierte das HCV CKS-NS5F Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS5F Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, acht Aminosäuren beigesteuert von Linker DNA-Sequenzen, und 294 Aminosäuren aus dem HCV NS5 Bereich (Aminosäuren 2188-2481). Fig. 28 zeigt eine schematische Darstellung des rekombinanten Antigens exprimiert durch pHCV-48. Fig. 29 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten HCV CKS-NS5F Antigens, produziert durch pHCV-48. Fig. 30 zeigt die Expression von pHCV-48 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthält das E. coli Lysat enthaltend pHCV-48, das das HCV CKS-NS5F Antigen (Aminosäuren 2188-2481) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-48 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit besitzt, die einer molekularen Größe von 65.000 Dalton entspricht. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 58.985 Dalton.

C. Herstellung von HCV CKS-NS5G

Sieben individuelle Oligonukleotide, die die Aminosäuren 2480-2729 des HCV-Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als ein 769 Basenpaar EcoRl-BamHl Fragment in dem CKS Fusionsvektor pJO200 geklont. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV-51, exprimiert das HCV CKS-NS5G Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS5G Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, acht Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA Sequenzen, und 250 Aminosäuren aus dem HCV NS5 Bereich (Aminosäuren 2480-2729). Fig. 31 zeigt eine schematische Darstellung des rekombinaten Antigens, exprimiert durch pHCV-51. Fig. 32 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des rekombinanten HCV CKS-NS5G Antigens, produziert durch pHCV- 51. Fig. 33 zeigt die Expression von pHCV-51 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat, enthaltend pHCV-51, das HCV CKS-NS5G Antigen exprimiert (Aminosäuren 2480-2729), vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-51 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit entsprechend einer molekulen Größe von 55.000 Dalton aufweist. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 54.720 Dalton.

D. Herstellung von HCV CKS-NS5H

Sechs individuelle Oligonukleotide, die die Aminosäuren 2728-2867 des HCV-Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als ein 439 Basenpa ar EcoRl-BamHl Fragment in den CKS- Fusionvektor pJO200 geklont. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV-50, exprimiert das HCV CKS-NS5H Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS5H Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, acht Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA Sequenzen, und 140 Aminosäuren aus dem HCV NS5 Bereich (Aminosäuren 2728-2867). Fig. 34 stellt eine schematische Darstellung des rekombinanten Antigens dar, exprimiert durch pHCV-50. Fig. 35 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen des HCV CKS-NS5H rekombinanten Antigens dar, das durch pHCV-50 produziert wird. Fig. 36 zeigt die Expression von pHCV-50 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat, enthaltend pHCV-50, das das HCV CKS-NS5H Antigen exprimiert (Aminosäuren 2728-2867), vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthielten es 2 bzw. 4 Stunden nach Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-50 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit hat, entsprechend einer molekularen Größe von 45.000 Dalton. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 42.783 Dalton.

E. Herstellung von HCV CKS-NS5I

Sechs individuelle Oligonukleotide, die die Aminosäuren 2866-3011 des HCV-Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als ein 460 Basenpaar EcoRI-BamHI Fragment in den CKS-Vektor pJO200 geklont. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV- 49, exprimiert das HCV CKS-NS5I Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS5I Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, acht Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA- Sequenzen, und 146 Aminosäuren aus dem HCV NS5 Bereich (Aminosäuren 2866-3011). Fig. 37 zeigt eine schematische Darstellung des rekombinanten Antigens, das durch pHCV-49 exprimiert wird. Fig. 38 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen des rekombinanten HCV CKS-NS5I Antigens dar, das durch pHCV-49 produziert wird. Fig. 39 zeigt der Expression von pHCV-49 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat, enthaltend pHCV-49, das das HCV CKS-NS5I Antigen (Aminosäuren 2866-3011) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-49 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit aufweist, entsprechend einer molekularen Größe von 42.000 Dalton. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 43.497 Dalton.

F. Immunblot von HCV CKS-NS5 Antigenen

Induzierte E. coli Lysate, die pHCV-23, pHCV-45, pHCV-48, pHCV-51, pHCV-50 oder pHCV-49 enthalten, wurden individuell auf den präparativen SDS/PAGE Gelen laufen gelassen, um die zahlreichen rekombinanten HCV CKS-NS5 oder HCV CKS-BCD Antigenassays von der Vielzahl von anderen E. coli Proteine zu trennen. Gelabschnitte, welche die getrennten individuellen rekombinanten HCV CKS-NS5 oder HCV CKS-BCD Antigene enthielten, wurden dann elektrophoretisch auf Nitrozellulose transferiert und das Nitrozelluloseblatt wurde in Streifen geschnitten. Fig. 40 zeigt die Ergebnisse einer Westerblotanalyse von zahlreichen Serum- oder Plasmaproben unter Verwendung dieser Nitrozellulosstreifen. Die Pfeile auf der rechten Seite zeigen die Position von jedem rekombinanten HCV CKS-BCD oder HCV CKS- NS5 Antigen an, und zwar von oben nach unten pHCV-23 (HCV CKS- BCD), pHCV-45 (HCV CKS-NS5E), pHCV-48 (HCV CKS-NS5F), pHCV-51 (HCV CKS-NS5G), pHCV-50 (HCV CKS-NS5H), pHCV-49 (HCV CKS-NS5I), und pJO200 (01%). Auswahl A enthielt fünf normale menschliche Plasmen, Auswahl B enthielt fünf normale menschliche Seren, Auswahl C enthielt zwanzig menschliche Seren positiv beim Abbott HCV EIA Test, Auswahl. D enthielt zwei Mausseren die gegen CKS gerichtet waren, und Auswahl E enthielt zwei normale Mausseren, Sowohl das HCV CKS-NS5E Antigen, exprimiert durch pHCV-45, und das HCV CKS-NS5F Antigen, exprimiert durch pHCV-48, waren bei der Untersuchung mit menschlichen Serumproben immunreaktiv, welche HCV Antikörper enthielten.

BEISPIEL 8 HCV CKS-C100

A. Herstellung von HCV CKS-C100 Vektoren

Achtzehn individuelle Oligonukleotide, die die Aminosäuren 1569-1931 des HCV-Genoms darstellen, wurden zusammenligiert und als vier getrennte EcoRI-BamHI Subfragmente in den CKS Fusionvektor pJO200 geklont. Nach der nachfolgenden DNA-Sequenzenbestätigung, wurden die vier Subfragmente geklont, mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, gelgereinigt, zusammenligiert und als ein 1102 Basenpaar EcoRI-BamHI Fragment in den CKS Fusionsvektor pJO200 geklont. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pHCV-24, exprimiert das HCV CKS-C100 Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-c100 Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, acht Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen, 363 Aminosäuren aus dem HCV NS4 Bereich (Aminosäuren 1569-1931) und 10 zusätzlichen Aminosäuren, beigesteuert durch Linker DNA Sequenzen. Das HCV CKS-c100 Antigen wurde in sehr niedrigen Niveaus durch pHCV-24 exprimiert.
Die schlechten Expressionsniveaus dieses rekombinanten HCV CKS-c100 Antigens wurden überwunden, indem zwei zusätzliche Klone konstruiert wurden, die Deletionen im extremen aminoterminalen Abschitt des HCV c100 Bereiches enthielten. Der erste dieser Klone, bezeichnet als pHCV-57, enthält eine 23-er Aminosäuredeletion (HCV Aminosäuren 1575-1597) und wurde konstruiert, indem ein 69 Basenpaar Ddel Restrikitonsfragment deletiert wurde. Der zweite dieser Klone, bezeichnet als pHCv- 58, enthält eine 21 Aminosäurendeletion (HCV Aminosäuren 1600- 1620) und wurde konstruiert, indem ein 63 Basenpaar NlalV-Haelll Restriktionsfragment deletiert wurde. Fig. 41 zeigt eine schematische Darstellung der rekombinanten Antigene, exprimiert durch pHCV-24, pHC-57, und pHCV-58. Fig. 42 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des rekombinanten HCV-C100D1 Antigens, produziert durch pHCV-57. Fig. 43 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten HCV-C100D2 Antigens, produziert von pHCV-58. Fig. 44 zeigt die Expression von pHCV- 24, pHCV-57 und pHCV-58 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat enthaltend pHCV-24, das HCV CKS-c100 Antigen exprimiert, (Aminosäure 1569-1931), vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Bahn 4 enthielt das E. coli Lysat, das pHCV-57 enthält, das das HCV-CKS- C100D1 Antigen (Aminosäuren 1569-1574 und 1598-1931) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 5 und 6 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Bahn 7 enthielt das E. coli Lysat pHCV-58, das das HCV CKS-C100D2 Antigen (Aminosäure 1569-1599 und 1621-1931) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 8 und 9 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl das pHCV-57 als auch das pHCV-58 Fusionsprotein bei einem signifikant höheren Niveau exprimieren als das pHCV-24 Fusionsprotein, und daß sowohl pHCV-57 als auch pHCV-58 Fusionsproteine eine ersichtliche Beweglichkeit besitzen, die einer molaren Größe von 65.000 Dalton entspricht. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 64.450 Dalton für pHCV-57 und von 64.458 Dalton für pHCV-58.

BEISPIEL 9 HCV PCR ABGELEITETE EXPRESSIONSVEKTOREN

A. Herstellung von HCV DNA Fragmenten

RNA wurde aus dem Serum von verschiedenen Schimpansen oder Menschen welche mit HCV infiziert waren, extrahiert, indem zunächst die Proben einer Verdauung mit Proteinase K und SDS während 1 Stunde bei 37ºC unterworfen wurden, gefolgt durch zahlreiche Phenol : Chloroformextraktionen. Die RNA wurde dann durch mehrere Ethanolprezipitationen konzentriert und in Wasser resuspendiert. Die RNA Proben wurden dann gemäß den Anweisungen der Hersteller rücktranscribiert, unter Verwendung eines spezifischen Primers. Ein zweiter Primer wurde dann hinzugefügt und PCR Amplifikation wurde gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Ein Anteil dieser PCR Reaktion wurde dann einer zusätzlichen PCR-Runde unterworfen, unter Verwendung von eingenisteten Primern, die sich innerhalb des ersten Satzes von Primern befanden. Im allgemeinen enthielten diese Primer ebenfalls Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen, um für weiteres Klonieren verwendet zu werden. Ein Anteil dieser in der zweiten Runde eingenisteten PCR-Reaktion wurde dann einer Agarosegelelektrophorese und Southernblot Analyse unterzogen, um die Spezifität der PCR-Reaktion zu bestätigen. Der Überstand der PCR-Reaktion wurde dann mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, das interessierende HCV-DNA Fragment wurde gelgereinigt, und an einen geeigneten Klonierungsvektor ligiert. Diese Ligierung wurde dann in E. coli transformiert und einzelne Kolonien wurden isoliert und die Plasmid DNA für die DNA- Sequenzanalyse vorbereitet. Die DNA-Sequenzen wurden dann beurteilt, um zu bestätigen, daß der interessierende spezifisch HCV codierende Bereich intakt war. HCV DNA Fragmente, die auf diese Art und Weise erhalten worden waren, wurden dann in geeignete Vektoren für die Expressionsanalyse geklont.

B. Herstellung von HCV CKS-NS3

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurde ein 474 Basenpaar DNA Fragment aus dem mutmaßlichen NS3 Bereich von HCV durch PCR erzeugt. Dieses Fragment stellt die HCV Aminosäuren Nr. 1473-1629 dar und wurde in den CKS Expressionsvektor pJO201 durch Ligation des stumpfen Endes geklont. Der resultierende Klon, bezeichnet als pHCV-105, exprimiert das HCV CKS-NS3 Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS3 Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, 12 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA Sequenzen, 157 Aminosäuren aus dem HCV NS3 Bereich (Aminosäuren 1473-1629) und 9 weiteren Aminosäuren beigesteuert durch Lnker DNA Sequenzen. Fig. 45 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-105 Antigens. Fig. 46 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des rekombinanten. HCV CKS-NS3 Antigens, das von pHCV-105 erzeugt wird. Fig. 47 zeigt die Expression von pHCV-105 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat, das pHCV-105 enthält, das HCV CKS-N53 Antigen (Aminosäuren 1472- 1629) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 2 und 3 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-105 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit aufweist, die einer molekularen Masse von 43.000 Dalton entspricht. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 46.454 Dalton [sic!].

C. Herstellung von HCV CKS-5'ENV

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurde ein 489 Basenpaar DNA-Fragment aus dem mutmaßlichen Hüllbereich des HCVs durch PCR erzeugt. Dieses Fragment stellt die HCV- Aminosäuren 114-276 dar und wurde in den CKS-Expressionsvektor pJO202 unter Verwendung von EcoRI-BamHI Restriktionsstellen geklont. Der resultierende Klon, bezeichnet als pHCV-103, exprimiert das HCV CKS-5'ENV Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-5'ENV Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, 7 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen, 163 Aminosäuresequenzen aus dem HCV Hüllbereich (Aminosäuren 114-276), und 16 weiteren Aminosäuren, beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen. Fig. 48 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-103 Antigens. Fig. 49 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des HCV CKS-5'ENV rekombinanten Antigens, das von pHCV-103 produziert wird. Fig. 47 zeigt die Expression von pHCV-103 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat, enthaltend pHCV-103, das das HCV CKS-5'ENV Antigen (Aminosäuren 114-276) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 5 und 6 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-103 Fusionsprotein eine ersichtliche Mobilität aufweist, die einer molekularen Masse von 47.000 Dalton entspricht. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 46.091 Dalton.

D. Herstellung von HCV CKS-3'ENV

Unter Verwendung der oben genannten Verfahren, wurde ein 621 Basenpaar DNA-Fragment aus dem mutmaßlichen Hüllbereich von HCV durch PCR erzeugt. Dieses Fragment stellt die HCV- Aminosäuren 263-469 dar und wurde in den CKS-Expressionsvektor pJO202 unter Verwendung von EcoRI Restriktionsstellen geklont. Der resultierende Klon, bezeichnet als pHCV-101, exprimiert das HCV CKS-3'ENV Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-3'ENV Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, 7 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen, 207 Aminosäuren aus dem HCV Hüllbereich (Aminosäuren 263-469), und 15 zusätzlichen Aminosäuren, beigesteuert durch Linker DNA- Sequenzen. Fig. 50 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-101 Antigens. Fig. 51 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des rekombinanten HCV CKS-3'ENV rekombinanten Antigens, das durch pHCV-101 produziert wird.
Fig. 47 zeigt die Expression von pHCV-101 Proteinen in E. coli. Bahn 7 enthielt das E. coli Lysat, enthaltend pHCV-101, das das HCV CKS-3'ENV Antigen (Aminosäuren 263-469) exprimiert, vor der Induktion, und Bahnen 8 und 9 enthalten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-101 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit entsprechend einer molekularen Massen von 47.000 Dalton aufweist. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten molekularen Masse von 51.181 Dalton.

E. Herstellung von HCV CKS-NS2

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurde ein 636 Basenpaar DNA-Fragment aus dem mutmaßlichen NS2 Bereich des HCV durch PCR erzeugt. Dieses Fragment stellt die HCV- Aminosäuren 994-1205 dar und geklont in den CKS- Expressionsvektor pJO201 unter Verwendung von EcoRI Restriktionsstellen wurde. Der resultierende Klon, bezeichnet als pHCV-102, exprimiert das HCV CKS-NS2 Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS2 Antigen besteht aus 239 Aminosäuren des CKS, 7 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA Sequenzen, 212 Aminosäuren aus dem HCV NS2 Bereich (Aminosäuren 994-1205), und 16 weiteren Aminosäuren, beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen. Fig. 52 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-102 Antigens. Fig. 53 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten HCV CKS-NS2 Antigens, produziert von pHCV-102. Fig. 54 zeigt die Expression von pHCV- 102 Proteinen in E. coli. Bahn 1 enthielt das E. coli Lysat, enthaltend pHCV-102, das das HCV CKS-NS2 Antigen (Aminosäuren 994-1205) exprimiert, und Bahnen 2 und 3 enthielten es 2 bzw. 4 Stunden nach der Induktion. Diese Ergebnisse zeigen, daß das pHCV-102 Fusionsprotein eine ersichtliche Beweglichkeit besitzt, die einer molekularen Masse von 53.000 Dalton entspricht. Dies entspricht in akzeptabler Weise der vorhergesagten Masse von 51.213 Daltons.

F. Herstellung von HCV CKS-NS1

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurde ein 654 Basenpaar DNA Fragment aus dem mutmaßlichen NS1 Bereich des HCV durch PCR erzeugt. Dieses Fragment stellt die HCV- Aminosäuren 617-834 dar und wurde in den CKS Expressionsvektor pJO200 unter Verwendung von EcoRI-BamHI Restriktionsstellen geklont. Der resultierende Klon, bezeichnet als pHCV-107 exprimiert das HCV CKS-NS1 Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-NS1 Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, 10 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA Sequenzen und 218 Aminosäuren aus dem HCV NS1 Bereich (Aminosäuren 617- 834). Fig. 55 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-107 Antigens. Fig. 56 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz des rekombinanten HCV CKS-PdS1 Antigens, produziert von pHCV-107.

G. Herstellung von HCV CKS-ENV

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurde ein 1068 Basenpaar DNA Fragment aus dem mutmaßlichen Hüllbereich von HCV durch PCR erzeugt. Dieses Fragment stellt die HCV Aminosäuren Nr. 114-469 dar, und wurde in den CKS- Expressionsvektor pJO202 unter Verwendung von EcoRI Restriktionsstellen geklont. Der entstehende Klon, bezeichnet als pHCV-104, exprimiert das HCV CKS-ENV Antigen unter Steuerung des lac Promotors. Das HCV CKS-ENV Antigen besteht aus 239 Aminosäuren von CKS, 7 Aminosäuren beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen, 356 Aminosäuren aus dem HCV Hüllbereich (Aminosäuren 114-469) und 15 weiteren Aminosäuren, beigesteuert durch Linker DNA-Sequenzen. Fig. 57 zeigt eine schematische Darstellung des pHCV-104 Antigens. Fig. 58 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des rekombinanten HCV CKS-ENV Antigens, das von pHCV-104 produziert wird.
Die rekombinanten Antigene, entweder alleine oder in Kombination, können in den Assayformaten verwendet werden, die hierin bereitgestellt und in den Beispielen verdeutlicht sind. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, daß diese rekombinanten Antigene verwendet werden können, um spezifische Inhibitoren viraler Replikation zu entwickeln und für therapeutische Zwecke verwendet werden können, sowie beispielsweise für Vaccine. Andere Anwendungen und Abwandlungen der Verwendung dieser Antigene und der spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung wie sie hier gezeigt ist, sind für Fachleute ersichtlich. Demgemäß soll die Erfindung nur im Sinne der beigefügten Ansprüche eingeschränkt sein.

Claims

1. Assay zur Identifizierung der Anwesenheit eines Antikörpers, der gegenüber einem HCV-Antigen in einer flüssigen Probe immunologisch reaktiv ist, wobei der Assay das In-Kontakt- Bringen der Probe mit folgendem umfaßt:

(a) mindestens zwei rekombinanten Proteinen, wobei ein rekombinantes Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert und eines Polypeptids, das das HCV-Genom von sowohl den Aminosäuren 1192- 1457 als auch 1676-1931, wie in den Fig. 1, 11 und 12 definiert, darstellt und wobei das zweite rekombinante Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und einem Polypeptid, das das HCV Genom von den Aminosäuren 1-150, wie in den Fig. 1, 5 und 6 definiert, darstellt, oder

(b) mindestens zwei Polypeptiden, wobei ein Polypeptid zwei nicht benachbarte codierende Bereiche des HCV-Genoms von den Aminosäuren 1192-1457 und 1676-1931 darstellt und das zweite Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wobei das erste und zweite Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer der Expression als Fusionen mit einem Polypeptid, für das das CKS-Gen codiert, erhältlich sind,

unter Bedingungen, die zur Komplexbildung des Antikörpers mit dem Polypeptid, und zum Nachweis des Antikörper- Polypeptidkomplexes geeignet sind.

2. Assay zur Identifizierung der Anwesenheit eines Antikörpers, der gegenüber einem HCV-Antigen in einer flüssigen Probe immunologisch reaktiv ist, wobei der Assay das In-Kontakt- Bringen der Probe mit folgendem umfaßt:

(a) mindestens drei rekombinanten Proteinen, wobei ein rekombinantes Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und eines Polypeptids, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1192-1457 darstellt, und das aus dem Plasmid nach Fig. 9 und aus dem Stamm erhältlich ist, der unter der ATCC Zugangsnummer 68381 hinterlegt wurde, und wobei das zweite rekombinante Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und eines Polypeptids, das das HCV- Genom von den Aminosäuren 1676-1931 darstellt, und das aus dem Plasmid nach Fig. 8 und aus dem Stamm erhältlich ist, der unter der ATCC Zugangsnummer 68380 hinterlegt wurde, und wobei das dritte rekombinante Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und eines Polypeptids, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wie in den Fig. 1, 5 und 6 definiert, oder

(b) mindestens drei. Polypeptiden, wobei ein Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1192-1457 darstellt, das zweite Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1676-1931 darstellt, und das dritte Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, und wobei das erste, zweite und dritte Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer der Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich sind, für das das CKS-Gen codiert,

unter Bedingungen, die zur Komplexbildung des Antikörpers mit dem Polypeptid und zum Nachweis des Antikörper- Polypeptidkomplexes geeignet sind.

3. Ein Bestätigungsassay zum Identifizieren der Anwesenheit eines Antikörpers in einer flüssigen Probe, wobei der Antikörper gegenüber einem HCV-Antigen immunologisch reaktiv ist, wobei die Probe verwendet wird, um einen ersten und zweiten immunologisch gleichwertigen aliquoten Anteil herzustellen, wobei der Bestätigungsassay folgende Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen des ersten aliquoten Anteils mit

(i) mindestens zwei rekombinanten Proteinen, wobei ein rekombinantes Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert und eines Polypeptids, das das HCV-Genom von den beiden Aminosäuren 1192- 1457 und 1676-1931, wie in den Fig. 1, 11 und 12 definiert, darstellt, und wobei das zweite rekombinante Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und eines Polypeptids, das das HCV- Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wie in den Fig. 1, 5 und 6 definiert, oder

(ii) mindestens zwei Polypeptiden, wobei ein Polypeptid zwei nicht benachbarte codierende Bereiche des HCV-Genoms von den Aminosäuren 1192-1457 und 1676-1931 darstellt, und wobei das zweite Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren von 1-150 darstellt, wobei das erste und zweite Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer der Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich sind, für das das CKS-Gen codiert,

unter Bedingungen, die zur Komplexbildung des Antikörpers mit dem Polypeptid geeignet sind, und wobei der erste Antikörper- Antigenkomplex nachgewiesen wird, und

(b) In-Kontakt-Bringen des zweiten aliquoten Anteils mit einem Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht:

synthetischen Polypeptiden, welche die Aminosäuren 1866-1930, 1684-1750, 1-75 oder 1689-1805 der HCV-Sequenz darstellen, einem Schimärenprotein aus Peroxiddismutase und dem HCV 33 Bereich von Fig. 1,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1676- 1931 darstellt, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1192- 1457 darstellt, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das zwei nicht benachbarte codierende Bereiche des HCV-Genoms der Aminosäuren 1192-1457 und 1676-1931 darstellt, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von Aminosäure 1-150 darstellt, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von Aminosäuren 1569-1931 darstellt, das eine 23-Aminosäuren-Deletion der HCV-Aminosäuren 1575-1597 enthält, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1569- 1931 darstellt, das eine 21-Aminosäuren-Deletion der HCV- Aminosäuren 1600-1620 enthält, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS-Gen codiert,

unter Bedingungen, die geeignet sind, einen zweiten Antikörper-Antigenkomplex zu bilden; und Nachweis des zweiten Antikörper-Antigenkomplexes; wobei die Polypeptide, die beim ersten aliquoten Anteil gewählt werden, nicht die gleichen sind, wie die Polypeptide, die beim zweiten aliquoten Anteil gewählt werden.

4. Ein Bestätigungsassay zur Identifizierung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer flüssigen Probe, der gegenüber einem HCV Antigen immunologisch reaktiv ist, wobei die Probe verwendet wird, um einen ersten und zweiten immunologisch gleichwertigen aliquoten Anteil herzustellen, wobei der Bestätigungsassay folgende Schritte umfaßt:

(a) das In-Kontakt-Bringen des ersten aliquoten Anteils mit

(i) mindestens drei rekombinanten Proteinen, wobei ein rekombinantes Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und eines Polypeptids, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1192- 1457 darstellt, das von dem Plasmid nach Fig. 9 codiert werden kann, und das aus dem Stamm erhältlich ist, der unter der ATCC Zugangsnummer 68381 hinterlegt worden ist, wobei das zweite rekombinante Protein ein Fusionsprotein des Polypeptids ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und eines Polypeptids, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1676-1931 darstellt, das aus dem Plasmid nach Fig. 8 erhältlich ist, und das aus dem Stamm erhältlich ist, der unter der ATCC Zugangsnummer 68380 hinterlegt worden ist, und wobei das dritte rekombinante Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert und einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wie in den Fig. 1, 5 und 6 definiert, oder

(ii) mindestens drei Polypeptiden, wobei ein Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1192-1457 darstellt, wobei das zweite Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1676-1931 darstellt, und wobei das dritte Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wobei das erste, zweite und dritte Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich sind, für das das CKS-Gen codiert,

synthetischen Polypeptiden, die die Aminosäuren 1866-1930, 1684-1750, 1-75 oder 1689-1805 der HCV Sequenz darstellen,

einem Schimären-Protein von Peroxiddismutase und der HCV 33 Region von Fig. 1,

einem Polypeptid, das zwei nicht benachbarte codierende Regionen des HCV-Genoms von den Aminosäuren 1192-1457 und 1676- 1931 darstellt, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS- Gen codiert,

einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1569- 1931 darstellt, das eine 23-Aminosäuren-Deletion der HCV- Aminosäuren 1575-1597 enthält, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich ist, für das das CKS-Gen codiert,

unter Bedingungen, die zur Ausbildung eines zweiten Antikörper-Antigenkomplexes geeignet sind;

und Nachweis des zweiten Antikörper-Antigenkomplexes, wobei die Polypeptide, die im ersten aliquoten Anteil gewählt werden, nicht die gleichen sind, wie die Polypeptide, die in dem zweiten aliquoten Anteil gewählt werden.

5. Bestätigungsassay nach Anspruch 3 oder 4, wobei in Schritt (b) der zweite aliquote Anteil weiter mit einem oder mehreren Polypeptiden in Kontakt gebracht werden kann, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus den Polypeptiden besteht, die das HCV- Genom von den Aminosäuren 1932-2191, 2188-2481, 2866-3011, 2728- 2867, 2480-2729, 263-469, 994-1205, 114-276, 114-469, 1472-1629, 617-834, wobei das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhalten wird, für das das CKS-Gen codiert.

6. Ein Immunoassaykit, das folgendes umfaßt:

(a) mindestens zwei rekombinante Proteine, wobei ein Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid, für das das E. coli CMP- KDO Synthetasegen (CKS) codiert und aus einem Polypeptid ist, das das HCV-Genom von den beiden Aminosäuren 1192-1457 und 1676- 1931 darstellt, wie in den Fig. 1, 11 und 12 definiert, und wobei das zweite rekombinante Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und aus einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wie definiert in den Fig. 1, 5 und 6 definiert, oder

(b) mindestens zwei Polypeptiden, wobei ein Polypeptid zwei nicht benachbarte codierende Bereiche des HCV-Genoms von den Aminosäuren von 1192-1457 und von 1676-1931 darstellt, und wobei das zweite Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wobei das erste und zweite Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich sind, für das das CKS-Gen codiert;

eines odere mehrere Proben-Vorbereitungsreagenzien;

und eines oder mehrere Nachweis- und signalerzeugende Reagenzien.

7. Immunoassaykit, der folgendes umfaßt:

(a) mindestens drei rekombinante Proteine, wobei ein rekombinantes Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und aus einem Polypeptid, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1192- 1457 darstellt, das aus dem Plasmid nach Fig. 9 und aus dem Stamm erhältlich ist, der unter der ATCC Zugangsnr. 68381 hinterlegt worden ist, wobei das zweite rekombinante Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid, für das das E. coli CMP- KDO Synthetasegen (CKS) codiert, und aus einem Polypeptid ist, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1676-1931 darstellt, das aus dem Plasmid nach Fig. 8 und aus dem Stamm erhältlich ist, der unter der ATCC Zugangsnr. 68380 hinterlegt worden ist, und wobei das dritte rekombinante Protein ein Fusionsprotein aus dem Polypeptid ist, für das das E. coli CMP-KDO Synthetasegen (CKS) codiert und aus einem Polypeptid ist, das das HCV-Genom von den Aminosäuren 1-150 darstellt, wie in den Fig. 1, 5 und 6 definiert, oder

(b) mindestens drei Polypeptide, wobei ein Polypeptid das HCV- Genom von den Aminosäuren 1192-1457 darstellt, das zweite Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren 1676-1931 darstellt, und das dritte Polypeptid das HCV-Genom von den Aminosäuren von 1-150 darstellt, wobei das erste, zweite und dritte Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Methodologien außer als durch Expression als Fusionen mit einem Polypeptid erhältlich sind, für die das CKS-Gen codiert;

eines oder mehrere Proben-Vorbereitungsreagenzien;

und eines oder mehrere Nachweis- und signalerzeugende Reagenzien.