DE69101305T2

DE69101305T2 - Verfahren zur behandlung von colostrum durch adsorptionschromatographie über hydroxyapatit und im zellularen milieu colostrum enthaltende aktive fraktion.

Info

Publication number: DE69101305T2
Application number: DE69101305T
Authority: DE
Inventors: Helene Lesur; Jean Montreuil; Bernard Quinque; Genevieve Spik; Daniel Thomas
Original assignee: CLAR SARL
Current assignee: Ingredia SA
Priority date: 1990-06-28
Filing date: 1991-06-24
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2011-06-25
Also published as: FR2663816B1; JPH05502946A; WO1992000014A1; EP0489884B1; EP0489884A1; FR2663816A1; DE69101305D1; JPH087201B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Kolostrum, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung einer Fraktion des Kolostrums, die besonders reich an Wachstumsfaktoren und frei von Proteasen ist. Die Erfindung betrifft sowohl das Verfahren zur Behandlung von Kolostrum als auch die Fraktion des Kolostrums, die man mit diesem speziellen Verfahren erhält. Sie betrifft ferner die Verwendung einer Fraktion des Kolostrums, die reich an Wachstumsfaktoren und arm an Proteasen ist, im folgenden als aktive Fraktion bezeichnet, in Kulturmedien.

STAND DER TECHNIK

Auf dem Gebiet der Zellkultivierung ist Serum der am häufigsten verwendete Zusatz zur Anregung der Zellproliferation. Diese biologische Flüssigkeit enthält die zur Ernährung, zum Wachstum und zur Zellentwicklung des Organismus erforderlichen Faktoren. Ihre Wirkungsweise ist nur unvollständig bekannt, und ihre Zusammensetzung variiert sehr stark von Charge zu Charge. Zudem handelt es sich um ein Produkt, das Schwankungen in der Verfügbarkeit und im Preis unterliegt. Es werden folglich Serum-Ersatzstoffe gesucht, die sich für die Entwicklung von Zellkulturmedien mit genau definierter Zusammensetzung eignen
Deshalb wurde vorgeschlagen, das Serum durch Milchprodukte zu ersetzen, wie z.B. Fraktionen der Milch oder der Molke von Kühen, beispielsweise gemäß FR-A-2 586 699, durch Milchfraktionen, die aus Bestandteilen bestehen, die ein Molekulargewicht von mindestens etwa 27.000 aufweisen und die frei sind von solchen unlöslichen Lipiden, die durch Ultrazentrifugation entfernt werden können. Derartige Fraktionen werden erhalten, indem eine durch Ultrazentrifugation und Abtrennung erhaltene klare Phase aus Milch, die die löslichen Proteine der Milch enthält, einer Ultrafiltration mit einer Membran unterzogen wird, die eine Ausschlußgrenze von etwa 50 bis 27.000 Dalton aufweist.
Hinsichtlich der Milchprodukte wurde vorgeschlagen, die Molke durch Kolostrum zu ersetzen, bei dem es sich um die Flüssigkeit handelt, die von den Milchdrüsen während einiger Tage nach der Geburt ausgeschieden wird. In US-A- 4 440 860 wird eine Fraktion des Kolostrums als besonders aktiver Wachstumsfaktor beschrieben, die ein Molekulargewicht unter 20.000 und einen isoelektrischen Punkt aufweist, der zwischen 4,4 und 4,8 liegt. Diese Fraktion wird durch Entrahmung, anschließendes Inkontaktbringen des entrahmten Kolostrums während 2 h mit Essigsäure von pH 4,3, durch Zentrifugieren zur Abtrennung des Niederschlags, eine auf dem isoelektrischen Punkt basierende Reinigung, Gelfiltration und gegebenenfalls Konzentrierung durch Elektrophorese erhalten.
Die vorgenannten Verfahren betreffen eine auf dem Molekulargewicht basierende Selektion von Bestandteilen.
Andere Verfahren zielen darauf ab, den Hauptwachstumsfaktor des Kolostrums zu isolieren. Derartige Verfahren sind von Yuen Shing und Michael Klagsbrum in dem Artikel "Purification and Characterization of a Bovine Colostrum- Derived Growth Factor", erschienen in Molecular Endocrinology 87/0335, und von Yuen Shing, Susan Davidson und Michael Klagsbrum in dem Artikel "Purification of Polypeptide Growth Factors from Milk", erschienen in Methods in Enzymology (1987), Band 146, S. 42-48, beschrieben. Nach diesen Autoren ist im Fall des Kolostrums der Kuh BCGF (Bovine Colostrum Growth Factor) der Hauptwachstumsfaktor, der ein Molekulargewicht von etwa 30.000 aufweist, und PDGF (Human Platelet-Derived Growth Factor) beim menschlichen Kolostrum, der ein Molekulargewicht von etwa 20.000 aufweist. Die für die Isolierung des Hauptwachstumsfaktors von Rinderkolostrum in Rede stehenden Verfahren umfassen die nachstehenden Abfolgen von Schritten: Entrahmen, Ausfällen durch Ansäuern oder durch Eindampfen, Ionenaustauschchromatographie und Chromatographie mit isoelektrischer Fokussierung; ein entsprechendes anderes Verfahren umfaßt Entrahmen, Filtrieren, Ionenaustauschchromatographie und Chromatographie mit isoelektrischer Fokussierung, wobei auf diesen Schritt in beiden Verfahren eine Trennung durch RP-HPLC folgt. Bei diesen Verfahren liegt die erzielte Ausbeute an Wachstumsfaktoren in der Größenordnung von 1 %, d.h., während der Durchführung der verschiedenen Schritte sind 99 % der ursprünglichen Aktivität an Wachstumsfaktoren des Kolostrums verlorengegangen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Aufgabe, die sich die Anmelderin gestellt hat, unterscheidet sich von den Aufgaben, die bei den vorerwähnten Verfahren verfolgt wurden. Unter einem ersten Aspekt wird angestrebt, eine Fraktion des Kolostrums zu gewinnen, die mit Wachstumsfaktoren angereichert ist, ohne daß jedoch eine besondere Reinigung des Hauptwachstumsfaktors durchgeführt wird, und die zusätzlich arm an Proteasen ist.
In diesem Zusammenhang wurde von der Anmelderin festgestellt, daß durch die Gegenwart von Proteasen, bei denen es sich um Proteine hydrolysierende Enzyme handelt, eine gute zeitliche Konservierung von an Wachstumsfaktoren angereicherten Fraktionen des Kolostrums verhindert und zusätzlich ein fortschreitendes Absinken der Aktivität der oben genannten Fraktionen bewirkt wird.
Die obige Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren in vollem Umfang gelöst. Dieses Verfahren zur Behandlung von Kolostrum umfaßt in an sich bekannter Weise mindestens einen Chromatographieschritt mit Kationenaustausch. Erfindungsgemäß wird der Teil des Kolostrums, der durch die Elution vom Kationenaustauscher gewonnen wurde, einer Adsorptionschromatographie an Hydroxylapatit unterzogen, und die am Hydroxylapatit zurückgehaltene Fraktion wird durch Elution zurückgewonnen.
Hydroxylapatit ist bekanntermaßen ein kristallisiertes Tricalciumphosphat, das als Träger zur Adsorption zur Fraktionierung von Proteinen verwendet wird.
Es ist das Verdienst der Erfinder, daß experimentelle Untersuchungen durchgeführt wurden und daß nachgewiesen wurde, daß durch die Verwendung von Hydroxylapatit nicht nur die Anreicherung an Wachstumsfaktoren gelingt, sondern, daß auch die Proteasen aus der so angereicherten Fraktion entfernt werden.
Im einzelnen wird die am Hydroxylapatit zurückgehaltene Fraktion durch Waschen mit einem Phosphatpuffer einer Konzentration von höchstens 500 mM zurückgewonnen.
Beispielsweise wird so verfahren, daß auf ein erstes Waschen des Hydroxylapatits mit einem Phosphatpuffer von etwa pH 6,8 einer Konzentration von höchstens 50 mM ein zweites Waschen mit einem Phosphatpuffer von etwa pH 6,8 einer Konzentration in der Größenordnung von 100 mM folgt. Bei diesem zweiten Waschen wird die an Wachstumsfaktoren angereicherte und an Proteasen arme Fraktion des Kolostrums gewonnen. Vorzugsweise wird diese Fraktion entsalzt, konzentriert und eingefroren oder beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Zerstäubung getrocknet.
Vorteilhafterweise wird, wenn ein Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen verwendet wird, der vom Kationenaustauscher verdrängte Teil des Kolostrums nach einem ersten Waschen des Kationenaustauschers mit einer höchstens 0,1 M Natriumacetatlösung und einem Waschen des Kationenaustauschers mit einer etwa 0,5 M Natriumacetatlösung erhalten.
Es ist von Vorteil, wenn vor der Kationenaustausch-Chromatographie nur ein Verfahrensschritt durchgeführt wird, der eine Entrahmung darstellt, durch die der Fettgehalt des Kolostrums auf höchstens 2 g/l gesenkt wird.
Nach der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Kolostrum nacheinander folgenden Verfahrensschritten unterzogen:
a. Entrahmung, durch die der Fettgehalt auf höchstens 2g/l gesenkt wird,
b Aufgeben des entrahmten Kolostrums auf einen Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen,
c. erstes Waschen des Kationenaustauschers mit einer höchstens 0,1 M Natriumacetatlösung,
d. zweites Waschen des Kationenaustauschers mit einer ungefähr 0,5 M Natriumacetatlösung,
e. Aufgeben des entsalzten und konzentrierten Teils vom zweiten Waschen (d) auf den Hydroxylapatit, der mit etwa 10 mM Phosphatpuffer äquilibriert wurde,
f. erstes Waschen des Hydroxylapatits mit einem Phosphatpuffer von etwa PH 6,8 und einer Konzentration von höchstens 50 mM,
g. zweites Waschen des Hydroxylapatits mit einem Phosphatpuffer von etwa PH 6,8 und einer Konzentration von etwa 100 mM,
h. Entsalzen, Konzentrieren und Einfrieren oder Trocknen des bei dem zweiten Waschen (g) erhaltenen Teils, welcher der aktiven Fraktion entspricht.
Die so erhaltene aktive Fraktion aus Kolostrum, die sog. aktive Fraktion, enthält mehr als 50 % der Gesamtheit der Wachstumsfaktoren des ursprünglichen Kolostrums und ist weitgehend frei von Proteasen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, Zellkulturmedien zu schützen, die die aktive Fraktion als Zusatz zur Stimulierung der Zellproliferation enthalten. In diesem Zusammenhang lassen sich folgende Zellarten nennen: Eukaryoten, unter anderem Fibroblasten, Hybridomzellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Hepatocyten, Lymphocyten, Makrophagen, Adipocyten, blutbildende Zellen, Granulo-monocyten, Herzmuskelzellen, Nervenzellen, Muskelzellen, Hautzellen, Keratinocyten, Melanocyten, Chondrocyten und Insektenzellen.
Von besonderem Interesse ist ein Zellkulturmedium, das Kälberfetalserum und die aktive Fraktion enthält. Die kombinierte Wirkung der aktiven Fraktion und des Serums ermöglicht in sehr erheblichem Umfang eine Verringerung der Menge an Serum, die für ein entsprechendes Zellwachstum gebraucht wird. Die aktive Fraktion kann auch auf anderen Gebieten7 insbesondere auf den Gebieten der Pharmazie und der Kosmetik, verwendet werden.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORN DER ERFINDUNG

Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen deutlicher aus der folgenden Beschreibung hervor, die sich auf ein Beispiel zur Behandlung von Kolostrum an Hydroxylapatit bezieht.
Der Begriff Kolostrum bezeichnet ein Gemisch von Milchabsonderungen und von Bestandteilen des Blutserums, das während sieben Tagen nach der Geburt (post partum) erhalten wird. Es stammt von Kühen oder anderen Säugern.
Es wird vom Kolostrum der Kuh ausgegangen, das einer Entrahmung durch Zentrifugation bei 7900 min&supmin;¹ unterzogen wird, um den größten Teil des Fettes zu entfernen. Ohne weitere Vorbehandlung wird ein Liter entrahmtes Kolostrum, das einen Fettgehalt unter 2 g/l aufweist, mit 15 g eines Kationenaustauscherharzes mit Sulfonsäuregruppen, im Handel unter der Bezeichnung SP-Sephadex C-50 (Pharmacia), in Kontakt gebracht. Der pH-Wert beträgt 6,3. Das Inkontaktbringen findet unter Rühren während einer Dauer von mindestens 4 h bei 4 ºC statt.
Der in dem Bad verbleibende Teil des entrahmten Kolostrums enthält all die Bestandteile, die nicht von den Sulfonsäuregruppen des Harzes zurückgehalten worden sind. Dieser Teil des Kolostrums ist im wesentlichen frei von Wachstumsfaktoren. Er ist dennoch aufgrund der Tatsache von Bedeutung, daß er neben anderen Bestandteilen reich ist an Immunglobulinen des Kolostrums, Zuckern, Enzymen und Peptonen aus dem Albuminabbau. Er kann als solcher oder nach Abtrennung der oben genannten Bestandteile verwendet werden.
Nach Entfernen des Bades wird das Harz zunächst mit einer 0,1 M Natriumacetatlösung gewaschen. Dieses erste Waschen hat die Entfernung der Bestandteile von der Oberfläche des Harzes zum Ziel, die nicht wirklich durch Ionenaustausch an den Sulfonsäuregruppen zurückgehalten worden sind.
Anschließend wird das Harz einem zweiten Waschen mit einer 0,5 M Natriumacetatlösung unterzogen. Dieses Waschen bewirkt die Verdrängung eines Teils der Bestandteile des Kolostrums, die durch Ionenaustausch an den Sulfonsäuregruppen des Harzes zurückgehalten wurden. Diese Verdrängung hängt von verschiedenen Parametern wie der jeweiligen Affinität der Bestandteile zu den Sulfonsäuregruppen, der Austauschkinetik und von sterischen Effekten ab.
Anschließend wird das Harz einem dritten Waschen mit einer 1,0 M Natriumacetatlösung unterzogen.
Die zwei Waschlösungen mit 0,5 bzw. 1,0 M Natriumacetat werden durch Ultrafiltration, Dialyse, Elektrodialyse bzw. mit Molekularsieben entsalzt und anschließend durch Ultrafiltration mit einer Ausschlußgrenze bei einer Molekülmasse von 5.000 aufkonzentriert.
Eine vergleichende Analyse des ursprünglichen entrahmten Kolostrums und der beiden Fraktionen, von denen die eine durch Waschen mit 0,5 M, die andere durch Waschen mit 1,0 M Natriumacetatlösung erhalten wurde, zeigt einerseits, daß sich mehr als 80 % der im entrahmten Kolostrum enthaltenen Wachstumsfaktoren in den beiden Fraktionen befinden, und andererseits, daß die Fraktion, die beim Waschen mit der 0,5 M Natriumacetatlösung erhalten wird, 73,2 % der im entrahmten Kolostrum vorhandenen Wachstumsfaktoren enthält. Diese Fraktion enthält ferner neben anderen Verbindungen Lactoperoxidase, Lactotransferrin, Lysozym und Proteasen.
Die folgende Tabelle I gibt die Ergebnisse zum Vergleich des entrahmten Kolostrums (A) und der mit 0,5 M Natriumacetatlösung eluierten Fraktion. Tabelle I (A) entrahmtes Kolostrum (B) mit 0,5 M Natriumacetatlösung eluierte Fraktion Proteine, gesamt (mg) Gesamtaktivität (U) spezifische Aktivität (U/mg) Aktivitätsausbeute (%)
Der Proteingehalt wurde nach der von Peterson modifizierten Technik von Lowry bestimmt. Die Einheit U des Wachstumsfaktors, die auch als mitogene Aktivität bezeichnet wird, entspricht der Proteinmenge, die benötigt wird, um den Einbau von tritiumhaltigem Methylthymidin in einer Menge hervorzurufen, die halb so groß ist wie die maximal einbaubare Menge.
Diese Fraktion (B) wird entsalzt und aufkonzentriert und anschließend auf eine zuvor in einem 10 mM Phosphatpuffer von pH 6,8 äquilibrierte Hydroxylapatit-Säule gegeben. Die Menge an Hydroxylapatit, der in Form eines Gels vorliegt, wird unter Berücksichtigung der in der Fraktion vorhandenen Menge an Proteinen so festgelegt, daß höchstens 40 mg Proteine pro Milliliter des Hydroxylapatitgels enthalten sind.
Anschließend wird die Hydroxylapatit-Säule nacheinander mit drei Phosphatpufferlösungen von pH 6,8 mit steigender Konzentration eluiert, von denen die erste eine Konzentration von 50 mM, die zweite von 100 mM und die dritte von 500 mM aufweist.
Jede der so erhaltenen Fraktionen wird entsalzt, konzentriert und gefriergetrocknet. Die 50-mM- und die 500-mM- Fraktion enthalten fast die gesamte Menge an Proteasen. Nur die 100-mM-Fraktion ist im wesentlichen frei von Proteasen.
Die zweite, sog. aktive Fraktion, die bei der Elution mit der 100-mM-Lösung entsteht, ist als einzige Fraktion an Wachstumsfaktoren angereichert.
In der folgenden Tabelle II werden die in Tabelle I gegebenen Ergebnisse durch Informationen vervollständigt, die sich auf die oben genannte wirksame Fraktion (C) beziehen. Tabelle II (A) entrahmtes Kolostrum (B) Ionenaustausch Elution mit der 0,5-M-Lösung (C) Hydroxylapatit Elution mit der 0,1-M-Lösung Proteine, gesamt (mg) Gesamtaktivität (U) spezifische Aktivität (U/mg) Aktivitätsausbeute (%)
Im Vergleich zum entrahmten Kolostrum (A) weist die aktive Fraktion (C) eine sehr große spezifische Aktivität auf.
Es wurde dann ein Vergleich der aktiven Fraktion mit Kälberfetalserum durchgeführt, das den gängigsten Zusatz zur Anregung der Zellproliferation darstellt. Hierfür wurde ein Test verwendet, bei dem der Einbau von tritiumhaltigem Thymidin zur Detektion der jeweiligen mitogenen Aktivität bei dem Fibroblastenstamm CCL 39 verwendet wird. Aus diesem Vergleich geht hervor, daß die spezifische Aktivität der aktiven Fraktion (117,6 U/mg Proteine) deutlich größer ist als die spezifische Aktivität des Kälberfetalserums (15 U/mg Proteine) . Dies stellt insofern einen echten Vorteil der aktiven Fraktion dar, als häufig eine nachträgliche Entfernung der Proteine notwendig ist, die mit dem Zusatz zugeführt wurden. Bei der aktiven Fraktion ist die zu entfernende Menge an Proteinen klein.
Die aktive Fraktion kann entweder als Ersatz für das Kälberfetalserum oder in Kombination damit in Zellkulturmedien, beispielsweise in einem MEM-Medium (essentielles Minimalmedium von Eagle) mit einem Zusatz von 2,2 g/l Natriumcarbonat, 1 Vol.-% Glutamin, 0,4 Vol.-% Penicillin und 0,4 % Streptomycin und 0,5 Vol.-% Fungizon verwendet werden.
Die aktive Fraktion wurde als Wachstumszusatz zur Ergänzung des Kälberfetalserums in einem Kulturmedium für Fibroblasten CCL 39 verwendet. Die gegebenenfalls zuvor mit Fibronectin behandelten Kulturplatten werden mit 160.000 Zellen und 2 ml Medium pro Vertiefung beimpft, wobei dieses Medium eine bestimmte Menge der aktiven Fraktion enthält.
Die Zugabe von 1 Vol.-% Kälberfetalserum und 1 Vol.-% aktiver Fraktion (enthält 1 g/l Proteine) zu einem Kulturmedium für Fibroblasten ermöglicht beispielsweise die Erzielung eines Zellwachstums, das dem mit etwa 9 Vol.-% Kälberfetalserum in dem gleichen Medium erhaltenen Zellwachstum entspricht.
Die Erfindung ist nicht auf die beispielhaft beschriebene Ausführungsform beschränkt. Die beanspruchten Behandlungsbedingungen sind nicht auf die beschriebenen Bedingungen beschränkt; andere Typen von Kationenaustauschern mit anderen Harzen können ebenso verwendet werden wie Kationenaustauscher, die andere Gruppen als Sulfonsäuregruppen aufweisen. Das Verdrängen des an dem Kationenaustauscher zurückgehaltenen Teils des Kolostrums gelingt nach jedem üblichen Verfahren zur Regenerierung des oben genannten Kationenaustauschers, und der geeignete Ablauf wird von Fall zu Fall bestimmt.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung von Kolostrum, das zumindest einen Chromatographieschritt mit Kationenaustausch umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß man den Teil des Kolostrums, der durch die Elution vom Kationenaustauscher gewonnen wurde, einer Adsorptionschromatographie an Hydroxylapatit unterwirft und die am Hydroxylapatit zurückgehaltene Fraktion durch Elution gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die am Hydroxylapatit zurückgehaltene Fraktion durch Waschen mit einem Phosphatpuffer einer Konzentration von höchstens 500 mM zurückgewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß so verfahren wird, daß auf ein erstes Waschen des Hydroxylapatits mit einem Phosphatpuffer einer Konzentration von höchstens 50 mM ein zweites Waschen mit einem Phosphatpuffer einer Konzentration in der Größenordnung von 100 mM folgt, wobei der bei diesem zweiten Waschschritt gewonnene Teil der aktiven Fraktion entspricht, die an Wachstumsfaktoren angereichert und arm an Proteasen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Fraktion entsalzt, konzentriert und eingefroren oder getrocknet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines Kationenaustauschers mit Sulfonsäuregruppen der vom Kationenaustauscher gewonnene Teil des Kolostrums nach einem ersten Waschen des Kationenaustauschers mit einer höchstens 0,1 M Natriumacetatlösung und einem Waschen des Kationenaustauschers mit einer eta 0,5 M Natriumacetatlösung erhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Kationenaustausch-Chromatographie nur einen Verfahrensschritt mit dem Kolostrum durchführt, der eine Entrahmung darstellt, durch die der Fettgehalt des Kolostrums auf höchstens 2 g/l gesenkt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kolostrum nacheinander folgenden Verfahrensschritten unterzogen wird:

a. Entrahmung, durch die der Fettgehalt auf höchstens 2 g/l gesenkt wird,

b. Aufgeben des entrahmten Kolostrums auf einen Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen,

c. erstes Waschen des Kationenaustauschers mit einer höchstens 0,1 M Natriumacetatlösung,

d. zweites Waschen des Kationenaustauschers mit einer ungefähr 0,5 M Natriumacetatlösung,

e. Aufgeben des entsalzten und konzentrierten Teils vom zweiten Waschen (d) auf den Hydroxylapatit, der mit ungefähr 10 mM Phosphatpuf fer äquilibriert wurde,

f. erstes Waschen des Hydroxylapatits mit einem Phosphatpuffer von etwa pH 6,8 und einer Konzentration von höchstens 50 mM,

g. zweites Waschen des Hydroxylapatits mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 6,8 und einer Konzentration von ungefähr 100 mM,

h. Entsalzen, Konzentrieren und Einfrieren oder Trocknen des bei dem zweiten Waschen (g) erhaltenen Teils, welcher der aktiven Fraktion entspricht.

8. Aktive Fraktion aus Kolostrum, die nach dem Verfahren nach Anspruch 3 oder 7 erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, daß sie mehr als 50 % der Wachstumsfaktoren des ursprünglichen Kolostrums enthält und weitgehend von Proteasen befreit ist.

9. Zellkulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß es die aktive Fraktion nach Anspruch 8 als Zusatz enthält, um die Zellproliferation anzuregen.

10. Zellkulturmedium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es für Zellkulturen von Eukaryoten, insbesondere Fibroblasten, Hybridomzellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Hepatocyten, Lymphocyten, Makrophagen, Adipocyten, blutbildenden Zellen, Granulo-monocyten, Herz muskelzellen, Nervenzellen, Muskelzellen, Hautzellen, Keratinocyten, Melanocyten, Chondrocyten und Insektenzellen vorgesehen ist.