DE69125185T2

DE69125185T2 - Einfluss von n,n,n-trimethylsphingosin auf die aktivität der protein-c-kinase, melanomzellwachstum in vitro, metastatisches potential in vivo und humane blutblättchenaggregation

Info

Publication number: DE69125185T2
Application number: DE69125185T
Authority: DE
Inventors: Mahammed N Ahmad; Sen-Itiroh Hakomori; Kazuko Handa; Yasyuki Igarashi; Satoshi Kimura; Hirofumi Okoshi
Original assignee: Oncomembrane Inc
Current assignee: Oncomembrane Inc
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1991-12-23
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2011-12-24
Also published as: ATE150000T1; EP0565587A1; WO1992012119A1; US5331014A; US5151360A; GR3023511T3; JPH06504052A; DK0565587T3; DE69125185D1; EP0565587B1; ES2100333T3; EP0565587A4; CA2097324A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, die eine große Wirkung auf die Aktivität der Proteinkinase-C und auf die Säugetier-Zellproliferation haben; und auf Verfahren, diese Verbindungen zu nutzen.
Sphingosin (SPN) ist ein langkettiger, ungesättigter Amino-Alkohol mit der Formel C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7;O&sub2;N, der in Zellmembranen und in hoher Konzentration im Nervengewebe gefunden wurde. Sphingosin und Sphingoid-Base (eine langkettige aliphatische Base, die eine 1,3- Dehydroxy-2-amino-Gruppe an einem Ende enthält und Derivate davon) wurden als Hemmstoffe für die Proteinkinase-C (PK-C) und für die EGF rezeptorgebundene Tyrosinkinase (EGF-RK) angesehen (Hannun & Bell, Science, 235, 670, 1987; Hannun, JBC, 261, 12604, 1986; Kreutter u. a., JBC, 262, 1632, 1987).
Die Proteinkinase-C Aktivität ist eng mit dem Zellwachstum verbunden und neuere Studien zeigen, daß eine erhöhte Tumorbildung bei einigen experimentellen Tumoren mit einer Überexpression von PK-Cβ1 und PK-Cγ korreliert (Housey u. a., Cell, 52, 343, 1988; Persons u. a., Cell, 52, 447, 1988). Ein Mutant, PK-Cα, induziert höchst bösartige Tumorzellen mit einem erhöhten Metastasepotential (Megidish & Mazurek, Nature, 324, 807, 1989). Es kann vorkommen, daß eine unnatürliche Expression von PK-C zu einem Tumorwachstum führen kann.
Neuere Studien zeigen, daß Phospholipide, Sphingolipide und Metaboliten daraus eine wichtige Rolle bei der Modulation transmembraner Signalübertragung durch PK-C und anderer membrangebundener Kinasen, wie der EGF rezeptorgebundenen Tyrosinkinase spielen (Hakomori, JBC, 265, 18713, 1990). Zum Beispiel wird die Aktivität von PK-C mit Diacylglycerol gefördert und von Sphingosin gehemmt (Hannun & Beil, supra; Hannun & Beil, Science, 243, 500, 1989; Merrill & Stevens, Biochem. Biophys. Acta, 1010, 131, 1989).
Sphingosin hemmte PK-C nicht in vitro oder bei Konzentrationen unter 100 µm und es zeigte keinen stereospezifischen Effekt auf PK-C (Igarashi u. a., Biochem., 28, 6796, 1989). Viele der oben beschriebenen Studien verwendeten Sphingosin, das im Handel erhältlich ist (z. B. Sigma Chemical Company), wobei die Zubereitungen zahlreiche Verunreinigungen enthielten, die 3-O-Methylsphingosin, 5-O-Methylsphingosin und N-Methylsphingosin aufwiesen. Die Verunreinigungen sind wahrscheinlich das Ergebnis des Herstellungsprozesses, nämlich der Methanolyse von Sphingomyelinen oder Cerebrosid.
Weiterhin ist in der Sphingosin-Hauptkette die D-erythro-Konfiguration bezüglich des chiralen Kohlenstoffatoms oft in die D-threo-Konfiguration umgewandelt.
Igarasha u. a. (supra) stellte fest, daß die Hemmwirkung von Sphingosin auf die Aktivität von PK-C zurückzuführen ist auf: (1) die stereospezifische Konfiguration von C1 zu C3 (D-erythro- Konfiguration ist erforderlich); (2) die Anwesenheit einer langkettigen aliphatischen Gruppe; und (3), möglicherweise am wichtigsten, eine negative Ladung an der ersten Aminogruppe an C2. Wenn die Aminogruppe N-acetyliert war, war die hemmende Aktivität auf PK-C aufgehoben, da die negative Ladung einer Aminogruppe durch Acetylierung beseitigt worden war. Wenn der anionische Charakter der Aminogruppe durch N-Methylierung vergrößert wurde, wurde die stereospezifisch hemmende Aktivität des PK-C erhöht.
Die Interaktion von Leukozyten mit aktivierten Plättchen und Endothelzellen ist ein Initialschritt bei Entzündungsprozessen und wird zum Teil durch eine Familie von Adhäsionsmolekülen, die als Selektine bekannt sind, vermittelt. Selektine beinhalten MEL-14 in der Maus und ELAM-1, LAM-1 und GMP-140 (CD62/PADGEM) im Menschen. Die Selektine sind durch ähnliche Strukturprinzipien gekennzeichnet, die im folgenden genannt sind: eine Lektin-Domaine an der N-endständigen Region, gefolgt von einer epidermalen Wachstumsfaktorsequenz, eine Komplement-Regulationsdomaine, eine transmembrane Region und eine C-endständige Domaine (Stoolman, Cell, 56, 907, 1989 und Osborn, Cell, 62, 3, 1990). Die Mitglieder der Selektin-Familie binden Kohlehydratliganden (siehe z. B., Springer, Nature, 346, 425, 1990; Brandley u. a., Cell 63, 861, 1990; Lowe u. a., Cell, 63, 475, 1990; und Walz u. a., Science, 250, 1132, 1990).
Basierend auf Hemm-Studien, bei welchen eine Vielzahl Glycosphingolipidliposome angewandt wurden, wurden die Bindungs-Epitope von ELAM-1 und GMP-140, das auf HL60-Zellen (eine menschliche promyelozytische Zellinie) exprimiert wird, als Sialosyl-Lex identifiziert (Phillips u. a., Science, 250, 1130, 1990 und Polley u. a., Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, im Druck). Die Expression von Selektinen ist übergeordnet durch den induktiven Effekt von Lymphokinen, dem Tumornekrosefaktor (TNFA), bakteriellen Lipopolysaccharid-Phorbolestern, Thrombin und vielleicht vielen anderen Verbindungen reguliert. Leukozyten werden hierbei zusammen mit Plättchen an den Entzündungsherd rekrutiert. Da Tumorzellen in der Lege sind, Plättchen zu aktivieren (siehe z. B., Ugen u. a., J. Natl. Canc. Inst., 80, 1461, 1988; Watanabe u. a., Canc. Res., 48, 6411, 1988; und Grignani & Jamieson, Blood, 71, 844, 1988), kann erwartet werden, daß ein ähnlicher Prozeß während der Tumorzelladhäsion an mikrovaskulären Endothelzellen auftritt. Folglich kann der Prozeß der Tumorzellmetastase durch eine selektinabhängige Tumorzelladhäsion initiiert werden. Obwohl es nicht offenkundig ist, daß Endothelzellen direkt durch Tumorzellen aktiviert werden, haben durch IL-1 oder TNFα- Endothelzellen direkt durch Tumorzellen aktiviert werden, haben durch IL-1 oder TNFα- aktivierte Endothelzellen gezeigt, daß sie sich an eine Vielzahl von Tumorzellen anhaften (Walz u. a., supra).
Auch wenn der Regulationsmechanismus für die Expression von Selektin nur wenig verstanden wird, so beinhaltet er offensichtlich eine komplexe Sequenz transmembraner Signalübertragungstransducer, die die Proteinkinase-C, Mitglieder der G-Proteinfamilie (z.B., ras,Gs, Gj, Go usw.) und ein 47 kDa Phosphoprotein aufweisen, wobei alle durch Glykosphingolipide und Sphingosinderivate moduliert werden, wie gezeigt wurde. Die Plättchenaggregation und die assozuerte ATP-Sekretion wird durch Trimethylsphingosin (TMS) stark gehemmt. Das Phänomen kann das Ergebnis der Hemmung der Phosphorylierung des 47 kDa Proteins oder der Umwandlung von Phosphoinositid als einen Weg der Signalübertragung in Membranen, der in Plättchen auftritt, sein. EP-381 541 beschreibt N,N-Dimethylsphingosin und seine Verwendung als Zellwachstumshemmstoff.
Biochemistry 1989, 29 3138-3145 Merrill u. a. beschreiben die Hemmung der Proteinkinase-C in vitro durch Sphingosin und Derivate daraus, einschließlich N,N-dimethyl-(18-sphingosin).
TMS hat eine quartäre Ammoniumstruktur und zeigt eine ausgezeichnete Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln. Obwohl nicht ganz klar ist, ob TMS in normalen Zellen anwesend ist oder eine Rolle spielt, so weist synthetisch hergestelltes TMS eine geringere Zytotoxizität und stärkere pharmakologische Wirkungen, z. B. auf Tumorzellen und Plättchen auf. Folglich bietet TMS gegenüber der Verwendung von SPN oder Dimethylsphingosin (DMS) Vorteile, wobei die Wirkung auf Sphingoid-Derivate zurückzuführen ist.
Die Erfindung trachtet danach, eine Verbindung und eine Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, um sowohl die Metastaseeigenschaften von bösartigen Tumorzellen zu hemmen, als auch die Zellproliferation zu steuern und um zahlreiche Krankheiten, die durch eine anomale Zellproliferation gekennzeichnet sind, zu behandeln.
Dieses und andere Ziele wurden durch die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von N,N,N-Trimethylsphingosin und durch in vitro und in vivo Beobachtungen seiner Wirksamkeit hinsichtlich der Steuerung der Zellproliferation und der Hemmung des bösartigen Phänotyps der Tumorzellen erreicht.
Es wurde festgestellt, daß N,N,N-Trimethylsphingosin eine höhere hemmende Aktivität auf die Proteinkinase-C und auf das Metastasepotential von Tumorzellen hat, als andere Sphingosinderivate; es hemmt die Plättchenaggregation und die tumorinduzierte Plättcheninteraktion; es hemmt Entzündungsprozesse, es beeinflußt die Expression von ntrazellulären Adhäsionsmolekülen und ist wasserlöslich Die eindrucksvolle Abnahme von rumorzelimetastasen durch N,N,N-Trimethylsphingosin kann auf seine hemmende Aktivität Luf die Proteinkinase-C oder auf die hemmende Aktivität auf die Plättchenaggregation oder auf beides zurückzuführen sein. TMS hemmt ebenfalls die Superoxidanion (O&sub2;&supmin;) Produktion, wie inhand einer Cytochrom C Reduktion gemessen wurde (Das Superoxidanion ist ein hochreaktives Molekül, das eine schädliche biologische Wirkung haben kann. Folglich kann TMS Gewebeschäden durch das Hemmen der Superoxidanionproduktion minimieren.), den O&sub2;-Verbrauch, die Phagokinese, die trans-endotheliale Migration, die 12-Myristat 13-acetat (PMA)-induzierte Proteinphosphorylierung, insbesondere von Proteinen mit Molmassen von etwa 65 kDa und 47 kDa, wobei beide über eine PK-c und Formyl-methionyl-leucylphenylalanin (fMLP) - abhängige Umwandlung in Phosphoinositide beeinflußt werden können.
Die Figur 1 gibt die Struktur von N,N,N-Trimethylsphingosin und verwandten Verbindungen wieder.
Die Figuren 2A-2C zeigen die Wirkung von Sphingosinderivaten auf das Wachstum menschlicher Tumorzellen. In Figur 2A wurde das Wachstum von menschlichen Dickdarmkrebszellen der Linie COLO-205 aufgezeichnet. In Figur 2B wurde das Wachstum von menschlichen Lungenkrebszellen der Linie LU-65 aufgezeichnet. In Figur 2C wurde das Wachstum von menschlichen Magenkrebszellen der Linie MKN-74 aufgezeichnet. In jeder Figur ist auf der Ordinate die Hemmung der Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin in Prozent wiedergegeben, wobei die ausgefüllten Kreise Sphingosin repräsentieren, die offenen Kreise N,N-Dimethylsphingosin und die Dreiecke N,N,N-Trimethylsphingosin repräsentieren.
Die Figur 3 gibt die komparative Wirkung verschiedener Reagenzien auf die Fumorzelldifferenzierung wieder. Die Zellen der Linie MKN-74 wurden den folgenden Reagenzien ausgesetzt: N,N,N-Trimethylsphingosin (offene Quadrate), N,N- Dimethylsphingosin (offene Kreise), zyklischem 8-chloro AMP (offene Dreieicke), zyklischem Dibutyryl AMP (ausgefüllte Dreiecke), Sphingosin (ausgefüllte Kreise) und Hexamethylenbisacetamid (ausgefüllte Quadrate).
Die Figuren 4A und 4B geben die Wirkung von Sphingosinderivaten auf die Proteinkinase-C Aktivität in A431-Zellen wieder. Es wurde die Standardliposommethode von Kraft und Anderson benutzt (Nature 301, 621, 1983). In Figur 4A zeigt die Ordinate die Menge an ³²P- ATP, die in ein Myelinbasisprotein (MBP) eingebracht worden war. In Figur 4B ist auf der Ordinate die radioaktive Aufnahme in das Histon III-S wiedergegeben. In beiden Abbildungen steht SP für Sphingosin, MMS für N-Monomethylsphingosin, DMS für N,N- Dimethylsphingosin und TMS für N,N,N-Trimethylsphingosin.
Die Figuren 5A und 5B geben die Wirkung von N,N,N-Trimethylsphingosin (offene Kreise), N,N-Dimethylsphingosin (ausgefüllte Kreise) und Sphingosin (offene Quadrate) auf zwei Melanomzellinien wieder, wobei es sich um BL6, eine höchst bösartige Zellinie (in Figur 5A) und F1, eine Zellinie von geringer Bösartigkeit (in Figur 5b) handelt. Die Zellproliferation wurde durch die Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin in die DNS bestätigt.
Die Figuren 6A-C geben die Wirkung von N,N,N-Trimethylsphingosin auf metastatische Ablagerungen in der Lunge nach einer intravenösen Injektion von BL6-Zellen in Mäuse wieder. Jede Kurve gibt den Mittelwert und die Standardabweichung der Ergebnisse wieder, die bei 8 Tieren erhalten wurden. In Figur 6A geben die offenen Balken die Gesamtanzahl der Kolonien wieder, die sich in der Lunge abgesetzt haben; die gestrichelten Balken geben die Anzahl der Kolonien in der Lunge mit einem Durchmesser von mehr als 1 mm wieder; und die ausgefüllten Balken geben die Anzahl der Kolonien in der Lunge mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm wieder. Die Balken 1-3 geben die Anzahl der Ablagerungen, die 14 Tage nach der Injektion beobachtet wurden, wieder. Die Balken 4-6 geben die Anzahl der in der Lunge abgelagerten Kolonien in Tieren wieder, die BL6-Zellen und eine Minute später 0,2 mg N,N,N-Trimethylsphingosin (TMS) erhalten hatten. Die Balken 7-9 geben die Anzahl der in der Lunge abgelagerten Kolonien in Tieren wieder, die BL6-Zellen und gleichzeitig 0,2 TMS erhalten hatten. Die Balken 10-12 geben die Anzahl der Ablagerungen in Tieren wieder, die TMS drei Stunden nach der Verabreichung von BL6 erhalten hatten.
In Figur 6B wurde 16 Tage nach der Behandlung die Anzahl der Kolonien in der Lunge bestimmt, wobei die Behandlung aus verschiedenen Dosierungen und Darreichungsformen bestand. Balken 1: 3 x 10&sup4; BL6-Zellen i.v. Balken 2: 5 x 10&sup6; BL6-Zellen s.k. Balken 3: 3 x 10&sup4; BL6-Zellen i.v. mit 0,5 mg TMS oral eine Stunde später. Balken 4: 5 x 10&sup6; BL6-Zellen s. k. mit 0,5 mg Sphingosin i.v. eine Stunde später. Balken 5: 5 x 10&sup6; BL6-Zellen s.k. mit drei Dosierungen von 0,5 mg TMS i.v. 2, 3 und 4 Tage später.
In Figur 6C ist die Dosisempfindlichkeit des Metastasepotentials von BL6 gegenüber TMS abgebildet. Balken 1 gibt eine Kontrolle wieder, die Kolonienzahl in den Lungen von Tieren zusammenfaßt, wobei 4 x 10&sup4; BL6-Zellen in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) intravenös injiziert wurden. Balken 2 gibt die Anzahl an Kolonien in den Lungen von Tieren wieder, die eine Minute nach der Injektion von BL6-Zellen 0,1 mg TMS in 100 µl PBS erhalten haben. Balken 3 zeigt Tiere, die auf dieselbe Weise behandelt wurden, mit der Ausnahme, daß die Dosis TMS auf 0,2 mg verdoppelt wurde. Balken 4 zeigt Tiere, die in gleicher Weise behandelt wurden, jedoch mit 0,5 mg TMS. Balken 5 zeigt Tiere, denen zuerst 0,5 mg TMS in PBS injiziert worden war und denen eine Minute später 4 x 10&sup4; BL6-Zellen in 100 µl PBS injiziert wurden. 16 Tage nach der Behandlung wurden die Mäuse geopfert, die Lungen geöffnet und die Anzahl der Kolonien in den Lungen unter einem Seziermikroskop gezählt.
Die Figuren 7A und 7B geben die Wirkung von N,N,N-Trimethylsphingosin (TMS) auf die Plättchenaggregation wieder. Ein Aliquot von 0,45 ml einer menschlichen Plättchensuspension 3-5 x 10&sup5; Plättchen pro µl Tyrode-Puffer) wurde mit Sphingosin oder TMS für zwei Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Plättchenaggregation durch die Zugabe von entweder γ- Fhrombin (Figure 7A) oder Adenosindiphosphat (ADP) (Figur 7B) in 0,05 ml die Plättchenaggregation induziert. Der Grad der Aggregation wurde in einem Aggregometer bestimmt und die Daten wurden mit einem integrierten Computer analysiert (Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd.).
Die Figur 8 gibt weiterhin das dosisabhängige Ansprechen der Plättchenaggregation auf Sphingoid wieder. Die Aggregation der Plättchen wurde mit 10 nM γ-Thrombin induziert.
Die Figur 9 gibt die Hemmung der γ-Thrombin-induzierten Phosphorylierung eines 40 kD Proteins aus menschlichen Plättchen mit Sphingosin und TMS wieder. Die menschlichen Plättchen (3 x 10&sup5; µl) wurden mit ³²P-Phosphorsäure (0,2 mCi/ml) in Tyrode-Puffer, der 22 (nM Trinatriumcitrat, 1 mg/ml Glukose und 3,5 mg/ml Rinderserumalbumin (ph 6,5) enthält, für 75 Minuten bei 37ºC vormarkiert. Nach dem Zentrifugieren (600 x g, 10 Minuten) wurden die Plättchen in Tyrode-Puffer (pH 7,2) wieder suspendiert, wobei der Tyrode-Puffer in Plastikröhrchen abgemessen und für 5 Minuten bei 37ºC mit verschiedenen Konzentrationen von Sphingosinen und seinen Derivaten (zugegeben als 50%ige Ethanollösungen mit einer Ethanolendkonzentration von 0,5 %) inkubiert wurde. Im Anschluß wurden die Plättchen mit Fhrombin (10 µm) stimuliert. Die Reaktion wurde nach 30 Sekunden durch die Zugabe der fünffachen Menge Probenpuffer abgestoppt, die Proben wurden gekocht und auf 10 %ige SDS- Polyacrylamidgele aufgebracht. Die Proteine wurden elektrophoretisch getrennt. Bahn 1: Kontrolle ohne Stimulation mit Thrombin; Bahn 2: Stimulation mit 1 µU/ml γ-Thrombin; Bahn 3: stimuliert mit Thrombin, das mit 1 µM TMS zugegeben wurde; Bahn 4: stimuliert mit Thrombin, das mit 10 µM TMS zugegeben wurde; Bahn 5: stimuliert mit Thrombin, das mit 20 µm TMS zugegeben wurde; Bahn 6: stimuliert mit Thrombin, das mit 30 µM TMS zugegeben wurde; Bahn 7: stimuliert mit Thrombin, das mit 20 µM Sphingosin zugegeben wurde; Bahn 8: stimuliert mit Thrombin, wobei zusätzlich 20 µM N,N-Dimethylsphingosin zugegeben wurden.
Die Figur 10 gibt die Wirkung von Sphingosinderivaten auf die T-Zellen von Mäusen der Linie CTLL wieder. Jeder Punkt ist der Mittelwert aus drei Wiederholungen. In der Figur repräsentiert DMS N,N-Dimethylsphingosin und TMS N,N,N-Trimethylsphingosin.
Die Figuren 11A und 11B geben die Ergebnisse repräsentativer Experimente wieder, wobei der Prozentsatz von Plättchen bestimmt wurde, die in der Lage sind, an anti-GMP-140-Antikörper zu binden, nachdem sie verschiedenen Verbindungen ausgesetzt waren. Die prozentuale Bindungsaktivität wurde in einem Fließ-Zytometer bestimmt. SPN ist Sphingosin; H-7 ist 1-(5- (soquinolinylsulfonyl)-2-methylpiperazin; Cal ist Calphostin-C; TMS ist Trimethylsphingosin; und DMS ist Dimethylsphingosin.
Die Figuren 12A und 12B geben die Ergebnisse von repräsentativen Experimenten wieder, wobei der Grad der HL60 Bindung an Plättchen bestimmt wurde. Die Plättchen wurden einer hemmenden Verbindung ausgesetzt (die Symbole sind dieselben wie in der Legende zu den Figuren 11A und 11B) und an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte fixiert. Die HL60- Zellen, die mit tritium markiertem Thymidin markiert wurden, wurden in die Vertiefungen eingebracht und die Menge gebundener Radioaktivität wurde bestimmt.
Die Figuren 13A und 13B geben die Wirkung von verschiedenen Reagenzien auf die Funktion der Neutrophilen wieder. In der Figur 13A wurde die Wirkung von TMS auf die O&sub2;- Produktion bestimmt, indem die Peroxid-vermittelte Reduktion von Cytochrom C (Clifford, Meth. Enz., 105, 393, 1981) von 10&sup6; Neutrophilen pro ml bei einer OD&sub5;&sub5;&sub0; und einem Extinktionskoeffizienten von 21000/M/cm in einem Beckmann DU-SO Spektrophotometer bestimmt wurde. Die Zellen wurden vor der Stimulation mit 1 µM PMA (Zeit 0) für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit den notierten Konzentrationen TMS vorinkubiert. In Figur 13B ist gezeigt, daß die Oxidradikalproduktion sofort nach der Einwirkung von 15 µM TMS gehemmt wurde.
In Figur 14 ist die Wirkung von verschiedenen Reagenzien auf den O&sub2; Verbrauch von Neutrophilen wiedergegeben. Die Elektrode vom Clark-Typ und der Sauerstoffmonitor wurden gemäß den Herstellerangaben mit luftgesättigtem Wasser kalibriert (Y.S.I. Inc., Yellow Springs, OH). Der Wert von 100 % wurde so angesehen, daß er die Konzentration von Sauerstoff in luftgesättigtem Wasser wiedergibt.
N,N,N-Trimethylsphingosin (TMS) ist in hohem Maße und insbesondere bei einem physiologischen pH-Wert wasserlöslich Infolgedessen hat die Verbindung im Hinblick auf ihre Modulatorwirkung bei der Zellproliferation einen ausgeprägten Vorteil gegenüber Sphingosin, N-Monomethylsphingosin und N,N-Dimethylsphingosin, die weniger wasserlöslich sind.
So wie es hier benutzt wird, bedeutet Sphingosin Sphingosin, und zwar unabhängig davon, ob die D-, L-, erythro- oder die threo-Konfiguration vorliegt.
Wie er ebenfalls hier angewandt wird, beinhaltet der Begriff "Zellen" Strukturen mit und ohne lellkern. Folglich fallen in den Umfang dieses Begriffs zusätzlich zu den "klassischen" Zellen, wie beispielsweise den Lymphozyten und den Endothelzellen, auch biologische Strukturen, wie z. B. Erythrozyten und Plättchen.
Wie es hier benutzt wird, umfassen Blut oder Blutprodukte sowohl das gesamte Blut, als auch Blutzellzubereitungen, wie beispielsweise gepackte Leukozyten oder gepackte Plättchen und dergleichen außerhalb des Körpers.
Wie weiterhin hier benutzt, meint der Begriff "synthetisch hergestellt" ein Produkt, das aus kommerziell erhältlichen Reagenzien und Baugruppen hergestellt wurde und auf dem Weg der chemischen Reaktion in vitro in Sphingosin und Derivate daraus zusammengefügt wurde. Andernfalls wurde Sphingosin aus Sphingolipiden, die natürlicherweise vorkommen, hergestellt.
Aufgrund der multifunktionellen Natur des Ausgangsmoleküls, Sphingosin, ist eine direkte Ausbildung des quartären Stickstoffatoms durch erschöpfende Methylierung (Sommer u. a., J. Org. Chem. 36, 824, 1971) oder reduzierende Methylierung unter Verwendung von wässrigem Formaldehyd (CH&sub2;O/NaH&sub2;PO&sub3;) nicht immer reproduzierbar. Alternativ kann N,N,N- Trimethylsphingosin synthetisch aus kommerziell erhältlichen, unsubstituierten Reagenzien hergestellt werden. Zum Beispiel kann unsubstituiertes Sphingosin (Sigma Chemical Company) derivatisiert werden, um die Verbindung (4E)-N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosin nach einer bekannten Methode (Igarashi u. a. JBC, 265, 5385, 1990) zu bilden. Das N,N- Dimethylsphingosin, das so erhalten wird, läßt sich in nahezu quantitativer Ausbeute in die quartäre Stickstoffverbindung überführen.
Eine etwa 37% ige wässrige Lösung Formaldehyd (die in etwa 20 normal ist) wird zu einer Lösung von D-erythro-Sphingenin in Acetatpuffer (NaOAc-AcOH-H&sub2;O, pH 4.5) gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten gemischt, woraufhin dreimal Natriumcyanoborhydrid (NaBH&sub3;-CN) (etwa 3.0, 2.0 und 1.0 normal) zugegeben wird. In 5 Minuten Intervallen wird überschüssiges Methanol zugegeben. Die Lösung wird unter einem Stickstoffstrom in einem "N-EVAP" (Organomation Assoc., Inc., South Berlin, MA) konzentriert und die Verbindung wird mit Chloroform extrahiert. Wenn die Menge groß ist (d. h. bei mehr als 5 bis 10 mg), wird die Lösung einer weiteren Konzentration unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer unterworfen. Das Extrakt kann dann mit Hochdruck-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt werden. Bei dieser Technik hat die Verbindung einen Rf-Wert von etwa 0,6 in einem Puffer, der
CHCl&sub3; : MeOHW:NH&sub4;OH in einem Volumenverhältnis von 8 : 2 : 0.2 enthält.
Das N,N-Dimethylsphingosin, das, so wie oben beschrieben, hergestellt wurde, wird als farbloser Sirup in Ausbeuten von etwa 80 % erhalten. Das Molekül hat ein Formelgewicht von 329,3281 mit einer Formel von C&sub2;&sub0;H&sub4;&sub0;HNO&sub2;, wie sich aus der hochauflösenden Massenspektroskopie ableiten läßt.
Anschließend wurden etwa 30 Milligramm (0,091 mmol) (4E)-N,N-dimethyl-D-erythrosphingosine (DMS) in etwa 1,5 ml wasserfreiem Chloroform gelöst. Zu der DMS-Lösung wird Frisch destilliertes Jodmethan (ein Volumen von etwa 170 µl, 2,73 mmol) gegeben und die Mischung wird in der Dunkelheit bei Umgebungstemperatur gerührt. (Die Menge des Jodmethanüberschusses ist nicht als kritisch anzusehen, wobei die Überschußmengen 25 bis 100 % betragen können, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen.)
In der Regel ist die Reaktion in wenigen Stunden abgeschlossen, auch wenn gestattet ist, die Mischung zweckmäßigerweise über Nacht stehen zu lassen. Der Fortschritt der Reaktion kann mit Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung eines Puffers, der Ethylacetat: Methanol: Ammoniumhydroxid in einem Verhältnis 20:10: 2 enthält, überwacht werden. Nach der Inkubation wird das ausgefallene quartäre Ammoniumsalz mit Wasser verdünnt und dann wiederholt mit Chloroform (3 ml x 4) extrahiert. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Unter Anwendung des obigen Verfahrens wurden 37 mg (86% Ausbeute) der Verbindung als gelbe Kristalle erhalten.
Die gelben Kristalle wurden in einer wässrigen Suspension eines vorneutralisierten (pH = 7,00) Anionenaustauscherharzes (Chlorid-Form, Dowex 1 x 2-400, 500 mg) bei Raumtemperatur unter dreistündigem Rühren aufgelöst. Die Mischung wurde anschließend durch einen gesinterten Glasfilter gefiltert und im Anschluß gefriergetrocknet (8 millitorr für zwei Tage).
Unter Anwendung des obigen Verfahrens wurden 26,5 mg (93 % Ausbeute) des N,N,N- Trimethylsphingosinchloridsalz erhalten. Die Struktur des Produktes wurde mit der Protonenkernresonanzspektroskopie bestimmt (500 MHz, CDCl&sub3;) und es wurde festgestellt, daß sie neun Wasserstoffgruppen und eine Aminogruppe mit drei Methylresten enthält. ¹H- NMR (D&sub2;O) δ 0,88 (t, 3, J = 6,8 Hz, Me), 1,31 (br s, 22, 11xCH&sub2;), 2,08 (q, 2, J = 6,8Hz, 2xH-6), 3,29 (s, 9 N&spplus;Me&sub3;), 3,38 (br s, 1, H-3), 4,13 (br s, 2, 2xH-1), 5,57 (dd, 1, J = 3,1 und 3,4 Hz, H-4), und 5,90 (m, 1, H-5). Die vorhergesagte Molekülformel der Verbindung ist C&sub2;&sub1;H&sub4;&sub4;NO&sub2; mit einem erwarteten Molekulargewicht von 342,3372, wobei die Massenspektroskopie ein Formelgewicht von 342,3371 zeigt (C&sub2;&sub1;H&sub4;&sub4;NO&sub2;, Δ-0,0003).
Die Wirkung von TMS auf die Zellproliferation kann in gewissem Grad dadurch gezeigt werden, daß man verschiedenartige Tumorzellen in vitro und in vivo der Verbindung aussetzt. Zu Vergleichszwecken wurden dieselben Testzellen auch Sphingosin und N,N- Dimethylsphingosin ausgesetzt. Ein Vorteil von TMS gegenüber den beiden anderen Verbindungen ist die Wasserlöslichkeit desselben. N,N-Dimethylsphingosin und Sphingosin sind in Wasser als Chloridsalze und bei leicht saurem pH-Wert löslich. Bei neutralem oder physiologischem pH-Wert neigen solche Lösungen dazu, undurchsichtige Suspensionen zu bilden. TMS ist unter sauren, neutralen oder basischen Bedingungen löslich, wobei stabile, 4are Lösungen zur Verfügung gestellt werden.
Ein in vitro Versuch, der sich auf die Aufnahme von tritium-markiertem Thymidin stützt, kann benutzt werden, um die Wirkung von verschiedenartigen Verbindungen auf die Zellproliferation zu bestimmen. Die Tumorzellen wurden in die, in Platten befindlichen Vertiefungen mit flachem Boden (96 Vertiefungen pro Platte) (Corning, NY) mit einer Konzentration von 2 x 10&sup4; Zellen pro Vertiefung geimpft. Die Zellen wurden zwei Tage in DMEM, das verschiedenartige Konzentrationen von Sphingoid enthält, das einer PBS-Lösung zugegeben wurde, gezüchtet. Das Nährmedium wird anschließend mit tritiummarkiertem Fhymidin mit einer Konzentration von 0,5 µCi pro Vertiefung ergänzt. Nach einer sechsstündigen Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung eines PHD Zell-Sammlers (Cambridge Technology, Cambridge, MA) gesammelt und die Mengen der aufgenommenen Radioaktiviät wurden nach dem Zusatz eines geeigneten Agens zur Zellauflösung und eines Szintillationscocktails, wie beispielsweise Scintiverse BD (Fisher Scientific, Fairlawn, CA), das beide Funktionen erfüllt, bestimmt.
Es wurden drei Krebszellinien untersucht: Colo-205, eine menschliche Dickdarmkrebslinie (ATCC Nr. CCL 222); Lu-65, eine Lungenkrebszellinie (T. Yamada u. a., Jpn. J. Cancer Res., 76, 967-976 (1985); und MKN-74, eine Magenkrebszellinie (Motoyama u. a., Acta Med. Biol., 27, 49-63 (1979).
Wie in Figur 2 wiedergegeben wurde, war in jedem Fall TMS hinsichtlich der Fähigkeit, das Tumorzellwachstum zu hemmen, Sphingosin überlegen. (In den Figuren sind die Ergebnisse als prozentuale Zellwachstumshemmung relativ zu einer Kontrollkultur, die keiner Testsubstanz ausgesetzt worden war, dargestellt.) TMS zeigte einen Vorteil gegenüber DMS, obgleich dieser nicht von derselben Höhe war. Jedoch sind, wegen der größeren Wirksamkeit von TMS gegenüber DMS geringere Mengen erforderlich, um ein spezifiziertes Hemmlevel zu bewirken.
Die erhöhte Hemmaktivität von TMS ist in den Daten, die in Figur 3 zusammengefaßt sind, validiert. MKN-74-Zellen wurden cAMP und Derivaten daraus und HMBA ausgesetzt, von lenen bekannt ist, daß sie das Tumorzeliwachstum durch die Induktion der Differenzierung hemmen. TMS war klarerweise der effektivste Hemmstoff für das Tumorzellwachstum.
In einem anderen in vitro Versuch kann der Einfluß verschiedenartiger Verbindungen auf die Aktivität von PK-C kontrolliert werden. Bestimmte Tumorzellen zeigen ein hohes PK-C Aktivitätsniveau. Die menschliche Epidermiskarzinomzellinie A-431 (ATCC Nr. CRL 1555) kann für eine biologische Prüfung der Aktivität von PK-C, wie in Igarashi u. a. (supra) beschrieben, benutzt werden. Phosphatidylserin (5 µg pro Röhrchen) und 1,2-Diolein (0,05 µg pro Röhrchen), mit oder ohne einer geeigneten Menge einer Sphingosin-Derivatprobe werden in ein organisches Lösungsmittel, wie Ethanol oder Ethanollchloroform gegeben, werden anschließend in ein 1,5 ml Röhrchen (Sarstedt) gegeben und die Mischung wird dann unter einem N&sub2;-Strom verdampft. Die Lipidmischung wird in etwa 30 µl einer 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) für 30 Minuten beschallt. Die resultierenden Liposomen werden mit einer Puffermischung, die 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 400 µM EDTA, 50 µM EGTA, 500 µM CaCl&sub2;, 200 µg/ml Histon III-S oder Myelinbasisprotein und 20 µM γ[³²P]- ATP (2 x 10&sup6; cpm) enthält, ergänzt, um ein Endvolumen von ca. 90 µl zu erhalten.
Die Reaktion wird durch das Zufügen von etwa 10 µl PK-C initiiert, das aus A431-Zellen, wie in Igarashi u. a. (supra) beschrieben oder aus Mäusehirn, wie in Kikkawa u. a. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 135, 636, 1986) beschrieben, hergestellt wird und das etwa 1-2 µg Protein enthält, und wobei die Mischung für 10 Minuten bei 30 Grad inkubiert wird. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1 ml einer 1 mM ATP-Lösung bei pH 7,5, die 25 % TCA und 1 % BSA enthält, beendet. Der Niederschlag wird auf dem Wege der Zentrifugation gesammelt, zweimal mit 1 ml 25 %igem TCA gewaschen, anschließend in 1 ml 1 mM NaOH Lösung, die 0,1 % Deoxycholat enthält, unter leichtem Erhitzen (80ºC für 10 Minuten) gelöst und in einem Szintillationszähler gezählt. Reaktionsmischungen ohne Phosphatidylserin, 1,2- Diolein oder Ca²&spplus; wurden als Kontrollen benutzt.
Die Daten von einer Serie von Experimenten, bei denen zwei verschiedene Substrate benutzt wurden - Histon III-S und Myelinbasisprotein - sind in Figur 4 zusammengefaßt. Unabhängig vom Substrat war TMS hinsichtlich der Fähigkeit PK-C zu hemmen, besser geeignet als die anderen Verbindungen.
Auch wenn die Daten zeigen, daß TMS eine bessere hemmende Aktivität gegenüber PK-C im Vergleich zu den verbleibenden, getesteten Verbindungen hat, so weist TMS auch andere Vorteile auf. Einige Krebszellen zeigen ein höheres Metastasepotential und invasive Fähigkeiten als andere. Zum Beispiel sind die BL6 und die F10 Melanomzellinien höchst metastatisch und invasiv. Andererseits ist die F1-Variante sehr viel weniger metastatisch und nvasiv (I. R. Hart u. a., Amer. J. Pathol., 97, 587-592 [1979]; G. Poote u. a., Cancer Res. 42, 2770-2778 [1982]; F1 und F10 Klone von ATCC, CRL 6323 und CRL 6475,).
BL6 und F1-Zellen wurden in vitro wie oben beschrieben getestet. Wie in Figur 5 gezeigt ist, war TMS bei der Hemmung des Zellwachstums effektiver als DMS und Sphingosin. Auch die BL6-Zellen waren empfindlicher auf die TMS-Behandlung, wie aus dem Linksshift der TMS- Kurve zu niedrigeren Konzentrationen offenbar wird.
Die Wirksamkeit von TMS in vivo wird in den Kurven, die in Figur 6 enthalten sind, zusammengefaßt. Die BL6-Zellen wurden in Mäuse injiziert und die metastatischen Ablagerungen in der Lunge wurden anschließend an verschiedenartige Behandlungen, die verschiedene Wege und Zeiten der Darreichung beinhalten, bestimmt. TMS ist wirkungsvoll hinsichtlich der Unterdrückung der Lungenkolonialisierung und der Tumorentwicklung und zwar unabhängig vom Weg oder der Zeit der Verabreichung, obgleich eine frühe Behandlung bevorzugt ist und eine wiederholte Behandlung wirkungsvoller ist. Wie die Daten, die in den Tafeln B und C zusammengefaßt sind, gab es eine ausgeprägte Dosiswirksamkeit gegenüber TMS hinsichtlich der Kolonialisierung der Lungentumoren.
Ein anderer Aspekt von TMS ist die starke Wirkung, die es auf die Plättchenaggregation hat (Für den Zweck dieser Erfindung werden Plättchen als Zellen angesehen.) Wie die Daten, die in den Figuren 7 und 8 zusammengefaßt sind, zeigen, hemmt TMS die Plättchenaggregation in dosisabhängiger Weise.
Nach der Stimulation mit Thrombin wurde ein 40 kD-Plättchen-Protein phosphoryliert. Wie in Figur 9 gezeigt ist, hemmt die Einwirkung von TMS die Phosphorylierung des 40 kD- Plättchen-Proteins. Auch wenn die Erfinder nicht durch ihre Aussage festgelegt werden wollen, so glauben sie doch, daß die Abwesenheit des phosphorylierten 40 kD-Proteins die Plättchenaggregation verhindert.
Die Aktivierung von Plättchen ist für zahlreiche biologische Prozesse, wie die Blutgerinnung, Entzündung, Wundheilung, die Tumorzellmetastase und die Tumorzellinvasion von zentraler Bedeutung. Es gibt viele Faktoren und Mechanismen, die die Plättchenaktivierung beeinflussen, und ebenso viele Konsequenzen ihrer Aktivierung. Das Selektin GMP-140 bindet an Neutrophile, HL60-Zellen oder Tumorzellen, die Sialosyl-LEx exprimieren. Die Expression von GMP-140 und seine anschließende Bindung an Sialosyl-LEx sind für die Inituerung von Entzündungsprozessen wie auch für die Tumorzellmetastase von zentraler Bedeutung. Die Expression von GMP-140 wird durch die Vorinkubation mit TMS herunter geregelt oder blockiert. Die Möglichkeit einer zytotoxischen Wirkung von TMS auf Plättchen ist klar durch he Tatsache ausgeschlossen, daß die Plättchen nach erfolgter Inkubation mit TMS eine tormale, durch Ristocetin induzierte Aggregation zeigen.
Die Verwendbarkeit von TMS ist nicht auf die Unterdrückung bösartigen Zellwachstums beschränkt. Zum Teil ist eine Entzündung durch eine Proliferation von lymphoiden und nyeloiden Zellen gekennzeichnet. In der Regel dient die Proliferation einem erwünschten zweck, wie beispielsweise der Komplexierung fremder Antigene oder den Wiederherstellungsfähigkeiten nach einer Verletzung, manchmal jedoch kann sie anormal in Erscheinung treten, wie zum Beispiel bei einer Fehlfunktion des Immunsystems. Infolgedessen findet TMS bei der Steuerung der Zellproliferation offensichtlich normaler Zellen Anwendung. Zum Beispiel werden Mäuse-CTLL-2-Zellen (ATCC Nr. TIB 214), eine T-Lymphozyten- Ziellinie, mit einer Zelldichte von 1,5 x 10&sup4; Zellen pro Vertiefung auf Platten aufgebracht und len Testsubstanzen ausgesetzt. Die Zellproliferation wurde mittels der Thymidin-Aufnahme überwacht. Die Daten mehrerer Experimente sind in Figur 10 zusammengefaßt. TMS erwies sich bei der Unterdrückung des CTLL-2-Zellwachstums als wirkungsvoll. Demgemäß kann RMS angewandt werden, um das Wachstum von menschlichen und tierischen Zellen dadurch zu hemmen, daß man sie einer, das Zellwachstum hemmenden, Menge N,N,N- Trimethylsphingosin oder einer pharmazeutisch akzeptablen Anwendungsform davon, aussetzt.
Da TMS eine hemmende Aktivität auf Proteinkinase C und andere Kinasen entfaltet, verhindert FMS wahrscheinlich den Verbrauch intrazellulärer ATP-Speicher und schwächt zusätzlich zur Hemmung der Plättchenaggregation und der Hemmung der Zelladhesion, die hier beschrieben sind, die Metabolismusaktivität ab. Infolgedessen kann TMS angewandt werden, um biologisches Material, wie beispielsweise Blutprodukte zu konservieren oder deren Aufbewahrung steil zu verlängern. Zum Beispiel konnte gezeigt werden, daß TMS unter, für die Blutaufbewahrung normalen Bedingungen, die Metabolismusaktivität von Erythrozyten in vitro verlangsamte, wie aus der Verringerung der Enzymaktivität der Erythrozyten klar zu erkennen war. Ahnliche Ergebnisse können für Leucozyten und Plättchen erwartet werden. Demgemäß kann TMS bei Verfahren und Zubereitungen, die derzeit in Anwendung sind, um biologische Materialien zu konservieren und aufzubewahren, als Zusatzstoff verwendet werden. Eine, das Zellwachstum hemmende Menge TMS kann zu dem Aufbewahrungsmedium gegeben werden.
Neutrophile (polymorphkernige Leucozyten) zeigen drei agonistisch abhängige Hauptreaktionen, die sich normalerweise in drei Hauptfunktionen manifestieren: (i) ein Ausbruch, um Superoxidanionen (O&sub2;&supmin;) zu erzeugen; (ii) phagokinetische Migrationsaktivität und (iii) die Fähigkeit mit aktivierten Endothelzellen (EC's) und Plättchen zu interagieren. Die Mechanismen (ii) und (iii) resultieren in der Anlagerung an EC's und in der Migration durch die EC-Monoschicht in die vaskuläre oder extravaskuläre Matrix . Normalerweise stellen diese Funktionen gemeinsam einen nützlichen Mechanismus zur Verfügung, um bei einer Entzündungsreaktion die Mikroorganismen zu beseitigen. Eine Akkumulation oder Überfunktion der Neutrophilen wänrend einer entzündlicher Krankheiten kann jedoch in Gewebeschäden und Kreislaufstörungen resultieren.
Die Reaktionen von Neutrophilen werden durch zahlreiche Stimulanzien ausgelöst, einschließlich chemotaktischer Peptide (z.B. Formyl-met-leu-phe (fMLP), Arachidonat, (urzkettiges Diacylglycerol (DAG, C8-DAG) und Phorbolester (z.B. PMA)).
Die Produktion des Superoxidanions, die in Neutrophilen unter Anwendung anerkannter Verfahren stattfindet - siehe zum Beispiel Nojiri u. a., Blood, 64, 534, 1984, wie durch die Reduktion von Cytochrom C festgestellt wurde, wird in dosisabhängiger Weise von TMS gehemmt (Figuren 13A und 13B). TMS (20 µM) beseitigt die Superoxidanion Produktion vollständig. (Die Reduktion von Cytochrom C wird mit bekannten Verfahren, wie beispielsweise dem Verfahren von Clifford, Meth. Enz., 105, 393, 1981, überwacht. Der O&sub2;- Verbrauch der Neutrophilen, der durch die Messung der elektrischen Leitfähigkeit mit einem Sauerstoff-Monitor und einer Micro-O&sub2;-Kammer-Anordnung (Y.S.I. Inc., Yellow Springs, OH) bestimmt wurde, wurde durch PMA signifikant erhöht. Die PMA-abhängige Erhöhung des O&sub2;-Verbrauchs wird von TMS stark gehemmt (Figur 14).
Die phagokinetische Aktivität von Neutrophilen auf einer mit kolloidem Gold beschichteten Platte kann mit einer essentiellen Technik, wie in Albrecht-Buehler (Cell, 11, 395, 1977) gelehrt, bestimmt werden. Die phagokinetische Aktivität wird von einer sehr kleinen Menge RMS (1,5 µM) signifikant und von 4,5 µM TMS vollständig unterdrückt. Die TMS-abhängige Hemmwirkung ist bei Austausch des Kulturmediums gegen ein TMS-freies Nährmedium vollständig rückläufig. Folglich ist die hemmende Wirkung von TMS auf die phagokinetische Aktivität nicht von einer Zytotoxizität abhängig.
Ein Kennzeichen von Neutrophilen ist die Fähigkeit sich an aktivierte EC's anzuhaften und durch die EC-Monoschicht in die vasculäre und extravasculäre Matrix zu wandern. Die Wirkung von TMS auf die neutrophile Interaktionen der Neutrophilen mit EC's und die anschließende trans-endotheliale Migration der Neutrophilen kann in vitro mit menschlichen umbilikalen Endothelzellen (HUVEC's) (Luscinskas u. a., J. Imm., 146, 1617, 1991) kontrolliert werden. Die Neutrophilen werden zu einer HUVEC-Monoschicht zugegeben, und die Interaktionen der Neutrophilen mit HUVEC werden nach der Fixierung, dem Einbetten und dem Anfärben der Monoschicht-Bereiche mikroskopisch bestimmt.
Unter physiologischen Bedingungen sind Neutrophile in der Lage durch die EC-Monoschicht in die kollagene Matrix zu wandern. Wenn die EC's für vier Stunden in einem M199- Nährmedium mit IL-1β- aktiviert werden, wandern die Neutrophilen innerhalb von 90 Minuten in die kollagene Matrix. Die Migration der Neutrophilen wird durch eine Vorbehandlung der Neutrophilen mit 8 µM TMS stark und durch eine Vorbehandlung mit 25 µM TMS vollständig gehemmt.
Die dosisabhängige hemmende Wirkung von TMS und anderen Protein-Kinase Hemmstoffen bezüglich der Migration von Neutrophilen durch die IL-1α-aktivierte EC Monoschicht ist in den Tabellen I und II zusammengefaßt. TMS (15 µm) reduziert die Anzahl der Zellen, die durch die EC Monoschicht wandern in hohem Maße, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen. Calphostin C (5 µM), 200 µM H7 und 2 µM Staurosporin rufen ähnliche zytotoxische Wirkungen bei Neutrophile hervor, obwohl Staurosporin und Calphostin C bemerkenswerte morphologische Schäden an den EC's verursachen (Tabellen III und IV).
RMS (15 µm) zeigt keine signifikante Zytotoxizität auf Zellen, wohingegen 15 µM SPN und 15 µM DMS 12 bis 13 % Zytotoxizität zeigen. Bei 25 µM verursachen SPN und DMS hauptsächlich zytotoxische Schäden an den Neutrophilen, wohingegen die diesbezügliche Wirkung von TMS vernachlässigbar ist (Tabelle V). Tabelle I Unterdrückung der phagokinetischen Aktivität mit Protein-Kinase-Hemmstoffen
* Mittelwert ± Standardabweichung der Probe
§ Der Bereich, über den sich die Neutrophilen erstreckten, wurde auf Photographien der Monoschicht bestimmt. Die, durch die Bewegung der Neutrophilen gereinigten Regionen wurden dann ausgeschnitten und gewogen.
H-7 wurde von Seikagaku Kogyo (Tokio, Japan) erhalten; Staurosporin und Calphostin C wurden von Kamiya Biochemical Co. (Thousand Oaks, CA) erhalten; und Ceramid wurde von Sigma erhalten. Tabelle II Die Wirkung von TMS und Ceramid auf die Migration von Neutrophilen
* Mittelwert ± Standardabweichung der Probe (N = 25)
Die Querschnitte (2µm) des Kollagen-Bettes mit HUVEC's und den Neutrophilen wurden mit einem Zeiss Lichtmikroskop mit KPL W10 und Ph2 Neofluar 16 Linsen beobachtet. Die Anzahl der durchgewanderten Zellen wurde für jede Ansicht gezählt.
ND = Nicht Bestimmt Tabelle III Die Wirkung von verschiedenartigen PKC-Hemmstoffen auf die Migration von Neutrophilen durch die endothelialen Monoschichten
* Mittelwert ± Standardabweichung der Probe (N = 25)
** signifikante morphologische Schäden an HUVEC's Tabelle IV Zurückgewinnung der phagokinetischen Aktivität vom Wirkstoff *
Mittelwert ± Standardabweichung der Probe
* Die Neutrophilen wurden für 10 Minuten mit 12 µm des genannten Behandlungsmittels in Teströhrchen vorinkubiert und dann auf die Monoschicht verteilt. Nach diesem Arbeitsgang wurden die Behandlungsreagentien auf das 200-fache verdünnt. Tabelle V Lebensfähigkeit der Neutrophile
* Mittelwert ± Standardabweichung der Probe (N = 8)
Die Konzentration der Neutrophilen lag zwischen 0,8 und 1,7 x 10&sup6;/ml. Die Lebensfähigkeit wurde mit der Trypanblau-Ausschluß-Analyse bestimmt. Die Zell-Suspension in RPMI 1640 mit Glutamat und Pyruvat aber ohne FCS wurde für 10 Minuten bei 37ºC mit dem Wirkstoff inkubiert. Das Aliquot wurde mit derselben Menge einer Trypanblau-Lösung gemischt und sofort unter einem Nikon Lichtmikroskop gezählt.
Wenn Neutrophile, die auf dem Metabolismusweg für eine Stunde mit [³²P]-Natriumphosphat (2 mCi) markiert wurden, um intrazelluläres ATP anzureichern, mit 1,5 µM PMA stimuliert werden, dann zeigen zwei Protein-Banden der nachfolgenden SDS-PAGE eine stark erhöhte Phosphorylierung. Die Proteine haben Molekulargewichte von etwa 47 kDa und 65 kDa. Wenn die Neutrophilen mit 15 bis 45 µM SPN, DMS oder TMS vorinkubiert und dann mit PMA stimuliert werden, ist die Phosphorylierung der beiden Proteine signifikant vermindert. Die hemmende Wirkung bezüglich der Phosphorylierung wird binnen zwei Minuten Inkubationszeit beobachtet. Da die 47 kDa und die 65 kDa Proteine anscheinend direkte Substrate von PK-C sind, kann die hemmende Wirkung von SPN, DMS und TMS als eine PK-C hemmende Wirkung erscheinen.
Die metabolische Aufnahme von [³²P]-Natriumphosphat (4 mCi) in Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylinositol-4-phosphat (PIP) und Phosphatidylinositol-4,5-bis-diphosphat (PIP2) wird durch das chemotaktische Peptid fMLP (1 µM) erhöht. Die fMLP-abhängige Erhöhung wird stark durch eine Vorinkubation der Neutrophilen mit 5 µM TMS unterdrückt. Die relative (ntensität der fMLP-induzierten Markierung in PIP und PIP2 und die Wirkungen von SPN, DMS und TMS auf die metabolische Aufnahme von ³²P in PIP und PIP2 sind in Tabelle VI zusammengefaßt. Tabelle VI Wirkung von TMS, DMS und SPN auf die Umwandlung von Phosphoinositid
* Mittelwert ± Standardabweichung der Probe (N = 6)
*1 p < 0,05
*2 p < 0,02
*3 p < 0,01
Die Menge von ³²P in PIP und PIP2 wurde unter Anwendung der TLC-Trennung gemessen. Jeder Fleck auf den TLC-Platten wurde abgekratzt und die Radioaktivität darin wurde mit einem Beckman Scintillationszähler gemessen. Jeder Fleck wurde hinsichtlich seiner Intensität mit dem identischen Fleck auf der Kontrollprobe verglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Medikamente zur Verfügung, um das Wachstum menschlicher und tierischer Zellen und die Aggregation von menschlichen und tierischen Plättchen zu hemmen, die folgendes aufweisen: (1) eine therapeutisch wirksame Menge N,N,N-Trimethylsphingosin oder pharmazeutisch zulässige Salze daraus; und (2) einen pharmazeutisch zulässigen Trägerstoff, ein Diluens oder einen Arzneimittelträger.
Die Medikamente sind sowohl für in vitro als auch für in vivo Applikationen anwendbar. Spezifische Verwendungsmöglichkeiten umfassen die Behandlung von bösartigem und gutartigem Tumorwachstum, Entzündungen, anderen Symptomen einer Fehlfunktion des Immunsystems oder Fälle bei denen das Immunsystem unangemessen oder übermäßig auf einen Reiz reagiert.
Das Medikament weist eine therapeutisch wirksame Menge TMS und einen pharmazeutisch zulässigen Trägerstoff, ein Diluens oder einen Arzneimittelträger auf. Die wirksame Menge TMS kann unter Anwendung anerkannter Verfahren bestimmt werden, wobei beispielsweise das Aufstellen von Dosis-Response-Kurven in geeigneten Tierversuchsmodellen, derart, wie sie hier beschrieben sind oder in nicht-menschlichen Primaten, deren Ergebnisse auf den Menschen extrapoliert werden; das Extrapolieren aus geeigneten in vitro Daten, wie sie )eispielsweise hier beschrieben sind; oder das Feststellen der Wirksamkeit aus klinischen Versuchen, zu nennen sind.
Trimethylsphingosin hat auch tiefgreifende Wirkungen auf Zelladhesionsmoleküle. Die Wirkung wird bei der Hemmung der Expression des Zelladhesionsmoleküls bei Plättchen offenbar. Zum Beispiel löst Thrombin in Plättchen die Expression von GMP-140 aus. Die Einwirkung von TMS auf die Plättchen hemmt die GMP-140 Expression. Infolgedessen wird FMS bei Krankheiten, die sich aus zelladhesionsmolekül-abhängigen Prozessen ableiten, nützlich sein. Wie oben bereits angemerkt, bindet sowohl GMP-140 als auch ELAM-1 an Sialosyl-Lex. Folglich wird TMS eine nützliche Anwendung bei der Vermeidung der ymphozytisch-endothelialen Zelladhesion und der nachfolgenden Interaktion zwischen Zellen, wie beispielsweise bei der Entwicklung einer Entzündung am Verletzungsort, finden.
Die geeigneten Dosen der Medikamente der gegenwärtigen Erfindung, die abhängig von der speziellen medizinischen Anwendung, wie der Schwere der Krankheit, dem Gewicht des Individuums, dem Alter des Individuums, der Halbwertszeit in der Blutbahn, usw. sind, kann von einem erfahrenen Fachmann bestimmt werden.
Die Medikamente können ein Vielzahl an Formen annehmen, wie zum Beispiel Tabletten, Kapseln, Pulver oder Körner in Massenbehältern oder Pulver oder Körner in Einzeldosen; sie können in Liposomen enthalten sein; oder sie können in Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salben, Pasten, Cremes, Gelen, Schäumen und Gelees zubereitet sein. Parenterale Dosierungsformen beinhalten Lösungen, Suspensionen und dergleichen. Das Medikament ist geeignet vielfältige, anerkannte Arzneimittelträger, Diluentien, Füllstoffe, usw. zu enthalten. Solche ergänzenden Zusatzstoffe beinhalten Abbaumittel, Bindemittel, Gleitmittel, oberflächenaktive Stoffe, Emulsionsbildner, Puffer, Feuchthaltemittel, Lösungsvermittler und Konservierungsmittel. Der Fachmann kann die geeignete Zubereitung, die TMS enthält, zusammenstellen, und er kann sich bei zahlreichen Sachverständigen und Literaturangaben, wie beispielsweise "Goodman & Gilman's, The Pharmazeutical Basis of Therapeutics" (6. Auflage, Goodman u. a., Hrgs., Macmillan Publ. Co., NY, 1980) eine Anleitung erfragen.
An Körperstellen, die durch ein kontinuierliches Zellwachstum oder durch die Notwendigkeit der Zellwachstumshemmung aufgrund einer Funktionsstörung gekennzeichnet sind, und die relativ unzugänglich sind, kann TMS in einer geeigneten Weise verabreicht werden, um eine wirksame lokale Konzentration sicherzustellen. Zum Beispiel kann TMS in ein Depot oder Adjuvans injiziert oder in ein chirurgisch angelegtes Implantat oder Reservoir befördert werden, das eine bestimmte Menge TMS über eine Zeitperiode langsam abgibt oder es kann mit Erkennungsmolekülen komplexiert werden, die die Fähigkeit haben an den Ort zu binden, der das anomale Zellwachstum zeigt. Ein Beispiel für solch ein beabsichtigtes Szenario ist ein Erkennungsmolekül, das ein Antikörper mit einer Bindungsspezifität für ein knochenmarkspezifisches Antigen ist, wobei der knochenmarkspezifische Antikörper mit TMS komplexiert ist und der Komplex einem Patienten mit Leukamie verabreicht wird.
Bestimmte Aspekte der Erfindung werden in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen beschrieben. Außer wenn etwas anderes angegeben ist, gelten alle Mengen- und Maßangaben in Gewicht/Volumen- oder Volumen/Volumen-Verhältnissen.

Beispiel 1

Aus plättchenreichem Plasma (erstanden von Oregon Red Cross, Portland, OR) wurden Plättchen isoliert. Die kontaminierenden Erythrozyten wurden durch Zentrifugieren entfernt (80 x g für 10 Minuten). Die Plättchen wurden durch Zentrifugieren (300 x g für 10 Minuten) erhalten, einmal in Tyrode-Puffer (pH 6,5), der 22 mM Trinatriumcitrat und 0,35 % (Gewicht/Volumen) BSA enthält, gewaschen und erneut in demselben Puffer suspendiert, um eine Konzentration von 1 - 2 x 10&sup9; Plättchen/ml zu erhalten. Alle Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
Eine Plättchensuspension (3,5 x 10&sup8;/ml) in Tyrode-Puffer wurde mit verschiedenartigen Hemmstoffverbindungen (H-7 ist [1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)-2-methylpiperazin, ein synthetischer Proteinkinase C Hemmstoff, der von Seikagaku America Inc., St. Petersburg, FL erstanden wurde], Calphostin C, , ein synthetischer Proteinkinase C Hemmstoff, der von Dr. Saitoh, Kyowa Hakko Co., Ltd., Machida, Tokyo, Japan erstanden wurde], Sphingosin, das von Sigma, St. Louis, MO erstanden wurde) und Dimethylsphingosin und Trimethylsphingosin, die gemäß Igarashi u. a., Biochem., 28, 6796,1989 synthetisiert wurden vorinkubiert und nachfolgend wurden Thrombin oder ADP (die beide von Sigma erstanden wurden) hinzugegeben. Die Plättchenaggregation wurde durch einen Wechsel in der Lichtdurchlässigkeit mit einem Aggregometer (Chrono-log Corp., Havertown, PA), das mit einem Computeranalysator ausgestattet ist, bestimmt.

Beispiel 2

TMS inhibierte Plättchenaggregation

Die GMP-140 Expression wurde mit (i) Fließ-Zytometrie mittels mAb ACl.2, das auf GMP- 140 orientiert ist und von Dr. Furie (Tufts Univ. Sch. Med., Boston, MA) erstanden wurde, und (ii) mit der Adhesion von HL60-Zellen auf einer plättchen-beschichteten festen Phase, bestimmt. Eine Plättchensuspension (1 x 10&sup8;/ml) in Tyrode-Puffer wurde bei pH 7,2 bei 37ºC für fünf Minuten mit Hemmstoff inkubiert, anschließend mit Aktivator, entweder Thrombin (Endkonzentration 1 Einheit/ml) oder Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) (Endkonzentration 10&supmin;&sup7; M) ergänzt, und bei 37ºC für 10 Minuten inkubiert. Die Plättchen wurden mit demselben Volumen 2 %igen (Gewicht/Volumen) Paraformaldehyds in PBS fixiert und zweimal mit PBS, das 1 % (Gewicht/Volumen) BSA enthält gewaschen.
Die paraformaldehyd-fixierten Plättchen wurden mit 50 µl mAb Acl.2 (2,5 µg/ml) bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Plättchen wurden zweimal mit PBS, das 1 % (Gewicht/Volumen) BSA enthält gewaschen, mit 50 µl eines Fluorescein Isothiocyanatmarkierten anti-Maus Ig von der Ziege (erstanden von Tago Co., Burlingame, CA) ergänzt, bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und nochmals mit PBS, das 1 % (Gewicht/Volumen) BSA enthält gewaschen. Zur negativen Kontrolle wurden paraformaldehyd-fixierte Plättchen statt mit mAb Acl.2 mit Maus IgG inkubiert und wie oben beschrieben behandelt.
Die Plättchen wurden in einem Epics Fließ-Zytometer (Coulter Corp.) mit einem geeigneten Einlaufsystem analysiert. Um die hemmende Wirkung verschiedenartiger Reagentien zu berechnen, wurde die mittlere Fluoreszenzintensität der ruhenden Plättchen (aus der Inkubation von Plättchen ohne Aktivator erhalten) vom Wert der aktivierten Plättchenproben subtrahiert.
Die Ergebnisse der repräsentativen Experimente sind in den Tabellen 11A und 11B zusammengefaßt. Die GMP-140 Expression wird von 10 - 20 µM TMS stark gehemmt. Auch wenn DMS die Thrombin- und die ADP-induzierte Plättchenaggregation nicht so gut hemmte wie dies TMS tat, so hemmte DMS die Thrombin-induzierte GMP-140 Expression dennoch stark. SPN und H-7 riefen keine Hemmung der GMP-140 Expression hervor. Eine schwache Hemmung wurde durch 10 - 20 µM Calphostin C hervorgerufen [Es wurde berichtet, daß die Verbindung Proteinkinase C in einer Konzentration von 0,05 µM in vitro hemmt (Tamaoki & Nakano, Bio/Tech., 8, 732, 1990).].
Ähnliche Ergebnisse wurden für PMA-induzierte Plättchen erhalten, d.h. sowohl TMS als auch DMS hemmten die GMP-140 Expression in einer Konzentration von 10 - 20 µm stark (Figur 11B). Weder SPN noch H-7 zeigten eine Hemmung, obwohl berichtet worden war, daß H-7 in ciner Konzentration von 15 µM PKC hemmt (Tamaoki & Nakano, supra).

Beispiel 3

Die Adhesion von HL60 (eine menschliche promyelozytische Zellinie, die bei der ATCC unter der Zugangsnummer CCL 240 verfügbar ist) auf einer ruhenden oder aktivierten plättchenbeschichteten festen Phase wurde wie folgt bestimmt. Jede Vertiefung auf einer Platte mit 48 Vertiefungen (Costar Scientific, Cambridge, MA) wurde mit einer Poly-L-lysin Lösung (100µg/ml in PBS) gefüllt und eine Stunde inkubiert. Jede Vertiefung wurde dann mit PBS gewaschen, anschließend wurden 150 µl PBS, das 6 x 10&sup7; ruhende oder aktivierte Plättchen enthielt, in jede Vertiefung zugegeben und die Platte wurde für eine Stunde inkubiert. Die Platten wurden zentrifugiert (300 x g für sieben Minuten) und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die gebundenen Plättchen wurden durch Zusatz von 0,1 %igem (Gewicht/Volumen) Glutaraldehyd in PBS für zwei Minuten bei 4ºC fixiert. Jede Vertiefung wurde mit 10 mM Glycin in PBS gewaschen und die Platten wurden mit 5 %igem (Gewicht/Volumen) BSA, das 0,1 % (Gewicht/Volumen) Natriumazid und 10 mM Glycin in PBS enthält, bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert.
Nach dem Waschen mit Kultur-Nährmedium (RPMI 1640, das 5 % (Volumen/Volumen) FCS enthält), wurden 1 x 10&sup6; HL60-Zellen, die mit [³H]-Thymidin markiert wurden, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die HL60 wurden in RPMI 1640 Medium (erstanden von Irvine Scientific, Santa Ana, CA), ergänzt, mit 10 % FCS (Hydone, Logan, UT) aufbewahrt. (Die radioaktive Markierung der HL60-Zellen, die für die Zell-Adhesionsversuche benutzt wurden, wurde durch die Inkubation der Zellen mit 2 µCi/ml [³H]-Thymidin über Nacht bewerkstelligt.) Nach der Inkubation für 45 Minuten bei Raumtemperatur wurden die ungebundenen Zellen abgesaugt, und die Vertiefungen wurden einmal mit Nährmedium (RPMI 1640, das 5 % (Volumen/Volumen) FCS enthält) gewaschen, die gebundenen Zellen wurden mit 0,05 % (Gewicht/Volumen) Trypsin-0,02 % (Gewicht/Volumen) EDTA (Irvine Scientific) in PBS abgelöst und die radioaktiven Leveis in jeder Zelle wurden in einem Flüssigscintillationszähler gemessen.
Die Ergebnisse der repräsentativen Experimente sind in den Tabellen 12A und 12B gezeigt. Für die Thrombin- und die PMA-stimulierten Plättchen wurde die HL60 Zellbindung durch TMS und DMS stark gehemmt, während sie durch SPN minimal gehemmt wurde. Die Bindung der HL60-Zellen an aktivierte Plättchen wird als alleinig abhängig von der Erkennung des Sialosyl-Lex, das von HL60-Zellen exprimiert wird, durch GMP-140 betrachtet, da die Bindung spezifisch durch Liposome, die Sialosyl-Lex enthalten und nicht durch Liposome, die andere Glycosphingolipide enthalten, gehemmt wird.

Beispiel 4

Menschliche Neutrophile wurden von normalen männlichen Erwachsenen erhalten. Heparinversetztes peripheres Blut wurde in einer 60 ml Injektionsspritze sanft mit einer 1 %igen Dextran-Lösung in PBS gemischt. Man ließ die Mischung für 60 bis 90 Minuten bei 37ºC absetzen. Die obere Phase, die reich an weißen Blutzellen ist, wurde sanft in Falcon 2095 Teströhrchen aus Plastik (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NY) im selben Volumen Ficoll-Paque (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) aufgenommen. Zentrifugieren mit 450 g für 30 Minuten bei 4ºC brachte die Neutrophilen in den unteren Teil der Röhrchen. Die obere Phase und die Grenzfläche, die Leucozyten enthält, wurde vorsichtig durch Absaugen entfernt.
Die kontaminierenden Erythrozyten wurden von den Zellpellets durch hypotonische Lyse entfernt, indem die Zellpellets für 30 Sekunden in eiskaltem destilliertem Wasser suspendiert wurden und anschließend ein gleiches Volumen einer 1,8 %igen NaCl-Lösung zugegeben wurde. Nach dem Zentrifugieren bei 80 g für 10 Minuten wurden die Zellen mit einem geeigneten Puffer oder Nährlösung wieder suspendiert.
Die End-Zubereitung bestand aus mehr als 98 % Neutrophilen, wie mittels der Wright-Giemsa- Färbung festgestellt wurde. Die Suspension wurde bei 4ºC aufbewahrt und innerhalb von drei Stunden benutzt.

Beispiel 5

Die Produktion des Superoxidanions durch Neutrophile wurde auf dem Weg der Überwachung der Reduktion von Cytochrom C, die durch das Superoxidanion vermittelt wird, quantifiziert (Clifford, supra, wobei die Reduktion als Erhöhung der Absorption bei 550 nm bei einem Extinktionskoeffizienten von 21000/M/cm festgestellt wurde). Die Messungen wurden mit einem Beckman DU-50 Spektophotometer bei 37ºC und etwa 1 x 10&sup6; Neutrophilen pro ml durchgeführt. Vor der Zugabe von 1 µM PMA wurden die Zellen für 10 Minuten mit TMS oder anderen Wirkstoffen ins Gleichgewicht gebracht.
FMS hat eine tiefgreifende Wirkung auf die Produktion des Superoxidanions bei Neutrophilen.

Beispiel 6

Der O&sub2;-Verbrauch wurde mit einer Elektrode vom Clark-Typ mit einem Y.S.I. biologischen Sauerstoffmonitor, Modell P300 und einer Mikro-Sauerstoff-Kammer-Anordnung (Y.S.I. Inc., Yellow Springs, OH) gemessen. Die Versuche wurden bei 37ºC mit etwa 6 x 10&sup6; Neutrophilen pro ml in einem Gesamtvolumen von 600 µl durchgeführt. Vor der Zugabe in die Mikrokammer wurde die Zellsuspension in Eppendorf Teströhrchen für einige Minuten auf 37ºC erwärmt. Die Wirkstoffe wurden vorsichtig unter Benutzung einer Hamilton Spritze injiziert und bei einer Geschwindigkeit von etwa 240 Umdrehungen pro Minute gut gerührt. Die Zellsuspension wurde für 5 Minuten mit Wirkstoff vorinkubiert bevor PMA zugegeben vurde, um eine Endkonzentration von 1,0 µM zu erhalten.
TMS hat die aufgezeichnete Wirkung auf den O&sub2;-Verbrauch von Neutrophilen.

Beispiel 7

Frisch gereinigte Neutrophile (etwa 8 x 10&sup7; Zellen) wurden für 60 Minuten in einem Schüttel- Wasserbad bei 37ºC mit 2 mCi Na&sub2;H [³²P] O&sub4; in einem Puffer, der 0,1 % lipidfreies BSA- HEPES (10 mM pH 7,4,136 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 5.6 mM Glukose und 0,33 mM CaCl&sub2;) enthält. Die überschüssigen ungebundenen Verbindungen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Pellets wurden wieder in demselben Puffer suspendiert, wobei dieser Vorgang Tweimal wiederholt wurde. Anschließend wurden die Zellen in sieben Behandlungsgruppen unterteilt, wobei jede etwa 1 x 10&sup7; Zellen in einem Gesamtvolumen von 0,4 ml enthielt. TMS, SPN oder DMS wurden zu der Suspension zugegeben und für 10 Minuten bei 37ºC inkubiert md anschließend durch Zugabe von PMA auf eine Endkonzentration von 1,5 µm gebracht. Zwei Minuten später wurde die Reaktion durch die Zugabe von 0,1 ml Laemmli's Probenpuffer und 20 mM EDTA und durch anschließendes Erhitzen auf 100ºC für 5 Minuten ibgestoppt. Die Aliquote wurden unter Anwendung bekannter Verfahren durch 10 %ige Natriumdodecylsulfatgele getrennt. Die Aufnahme von ³²P wurde mit Autoradiographie sichtbar gemacht.
TMS hat einen Einfluß auf die Phosphorylierung von spezifischen Proteinen, die sich auf den Metabolismus und die Aktivität von Proteinkinase-C beziehen.

Beispiel 8

Frisch menschliche gereinigte Neutrophile (1,3 x 10&sup8;/ml in 10 mM 0,1 %igem BSA-HEPES Puffer: pH 7,45, 136 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 5,6 mM Glukose und 0,33 mM CaCl&sub2;) wurden in einem Schüttel-Wasserbad für 90 Minuten bei 37ºC mit 4 mCi NaH&sub2;[³²P]O&sub4; inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und in demselben Puffer bei einer Konzentration von 1 x 10&sup7; Zellen pro ml wieder suspendiert. Anschließend wurde jede Suspension (1 ml) mit TMS, SPN oder DMS oder mit dem gleichen Volumen 50 %igen Ethanols für 10 Minuten bei 37ºC vorbehandelt. Daraufhin wurde, unter Beibehaltung derselben Temperatur, fMLP bis zu einer Endkonzentration von 1,0 µM hinzugegeben. Zwei Minuten später wurde die Reaktion durch Zugabe von 3,75 ml einer Mischung aus Chloroform/Methanol (1:2) zu jeder Zellsuspension und nachfolgendem Beschallen für 15 Minuten abgestoppt. Weitere 1,25 ml Chloroform, 1,25 ml Wasser und 50 µl Aceton wurden hinzugegeben, die gesamte Mischung wurde gemischt und über Nacht stehengelassen.
Nach dem Zentrifugieren der Mischung wurden die Phosholipide mit dem Folch's Partitionsverfahren extrahiert, wobei die niedrigere Phase aus dem Zell-Lysat genommen wurde. Nach der Verdampfung der niedrigeren Phase wurden etwa 10 000 cpm der Phosphatverbindungen auf eine Whatman HP-KF (Whatman, Maidstone, England) Silikagel FLC Platte aufgebracht, die zuvor mit Methanol/Wasser (2:3), das 1 % Kaliumperoxalat Sigma, St. Louis, MO) enthält, imprägniert. Die TLC Platte wurde mit Kontrollphospholipiden für 65 Minuten bei 37ºC in einem Lösungsmittel entwickelt, das Chloroform/Methanol/4M NaOH in einem Verhältnis von 45:35:10 enthält und das 0,1 % CDTA (trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure) enthält. Die Banden wurden durch Anfärben der Kontrollphospholipide mit Primulin und Sichtbarmachen unter ultraviolettem Licht identifiziert. Die Autoradiographie wurde durch eine Einwirkung über Nacht bei 37ºC mit einem Kodak Diagnosefilm GBX-2 (Rochester NY) durchgeführt.
TMS unterdrückt die durch fMLP-induzierte Phosphorylierung von Phosphotidylinositol.

Beispiel 9

Die phagokinetische Aktivität wurde durch das Verfolgen der Spuren der Neutrophilen, die sich auf einem Glassubstrat bewegen, das mit kolbiden Goldpartikeln bedeckt wurde, beobachtet. Diese Technik wurde ursprünglich von Albrecht-Buehler, supra, beschrieben, der 3T3 und andere Zellinien benutzte. 22 x 22 mm große quadratische Deckgläschen (Corning Glass Works, Corning, NY) wurden für eine Minute in 1 %iges BSA getaucht, das in Milli Q Wasser zubereitet wurde. Die BSA Lösung wurde jeden Tag frisch zubereitet und durch einen 3,20 µm Nalgene Filter (Nalgene Labware Division, Rochester, NY) gefiltert.
Anschließend wurde das Deckgläschen durch das Berühren mit einem Kim-wipe Papierhandtuch an seiner Ecke abgesaugt, in 100%iges Ethanol getaucht und schnell und vollständig in einem 85ºC heißen Luftstrom getrocknet. Das Deckgläschen wurde in eine 3,5 m Falcon Plastikschüssel gelegt. Anschließend wurden 5,4 ml AuCl&sub4;H und 18 ml 36,5 mM Na&sub2;CO&sub3; zu 33 ml destilliertem Wasser hinzugegeben und erhitzt. Unmittelbar nach Erreichen des Siedepunktes wurden 5,4 ml von 0,1 % igem Formaldehyd in Wasser schnell hinzugegeben und gemischt. Die Suspension der Goldpartikel, die eine bräunliche Farbe zeigen, wurde sofort auf der Schüssel verteilt (2 ml jede) und das Deckgläschen wurde für zwei Stunden bei 37ºC inkubiert.
Die teilchenbeschichteten Deckgläschen wurden in PBS gewaschen, zwei weitere Male in RPMI 1640 gewaschen und letztendlich in eine andere 3,5 cm Falcon Plastikschüssel, die 2 ml RPMI 1640 mit Glutamat und Pyruvat enthielt, gelegt. Die Deckgläschen wurden bei 4ºC aufbewahrt und innerhalb von 24 Stunden nach der Herstellung benutzt.
Die frisch gereinigten Neutrophilen (1 x 10&sup4; Zellen/Platte) wurden auf die kolloidbeschichteten Deckgläschen gegeben. TMS und andere Wirkstoffe wurden in das Nährmedium auf der Platte hinzugegeben. Als Kontrolle wurde das Lösungsmittel der Wirkstoffe (50 % Ethanol) in einer gleichen Menge zugegeben. Bei dieser Konzentration (0,1 %) zeigte Ethanol keine signifikante Wirkung auf die Aktivitäten der Neutrophilen. Um die Zellwiederherstellung bezüglich der Einwirkung der Wirkstoffe zu beobachten, wurden die Neutrophilen (2 x 10&sup5; Zellen/ml) bei 37ºC mit 12 µM TMS, SPN und DMS vorinkubiert und dann tröpfchenweise auf die Schüssel verteilt, wobei der Wirkstoff 200fach verdünnt wurde. Die Inkubation wurde für zwei Stunden inter 5 % CO&sub2; bei 37ºC ausgeführt und durch den Zusatz von 200 µl 10%igen Formaldehyds beendet. Die mikroskopische Untersuchung einer jeden Platte wurde mit einem Nikon- Mikroskop durchgeführt, das an eine Polaroidkamera für Aufnahmen angeschlossen war. Die phagokinetische Aktivität wurde durch das Verfolgen der Spur eines Neutrophilen gemessen. Die Spur wurde photografisch aufgenommen und anschließend wurde der Bereich durch Ausschneiden und Wiegen des Erstreckungsbereiches gemessen.
TMS hemmte die Migration der Neutrophilen ohne eine nachteilige Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu haben.

Beispiel 10

HUVEC's und die Kulturmedien wurden von Cell Systems (Kirkland, WA) erstanden. Die Zellen wurden mit einigen Änderungen, so wie es in Luscinskas u. a., supra, beschrieben ist, aufbewahrt und kultiviert. HUVEC's wurde in Kolben mit 10 ml Gewebekultur auf einem Kollagenbett vom Typ 1 aufbewahrt, das aus einem Rattenschwanz (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) mit einem CS-vollständigen Nährmedium, einem CS-Wachstumsfaktor und CS-AF-1 (Cell Systems) erhalten wurde. Die Zellen wurden innerhalb von zwei bis vier ragen konfluent, wenn sie bei 37ºC in 5 % CO&sub2; inkubiert wurden.
Für den Transmigrationsversuch wurden dicke Gele mit Gewebekultur in den Vertiefungen in den Platten mit 24 Vertiefungen gebildet. Die Zubereitung der Gellösungen wurde bei 4ºC lurchgeführt. Acht Teile der Kollagenlösung (Vitrogen 100, aus Rindersehnen, die weniger als 5 ng/ml Endotoxin enthalten; Celtrix Labs, Pab Alto, CA), ein Teil einer 10x RPMI und ein Feil einer Alkalilösung (2,2 g NaHCO&sub3; in 100 ml und 0,05 N NaOH und 200 mM HEPES) wurden sanft gemischt und mit 0,7 ml pro Vertiefung verteilt. Die Lösung wurde für vier Stunden bei 37ºC stehengelassen, um Luftblasen zu entfernen, und anschließend ließ man sie für drei Stunden in einem 37ºC warmen Ofen gelieren. Die Vertiefungen wurden mit 1,0 ml eines CS-vollständigen Nährmediums mit Anlagerungsfaktoren wenigstens viermal und dann alle drei bis sechs Stunden während der weiteren Inkubation bei 37ºC in 5 % CO&sub2; gewaschen.
HUVEC's mit einem Durchlaßniveau von weniger als 3 wurde aus den 10 ml Gewebekulturkolben mit 3 ml Trypsin-EDTA bei 37ºC für 30 bis 60 Sekunden abgelöst. Es wurden unmittelbar 3 ml M199 mit 20 % Hitze-inaktiviertem FCS zugegeben. Die Zellen wurden auf dem Weg des Zentrifugierens gesammelt. Das Pellet wurde in 10 ml eines CS- vollständigen Nährmediums mit Anlagerungsfaktoren wieder suspendiert. Die homogenen Zellsuspensionen wurden mit 0,9 ml in jede Vertiefung eingebracht und die Platten wurden für drei Stunden bei 37ºC inkubiert. Der Überstand, der tote Zellen enthält, wurde vorsichtig abgesaugt und frisches vollständiges Nährmedium mit Anlagerungsfaktoren wurde hinzugefügt. Unter diesen Bedingungen bildete HUVEC's konfluente Monoschichten, wobei die Lntrazellulären Grenzflächen folgerichtig innerhalb von 24 Stunden nach dem Aufbringen Silberfarbung zeigten und die Zellen diese Eigenschaft nach einem Tag in der Kultur beibehielten.
Die HUVEC Monoschicht wurde in den 24-Vertiefungsgewebe-Kulturplatten mit M199 ohne FCS gewaschen, anschließend mit 1 ml pro Vertiefung IL-1β (Boehringer Mannheim Biochemical Products, Indianapolis, IN) inkubiert und in M199 mit 1 % Hitze-inaktiviertem FCS (HIFCS) mit 10 Einheiten pro ml aufgelöst. Die Platten wurden für vier Stunden bei 37ºC und 5 % CO&sub2; inkubiert und anschließende sanft mit 1 ml M199 gewaschen. Die gereinigte Suspension Neutrophiler (1,5 x 10&sup6; Zellen pro ml) in M199, die 1 % HIFCS enthält, wurde mit TMS oder anderen Wirkstoffen für 10 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Nach dem Absaugen der Kulturlösung in den Vertiefungen wurden 0,5 ml der Suspension Neutrophiler auf die HUVEC Monoschicht aufgebracht. Die Gewebekulturplatte wurde für 90 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Das Kulturwachstum wurde durch sanftes Absaugen der Zellsuspension und der Zugabe von 1 ml 10 %igen Formaldehyds in PBS beendet und über Nacht bei 4ºC zur Fixierung aufbewahrt. Die Kante des Kollagenbettes wurde zwei Stunden vor der Entfernung aus der Vertiefung mit einem schmalen Spatel entlang der Wand abgeschnitten. Das Kollagenbett, das HUVEC's auf der Oberfläche und transmigrierte Neutrophile innerhalb des Kollagenbettes aufweist, wurde in Paraffin eingebettet, geteilt und anschließend für die mikroskopische Untersuchung mit Hematoxylin-Eosin angelärbt.
TMS beeinflußte die Migration der Neutrophilen ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen. Alle hier zitierten Verweise wurden als Referenz aufgenommen.
Obwohl die Erfindung im Detail und mit dem Verweis auf bestimmte Ausführungen beschrieben wurde, wird es einem Fachmann klar sein, daß verschiedenartige Änderungen und Modifizierungen gemacht werden können.

Claims

1. N,N,N-Trimethylsphingosin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Arzneimittel, das folgendes aufweist:

(a) eine die Zellproliferation oder Plättchenaggregation hemmende Menge an N,N,N-Trimethylsphingosin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon; und

(b) eine pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanz, Verdünnungsmittel oder Arzneimittelträger.

3. Zusammensetzung, die folgendes aufweist:

(a) eine die Zellproliferation oder Plättchenaggregation hemmende Menge an N,N,N-Trimethylsphingosin; und

(b) eine Trägersubstanz, Verdünnungsmittel oder Puffer.

4. Verfahren zur Hemmung der Zellproliferation, das kein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers durch chirurgische oder therapeutische Behandlung und diagnostische Verfahren ist, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeübt wird und das Kontaktieren von Zellen mit einer das Zellwachstum hemmenden Menge an N,N,N-Trimethylsphingosin aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen Krebszellen sind oder von dem Immunsystem sind.

6. Verfahren zur Herstellung von N,N,N-Trimethylsphingosin, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:

(a) Auflösen von (4E)-N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosin in einem wasserfreien organischen Puffer, wie wasserfreies Chloroform, um eine Lösung herzustellen;

(b) Auflösen von frisch destilliertem Iodmethan in der Lösung von Schritt (a), das vorzugsweise mit einem Überschuß von 25 bis 100% vorhanden ist, um ein Gemisch her-zustellen;

(c) Inkubieren des Gemisches von Schritt (b), um ein N,N,N- Trimethylsphingosin-Produkt herzustellen; und

(d) Abtrennen des N,N,N-Trimethylsphingosin-Produktes, und wobei das Verfahren gegebenenfalls weiter die folgenden Schritte aufweist:

(e) Rühren des Produktes von Schritt (d) mit neutralisiertem Anionen- Austauscherharz, um das Halogenderivat von N,N,N-Trimethylsphingosin herzustellen; und

(f) Abtrennen des daraus hergestellten Halogenderivats von N,N,N- Trimethylsphingosin.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Gemisch von Schritt (c) über Nacht inkubiert wird.

8. Verfahren zur Synthetisierung von N,N,N-Trimethylsphingosin, das die folgenden Schritte aufweist:

(a) Behandeln von N,N-Dimethylsphingosin mit Iodmethan, um einen Niederschlag herzustellen; und

(b) Extrahieren des Niederschlags mit Chloroform.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das N,N-Dimethylsphingosin nach einem Verfahren synthetisiert wird, das die folgenden Schritte aufweist:

(a) Behandeln von Sphingenin mit Formaldehyd;

(b) Aussetzen des behandelten Sphingenin Natriumborhydrid und überschüssigem Methanol, um N,N-Dimethylsphingosin herzustellen; und

(c) Extrahieren des N,N-Dimethylsphingosin mit Chloroform.

10. Verfahren zur Hemmung von Plättchenaggregation, die zum Beispiel durch eine Krebszelle verursacht wird, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch chirurgische oder therapeutische Behandlung oder diagnostische Verfahren ist, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeübt wird und das Aussetzen von Plättchen einer die Aggregation hemmenden Menge N,N,N-Trimethylsphingosin aufweist.

11. Verfahren zum Modulieren des interzellulären Kontaktes, das kein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers durch chirurgische oder therapeutische Behandlung oder diagnostische Verfahren ist, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeübt wird und das Aussetzen von Zellen, wie Immunsystemzellen, Endothelzellen, Tumorzellen oder Plättchen, einer biologisch wirksamen Menge N,N,N-Trimethylsphingosin aufweist, wobei die biologisch wirksame Menge eine Menge ist, die die Ex-pression oder Funktion oder ein Zelladhäsionsmolekül hemmt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Adhäsionsmolekül ein Selektin, wie ELAM oder GMP-140, ist.

13. Verfahren zur Steuerung des Neutrophilmetabolismus, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch chirurgische oder therapeutische Behandlung oder diagnostische Verfahren ist, das am menschlichen oder tierischen Körper ausgeübt wird und das Aussetzen von Neutrophilen einer aktivitätshemmenden Menge N,N,N-Trimethylsphingosin aufweist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Menge die Herstellung neutrophiler Peroxide oder die neutrophile Migration hemmt.

15. Verfahren zur Aufbewahrung biologischer Materialien, wie Blut oder ein Blutprodukt, das das Aussetzen des Materials einer Zellwachstum hemmenden Menge N,N,N-Trimethylsphingosin aufweist.

16. N,N,N-Trimethylsphingosin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Verwendung als einen pharmazeutischen Wirkstoff.

17. Verwendung von N,N,N-Trimethylsphingosin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Zellwachstum oder zur Hemmung von Plättchenaggregation oder zum Modulieren interzellulären Kontakts oder zur Abschwächung von Entzündungsreaktionen.