DE69125263T2

DE69125263T2 - Verfahren für schnellen mikrobiologischen nachweis

Info

Publication number: DE69125263T2
Application number: DE69125263T
Authority: DE
Inventors: Stephen Paul Lewes East Sussex Bn7 3Na Denyer; Sabah Abdel Amir Clifton Nottingham Ng11 8Fy Jassim; Simon Fearon Bollington Macclesfield Sk10 5Bn Park; Catherine Elizabeth Dunn Keyworth Nottingham Ng12 5Jp Rees; Katalin Beeston Rylands Nottingham Ng5 1Qb Rostas-Mulligan; Gordon Sydney Anderson Birnie Loughborough Le11 0Ql Stewart
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Foundation For Innovative New Diagnostics Gen Ch
Priority date: 1990-08-09
Filing date: 1991-08-08
Publication date: 1997-09-18
Anticipated expiration: 2011-08-09
Also published as: ATE150489T1; ES2100955T3; GB9017443D0; EP0495960A1; CA2066561A1; US5498525A; JP3088014B2; US5723330A; CA2066561C; JPH05501958A; DE69125263D1; EP0495960B1; WO1992002633A1; DK0495960T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von Mikroben, d.h. Bakterien und Bakteriophagen, bei verschiedensten Fällen wie z.B. Lebensmitteln, klinischen Proben sowie Proben ökologischer Wichtigkeit. Die Erfindung läßt sich auch auf die Untersuchung von Empfindlichkeit gegen antibakterielle Verbindungen und die Wirksamkeit viruzider Mittel anwenden.

Hintergrund der Erfindung

Nachweis und Identifizierung von Bakterien sind bei verschiedenen mikrobiologischen Anwendungen von großem Interesse. So ist zum Beispiel die Notwendigkeit, Nahrungsmittel, Wasser und andere Getränke auf pathogene Bakterien zu untersuchen, von höchster Wichtigkeit für die Sicherheit der Konsumenten. Die Bestimmung der Niveaus gewisser Bakterienfamilien stellt einen häufig verwendeten Ansatz zur Abschätzung der Haltbarkeit und der Unbedenklichkeit solcher Produkte in bezug auf Mikroorganismen sowie des Hygieneniveaus der bei deren Herstellung verwendeten Verarbeitungsgeräte und Rohmaterialien dar. Die Diagnose von Mikroorganismen stützt sich weiterhin auf den Nachweis des Erregers. Die Überprüfung von Wasser in der Umwelt auf Organismen wie Legionella hat in letzter Zeit stark an Wichtigkeit gewonnen.
Der Wunsch, Bakteriophagen nachzuweisen (Viren, die spezifisch Bakterien infizieren), beruht auf deren Fähigkeit, Bakterien zu töten und folglich der katastrophalen Wirkung, die sie zum Beispiel auf die Fermentation von Milch ausüben können, dadurch, daß sie die Bakterien der Starterkultur töten. Bakteriophagen werden zum Beispiel auch in der Wasserwirtschaft als Nachweismittel verwendet, um Flußbewegungen oder das Auslaufen von Abwässern mengenmäßig zu bestimmen.
Die für Nachweis und Quantifizierung von Bakterien zur Verfügung stehenden Verfahren leiden unter verschiedenen Nachteilen. Konventionelle Verfahren auf Kulturgrundlage bilden die Grundlage der angewandten Prüfungen, da sie jedoch auf dem Bakterienwachstum beruhen, das häufig in selektiven Medien stattfindet, die ein Wachstum des gewünschten Organisms gestatten, während sie das Wachstum anderer Bakterien unterdrücken, sind sie naturgemäß langsam; für eine Gesamt- Lebendzellzahlbestimmung sind 18-24 Stunden, für den Nachweis von Salmonella 4-7 Tage erforderlich. Häufig wird die Anzahl der Bakterien unterschätzt, da die zur Verfügung gestellten Medien nicht den jeweils erforderlichen Wachstumsbedingungen entsprechen oder weil sie subletale Verletzungen erlitten haben oder sich in einem streßinduzierten physiologischen Zustand befinden, in dem sie lebensfähig sind, jedoch nicht kultiviert werden können. Verfahren auf Kulturgrundlage sind aufgrund der erforderlichen langen Inkubationszeiten nicht für das Prüfen vor Ort geeignet.
Um diesen Nachteilen zu begegnen und rasches Nachweisen von Bakterien zu gestatten, wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, wobei von einigen behauptet wird, daß sie sich für die Anwendung vor Ort eignen. So stellt zum Beispiel die Messung von Adenosintriphosphat (ATP), einem intrazellulären Bestandteil aller Lebewesen, eine Schnellmethode dar, welche jedoch nicht spezifisch ist und daher im besten Fall eine Schätzung der Bakterien-Gesamtpopulation gestattet.
Immuntest-Ansätze mit Antikörpern, die für die gewünschten Bakterien spezifisch sind, haben deshalb keine größere Bedeutung erlangt, da zum Beispiel bei einem Salmonella-Test aufgrund ungenügender Spezifität und Empfindlichkeit vor dem Immuntest zwei Tage lang eine Anreicherungskultur durchgeführt werden muß. Störung durch konkurrierende Organismen und das Probenmaterial haben zu einer nicht akzeptablen Anzahl falsch positiver und falsch negativer Resultate sowie zu Protokollen, die nicht wesentlich kürzer als eine Kultur dauern, geführt.
Verfahren, die auf DNA- oder RNA-Sonden beruhen, wurden zum Nachweis von Bakterien verwendet, leiden jedoch zur Zeit darunter, daß komplizierte Protokolle, unangenehme Chemikalien in einigen Lösungen sowie höhere Temperaturen erforderlich sind. Für technisches Personal mit einer Ausbildung in klassischer Mikrobiologie sind sie jedenfalls nicht benutzerfreundlich. Wie Immuntests und Nukleinsäureamplifizierungsmethoden, wie Polymerase Kettenreaktion (PCR), unterscheiden sie nicht unter lebenden und toten Bakterien. Sie sind dadurch für die direkte Prüfung von lebensfähigen Bakterien (ohne Kultivierungsschritt, bei dem sich die lebenden Organismen vermehren können) ungeeignet. Bei bestimmten Anwendungen ist diese Unterscheidung äußerst wichtig; wurden zum Beispiel Infektionsmittel verwendet, um zu garantieren, daß in einem Wassersystem sehr wenige lebende Exemplare von Legionella vorhanden sind, so ist die Verwendung eines Tests, der nicht zu einer Unterscheidung im Stande ist und die Organismen nachweist, die durch die Desinfektion getötet worden sind, nicht sinnvoll.
Es existiert eine Reihe von Ansätzen, die auf teuren Geräten zur Beschleunigung des Nachweises der Bakterien beruhen. Ein Beispiel hierfür ist die Impedanz-Leitfähigkeits-Messung, bei der das Vorhandensein von Bakterien dadurch nachgewiesen wird, daß sie komplexe Nährstoffe zu einfacheren Chemikalien metabolisieren, wobei gleichzeitig eine Veränderung der elektrischen Eigenschaften des Mediums stattfindet. Solche Verfahren sind äußerst kostspielig und für kleine Laboratorien oder für die Verwendung vor Ort unzweckmäßig. Mikroskopische Methoden, gegebenenfalls unter Verwendung selektiver Färbungen, sind bezüglich ihrer Empfindlichkeit beschränkt und gestatten im allgemeinen eine schlechte Unterscheidung zwischen lebenden und toten Bakterien. Wird routinemäßige Mikroskopie nicht mit selektiver Kultivierung oder immunologischer Färbung kombiniert, so gestattet sie lediglich eine mutmaßliche, auf Morphologie beruhende Bestimmung.
Angesichts der obigen Tatsachen ist es höchst wünschenswert, über Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Bakteriophagen zu verfügen, die einfach durchzuführen, spezifisch, schnell (Ergebnisse in Stunden und nicht Tagen erhältlich), zum Nachweis von ausschließlich lebenden Organismen und für die Verwendung vor Ort fähig sind und die ohne teure Instrumente auskommen. Die Tests wären vorzugsweise auf verschiedenste Probentypen ohne Vorbehandlung und mit sowenig Schritten wie möglich anzuwenden. Das Testergebnis sollte ein nachweisbares Ereignis sein, das leicht zu beobachten und einer automatischen Ablesung zugänglich ist. Es wäre weiterhin wünschenswert, wenn sich die Tests zum Nachweis von "disabled" Bakterien eignen würden, die anderenfalls möglicherweise einen Voranreicherungskultivierungsschritt und einen selektiven Anreicherungsschritt für ihren Nachweis erfordern würden. Außerdem sollten nichtkultivierbare, jedoch lebensfähige Organismen nachgewiesen werden.

Stand der Technik

Viele der Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen beruhten auf der klassischen Mikrobiologie unter Verwendung von Nähragarplatten. In jüngster Zeit wurde auch versucht, die Molekularbiologie sowie die Gentechnik auf diesem Gebiet anzuwenden. Insbesondere wurde von Ulitzur und Kuhn (Europäische Patentanmeldung 0168933) ein nachweisbarer Marker, häufig das Enzym Luciferase, in Bakteriophagen eingeführt, und diese Bakteriophagen können dann zum Nachweis von Bakterien verwendet werden. Veränderte Phagen werden Proben zugegeben, von denen man vermutet, daß sie das betreffende Bakterium, welches einen Wirt für diesen Bakteriophagen darstellt, enthalten. Ist ein geeigneter bakterieller Wirt vorhanden, so wird Bakteriophagen-Nukleinsäure diesen Wirt infizieren und in dem Bakterium exprimiert werden. Enthält der veränderte Bakteriophage den Marker Luciferase, so kann das Vorhandensein von Bakterien durch die Abgabe von Licht, das leicht gemessen werden kann, bestimmt werden.
In WO90/04041, DNA Plant Corporation, wird ein anderes Markersystem, nämlich Eiskernbildung, verwendet, sowie zusätzlich eine Gruppe von Phagen zur Typbestimmung.
In WO90/04037 werden gentechnisch veränderte Mikroorganismen als Indikatoren in einem Prüfsystem zum Nachweis verschiedener toxischer Substanzen verwendet.
In WO89/03878 wird ein auf Gentechnik beruhendes System beschrieben, das sich auf Eukaryontenviren anwenden läßt.
In US 4 797 363 werden Bakteriophagen verwendet, die mit verschiedenen Signalsystemen markiert worden sind. Die Markierung ist jedoch direkt chemisch und hängt nicht von der Expression zusätzlicher Gene ab.

Vorteile der neuen Erfindung

In auf Gentechnik beruhenden Systemen, die zum Nachweis von Bakterien Bakteriophagen verwenden, war es der Bakteriophage, der gentechnisch verändert wurde. Aus verschiedenen technischen Gründen ist so eine Veränderung nicht immer einfach durchzuführen. Ist eine Gruppe von Phagen zur Bestimmung von Bakterien erforderlich, dann ist für jeden Phagen der Gruppe eine ähnliche Veränderung erforderlich, wodurch das Problem vervielfacht wird. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gestattet die Verwendung von nichtgentechnisch veränderten Bakteriophagen mit der anschließenden Verwendung eines veränderten Bakteriums (bzw. einer Gruppe von veränderten Bakterien) mit dem nachweisbaren Marker. Das Bakterium ist technisch gesehen wesentlich einfacher zu verändern als der Bakteriophage.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt mehrere Verfahren zur Untersuchung bzw. zum Nachweis von Bakterien oder Bakteriophagen in einer Probe. Es gestattet auch die Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien gegen antibakterielle Mittel und die Beurteilung der Wirksamkeit viruzider Mittel. Es wird sowohl qualitativ als auch guantitativ untersucht.
Dies wird durch Ausnutzung der Wechselwirkung zwischen Bakteriophagen und Bakterien erreicht. Die Art und Weise, auf die ein Bakteriophage ein Bakterium infiziert, läßt sich zur Entwicklung von Tests verwenden. Die Wechselwirkung ist spezifisch, und sobald die Erkennung/Bindung stattgefunden hat, injiziert der Bakteriophage seine Nukleinsäure in das Wirtsbakterium. Der Wirt wird dann dazu verwendet, den produzierten "Phagen" zu replizieren und dann, sobald der Wirt aufbricht, weitere Bakterien zu infizieren.
Sobald der Phage die Zelle spezifisch infiziert und seine Nukleinsäure injiziert hat, ist er von der Umgebung außerhalb der Zelle geschützt. Ein Teil der Erfindung benutzt dies dazu, die Phagen, die nicht ein Bakterium spezifisch infiziert haben, zu töten oder zu entfernen. Enthält die Probe zum Beispiel Salmonella, dann wird der spezifische Phage geschützt werden, ist Salmonella nicht vorhanden, so wird kein Phage geschützt werden. Die Entfernung bzw. das Töten von nicht gebundenen Phagen kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, zum Beispiel durch viruzide Mittel, Hitze, Entfernung von für die Stabilität des Phagen wesentlichen Chemikalien usw.
Es ist klar, daß sich dieser Gesichtspunkt sehr stark von anderen Diagnoseansätzen mit Phagen unterscheidet, bei denen ein direkt oder indirekt markierter Phage an die Oberfläche eines Bakteriums binden gelassen wird und ungebundene Phagen vor Entwicklung eines Signais (enzymatisches Signal, Fluoreszenzsignal, Lumineszenzsignal usw.) abgespült werden. In diesem Fall laufen alle wichtigen Vorgänge außerhalb der Zelle ab, was ein deutlicher Unterschied zu der vorliegenden Erfindung ist.
Die nächste Stufe der Erfindung hängt von der nachzuweisenden Zellzahl ab. Die Anzahl der geschützen Bakteriophagen, die replizieren und austreten können, mag hoch genug sein, um direkt nachgewiesen zu werden. Ist dies nicht der Fall, so können sie dadurch amplifiziert werden, daß man sie lange genug (es kann sich dabei um eine kurze Zeitspanne handeln, da die Generationszeiten von Phagen unter 1 Stunde betragen und die produzierte Nachkommenschaft 10 - 1000 beträgt) auf einem Vermehrungswirt züchtet.
Wenn die Anzahl Phagen für den Nachweis ausreichen, kann dies durch ein bevorzugtes Verfahren geschehen, das auf der Entdeckung beruht, daß ein Bakterium gentechnisch konstruiert werden kann, das über das Potential, ein nachweisbares Signal zu produzieren (ein oder mehrere für einen leicht nachzuweisenden Phänotyp codierende Gene) verfügt, dieses Potential wird jedoch nur dann exprimiert, wenn das Bakterium mit einem Phagen infiziert ist. Der Phage löst die Erzeugung des Signals aus, und das Vorhandensein des Phagen (und daher des Bakteriums, das ihn geschützt hat) läßt sich auf empfindliche Weise und leicht nachweisen. Bei diesen Bakterien, die im vorliegenden Text als Reporterbakterien bezeichnet werden, handelt es sich per se um neue Materialien und sie stellen ebenfalls einen Erfindungsgegenstand dar.
Die Erfindung beinhaltet daher mehrere Untersuchungsverfahren, bei denen von zwei wesentlichen Merkmalen eines oder beide verwendet werden. Ein wesentliches Merkmal ist das Abtöten von außerhalb der Zelle befindlichen Bakteriophagen in einer flüssigen Probe, die auch mit Phagen infizierte Bakterien enthält. Das zweite wesentliche Merkmal ist, daß Reporterbakterien zur Verfügung gestellt werden, die so gentechnisch verändert sind, daß sie ein Indikatorgen haben, das bei Expression zu einem nachweisbaren Polypeptid führt. Die Expression des Indikatorgens wird nur durch Bakteriophageninfektion der Bakterien in Gang gesetzt. Die Art des Indikatorgens und das zum Nachweis des nachweisbaren Polypeptids verwendete Mittel sind nicht erfindungswesentlich.
Es folgen nun Abschnitte, in denen diese beiden wesentlichen Merkmale beschrieben werden. Hierauf schließt sich eine Beschreibung von verschiedenen erfindungsgemäßen Prüfungsverfahren an.

Differentielles Abtöten von Phagen

Bei Hirotani et al. (1991) wird die antivirale Wirkung von ungesättigten Fettsäuren und verwandten Alkoholen gegen T5-Phagen beschrieben. Wurde mit 3000 Lux (Lumen pro Quadratmeter) beleuchtet, so wurde mit C18:2-Linoelaidinsäure (LA) bei 50 µg/ml eine Inaktivierung von T5-Phagen von 97.6% erreicht. Es wurde nachgewiesen, daß ein Protokoll dieser Art die erwünschte differentielle Abtötung von Phagen bewirkt. Die flüssige Probe, die diesen Zusatz von Säure oder Alkohol enthält, wird mit Photonen bestrahlt, wobei Röhrenlicht durchaus geeignet ist. Verwendet man monochromatisches Licht, so beträgt die Wellenlänge vorzugsweise ungefähr 420 nm, obwohl sich bei ungefähr 530 nm eine Hilfswirkung bemerkbar macht. Eine genügend lange und genügend intensive Beleuchtung bewirkt die selektive Abtötung von außerhalb der Zelle befindlichen Bakteriophagen ohne Phagen, die Bakterien in der Probe infiziert haben, zu schädigen.
Eine andere Behandlungsmöglichkeit, um Phagen differentiell abzutöten, besteht darin, daß man die Probe mit einer C&sub1;- bis C&sub4;-Carbonsäure, wie Essigsäure, versetzt. Die Essigsäurekonzentration in der Probe beträgt vorzugsweise 0,01 bis 1,0%, insbesondere 0,1 bis 0,5%, wobei die Zahlen die Volumensprozente Eisessig in der Probe bedeuten. Ist die Konzentration zu niedrig, so werden die außerhalb der Zelle befindlichen Bakteriophagen nicht abgetötet; ist die Konzentration zu hoch, so können infizierte Bakterien in der Probe geschädigt werden. Die Probe wird eine zeitlang inkubiert, um die Essigsäure viruzid wirken zu lassen, z.B. Minuten bei 37ºC, und wird dann durch Zugabe einer Base wieder ungefähr neutral gestellt. Statt Essigsäure wurde Essig (5%) verwendet, wobei die Ergebnisse sehr ähnlich waren.
Nach dem Abtöten von außerhalb der Zelle befindlichen Bakteriophagen ist es häufig erforderlich, überlebende Phagen (innerhalb der infizierten Bakterien) in der Probe zu amplifizieren. Es scheint jedoch, daß die Bakteriophageninfektion von Bakterien bei Umgebungstemperatur oder darüber möglicherweise die Bakterien gegen die anschließende Behandlung mit Essigsäure sensibilisiert, so daß die Bakterien anschließend die Phagen nicht richtig amplifizieren. Eine bevorzugte Lösung für dieses Problem ist die Durchführung der Bakteriophageninfektion von Bakterien in der Probe bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur. Die Probe kann sich zum Beispiel in einem Eisbad bei 0ºC befinden. Sogar bei diesen niedrigen Temperaturen findet die Phageninfektion auf wirksame Weise statt, und die entstandenen infizierten Bakterien sind nicht mehr gegen die Essigsäurebehandlung empfindlich.
Bei Organismen, die selbst säureempfindlich sind, z.B. Pseudomonadaceae, mag solch eine Behandlung nicht wirksam sein. Bei einer möglichen anderen Behandlung wird eine Mischung aus Wasserstoffperoxid und Natriumhydroxid verwendet.

Herstellung von Reporterbakterien

Im allgemeinen erfordert die erfolgreiche Bakteriophageninfektion (Phageninfektion) die sequentielle Expression von Gengruppen. Bei Untersuchungen verschiedener Bakteriophagen wurden unterschiedliche biologische Strategien für temporale Regulation identifiziert (siehe z.B. Rabussay und Geiduschek, 1977; McKnight und Tjian, 1986). Diese Strategien beinhalten meistens transkriptionelle Kontrolle. Die klassischerweise beschriebenen Strategien setzen beim Transkriptionsstart an (Jacob und Monod, 1961; Ptashne, 1986).
Bei einem anderen, zuerst für den Phagen Lambda beschriebenen Mechanismus werden die gleichen Promoter, die für die Transkription von frühzeitig bei der Infektion exprimierten Genen verwendet werden, dazu verwendet, mittels eines Transkript-Antiterminationsvorgangs Gene später zu transkribieren (Roberts, 1969). Operons, die diese Art von Kontrolle ausüben, werden so angeordnet, daß Gene, die sich Promoter-proximal zum Terminationssignal befinden, maximal exprimiert werden können, während Gene, die sich Promoter-distal zum Terminationssignal befinden, nicht oder nur wenig exprimiert werden. Diese letztgenannten Gengruppen werden exprimiert, wenn eine physiologische Veränderung oder eine Veränderung der Umwelt die Aktivität des Terminationssignals eliminiert. Die Art der Terminationssignale und die Art der Antiterminationsfaktoren sind höchst unterschiedlich (Platt, 1986).
Mit den Werkzeugen und Techniken der Molekularmikrobiologie kann man ein Bakteriophagengenom zerschneiden und Elemente dieses Genoms in autonom replizierende Plasmidvektoren klonieren. Von einer Bibliothek solcher zufällig hergestellten Konstrukte könnten diejenigen, die einen Bakteriophagenpromoter enthalten, Promoter-proximale Gene exprimieren; jeweils unter der Bedingung, daß der Promoter die normale, Rifampicin-empfindliche bakterielle RNA-Polymerase verwendet. Enthielt die klonierte Bakteriophagen-DNA außer einem Promoter auch ein Terminationssignal, so würden Promoter-proximale Gene exprimiert, jedoch Promoter- Terminator-distale Gene würden nicht exprimiert. Diese Promoter-distalen Gene könnten nur dann exprimiert werden, wenn das richtige vom Bakteriophagen codierte Antiterminationssignal gegeben würde, und dieses kann auf dem klonierten DNA-Abschnitt durchaus fehlen. Der trans-wirkende Antiterminationsfaktor könnte jedoch als natürlicher Teil der der Bakteriophageninfektion entsprechenden temporal kontrollierten Genexpression zur Verfügung gestellt werden. Anders ausgedrückt könnten in ein Plasmid klonierte Promoter-distale Gene stromabwärts eines Transkriptionsterminators nur während Bakteriophageninfektion exprimiert werden. Werden die natürlich vorkommenden Bakteriophagengene durch ein Indikatorgen wie luxAluxB, dessen Produkt leicht verfolgt werden kann, ersetzt, so führt eine phagenabhängige Antitermination zur Expression des Indikatorgen- Phänotyps. Bei einem Konstrukt mit luxAluxB würde dies bedeuten, daß das anfängliche Plasmidvektorkonstrukt dunkel sein würde, daß jedoch während der Bakteriophageninfektion Biolumineszenz entstehen würde. Obwohl die Expression von luxAluxB und Biolumineszenz ein bevorzugtes Indikatorsystem darstellen, könnten andere Indikatorsysteme, die die Kontrolle eines trans-wirkenden Antiterminationsereignisses im Anschluß an Bakteriopha geninf ektion erleichtern, verwendet werden.
Durch vorhandene Kenntnis der molekularen Architektur und der Genkontrolimechanismen von Bakteriophagen wie Lambda ∅80, P2, P22, Hk022 und 21 wäre es den Fachleuten möglich, spezifische DNA-Regionen zu identifizieren, die in vitro isoliert und für die Herstellung eines wie oben definierten Konstrukts verwendet werden könnten. Diese eingehende Kenntnis ist zwar hilfreich, jedoch nicht nötig, da ein statistisches Klonieren des Genons eines genetisch nicht charakterisierten Bakteriophagen zu ebenso wirksamen Konstrukten führen kann.
Bei dem Bakteriophagen 23074-B1 (ATCC) handelt es sich um einen Listeria moncytogenes-Serotyp-4-Phagen, dessen Genom nicht charakterisiert ist. Das Genom von 23074-B1 wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3a partiell verdaut und die DNA-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle von Plasmid pSB292 mit dem pCK1-Grampositiv-Replicon (Gasson & Anderson, 1985) und einer promoterfreien Kopie der luxAluxB-Gene (Figur 1) ligiert. Mit der Ligationsreaktionsmischung transformierte man Listeria monocytogenes 23074 auf Chloramphenicolresistenz, und rekombinante Klone wurden auf einen biolumineszenten Phenotyp überprüft. Klone ohne konstitutive Biolumineszenz (dunkle Klone) wurden weiter auf Biolumineszenz geprüft, nachdem sie mit dem Bakteriophagen 23074-B1 infiziert worden waren. Klone mit phagenabhängiger Biolumineszenz wurden identifiziert. Figur 2 stellt das Biolumineszenzprofil solch eines Konstrukts (pSP19) nach Phageninfektion dar. Zwischen phageninfizierten und nicht infizierten Zellen wurde ein 1000- facher Unterschied bezüglich deren Biolumineszenz beobachtet. pSP19 sowie Konstrukte mit ähnlichen Phänotypen bilden die Basis für den Nachweis für das Vorhandensein des Bakteriophagen 23074-B1.pSP19 wurde ohne vorhergehende Kenntnis des Phagengenons konstruiert und beschreibt den Selektionsvorgang artmäßig. Mit einem ähnlichen Protokoll könnte man andere Bakteriophagen für Listeria monocytogenes auffinden.
Es ist bekannt, daß nicht alle Bakteriophagen die temporale Genexpression mittels Antitermination kontrollieren. T7 zum Beispiel stellt eine neue rifampicinresistente RNA-Polymerase zur Verfügung, die die Transkription von neuartigen T7-RNA-polymerasespezifischen Bakteriophagen-Promotern fördert (Chamberlin et al., 1970). Würde man andere Phagen des Typs T7 mit einem wie oben beschriebenen Klonierprogramm überprüfen, so erhielte man trotzdem rekombinante Konstrukte, die bezüglich Expression des Indikatorgens stumm sind, außer wenn sie mit dem entsprechenden Bakteriophagen infiziert sind. Solche Konstrukte würden über die bakteriophagenspezifische RNA-Polymerase- Promoterseguenz, die sich proximal zum Indikatorgen befindet, verfügen. Die Wirts-RNA-Polymerase würde solch ein Konstrukt nicht transkribieren und bei Verwendung von luxAluxB als Indikator wäre die Rekombinante dunkel. Bakteriophageninfektion wurde jedoch zur temporalen Expression der Bakteriophagen-RNA-Polymerase und dadurch zu einer aktiven Transkription des Indikator gens führen. Die Verwendung von T7-, T3-, T5- und SP6- phagenspezifischen RNA-Polymerasen zur Steuerung der Genexpression auf rekombinanten Plasmidvektoren ist gut bekannt (Old und Primrose, 1989). Dies wurde jedoch bis jetzt nicht zur zahlenmäßigen Bestimmung von Bakteriophagen verwendet, und dieses Element stellt lediglich einen möglichen Steuerkreis bei einem Ansatz dieser Art bei der Ausnutzung von temporaler Expression zur trans-weisen Induktion der Expression eines Indikatorgens dar.
Beim Bakteriophagen P1 handelt es sich um einen gut beschriebenen Phagen, der anscheinend weder Termination noch eine spezifische RNA-Polymerase für die temporale Regulierung der Phagengenexpression benutzt (Yarmolinsky und Sternberg, 1988). Es wurden trotzdem P1-Promoter identifiziert, die in nicht induzierten P1-lysogenen Bakterien inaktiv sind, jedoch ungefähr 30 Minuten nach Prophageninduktion aktiv werden (ibd).
Es läßt sich vorhersagen, daß diese Promoter bei einem wie oben für den Bakteriophagen 23074-B1 beschriebenen Screening-Vorgang identifiziert werden würden. Der Klonierungsvektor müßte in einem P1-Wirtsbakterium funktionell sein, das Selektionsprinzip wäre jedoch das gleiche.
Unter den zur Zeit auf genetischem Niveau gut beschriebenen Bakteriophagen gibt es keine, bei denen ein Fehlen von Elementen zur temporalen Kontrolle beobachtet wird. Man kann daher berechtigterweise die Theorie aufstellen, daß solche Elemente bei allen Bakteriophagen existieren. Obwohl sich die Mechanismen der temporalen Kontrolle unterscheiden, eignen sich alle zur Zeit identifizierten Mechanismen für die Konstruktion von Bakteriophagen-Indikator-Chimären, die Indikatorgene wie luxAluxB unter die Expressionskontrolle einer temporal regulierten Bakteriophagengenschaltung bringt. Liegt das Indikatorgen als stabiles Genkonstrukt in einem nichtphageninfizierten Wirt vor, so wird es nicht exprimiert werden. Während der Phageninfektion kann der Bakteriophage jedoch einen trans-wirkenden Faktor liefern, der die Expression des chimänschen Indikatorkonstrukts aktiviert. Die Messung der Indikatorexpression, zum Beispiel in vivo- Biolumineszenz bei Verwendung von luxAluxB, ist ein direktes und quantitatives Maß für das Vorhandensein virulenter Bakteriophagenpartikel. Obwohl eine genaue molekularbiologische Kenntnis eines Bakteriophagen bei der Konstruktion des chimärischen Indikators von Hilfe wäre, so wird durch solch ein Konstrukt für den L. monocytogenes-Phagen 23074-B1 demonstriert, daß sich ein chimärischer Indikator aus einem völlig unbeschriebenen Bakteriophagen erzeugen läßt. Im Prinzip köonnte man daher chimärische Indikatorkonstrukte für alle möglichen Bakterium-Bakteriophage-Paare erzeugen.
Durch diese Techniken erhält man Reporterbakterien, nämlich gentechnisch veränderte Bakterien, die so konstruiert sind, daß sie über eine Genschaltung-Indikatorgen-Chimäre verfügen, bei der die Aktivierung der Schaltung von einem während der Phageninfektion gelieferten trans-wirkenden Faktor abhängig ist. Diese gentechnisch veränderten Bakterien können nicht lebensfähig und nicht kultivierfähig gemacht werden, es bleibt ihnen jedoch die Fähigkeit, Phageninfektion nachzuweisen, erhalten.
Im folgenden Teil werden verschiedene Untersuchungsmethoden beschrieben, bei denen solche Reporterbakterien verwendet werden.

1. Schnellnachweis von Bakterien

a) Phagenamplifizierung und Test

Bakterien wie Salmonella spp. oder Listeria spp. müssen vor dem Nachweis gewonnen und angereichert werden. Die Anreicherung, die die Anzahl der Bakterien auf ein nachweisbares Niveau erhöht, erfordert einen Zeitraum, der von der Wachstums- und Teilungsgeschwindigkeit der Mikroorganismen abhängig ist. Die Anzahl an Bakterien beschreibt eine Exponentialkurve, und um von einem Salmonella- oder Listeria Bakterium auf 10&sup8; zu kommen, bräuchte man 27 Teilungen, was bei einer Wachstumsrate von 30 Minuten mindestens 14 Stunden betrüge. Im Vergleich dazu dauert ein Bakteriophagen-Infektionszyklus typischerweise 40 Minuten, wobei zwischen 10 und 100 Nachkommenschaftsphagen produziert werden. Ein einzelnes Salmonella oder Listeria Bakterium, das mit einem lytischen Phagen infiziert ist, könnte bei Vorhandensein von zusätzlichen Helferbakterien 10&sup8; Bakteriophagenpartikel in 5,3 Stunden bei einer Wurfgröße von 10 oder in 2,6 Stunden bei einer Wurfgröße von 100 produzieren. Anders gesagt werden Bakteriophagen 3 bis 5 mal so schnell wie Bakterien amplifiziert. Diese Bakteriophagenamplifizierung könnte man dazu verwenden, das Vorhandensein einer niedrigen Anzahl an pathogenen Bakterien in Lebensmitteln und anderen Proben nachzuweisen, und zwar folgendermaßen:
25 g eines Lebensmittels mit 1-10 pathogenen Bakterien würden in Wachstumsmedium homogenisiert werden und ein mit dem Pathogen assoziierter Bakteriophage würde in solch einer Konzentration zugegeben werden, die hoch genug ist, um eine rasche Infektion des Pathogens zu garantieren (m.o.i.* gleich oder größer 10) (m.o.i. *: Multiplizität der Infektion). Nach 10 bis 15 Minuten, während dessen Phagen-DNA in das Pathogen injiziert wird, würde man alle verbleibenden Bakteriophagen durch chemische oder physikalische Behandlung zerstören, entfernen, neutralisieren oder inaktivieren. Zu den chemischen Behandlungen gehören zum Beispiel viruzide, jedoch subantimikrobielle Biozidkonzentrationen. Physikalische Behandlungen sind zum Beispiel viruzide, jedoch subantimikrobielle Temperaturbereiche. Nach Zerstörung des Bakteriophagen würden chemische Viruzide neutralisiert werden und bei Verwendung hoher Temperaturen würden die Temperaturen wieder auf das für das mikrobielle Wachstum optimale Niveau gebracht. Die Ausgangspathogene wären nun phageninfiziert, und es würden keine lebensfähigen Phagen außerhalb der Zelle vorhanden sein. Nach einer weiteren Inkubationsdauer von 30 bis 40 Minuten wäre der Phageninfektionszyklus in den Ausgangspathogenen vollständig, und virulente Bakteriophagen würden bei Lyse der Pathogene freigesetzt werden. Die Anzahl an freigesetzten Bakteriophagen wäre zu niedrig, um nachgewiesen werden zu können, diese wenigen Phagen könnten jedoch amplifiziert werden, wenn man die Kultur mit einem permessiven Wirt (nicht unbedingt pathogen) versetzen würde. Eine Zugabe von 10&sup6; - 10&sup7; permessiven Bakterien würde eine Amplifizierung von 10 - 100 Phagenteilchen oder darüber in 3 bis 5 Stunden gestatten. Das Vorhandensein von Bakteriophagen auf diesen Niveaus könnte mit der oben beschriebenen Bakteriophagenteststruktur rasch und bequem nachgewiesen werden.
Enthalten Nahrungsmittel oder andere Proben die Zielpathogene auf niedrigem Niveau, so werden diese Pathogene durch einen positiven Bakteriophagentest im Anschluß an Infektion und Amplifizierung indirekt nachgewiesen werden. Der bevorzugte Bakteriophagentest wäre über die Induktion eines biolumineszenten Phänotyps in ein Bakterium, das genetisch so verändert wurde, daß es eine Promoter/luxB- oder -luxAluxB-Chimäre enthielte, die für die Expression von Phageninfektion abhängig ist. Immuntests auf das Vorhandensein von Phagen in dem als Endprodukt erhaltenen Kulturmedium, in dem die Amplifizierung stattgefunden hat, könnten jedoch auch in Erwägung gezogen werden.
Proben, die keine Zielbakterien enthalten, können keine Bakteriophagen vor der viruziden Behandlung schützen (Eklipse). Es wären daher keine vom permessiven Bakterienwirt zu amplifizierenden Phagen vorhanden. Solche Proben würden in der als Endprodukt entstandenen Kultur, in der Amplifizierung stattgefunden hat, keine Bakteriophagen enthalten, und Proben solch einer Kultur wären bei dem oben beschriebenen Bakteriophagentest negativ.
Die Proben könnten innerhalb von 3 bis 6 Stunden aufgrund des Vorhandenseins bzw. Fehlens von mit Pathogenen assoziierten Bakteriophagen als positiv oder negativ für ein Zielpathogen beurteilt werden.
Da Bakteriophagen lebensfähige, jedoch nicht kulturfähige Bakterien infizieren und darin replizieren können, müßten auch subletal verletzte Bakterien dem Bakterien-Schnellnachweis unterliegen. Dadurch, daß es nicht erforderlich ist, das Wachstumspotential in subletal verletzten Bakterien wiederzuerlangen, wird die Geschwindigkeit des Tests wesentlich erhöht.
Für den Nachweis niedriger Bakterienzahlen ver wendete Bakteriophagen können entweder chemisch mit Mitteln wie NaOH behandelt werden oder auf natürliche Mutationen, die ihre Empfindlichkeit gegen chemische oder physikalische Inaktivierungsmittel erhöhen, selektiert werden. Solche Mutanten würden die Inaktivierung restlicher Bakteriophagen nach der Primärinfektion der Zielbakterien und vor der Amplifizierung der aus diesen Zielbakterien freigesetzten Phagen erleichtern.
Die für die Amplifizierung von aus den Zielbakterien freigesetzten Bakteriophagen verwendeten permessiven Bakterien können auf natürlichen Mutationen, die ein pathogenes Potential und/oder die Fähigkeit, in der natürlichen Umgebung wirksam konkurrieren zu können, abzuschwächen, selektiert werden.

b) Einzelzyklusinfektion und Test unter Verwendung derselben

Indikatormikroorganismen, wie die Enterobakterien, liegen typischerweise in Nahrungsmitteln und Umweltproben in Zahlen vor, die die der spezifischen Pathogene weit übersteigen. Steigende Anzahlen an Indikatorbakterien können als Maß für eine steigende Wahrscheinlichkeit des Vorliegens von Pathogenen verwendet werden, und daher kann eine sorgfältige Kontrolle der ersteren bei der Feststellung des Hygienestands und bei der HACCP-Kontrolle von beträchtlichem Wert sein (siehe Microorganisms in Foods 4; ICMSF). Das Vorhandensein von Indikatorbakterien in einer Anzahl von 10²/g oder cm² würde am besten durch den oben beschriebenen Phagenvermehrungstest kontrolliert werden. Anzahlen von ≥10³/g oder cm² könnten jedoch dadurch getestet werden, daß man einen einzelnen Zyklus der Phageninfektion ohne Vermehrung verwendet, was dementsprechend einen Zeitraum von unter 100 Minuten erfordert.
Proben, die ≥10³ Indikatorbakterienig oder cm² enthalten, würden mit einem bzw. mit mehreren mit einem Indikator assoziierten Bakteriophagen bei einer Konzentration behandelt werden, die hoch genug ist, um zu garantieren, daß der Indikator rasch infiziert wird (m.o.i. 10 oder darüber). Nach 10 bis 15 Minuten zur Infektion der Indikatorbakterien mit Phagen-DNA würde man alle restlichen Bakteriophagen mit einer chemischen oder physikalischen Behandlung zerstören.
Nach Neutralisierung der viruziden Behandlung würde man in einem Mikroorganismen-Wachstumsmedium 40 bis 50 Minuten weiter inkubieren, so daß der Phageninfektionsszyklus vervollständigt werden kann. Bakteriophagen würden in einer Anzahl von 10&sup4; oder darüber freigesetzt werden (unter Annahme einer Mindestwurfgröße von 10). Auf diesen Niveaus könnte man mit der oben beschriebenen neuen Teststruktur direkt auf das Vorhandensein von Bakteriophagen prüfen, ohne daß man weiter in einem permessiven Wirt amplifizieren muß.

c) Kompetitive Bindung und Test unter Verwendung derselben

Bei einer Struktur, die sich von der für die Einzelzyklusinfektion und den Test unter Verwendung derselben beschriebenen unterscheidet, könnte man die kompetitive Bindung von Bakteriophagen zwischen den in der zu testenden Probe vorhandenen Indikatorbakterien und den Bakterien, die so verändert wurden, daß sie das Vorhandensein von Phagen nachweisen, verwenden. Bei gleicher Konzentration an natürlichen Indikatorbakterien und veränderten Testbakterien sowie einem Bakteriophagenniveau unter der Sättigungsgrenze wäre der Phage bezüglich Bindung und Infektion gleichmäßig zwischen Indikator- und Testbakterien verteilt. Unter diesen Umständen wäre die Menge der in einem luxAB-Test erhaltenen Biolumineszenz halb so groß wie diejenige, die bei Fehlen von Indikatorbakterien erhalten würde. Bei dieser Struktur betrüge die Testzeit unter 60 Minuten, eine viruzide Behandlung wäre nicht erforderlich, und durch Verändern des Verhältnisses zwischen Testbakterien und Bakteriophagen ließe sich die Anzahl der Bakterien mengenmäßig schätzen.

2. Schnellnachweis eines Bakteriophagen aus der Umwelt

Die Struktur des Bakteriophagentests könnte so konstruiert sein, daß man die Reporterbakterien dahingehend verändert, daß sie auf Infektion mit vorher bestimmten Bakteriophagen aus der Umwelt reagieren. Zu solchen Phagen gehören zum Beispiel Coliphagen. Mit solch einem Test könnte man lebensfähige Coliphagen in Wasser und austretendem Abwasser rasch nachweisen. Da der Test im Prinzip so konstruiert werden kann, daß man irgendein Bakterien-Bakteriophagen-Paar nachweisen kann, kann man einen in situ-Nachweis aller möglicher Bakteriophagen in Erwägung ziehen.

3. Schnellauswertung viruzider Mittel

Die Teststruktur des Bakteriophagennachweises weist lediglich lebensfähige und infektiöse Phagen nach; sie spiegelt die biologische Aktivität wider und nicht nur das Vorhandensein von Phagenpartikeln. Bestimmung und Beurteilung von antiviraler Aktivität in eventuellen Viruziden erfordern im allgemeinen aufwendige Zellkultur- oder Elektronenmikroskopeinrichtungen. Als Prokaryontenviren lassen sich Bakteriophagen als virale Modellagentien zur Prüfung der Wirksamkeit viruzider Verbindungen verwenden. Die viruzide Aktivität gegen Wildtyp-Bakteriophagen ließe sich als Abnahme der Biolumineszenz nach Tests mit einem Bakterium, das gentechnisch so verändert worden ist, daß es eine von phageninduzierter Expression abhängige Promoter-luxAB-Chimäre enthält, messen. Solch ein Bakterium wurde im vorliegenden Text als neuartige Teststruktur für Bakteriophagen beschrieben.
Ein Viruzidtest, bei dem ein rekombinanter Bakteriophage verwendet wird, der so verändert wurde, daß er luxAB innerhalb des Bakteriophagengenoms enthält, ist bereits beschrieben worden (Jassim et al., 1990). Bei der vorliegenden Erfindung lassen sich jedoch Wildtyp-Bakteriophagen verwenden, wobei trotzdem die Expression von Biolumineszenz als Maß für die Lebensfähigkeit des Virus erhalten bleibt.
Die vorliegende Erfindung wird nun genauer anhand der folgenden Beispiele erläutert:
In Beispiel 1 werden Herstellung und Verwendung von auf Listeria monocytogenes 23074 beruhenden Reporterbakterien beschrieben.
In den Beispielen 2 bis 5 werden Methoden zur Abtötung von außerhalb der Zelle befindlichen Bakteriophagen beschrieben, ohne daß dabei die Fähigkeit phageninfizierter E. coli, im Anschluß daran amplifiziert zu werden, beeinflußt wird.
In Beispiel 6 wird der Nachweis von Listeria durch Aktivierung von Reporterbakterien aus Beispiel 1 mit amplifizierten Bakteriophagen beschrieben.

BEISPIEL 1

Klonieren des Promoters aus dem B1-Phagen von Listeria monocytogenes 23074

Isolierung von Plasmid-DNA und Phagen-DNA

Die Plasmid-DNA wurde nach Standardverfahren isoliert und durch CsCl-Gradienten- Gleichgewichtszentrifugation gereinigt. Die B1- Phagenpartikel wurden in Listeria monocvtogenes ATCC 23074 vermehrt und durch Bandierung in CsCl- Gradienten nach der Methode von Audurier et al. (1977) gereinigt. Die DNA wurde aus dem Phagen durch ein Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahren freigesetzt und durch Fällung mit Ethanol in der Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat gewonnen.

Herstellung einer B1-Phagen-Bibliothek in pSB292 für das Promoter-Screening

Die DNA aus dem B1-Phagen wurde getrennt mit den Restriktionsenzymen AluI, HaeIII und RsaI verdaut. Nach dem vollständigen Reagieren wurde das Enzym mittels Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt und die DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Parallel dazu wurde das Plasmid pSB292 (Figur 1 sowie Park et al. 1991) mit SmaI verdaut und die DNA wie oben gewonnen. Durch Vermischen gleicher Teile der AluI-, HeaIII- und RsaI- Verdauer wurde eine Mischung aus DNA-Fragmenten des Phagen B1 hergestellt. Diese Fragmente wurden anschließend mit einer Standard-Ligationsmischung mit 1 mM Hexamincobalt-III-Chlorid in die SmaI-Stelle von pSB292 ligiert (Insert/Vektor-Verhältnis 2.1). Die Ligationsmischung wurde 30 Minuten unter Verwendung von VSWP-Filtern (Millipore) gegen destilliertes Wasser dialysiert und zur Transformation von L. monocytogenes ATCC 23074 nach der Methode von Park und Stewart (1990) verwendet. Die Transformanten wurden dadurch gewonnen, daß man auf Hirn-Herz-Infusionsagar (BHI, Oxoid) mit 5µg/ml Chloramphenicol ausplattierte und über Nacht bei 30ºC inkubierte.

Screening der Transformanten auf phageninduzierbare Promoter

Ungefähr 3 x 10³ Transformanten wurden aus der B1-Phagen-Bibliothek erhalten. Transformanten, die Abkömmlinge von pSB292 enthielten, in denen Phagen- Promoter luxAB konstitutiv exprimierten, wurden nach Zugabe von 20 µl Dodecanol auf den Petrischalendeckel unter Verwendung einer Photon-Imaging-Kamera mit der Bezeichnung Argus 100 VIM3 (Hamamatsu Photonics) in Form biolumineszierender Kolonien sichtbar gemacht. Mehrere "dunkle" Transformanten (350), in denen die lux- Gene nicht exprimiert wurden, wurden auf Gruppen von BHI/chloramphenicol-Platten in zwei Wiederholungen umgesetzt und 4 Stunden bei 30ºC inkubiert. B1-Phagen (10 µl mit 3 x 10&sup8; PFU) wurde dann auf eine Wiederholung der Platten in zwei Wiederholungen gesprenkelt und es wurde eine Stunde weiter inkubiert. Die phageninfizierten und nicht infizierten Platten wurden dann unter der Photon- Imaging-Kamera sichtbar gemacht. Von einer Transformante, die lediglich bei Vorhandensein einer B1- Bakteriophageninfektion biolumineszent war, wurde angenommen, daß sie eine pSB292-Abkömmling enthielt, in dem ein phageninduzierbarer Promoter die Expression der lux-Gene kontrollierte. Dieses Plasmid wurde mit pSB19 bezeichnet.

Promoterinduktionsversuche

Zellen mit pSP19 wurden in BHI-Bouillon mit 5 µg/ml Chloramphenicol bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Als die Extinktion bei 600 nm 0,1 betrug, wurden die Zellen geerntet (8000 g und 30ºC, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wieder in 1/100 des Bouillon-Ausgangsvolumens suspendiert. Zwei aliquote Teile dieser Suspension zu 0,5 ml wurden in Plastik-Probenröhrchen überführt. Ein Röhrchen wurde mit B1-Bakteriophage mit einer Multilizität der Infektion von 3 versetzt. Beide Röhrchen wurden dann 10 Minuten bei 30ºC ohne Bewegen inkubiert, um den Phagen absorbieren zu lassen. Nach diesem Zeitraum wurde der Inhalt der Probenröhrchen in getrennte Flaschen mit jeweils 50 ml vorgewärmtes BHI-Medium überführt. Die Kulturen wurden dann unter den Ausgangsbedingungen inkubiert (30ºC, 150 U/min). Nach festgelegten Zeiträumen wurden Proben zu 1 ml entfernt, um die Zelldichte und die Zell-Biolumeszenz zu messen. Die Bioluminezenz wurde durch Zugabe von 0,01 Vol. einer 1%igen Dodecanallösung in Ethanol zu den Proben und sofortige Beurteilung der Lichtproduktion in einem Luminometer (Turner Designs, 20) beurteilt.
Listeria monocytogenes 23074, das das Plasmid pSP19 enthielt, wurde zum Zeitpunkt null mit dem Bakteriophagen 23074-B1 infiziert. Im Anschluß an Phageninfektion wurde mit zunehmender Zeit ein Zunehmen der Biolumineszenz beobachtet. Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt.

BEISPIEL 2

Methoden

Der Phage Lambda wurde mit Linoelaidinsäure (LS) (50 µg/ml) in TRIS-Cu-Puffer (1,21 g TRIS; 5,8 g NaCl; 0,075 g CaCl&sub2;; 10 ml 1% W/V CuSO&sub4; pro Liter; pH 7,4) unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen behandelt. Darunter befanden sich Dunkelheit, Röhrenlicht und Belichtung mit relativ spezifischen Wellenlängen unter Verwendung einer Reihe von Filtern mit einem Strahlungsdurchgangsoptimum bei 300, 338, 360, 375, 395, 400, 420, 450, 455 und 530 nm (Waters Associates, Inc. Manual Nr. 1M82902, 1980 sowie Figur 3). Das einfallende Licht für den Strahlungsdurchgang durch das Filter stammte von einem Mikroskopkondensor. Es wurden Belichtungszeit, Belichtungstemperatur und die Bedeutung von Cu²&spplus; beurteilt.

Ergebnisse

Bei einer Konzentration von 50 µg/ml inaktivierte LS in 30 Minuten bei 37ºC 93% der Lambda- Phagen (Tabelle 1). Wurden die Proben im Dunkeln inkubiert, so wurde diese Inaktivierung nicht beobachtet. Wesentlich war, daß mit oder ohne Beleuchtung die ungesättigte Fettsäure keine Wirkung auf E. coli W3110 ausübte. Tabelle 1 Wirkung der Kombination von 50 µg/ml Linoelaidinsäure (LS) und Licht auf die kinetische Abtötung der Phagen Lambda sowie Wirtszellen nach 30 Minuten bei 37ºC.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Essigsäure als selektives viruzides Mittel.
8,4 µl mit einer Phagendichte von 10&sup9; PBE/ml + 8,4 µl einer bestimmten Verdünnung von Wirtsbakterienzellen wurden in sterile Eppendorf -Röhrchen gefüllt. Diese Mischung wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert. Jedes Röhrchen wurde anschließend mit entweder
i) Essiglösung auf eine Essigendkonzentration von 5, 10, 15 oder 20% V/V in Lambda-Puffer oder
ii) Eisessiglösung auf Essigsäureendkonzentrationen von 0,005, 0,05, 0,1, 0,25 und 0,5% V/V in Lambda- Puffer versetzt. Die Röhrchen wurden unter statischen Bedingungen 15 oder 30 Minuten bei 37ºC weiter inkubiert. Dann wurde die Säure mit 3 M Natronlauge neutralisiert. Das Phagenwachstum (PBE/ml) wurde durch Plaque-Bildung auf Platten mit 100 µl anfälligen Wirtszellen (10&sup8; KBE/ml) nachgewiesen.
Die in Tabelle 2 unten dargestellten Ergebnisse zeigen, daß bei pH-Werten zwischen 2,91 und 2,35 - ähnlich wie bei den mit Essig erhaltenen Ergebnissen (nicht gezeigt) - die Phagen rasch abgetötet werden (15 Minuten). Wie bei Essig war das Essigsäuresystem ebenso wirksam gegen Listeria monocytogenes-Phagen.
Ein Vergleich zwischen 5% V/V Essig und 0,25% V/V Essigsäure ergab beinahe gleiche Phageninaktivierungsprofile. Es wurde gezeigt, daß die Zeitspanne für Behandlung der Bakterien mit Phagen zwischen 5 und 50 Minuten auf Eis betrug, wobei das Optimum bei ungefähr 10 Minuten auf Eis lag. Mit dieser Vorschrift lassen sich Bakterien wie in Tabelle 3 unten dargestellt in 5 Stunden durch Plaque-Bildung nachweisen. Sogar bei Infektionszeiten von 20 Minuten auf Eis nahm die Lebensfähigkeit der Bakterien während der anschließenden 15minütigen Behandlung mit Essig oder Essigsäure nicht ab.
Es wurde untersucht, ob sich die Phagenabtötung durch Essigsäure für den Nachweis von E. coli W3110 in einer Bakterienmischpopulation eignet. Mischkulturen, die 10&sup9; KBE/ml Staph.epdermis, S. arizonae, Strep.mutans, Ps.aeruginosa und B.subtilis enthielten, wurden mit unterschiedlichen Mengen an E.coli W3110 beimpft. Mit der oben beschriebenen Vorschrift zur Phageninaktivierung mittels Essigsäure wurde der Phage Lambda dazu verwendet, um das in den Mischkulturen vorhandene E.coli W3110 spezifisch nachzuweisen. Die Ergebnisse, die beweisen, daß das Verfahren praktisch angewandt werden kann, sind in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 2. Wirkung von Essigsiure in unterschiedlichen Konzentrationen und bei unterschiedlichen pH-Werten bei 37ºC/15 Minuten auf das überleben von Phagen sowie Wirtszellen.
Die Daten in Klammern bezeichnen KBE/ml bei Listeria monocytogenes ATCC 23074 und PBE/ml bei Phage 23074 B1. Tabelle 3. Anzahl an PBE des Phagen 23074 B1 nach Infektion verschiedener Anzahlen an Listeria monocytogenes ATCC 23074. Tabelle 4. Nachweis von E.coli W3110 in komplexen Kulturen durch Plaque-Bildung

BEISPIEL 4

Vorschrift

Eine Übernachtkultur von E.coli W3110 wurde schrittweise mit Lambda-Puffer auf das Zehnfache verdünnt. Aliquote Teile zu 8,4 µl, die unterschiedliche Zellzahlen enthielten, wurden in zweifacher Wiederholung in sterile Eppendorf -Röhrchen überführt. Es wurde mit 8,4 µl einer Suspension des Phagen Lambda (1 x 10&sup9; PBE/ml) versetzt, und der Phage wurde 10 Minuten bei 0 ºC an die Zellen adsorbieren gelassen. Nichtadsorbierte Phagen wurden dann durch Zugabe von 83,2 µl Essigsäure in Lambda-Puffer (auf eine Endkonzentration von 0,25%) und 2ominütiger Inkubation bei 39ºC inaktiviert. Die Säure wurde dann durch Zugabe von 14 µl 0,3M NaOH (auf einen End-pH von 8, 0) neutralisiert.
Der Titer der nichtbehandelten Phagen (d.h. derjenigen, die durch Adsorption an W3110-Zellen geschützt waren) wurde dann sofort in einer Gruppe der zweifachen Wiederholung dadurch bestimmt, daß man mit 100 µl W3110-Zellen (1 x 10&sup6; KBE) und 3 ml 0,6%igem Überschichtungsagar vermischte, über Luria-Agarplatten ausgoß und bei 37ºC inkubierte. Die Plaques wurden nach einer Inkubationszeit von 18 Stunden gezählt.
Die Phagenamplifizierung der anderen Gruppe der zweifachen Wiederholung wurde dadurch initiiert, daß man 3 ml FT-Bouillon zugab und die Kulturen 5 Stunden bei 37ºC unter Schütteln (150 U/min) inkubierte. Die Phagentiter wurden durch Ausplattieren von 100-µl- Proben wie oben beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten dargestellt.
Der Lambda-Puffer besteht aus 6 mM TRIS-HCl, pH 7,8, 10 mM MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 10 mM CaCl&sub2;, 0,005% Gelatine.
Die FT-Bouillon enthält pro Liter 5 g NaCl, 10 g Trypton, 10 ml 1M MgCl&sub2;, 20 ml 10% Maltose. Tabelle 5. Infektion verschiedener Anzahlen E.coli W3110 mit dem Phagen Lambda, und Amplifizierung nach 5 Stunden bei 37ºC nach Abtöten der außerhalb befindlichen Phagen
In den Beispielen 3 und 4 oben wird eine vollständige Vorschrift beschrieben, mittels derer Bakteriophagen innerhalb von 15 Minuten abgetötet werden können, und zwar mit einer Wirksamkeit von über 9 log-Zyklen, ohne daß die Anzahl der gleichzeitig vorhandenen Bakterienzellen oder die Fähigkeit dieser Bakterienzellen, sich im Anschluß an die viruzide Behandlung vermehren zu können, nachweisbar herabgesetzt wird. In den Beispielen wird weiterhin gezeigt, daß sich das Verfahren für verschiedene Bakteriophagen eignet und sowohl bei Gram-positiven als auch bei Gramnegativen Gattungen wirksam ist. Es wird der direkte Nachweis von Bakterien durch Bakteriophagenvermehrung in axenischen und komplexen Kulturen nachgewiesen.
Wie im folgenden Beispiel dargestellt, mag es nötig sein, je nach dem Testorganismus die Vorschrift leicht abzuändern, das Prinzip bleibt jedoch das gleiche.

BEISPIEL 5

Man ging wie in den Beispielen 3 und 4 vor, jedoch unter Verwendung von Staphyloccus aureus NCIMB 8588 sowie dem Phagen NCIMB 9563. Eine differenzierte Phagenabtötung wurde dadurch erzielt, daß man Essigsäure in zwei unterschiedlichen Konzentrationen verwendete. Im Anschluß an die Phagenbindung bei 0ºC wurden die Proben 5 Minuten auf 37ºC erwärmt, und dann vor der Behandlung mit Essigsäure auf 0ºC gekühlt. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 6 ersichtlich. Tabelle 6

BEISPIEL 6

Nachweis von Listeria durch Aktivierung von Lm23074 (pSP19)mit amplifizierten Phagen

Vorschrift

Eine Übernachtkultur von L. monocytogenes 23074 (ATCC), die 6 x 10&sup8; Zellen pro ml enthielt, wurde stufenweise mit Lambda-Puffer auf das Zehnfache verdünnt. Aliquote Teile zu 10 Mikroliter, die unterschiedliche Zellzahlen enthielten, wurden in sterile Eppendorf -Röhrchen überführt und 5 Minuten in Eiswasser gekühlt. Man versetzte mit 10 µl einer Suspension des Phagen Lm23074-B1 (ATCC), die 1 x 10&sup9; PBE/ml enthielt, und die Phagen wurden 10 Minuten bei 0ºC an die Zellen adsorbieren gelassen. Nichtabsorbierte Phagen wurden dann durch Zugabe von 80 µl 0,31%iger Essigsäure in Lambda-Puffer und 20minütige Inkubation bei 39ºC inaktiviert. Die Säure wurde dann durch Zugabe von 14 µl 0,3M NaOH (auf einen End-pH von 8,0) neutralisiert. Um den Phagen amplifizieren zu lassen, wurden 1 x 10&sup8; Zellen des Vermehrungsstamms Lm23074 in 1,4 ml Luria-Bouillon zu den Eppendorf- Röhrchen zugegeben und die Proben wurden 4 Stunden bei 30ºC inkubiert. Der in dieser Kultur vorhandene Phagentiter wurde anfänglich direkt nach Zugabe der Vermehrungebakterien dadurch bestimmt, daß man 10-µl-Proben auf einen Lm23074-Rasen sprenkelt (mit diesem Testverfahren lassen sich nur Titer bis zu einem Minimum von 10³ PBE/ml bestimmen). Das Vorhandensein von Phagen im überstand nach einer Amplifizierungszeit von 4 Stunden wurde dadurch bestimmt, daß man 200 µl einer exponentiell wachsenden Kultur von Lm23074 (pSP19) bei einem E&sub4;&sub5;&sub0;-Wert zwischen 0,25 und 0,3 mit aliquoten Teilen zu 100 µl versetzte. Man ließ 60 Minuten infizieren, bevor die Lichtinduktion gemessen wurde.
Die Ergebnisse sind aus Tabelle 7 unten ersichtlich, in der in Spalte 3 die pro Zelle gemessenen Lichteinheiten angegeben sind. Tabelle 7
n.b.: bei dem verwendeten Titriersystem nicht bestimmbar.
In dem Beispiel oben wird gezeigt, daß in einer Gesamttestzeit von 5,5 Stunden sogar lediglich 6 Zellen von Listeria monocvtogenes nachgewiesen werden können. Dies stellt einen wesentlichen Fortschritt bei den zur Zeit vorhandenen Schnellnachweismethoden dar.

Literatur

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Claims

1. Reporterbakterien, welche gentechnisch so verändert sind, daß sie ein Indikatorgen haben, das bei Expression zu einem nachweisbaren Polypeptid führt, wobei die Expression des Indikatorgens durch Bakteriophageninfektion der Bakterien in Gang gesetzt wird.

2. Reporterbakterien nach Anspruch 1, worin das Indikatorgen Luciferase ist.

3. Verfahren zum Untersuchen auf ein Zielbakterium in einer flüssigen Probe oder in einer Probe, welche durch eine geeignete Behandlung flüssig gemacht wurde, mit den Schritten:

a) Bakteriophagenzugabe zu der Probe unter Bedingungen, die die Infektion von irgendwelchen anwesenden Zielbakterien verursacht,

b) Zerstören, Entfernen, Neutralisieren oder Inaktivieren von extrazellulären Bakteriophagen in der Probe, Inkubieren der Probe, um die Infektion zu vervollständigen und die Zielbakterien zu veranlassen, den Bakteriophagen freizusetzen, und

d) Überprüfen des Bakteriophagen durch

i) Verwenden des resultierenden Bakteriophagen, um Reporterbakterien gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 zu infizieren, und

ii) Beobachten des nachweisbaren Polypeptids, welches durch die Reporterbakterien als ein Hinweis auf die Zielbakterien in der Probe exprimiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, welches zwischen den Schritten c) und d) einen zusätzlichen Schritt einschließt:

ci) Amplifizieren des Bakteriophagen in der Probe durch Verwendung eines permissiven bakteriellen Wirtes.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Zielbakterium ein Pathogen ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin Schritt b) durch Aussetzen der Probe einer Photonenbestrahlung in Anwesenheit einer ungesattigten Fettsäure vollzogen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin Schritt b) mittels Essigsäure vollzogen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin Schritt a) bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur vollzogen wird.

9. Verfahren zum Untersuchen auf ein Zielbakterium in einer Probe mit den Schritten:

a) Zugeben von Reporterbakterien gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 zu der Probe,

b) zugeben von Bakteriophagen zu der Probe unter kompetitiven Testbedingungen, um irgendwelche- anwesenden Zielbakterien und auch die hinzugegebenen Reporterbakterien infizieren zu lassen,

c) Beobachten des nachweisbaren Polypeptids, welches von den Reporterbakterien als ein Hinweis auf die Zielbakterien in der Probe exprimiert wird.

10. Verfahren zum Untersuchen auf Bakteriophagen in einer Probe mit den Schritten:

a) Zugeben von Reporterbakterien gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 zu der Probe unter Bedingungen, die irgendeinen anwesenden Bakteriophagen die Reporterbakterien infizieren läßt,

b) Beobachten des nachweisbaren Polypeptids, welches durch die Reporterbakterien als ein Hinweis auf Bakteriophagen in der Probe exprimiert wird.

11. Verfahren zum Untersuchen eines viruziden Mittels mit den Schritten:

a) Bereitstellen einer Flüssigkeit enthaltend einen vorbestimmten Bakteriophagen mit einer bekannten Konzentration,

b) Behandeln der Flüssigkeit mit dem viruziden Mittel,

c) zugeben von Reporterbakterien gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 zu der behandelten Flüssigkeit unter Bedingungen, die verursachen, daß sie durch irgendeinen überlebenden Bakteriophagen infiziert werden,

d) Beobachten des nachweisbaren Polypeptids, welches durch die markierten Bakterien exprimiert wird als ein Hinweis auf die Effektivität der viruziden Behandlung.