DE69123871T2 - Anti-Oncostatin-M monoklonale Antikörper - Google Patents
Anti-Oncostatin-M monoklonale AntikörperInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Anti-Oncostatin M-Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, an Oncostatin M zu binden, die oncostatin M-Rezeptorbindung zu inhibieren und/oder die Oncostatin M-Bioaktivität zu inhibieren. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können zur Detektion der Gegenwart von Oncostatin M und/oder zur Modulierung der biologischen Aktivi- täten von Oncostatin M in einem in vivo- oder in einem in vitro-System verwendet werden.
- Es ist bekannt, daß somatische Zellhybride ("Hybride") eine wichtige Quelle für bestimmte Zellprodukte sind, die nicht aus kurzzeitigen primärkulturen erhalten werden können. Das beste Beispiel hierfür ist das von Milstein und anderen entwickelte System zur Herstellung von Hybridmyelomen, die einen monoklonalen Antikörper gegen ein beliebiges Antigen produzieren (Köhler und Milstein, 1985, Nature (London) 256:495; Galfre et al., 1977, Nature (London) 266:550). Solche Hybride liefern einen konstanten Vorrat an monoklonalen Antikörpern gegen spezifische Antigene. Diese Antikörper können als Reagenzien in jedem Verfahren verwendet werden, für das bisher Antikörper verwendet wurden; sie besitzen jedoch zusätzliche Vorteile, wie höhere Unterscheidungsraten, geringeren Hintergrund und eine ständig verfügbare Quelle für Antikörper.
- Die Herstellung monoklonaler Antikörper umfaßt im allgemeinen zunächst die Immunisierung, die Entfernung immunologisch reaktiver Zellen, das Fusionieren dieser Zellen, z. B. in Polyethylenglykol, mit sich ständig teilenden ("immortalen") Tumorzellen, die aufgrund ihrer Unfähigkeit zur Sezernierung eines Immunoglobins gewählt wurden. Die resultierenden Zellen (Hybridome) werden z. B. durch Wachstum in HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Medium differenziert. Jedes Hybridom ist das Fusionsprodukt einer einen einzigen Antikörpertyp-bildenden Zelle und einer Tumorzelle. Das Hybridom besitzt die Fähigkeit der ersteren, eine einzige Spezies eines Antikörpers zu sezernieren, und die Iminortalität der letzteren, die seine kontinuierliche Proliferation ermöglicht, was eine Zeilnachkommenschaft ergibt, die eine unendliche Menge an Antikörpern mit einer einzigen Spezifität produziert.
- In GB 2 185 485 wird der Zellwachstum-regulierende Faktor Oncostatin M beschrieben. In diesem Dokument sind auch gegenüber Oncostatin M spezifische monoklonale Antikörper beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion und Verwendung monoklonaler Antikörper mit Spezifität gegenüber Oncostatin M, einem neuen Cytokin, das auf einer breiten Palette normaler und transformierter Zellen pleiotrope Effekte zeigt.
- Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, dessen Antigenbindungsstelle an Oncostatin M bindet und die immunspezifische Bindung der von den Hybridomzellinien 11R2F8, 12R13D7 und LR10F11 produzierten Antikörper OM2, OM3 oder OM1 an das Target-Antigen kompetitiv inhibiert.
- Alle monoklonalen Antikörper mit den Eigenschaften der hier beschriebenen monoklonalen Antikörper fallen unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise fallen monoklonale oder chimäre Antikörper, welche die immunospezifische Bindung der hier beschriebenen monoklonalen Antikörper an ihre Oncostatin M-Epitope inhibieren und/oder die biologische Aktivität von Oncostatin M modulieren, unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemäßen Antikörper können an das aktive Zentrum von Oncostatin M binden. Insbesondere können diese Antikörper die biologische Aktivität von Oncostatin M inhibieren.
- Die Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, bei denen die Hybridomtechnologie zur Bildung der erfindungsgemäßen Anti-Oncostatin M-Antikörper angewendet wird, wobei der Schutzumf ang der Erfindung jedoch nicht auf die Anwendung solcher Zellhybridisierungstechniken beschränkt sein soll. Die beispielhaften Antikörper sind dahingehend gruppiert, ob sie Immunopräzipitate mit nativem Oncostatin M und/oder denaturiertem Oncostatin M bilden. Jede Gruppe ist zusätzlich durch die Fähigkeit gekennzeichnet, die Oncostatin M-vermittelte Wachstumsinhibierung und/oder die Bindung von Oncostatin M an seine Zelloberflächenrezeptoren zu blockieren. Solche Antikörper werden zur Kartierung von Epitopen und funktionalen Zentren neuer Oncostatin M-Proteine verwendet.
- Die folgenden Begriffe besitzen die angegebenen Bedeutungen:
- DDEIA -- Doppeldeterminanten-Enzymimmunoassay
- GIA -- Wachstumsinhibitionstest
- HRP -- Meerrettich-Peroxidase
- micro-EIA -- Micro-Enzymimmunoassay
- MAB -- monoklonaler Antikörper
- OM -- Oncostatin M
- RRA -- Radiorezeptortest
- OM1 -- monoklonaler Antikörper 1R10F11
- OM2 -- monoklonaler Antikörper 11R2F8
- OM3 -- monoklonaler Antikörper 12R13D7
- OM4 -- monoklonaler Antikörper 4R12C7
- OM5 -- monoklonaler Antikörper 3R9D9
- OM6 -- monoklonaler Antikörper 3R13F4
- OM7 -- monoklonaler Antikörper 12R13B5
- OM8 -- monoklonaler Antikörper 12R19E3
- Figur 1 zeigt die Immunopräzipitation von ³&sup5;S-Methionin- und ³&sup5;S-Cystein-markiertem Oncostatin M aus Überständen der CHO- Zellinie, die stabil mit für Oncostatin M kodierender cDNA transfiziert wurde. Figur 1A zeigt die Reaktivität einer Reihe monoklonaler Anti-Oncostatin M-Antikörper gegenüber "nativem", metabolisch markiertem Oncostatin M (Überstand aus metabolisch markierten CHO-Transfektanten isoliert). Figur 1B zeigt die Reaktivität derselben Antikörper gegenüber Überstand, der aus metabolisch markierten CHO-Zellen isoliert und vor der Inkubation mit den monoklonalen Antikörpern durch Behandlung mit SDS, 2-Mercaptoethanol und durch Kochen denaturiert wurde. Bahn 1: negativer Kontroll-Antikörper; Bahn 2: OM1; Bahn 3: OM5; Bahn 4: OM6; Bahn 5: OM4; Bahn 6: OM2; Bahn 7: OM7; Bahn 8: OM3; Bahn 9:OM8.
- Figur 2 gibt Daten der Untersuchung der neutralisierenden Aktivität zweier verschiedener monoklonaler Anti-Oncostatin M- Antikörper durch einen GIA der Melanomzellinie A375 an. Figur 2A zeigt die Aktivität von OM2 bei verschiedenen Konzentrationen und Figur 2B zeigt die Aktivität von OM1 bei verschiedenen Konzentrationen.
- Figur 3 zeigt die Auswirkungen verschiedener monoklonaler Anti-Oncostatin M-Antikörper auf die Bindung von ¹²&sup5;I-Oncostatin M and die Lungenkarzinomzellinie H2981 im Radiorezeptortest.
- Figur 4 zeigt die durch einen EIA detektierte Bindung zweier verschiedener monoklonaler Anti-Oncostatin M-Antikörper an Überstände, die von COS-Zellen sezerniert wurden, welche mit einer Reihe von Aminosäuredeletionen oder -veränderungen aufweisenden mutanten Oncostatin M-Konstrukten transfiziert worden waren. Die Daten sind als Gesamtextinktion bei OD&sub4;&sub6;&sub0; angegeben. Die Hintergrund-Bindung wurde nicht subtrahiert. In dieser Figur steht "del" für die letzte Aminosäure, die vom C-Terminus deletiert wurde, während die alphabetischen Buchstaben die vorgenommene Aminosäureveränderung angeben.
- Figur 5 zeigt einen Vergleich der Fähigkeit unterschiedlicher monoklonaler Anti-Oncostatin M-Antikörper zur Immunopräzipitation von Oncostatin M, das entweder von dem Parentalkonstrukt "SPOM" oder von der Deletionsmutante Δ44-47 sezerniert wurde. Bahn 1: negative Kontroll-Antikörper; Bahn 2: OM1; Bahn 3: OM2; Bahn 4: OM3.
- Figur 6 zeigt die Kartierung von Epitopen, die durch zwei verschiedene monoklonale Anti-Oncostatin M-Antikörper, nämlich OM3 und OM4, detektiert wurden. Die relative Bindung von OM3 und OM4 in Extinktionseinheiten wird mit derjenigen eines negativen Kontroll-Antikörpers auf OM aus serumfreiem, konditioniertem Medium von COS-Zellen verglichen, die mit den Plasmiden Δ188-227, Δ188-227/L 108S und GAG 104 transfiziert worden sind. Die Bindungsraten werden mit derjenigen von aus COS-Zellen sezerniertem OM ("SPOM") verglichen (Linsley, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:1882-1890).
- Figur 7 ist ein schematisches Diagramm von Oncostatin M- Mutationen, welche die Bindung einer Reihe von gegen Oncostatin M gerichteten monoklonalen Antikörpern beeinflussen. Die Leader-Sequenz von OM erstreckt sich über die Reste -25 bis -1. Das nicht-prozessierte, von COS-Zellen sezernierte Molekül ist 227 Aminosäuren lang und wird zu einem reifen Protein mit 196 Aminosäuren gespalten (Linsley, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:1182-1890). Die Deletion C-terminaler Aminosäuren bis ein schließlich 184 (Δ) stört die Bindung von OM1 und OM2. Zusätzlich wird die OM2-Bindung durch Deletion der Reste 22-36 oder 44-47 gestört. Das Epitop des Antikörpers OM3 wurde an einer Stelle kartiert, die den Rest 108 (Pfeil) enthält, da eine Umwandlung von Leucin zu Serin an diesem Rest die Bindung dieses 4C mab stört. Die Insertion des Tripeptids Glycin-Alanin-Glycin am Rest 104 ( ) stört die OM4-Bindung.
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper mit Spezifität gegenüber Oncostatin M, einem neuen Cytokm, das auf einer breiten Palette normaler und transformierter Zellen pleiotrope Effekte zeigt. Es werden monoklonale Antikörper beschrieben, die an Oncostatin M binden, die Oncostatin M- Rezeptorbindung inhibieren und/oder die Oncostatin M-Bioaktivität inhibieren.
- Die beschriebenen monoklonalen Antikörper lassen sich zur Kartierung von Oncostatin M-Epitopen und zur Definierung der Struktur-Funktions-Beziehungen seiner Domänen verwenden. Solche Antikörper lassen sich in diagnostischen Assays, z. B. zur Detektion der Gegenwart von Oncostatin M oder von Oncostatin M- Mutanten, verwenden. Alternativ dazu kann man diese monoklonalen Antikörper zur Modulation der biologischen Aktivitäten von Oncostatin M in einem in vivo- oder in einem in vitro-System einsetzen. Die Erfindung wird in den nachfolgenden Abschnitten im Detail beschrieben.
- Hier werden monoklonale Antikörper beschrieben, die verschiedene Epitope nativer und/oder denaturierter Formen von Oncostatin M definieren. Diese monoklonalen Antikörper werden zusätzlich gemäß ihrer Fähigkeit zur Blockierung der biologischen Aktivität von Oncostatin M und/oder dessen Bindung an Zelloberflächenrezeptoren klassifiziert. Jeder monoklonale Antikörper, einschließlich chimärer Antikörper, der die immunospezifische Bindung der beschriebenen monoklonalen Antikörper an ihre Oncostatin M-Epitope inhibiert, fällt unter den Schutzumfang der Erfindung.
- Oncostatin M, das ursprünglich aufgrund seiner inhibitonschen Effekte gegenüber menschlichen Tumorzellinien identifiziert worden war, wurde zuerst aus Phorbol-12-myristat-13-acetat ("PMA")-induzierten, menschlichen histiocytischen Lymphomzellen (Zarling et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:9739-9743) und aus aktivierten T-Lymphocyten (Brown et al., 1987, J. Immunol. 139:2977-2983) isoliert. Dieses Molekül ist ein hitze- und säurebeständiges Protein, das eine einzige Polypeptidkette mit Mr = 28 000 umfaßt. Wie andere natürlich vorkommende Wachstumsregulatoren, zeigt Oncostatin M verschiedene biologische Aktivitäten. Eine Wachstumsinhibierung ist gegenüber einigen, jedoch nicht gegenüber allen, menschlichen Tumorzellinien zu beobachten. Im Gegensatz dazu wird das Wachstum einiger normaler Fibroblasten, wie z. B. menschlicher Vorhaut- Fibroblasten oder WI-38 Zellen, durch Behandlung mit Oncostatin M stimuliert (Zarlin et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:9739-9743). Das Gen für Oncostatin M ist kloniert und sequenziert worden, und vor kurzem wurde eine aktive Form von rekombinantem Oncostatin M in Säugetierzellen exprimiert (siehe US-Serial No. 144,574 vom 15. Januar 1988, die der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A-0 290 948, veröffentlicht am 17. November 1988, entspricht). Die reife Form, nach Abspaltung des Signalpeptids, ist ein Glycoprotein mit 227 Aminosäuren, von denen fünf Cysteinreste sind. Dieses Protein besitzt eine äußerst hydrophile carboxyterminale Domäne. Obwohl Oncostatin M strukturell nicht mit anderen bekannten Cytokinen verwandt ist, weist seine mRNA an ihrem 3'-untranslatierten Ende eine AU-reiche Region auf. Diese Region in der Oncostatin M-Message ist homolog zu derjenigen vieler Cytokine, Lymphokine und anderer Wachstums-regulierender Moleküle, was auf einen gemeinsamen Modus der Genexpressions-Regulierung hinweist. Auf verschiedenen Säugetierzellen ist ein Zellrezeptor für Oncostatin M gefunden worden. Das wichtigste Oncostatin M-Rezeptormolekül ist ein spezifisches Protein mit Mr = 150 000-160 000 (Linsley et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:4282-4289).
- Oncostatin M ist durch dem Fachmann bekannte Techniken aus einer Reihe von zellulären Quellen zur Synthese von bioaktivem Oncostatin M erhältlich. Dazu zählen beispielsweise Zellen, die Oncostatin M natürlich produzieren und Zellen, die mit rekombinanten DNA-Molekülen transfiziert sind, welche zur Steuerung der Synthese und/oder Sekretion von Oncostatin M befähigt sind. Alternativ dazu läßt sich Oncostatin M durch chemische Syntheseverfahren synthetisieren. Dazu zählt, ohne darauf beschränkt zu sein, beispielsweise die Festphasen-Peptidsynthese. Verfahren zur Herstellung von Oncostatin M sind in der US-Serial No. 144,574 vom 15. Januar 1988 beschrieben, die der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A-0 290 948 (veröffentlicht am 17. November 1988) entspricht.
- Monoklonale Antikörper mit Affinität zu Oncostatin M kann man selektieren, indem man ihre Fähigkeit zur Bindung von Oncostatin M unter Anwendung eines beliebigen immunologischen Assays testet. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, beispielsweise der Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA), die Immunopräzipitation, die Western Blot-Analyse, radioimmunometrische Assays, kompetitive und nicht-kompetitive Immunoassays. Es kann z. B. ohne weiteres der nachfolgend beschriebene Festphasen-Micro-Enzymassay ("MicroEIA") zur Anwendung kommen. Dabei werden im Überstand von Hybriden gefundene Antikörper auf ihre Fähigkeit zur Bindung an Oncostatin M untersucht, das an eine feste Oberfläche von Vertiefungen gebunden ist. Nach Zugabe des Überstandes wird Peroxidase-konjugiertes F(ab')&sub2;- Ziege-Anti-Maus-Ig in die Vertiefung gegeben. Nach dem Auswaschen sämtlicher nichtgebundener Materialien werden die gebundenen Enzyme durch Zugabe eines sich verfärbenden Substrates sichtbar gemacht. Die Verfärbung weist indirekt auf die Bildung eines Antikörper/Oncostatin M-Komplexes in der Vertiefung hin.
- Antikörper, welche die biologische Aktivität von Oncostatin M inhibieren, können insbesondere für therapeutische Anwendungen verwendet werden. Diese Antikörper können unter Anwendung des nachfolgend beschriebenen Wachstumsinhibitions- Assays ("GIA") identifiziert werden. Der GIA bietet ein Testsystem zur Bestimmung der Fähigkeit eines Antikörpers, die inhibitorischen Effekte von Oncostatin M gegenüber Wachstum und Proliferation von Target-Zellen zu neutralisieren.
- Zelloberflächenrezeptoren weisen üblicherweise eine hohe Affinität zu ihrem Liganden auf. Durch die Bindung des Liganden an den spezifischen Zelloberflächenrezeptor wird die Steuerung verschiedener Zellvorgänge initiiert. Die Bindung von Oncostatin M an einen Membranrezeptor ist unter Anwendung des im folgenden und in der bereits erwähnten US-Serial No. 144,574 vom 15. Januar 1988 beschriebenen Radiorezeptortests gezeigt worden. Es wurden u.a. folgende menschliche Tumorzellen getestet: A375 (Melanom), A875 (Melanom), Me1109 (Melanom), T24 (Blasenkarzinom), A549 (Lungenadenokarzinom), H1477 (Melanom), Me180 (Melanom) und MCF (Brust). Die Bindung von ¹²&sup5;I-Oncostatin M war spezifisch und sättigbar und wurde nicht durch andere bekannte Polypeptid-Wachstumsregulatoren inhibiert. Eine Scatchard-Analyse der mit unterschiedlichen Zellinien erhaltenen Bindungsdaten zeigte, daß ¹²&sup5;I-Oncostatin M an 1-2 x 10&sup4; Bindungsorte pro Zelle mit einem Kd-Wert von etwa 10&supmin;&sup9;M gebunden hatte. Die von der Hybridzellinie produzierten monoklonalen Antikörper wurden unter Anwendung des nachfolgend beschriebenen Radiore zeptortests auf ihre Fähigkeit zur Blockierung der Bindung von Oncostatin M an seinen Zelloberflächenrezeptor untersucht.
- Die erfindungsgemäßen Anti-Oncostatin M-Antikörper können unter Anwendung einer Reihe von Techniken hergestellt werden, bei denen Oncostatin M als Immunogen verwendet wird, das dem Wirtssäugetier, z. B. Maus, Kuh, Ziege, Schaf, Kaninchen usw., insbesondere zusammen mit einem Adjuvans, z. B. komplettem Freund'schem Adjuvans, Aluminiumhydroxidgel oder dergleichen, injiziert wird. Den Wirt läßt man dann ausbluten und verwendet das Blut zur Isolierung polyklonaler Antikörper. Alternativ dazu können Peripherblut-Lymphocyten, Milzlymphocyten (B-Zellen) oder Lymphknoten-Lymphocyten zur Fusion mit einer geeigneten Myelomzelle verwendet werden, um die Chromosomen zur monoklonalen Expression von Antikörpern mit Spezifität gegenüber Oncostatin M zu immortalisieren.
- Obwohl die Erfindung anhand von Beispielen unter Verwendung monoklonaler Maus-Antikörper beschrieben wird, ist die Erfindung nicht auf diese beschränkt und umfaßt beispielsweise auch die Verwendung menschlicher Antikörper. Diese Antikörper sind erhältlich unter Verwendung menschlicher Hybridome (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 80:2026-2030) oder durch Umwandlung menschlicher B-Zellen mit EBV (Epstein Barr-Virus) in vitro (Cole et al. 1985, in "Monodonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, S. 77-96). Es können jüngst zur Herstellung "chimärer Antikörper" entwickelte Techniken zur Anwendung kommen (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). Diese Techniken umfassen das Spleißen der Gene eines Maus-Antikörpermoleküls mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen eines menschlichen Antikörpermoleküls mit geeigneter biologischer Aktivität.
- Eine kürzlich beschriebene Technik kann zur Bildung eines Repertoires an monoklonalen Antikörpern, die Oncostatin M definieren, verwendet werden (siehe Sastry, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 86:5728-5732 und Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281). Demgemäß kann eine cDNA-Bank von Fab- Fragmenten aus Milz-DNA von Tieren, die mit Oncostatin M geprimt wurden, in bakteriellen Wirtszellen erzeugt werden.
- Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können durch Behandlung mit geeigneten Proteasen, wie z. B. Pepsin, Papain und dergleichen, modifiziert werden, um Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv- Fragmente zu bilden, die immunospezifisch an Oncostatin M binden.
- Zusätzlich kann das ganze Antikörpermolekül oder das Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment an verschiedene Verbindungen gebunden sein. Dazu zählen beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, signalerzeugende Verbindungen, wie z. B. eine fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Markierung, ein Chromophor, ein Enzym, ein chemolumineszentes oder biolumineszentes Molekül usw.. Alternativ dazu kann der ganze Antikörper oder sein Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment an einen Wachstumsfaktor, der die biologische Aktivität von Oncostatin M verstärken oder inhibieren kann, oder an Toxine gebunden sein, so daß Zellen, die Oncostatin M-Präkursoren auf ihrer Oberfläche exprimieren, selektiv getötet werden. Methoden, die zur Bindung von Markierungen, Proteinen, Toxinen usw. an Antikörper oder Antikörperfragmente angewendet werden können, sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. US-Patente Nr. 4,220,450; 4,235,869; 3,935,074 und 3,996,345).
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon, dessen Antigenbindungsstelle an Oncostatin M bindet, umfassend die
- (a) Kultivierung einer Zellinie, die in der Lage ist einen Anti-Oncostatin M-Antikörper oder ein Fragment davon zu produzieren, und Isolierung des erhaltenen Produktes; oder
- (b) Herstellung eines Anti-Oncostatin M-Antikörperfragmentes aus einem intakten Anti-Oncostatin M-Antikörper; und gegebenenfalls
- (c) Bindung des in (a) oder (b) hergestellten Antikörpers oder Antikörperfragmentes an eine Markierung, einen Wachstumsfaktor oder ein Toxin.
- Die erfindungsgemäßen Antikörper können in vorteilhafter Weise zur Detektion nativer oder denaturierter Formen von natürlichem oder rekombinantem Oncostatin M oder zur Detektion der Gegenwart von Oncostatin M in Serumproben verwendet werden, worin es in freier Form oder zusammen mit seinem Bindungsprotein vorliegen kann. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Antikörper zur Inhibierung der biologischen Effekte von Oncostatin M in vivo verwendet werden. Zur Detektion von Oncostatin M in einer Probe, wie Zellen oder physiologische Flüssigkeit, z. B. Blut, können polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Die Detektion von Oncostatin M in einer Körperflüssigkeit kann auch als Hinweis für die Gegenwart einer Tumorzelle verwendet werden. In dieser Hinsicht sind die Anti-Oncostatin M-Antikörper brauchbar zur Diagnose und/oder Prognose von Krebs und/oder anderen Zellwachstum-bedingten Erkrankungen. Die Antikörper können auch für die Affinitätschromatographie zur Isolierung und Reinigung von Oncostatin M aus natürlichen oder synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper können auch zur Kontrolle der mit Zellen in Kultur oder in vivo assoziierten Menge an Oncostatin M verwendet werden, wobei das Wachstum der Zellen durch Bildung eines spezifischen Antikörper:Oncostatin M-Komplexes modifiziert werden kann, der eine kompetitive Inhibierung der Oncostatin M: Oncostatin M-Rezeptor-Bindung bewirkt. Somit sind die erfindungsgemäßen Antikörper brauchbar als therapeutische Agenzien zur Behandlung von Zellwachstumsstörungen, bei denen die Wachstumsstimulierende Aktivität von Oncostatin M eine Rolle spielt.
- Deshalb wird für diese Zwecke eine pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die als Wirkstoff einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Exzipienten oder Träger dafür, umfaßt.
- Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können auch zur Bildung von Anti-Idiotyp-Antikörpern verwendet werden, welche die biologischen Effekte von Oncostatin M nachahmen. Anti- Idiotyp-Antikörper oder Anti-Idiotypen sind Antikörper, die gegen die Antigenbindungsstelle oder variable Region (den sogenannten Idiotyp) eines anderen Antikörpermoleküls gerichtet sind. Ausgehend von Jernes Netzwerkmodell idiotypischer Beziehungen (Jerne, N.K., 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125:373; Jerne, N.K. et al., 1982, EMBO 234), müßte die Immunisierung mit einem Antikörpermolekül, das ein Paratop (eine Antigenbindungsstelle) für ein bestimmtes Antigen exprimiert, theoretisch eine Gruppe von Anti-Idiotyp-Antikörpern ergeben, die z. T. eine zu dem Paratop komplementäre Struktur mit dem Antigen gemein haben. Die Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern, welche die Bindung von Oncostatin M an seinen Rezeptor inhibieren müßte wiederum Anti-Idiotypen ergeben, die Oncostatin M nachahmen und an den Oncostatin M-Rezeptor binden. Unter den Schutzumfang der Erfindung fällt somit auch, daß diese Anti-Idiotypen von den monoklonalen Antikörpern produziert werden, die gegen Oncostatin M gerichtet sind und die Effekte von Oncostatin M in vivo und in vitro nachahmen. Ebenso soll die Definition monoklonaler Antikörper, die Oncostatin M definieren, hier auch Anti-Idiotyp-Antikörper umfassen, die an Oncostatin M binden.
- Die Strukturanalyse des Wachstumsregulators Oncostatin M ist eine wichtige Vorstufe zur Bestimmung der biologischen Rolle, die dieses neue Cytokin bei der Homeostase oder bei pathologischen Zuständen spielt. In den nachfolgend beschriebenen Beispielen wurden eine Reihe von monoklonalen Antikörpern (OM1 bis OM8), produziert gegen rekombinantes Oncostatin M, analysiert, um ihre strukturellen Bindungsvoraussetzungen und Epitop-Lokalisierung zu bestimmen. Diese Antikörper detektieren lineare (OM3 und OM4) oder gefaltete Epitope (OM1 und OM2). Die von OM3 und OM4 detektierten linearen Epitope liegen dicht beieinander. OM3, dessen Epitop den Rest 108 enthält, reagiert sowohl mit gefaltetem als auch mit denaturiertem Oncostatin M, während Mab OM4, dessen Epitop durch Insertion eines Tripeptids bei Aminosäurerest 104 unterbrochen ist, nur an denaturiertes Oncostatin M bindet.
- Der monoklonale Antikörper OM2 störte die funktionalen Effekte von Oncostatin M in einem Wachstumsinhibitionsassay. Die nachfolgend angegebenen Daten zeigen, daß der Antikörper OM2 die Effekte von OM antagonisiert, indem er die Bindung von OM an seinen Rezeptor verhindert. Durch serologische Analyse wurde festgestellt, daß bestimmte Mutationen durch Aminosäureinsertion, -deletion oder -substitution die Bindung des neutralisierenden Antikörpers beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Versuche stimmen weitgehend mit denjenigen überein, die durch Analyse der GIA- und RRA-Aktivität dieser mutanten Moleküle erhalten wurden, und weisen darauf hin, daß der Bindungsort für den neutralisierenden Antikörper innerhalb der Tertiärstruktur des OM-Moleküls liegt, weshalb die biologische Aktivität eine geeignete Faltung erfordert.
- Die Annahme, daß die funktionell wichtige(n) Region(en) von Oncostatin M in hohem Maße von der richtigen Tertiärstruktur abhängig ist (sind), wird durch die Störung der Rezeptorbindung und der OM2-Bindung in Mutanten, in denen eine Deletion oder Veränderungen nicht benachbarter Aminosäuren (C-terminal, Δ22-36, Δ44-47) vorgenommen wurde, gestützt. Diese Daten weisen zusätzlich darauf hin, daß sowohl Regionen des N-Terminus als auch des C-Terminus des reifen Moleküls direkt, d.h. durch Bildung der Rezeptorbindungsstelle, oder indirekt, d.h. durch Stabilisierung der für die Aktivität erforderlichen Tertiärstruktur, für die funktionale Aktivität von Oncostatin M von Bedeutung sind.
- Ähnliche Beobachtungen wurden bezüglich Interleukin-6 gemacht, das Oncostatin M in einigen funktionalen Eigenschaften, einschließlich Wachstumsinhibition bestimmter Tumorzellinien und Induktion des Plasminogenaktivator-Inhibitors in vitro, gleicht (Brown, et al. 1990, in "Molecular Biology of the Cardiovascular System", Elsevier, Amsterdam, S. 195-206). Die gleichzeitige Deletion der N-terminalen Aminosäuren nach Rest 31 und der ersten fünf carboxyterminalen Aminosäuren von Il-6 bewirkt eine deutliche Verringerung der Aktivität, während die Deletion der sechzehn C-terminalen Reste die funktionale Aktivität vollständig unterdrückt. Eine Reihe neutralisierender Antikörper gegen IL-6 scheint die durch die amino- und carboxyterminalen Aminosäuren gebildeten Epitope zu erkennen, und es ist auch angenommen worden, daß die sieben C-terminalen Aminosäuren von Il-6 eine Alpha-Helixstruktur aufweisen (Brakenhoff, et al., 1990, J. Immunol. 145:561-568). Im Gegensatz zu den für Oncostatin M erhaltenen Ergebnissen, scheinen intramolekulare Disulf idbindungen für die funktionale Aktivität von Il-6 nicht essentiell zu sein (Jambou, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:9462-9430). Es sind neutralisierende Antikörper gegen α-Interferon (Cebrian, et al., 1987, J. Immunol. 138:484-490) und gegen β-Interferon (Redlich & Grossberg, 1989, J. Immunol. 143:1887-1893) produziert worden, bei denen, wie auch bei Oncostatin M, Disulfidbindungen zur Funktionalität erforderlich sind. Zur Epitopkartierung von mutanten Interferonmolekülen gibt es noch keine Veröffentlichungen. Die Zusammenstellung von Struktur-Funktionsanalysen für diese und andere Cytokine soll dabei helfen, festzustellen, wie ähnliche Tertiärstrukturen und funktionale Eigenschaften dieser Moleküle mit sich unterscheidenden Primärstrukturen vereinbar sind. Ein schematisches Modell der bisher mit OM2 und durch Kartierung der OM3- und OM4-Epitope bestimmten, funktional wichtigen Regionen von Oncostatin M ist in Figur 7 dargestellt.
- Die Daten für interne Deletionsmutanten zeigen, daß das durch den nicht-neutralisierenden Antikörper OM1 detektierte Epitop trotz des Verlustes der Bindungsstelle für den neutralisierenden Antikörper intakt bleibt. Ähnliche Ergebnisse erhielt man durch Alanin-Scanning-Mutagenese des menschlichen Wachstumshormons, wobei zahlreiche Mutationen die Rezeptorbindung beeinflussen können, ohne sich auf die Bindung derjenigen monoklonalen Antikörper auszuwirken, die gegen Epitope gerichtet sind, bei denen es sich nicht um die Rezeptorbindungsregion handelt Cunningham & Wells, 1989, Science 244:1081-1085). Diese Daten zeigen, daß lokale Störungen an der Rezeptorbindungsstelle auftreten können, ohne eine massive Störung der Tertiärstruktur von Oncostatin M zu verursachen. Die Kartierung des OM1-Epitops ist unter Verwendung der bisher hergestellten Mutanten nicht möglich. Das OM1-Epitop ist möglicherweise von der Stabilisierung der Tertiärstruktur durch die Faltung des C-Terminus abhängig.
- Es sind hier und an anderen Stellen einige zusätzliche Methoden zur Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehungen von Oncostatin M beschrieben worden. Da der Antikörper OM2 seine neutralisierende Wirkung durch Blockierung der Bindung von Oncostatin M an dessen Rezeptor ausübt, besteht die Möglichkeit zur Erzeugung eines Anti-Idiotyp-Antikörpers, der gegen das Internal Image des neutralisierenden Antikörpers gerichtet ist, der den Oncostatin M-Rezeptor erkennen könnte. Diese Methode ist erfolgreich zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt worden, die gegen eine Reihe unterschiedlicher Rezeptoren, wie z. B. den Insulinrezeptor (Sege & Peterson, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75:2443-2444) und den β-adrenergen Rezeptor (Schreiber, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:7385-7389; Homey, et al., 1982, J. Clin. Invest. 69:1147- 1154), sowie andere Rezeptoren (Gaulton & Green, 1986, Ann. Rev. Immunol. 4:253-280; Vaux et al., 1990, Nature 345:495- 502), gerichtet sind. Die Lokalisierung der Epitope, die von den hier beschriebenen monoklonalen Antikörpern detektiert werden, liefert wichtige Instrumente zur Untersuchung der biologischen Funktion und der Gewebeverteilung von Oncostatin M.
- Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele und Verfahren dienen zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung.
- Die Hybridome wurden durch Immunisierung von 4 Balb/c-Mäusen mit 5 µg bzw. 10 µg rekombinantem Oncostatin M produziert, das von mit dem Plasmid PBOM (Linsley, et al. 1989, J. Biol. Chem. 264:4282-4289) transfizierten CHO-Zellen exprimiert und in bekannter Weise gereinigt wurde (Zarling, et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:9739-9743). Die transfizierten CHO-Zellen sezernieren Oncostatin M als reifes Molekül mit 196 Aminosäuren, das aus einem Präkursor-Molekül mit 227 Resten prozessiert wird (Linsley, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:1882-1890).
- Dieses Oncostatin M wurde in PBS resuspendiert, in einem äquivalenten Volumen von komplettem Freund'schem Adjuvans emulgiert, und es wurden 25 µg der Emulsion intradermal in eine Hinterpfote injiziert. Zwei Wochen später immunisierte man dieselbe Hinterpfote nach der gleichen Prozedur, wobei die Oncostatin M-Konzentrationen mit denjenigen der ersten Immunisierung identisch waren. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung injizierte man den Mäusen in dieselbe Hinterpfote eine dritte Oncostatin M-Präparation, die diesmal in unvollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert war. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde der Kniekehlen-Lymphknoten entnommen, und die Lymphknotenzellen wurden mit Maus-Myelom-Zellen 653/AG8 in einem Verhältnis von Lymphknotenzellen:Myelomzellen von 1:1 fusioniert, wobei 40 %-iges Polyethylenglykol als Fusionierungsmittel verwendet wurde. Die Fusionsprodukte wurden in einer Konzentration von 5 x 10&sup4; zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen, die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin als Selektions-Agens enthielten, in "Iscoves Modification of Dulbecco's Modified Eagle's Medium" ("IDMEM"), ergänzt mit 10 %-igem fötalem Rinderserum, Natriumpyruvat und L-Glutamin, ausplattiert. Nach einer Woche wurde das ursprüngliche Medium durch frisches Medium, das ein Selektionsmittel enthielt, ersetzt. Wenn die Hybride makroskopisch sichtbar waren, wurden sie durch den nachfolgend beschriebenen Festphasen-Micro-Enzymassay ("Micro EIA") gescreent.
- Unter Anwendung des folgenden Micro-EIA wurde die Spezifität der Antikörper gegenüber dem von den Hybridomen produzierten Oncostatin M charakterisiert. Die Aktivität der Hybridom- Überstände wurde unter Anwendung eines Festphasen-EIA untersucht, der zur Durchführung in Microtest-Platten (Robbins Scientific, San Francisco) abgewandelt wurde. Jede Vertiefung wurde mit einer Menge von 5 µl gereinigtem Oncostatin M in Konzentrationen von 2 bis 4 µg/ml ausplattiert und über Nacht luftgetrocknet. Nach einstündiger Blockierung mit 5 % fettfreier Trockenmilch in PBS und 0,1 % Natriumazid wurden die Hybridomüberstände in einer Menge von je 1 µl zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden sechsmal durch Immergieren in PBS gewaschen. Peroxidase-konjugiertes F(ab')&sub2;- Ziege-Anti-Maus-IgG (Pel-Freez, Rogers AK) in PBS+2% BSA in einer Konzentration von 1:1500 wurde in einer Menge von je 5 µl in jede Vertiefung gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wurden die Platten, wie oben beschrieben, sechsmal gewaschen; dann wurden 10 µl Substrat, d.h. 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) ("ABTS", Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), zugegeben und die Platten wurden nach 20 Minuten bei OD = 660 nm gelesen. Positive Vertiefungen wurden aufgrund des Signals über dem Hintergrund, bezogen auf das Signal eines zuvor erzeugten Kaninchen-Antiserums gegen Oncostatin M, bestimmt. Positive Hybride wurden in Weichagar kloniert.
- Unter Anwendung eines Doppeldeterminanten-EIA (DDEIA) bestimmte man die Fähigkeit monoklonaler Antikörper, deren Epitope eine Tertiärstruktur aufweisen, an eine Reihe von mutanten Oncostatin M-Molekülen zu binden. Diese Mutanten enthielten Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten an verschiedenen Stellen des Moleküls Unter Anwendung eines direkten EIA mit mab OM3 bestimmte man vor der DDEIA-Analyse die Konzentrationen mutanter Moleküle in den Überständen. Für den DDEIA wurden 100 µl Protein G (Pharmacia)-Affinitätsgereinigten monoklonalen Antikörper OM3 in einer Konzentration von 10 µg/ml in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, in flachbödige Platten mit 96 Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Antikörper wurden entfernt, und nach einstündiger Blockierung mit PBS, 1% BSA, 0,05 % Tween 20, gab man entweder gereinigtes Oncostatin M in vorgegebenen Konzentrationen oder Überstände aus COS-Zellen, die mit für mutante Formen von OM kodierenden Plasmiden transfiziert waren, in seriellen Verdünnungen zu. Die Platten wurden 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, fünfmal mit PBS gewaschen und erneut 1 Stunde bei 37ºC mit 100 biotinylierten monoklonalen Antikörpern (OM1 oder OM2) in einer Konzentration von 200 ng/ml inkubiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Platten fünfmal gewaschen; dann gab man 100 µl einer im Verhältnis 1:10 000 verdünnten Lösung von HRP-konjugiertem Streptavidin (Vektor) zu und inkubierte die Platten 30 Minuten bei 37ºC. Nach dem Waschen wurde die Reaktion mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin ("TMB") entwickelt und mit 1 N Schwefelsäure abgebrochen und der A&sub4;&sub5;&sub0;-Wert wurde abgelesen.
- Mit der Oncostatin M-kodierenden cDNA transfizierte CHO- Zellen (Linsley, et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:4282-4289) wurden 4-8 Stunden mit je 200 µCi ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein in einem Volumen von 4 ml in einer Petrischale (60 x 15 cm) inkubiert. Die Überstände wurden isoliert und filtriert; 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid ("PMSF") und 100 mM Tosyl-Lysin- Chlormethylketon ("TLCK") wurden zur Inhibierung von Proteasen zugegeben. Für die Immunopräzipitationen wurden 100-200 µl markierter Überstand über Nacht bei 4ºC unter Rotation mit 200 µl verbrauchtem Überstand der die monoklonalen Antikörper sezernierenden Hybride inkubiert. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch Inkubation mit einem monoklonalen Ratte-Anti-Maus-κ- Leichte Kette-Antikörper isoliert, der kovalent an Reactigel- Perlen (Pierce Chemicals) gebunden war. Nach dem Waschen wurden die Antigen-Antikörper-Komplexe durch Kochen in Probenpuffer, der 1% SDS und 5% 2-Mercaptoethanol enthielt, eluiert. Das eluierte Material wurde einer Elektrophorese in 15 % SDS-PAGE unterworfen. Die Gele wurden mit Amplify (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) fluorographiert, getrocknet und mit einem Kodak X-ARS-Röntgenfilm autoradiographiert.
- Die Antikörper wurden getestet, um festzustellen, ob sie die inhibitorischen Effekte von Oncostatin M in einem Wachstumsinhibitionstest ("GIA") neutralisieren konnten. Beim GIA werden A375 Melanomzellen (4 x 10³ Zellen/SO µl) als Indikatorzellen verwendet. Die A375-Zellen werden 4 Stunden aufflachbödigen Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar 3595, Cambridge, MA) in Wachstumsmedium subkultiviert, das Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium ("DMEM"), ergänzt mit 10 % hitz einaktiviertem fötalem Rinderserum, und Penicillin/Streptomycin umfaßt. Oncostatin M wird mit Wachstumsmedium verdünnt und durch Zugabe von 50 µl der verdünnten Probe pro Vertiefung dreifach hinsichtlich der Wachstumsinhibition getestet. Die Zellen werden dann 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Am Ende dieses Inkubationszeitraums wird jede Vertiefung 24 Stunden mit 100 µl Wachstumsmedium, das [¹²&sup5;I]-Iod-2'-deoxyuridin (0,05 µCi/Vertiefung (Amersham Corp., Arlington Heights, IL)) enthält. Die Monolayers werden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ("PBS") gewaschen, in 95 %-igem Methanol fixiert und luftgetrocknet. Das von den Zellen aufgenommene [¹²&sup5;I]-Ioddeoxyuridin wird mit 200 µl 1 N Natriumhydroxid solubilisiert und das Ausmaß des Zellwachstums wird anhand der in die DNA aktiv wachsender Zellen aufgenommenen Menge an [¹²&sup5;I]-Ioddeoxyuridin bestimmt. Eine Aktivitätseinheit ist als die Menge an Oncostatin M definiert, die für eine 50 %-ige Inhibierung des Wachstums von A375-Zellen, bezogen auf unbehandelte Zellen, erforderlich ist.
- Antikörper wurden in einem Radiorezeptortest auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Oncostatin M an Zelloberflächenrezeptoren für Oncostatin M auf der menschlichen Karzinomzellinie H2981 getestet. H2981-Zellen werden in Platten mit 48 Vertiefungen in einer Dichte von 2 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung ausplattiert und 16-24 Stunden bei 37ºC gehalten, bevor der Assay durchgeführt wird. Die Zell-Monolayer werden dann einmal mit Bindungspuffer (Linsley et al. 1986, Biochemistry 25:2978-2986) gewaschen. Zur Bestimmung der gesamten Bindung wurde ¹²&sup5;I-Oncostatin M in Konzentrationen im Bereich von 0,5-100 ng/ml zugegeben. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung wird nicht-markiertes Oncostatin M gleichzeitig mit ¹²&sup5;I-Oncostatin M Replikaplatten in einer 20- bis 100- mal höheren Konzentration als ¹²&sup5;I-Oncostatin M zugegeben. Man läßt die Bindung 2-5 Stunden bei 23ºC fortschreiten und wäscht die Monolayers dann viermal mit Bindungspuffer. Zellgebundenes radioaktives Material wird dann mit 1 N NaOH solubilisiert und in einem Gamma-Zähler ausgezählt. Die spezifische Bindung wird durch Subtraktion der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung berechnet. Die Dissoziationskonstante (Kd) und die Bindungskapazität wurden durch Scatchard-Analyse bestimmt (Scatchard, 1949, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660).
- Monoklonale Anti-Oncostatin M-Antikörper wurden gegenüber einer Reihe von rekombinanten Oncostatin M-Mutanten getestet, die Insertionen, Deletionen oder Substitutionen aufwiesen, welche auf der DNA-Ebene erzeugt worden waren. Die Antikörper wurden in Form von verbrauchten Überständen in einem EIA mit Medien aus COS-Zellen, die vorübergehend mit verschiedenen parentalen und mutanten Konstrukten transfiziert wurden, getestet.
- Die Gegenwart von Oncostatin M in Serum wurde wie folgt detektiert: Menschliche Serumproben wurden zunächst auf eine 5- 300-Größenausschlußsäule gegeben, um die Serumproteine anhand ihres Molekulargewichtes zu trennen. Die aus der S-300-Säule isolierten Fraktionen wurden auf ihre GIA-Aktivität vor und nach Acidifizierung der Serumproben untersucht. Vor der Acidifizierung zeigte der Großteil der Serumproben keine GIA-Aktivität in den Fraktionen des Durchlaufvolumens. Die Serumfraktionen, die acidifiziert und dann erneut neutralisiert wurden, bevor sie zu dem GIA gegeben wurden, zeigten jedoch Aktivität in Fraktionen mit einem Molekulargewicht von mehr als 200 Kilodalton, was darauf hinweist, daß Oncostatin M in Serum im allgemeinen mit einem Bindungsfaktor von mehr als 200 kd assoziert und in diesem Zustand inaktiv ist. Die verschiedenen Serumfraktionen wurden durch Western Blotting untersucht. Die Reaktion der Oncostatin M-spezifischen monoklonalen Antikörper mit Proteinen, die in den Fraktionen mit hohem Molekulargewicht vorgefunden wurden, das dem Molekulargewicht von Oncostatin M entspricht, bestätigten die Anwesenheit von Oncostatin M in diesen Fraktionen. Das im Serum vorgefundene Oncostatin M wurde gereinigt und ist, wie eine Sequenzierung der N-terminalen Aminosäuren zeigte, identisch mit dem zuvor erhaltenen nativen und rekombinanten Oncostatin M.
- Es wurden zwei Fusions-Serien durchgeführt, wobei jede Serie vier Fusionen umfaßte und wobei ein Lymphknoten jeder Maus pro Fusion verwendet wurde.. Vier Hybride der ersten Serie wurden intensiver untersucht. Aus der zweiten, erfolgreicheren Fusionsserie (hinsichtlich der Anzahl positiver Hybride, die durch MicroEIA identifiziert wurden) wurden wenigstens 20 andere monoklonale Anti-Oncostatin M-Antikörper identifiziert. Unter diesen wurden die nachfolgenden Hybride für weitere Studien, ausgehend vom relativen Signal im EIA und von der Fähigkeit zur Immunopräzipitation von nativem oder denaturiertem, metabolisch markiertem Oncostatin M, ausgewählt: OM2, OM7, OM3 und OM8. Ausgehend von den nachfolgend angegebenen Immunoprazipitationsdaten, wurden die Hybride, je nach ihrer Reaktivität mit nativem Oncostatin M und/oder denaturiertem Oncostatin M, einer von drei Kategorien zugeordnet (Tabelle I). Dann wurden fünf dieser monoklonalen Antikörper dahingehend getestet, ob sie die inhibitorischen Effekte von Oncostatin M im Wachstumsinhibitionstest neutralisieren könnten. Diese Ergebnisse sind nachfolgend angegeben. TABELLE I MONOCLONALE ANTI-ONCOSTATIN M-ANTIKÖRPER
- a Durch Immunopräzipitation bestimmt
- b Durch GIA bestimmt
- ND = Nicht bestimmt
- Durch die Ergebnisse der Immunopräzipitationsdaten wurden drei monoklonale Antikörper (OM1, OM2 und OM7) identifiziert, die nur mit ³&sup5;S-Methionin-markiertem Oncostatin M in der Form, in der es von CHO-Transfektanten (Gruppe 1 (Bahnen 2, 6, 7; Figur 1; siehe Tabelle I zur Identifizierung der Antikörper) sezerniert wurde, reagierte. Drei weitere monoklonale Antikörper (OM4, OM5 und OM6) reagierten nur mit ³&sup5;S-Methionin-markiertem Oncostatin M, das durch Behandlung mit SDS und Reduktionsmitteln und anschließendes Kochen bei 100ºC zunächst reduziert und dann denaturiert wurde, jedoch nicht mit nativem Oncostatin M (Gruppe 2, Bahnen 3, 4, 5). Zwei zusätzliche monoklonale Antikörper (OM3 und OM8) reagierten sowohl mit nativem als auch mit denaturiertem (Gruppe 3, Bahnen 8, 9), biosynthetisch markiertem Oncostatin M.
- Gereinigte Antikörper des Hybrids OM2 neutralisierten die Effekte von Oncostatin M in konzentrationsabhängiger Weise (Figur 2A). Der Antikörper OM1, der gegen natives Oncostatin M gerichtet ist, zeigte keine Blockierung der Wachstumsinhibitions-Effekte von Oncostatin M (Figur 2B). Wie durch GIA fest gestellt wurde, war keiner der eine denaturierte Determinante detektierenden Antikörper in der Lage, Oncostatin M zu neutralisieren. Der neutralisierende Antikörper OM2 wurde, wie nachfolgend beschrieben, zusätzlich auf seine Fähigkeit zur Inhibition der Oncostatin M-Rezeptorbindung untersucht.
- Im Gegensatz zu dem gegen ein natives, nicht-neutralisierendes Zentrum gerichteten Antikörper OM1 oder einem dritten, gegen ein Epitop auf denaturiertem Oncostatin M (Figur 3) gerichteten Antikörper, nämlich OM4, war der Antikörper OM2 in der Lage, die Oncostatin M-Rezeptorbindung in konzentrationsabhängiger Weise zu inhibieren.
- In den nachfolgenden Abschnitten ist die Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen rekombinantes OM, das aus Überständen transfizierter CHO-Zellen (Linsley et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:4282-4289) gereinigt wurde, beschrieben. Durch serologische Analyse von Produkten, die aus COS-Zellen sezerniert wurden, welche mit für eine Reihe von OM-Mutanten kodierenden Plasmiden transfiziert worden waren, wurden einige der von den monoklonalen Antikörpern detektierten Epitope kartiert und einige der Tertiärstruktur-Anforderungen für die Antikörperbindung und die funktionale Aktivität des OM-Moleküls bestimmt.
- Von den zwei Antikörpern, die gefaltete Epitope detektieren, wurde OM2, und nicht OM1, aufgrund seiner Fähigkeit zur Beeinträchtigung der OM-Aktivität beim Wachstumsinhibitionstest (GIA) und zur Inhibierung der OM-Bindung beim Radiorezeptortest ("RRA") als neutralisierender Antikörper identifiziert. Eine serologische Analyse der mutanten OM-Moleküle zeigte, daß die Bindungsstelle von OM2 durch nicht-benachbarte Regionen von OM beeinflußt wird und daß die Gegenwart einer der beiden Disulfidbindungen (C&sub4;&sub9;-C&sub1;&sub6;&sub7;) für die Bindung des neutralisierenden Antikörpers wesentlich ist. Zusätzlich stören bestimmte Mutationen die OM2-Bindung, ohne eine globale Fehlfaltung des OM- Moleküls zu bewirken.
- Diese Daten zeigen, daß das durch OM2 definierte Epitop räumliche Verwandtschaft mit der OM-Bindungsstelle aufweist, während sich die von OM1, OM3 und OM4 detektierten Epitope unterscheiden. Die hier beschriebenen Antikörper sind immunologische Sonden zur Detektion von OM in interessierenden Geweben und Flüssigkeiten und sind zur Bestimmung der physiologischen Funktion und Verteilung von OM von Nutzen.
- Der Wachstumsregulator Oncostatin M (OM) ist ein neues Cytokin, das pleiotrope Effekte gegenüber einer breiten Palette normaler und transformierter Zellinien besitzt. Zur Bestimmung einiger physiologischer Funktionen von OM ist eine Reihe von monoklonalen Antikörpern (OM1, OM2, OM3 und OM4) gegen das in den nachfolgenden Abschnitten beschriebene rekombinante Molekül entwickelt und charakterisiert worden.
- Die Antikörper OM1 und OM2 banden an natives, jedoch nicht an denaturiertes OM, was darauf hindeutet, daß sie Epitope mit Tertiärstrukturkonformation erkannten. Ein dritter Antikörper, nämlich OM3, band an natives oder denaturiertes OM und Antikörper OM4 band nur an denaturiertes OM. Epitope für diese monoklonalen Antikörper (mAb) wurden durch Bestimmung der Antikörperbindung an eine Reihe von OM-Mutanten lokalisiert. Die OM3- Bindungsstelle enthält den Rest 108, während die OM4-Bindungsstelle durch eine Aminosäureinsertion in Position 104 unterbrochen ist.
- Zur Kartierung der von diesen Antikörpern detektierten Epitope wurde ihre Bindung an OM in serumfreiem, konditioniertem Medium aus COS-Zellen, die mit einer Reihe von Plasmiden transfiziert wurden, welche für OM-Mutationen an Aminosäureresten an verschiedenen Stellen im Molekül kodieren, getestet. Die Antikörper OM3 und OM4, die lineare Epitope detektieren, wurden in einem Direkt-EIA hinsichtlich der Bindung an eine Reihe von mutanten OM-Proteinen untersucht, deren C-terminale Aminosäuren durch Stop-Codon-Insertionen sequenziell deletiert wurden (Figur 6). Die Mutante Δ188-227 wurde von OM3 gebunden, während Δ188-227/L108S, mit einer zusätzlichen Änderung von Leucin zu Serin am Rest 108, nicht gebunden wurde. Der Antikörper OM4 wurde einer Stelle zugeordnet, die durch Insertion einer Glycin-Alanin-Glycin-Sequenz in Position 104 aufgebrochen wurde (Figur 6). Die Antikörper OM5 und OM6, die auch vorwiegend mit denaturiertem OM reagierten, reagierten nicht mit demselben Epitop wie OM4, da sie mit der GAG104-Mutante reagierten, die nicht von OM4 gebunden wird. Keine der OM-Mutanten aus den bisher erzeugten Reihen lieferte Hinweise zur Epitop-Kartierung dieser Mutanten. Der Antikörper OM7 ist wahrscheinlich identisch mit dem neutralisierenden Antikörper OM2, da er die gleichen Ig-Isotyp- und OM-Mutanten-Bindungsmuster aufweist wie OM2, während die Antikörper OM8 und OM3 wahrscheinlich aus demselben Grund identisch sind.
- Zur Analyse der strukturellen Anforderungen an OM zur Bindung der Antikörper OM1 und OM2, die beide nur mit der gefalteten Form von OM reagierten, wurde ein Doppel-Determinanten-EIA entwickelt. Bei diesem Test wurde der Antikörper OM3, der an natives oder denaturiertes OM band, als Capture-Antikörper für OM aus COS-Transfektantenmutanten-Überständen eingesetzt. Die Konzentrationen an OM (aus den mutanten Molekülen), das an biotinyliertes OM1 oder OM2 gebunden war, wurden mit einer Standardkurve von gereinigtem, nativem OM, das an die entsprechenden Antikörper gebunden war, verglichen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle II als Konzentration der von diesen Antikörpern gebundenen OM-Mutantenmoleküle in ng/ml, verglichen mit der Bindung von gereinigtem OM, angegeben. Da dieser Test bei den in den unverdünnten Überständen der mutanten Transfektanten vorliegenden OM-Konzentrationen gesättigt war, waren serielle Verdünnungen erforderlich, um OM im linearen Bereich des DDEIA zu detektieren. Waren die extrapolierten OM-Detektionswerte größer als 200 ng/ml, wiesen die Extink-2C tionswerte für die Verdünnungsserien der verschiedenen Mutanten auf den Molekülen dieselbe Steigung auf, was darauf hinweist, daß die biotinylierten Antikörper solche mutanten Moleküle mit derselben relativen Affinität banden. TABELLE II RELATIVE BEFÄHIGUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER OM1 UND OM2 ZUR BINDUNG AN VARIANTEN VON ONCOSTATIN M IN EINEM DOPPELDETERMINANTEN-EIA*
- *Es wurde die Reaktivität einer Reihe mutanter OM-Moleküle, die mAB OM3 eingefangen wurden, mit biotinylierten OM1 oder OM2 bestimmt. Getestet wurde serumfreies, konditioniertes Medium aus COS-Zellen, die mit einer Reihe von Plasmiden transfiziert wurden, welche die jeweils aufgelisteten Insertionen, Deletionen oder Substitutionen aufwiesen.
- Eine Strukturanalyse des OM-Moleküls ergab den Hinweise auf das Vorliegen eines stark amphiphatischen/amphiphilen Bereichs in der Nähe des C-Terminus von Aminosäure 168-196. Die Antikörper OM1 und OM2 wurden auf ihre Bindung an eine Reihe von Mutanten untersucht, die sequenzielle C-terminale Deletionen aufwiesen. Sowohl OM1 als auch OM2 waren in der Lage, mit hoher Affinität OM unter Mutanten zu detektieren, die sequenzielle C-terminale Aminosäuredeletionen bis zur Aminosäure 186 aufwiesen (wie aus der hohen Konzentration an gebundenem Protein ersichtlich war). Was die C-terminale Deletionsmutante Δ185-227 betrifft, so banden beide Antikörper mit geringerer Affinität; die Bindungsrate des neutralisierenden Antikörpers OM2 war niedriger als die von OMI. Die Bindungsaktivität beider Antikörper ging bei der C- terminalen Deletionsmutante Δ184-227 völlig verloren. Eine Reihe von Mutanten des amphiphilen Bereichs mit Resteveränderungen von hydrophoben oder hydrophilen zu neutralen Aminosäuren ergaben ein komplexeres Antikörper-Bindungsmuster. Von den drei Umwandlungen von Phenylalanin zu Glycin führte nur diejenige an Position 176 zu einem völligen Bindungsverlust beider Antikör per, während die Veränderung bei 184 die Bindung des neutralisierenden Antikörpers OM2, nicht jedoch die von OM1, verringerte. Die Substitution von Phenylalanin durch Glycin am Rest 169 wirkte sich bei keinem Antikörper auf die Bindung aus. Zwei verschiedene Proteine, nämlich H174G und H178G, bei denen die hydrophilen Histidine an den Positionen 174 bzw. 178 durch Glycm ersetzt wurden, wurden mit hoher Affinität von OM1 und OM2 gebunden.
- Im nativen Oncostatin M-Molekül existieren zwei intramolekulare Disulfidbindungen. Die C&sub6;-C&sub1;&sub6;&sub7;-Disulfidbindung wirkte sich nicht auf die lokale(n) Tertiärstruktur(en) der OM1- und OM2-Epitope aus, da die Antikörperbindung durch die Umwandlung des Cysteins in Position 6 zu Serin nicht verringert wurde. Durch Eliminierung beider Disulfidbindungen (C6S/C167S) wurden die Epitope beider Antikörper zerstört, da dies vermutlich eine globale Fehlfaltung des Moleküls verursachte.
- Zwei mutante OM-Moleküle, nämlich Δ44-47 und Δ22-36, lieferten Hinweise zur Unterscheidung der Bindungsanforderungen der Antikörper OM1 und OM2. Diese Deletionsinutanten wurden von dem nicht-neutralisierenden Antikörper OM1, jedoch nicht von dem neutralisierenden Antikörper OM2, gebunden. Ein schematisches Modell der funktional wichtigen Regionen des Oncostatin M-Moleküls, die mit OM2 und durch Kartierung der OM3- und OM4- Epitope bestimmt wurden, ist in Figur 7 dargestellt.
- Die folgenden für die vorliegende Erfindung repräsentativen Zellinien sind bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt worden und haben die nachfolgend aufgeführten Hinterlegungsnummern erhalten:
- Die hinterlegten Zellinien sind Einzelbeispiele für bestimmte Aspekte der Erfindung und funktional äquivalente Zellinien oder Antikörper jeglicher Art fallen unter den Schutzumfang dieser Erfindung.
Claims (14)
1. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon, dessen
Antigenbindungsstelle an Oncostatin M bindet und die
immunspezifische Bindung der von den Hybridomzellinien
11R2F8 (ATCC HB 10398), 12R13D7 (ATCC HB 10396) bzw.
1R10F11 (ATCC HB 10397) produzierten Antikörper OM2, OM3
oder OM1 an das Target-Antigen kompetitiv inhibiert.
2. Monoklonaler Antikörper OM2, OM3 oder OM1, produziert von
den Hybridomzellinien 11R2F8 (ATCC HB 10398), 12R13D7
(ATCC HB 10396) bzw. 1R10F11 (ATCC HB 10397), oder ein
Fragment davon.
3. Fab-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment eines monoklonalen
Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 und 2.
4. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon nach einem
der Ansprüche 1 bis 3, gebunden an eine Markierung, die in
der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen.
5. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon nach
Anspruch 4, wobei es sich bei der Markierung um eine
fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Markierung, ein
Chromophor oder ein Enzym handelt.
6. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon nach einem
der Ansprüche 1 bis 3, gebunden an einen Wachstumsfaktor
oder ein Toxin.
7. Zellinie, die in der Lage ist, einen monoklonalen
Antikörper oder ein Antikörperfragment davon nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zu produzieren.
8. Hybridomzellinie 11R2F8 (ATCC HB 10398), 12R13D7 (ATCC HB
10396) oder 1R10F11 (ATCC HB 10397).
9. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon nach einem
der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung für die Diagnose oder
Behandlung eines Krankheitszustandes, an dem die
biologische Aktivität von Oncostatin M beteiligt ist.
10. Verfahren zur Detektion von Oncostatin M, wobei man eine
biologische Probe mit einem Antikörper oder einem Fragment
davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kontakt bringt.
11. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Fraginentes
davon, dessen Antigenbindungsstelle an Oncostatin M
bindet, umfassend die
(a) Kultivierung einer Zellinie, die in der Lage ist
einen Anti-Oncostatin M-Antikörper oder ein Fragment
davon zu produzieren, und Isolierung des erhaltenen
Produktes; oder
(b) Herstellung eines Anti-Oncostatin
M-Antikörperfragmentes aus einem intakten Anti-Oncostatin
M-Antikörper; und gegebenenfalls
(c) Bindung des in (a) oder (b) hergestellten Antikörpers
oder Antikörperfragmentes an eine Markierung, einen
Wachstumsfaktor oder ein Toxin.
12. Pharmazeutische Formulierung, umfassend als Wirkstoff
wenigstens einen Antikörper oder ein Fragment davon nach
einem der Ansprüche 1 bis 6, zusammen mit einem
pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder
Exzipienten dafür.
13. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
wobei es sich um einen chimären Antikörper oder ein
Fragment davon handelt.
14. cDNA-Molekül, welches für den chimären Antikörper oder
dessen Fragment gemäß Anspruch 13 kodiert.
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