DE69103001T2

DE69103001T2 - Dns-sequenz, die für galactoprotein b3 kodiert.

Info

Publication number: DE69103001T2
Application number: DE69103001T
Authority: DE
Inventors: Sen-Itiroh Hakomori; Tsutomu Tsuji; Fumi-Ichiro Yamamoto
Original assignee: Biomembrane Institute
Current assignee: Biomembrane Institute
Priority date: 1990-03-12
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2011-03-09
Also published as: WO1991013983A1; DE69103001D1; EP0522086A1; JPH05506577A; EP0522086B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Glykoprotein Galacto-Protein b3 und seine Verwendungen. Diese Erfindung betrifft genauer gesagt das Galactoprotein-b3-Gen, Sonden zu den DNA- Sequenzen, Verfahren zum Tumornachweis, DNA-Konstrukte, rekombinante Plasmide, rekombinante Verfahren zur Herstellung von Galactoprotein b3, gereinigtes Galactoprotein b3 und daraus hergestellte Antikörper.

Hintergrund der Erfindung

Trotz enormer Einsätze an finanziellen und menschlichen Mitteln bleibt Krebs eine der Haupttodesursachen. Frühe Diagnose ist wesentlich, um Radikalchirurgie oder Verlust von Leben zu verhindern.
Um irgendeine Form von Krebs nachzuweisen oder zu behandeln, ist es notwendig, in der Lage zu sein, die transformierten Zellen von den normalen Zellen zu unterscheiden. Vergleiche von normalen und Krebs Zellen haben sich auf transformations abhängige Veränderungen in den Molekülen konzentriert, die an der Oberfläche von Zellmembranen liegen. Diese Moleküle schließen Glykolipide, Proteine und Clykoproteine ein. Es hat sich herausgestellt, daß bestimmte Moleküle bei onkogenetischer Transformation verschwinden oder Zumindest in großem Umfang abnehmen, während andere Moleküle zunehmen.
Galactoprotein a, später umbenannt als Fibronectin, ist ein Beispiel für ein Haupt-Glykoprotein, das bei onkogenetischer Transformation abnimmt. Fibronectin ist umfassend charakterisiert worden. Umgekehrt hat es, obgleich sich herausstellte, daß die Expression von Galactoprotein b3 ("Gap b3") an der Oberfläche von Polyoma-transformierten NIL-Zellen, verglichen mit Progenitor-NIL-Zellen, erhöht war, sehr wenig Untersuchungen über Gap b3 gegeben.
Folglich besteht wegen des Zuammenhanges zwischen einer erhöhten Expression von Gap b3 und onkogenetischer Transformation ein Bedürfnis in der Technik für die primäre Struktur des Gens, das Gap b3 kodiert. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und stellt außerdem andere verwandte Vorteile bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül bereit, das Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen. In einer Ausführungsform kodiert das DNA-Molekül menschliches Galactoprotein b3, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen. In einer anderen Ausführungsform kodiert das DNA-Molekül Galactoprotein b3, das die Aminosäuresequenz, die in Figur 6 dargestellt ist, von Phenylalanin, Aminosäure 1 bis Tyrosin, Aminosäure 1019, umfaßt. Ebenfalls offenbart ist ein isoliertes DNA-Molekül, das in der Lage ist, spezifisch mit einem DNA-Molekül zu hybridisieren, das Galactoprotein b3 kodiert. Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem ein DNA-Konstrukt, das eine DNA- Sequenz umfaßt, die Galactoprotein b3 kodiert.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Plasmide bereitgestellt, die zur Expression in einer Wirtszelle in der Lage sind, wobei das rekombinante Plasmid außerdem eine DNA-Sequenz umfaßt, die Galactoprotein b3 kodiert. Geeignete Promotoren und/oder Polyadenylierungssignale sind ebenfalls offenbart. Zusätzlich sind auch eukaryontische Zellen, die mit rekombinanten Plasmiden transfiziert sind, die eine DNA-Sequenz umfassen, die Galactoprotein b3 kodiert, und Verfahren zur Herstellung von Galactoprotein b3 unter Verwendung von mit einem geeigneten DNA-Molekül transfizierten oder transformierten Wirtszellen offenbart. Ein Verfahren zur Herstellung von Galactoprotein b3 umfaßt: Einführen einer DNA-Sequenz, die Galactoprotein b3 kodiert, in eine eukaryontische Wirtszelle; Züchten der Wirtszelle in einem geeigneten Medium; und Isolieren des von der DNA-Sequenz kodierten Proteinproduktes, das von der Wirtszelle produziert ist.
In einem verwandten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung Antikörper, die sich spezifisch an Galactoprotein b3 binden. Bevorzugte Antikörper schließen monoklonale Antikörper ein.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verfahren Zum Nachweis eines Tumors bereitgestellt, der zur Expression von Galactoprotein b3 in Gehalten führt, die diejenigen übersteigen, die von nicht-transformierten Zellen exprimiert werden. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Schritte:
(a) Messen des Gehaltes von RNA, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, in aus einem Warmblüter isolierter RNA;
(b) Messen des Gehaltes von RNA, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, in Kontroll-RNA, die aus nicht-transformierten, Galactoprotein b3-exprimierenden Zellen von einem Warmblüter isoliert ist; und
(c) Vergleichen der in den Schritten (a) und (b) gemessenen Gehalte von RNA und dadurch Bestimmen des Vorhandenseins und des Nicht-Vorhandenseins des Tumors.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Schritte:
(a) Inkubieren einer biologischen Probe von einem Warmblüter, wobei bei besagter Probe der Verdacht besteht, daß sie Galactoprotein b3 enthält, mit einem Antikörper, der sich spezifisch an Galactoprotein b3 bindet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um zu ermöglichen, daß sich zwischen diesen Immunkomplexe bilden;
(b) Nachweisen von zwischen besagtem Antikörper und Galactoprotein b3 in besagter biologischer Probe gebildeten Immunkomplexen;
(c) Inkubieren einer biologischen Kontrollprobe, wobei besagte Kontrollprobe von einem Warmblüter stammt, der nicht-transformierte Zellen besitzt die Galactoprotein b3 exprimieren, mit einem Antikörper, der sich spezifisch an Galactoprotein b3 bindet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um zu ermöglichen, daß sich zwischen diesen Immunkomplexe bilden;
(d) Nachweisen von zwischen besagten Antikörper und Galactoprotein b3 in besagter biologischer Kontrollprobe gebildeten Immunkomplexen; und
(e) Vergleichen der Zahl von Immunkomplexen, die in den Schritten (b) und (d) nachgewiesen sind, und dadurch Bestimmen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins des Tumors.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Trennung von Gap b-Proteinen durch SDS-PAGE. Gap b-Fraktion aus ³H-markierten NILpy-Zellen wurde durch (A)1-D- und (B)2-D-SDS-PAGE in der Gegenwart (+) und Abwesenheit (-) von 2-Mercaptoethanol (2-ME) getrennt, Zelloberflächenmarkierung wurde mit der Galactose-Oxidase/ NaB³H&sub4;-Methode durchgeführt. Positionen von Protein-Molekulargewichts-Standards sind angegeben. 8%iges und 12,5%iges Polyacrylamidgel wurde für die erste bzw. zweite Dimension in 2-D-Gelanalyse verwendet. Es stellte sich heraus, daß Gap b3 (b3) in zwei Flecken aufspaltete, wohingegen Gap b2 (b2) als ein einzelner Fleck im 2-D-Gel blieb.
Figur 2 stellt eine partielle Aminosäure(a.a.)-Sequenz eines inneren Peptids und entsprechender degenerierter Oligodesoxynucleotidsequenzen dar, die als Sonden verwendet werden. Die schwere Kette von Gap b3 wurde mit Achromobacter-Protease I verdaut und die resultierenden Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC getrennt. Die Sequenz ist im oberen Feld dargestellt. Die a.a.-Sequenzen der zwei Abschnitte eines Peptids wurden zur Synthese von Oligonucleotidsonden verwendet. Nucleotidsequenzen für Oligos (#1 und #2) sind im unteren Feld dargestellt. Ihre Degeneriertheiten betrugen 256 bzw. 32.
Figur 3 veranschaulicht die Restriktionskarte für drei überlappende Klone, die Hamster-Gap b3 kodieren, und die Sequenzierungsstrategie. Vollständige cDNA wurde in drei überlappenden Klonen (104, 108 und 130) kloniert, um ungefähr 5 kb abzudecken. Proteinkodierungs- und nicht-translierte Regionen sind durch dicke bzw. dünne Linien dargestellt. Die Pfeile zeigen die Richtung und den Umfang der einzelnen Sequenzierungen.
Figur 4 stellt die Nucleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Hamster-Gap b3 dar. Nucleotid- und abgeleitete a.a.-Sequenz der gesamten cDNA von Gap b3 ist dargestellt. Die N-terminale a.a. des gereinigten Gap b3(F) ist mit 1 numeriert. 32 a.a.-Reste gehen diesem N-Terminus voran. Symbole: dünne unterbrochene Unterstreichungen, zusammenpassende Positionen von a.a.-Sequenzen, bestimmt durch Sequenzanalyse; durchgehende Unterstreichung mutmaßliche Transmembran-Domäne; Punkte, potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungs-Stellen (N X S/T); Pfeile, mögliche Spaltungsstellen; dicke unterbrochene Unterstreichung, mutmaßliche Bindungsstellen für zweiwertige Kationen. Polyadenylierungssignale sind an den Nucleotid-Positionen 4979 und 4983 zu finden.
Figur 5 veranschaulicht die Restriktionkarte für drei überlappende Klone, die menschliches Gap b3 kodieren, und die Sequenzierungsstrategie. Die Kodierungsregion ist durch eine dicke Linie dargestellt. Die Pfeile zeigen die Richtung und das Ausmaß der einzelnen Sequenzierungen.
Figur 6 stellt die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz der Kodierungsregion von menschlichem Gap b3 dar. Die N-terminale a.a. des reifen menschlichen Gap b3-Polypeptids(F) ist mit 1 numeriert. Symbole: Unterstreichung, mutmaßliche Transmembran-Domäne; Punkte, potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungsstellen (NXS/T); Pfeil, mögliche Spaltungsstelle; unterbrochene Unterstreichung, mutmaßliche Bindungssequenzen für zweiwertige Kationen. Drei typische Sequenzen (angeordnet auf der C-terminalen Seite) und zwei verwandte Sequenzen (angeordnet auf der N-terminalen Seite) sind dargestellt.
Figur 7 zeigt Northern- und Southern-Hybridisierungsanalyse. In Teil A wurde Poly A&spplus;-RNA (5 ug), isoliert aus NILpy (links) und NIL (rechts), auf einem 1%igen Formaldehyd-Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Positionen von rRNAs (28S, 185) sind angegeben. In Teil B wurden Genom-DNAs (10 ug) von Hamster (Spuren 1-3), Maus (4-6) und Mensch (7-9) mit Eco RI (Spuren 1, 4, 7), Hind III (2, 5, 8) oder BamHI (3, 6, 9) verdaut und auf einem 1%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Sowohl Northern- als auch Southern-Blots wurden mit einem ³²P-markierten 400 bp langen Pst I-Fragment eines Hamster-Gap b3-Klons sondiert. Positionen von Marker (Lambda, verdaut mit Hind III) sind angegeben.
Figur 8 zeigt Northern-Hybridisierungsanalyse Poly A&spplus;-RNA (4 ug), isoliert aus verschiedenen Zellinien, wurde auf einem 1%igen Formaldehyd-Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Die Membranfilter wurden mit einem ³²P-markierten 400 bp langen Pst I-Fragment eines Hamster-Gap b3-Klons sondiert. Spuren 1 und 2, Hamster-FibroblastNIL und sein Polyoma-Virus-Transfor mant NILpy; Spuren 3 und 4, Mäuse-FibroblastBALB/3T3 und sein SV-40-Transformant SV-T2; Spuren 5 und 6, Human-FibroblastWI- 38 und sein SV-40-Transformant WI-38/VA-13; Spuren 7 und 8, menschliche Blasenkarzinom-Zellinien EJ-1 und T24. Positionen von rRNAs (28S, 18S) sind angegeben.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Vor der Darlegung der Erfindung kann es hilfreich für ein Verständnis derselben sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die hierin verwendet werden sollen, anzugeben.
Antikörper - wie hierin verwendet, schließt ein intaktes Molekül, ein Fragment desselben oder ein funktionales Äquivalent desselben ein; und kann gentechnisch hergestellt oder verändert werden. Beispiele für Antikörperfragmente schließen F(ab')&sub2;, Fab', Fab und Fv ein.
Komplementäre DNA oder cDNA - ein DNA-Molekül oder eine Sequenz, das (die) enzymatisch aus den Sequenzen synthetisiert worden ist, die in einer mRNA-Matrize vorhanden sind, oder ein Klon eines solchen Moleküls.
DNA-Konstrukt - ein DNA-Molekül, oder ein Klon eines solchen Moleküls, entweder einzel- oder doppelsträngig, das so modifiziert worden ist, daß es DNA-Segmente enthält, die in einer Weise kombiniert und nebeneinandergestellt sind, die ansonsten in der Natur nicht existieren wurde.
Plasmid oder Vektor - eine DNA-Sequenz, die genetische Information enthält, die für ihre Replikation sorgen kann, wenn sie in eine Wirtszelle inseriert ist. Ein Plasmid enthält im allgemeinen wenigstens eine Gensequenz, die in der Wirtszelle exprimiert werden soll, sowie Sequenzen, die solche Genexpression erleichtern, einschließlich Promotoren und Transkriptionsinitiationsstellen. Es kann ein lineares oder geschlossenes zirkuläres Molekül sein.
Die vorliegende Erfindung stellt das Glykoprotein Galactoprotein b3 zur Verfügung. Dieses Protein (hierin im weiteren als "Gap b3" bezeichnet) ist ein membrangebundenes Protein, dessen Expression bei onkogenetischer Transformation zunimmt.
Gap b3 kann durch eine Kombination von Extraktions- und Chromatographietechniken isoliert werden. Kurz gesagt wird Gap b3 in einer Ausführungsform aus Säugetierzellen durch Homogenisierung und Löslichmachung mit Detergens extrahiert. Der Detergens-Extrakt wird über eine Lectin-Affinitätschromatographiesäule gegeben. Die Fraktion, die Gap b3 enthält, wird unter Verwendung einer Lösung eluiert, die einen spezifischen Zucker, wie etwa Lactose, enthält. Endgültige Reinigung wird unter Verwendung einer präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt.
Eine Vielzahl von Säugetierzellen sind zur Reinigung von Gap b3 geeignet. Eine bevorzugte Quelle für Ausgangsmaterial für solch eine Reinigung sind onkogenetisch transformierte Hamster-Fibroblasten. Ein repräsentatives Isolierungsverfahren ist wie folgt. Homogenisierung von Zellen in einer Pufferlösung, die ein Detergens enthält, wie etwa Empigen BB, liefert eine Lösung mit Galactoproteinen b. Der lösliche Überstand des Extraktes kann auf RCA (Ricinus communis-Lectin), gekoppelt an Sepharose, adsorbiert und mit Lactose eluiert werden. Endgültige Reinigung von Gap b3 bis zur Homogenität wird erreicht durch präparative SDS-PAGE-Chromatographie, z.B. durch Aufbringen eines Lactose-Eluats auf ein SDS-Plattengel.
Ein repräsentatives gereinigtes Gap b3 der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Eigenschaften. Zwei Hauptbanden mit scheinbarem Mr 125.000 und 100.000 wurden im Eluat aus einer RCA-Sepharose-Säule durch 0,3 M lactosehaltigen Puffer beobachtet, wenn analysiert auf SDS-Page in der Gegenwart von 2-Mercaptoethanol (2-ME) (Figur 1A). Diese Banden werden hierin im weiteren als Galactoprotein b2 bzw. b3 (Gap b2 bzw. b3) bezeichnet. In der Abwesenheit von 2-ME wurde ein unterschiedliches Elektrophoreseprofil beobachtet (Figur 1A), in dem die scharfe Bande (Gap b3) leicht zum höheren Mr-Bereich verschoben war, während die Mobilität der breiten Bande (Gap b2) unverändert war. Die scheinbare Mr von Cap b3 unter nicht- reduzierenden Bedingungen wurde auf 140.000 geschätzt. Um die Veränderung in der Mobilität zu bestätigen, wurde 2-D-Gelelektrophorese in der Abwesenheit (erste Dimension) und Gegenwart (zweite Dimension) von 2-ME durchgeführt. Wie in Figur 1B gezeigt, wurde festgestellt, daß Gap b3 sich in zwei Flecken auftrennte (bezeichnet mit Pfeilen als "b3"). Die Mobilität dieser Flecken in der ersten Dimension war geringfügig niedriger als diejenige von Gap b2 und wurde zwischen den Gap b1- und -b2-Flecken lokalisiert.
Gap b3 scheint aus zwei Disulfid-verknüpften Polypeptidketten mit ungefährer Mr 110.000 und 30.000 zu bestehen. Die letztere Komponente wurde sehr schwach durch Galactose-Oxidase/NaB³H&sub4; markiert. Gap b2 und die schwere Kette von Gap b3 wurden aus den Gelfragmenten getrennt gereinigt und elektrophoretisch extrahiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die sich spezifisch an Gap b3 binden, d.h. eine Bindungsaffinität von ungefähr 10&sup7; Litern/Mol zeigen. Die Antikörper sind nützliche Instrumente für die Zytolokalisierung, z.B. Immunogoldelektronenmikroskopie, von Gap b3 und für die Aufklärung seiner Rolle in der zellulären Differentiation und malignen Transformation. Das gereinigte Protein Gap b3, das oben beschrieben ist, kann verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu produzieren, die sich an Gap b3 binden. Es wird für den Fachmann auf diesein Gebiet offensichtlich sein, daß Antikörper zu Fragmenten von Gap b3 ebenfalls produziert werden können. Antikörper zu intaktem, denaturiertem Gap b3 sind besonders nützlich zum Nachweis von "fixierten", z.B. Formaldehyd oder Glutaraldehyd, Zellen, die Gap b3 exprimieren.
Kurz gesagt können polyklonale Antikörper durch Immunisierung eines Tieres und anschließende Sammlung seiner Seren produziert werden. Es ist im allgemeinen bevorzugt der anfänglichen Immunisierung einen oder mehrere Booster vor der Serensammlung folgen zu lassen.
Monoklonale Antikörper (MAbs) können im allgemeinen mit dem Verfahren von Kohler und Milstein (Nature 256:495-497, 1975; Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976) hergestellt werden. Kurz gesagt werden Lymphknoten und/oder Milzen eines Tieres, dem gereinigtes Protein injiziert worden ist, mit Myelomzellen verschmolzen, um Hybrid-Zellinien zu bilden ("Hybridomas" oder "Klone"). Jedes Hybridoma sekretiert einen einzigen Typ von Immunglobulin, der für das Protein spezifisch ist und hat, wie die Myelomzellen, das Potential zu unbegrenzter Zellteilung.
Die MAbs der vorliegenden Erfindung werden durch Immunisierung eines Tieres mit im wesentlichen reinem Gap b3 hergestellt. Milzzellen werden mit Myelomzellen verschmolzen und Hybridomas durch Grenzverdünnungsverfahren kloniert. Hybridomas werden auf der Basis der Reaktivität mit dem gereinigten Gap b3 selektioniert, das an eine feste Phase gebunden ist, indem Zellen angefärbt werden, die höhere Expression von Gap b3 und/oder Immunausfällung von markierten Gap b3 aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte DNA-Moleküle bereit, einschließlich Genom-DNA und cDNA, die Gap b3 kodieren. Auf der Grundlage der partiellen Aminosäuresequenz der schweren Kette von Gap b3 wurde cDNA, die Hamster-Gap b3 kodiert, kloniert. Die Klonierungsstrategie kann kurz wie folgt zusammengefaßt werden: (1) Synthese von degenerierten Oligodesoxynucleotiden, revers transliert aus Aminosäuresequenz; (2) cDNA-Herstellung; (3) cDNA-Bibliothekskonstruktion; und (4) Screening der Bibliothek mit ³²P-markierter Oligodesoxynucleotid-Sonde. Genauer gesagt wurde für die Isolierung eines repräsentativen DNA-Moleküls, das ein Gap b3 kodiert, Poly A+-RNA aus der Polyoma-transformierten Hamster- NIL (NILpy)-Zellinie (die hohe Gehalte an Gap b3 exprimiert) zur Konstruktion einer λgt10-cDNA-Bibliothek verwendet. Alternativ kann eine cDNA-Bibliothek aus menschlichem Gewebe konstruiert werden.
Degenerierte synthetische Oligodesoxynucleotid-Sonden, auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenzen von Gap b3, wurden konstruiert, wie in Figur 2 dargestellt. cDNA wurde durch Zufallspriming konstruiert. Hybridisierungs- und Waschtemperaturen wurden mit der folgenden Formel bestimmt: Tm = 4(G + C) + 2 (T + A). Spezifische Hybridisierung mit einem DNA-Molekül, das Gap b3 kodiert, wird unter Verwendung der Hybridisierungs- und Waschbedingungen erreicht, die unten beschrieben sind (Beispiel 3E). Die Identität der Kandidaten-Klone wurde durch die Hybridisierung mit Oligo-Sonden getestet, die für verschiedene Regionen von Gap b3 hergestellt worden waren. Screening einer Hamster-NILpy-cDNA-Bibliothek (5x10&sup5; unabhängige Phagen) mit den zwei Sonden, die in Figur 2 dargestellt sind, führte zur Isolierung von 15 doppeltpositiven Klonen. Klon #104 hatte das längste Insert (3,7 kb) (Figur 3). Es zeigte sich jedoch, daß keiner von diesen die N-terminale Region von Gap b3 enthielt. Um zusätzliche Klone zu erhalten, die diese Region enthalten, wurde die Primerextensions-Bibliothek gescreent; es wurde festgestellt, daß ein Klon (#130) das längste Insert besaß, das diese Region enthielt. Auf der Basis einer Kartierung und partiellen Sequenzanalyse wurden drei Klone (#104, 108, 130) aneinander ausgerichtet, wie in Figur 3 gezeigt. Die Identität dieser Klone als cDNA für Gap b3 wurde bestätigt durch das Vorhandensein der N-terminalen Sequenz FNLDTRFLVVKEAVNPGS, und zweier innerer Sequenzen, identifiziert durch die Sequenzanalyse, d.h. TVEDVGSPLKYEFQVSPVGDGLAALGTLVLG und LGMRSLDAYPVLNQAQALE, die identisch zu denjenigen waren, die aus der Nucleotidsequenz von cDNA abgeleitet worden war (Figur 4).
Die vollständige cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäure(a.a.) -Sequenz von Hamster-Gap b3 sind in Figur 4 dargestellt. Die vollständige cDNA-Sequenz wurde aus den drei überlappenden partiellen cDNA-Klonen konstruiert. Die abgeleitete a.a.-Sequenz enthält den N-Terminus und die zwei anderen a.a.-Sequenzen, die aus Proteinsequenzanalyse der schweren Kette von Gap b3 erhalten wurden. Eine relativ hydrophobe Region, die 32 a.a.-Reste überspannt, die der N-terminalen Sequenz (FNLDTR----) vorangehen, scheint eine Signalsequenz zu sein, eingeleitet durch einen Methioninrest an der -32-Position. Die Nucleotidsequenz, die diesen Methionincodon ATG umgibt (GCCATGG), lag dicht an der Consensus-Sequenz (ACCATGG) für die Translationsinitiation, und war identisch zu derjenigen für murinen Lymphknoten-Homingrezeptor und für menschliche N-acetylgalactosaminyl-Transferase Zwei überlappende Polyadenylierungssignale (AATAAATAAA) wurden 22 Nucleotide vor dem Poly A-Schwanz gefunden.
In einer ähnlichen Art und Weise wurden DNA-Moleküle, die menschliches Gap b3 kodieren, isoliert. Screening einer menschlichen T24 (Blasenkarzinom-Zellinie)-cDNA-Bibliothek (> 2 kbp, 2 x 10&sup5; unabhängige Phagen) mit einer Hamster-Gap-b3- cDNA-Sonde führte zur Isolierung von 20 positiven Klonen. Klon Nr. 1 hatte das größte Insert (4,4 kbp) (Figur 5). Es stellte sich jedoch heraus, daß keines von diesen die N-terminale Region des Polypeptids enthielt. Um zusätzliche Klone zu erhalten, die diese Region enthalten, wurde dieselbe Bibliothek mit 5'-Terminus von cDNA-Klon Nr. 1 (180 bp langes PstI-Fragment) als einer Sonde gescreent; es wurde festgestellt, daß ein Klon (Nr. 42) diese Region enthielt. Auf der Grundlage der Kartierung und partiellen Sequenzanalysen wurden drei Klone (Nr. 1, 8 und 42) aneinander ausgerichtet, wie in Figur 5 gezeigt.
Die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz in der Kodierungsregion von menschlichem Gap b3 sind in Figur 6 dargestellt. Die cDNA-Sequenz wurde aus drei überlappenden partiellen cDNA-Klonen konstruiert. Die Identität dieser Klone als cDNA für das menschliche Gegenstück von Gap b3 wurde durch dieselbe Anzahl (1019) an Aminosäureresten wie das authentische Hamster-Gap b3 und eine sehr hohe Sequenzhomologie (89 % für die Aminosäuren), einschließlich aller 19 Cys-Reste an zueinanderpassenden Positionen, bestätigt.
Das reife Polypeptid aus entweder Hamstern oder Menschen enthält 1019 a.a.-Reste und hat eine vorhergesagte Mr von 113.295 bzw. 113.504. Diese Werte stehen in recht guter Übereinstimmung mit der geschätzten Mr von deglykosyliertem Gap b3 (115.000), das durch Verdauung mit Glykopeptidase F (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Ind.) hergestellt wurde. Die Hamster-Sequenz enthält 11 potentielle N-Glykosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr, wobei X nicht Pro ist) und die menschliche Sequenz enthält 14 solche Stellen (Figuren 4 bzw. 6). Wenn man annimmt, daß eine Kohlehydratkette mit einer mittleren Mr von 2.500 sich an 11 solche Einheiten auf Hamster-Gap b3 oder 14 solche Einheiten auf menschlichem Gap b3 bindet, wäre die Gesamt-Mr 140.795 bzw. 148.504. Der erste Wert ist auch konsistent mit der geschätzten Mr von 140.000 aus der relativen Mobilität von Hamster-Gap b3 auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen, wie oben beschrieben. Da Gap b3 aus zwei Disulfid-verknüpften Polypeptidketten zu bestehen scheint, kann eine einzelne mRNA eine einzelne Polypeptidkette kodieren, die durch Proteolyse nach Translation in die zwei Ketten gespalten wird.
Auf der Basis einer Hydrophobie-Plotanalyse wird eine hydrophobe Region, die aus einer Strecke von 28 a.a.-Resten besteht, nahe dem C-Terminus von sowohl Hamster- als auch menschlichem Gap b3 lokalisiert. Diese hydrophobe a.a.- geclusterte Region ist vermutlich eine Transmembran-Domäne. Da alle 11 (für Hamster) oder 14 (für Menschen) potentielle Kohlehydrat-Bindungsstellen auf der N-terminalen Seite der mutmaßlichen Transmembran-Domäne angeordnet sind und sich keine solche Stelle auf der C-terminalen Seite befindet, scheint Gap b3 in der Membran mit seinem N-Terminus zum Äußeren der Zelle hin orientiert zu sein. Das C-terminale 32 a.a. lange Segment stellt daher wahrscheinlich die Zytoplasma-Domäne dar. Das lange Segment, das aus den restlichen 959 a.a.-Resten (94 %) besteht, ist vermutlich eine extrazelluläre Domäne.
Bei ungefähr einem Drittel der Distanz vom N-Terminus von sowohl Hamster- als auch menschlichem Gap b3 liegt ein Dreier- Homologsequenz-Motiv mit der Consensus-Sequenz D X D/N X D/N G X X D (Figur 4 bzw. 6). Diese Sequenz ist üblicherweise verantwortlich für Metallbindung, z.B. Ca²&spplus; und Mg²&spplus;. Die N-terminale Region des menschlichen Polypeptids hat sieben homologe Wiederholungen, von denen drei die mutmaßlichen Metallbindungssequenzen einschließen. Jede Wiederholung besteht aus einer langen (21-28 Aminosäuren) und einer folgenden kurzen (5 Aminosäuren) Strecke. Die Ausrichtung von Glycin- und hydrophoben Aminosäureresten in jeder Wiederholung zeigt ein ähnliches Muster, insbesondere das Vorhandensein von XXXGAP-Sequenz (in der X eine hydrophobe Aminosäure ist) am Ende der meisten längeren Strecken (ausgenommen für die zweite und siebente Wiederholung).
Wie oben angegeben, ist Gap b3 ein transformationsabhängiges Zelloberflächen-Glykoprotein mRNA-Gehalte für das Glykoprotein vor und nach der Transformation wurden mit Northern-Blot- Analyse verglichen. Figur 7A zeigt daß ein Transkript von 5,0 kb in RNA aus sowohl NILpy- als auch NIL-Zellen identifiziert wurde. Außerdem tauchte mRNA für Gap b3 sehr viel reichlicher in den transformierten Zellen als in den Progenitor-Zellen auf. Hybridisierung desselben Blots mit einer cDNA-Sonde für das β-Actin-Gen ergab vergleichbare Signale in den zwei Spuren. Diese Ergebnisse zeigen, daß erhöhte Expression von Gap b3 durch seinen mRNA-Gehalt transkriptional gesteuert wird. In ähnlicher Weise wurde Northern-Blot-Analyse auf RNA aus murinen und menschlichen Fibroblasten vor und nach onkogenetischer Transformation, induziert mit SV-40, durchgeführt. Figur 8 zeigt, daß Fibroblasten von Menschen (WI-38) und Mäusen (BALB/3T3) und ihre entsprechenden SV-40-Transformanten, ein einzelnes Transkript (~4,8 kb) ergaben, das mit einer aus Hamstern gewonnenen Gap-b3-cDNA-Sonde hybridisiert war. Außerdem wurde festgestellt, daß SV-40-transformierte Zellen größere Mengen mRNA enthielten, als die Progenitor- Zellen aus sowohl Menschen als auch Mäusen sowie Hamstern. Hybridisierung desselben Blots mit einer cDNA-Sonde für das β-Actin-Gen ergab vergleichbare Signale in den sechs Spuren. Der Anstieg von mRNA für Gap b3 nach der Transformation ist ein allgemeines Phänomen in menschlichen, Mäuse- und Hamster- Fibroblasten. Figur 8 zeigt auch, daß zwei menschliche Blasenkarzinom-Zellinien (EJ-1 und T24) hohe Gehalte von mRNA für Gap b3 enthalten.
Southern-Hybridisierung wurde durchgeführt, um DNAs von verschiedenen Säugetierspezies zu analysieren. Southern-Blot- Analyse von Genom-DNA, verdaut mit drei unterschiedlichen Endonucleasen, zeigte, daß jede verdaute DNA von allen drei Spezies ein einzelnes Fragment ergab, hybridisiert mit einem 400 bp langen Pst I-Fragment vom Gap b3-Klon (Figur 7B). Daher ist das Gap b3-Gen ein Einzelkopie-Gen und Mäuse und Menschen haben Gene, die zu dem von Hamster abgeleiteten Gap b3 homolog sind.
Die DNA-Moleküle und Antikörper in der vorliegenden Erfindung erlauben den Nachweis eines Tumors, der zur Expression von Gap b3 in Gehalten führt, die diejenigen übersteigen, die von nicht-transformierten Zellen exprimiert werden. Repräsentative Beispiele für Krebsarten, die erhöhte Gehalte von Gap b3 exprimieren, schließen Kolon-Rektum-Karzinom, Blasen-Karzinom und bestimmte hämatopoietische Zellmalignitäten ein. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Messen des Gehaltes an für Gap b3 spezifische RNA. RNA wird aus einem Warmblüter, wie etwa einem Menschen, isoliert, der einen Tumor besitzen kann, der zu der erhöhten Expression von Gap b3 führt. Der Gehalt an für Gap b3 spezifischer RNA wird in der isolierten RNA-Probe gemessen. Dieser Gehalt wird verglichen mit dem Gehalt in Kontroll-RNA von einem Warmblüter. Geeignete Quellen für Kontroll-RNA, z.B. aus nicht-transformierten Zellen, die Gap b3 exprimieren, sind diejenigen, durch die die Expression von Gap b3 nicht erhöht wird. Messung des Gehaltes an spezifischer RNA in der Probe von dem Warmblüter kann vor der, gleichzeitig mit der oder anschließend an die Messung unter Verwendung der Kontroll-RNA erfolgen. Ein Gehalt an Gap b3- spezifischer RNA in der Probe, der denjenigen in der Kontroll- RNA übersteigt, zeigt das Vorhandensein des Tumors an. Es wird für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein, daß eine Vielzahl von Verfahren zur Messung einer besonderen RNA existiert.
Ein repräsentatives Beispiel für einen geeigneten Weg, um für Gap b3 spezifische RNA zu messen, ist durch spezifische Hybridisierung mit einem DNA-Fragment. Auf der Basis der Gap b3- Sequenzinformation und des entsprechenden Materials, die oben beschrieben sind, können Nucleotidsonden, z.B. durch PCR- Amplifikation, hergestellt und für DNA- und RNA-Diagnoseverfahren verwendet werden (Landegren et al., Science 242:229, 1988), die Gap b3 betreffen. Es wird für einen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein, daß die Sonden eine Nucleotidsequenz umfassen können, die von DNA abgeleitet ist, die das Genprodukt kodiert, oder von einem Abschnitt solcher DNA. Oligodesoxynucleotide können synthetisiert worden (Tan et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. 47, S. 383) oder hergestellt mit einem DNA-Synthesizer, z.B. einem Applied Biosystems DNA Synthesizer 380B.
Zum Beispiel wird ein DNA-Fragment (Sonde), das in der Lage ist, mit für Gap b3 spezifische RNA spezifisch zu hybridisieren, mit einer RNA-Probe unter Bedingungen inkubiert, die Hybridisierung ermöglichen. Wenn Hybridisierung aufgetreten ist, wird ein Hybridisierungsmuster nachgewiesen (z.B. durch Northern-Blot-Analyse). Die Hybridisierungsmenge wird gemessen und mit derjenigen für eine Probe von Kontroll-RNA (wie oben diskutiert) verglichen. Eine erhöhte Hybridisierungsmenge und daher ein erhöhter Gehalt an für Gap b3 spezifischer RNA ist diagnostisch für das Vorhandensein eines Tumors, das zu der erhöhten Expression von Gap b3 führt. Der Schritt der Messung der Hybridisierungsmenge kann unter Verwendung einer Reporter- Gruppe durchgeführt werden, die an die Sonde, an ein Molekül, das mit der Sonde reagiert, oder an ein zweites Molekül, das mit dem ersten Molekül reagiert, gebunden ist. Geeignete Reporter-Gruppen schließen Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, Lumineszere und Farbstoffteilchen ein.
In einer anderen Ausführungsform für den Nachweis eines Tumors, der zu der erhöhten Expression von Gap b3 führt, werden Antikörper zu Gap b3 eingesetzt. Zum Beispiel wird eine biologische Probe, wie etwa Gewebe, die einem Warmblüter entnommen ist, mit einem Antikörper inkubiert, der spezifisch Gap b3 bindet (d.h. eine Bindungsaffinität von etwa 10- Litern/Mol zeigt) unter Bedingungen, die es erlauben, daß sich Immunkomplexe bilden. Der Nachweis von Immunkomplexen, die zwischen Gap b3 und Antikörpern, die Gap b3 spezifisch binden, gebildet sind, kann mit einer Vielzahl von bekannten Techniken durchgeführt werden, wie etwa Radioimmunoassays (RIA) und Enzym-verknüpfte Immunosorbentassays (ELISA). Die Anzahl der unter Verwendung der biologischen Probe gebildeten Immunkomplexe wird verglichen mit derjenigen aus einer Kontrollprobe, in der die Expression von Gap b3 nicht erhöht ist. Eine geeignete Kontrollprobe stammt von einem Warmblüter mit nicht-transformierten Zellen, die Gap b3 exprimieren. Messung der Anzahl von Immunkomplexen in der Probe kann vor der, gleichzeitig mit der oder anschließend an die Messung unter Verwendung der Kontrollprobe erfolgen. Zahlen von Immunkomplexen, die diejenigen für eine Kontrollprobe übersteigen, zeigen das Vorhandensein des Tumors an.
Geeignete Immunoassays schließen die Sandwich-Immunoassay- Technik mit doppeltem monoklonalen Antikörper von David et al. (U.S.-Patent Nr. 4,376,110); Sandwich-Assays mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern (Wide et al., in Kirkham und Hunter, Hrg., Radioimmunoassay Methods, E. und S. Livingstone, Edinburgh, 1970); das "Western-Blot"-Verfahren von Gordon et al. (U.S.-Patent Nr. 4,452,901); Immunfällung von markierten Liganden (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); Enzym-verknüpfte Immunosorbentassays, wie z.B. von Raines und Ross beschrieben (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); Immunozytochemische Techniken, einschließlich der Verwendung von Fluorochromen (Brooks et al., Clin. ExD, Immunol. 39:477, 1980); und Aktivitätsneutralisation [Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400 (1984)] ein. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Immunoassays ist eine Anzahl von anderen Immunoassays verfügbar, einschließlich denjenigen, die in den U.S.-Patent Nrn.: 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 und 4,098,876 beschrieben sind.
Für Nachweiszwecke können die Antikörper entweder markiert oder nicht-markiert sein. Wenn nicht-markiert, finden die Antikörper Verwendung in Agglutinationstests Zusätzlich können nicht-markierte Antikörper in Kombination mit markierten Molekülen, die mit Immunkomplexen reaktiv sind, oder in Kombination mit markierten Antikörpern (zweite Antikörper), die mit dem gegen das Gap b3 gerichteten Antikörper reaktiv sind, wie etwa für Immunglobulin spezifische Antikörper, verwendet werden. Alternativ können die Antikörper direkt markiert sein. Wo sie markiert sind, kann die Reporter-Gruppe Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, Lumineszere oder Farbstoffteilchen einschließen. Diese und andere Markierungen sind in der Technik gut bekannt und sind z.B. in den folgenden U.S.- Patenten beschrieben: 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 3,996,345 und 4,233,402.
Tpypischerweise wird in einem ELISA-Assay Antigen an die Oberfläche einer Mikrotiter-Vertiefung adsorbiert. Die übrigen Protein-bindenden Stellen auf der Oberfläche werden dann mit einem geeigneten Agens blockiert, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA), hitzeinaktiviertem normalen Ziegenserum (NGS) oder BLOTTO (gepufferte Lößung von Trockenmagermilch, die auch einen Konservierungsstoff, Salze und ein Antischaummittel enthält). Typischerweise wird die Vertiefung dann mit einer Probe inkubiert, bei der der Verdacht besteht, daß sie einen spezifischen Antikörper enthält. Ein ELISA-Assay kann jedoch auch in der Form eines Inhibitions-Assays verwendet werden, um eine Probe zu analysieren, bei der der Verdacht besteht, daß sie spezifisches Antigen, z.B. Gap b3, enthält. In einem Inhibitions-ELISA-Assay wird eine Probe, bei der der Verdacht besteht, daß sie Gap b3 enthält, in Kombination mit einem für Gap b3 spezifischen Antikörper, auf Gap b3 aufgebracht, das an einen festen Träger, wie etwa eine Mikrotiter-Vertiefung, adsorbiert ist. Die Probe kann rein aufgebracht werden, oder öfter kann sie verdünnt aufgebracht werden, üblicherweise in einer gepufferten Lösung, die eine geringe Menge (0,1-5,0 Gew.-%) Protein enthält, wie etwa BSA, NGS oder BLOTTO. Nach Inkubation für eine ausreichende Zeitdauer, um es zu ermöglichen, daß spezifische Bindung auftritt, wird die Vertiefung gewaschen, um "nicht-gebundenen" Antikörper zu entfernen (d.h. Antikörper, der nicht an das Gap b3 gebunden ist, das an einen festen Träger adsorbiert ist, und schließt Antikörper ein, der an Gap b3 in der Probe gebunden ist). Der über Gap b3 an den festen Träger gebundene Antikörper kann auf eine Vielzahl von Arten nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann die Vertiefung mit einem anti-Spezies-spezifischen Immunglobulin-Antikörper inkubiert werden, der mit einer Reporter-Gruppe markiert ist. Die Reporter-Gruppe kann aus einer Vielzahl von Enzymen ausgewählt werden, einschließlich Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Glucose-Oxidase. Ausreichend Zeit wird gelassen, damit spezifische Bindung eintritt, dann wird die Vertiefung erneut gewaschen, um nicht- gebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat für das Enzym wird zugegeben. Man läßt die Farbe sich entwickeln und die optische Dichte des Inhalts der Vertiefung wird visuell oder instrumental bestimmt. In diesem Inhibitions-ELISA wird maximale Farbentwicklung bei Abwesenheit von Gap b3 in der Probe auftreten. Das Vorhandensein von Gap b3 in der Probe wird den Antikörper verringern, der sich an das an einen festen Träger adsorbierte Gap b3 bindet, und somit die gemessene Farbmenge senken.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung ist eine Reporter-Gruppe an den Antikörper gebunden. Der Schritt des Nachweisens von Immunkomplexen umfaßt das Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Antikörper und anschließendes Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der Reporter-Gruppe. Nicht-gebundene Antikörper ist ein Antikörper, der sich nicht an Gap b3 gebunden hat.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine Reporter-Gruppe an einen zweiten Antikörper gebunden, der in der Lage ist, sich an die für Gap b3 spezifischen Antikörper zu binden. Der Schritt des Nachweisens von Immunkomplexen umfaßt (a) Entfernen von in wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Antikörper (d.h. nicht an Gap b3 gebundenem Antikörper), (b) Zugeben des zweiten Antikörpers, (c) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen zweiten Antikörper und anschließend (d) Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der Reporter-Gruppe. Wo der für Gap b3 spezifische Antikörper aus einer Maus gewonnen ist, ist der zweite Antikörper ein anti-muriner Antikörper.
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform zum Nachweisen von Immunkomplexen ist eine Reporter-Gruppe an ein Molekül gebunden, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden. Der Schritt des Nachweisens umfaßt (a) Zugeben des Moleküls, (b) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Molekül und anschließend (c) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins der Reporter-Gruppe. Ein Beispiel für ein Molekül, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden, ist Protein A.
Es wird für einen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein, daß eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweisen der Immunkomplexe bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann. Reporter-Gruppen, die zur Verwendung in irgendeinem dieser Verfahren geeignet sind, schließen Radioisotope, Fluorophoren, Enzyme, Lumineszere und Farbstoffteilchen ein.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung, der auf der Klonierung und Charakterisierung von Gap b3 beruht, ist die Herstellung von DNA-Konstrukten und rekombinanten Plasmiden. Wie oben angegeben, umfaßt der Ausdruck "DNA-Konstrukte", wie hierin verwendet, DNA-Segmente, die in einer Art und Weise kombiniert und nebeneinandergestellt sind, die ansonsten in der Natur nicht auftreten wurde. Genauer gesagt können DNA- Konstrukte eine DNA-Sequenz, die Gap b3 kodiert, umfassen, in der es eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Additionen und/oder Insertionen, relativ zu "isolierten" DNA-Sequenzen, gegeben hat. Ein Abschnitt der DNA-Sequenz kann aus einem Genom- oder cDNA-Klon abgeleitet werden. Die hierin beschriebene DNA kann einen geeigneten Promotor einschließen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen rekombinante Plasmide, die zur Integration in eine eukaryontische Wirtszelle in der Lage sind, einen Promotor, flußabwärts gefolgt von einer DNA-Sequenz, die Gap b3 kodiert, der ihrerseits stromabwärts ein Polyadenylierungs signal folgt. Die DNA-Sequenz kann eine cDNA oder Genom-DNA sein. Die Plasmide können verwendet werden, um Zellen stabil zu transfizieren (transformieren) und dadurch eine Wirtszelle zu etablieren (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 & 2, Wiley Interscience). Eine Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung von Gap b3 umfaßt das Einführen einer DNA-Sequenz, die Gap b3 kodiert, in eine eukaryontische Wirtszelle. Die Wirtszellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und das durch die DNA-Sequenz kodierte Proteinprodukt, das von der Wirtszelle produziert wird, wird isoliert. Bevorzugte Wirtszellen schließen Säugetierzellen ein. Besonders bevorzugte Wirtszellen schließen COS-1-Zellen ein. Geeignete Verfahren zum Einführen klonierter DNA- Sequenzen in kultivierte Säugetierzellen schließen Calciumphosphat-mediatisierte Transfektion ein (z.B. Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 2:603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52:456, 1973). Für einen Fachmann auf diesem Gebiet wird es offensichtlich sein, daß es nicht notwendig ist, die gesamte Sequenz zu verwenden, wenn man rekombinante Gap b3-Proteine produziert.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Reinigung von Galactoprotein b3

A. Herstellung von Galactoprotein b-Fraktion

Hamsterembryo-Fibroblastenzeilen, transformiert mit Polyoma- Virus ("NILpy-Zellen") (20 ml gepackt) wurden in 100 ml (bei 0ºC) 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 0,34 M Saccharose, 1 mM ATP, 1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF und 0,2 mM Leupeptin enthielt, homogenisiert. Die Zellsuspension wurde bei 25.000 UPM für 20 Minuten zentrifugiert. Der Pellet wurde wieder mit demselben Puffer extrahiert und dann mit einem detergenthaltigen Puffer löslich gemacht (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM CaCl&sub2;, 5 mM MgCl&sub2;, 1 % Empigen BB, 0,2 mM PMSF und 0,2 mM Leupeptin). Die Mischung wurde bei 0ºC für 1 Stunde inkubiert und unlösliche Materialien wurden durch Zentrifugation bei 25.000 UPM für 40 Minuten entfernt. Der so erhaltene Überstand wurde auf eine Säule (15 ml) aus an Sepharose konjugiertes RCA (Ricinus communis-Lectin) aufgebracht. Die RCA-Sepharose wurde hergestellt, indem RCA an ein Glutaraldehydderivat von Polyacrylhydrazido-Sepharose (beschrieben in Wilchek und Miron, Meth. Enzymol. 34:72-76, 1974) gekoppelt wurde, gefolgt von NaBH&sub4;-Reduktion (beschrieben in Carter und Sharon, Arch. Biochem. Biophys. 180:570-582, 1977). Nachdem der Überstand auf die RCA-Sepharose -Säule aufgebracht und die Säulen extensiv mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,5 % Empigen BB enthielt, gewaschen worden war, wurden die gebundenen Materialien mit denselben Puffer, der 0,3 M Lactose enthielt, eluiert, um die Galactoprotein b-Fraktion zu liefern.

B. Isolation von Galactoprotein b3 bis zur Homogenität

Das Galactoprotein-b(Gap b)-Eluat aus der RCA-Sepharose -Säule wurde auf präparativer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt. Die SDS-PAGE wurde mit dem Verfahren gemäß Laemmli (Nature 227:680-685, 1970) unter Verwendung von 2 mm-Plattengelen durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Banden, die Gap b entsprachen, durch Schneiden des Gels entfernt und Glykoproteine wurden elektrophoretisch extrahiert (beschrieben bei Stralfors und Belfrage, Anal. Biochem. 128:7-10, 1983), ausgenommen, daß der Puffer ohne Agarose zur Elektrophorese verwendet wurde. Banden, die Gap b entsprachen, wurden durch ihre erhöhte Expression an der Oberfläche von NILpy-Zellen identifiziert, wie nachgewiesen durch Tritium-Markierung der Oberflächen-Galactoproteine. NILpy-Zellen wurden mit dem Galactose-Oxidase/NaB³H&sub4;-Verfahren markiert (Gahmberg und Hakomori, J. Biol. Chem. 250:2447-2451, 1975). Tritium-markierte Glykoproteine auf Gelen wurden durch Fluorographie unter Verwendung von EN³HANCE (New England Nuclear, Boston, Mass.) nachgewiesen. Zweidimensionale (2-D) SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden (erste Dimension) und reduzierenden (zweite Dimension) Bedingungen wurde gemäß dem Verfahren von Kunicki et al. (J. Biol. Chem. 263:4516-4519, 1988) durchgeführt.

BEISPIEL 2

Proteinsequenzierung

Um die innere Aminosäure(a.a.)-Sequenz zu erhalten, wurde die schwere Kette von Gap b3 verdaut mit Achromobacter-Protease I (Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981), nach Reduktion von Disulfidbindungen mit DTT, gefolgt von S-Pyridylethylierung (Cavins und Friedman, Anal. Biochem. 35:489- 493, 1970; Rüegg und Rudinger, Meth. Enzymol. 47:111-116, 1977). Peptide wurden auf einer Aquapore RP300-Säule (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) mit High Resolution Liquid Chromatography Model 1090M (Hewlett Packard) getrennt. Die N-terminale a.a.-Sequenz der schweren Kette von Gap b3 und die inneren Peptide wurden mit einem Applied Biosystems Protein Sequencer Model 477A mit PTH Analyzer Model 120A analysiert.

BEISPIEL 3

Klonierung und Charakterisierung von zu Galactoprotein b3-mRNA komplementärer DNA

A. Herstellung von synthetischen Oligodesoxynucleotid-Sonden in Übereinstimmung mit partiellen Aminosäuresequenzdaten
Auf der Basis von Aminosäuresequenzen einiger Peptide, die bei Endolysylpeptidasebehandlung freigesetzt wurden (beschrieben in Beispiel 2), wurden synthetische Oligodesoxynucleotide mit einem Applied Biosystems DNA Synthesizer 380D (Foster City, California) hergestellt.

B. RNA- und DNA-Herstellung

Gesamt-RNA wurde mit dem Guanidinthiocyanatverfahren (z.B. Chirgwin et al., Biochemistrv 24:5294-5299, 1979) hergestellt. Kurz gesagt wurden Zellpellets in Guanidinthiocyanatlösung homogenisiert und zweimal ethanolgefällt. Nach erneuter Suspension in einer Kochsalzlösung/SDS-Mischung wurde RNA mit Phenol und Seavag-Mischung (Chloroform/Isoamylalkohol, 24:1) extrahiert, gefolgt von Ethanolausfällung. Die Poly A+ -Fraktion wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Säulenchromatographie selektioniert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 1982, Cold Springs Harbor Laboratory, New York). Genom-DNA wurde gereinigt durch Verdauung der Gewebe mit Protenase K in der Gegenwart von SDS und EDTA, gefolgt von Extraktion mit Seavag-Mischung und Ethanolausfällung (a.a.O.).

C. cDNA-Bibliotheken

Alle Reagenzien und Enzyme für cDNA-Synthese stammten aus dem Promega-cDNA-Synthesekit und wurden nach den Herstelleranweisungen verwendet. cDNA wurde mit NILpy-Poly A+-RNA (5 ug) mit dem Verfahren von Gubler und Hoffmann (Gene 25:263-269, 1983) unter Verwendung eines Zufalls-Hexamers anstelle von Oligo-dT als einem Primer synthetisiert. Die cDNA wurde mit einem phosphorylierten Eco RI-Linker ligiert, mit Eco RI verdaut und auf 1%igem Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen. Die cDNA wurde nach Größe selektioniert (> 2 kb) und aus dem Gel unter Verwendung von Geneclean (Bio 101, LaJolla, Calif.) gewonnen, dann an die dephosphorylierte Eco RI-Arme des λgt10-Vektors ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro mit einem Verpackungsextrakt verpackt (Gigapack, Stratagene, San Diego, Calif.).

D. Screening der λgt10-Bibliothek

1. Sondenherstellung. Synthetische Oligodesoxynucleotide wurden mit γ-[³²-P]ATP mit Polynucleotidkinase markiert.
2. Screening. Fünfzehn Plaques aus 5 X 10&sup5; primären rekombinanten Phagen, die nach Audioradiographie positive Signale ergaben, wurden durch sukzessive Plattierung und erneutes Screening gereinigt.
3. Zusätzliche Klone. Um zusätzliche Klone zu erhalten, die die N-terminale Region von Gap b3 abdecken, wurde eine Primerextensions-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Poly A&spplus;- RNA (15 ug) aus NILpy-Zellen und eines 17meren Oligodesoxynucleotids (5' GCCCTCAAATGGAGCTC 3', 0,7 ug) als einem Primer konstruiert. Die cDNA wurde mit λgt10-Armen ligiert und, wie oben beschrieben, verpackt. Diese cDNA-Bibliothek wurde mit ³²P-markiertem, 170 bp langen Pst I-Fragment von Klon #108 (5'- Terminus von Klon #108) gescreent.

E. Northern- und Southern-Hybridisierung

Für Northern-Blot-Analyse wurden 50 ug RNA oder 5 pg Poly A&spplus;- RNA durch ein denaturierendes Formaldehyd-Agarosegel hindurch einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylon-Membran (Hybond-N, Amersham, Arlington Heights, Ill.) überführt.
Für Southern-Blot-Analyse wurden 10 ug Genom-DNA über Nacht mit der geeigneten Restriktionsendonuclease (Eco RI, Hind III oder Bam HI) verdaut und auf ein 1%iges Agarosegel geladen. Nach Elektrophorese wurden die Gele in 0,5 N NaOH und 1,5 M NaCl denaturiert (20 min), in 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) 1,5 M NaCl neutralisiert (30 min, 2 x). Die DNA wurde sukzessive auf eine Nylon-Membran durch Kapillarwirkung überführt und durch UV-Bestrahlung fixiert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Springs Harbor Laboratory, New York).
Sowohl Northern- als auch Southern-Membrantilter wurden in 50 % Formamid, 5x SSPE, 5x Denhardt-Lösung und 0,1 % SDS-Lösung bei 42ºC für zwei Stunden vorhybridisiert und dann über Nach bei 42ºC mit eine ³²P-zufallsgeprimten, markierten (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132:6, 1983; Anal. Biochem. 137:266, 1984) 400 bp langen DNA-Fragment, das durch Verdauung von Klon #104 mit Pst 1 erhalten worden war, hybridisiert. Die Membranfilter wurden in 2x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur 5 min zweimal und dann in 1x SSC, 0,05 % SDS bei 68ºC für eine Stunde gewaschen.

F. Subklonierung und Restriktionsenzymkartierung

DNA aus den Phagenklonen wurden mit Eco RI verdaut und mit dephosphorylierten Eco RI-Armen von pT7T3-18U-Plasmid (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) ligiert. Nach DNA-Transformation von Bakterien vom XL-1-Blue-Stamm (Stratagene) wurden die Klone mit Insert durch Farbselektionierung mit Isopropyl- 1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) und X-Gal gescreent. Restriktionsenzyme wurden von BRL oder New England Biolabs erhalten.

G. DNA-Sequenzierung

Didesoxynucleotidterminationssequenzierungsreaktionen (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) wurden mit einzelsträngiger DNA von Phagescript-Klonen oder pT7T3- Klonen, erhalten durch Superinfektion mit einer Helfer-Phage, M13K07 (Vieira und Messing, Meth. Enzymol. 153:3-34, 1987), durchgeführt. Die Sequenzierungsstrategie ist in Figur 3 dargestellt. DNA-Sequenzierung wurde mit einem DNA-Sequenzer Model 373A (Applied Biosystems, Foster City, California) unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) und einem universellen M13-Primer oder synthetischen Oligodesoxynucleotidprimern durchgeführt, IBI Pustell Sequence Analysis Software (MS-DOS-Version) wurde zur Sequenzanalyse verwendet.

H. Klonierung und Charakterisierung von zu mRNA von GaD b3 aus menschlichen Zellen komplementärer DNA

WI38 (menschlicher Vorhaut-Fibroblast, ATCC CCL75), WI38/VA13 (SV-40-Transformant von WI38, ATCC CCL 75.1), BALB/3T3 (muriner embryonaler Fibroblast, ATCC CCL 163), SV-T2 (SV-40- Transformant von BALB/3T3, ATCC CCL 163.1), EJ-1 (menschliches Blasenkarzinom, JCRB 0710) und T24 (menschliches Blasenkarzinom, JCRB 0711) wurden geliefert von der Japanese Cancer Research Resources Bank (JCRB, Tokyo, Japan). Alle Zellinien wurden in Dulbeccos modifiziertem MEM (D-MEM), das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt ist, bei 37ºC unter 5 % CO&sub2; kultiviert.
Gesamt-RNA wurde hergestellt gemäß Abschnitt B oben. Die Poly- A&spplus;-Fraktion wurde ebenfalls gemäß Abschnitt B oben selektioniert, unter Verwendung von zwei Zyklen Oligo(dT)-cellulosesäulenchromatographie. Die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken wurde durchgeführt, wie in Abschnitt C oben beschrieben, ausgenommen, daß cDNA mit T24-Poly A&spplus;-RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits von Pharmacia (Uppsala, Schweden) synthetisiert wurde.
Primäre rekombinante Phagen (2 x 10&sup5;) wurden durch Hybridisierung mit ³²P-Zufallsprime-markiertem (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132:6-13, 1983), 400 bp langen DNA-Fragment, erhalten aus der Verdauung von Hamster-Gap b3-Klon 104 mit Pst I, gescreent. Zwanzig Plaques, die positive Signale nach Audioradiographie ergaben, wurden durch sukzessive Plattierung und erneutes Screening gereinigt. Um zusätzliche Klone zu erhalten, die die N-terminale Region von menschlichem Gap b3 abdecken, wurde dieselbe Bibliothek mit ³²P-markiertem 180 bp langen Pst 1-Fragment von menschlichem Gap b3-Klon 1 (5'- Terminus von Klon 1) gescreent.
Northern-Hybridisierungen wurden durchgeführt, wie in Abschnitt E oben beschrieben, ausgenommen, daß 4 ug Poly A&spplus;-RNA verwendet wurden.
Subklonierung wurde gemäß Abschnitt F oben durchgeführt. DNA- Sequenzierung wurde durchgeführt, wie in Abschnitt G oben beschrieben. Ein Satz Deletionen wurde gemäß der Methodik von Henikoff (Gene [Amst.] 28:351-359, 1984) und durch Verwendung von Restriktionsstellen hergestellt. Die Sequenzierungsstrategie ist in Figur 5 dargestellt.

BEISPIEL 4

Herstellung und Charakterisierung von auf Galactoprotein b3 gerichteten MAbs

A. Erzeugung von MAbs

Produktion von auf Galactoprotein b3 gerichteten MAbs wurde erreicht durch Immunisierung von drei Monate alten BALB/c- Mäusen. Die Mäuse wurden mit Galactoprotein b3 (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben), emulgiert in Ribi-Adjuvans (Monophosphoryllipid A + Trehalosedimycolat) durch viermalige (3wöchiger Abstand) intraperitoneale Injektion mit ungefähr ug Gap b3 pro Injektion immunisiert. Milzzellen wurden 3 Tage nach der letzten Immunisierung mit NS-1-Myelomzellen verschmolzen und Hybridomas werden durch wenigstens dreimalige Grenzverdünnung kloniert. Hybridomas werden durch Partikelkonzentrierten Fluoreszensimmunoassay (PCFI) gescreent. Isotop und Unterklasse werden mit PCFI unter Verwendung von Fluoreszeinisothiocyanat(FITC)-konjugierten Ziegen-anti-Mäuse-Antikörpern sowie durch die Ochterlony-Methode unter Verwendung von Kaninchen-anti-Mäuse-Antikörpern (Boehringer Mannheim Biochemicals) bestimmt. Antikörper werden gereinigt auf einer Protein A-Sepharose -4B-Säule (pH 9,0), eluiert mit 100 mM Citratpuffer (pH 4,2) und gegen 20 mM Tris-Puffer (pH 7,4) dialysiert.

B. PCFI-Screening

Ungefähr 50 ug gereinigtes Gap b3 (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) wird mit 1 ml 0,5 % (w/v) Fluoricon Carboxyl- Polystyrene Assay Particles (0,86 pm, Pandex) vermischt und kovalent gekoppelt durch Zugabe von festem 1-Ethyl-3[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu ergeben. Nach Verwirbelung wird die Mischung bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden inkubiert. Die Mikropartikel werden dann zentrifugiert (3000 xg, 10 min), mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, mit entweder Rinderserumalbumin (BSA)/PBS 5 % oder menschlichem Serum (1: 10-Verdünnung) blockiert und auf ein Endvolumen von 0,25 % w/v in PBS gebracht. Antigen-beschichtete Teilchen werden dann 1:10 in BSA-beschichteten Teilchen verdünnt (gleiches Verfahren), um eine endgültige Teilchenkonzentration von 0,225 % BSA-Teilchen und 0,025 % Gap b3-Teilchen zu ergeben. 20 pl BSA-Gap b3 oder BSA-beschichtete Teilchen werden in Epicon-Testplatten mit 96 Vertiefungen (Pandex) mit einem 0,2 pm-Filter verteilt. Die automatisierte Maschine für das Partikel-konzentrierte Fluoreszens-Immunoassayscreening (Pandex) (wie beschrieben in Jolley et al., J. Immunol. Meth. 67:21-35, 1984) führt die folgenden Schritte nacheinander durch Vakuumabsaugung durch den 0,2 um-Filter im Boden jeder Vertiefung-und Verteilung von Puffern durch eine 9-Kanal-Pumpe aus: Inkubation für 10 min mit 50 ul Mab-Kulturüberstand, Waschen mit PBS, Inkubation für 10 min mit 25 ul affinitätsgereinigtem FITC-konjugierten Ziegen-anti-Mäuse-Ig-Antikörper (1:200, Pandex) Waschen mit PBS und Ablesen bei 485 mm/535 nm nach Endabsaugungszentrierung und Konzentrierung von Antigen-beschichteten Teilchen aut dem Boden der Vertiefungen.
Aus dem Vorstehenden wird deutlich werden, daß, obgleich besondere Ausführungsformen der Erfindung hierin zur Veranschaulichungszwecken beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Ein isoliertes DNA-Molekül, das Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

2. Das isolierte DNA-Molekül von Anspruch 1, wobei besagtes DNA-Molekül menschliches Galactoprotein b3 kodiert.

3. Ein cDNA-Molekül nach Anspruch 1.

4. Ein Genom-DNA-Molekül nach Anspruch 1.

5. Ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei besagtes Galactoprotein b3 die Aminosäuresequenz von Figur 6 von Phenylalanin, Aminosäure 1, bis Tyrosin, Aminosäure 1019, umfaßt.

6. Ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei besagtes Galactoprotein b3 eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, wie dargestellt in Figur 6, von Nukleotid 1 bis Nukleotid 3057.

7. Ein isoliertes DNA-Molekül, das in der Lage ist, spezifisch mit einem DNA-Molekül zu hybridisieren, das Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL- Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

8. Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein erhältlich ist aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

9. Das DNA-Konstrukt von Anspruch 8, wobei wenigstens ein Abschnitt der DNA-Sequenz abgeleitet ist von einem cDNA-Klon von Galactoprotein b3.

10. Das DNA-Konstrukt von Anspruch 8, wobei wenigstens ein Abschnitt der DNA-Sequenz abgeleitet ist von einem Genom-Klon von Galactoprotein b3.

11. Ein rekombinantes Plasmid, das zur Expression in einer Wirtszelle in der Lage ist, wobei besagtes rekombinantes Plasmid außerdem eine DNA-Sequenz umfaßt, die Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten- NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

12. Das rekombinante Plasmid von Anspruch 11, wobei die DNA- Sequenz Galactoprotein b3-cDNA umfaßt.

13. Das rekombinante Plasmid von Anspruch 11, wobei die DNA- Sequenz Galactoprotein b3-Genom-DNA umfaßt.

14. Ein rekombinantes Plasmid, das zur Integration in Wirtszell-DNA in der Lage ist, wobei besagtes Plasmid einen Promotor umfaßt, flußabwärts gefolgt von einer DNA-Sequenz, die Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen, wobei besagter DNA-Sequenz flußabwärts ein Polyadenylierungssignal folgt.

15. Eukaryontische Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid stabil transfiziert sind, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die Galactoprotein b3 kodiert, wobei besagtes Protein erhältlich aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen, wobei besagte Zellen besagtes Galactoprotein b3 in gewinnbaren Mengen produzieren.

16. Ein Verfahren zur Herstellung von Galactoprotein b3, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen, welches umfaßt:

Einführen einer DNA-Sequenz, die Galactoprotein b3 kodiert, in eine eukaryontische Wirtszelle;

Züchten besagter Wirtszelle in einem geeigneten Medium; und Isolieren des von besagter DNA-Sequenz kodierten Proteinproduktes, das von besagter Wirtszelle produziert ist.

17. Das Verfahren von Anspruch 16, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.

18. Das Verfahren von Anspruch 17, wobei die Säugetierzelle COS-1 ist.

19. Ein Antikörper, der sich spezifisch an Galactoprotein b3 bindet, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL- Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

20. Der Antikörper von Anspruch 19, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

21. Ein monoklonaler Antikörper, der von einem Hybridom produziert ist, das gebildet ist durch die Fusion von Zellen aus einer Myelomlinie und Milzzellen von einem Tier, das zuvor mit einem im wesentlichen reinen Galactoprotein b3 immunisiert worden ist, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten- NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natrlumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen.

22. Ein monoklonaler Antikörper, der kompetitiv die Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Antikörper von Anspruch 19 und Galactoprotein b3 inhibiert.

23. Ein Verfahren zum Nachweis eines Tumors, der zur Expression von Galactoprotein b3 führt, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NIL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen, in Gehalten, die diejenigen übersteigen, die von nicht- transformierten Zellen exprimiert werden, welches die Schritte umfaßt:

(a) Messen des Gehaltes von RNA, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, in aus einem Warmblüter isolierter RNA;

(b) Messen des Gehaltes von RNA, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, in Kontroll-RNA, die aus nicht- transformierten, Galactoprotein b3-exprimierenden Zellen von einem Warmblüter isoliert ist; und

(c) Vergleichen der in den Schritten (a) und (b) gemessenen Gehalte von RNA und dadurch Bestimmen des Vorhandenseins und des Nicht-Vorhandenseins des Tumors.

24. Das Verfahren von Anspruch 23, wobei Schritt (a) des Messens des Gehaltes von RNA, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, umfaßt:

(a) Inkubieren besagter RNA mit einem DNA-Fragment, das in der Lage ist, spezifisch mit RNA zu hybridisieren, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung zu ermöglichen; und

(b) Messen der Menge besagter Hybridisierung.

25. Das Verfahren von Anspruch 23, wobei Schritt (b) des Messens des Gehaltes von RNA, die für Galactoprotein spezifisch ist, in Kontroll-RNA umfaßt:

(a) Inkubieren besagter Kontroll-RNA mit einem DNA- Fragment, das in der Lage ist, spezifisch mit RNA zu hybridisieren, die für Galactoprotein b3 spezifisch ist, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Hybridisierung zu ermöglichen; und

(b) Messen der Menge besagter Hybridisierung.

26. Das Verfahren von Anspruch 24 oder 25, wobei eine Reporter-Gruppe an besagtes DNA-Fragment gebunden ist.

27. Das Verfahren von Anspruch 26, wobei besagte Reporter- Gruppe ein Radioisotop ist.

28. Ein Verfahren zum Nachweis eines Tumors, der zur Expression von Galactoprotein b3 führt, wobei besagtes Protein aus Hamster-Fibroblasten-NTL-Zellen gewonnen werden kann, die mit Polyoma-Virus transformiert sind, und besagtes Protein eine ungefähre relative Molekülmasse von 140.000 besitzt, wie bestimmt mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen, in Gehalten, die diejenigen übersteigen, die von nicht- transformierten Zellen exprimiert werden, welches die Schritte umfaßt:

(a) Inkubieren einer biologischen Probe von einem Warmblüter, wobei bei besagter Probe der Verdacht besteht, daß sie Galactoprotein b3 enthält, mit einem Antikörper, der sich spezifisch an Galactoprotein b3 bindet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um zu ermöglichen, daß sich zwischen diesen Immunkomplexe bilden;

(b) Nachweisen von zwischen besagtem Antikörper und Galactoprotein b3 in besagter biologischer Probe gebildeten Immunkomplexen;

(c) Inkubieren einer biologischen Kontrollprobe, wobei besagte Kontrollprobe von einem Warmblüter stammt, der nicht-transformierte Zellen besitzt, die Galactoprotein b3 exprimieren, mit einem Antikörper, der sich spezifisch an Galactoprotein b3 bindet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um zu ermöglichen, daß sich zwischen diesen Immunkomplexe bilden;

(d) Nachweisen von zwischen besagten Antikörper und Galactoprotein b3 in besagter biologischen Kontrollprobe gebildeten Immunkomplexen; und

(e) Vergleichen der Zahl von Immunkomplexen, die in den Schritten (b) und (d) nachgewiesen sind, und dadurch Bestimmen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins des Tumors.

29. Das Verfahren von Anspruch 28, wobei eine Reporter-Gruppe an einen zweiten Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist, sich an den Antikörper zu binden, und wobei der Nachweis- Schritt (a) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht- gebundenen Antikörper, (b) Inkubieren mit dem zweiten Antikörper unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um es zu ermöglichen, daß sich Immunkomplexe bilden, (c) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht- gebundenen zweiten Antikörper und (d) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins der Reporter-Gruppe umfaßt.

30. Das Verfahren von Anspruch 28, wobei eine Reporter-Gruppe an ein Molekül gebunden ist, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden, und wobei der Nachweis-Schritt (a) Inkubieren mit dem Molekül unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um Bindung an die Immunkomplexe zu ermöglichen, (b) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Molekül und (c) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins der Reporter-Gruppe umfaßt.

31. Das Verfahren von Anspruch 28, wobei eine Reporter-Gruppe an den Antikörper gebunden ist und wobei der Nachweis-Schritt Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Antikörper und danach Nachweisen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins der Reporter-Gruppe umfaßt.

32. Das Verfahren von Anspruch 29, 30 oder 31, wobei die Reporter-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Enzymen, Lumineszeren und Farbstoffteilchen besteht.