JPH05244980A

JPH05244980A - 抗オンコスタチンｍモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH05244980A
Application number: JP3166544A
Authority: JP
Inventors: Susan F Radka; エフラドカスーザン; Peter S Linsley; エスリンスレイピーター; Mohammed Shoyab; ショーヤブモハメド
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1991-03-27
Publication date: 1993-09-24
Also published as: DE69123871D1; AU649658B2; PT97179B; NO305867B1; AU7390891A; DE69123871T2; NO974793L; IE911078A1; OA09745A; NZ237533A; HUT62039A; EP0451612A1; EP0451612B1; ATE147106T1; NO303226B1; NO911127L; NO911127D0; HU911006D0; KR910016345A; IL97623A

Abstract

(57)【要約】【目的】生体内又は生体外の系でオンコスタチンＭの
存在の検出及び／又はオンコスタチンＭの生物学的活性
の調節に用いられるモノクローナル抗体を提供する。【構成】その抗原結合部位がオンコスタチンＭに結合
するモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗オンコスタチンＭモノ
クローナル抗体に関する。本発明の抗体は、オンコスタ
チンＭに結合し、オンコスタチンＭ−オンコスタチンＭ
受容体結合の阻害及び／又はオンコスタチンＭの対生物
活性の阻害を行なうことが出来るという特徴を有する。
本発明のモノクローナル抗体は、又オンコスタチンＭの
存在の検出及び／又は生体内又は生体外の系におけるオ
ンコスタチンＭの生物学上の活性の調節に使用すること
が出来る。

【０００２】

【従来の技術】体細胞ハイブリッド（「ハイブリッ
ド」）が、短期の一次培養から得られない特定の細胞性
生成物の重要な源であることは、現在十分に認められて
いる。この最も良い例は、選ばれた抗原に対するモノク
ローナル抗体を生成するためのハイブリッド骨髄腫の生
成に関するＭｉｌｓｔｅｉｎらにより開発された系であ
る（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９８
５、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎ−ｄｏｎ）２５６：４９５；
Ｇａｌｆｒｅら、１９７７、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎ−ｄ
ｏｎ）２６６：５５０）。これらハイブリッドは、特定
の抗原に対してモノクローナル抗体を常に供給する。こ
れらの抗体は、抗体が既に用いられた全ての方法の試薬
として使用できるし、高度の識別、低いバックグラウン
ド及び連続的に利用できる抗体の供給という追加の利点
を有する。

【０００３】モノクローナル抗体の生成は、一般に、免
疫化、免疫応答細胞の取出しそして例えばポリエチレン
グリコール中のこれら細胞と、免疫グロブリンを分泌す
るそれらの無能力のために選ばれた常に分割する（「不
滅の」）腫瘍細胞との融合を含む。得られる細胞（ハイ
ブリドーマ）は、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）培地中の成長により、区別され
る。各ハイブリドーマは、単一抗体形成細胞及び腫瘍細
胞の融合生成物である。ハイブリドーマは、抗体の単一
の種類を分泌させる前者の能力そしてそれをして連続的
に増殖させる後者の不滅性を有し、細胞の後代をもたら
し単一の特異性を有する抗体を終わることなく供給す
る。

【０００４】

【発明の概要】本発明は、オンコスタチンＭに特異的な
モノクローナル抗体の生成及び用途を含む。オンコスタ
チンＭは、広範囲の正常及び形質転換された細胞に多面
性の作用を示す新規なサイトカインである。本明細書に
記載されたモノクローナル抗体の特徴を有する全てのモ
ノクローナル抗体又はそのフラグメントは、本発明の範
囲内に包含される。例えば、それらのオンコスタチンＭ
エピトープに対する本明細書で記載されたモノクローナ
ル抗体の免疫特異性結合を競合的に阻害する及び／又は
オンコスタチンＭの対生物活性を調節するモノクローナ
ル又はキメラ抗体は、本発明の範囲内にある。

【０００５】本発明は、ハイブリドーマ技術が本発明の
抗オンコスタチンＭ抗体を発生させるのに用いる実施例
により記述されるが、本発明の範囲は、この細胞交雑技
術の使用に制限されることを目的としていない。例示の
抗体は、それらが本来のオンコスタチンＭ、変性オンコ
スタチンＭ又はその両者の何れかにより免疫沈降物を形
成するかどうかにより分類される。各グループは、オン
コスタチンＭ成長阻害の対生物活性及び／又はその細胞
表面受容体へのオンコスタチンＭの結合をブロックする
能力によりさらに特徴付けられる。これら抗体は、新規
なオンコスタチンＭ蛋白のエピトープ及び官能性部位を
マップするのに利用される。

【０００６】下記の用語が、用いられるとき、指示した
意味を有する。ＤＤＥＩＡ・・二重決定因子酵素結合免
疫アッセイ、ＧＩＡ・・成長阻害アッセイ、ＨＲＰ・・
西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミクロＥＩＡ・・ミクロ
酵素結合免疫アッセイ、Ｍａｂ・・モノクローナル抗
体、ＯＭ・・オンコスタチンＭ、ＲＲＡ・・放射性受容
体アッセイ、ＯＭ１・・１Ｒ１０Ｆ１１モノクローナル
抗体、ＯＭ２・・１１Ｒ２Ｆ８モノクローナル抗体、Ｏ
Ｍ３・・１２Ｒ１３Ｄ７モノクローナル抗体、ＯＭ４・
・４Ｒ１２Ｃ７モノクローナル抗体、ＯＭ５・・３Ｒ９
Ｄ９モノクローナル抗体、ＯＭ６・・３Ｒ１３Ｆ４モノ
クローナル抗体、ＯＭ７・・１２Ｒ１３Ｂ５モノクロー
ナル抗体、ＯＭ８・・１２Ｒ１９Ｅ３モノクローナル抗
体。

【０００７】図１は、ｃＤＮＡエンコードオンコスタチ
ンＭにより安定にトランスフェクションされたチャイニ
ーズ・ハムスター・オーバリー（「ＣＨＯ」）細胞系の
上澄み液からの^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−システ
インをラベルしたオンコスタチンＭの免疫沈降を示す。
図１のＡは、「本来」の代謝的にラベルされたオンコス
タチンＭ（代謝的にラベルされたＣＨＯトランスフェク
タントから集められた上澄み液）による一連の抗オンコ
スタチンＭモノクローナル抗体の反応性を示す。図１の
Ｂは、モノクローナル抗体とのインキュベーション前に
ＳＤＳ、２−メルカプトエタノール及び煮沸による処理
により変性された、代謝的にラベルされたＣＨＯ細胞か
ら集められた上澄み液によるこれら同じ抗体の反応性を
示す。レーン１：ネガティブ・コントロール抗体；レー
ン２：ＯＭ１；レーン３：ＯＭ５；レーン４：ＯＭ６；
レーン５：ＯＭ４；レーン６：ＯＭ２；レーン７：ＯＭ
７；レーン８：ＯＭ３；レーン９：ＯＭ８。

【０００８】図２は、Ａ３７５黒色腫細胞系に関するＧ
ＩＡの種々の濃度のＯＭ２の中和する活性の検討からの
データを提供する。

【０００９】図３は、Ａ３７５黒色腫細胞系に関するＧ
ＩＡの種々の濃度のＯＭ１の中和する活性の検討からの
データを提供する。

【００１０】図４は、放射受容体アッセイにおけるＨ２
９８１肺癌細胞系への^１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結
合に対する二三の抗オンコスタチンＭモノクローナル抗
体の効果を示す。

【００１１】図５は、アミノ酸の欠失又は変更を含む一
連の突然変異オンコスタチンＭ構造物によってトランス
フェクションされたＣＯＳ細胞により分泌された二つの
異なる抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の結合を
ＥＩＡにより検出して示す。データは、ＯＤ_４６０にお
ける全吸収単位として提供される。バックグラウンド結
合は、引かれなかった。この図において、「ｄｅｌ」
は、Ｃ末端から欠失された最後のアミノ酸を示し、一方
アルファベットの字は、なされたアミノ酸の変更を示
す。

【００１２】より分泌された免疫沈降オンコスタチンＭモノクローナ
ル抗体の能力の比較を示す。レーン１：ネガティブ・コ
ントロール抗体；レーン２：ＯＭ１；レーン３：ＯＭ
２；レーン４：ＯＭ３。

【００１３】図７は、２種の異なる抗オンコスタチンＭ
モノクローナル抗体、ＯＭ３及びＯＭ４により検出され
るエピトープのマッピングを示す。ＯＭ３及びＯＭ４の
吸収１０８Ｓ及びＧＡＧ１０４をトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞の無血清調整培地からのＯＭのネガティブ
・コントロール抗体のそれと比較される。結合レベル
は、ＣＯＳ細胞から分泌されるＯＭ（「ＳＰＯＭ」）の
それと比較される（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９０、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１８８２−１８９
０）。

【００１４】図８は、オンコスタチンＭに対する一連の
モノクローナル抗体の結合に影響するオンコスタチンＭ
の突然変異の概略図である。ＯＭのリーダー配列は、残
基−２５〜−１に位置する。ＣＯＳ細胞から分泌される
未処理分子は、長さ２２７個のアミノ酸であり、開裂し
て成熟した１９６個のアミノ酸蛋白となる。（Ｌｉ−ｎ
ｓｌｅｙら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１０：１８８２−１８、ＯＭ１及びＯＭ２の両者の結合を破壊する。さらに、
ＯＭ２結合は、残基２２−３６又は４４−４７の欠失に
より破棄される。抗体ＯＭ３のエピトープは、残基１０
８を含む部位（矢印）にマップされる。それは、この残
基におけるロイシンからセリンへの変化がこのＭａｂの
結合を破壊するからである。残基１０４結合を廃止する。

【００１５】本発明は、オンコスタチンＭ（広範囲の正
常及び形質転換された細胞に多面性の作用を示す新規な
サイトカイン）に特異的なモノクローナル抗体に関す
る。オンコスタチンＭと結合し、オンコスタチンＭ受容
体結合を阻害する及び／又はオンコスタチンＭの対生物
活性を阻害するモノクローナル抗体が、記述される。

【００１６】記述されるモノクローナル抗体は、オンコ
スタチンＭのエピトープをマップし、そのドメインの構
造・機能の関係を規定するのに用いられる。これら抗体
は、例えばオンコスタチンＭ又はオンコスタチンＭの突
然変異体の存在を検出する診断アッセイに使用できる。
一方、モノクローナル抗体は、生体内又は生体外の系で
オンコスタチンＭの生物学的活性を調節するのに使用で
きる。本発明は、下記のサブセクションに詳しく記述さ
れる。

【００１７】オンコスタチンＭに対するそれらの特異性
により規定されるモノクローナル抗体の特徴

【００１８】オンコスタチンＭの本来及び／又は変性し
た形の種々のエピトープを規定するモノクローナル抗体
を記述する。モノクローナル抗体は、さらにオンコスタ
チンＭの生物学的活性のブロック及び／又は細胞表面受
容体への結合のそれらの能力により分類される。それら
のオンコスタチンＭエピトープに対する記載されたモノ
クローナル抗体の免疫特異性結合を競合的に阻害するキ
メラ抗体を含む全てのモノクローナル抗体は、本発明の
範囲内にある。

【００１９】オンコスタチンＭ抗原の認識

【００２０】ヒト腫瘍細胞系に対するその阻害効果を既
に同定されたオンコスタチンＭは、初めホルボール１２
−ミリステート１３−アセテート（「ＰＭＡ」）誘発ヒ
ト組織球リンパ腫細胞から（Ｚａｒｌｉｎｇら、１９８
６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８３：９７３９−９７４３）そして活性化Ｔリンパ
球から（Ｂｒｏｗｎら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
・１３９：２９７７−２９８３）単離された。分子は、
Ｍｒ＝２８０００の一本鎖ポリペプチドよりなる熱及び
酸に安定な蛋白である。他の天然に生ずる成長調節剤と
同じく、オンコスタチンＭは、種々の生物学上の活性を
示す。成長の阻害は、全てではないが或るヒト腫瘍細胞
系について観察される。対照的に、或る正常の繊維芽細
胞例えばヒト包皮繊維芽細胞又はＷＩ−３８細胞の成長
は、オンコスタチンＭへの暴露により刺激される（Ｚａ
ｒｌｉｎｇら、１９８６、Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃ−
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７４
３）。オンコスタチンＭに対する遺伝子は、クローンさ
れそして配列され、組換えオンコスタチンＭの活性形
は、最近哺乳動物の細胞に発現された（公開されたヨー
ロッパ特許出願ＥＰＡ０２９０９４８号（公開日：１９
８８年１１月１７日）に相当する米国出願第１４４５７
４号参照。その全部をここに参考文献として引用す
る）。シグナルペプチドの開裂後、成熟した形は、２２
７個のアミノ酸を含む糖蛋白であり、その内の５個はシ
ステイン残基である。蛋白は、非常に親水性のカルボキ
シ末端ドメインを有する。オンコスタチンＭは構造的に
他の周知のサイトカインに関連していないが、そのｍＲ
ＮＡは、その３’未翻訳末端でＡＵの多い領域を含む。
オンコスタチンＭのメッセージにおけるこの領域は、多
くのサイトカイン、リンホカイン及び他の成長調節分子
のそれとホモローガスであり、遺伝子の発現を調節する
共通の態様を示唆している。オンコスタチンＭに対する
細胞受容体は、種々の哺乳動物の細胞に見出だされる。
主なオンコスタチンＭ受容体分子は、Ｍｒ＝１５０００
０−１６００００の特異蛋白である（Ｌｉｎｓｌｅｙ
ら、１９８９、Ｊ．Ｂ−ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６
５２８−６５３２）。

【００２１】オンコスタチンＭは、例えばオンコスタチ
ンＭの合成及び／又は分泌を支配できる組換えＤＮＡ分
子によりトランスフエクションされた細胞及びオンコス
タチンＭを天然に生成する細胞を含む生体に作用するオ
ンコスタチンＭを合成する種々の細胞の源から当業者に
周知の技術により得ることができる。一方、オンコスタ
チンＭは、固相ペプチド合成を含むがそれに限定されな
い化学的合成法により合成できる。オンコスタチンＭの
生成法は、公開されたヨーロッパ特許出願ＥＰＡ０２９
０９４８号（公開日：１９８８年１１月１７日）に相当
する米国出願第１４４５７４号に記載されている。その
全部をここに参考文献として引用する。

【００２２】オンコスタチンＭについて親和性を有する
モノクローナル抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウエスタン・ブロット分析、放
射線免疫検定法、競合及び非競合免疫アッセイを含むが
これらに限定されない多数の免疫学的アッセイの任意の
ものを用いてオンコスタチンＭを結合するそれらの能力
をアッセイすることにより選択できる。例えば、下記の
固相ミクロ酵素アッセイ（「ミクロＥＩＡ」）が、容易
に使用できる。簡単には、ハイブリッドの上澄み液に見
出だされる抗体は、穴中の固体表面へコーティングされ
たオンコスタチンＭへ結合するそれらの能力により評価
される。上澄み液の添加後、ペルオキシダーゼ複合Ｆ
（ａｂ’）ヤギ抗マウスＩｇを穴に加える。全ての未結
合物質を洗い流した後、結合した酵素が色の変化をする
基質の添加により明らかになる。色の変化は、穴に形成
されたモノクローナル抗体／オンコスタチンＭ複合体を
間接的に示す。

【００２３】オンコスタチンＭ活性の阻害

【００２４】オンコスタチンＭの生物学上の活性を阻害
する抗体は、治療上の応用に特に用いられる。これら抗
体は、下記の成長阻害アッセイ（「ＧＩＡ」）を用いて
同定できる。簡単には、ＧＩＡは、標的細胞の成長及び
増殖に対するオンコスタチンＭの阻害作用を中和する抗
体の能力を評価するテストシステムを提供する。

【００２５】オンコスタチンＭ受容体への結合の阻害

【００２６】細胞の表面受容体は、それらのリガンドに
高い親和性を一般に有する。特定の細胞表面受容体への
リガンドの結合は、種々の細胞の事象のコントロールを
開始する。膜受容体へのオンコスタチンＭの結合は、下
記の放射線受容体アッセイを用いて立証され、前述の米
国特許出願第１４４５７４号に記載されている。テスト
されたヒト腫瘍細胞は、Ａ３７５（黒色腫）；Ａ８７５
（黒色腫）；Ｍｅ１１０９（黒色腫）；Ｔ２４（勝絖
癌）；Ａ５４９（肺腺癌）；Ｈ１４７７（黒色腫）；Ｍ
ｅ１８０（黒色腫）；及びＭＣＦ（乳癌）を含んだ。
^１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合は、特異的でしかも
飽和可能であり、他の周知のポリペプチド成長調節剤に
より阻害されなかった。異なる細胞系により得られる結
合データのスカッチャヤード分析は、^１２５Ｉ−オンコ
スタチンＭが約１０^−９ＭのＫ_ｄで細胞１個当たり１−
２×１０^４結合部位に結合したことを明らかにした。ハ
イブリッド細胞系により生成されるモノクローナル抗体
は、その細胞表面受容体へのオンコスタチンＭの結合を
ブロックするそれらの能力について、下記の放射線受容
体アッセイを用いてテストされた。

【００２７】オンコスタチンＭに対するモノクローナル
抗体の製法

【００２８】本発明の抗オンコスタチンＭ抗体は、種々
の技術の任意のものを用いて製造でき、その場合オンコ
スタチンＭは、特にアジュバント例えば完全フロインド
アジュバンド、水酸化アルミニウムゲルなどとともに哺
乳動物の宿主例えばマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサ
ギなどに注射される免疫原として用いられる。宿主は、
次に採血され、血液はポリクローナル抗体の単離に用い
られる。一方、末梢血液リンパ球、脾リンパ球（Ｂ−細
胞）又はリンパ節リンパ球が、適切な黒色腫細胞との融
合に用いられて、オンコスタチンＭに特異的な抗体のモ
ノクローナル発現のための染色体を不滅にできる。

【００２９】本発明は、マウスモノクローナル抗体を用
いる実施例により記述されているが、本発明はそれだけ
に限定されず例えばヒト抗体の使用を含む。これら抗体
は、ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８
３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８０：２０２６−２０３０）により、又は生体外の
ＥＢＶ（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒＶｉｒｕｓ）によ
るヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５、「Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣ
ａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ．・Ｌ；ｓ
ｓ、７７−９６ページ）により得ることができる。「キ
メラ抗体」の製造に最近開発された技術も使用できる
（Ｍｃｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃ−ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：６８５１−
６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕ
ｒｅ３１２：６０４−６０８；タケダら、１９８５、Ｎ
ａ−ｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４）。これら後者
の技術は、適切な生物学上の活性のヒト抗体分子からの
遺伝子により適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの
遺伝子を切り継ぎすることを含む。

【００３０】最近記述された技術は、オンコスタチンＭ
を規定するモノクローナル抗体の全能力を発生するのに
用いることができる（Ｓａｓｔｒｙら、１９８９、Ｐｒ
ｏ−ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
６：５７２８−５７３２；及びＨｕｓｅら、１９８９、
Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１参照）。
従って、オンコスタチンＭによりプライムされた動物の
脾ＤＮＡから由来するＦａｂフラグメントのｃＤＮＡラ
イブラリーが、細菌性宿主細胞に発生できる。

【００３１】本発明のモノクローナル抗体は、適切なプ
ロテアーゼ例えばペプシン、パパインなどによる処理に
より修飾されて、オンコスタチンＭに免疫特異的に結合
するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦｖフラグメントを
発生する。

【００３２】さらに、全抗体分子又はそのＦａｂ、Ｆ
（ａｂ’）_２又はＦｖフラグメントは、シグナル発生化
合物例えばフルオロレサー、放射ラベル、発色団、酵
素、化学発光又は生物発光分子などを含むがこれらに限
定されない種々の化合物の任意のものに複合できる。一
方、全抗体又はそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦｖフ
ラグメントは、オンコスタチンＭの生物学上の活性を増
強又は阻害できる成長因子又はトキシンに複合されて、
それらの表面にオンコスタチンＭプレカーサーを発現す
る細胞が選択的に殺される。抗体及び抗体フラグメント
へのラベル、蛋白、トキシンなどの複合に用いられる方
法は、当業者に周知である。例えば米国特許第４２２０
４５０；４２３５８６９；３９３５０７４；及び３９９
６３４５号参照。

【００３３】従って、本発明の追加の態様において、
（ａ）抗オンコスタチンＭ抗体又はそのフラグメントを
生成できる細胞系を培養し、生成する生成物を採取する
か、又は（ｂ）末処理抗オンコスタチンＭ抗体から抗オ
ンコスタチンＭ抗体フラグメントを生成し、さらに所望
ならば（ｃ）ラベル、成長因子又はトキシンに（ａ）又
は（ｂ）で生成する抗体又は抗体フラグメントを複合す
ることよりなるオンコスタチンＭに結合する抗原結合部
位を有するモノクローナル抗体又はそのフラグメントを
製造する方法が提供される。

【００３４】オンコスタチンＭへのモノクローナル抗体
の使用

【００３５】本発明の抗体は、本来又は変性の形の天然
又は組換えオンコスタチンＭを検出したり、又はオンコ
スタチンＭが遊離の形か又はその結合蛋白と結合して生
ずる血清サンプル中のオンコスタチンＭの存在を検出す
るのに有利に使用できる。一方、本発明の抗体は、生体
内で用いられて、オンコスタチンＭの生物学上の作用を
阻害する。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
の何れかが、サンプル例えば細胞又は生理学上の流体例
えば血液中のオンコスタチンＭの検出に使用できる。体
液中のオンコスタチンＭの検出は、又腫瘍細胞の存在の
指標として使用できる。この点に関し、抗オンコスタチ
ンＭ抗体は、癌及び／又は他の細胞成長関連疾患の診断
及び／又は予後に有用である。抗体は、又天然又は合成
の源からオンコスタチンＭを単離し精製するアフイニー
・クロマトグラフィーに使用できる。抗体は、培養物中
又は生体内で細胞と結合したオンコスタチンＭの量をコ
ントロールし、それにより細胞の成長が、オンコスタチ
ンＭ：オンコスタチンＭ受容体結合の競合的阻害をもた
らす特異的抗体：オンコスタチンＭ複合体の形成により
修飾されるのに用いられる。従って、本発明の抗体は、
オンコスタチンＭの成長刺激活性が因子である細胞成長
障害の治療に治療剤として有用である。

【００３６】従って、これらの目的のために、それに対
する製薬上許容できる担体、希釈剤又は助剤と組み合わ
された、活性成分として本発明の抗体又はそのフラグメ
ントを含む製薬組成物が提供される。

【００３７】オンコスタチンＭの作用を真似る抗イディ
オタイプの発生

【００３８】本発明のモノクローナル抗体は、又オンコ
スタチンＭの生物学上の作用を真似る抗イディオタイプ
抗体を発生するのに使用できる。抗イディオタイプ抗体
又は抗イディオタイプは、他の抗体分子の抗原結合領域
又は可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対して向
う抗体である。理論では、イディオタイプ的関係のＪｅ
ｒｎｅのネットワークモデルに基づいて（Ｊｅｒｎｅ、
Ｎ．Ｋ．、１９７４、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａ
ｒｉｓ）１２５：３７３；Ｊｅｒｎｅ、Ｎ．Ｋ．ら、１
９８２、ＥＭＢＯ２３４）、或る抗原についてパラト
ープ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫化
は、一群の抗イディオタイプ抗体を生成し、それらの或
るものは抗原とパラトープに補完的な構造をともにす
る。オンコスタチンＭのその受容体への結合を阻害する
モノクローナル抗体による免疫化は、ついでオンコスタ
チンＭを真似し、オンコスタチンＭ受容体に結合する抗
イディオタイプを生成する。従って、これら抗イディオ
タイプが、生体内及び生体外でオンコスタチンＭの作用
を真似するオンコスタチンＭに向けられるモノクローナ
ル抗体により生成されることは、本発明の範囲内にあ
る。同様に、オンコスタチンＭに結合する抗イディオタ
イプ抗体は、本明細書で用いられるオンコスタチンＭを
規定するモノクローナル抗体の規定に含まれることを目
的としている。

【００３９】オンコスタチンＭエピトープのマッピング

【００４０】成長調節剤オンコスタチンＭの構造上の分
析は、この新規なサイトカインがホメオスタシス又は病
理学的状態に果たす生物学的役割を決めるのに重要なプ
レリュードである。下記の実施例において、組換えオン
コスタチンＭに対して生成される一連のモノクローナル
抗体（ＯＭ１〜ＯＭ８）は、それらの構造上の結合要件
及びエピトープの位置測定を求めるために分析された。
これらの抗体は、線状（ＯＭ３及びＯＭ４）又は折り畳
んだ（ＯＭ１及びＯＭ２）エピトープの何れかを検出す
る。ＯＭ３及びＯＭ４により検出された線状エピトープ
は、互いに密に位置している。そのエピトープが残基１
０８を含むＯＭ３は、折り畳んだオンコスタチンＭ及び
変性オンコスタチンＭの両者と反応し、一方そのエピト
ープがアミノ酸残基１０４におけるトリペプチドの挿入
により分裂したＭａｂＯＭ４は、変性オンコスタチンＭ
のみと結合する。

【００４１】モノクローナル抗体ＯＭ２は、成長阻害ア
ッセイにおいてオンコスタチンＭの機能的作用を破壊す
る。下記のデータは、抗体ＯＭ２が、その受容体への結
合からＯＭを妨げることによりＯＭの作用と拮抗するこ
とを示す。血清学上の分析により、或るアミノ酸の挿
入、欠失又は置換突然変異が、中和する抗体の結合に影
響することが知られている。これらの実験の結果は、こ
れら突然変異分子のＧＩＡ及びＲＲＡ活性の分析により
得られるものと密接に相関し、中和する抗体の結合部位
が、生物学上の活性のための適切な折畳みを要するＯＭ
分子の三次構造内にあることを示唆する。

【００４２】突然変異体の受容体及びＯＭ２結合の両者の分裂は、オ
ンコスタチンＭの機能的に重要な領域が適切な三次構造
に非常に依存するという解釈を強調する。これらのデー
タは、次に成熟分子のＮ末端及びＣ末端の両者の領域
が、受容体結合部位を形成することにより直接か、又は
活性に必要な三次構造を安定化することにより間接にオ
ンコスタチンＭの機能性活性に必須であることを示唆し
ている。

【００４３】同様な観察が、インターロイキン−６につ
いてなされ、それは或る腫瘍細胞系の生体外成長阻害及
びプラスミノーゲン活性体阻害剤の誘発を含むオンコス
タチンＭと或る機能性をともにする（Ｂｒｏｗｎら、１
９９０、「Ｍｏｌｅｃｕ−ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏ
ｆｔｈｅＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＳｙｓｔ
ｅｍ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９
５−２０６ページ）。残基３１を過ぎたＮ末端アミノ酸
及びＩｌ−６の初めの５個のカルボキシ末端アミノ酸の
両者の同時の欠失は、顕著に活性を低下させ、一方１６
番目のＣ末端残基の欠失は完全に機能性活性を破壊す
る。Ｉｌ−６に対する一連の中和する抗体は、アミノ及
びカルボキシ末端アミノ酸により形成されるエピトープ
を認識するように見え、アルファらせん状構造は、同様
にＩｌ−６の７個のＣ末端アミノ酸について提案されて
いる（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９９０、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４５：５６１−５６８）。オンコスタチ
ンＭについて提供されている結果とは対照的に、分子内
ジスルフィド結合は、Ｉｌ−６機能性活性に必須でない
ように見える（ジンボら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：９４６２−９４３０）。
中和するモノクローナル抗体は、α−インターフェロン
（Ｃｅｂｒｉａｎら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３８：４８４−４９０）及びβーインターフェロン
（Ｒｅｄｌｉｃｈ及びＧｒｏ−ｓｓｂｅｒｇ、１９８
９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８８７−１８９
３）へ生成され、オンコスタチンＭと同じように、ジス
ルフイド結合が機能性に要求される。突然変異体インタ
ーフェロン分子に関するエピトープのマッピングは、ま
だ発表されていない。これら及び他のサイトカインに関
する構造・機能の分析の編集は、如何にこれら分子の同
様な三次構造及び機能的特徴が異なる一次構造により適
応できるかを詳しく説明するのに助けとなるだろう。Ｏ
Ｍ２により並びにＯＭ３及びＯＭ４エピトープのマッピ
ングにより今まで決められたオンコスタチンＭ分子の機
能的に重要な領域の概略的なモデルは、図８に示され
る。

【００４４】内部の欠失突然変異体のデータは、中和す
る抗体結合部位が失われても、非中和抗体ＯＭ１により
検出されるエピトープは未処理のままであることを明ら
かにする。同様な結果が、ヒト成長ホルモンのアラニン
走査突然変異誘発によリ得られ、多数の突然変異が受容
体結合領域以外のエピトープに対するこれらモノクロー
ナル抗体の結合に影響することなく、受容体結合に影響
する（Ｃｕｎｎｉ−ｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、１９８
９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５）。
これらのデータは、受容体結合部位の局部的分裂がオン
コスタチンＭの三次構造の大規模な分裂を生ずることな
く生ずることを示す。ＯＭ１エピトープのマッピング
は、今まで生じた突然変異体を用いては不可能であつ
た。ＯＭ１エピトープは、Ｃ末端の折畳みにより安定化
された三次構造に依存する。

【００４５】オンコスタチンＭの構造・機能の関係を調
べる二三の補足的なアプローチが、本明細書及び他の場
所に記載されている。抗体ＯＭ２は、その受容体へのオ
ンコスタチンＭの結合をブロックすることによりその中
和活性を働かせるように思われるので、可能性は、オン
コスタチンＭ受容体を認識できる中和する抗体の内部イ
メージに対する抗イデイオタイプ抗体を生じさせるため
に存在する。このアプローチは、多数の異なる受容体例
えばインスリン受容体（Ｓｅｇｅ及びＰｅ−ｔｅｒｓｏ
ｎ、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）７５：２４４３−２４４４）及びβ−ア
ドレナリン作用受容体（Ｓｃｈｒｅｉ−ｂｅｒら、１９
８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）７７：７３８５−７３８９；Ｈｏｍｅｙら、１９８
２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：１１４７−１
１５４）さらに他のもの（Ｇａｕｌｔｏｎ及びＧｒｅｅ
ｎ、１９８６、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：
２５３−２８０；Ｖａｕｘら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ
３４５：４９５−５０２）に対する抗体の発生にうま
く適用された。本明細書で記述されたモノクローナル抗
体により検出されたエピトープの位置測定は、オンコス
タチンＭの生物学的機能及び組織分布が調べられる重要
な手段を提供する。

【００４６】本発明を制限をすることを目的としない以
下の実施例及びやり方は、本発明をさらに説明するため
に提供される。

【００４７】

【実施例】

【００４８】オンコスタチンＭに対するモノクローナル
抗体の生成

【００４９】材料及び方法

【００５０】Ａ．免疫化及び融合

【００５１】ハイブリドーマは、プラスミドｐＢＯＭに
よりトランスフエクションされたＣＨＯ細胞により発現
され（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６４：４２８２−４２８９）そして前記（Ｚ
ａｒｌｉｎｇら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７４３）
のように精製された組換えオンコスタチンＭの５μｇ又
は１０μｇの何れかによる４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの
免疫化により作成された。トランスフェクションされた
ＣＨＯ細胞は、２２７残基プレカーサー分子から処理さ
れた１９６個のアミノ酸の成熟分子としてオンコスタチ
ンＭを分泌する（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９０、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１８８２−１８９
０）。

【００５２】簡単に云えば、オンコスタチンＭを、ＰＢ
Ｓに再懸濁し、等容量の完全フロインドアジュバント中
で乳化し、そして２５μｇのエマルションを皮内で後足
肉趾に注射した。２週間後、同じ後足肉趾に同じ免疫化
プロトコールを行い、オンコスタチンＭの濃度は初めの
免疫化のそれと同じであった。第二の免疫化２週間後、
マウスに同じ後足肉趾で第三のオンコスタチンＭ製剤を
注射し、このとき製剤は不完全フロインドアジュバント
に乳化した。最後の免疫化後３日目に、膝かリンパ節を
取出し、リンパ節細胞を、融合剤として４０％ポリエチ
レングリコールを用い、１：１のリンパ節細胞対黒色腫
細胞の比でけっ歯類黒色腫６５３／ＡＧ８細胞と融合し
た。融合生成物を、５×１０^４細胞／穴の濃度で、１０
％仔ウシ血清、ピルビン酸ナトリウム及びＬ−グルタミ
ンを補充したダルベッコの変性イーグル培地（ＩＤＭＥ
Ｍ）のイスコブ変性培地で、選択剤としてヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジンを含む９６穴プレート
に入れた。１週間後、初めの培地を選択剤を含む新しい
培地と置換した。ハイブリッドが顕微鏡的に見えるよう
になったとき、ハイブリッドを固相ミクロ酵素結合アッ
セイ（「ＭｉｃｒｏＥＩＡ」）によりスクリーンした。

【００５３】Ｂ．酵素結合免疫アッセイ

【００５４】ハイブリドーマにより生成したオンコスタ
チンＭに対する抗体の特異性を特徴付けるために、下記
のミクロＥＩＡを用いた。ハイブリドーマの上澄み液
を、ミクロテスト・プレート（ＲｏｂｂｉｎｓＳｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）に用い
るように適合された固相ＥＩＡを用いて活性についてス
クリーンした。２−４μｇ／ｍｌに及ぶ濃度の精製した
オンコスタチンＭを各穴に５μｌの容量で入れ、一晩風
乾させた。ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳及び０．１％ナトリ
ウムアジドによる１時間のブロック後、ハイブリッドの
上澄み液を１μｌの容量で加え、１時間室温でインキュ
ベートした。プレートをＰＢＳ中の浸漬により６回洗っ
た。１：１５００の濃度でＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中のペル
オキシターゼ複合Ｆ（ａｈ’）_２ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏ−ｇｅｒｓＡＫ）を各穴
に５μｌの容量で加えた。１時間のインキュベーション
後、プレートを前記のように６回洗い、１０μｌの基
質、２、２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチア
ゾリン−６−スルホン酸）（「ＡＢＴＳ」）（Ｓｉｇｍ
ａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
ｏ）を加え、プレートを２０分後ＯＤ＝６６０ｎｍで読
み取った。ポジティブの穴を、オンコスタチンＭに対す
る既に発生したウサギ抗血清のシグナルに比較してバッ
クグラウンドより上のシグナルに基づいて決めた。ポジ
テイブのハイブリッドをソフトアガーにクローンした。

【００５５】二重決定因子ＥＩＡ（ＤＤＥＩＡ）を用い
て、そのエピトープが一連の突然変異オンコスタチンＭ
分子に結合する三次構造を有するモノクローナル抗体の
能力を評価した。これらの突然変異体は、分子の種々の
部位でアミノ酸残基に挿入、欠失又は置換を含んだ。ｍ
ＡＢＯＭ３を用いる直接ＥＩＡを利用して、ＤＤＥＩ
Ａにおけるそれらの分析前に上澄み液中の突然変異分子
の濃度を評価した。ＤＤＥＩＡでは、０．０５Ｍカーボ
ネート緩衝液（ｐＨ９．６）中で１０μｇ／ｍｌの濃度
のプロティンＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニティ精
製モソクローナル抗体ＯＭ３を１００μｌで９６穴平底
プレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。抗体
を取出し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ツィーン２
０による１時間のブロッキング後、規定した濃度の精製
したオンコスタチンＭ、又はＯＭのプラスミドエンコー
ディング突然変異体の形によりトランスフエクションさ
れたＣＯＳ細胞からの上澄み液の連続希釈の何れかを加
えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、Ｐ
ＢＳにより５回洗い、１００μｌの２００ｎｇ／ｍｌの
濃度のビオチン化モノクローナル抗体（ＯＭ１又はＯＭ
２）とともに３７℃で１時間再びインキュベートした。
３７℃の１時間のインキュベーション後、プレートを５
回洗い、１００μｌの１：１００００希釈のＨＲＰ複合
ストレプタビジン（Ｖｅｃｔｏｒ）を加え、プレートを
３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、反応物
を３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（「Ｔ
ＭＢ」）により発色させ、１Ｎ硫酸により停止し、Ａ
_４５０を読み取った。Ｃ．免疫沈降

【００５６】オンコスタチンＭエンコードｃＤＮＡによ
りトランスフェクションされたＣＨＯ細胞（Ｌｉｎｓｌ
ｅｙら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：
４２８２−４２８９）を、６０×１５ｃｍペトリ皿で４
ｍｌの容量でそれぞれ^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−
システインの２００μＣｉにより４−８時間インキュベ
ートした。上澄み液を集め、濾過し、１０ｍＭのフェニ
ルメチルスルホニルフルオリド（「ＰＭＳＦ」）及び１
００ｍＭのトシル−リジン−クロロメチルケトン（「Ｔ
ＬＣＫ」）を加えてプロテアーゼを阻害した。免疫沈降
のために、１００−２００μｌのラベルした上澄み液
を、モノクローナル抗体分泌ハイブリッドからの廃上澄
み液２００μｌとともに回転しつつ、４℃で一晩インキ
ュベートした。抗原・抗体複合体を、Ｒｅａｃｔｉｇｅ
ｌビード（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ，ｓ）と共
有結合でカップリングしたモノクローナルラット抗マウ
スκ軽鎖モノクローナル抗体とのインキュベーションに
より単離した。洗浄後、抗体・抗原複合体を１％ＳＤＳ
及び５％２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝
液中の煮沸により溶離した。溶離した物質を、１５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ゲルをＡｍｐｌｉ
ｆｙ（商標）（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．、Ａｒｌ
ｉ−ｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）によリフルオロ
グラフィーし、乾燥し、コダックＸ−ＡＲ５Ｘ線フィ
ルムによりオートラジオグラフィした。

【００５７】Ｄ．成長阻害アッセイ

【００５８】抗体をテストして、全てが成長阻害アッセ
イ（「ＧＩＡ」）でオンコスタチンＭの阻害作用を中和
できるかどうかを決めた。ＧＩＡは、指標細胞としてＡ
３７５黒色腫細胞（４×１０^３細胞／５０μｌ）を用い
る。Ａ３７５細胞を、１０％熱不活性化仔ウシ血清及び
ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ
の変性イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を含む成長培地
で、平底９６穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９
５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で４時間予備培養し
た。オンコスタチンＭを成長培地で希釈し、１穴当たり
５０μｌの希釈したサンプルを加えることにより３検体
で成長の阻害についてアッセイする。細胞を次に３７℃
で７２時間インキュベートする。このインキュベーショ
ン後、各穴を［^１２５Ｉ］ヨードー２’−デオキシウリ
ジン（０．０５μＣｉ／穴）（Ａｍｅ−ｒｓｈａｍＣ
ｏｒＰ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）
を含む成長培地１００μｌにより２４時間処理する。単
層をホスフェート緩衝塩水（「ＰＢＳ」）により洗い、
９５％メタノールで固定し、風乾する。細胞により配合
された［^１２５Ｉ］ヨードデオキシウリジンを２００μ
ｌの１Ｎ水酸化ナトリウムにより可溶化し、細胞成長の
量を、活発に成長している細胞のＤＮＡに配合された［
^１２５Ｉ］ヨードデオキシウリジンの量により測定す
る。活性の１単位は、末処理細胞に比べてＡ３７５細胞
の成長を５０％阻害するのに必要なオンコスタチンＭの
量として規定される。

【００５９】Ｅ．オンコスタチンＭ放射線受容体アッセ
イ

【００６０】抗体を、ヒト癌細胞系Ｈ２９８１のオンコ
スタチンＭのための細胞表面受容体への^１２５Ｉラベル
オンコスタチンＭの結合を阻害する能力に関する放射線
受容体アッセイでテストした。Ｈ２９８１細胞を、２×
１０^５細胞／穴の密度で４８穴プレートに入れ、アッセ
イの開姶前１６−２４時間３７℃に保つ。細胞の単層
を、次に結合緩衝液（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８６、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：２９７８−２９８６）に
より一回洗う。全結合を測定するために、^１２５Ｉ−オ
ンコスタチンＭを０．５−１００ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度
で加える。非特異的結合を測定するために、未ラベルオ
ンコスタチンＭを^１２５Ｉ−オンコスタチンＭと同時に
加えて、^１２５Ｉ−オンコスタチンＭの濃度よりも２０
−１００倍高い濃度でプレートを作成する。結合を２３
℃で２−５時間進めさせ、次に単層を結合緩衝液により
４回洗う。細胞結合放射活性を１ＮＮａＯＨにより可
溶化し、ガンマ・カウンターでカウントする。特異的結
合は、全結合から非特異的結合を差し引くことにより計
算される。解離定数（Ｋｄ）及び結合容量は、スキャチ
ャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０）により求
められた。

【００６１】Ｆ．オンコスタチンＭ突然変異体

【００６２】抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体
を、ＤＮＡレベルで生じた、挿入、欠失又は置換を有す
る一連の組換えオンコスタチンＭ突然変異体に対してテ
ストした。抗体を、種々の親及び突然変異の構造物によ
り一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞から
培地上のＥＩＡ中の廃上澄み液としてテストした。

【００６３】Ｇ．モノクローナル抗体による血清中のオ
ンコスタチンＭの検出

【００６４】血清中のオンコスタチンＭの存在を次のよ
うに検出した。ヒト血清サンプルを先ずＳ−３００サイ
ジング・カラムに加えて分子量により血清蛋白を分離し
た。Ｓ−３００カラムから集めたフラクションを、血清
サンプルの酸性化の前及び後の両方でＧＩＡ活性につい
て調べた。酸性化前、多くの血清サンプルは、オンコス
タチンＭの分子量の範囲でＧＩＡ活性を示さなかった。
しかし、酸性化され次にＧＩＡに加えられる前に再び中
和された血清フラクションは、２００キロダルトンより
高い分子量のフラクションで活性を示し、血清中のオン
コスタチンＭが一般に２００Ｋｄより大きい結合因子と
結合し、この状態で不活性である。種々の血清フラクシ
ョンは、ウエスタン・ブロテイングにより調べられた。
オンコスタチンＭ特異的モノクローナル抗体と、オンコ
スタチンＭの分子量に相当するが高い分子量フラクショ
ンに見出だされる蛋白との反応は、これらのフラクショ
ンにおけるオンコスタチンＭの存在を確証した。血清に
見出だされるオンコスタチンＭは精製され、そしてＮ末
端アミノ酸の配列は、それが既に得られた本来及び組換
えオンコスタチンＭと同じであることを示す。

【００６５】結果

【００６６】Ｈ．オンコスタチンＭに特異性を有するモ
ノクローナル抗体の選択

【００６７】各シリーズで４種の融合よりなる二つのシ
リーズの融合を行い、各融合当たり各マウスからの１個
のリンパ節を用いた。初めのシリーズからは、４種のハ
イブリッドがさらに詳しく調べられた。次のしかもさら
に成功したシリーズの融合（マイクロＥＩＡで同定され
たポジティブ．ハイブリッドの数の条件で）から、少な
くとも２０個の他の抗オンコスタチンＭモノクローナル
抗体が同定された。この数から、下記のハイブリッドが
ＥＩＡにおける相対的シグナル及び免疫沈降への能力に
基づく次の検討に選ばれた。本来の又は変性した代謝的
にラベルしたオンコスタチンＭ：ＯＭ２、ＯＭ７、ＯＭ
３及びＯＭ８。下記の免疫沈降のデータに基づいて、ハ
イブリッドは、本来のオンコスタチンＭ、変性オンコス
タチンＭ又はその両者の何れかとのそれらの反応性に基
づいて三つのカテゴリーの一つに区分けされた（表
Ｉ）。これらのモノクローナル抗体の内の５種は、次に
それらのどれかが成長阻害アッセイにおけるオンコスタ
チンＭの阻害効果を中和できるかどうかを決めるのにテ
ストされた。これらの結果を下記に記述する。

【００６８】

【表１】

【００６９】Ｉ．オンコスタチンＭによるモノクローナ
ル抗体免疫沈降

【００７０】免疫沈降のデータの結果は、それがＣＨＯ
トランフェクタント（グループ１）から分泌された形で
^３５Ｓ−メチオニンをラベルしたオンコスタチンＭとの
み反応する３種のモノクローナル抗体（ＯＭ１、ＯＭ２
及びＯＭ７）を同定した（レーン２、６、７；図１；抗
体の同定のための表Ｉ参照）。３種の他のモノクローナ
ル抗体（ＯＭ４、ＯＭ５及びＯＭ６）は、先ずＳＤＳ及
び還元剤による処理により還元されそして変性され次に
１００℃で煮沸された^３５Ｓ−メチオニンをラベルした
オンコスタチンＭとのみ反応するが、本来のオンコスタ
チンＭとは反応しなかった（グループ２、レーン３、
４、５）。２種の他のモノクローナル抗体（ＯＭ３及び
ＯＭ８）は、それが本来のものであつても又は変性した
ものであっても、生合成的にラベルしたオンコスタチン
Ｍと反応した（グループ３、レーン８、９）。

【００７１】Ｊ．成長阻害アッセイにおいてオンコスタ
チンＭを中和するモノクローナル抗体

【００７２】ハイブリッドＯＭ２からの精製した抗体
は、濃度依存の形でオンコスタチンＭの効果を中和した
（図２）。本来のオンコスタチンＭに対する抗体ＯＭ１
は、オンコスタチンＭの成長阻害効果のブロッキングを
示さなかった（図３）。変性した決定因子を検出する抗
体は、ＧＩＡにより測定してオンコスタチンＭを中和で
きなかった。中和する抗体ＯＭ２は、下記のようにオン
コスタチンＭ受容体の結合を阻害するその能力について
さらにテストされた。

【００７３】Ｋ．放射線受容体アッセイにおいてオンコ
スタチンＭの結合を阻害するモノクローナル抗体

【００７４】ＯＭ２抗体は、本来のしかし非中和性の部
位と反応性のＯＭ１抗体、又は変性したオンコスタチン
Ｍのエピトープに対する第三の抗体ＯＭ４の何れかとは
対照的に、濃度依存の形でオンコスタチンＭ受容体結合
を阻害できた（図４）。

【００７５】Ｌ．オンコスタチンＭの機能部位及びエピ
トープマッピングの分析

【００７６】以下のサブセクションは、トランスフェク
ションされたＣＨＯ細胞の上澄み液から精製した組換え
ＯＭに対して生ずるモノクローナル抗体の特徴を記述す
る（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ・Ｃｈ
ｅｍ・２６４：４２８２−４２８９）。ＯＭの一連の突
然変異の形をエンコードするプラスミドによりトランス
フェクションされたＣＯＳ細胞により分泌する生成物の
血清学上の分析を通して、本発明者らは、モノクローナ
ル抗体により検出されるエピトープのあるものをマッピ
ングし、そしてＯＭ分子の抗体結合及び機能活性の両者
の三次構造の要件の或るものを決めた。

【００７７】折り重なったエピトープを検出する２種の
抗体の内、ＯＭ１ではないＯＭ２を、成長阻害アッセイ
（ＧＩＡ）におけるＯＭ活性の破壊及び放射性受容体ア
ッセイ（「ＲＲＡ」）におけるＯＭ結合の阻害のその能
力に基づいて中和する抗体として同定した。突然変異Ｏ
Ｍ分子の血清学的分析は、ＯＭ２の結合部位がＯＭの非
隣接領域により影響され、さらに２個のジスルフィド結
合（Ｃ_４９−Ｃ_１６７）の１個の存在が中和する抗体の
結合にとり必須であることを立証した。さらに、或る突
然変異は、ＯＭ分子の全体の誤った折り重ねを生ずるこ
となくＯＭ２結合を破壊する。

【００７８】これらのデータは、ＯＭ２により規定され
たエピトープがＯＭの結合部位に空間的に関連するが、
ＯＭ１、ＯＭ３及びＯＭ４により検出されるものは別個
のものであることを示す。本明細書に記載された抗体
は、関心のある組織及び体液中のＯＭを検出するための
免疫学的プローブをもたらし、ＯＭの生理学上の機能及
び分布を規定するのに有用であろう。

【００７９】Ｍ．オンコスタチンＭ突然変異体上のＥＩ
ＡによるＯＭエピトープのマッピング

【００８０】成長調節剤オンコスタチンＭ（ＯＭ）は、
広範囲の正常のそして形質転換した細胞系に多面発現作
用を示す新規なサイトカインである。ＯＭの生理学上の
機能の或るものを知るために、本発明者は、以下のサブ
セクションに記載されているように組換え分子に対して
一連のモノクローナル抗体（ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及
びＯＭ４）を開発し、特徴付けた。

【００８１】抗体ＯＭ１及びＯＭ２は、本来のものに結
合したが、変性ＯＭではそうでなく、それらが三次構造
的立体配座でエピトープを認識したことを示唆してい
る。第三の抗体ＯＭ３は、本来又は変性ＯＭに結合し、
抗体ＯＭ４は、変性ＯＭのみに結合した。これらモノク
ローナル抗体（ｍＡｂ）のエピトープは、ＯＭの突然変
異の形のパネルへの抗体の結合を測定することにより位
置を測定された。ＯＭ３結合部位は、残基１０８を含
み、ＯＭ４のそれは位置１０４におけるアミノ酸の挿入
により分裂される。

【００８２】これらの抗体により検出されるエピトープ
をマッピングするために、本発明者は、分子の種々の部
位でアミノ酸残基のＯＭ突然変異をエンコードする一連
のプラスミドによりトランスフェクションされたＣＯＳ
細胞から無血清調整培地でＯＭへのそれらの結合をテス
トした。線状エピトープを検出する抗体ＯＭ３及びＯＭ
４は、停止コドン挿入により、連続でＣ末端アミノ酸が
欠失した一連の突然変基１０８におけるロイシンからセリンへの追加の変化と
ともに、結合されなかった。抗体ＯＭ４は、位置１０４
でグリシン・アラニン・グリシン配列の挿入により分裂
した部位にマッピングされた（図７）。抗体ＯＭ５及び
ＯＭ６は、又主として変性ＯＭと反応したが、ＯＭ４と
同じエピトープとは反応しなかった。それは、それら
が、ＯＭ４により結合されないＧＡＧ１０４突然変異体
と反応したからである。このようにして今まで生じた一
連のＯＭ突然変異体のどれも、これら突然変異体のエピ
トープマッピングに情報を与えなかった。抗体ＯＭ７
は、恐らく抗体ＯＭ２即ち中和する抗体と同じである。
それは、それがＯＭ２と同じＩｇアイソタイプ及びＯＭ
突然変異体結合パターンを有し、一方抗体ＯＭ８及びＯ
Ｍ３は、恐らく同じ理由で同じであるからである。

【００８３】Ｎ．ＯＭ１及びＯＭ２のエピトープの血清
学上の分析

【００８４】抗体ＯＭ１及びＯＭ２（その両者はＯＭの
折り重なった形とのみ反応した）の結合に関するＯＭの
構造上の要件を分析するために、本発明者は、二重決定
因子ＥＩＡを開発した。アッセイは、本来又は変性ＯＭ
の何れかと結合した抗体ＯＭ３を用いて、ＣＯＳトラン
スフェクタント突然変異体上澄み液からＯＭを捕捉し
た。ビオチン化ＯＭ１又はＯＭ２の何れかにより結合し
たＯＭ（突然変異体分子から）の濃度を、それぞれの抗
体により結合した精製した本来のＯＭの標準曲線に比較
した。

【００８５】結果は、精製したＯＭのそれらの結合に比
べて、ｎｇ／ｍｌで、これらの抗体により結合したＯＭ
突然変異体分子の濃度として、表ＩＩに提供される。こ
のアッセイが、突然変異トランスフェクタントの未希釈
上澄み液に存在するＯＭの濃度で飽和したので、連続希
釈が、ＤＤＥＩＡの直線部分でＯＭを検出するのに必要
とされた。検出されたＯＭの外挿した値が２００ｎｇ／
ｍｌより大きい全ての場合において、分子上の異なる突
然変異体に関する希釈シリーズの吸収値は、同じスロー
プを有し、ビオチン化抗体が同じ相対的親和性で、これ
ら突然変異体分子と結合したことを示す。

【００８６】

【表２】

【００８７】ＯＭ分子の構造上の分析は、アミノ酸１６
８−１９６からＣ末端に近い強い両親媒性／アンフィフ
ィリック領域の存在を示した。ＯＭ１及びＯＭ２抗体
は、連続するＣ末端欠失を有した一連の突然変異体への
結合についてテストした。ＯＭ１及びＯＭ２の両者は、
アミノ酸１８６までの連続Ｃ末端アミノ酸欠失を有した
突然変異体から高い親和性でＯＭを検出できる（結合し
た蛋白の高濃度により示和性で結合し、中和する抗体であるＯＭ２の結合レベル
は、ＯＭ１のそれより低完全に失われた。中性アミノ酸に対して親水性又は疎水
性の何れかから残基が変化した両親媒性領域の一連の突
然変異体は、抗体結合のさらに複雑なパターンを捉供し
た。３個のフェニルアラニンのグリシンへの変化の内、
位置１７６におけるもののみが、両方の抗体による結合
の完全な損失をもたらしたが、一方１８４における変化
は、中和する抗体ＯＭ１ではなくＯＭ２の結合を減少さ
せた。残基１６９におけるフェニルアラニンからグリシ
ンへの置換は、両方の抗体の結合に影響しなかった。そ
れぞれ位置１７４及び１７８におけるグリシンへの親水
性ヒスチジンの変更を伴う２個の別々の蛋白Ｈ１７４及
びＨ１７８６は、高い親和性でＯＭ１及びＯＭ２の両者
により結合された。

【００８８】２個の分子内ジスルフィド結合は、本来の
オンコスタチンＭ分子に存在する。Ｃ_６−Ｃ_１６７ジス
ルフィド結合は、ＯＭ１及びＯＭ２エピトープの１種以
上の局所的な三次構造に影響しなかった。それは、抗体
の結合が、位置６におけるシステインがセリンに変化し
たとき減少しなかったからである。両方のジスルフイド
結合（Ｃ６Ｓ／Ｃ１６７Ｓ）の除去は、恐らく分子の全
体的な誤った折畳みを起こすことにより、両方の抗体の
エピトープを破壊した。

【００８９】Ｍ２の結合の要件を識別するのに情報を提供した。これ
らの欠失突然変異体は、非中和抗体であるＯＭ１により
結合したが、中和抗体であるＯＭ２ではそうではなかっ
た。ＯＭ２により決定されるオンコスタチンＭ分子の機
能的に重要な領域の概略的なモデル及びＯＭ３及びＯＭ
４エピトープのマッピングは、図８に示される。

【００９０】Ｍ．生物の寄託

【００９１】本発明を代表する下記の細胞系は、ｔｈｅ
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙ１−ａ
ｎｄに寄託され、表示した寄託番号を付された。

【００９２】

【００９３】本発明は、寄託された細胞系により範囲を
制限されない。それは、寄託された態様が本発明の個々
の態様の単一の説明として考えられたものであり、機能
的に等しい全ての細胞系又は抗体は、本発明の範囲内で
あるからである。事実、本発明の種々の変法は、示され
記述されたものに加えて、前記の記述及び図から当業者
にとり明らかであろう。この変法は、請求の範囲の範囲
内に入ることを目的としている。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｃＤＮＡエンコードオンコスタチンＭ
により安定にトランスフェクションされたチヤイニーズ
・ハムスター・オーバリー（「ＣＨＯ」）細胞系の上澄
み液からの^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−システイン
をラベルしたオンコスタチンＭの免疫沈降を示す。図１
のＡは、「本来」の代謝的にラベルされたオンコスタチ
ンＭ（代謝的にラベルされたＣＨＯトランスフエクタン
トから集められた上澄み液）による一連の抗オンコスタ
チンＭモノクローナル抗体の反応性を示す。図１のＢ
は、モソクローナル抗体とのインキュベーション前にＳ
ＤＳ、２−メルカプトエタノール及び煮沸による処理に
より変性された、代謝的にラベルされたＣＨＯ細胞から
集められた上澄み液によるこれら同じ抗体の反応性を示
す。レーン１：ネガティブ・コントロール抗体；レーン
２：ＯＭ１；レーン３：ＯＭ５；レーン４：ＯＭ６；レ
ーン５：ＯＭ４；レーン６：ＯＭ２；レーン７：ＯＭ
７；レーン８：ＯＭ３；レーン９：ＯＭ８。

【図２】図２は、Ａ３７５黒色腫細胞系に関するＧＩＡ
の種々の濃度のＯＭ２の中和する活性の検討からのデー
タを提供する。

【図３】図３は、Ａ３７５黒色腫細胞系に関するＧＩＡ
の種々の濃度のＯＭ１の中和する活性の検討からのデー
タを提供する。

【図４】図４は、放射受容体アッセイにおけるＨ２９８
１肺癌細胞系への^１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合に
対する二三の抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の
効果を示す。

【図５】図５は、アミノ酸の欠失又は変更を含む一連の
突然変異オンコスタチンＭ構造物によってトランスフェ
クションされたＣＯＳ細胞により分泌された二つの異な
る抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の結合をＥＩ
Ａにより検出して示す。データは、ＯＤ_４６０における
全吸収単位として提供される。バックグラウンド結合は
引かれなかった。この図で、「ｄｅｌ」は、Ｃ末端から
欠失された最後のアミノ酸を示し、一方アルファベット
の字は、なされたアミノ酸の変更を示す。

【図６】より分泌された免疫沈降オンコスタチンＭモノクローナ
ル抗体の能力の比較を示す。レーン１：ネガティブ・コ
ントロール抗体；レーン２：ＯＭ１；レーン３：ＯＭ
２；レーン４：ＯＭ３。

【図７】図７は、２種の異なる抗オンコスタチンＭモノ
クローナル抗体、ＯＭ３及びＯＭ４により検出されるエ
ピトープのマッピングを示す。ＯＭ３及びＯＭ４の吸収１０８Ｓ及びＧＡＧ１０４をトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞の無血清調整培地からのＯＭのネガティブ
・コントロール抗体のそれと比較される。結合レベル
は、ＣＯＳ細胞から分泌されるＯＭ（「ＳＰＯＭ」）の
それと比較される（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９０、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１８８２−１８９
０）。

【図８】図８は、オンコスタチンＭに対する一連のモノ
クローナル抗体の結合に影響するオンコスタチンＭの突
然変異の概略図である。ＯＭのリーダー配列は、残基−
２５〜−１に位置する。ＣＯＳ細胞から分泌される未処
理分子は、長さ２２７個のアミノ酸であり、開裂して成
熟した１９６個のアミノ酸蛋白となる（Ｌｉ−ｎｓｌｅ
ｙら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：
１８８２−１８、ＯＭ１及びＯＭ２の両者の結合を破壊する。さらに、
ＯＭ２結合は、残基２２−３６又は４４−４７の欠失に
より破棄される。抗体ＯＭ３のエピトープは、残基１０
８を含む部位（矢印）にマップされる。それは、この残
基におけるロイシンからセリンへの変化がこのＭａｂの
結合を破壊するからである。残基１０４結合を廃止する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｚ 8310−2Ｊ 33/533 8310−2Ｊ 33/534 8310−2Ｊ 33/535 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ピーターエスリンスレイアメリカ合衆国ワシントン州 98119 シアトルナインスアベニューウエスト 2430 (72)発明者モハメドショーヤブアメリカ合衆国ワシントン州 98119 シアトルウエストモントウエー 2405

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オンコスタチンＭと結合する抗原結合部
位を有するモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】オンコスタチンＭと結合ししかもオンコ
スタチンＭの生物学的活性を阻害する抗原結合部位を有
するモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】オンコスタチンＭの活性部位に結合する
抗原結合部位を有するモノクローナル抗体又はそのフラ
グメント。
【請求項４】その標的抗原へのモノクローナル抗体Ｏ
Ｍ２、ＯＭ３又はＯＭ１の免疫特異性結合を競合的に阻
害する抗原結合部位を有するモノクローナル抗体又はそ
のフラグメント。
【請求項５】モノクローナル抗体ＯＭ２、ＯＭ３又は
ＯＭ１又はそのフラグメント。
【請求項６】請求項１−５の何れか一つの項記載のモ
ノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦｖフ
ラグメント。
【請求項７】検出可能なシグナルを生成できるラベル
に複合した請求項１−５の何れか一つの項記載のモノク
ローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】ラベルが、フルオレサー、放射性ラベ
ル、発色団又は酵素よりなる請求項７のモノクローナル
抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】成長因子又はトキシンに複合した請求項
１−６の何れか一つの項記載のモノクローナル抗体又は
そのフラグメント。
【請求項１０】請求項１−６の何れか一つの項記載の
モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを生成可
能な細胞系。
【請求項１１】ハイブリドーマ細胞系１１Ｒ２Ｆ８、
１２Ｒ１３Ｄ７又は１Ｒ１０Ｆ１１。
【請求項１２】請求項１−９の何れか一つの項記載の
モノクローナル抗体又はそのフラグメントを有効成分と
して含むオンコスタチンＭの生物学的活性を含む疾患の
状態の診断又は治療剤。
【請求項１３】生物学的サンプルを請求項１−９の何
れか一つの項記載のモノクローナル抗体又はそのフラグ
メントと接触させることよりなるオンコスタチンＭの検
出方法。
【請求項１４】（ａ）抗オンコスタチンＭ抗体又はそ
のフラグメントを生成できる細胞系を培養し、生成する
生成物を採取するか、又は（ｂ）未処理抗オンコスタチ
ンＭ抗体から抗オンコスタチンＭ抗体フラグメントを生
成し、さらに所望ならば（ｃ）ラベル、成長因子又はト
キシンに（ａ）又は（ｂ）で生成する抗体又は抗体フラ
グメントを複合することよりなるオンコスタチンＭに結
合する抗原結合部位を有するモノクローナル抗体又はそ
のフラグメントを製造する方法。
【請求項１５】請求項１−９の何れか一つの項記載の
抗体又はそのフラグメントを製造するための請求項１４
の方法。
【請求項１６】請求項１４−１５記載の方法により製
造されたモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項１７】それに対する製薬上許容できる担体、
希釈剤又は助剤と組み合わされた、活性成分として請求
項１−９の何れか一つの項記載の抗体を含む製薬組成
物。