1. TECHNISCHES GEBIET
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Diese Erfindung betrifft Analoge von Huperzin A, wie in Anspruch 1 definiert.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Huperzin A, ein Lycopodium-Alkaloid, wurde aus der Pflanze Huperzia serrata
rein dargestellt. Es konnte nachgewiesen werden, dass es das Cholinesterase-Enzym
hemmt, und man hat es daher Untersuchungen im Hinblick auf die Behandlung von
Erkrankungen des cholinergischen Systems unterzogen. So wird Huperzin A
beispielsweise untersucht im Hinblick auf eine Behandlung von Myasthenia gravis, der
Alzheimer-Krankheit sowie auf eine Verbesserung des altersbedingten
Gedächtnisverlustes. Siehe J. Liu, et al., The Structures of Huperzin A und B. Two New Alkaloids
Exhibiting Marked Anticholinesterase Activity, Can. J. Chem., 64, S. 837-839 (1986).
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die Verbindungen entsprechend dieser Erfindung können über die Synthese
eines verbrückten, kondensierten Ring-Pyridins mit der nachstehenden allgemeinen
Formel I dargestellt werden:
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wobei das Verfahren die nachgenannten Schritte umfaßt
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(A) Herbeiführen des Kontakts zwischen einem kondensierten Ring-
Pyridin mit der allgemeinen Formel II:
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und einer ungesättigten Kohlenstoff-Brücke mit der allgemeinen Formel III:
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in einem geeigneten Lösemittel, das einen Katalysator auf Aminbasis mit einem pKa-
Wert von ca. 11 bis ca. 20 aufweist, um das verbrückte, kondensierte Ring-Pyridin mit
der allgemeinen Formel I zu bilden;
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dadurch gekennzeichnet, dass:
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R¹&sub1; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkoxy;
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R²&sub1; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder verzweigtem
Alkyl;
-
R³&sub2; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
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R¹&sub3; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkoxy;
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R²&sub3; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder verzweigtem
Alkyl;
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R³&sub3; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
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n&sub1; eine ganze Zahl zwischen 0 und 4 ist; und
-
n&sub2; eine ganze Zahl zwischen 0 und 4 ist;
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mit der Maßgabe, dass:
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R²&sub1; = R²&sub3;; R¹&sub1; = R¹&sub3;; R³&sub2; = R³&sub3; und n&sub1; = n&sub2;.
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Das verbrückte, kondensierte Ring-Pyridin mit der allgemeinen Formel I kann
umgewandelt werden in die Verbindung mit der allgemeinen Formel IV, die Huperzin A
sowie die Analoge von Huperzin A der hier beschriebenen Erfindung umfasst:
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dadurch gekennzeichnet, dass:
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R³&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup4;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearen oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup5;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup6;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup7;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
n&sub3; eine ganze Zahl zwischen 0 und 4 ist;
-
p gleich 0 oder 1 ist;
-
eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen
14 und 15 oder eine Doppelbindung zwischen
den Kohlenstoffen 8 und 15 darstellt;
-
mit der Maßgabe, dass: R³&sub2; = R³&sub3; = R³&sub4;.
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Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel IV sind in der Lage, die
Cholinesterase-Enzyme zu inhibieren.
4. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
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Es ist festzuhalten, dass die in dieser Erfindung verwendeten allgemeinen
Formeln keine Stereochemie implizieren; alle Stereoisomere sind in den einzelnen
allgemeinen Formeln enthalten.
4.1 Darstellung des kondensierten Ring-Pyridins
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Das kondensierte Ring-Pyridin mit der allgemeinen Formel II kann hergestellt
werden unter Anwendung von SCHEMA 1, das im folgenden noch beschrieben wird.
Ausgangsmaterial ist ein monogeschütztes Diketon 1. Dieses monogeschützte Diketon 1
wird mit Pyrrolidin zur Reaktion gebracht, und das resultierende Enamin wird mit
Acrylamid erhitzt, um das Lactam 2 zu gewinnen. Das Zwischenprodukt Lactam wird
sodann anhand eines Dehydrierungsverfahrens zum Pyridon 3 umgewandelt. Als
nächstes wird dieses Pyridon an Sauerstoff alkyliert, um das Alkoxypyridin-Derivat 4
(R¹ = OR) hervorzubringen. Nun wird die Keton-Carbonyl-Gruppe deprotektiert, und es
wird eine α-Carboalkoxylierungs-Reaktion durchgeführt, um das β-Ketoester-Material 5
zu erhalten, das einem Molekül mit der allgemeinen Formel II entspricht.
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Pyridon 3 kann auch in ein kondensierter Ring-Pyridin der allgemeinen Formel II
(oder 5) mit R¹ = H konvertiert werden, indem man die Pyridon-Carbonyl-Gruppe aus 3
zu Hydroxyl reduziert und einen Dehydrierungsschritt anschließt. Die Eliminierung der
Ketal-schützenden Gruppe sowie eine Carboalkoxylierungs-Reaktion liefern dann II
(oder 5) mit R¹ = H.
SCHEMA I
4.2 Umwandlung des verbrückten, kondensierten Ring-Pyridins in
Huperzin A und Analoge von Huperzin A
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Das verbrückte, kondensierte Ring-Pyridin mit der allgemeinen Formel I kann
umgewandelt werden in eine Verbindung mit der allgemeinen Formel IV, die Huperzin
A und die Analoge von Huperzin A dieser Verbindung umfasst:
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dadurch gekennzeichnet, dass:
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R³&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
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R&sup4;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup5;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup6;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup7;&sub4; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
n&sub3; eine ganze Zahl zwischen 0 und 4 ist;
-
p gleich 0 oder 1 ist;
-
eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen
14 und 15 oder eine Doppelbindung zwischen
den Kohlenstoffen 8 und 15 darstellt;
-
mit der Maßgabe, dass: R³&sub2; = R³&sub3; = R³&sub4;.
-
Da Huperzin A die bevorzugte zu synthetisierende Verbindung ist, gilt
vorzugsweise:
-
R³&sub4; entspricht CH&sub3;;
-
R&sup4;&sub4; entspricht CH&sub3;;
-
R&sup5;&sub4; entspricht H;
-
R&sup6;&sub4; entspricht H;
-
R&sup7;&sub4; entspricht H;
-
n&sub3; ist 1;
-
p ist 0;
-
stellt eine Doppelbindung zwischen Kohlenstoff 8
und Kohlenstoff 15 dar;
-
Von dieser bevorzugten Ausführungsart wird das E-Stereoisomer mit der
allgemeinen Formel IV, die für Huperzin A steht, besonders bevorzugt.
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Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel IV lassen sich unter Anwendung
von SCHEMA II herstellen, das im folgenden noch beschrieben wird.
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Das verbrückte, kondensierte Ring-Pyridin 6 wird durch verschiedene
Dehydrierungsbedingungen in das verbrückte Keton 7 umgewandelt. Der Alkohol wird
vorzugsweise aktiviert zum Zwecke seiner Eliminierung durch Umwandlung in sein
Mesylat-Derivat, welches dann in Natriumacetat und Essigsäure erhitzt wird, um das
verbrückte Keton 7 zu ergeben.
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Das verbrückte Keton 7 wird dann mit dem gewünschten Alkylidenphosphoran
(Ph&sub3;P = CHR&sup4;, worin R&sup4; für H steht oder für ein C&sub1;-C&sub8; lineares oder verzweigtes Alkyl) in
einem geeigneten Lösemittel, z. B. Tetrahydrofuran oder Ether, zur Reaktion gebracht,
um das Olefin 8 zu ergeben (Hinweis: wo R&sup4; für ein Alkyl steht, bildet sich ein cis/trans-
Gemisch). Um das Olefin-Produkt mit überwiegender E-Stereochemie zu erhalten, kann
eine thermische Isomerisations-Reaktion unter Einsatz von Thiophenol und
Azoisobutyronitril (AIBN) durchgeführt werden, um Ester 9 zu bilden.
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Die Umwandlung von Ester 9 in das Urethan-Derivat 10 lässt sich dann über
einen normalen Curtius-Abbau herbeiführen, der die folgenden Schritte umfasst:
Hydrolyse des Esters, um die entsprechende Säure zu erhalten, Umwandlung der Säure
in ein Säurechlorid und anschließendes Erwärmen des Säurechlorids mit Natriumazid
und dann mit Methanol.
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Das Urethan 10 kann dann überführt werden in Amin 11 (Huperzin A, wenn R³ =
R&sup4; = CH&sub3; und n = 1), indem eine Abspaltung sowohl der Alkyl-Gruppe R¹ (mit R¹ = OR)
als auch der Carbomethoxy-Gruppe bewirkt wird durch Herbeiführen einer Reaktion
zwischen Urethan 10 und einem Dealkylierungsmittel, z. B. Trimethylsilyliodid.
In den Fällen, wo in den begleitenden Strukturen R¹ gleich H ist, wird der Pyridin-Ring
aus dem Pyridon-Ring anhand eines Verfahrens gewonnen, das die Bildung von Pyridin-
N-Oxid impliziert, und zwar durch Einsatz einer Persäure, Behandlung mit
Essigsäureanhydrid und anschließender Säurehydrolyse [M. Katada, J. Pharm. Soc. Japan, 67, S. 51
(1947)]. Dieser Umwandlungsschritt wird am besten vor der TMSI-geförderten Spaltung
des Urethans durchgeführt und kann bei Bedarf zu einem früheren Zeitpunkt erfolgen.
Die ein oder andere Abwandlung kann notwendig werden, um zu vermeiden, dass es
zwischen einer Olefin-Epoxidation und/oder einer Oxidation der azyklischen Amino-
Gruppe zum Wettstreit kommt.
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Um die N-alkyl-amino-substituierten Derivate 13 von Huperzin A zu erhalten,
wird die Carbomethoxy-Gruppe von 10 durch Basenhydrolyse entfernt und wird das
resultierende freie Amin in der Folge alkyliert, um R&sup5; und R&sup6; oder R&sup5; alleine
einzuführen. Es wird ein geeignetes Alkylhalogenid oder Tosylat oder ein reduktives
Aminierungsverfahren zu Hilfe gezogen, um diese Gruppen einzuführen. Schließlich
wird das Alkoxypyridin-Zwischenprodukt 12 (mit R¹ = OR) an das Pyridon 13 durch O-
Dealkylierung unter Einsatz eines Reaktionsmittels wie TMSI angespalten.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist das Pyridin-Zwischenprodukt 12 mit der
allgemeinen Formel V:
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dadurch gekennzeichnet, dass:
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R¹&sub5; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkoxy;
-
R³&sub5; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup4;&sub5; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup5;&sub5; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
R&sup6;&sub5; ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend H und C&sub1;-C&sub8; bei linearem oder
verzweigtem Alkyl;
-
n&sub4; eine ganze Zahl zwischen 0 und 4 ist;
-
p gleich 0 oder 1 ist;
-
eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen
14 und 15 oder eine Doppelbindung
zwischen den Kohlenstoffen 8 und 15 darstellt.
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Da Huperzin A die bevorzugte zu synthetisierende Verbindung ist, gilt
vorzugsweise:
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R¹&sub5; entspricht OCH&sub3;;
-
R³&sub5; entspricht CH&sub3;;
-
R&sup4;&sub5; entspricht CH&sub3;;
-
R&sup5;&sub5; entspricht H;
-
R&sup6;&sub5; entspricht H;
-
n&sub4; ist 1;
-
p ist 0; und
-
stellt eine Doppelbindung zwischen Kohlenstoff 8
und Kohlenstoff 15 dar.
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Von dieser bevorzugten Ausführungsart besonders bevorzugt wird das E-
Stereoisomer mit der allgemeinen Formel V, das sich in Huperzin A umwandeln lässt.
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Um die Huperzin-Analoge 14, die eine Alkyl-Gruppe (R&sup7;) an dem Stickstoff des
Pyridin-Rings aufweisen, zu erhalten, wird das Zwischenprodukt 13 mit einer Base
deprotoniert und wird das resultierende Anion mit R&sup7;X zur Reaktion gebracht, wobei X
für eine geeignete abgehende Gruppe steht wie z. B. Tosylat, Mesylat oder Halogenid.
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Um das Doppelbindungs-Regioisomer 16 von Huperzin A zu erhalten, wird die
Doppelbindung von 7 einer Olefin-Isomerisationsreaktion unter Einsatz eines geeigneten
Metallkatalysators (z. B. Fe(CO)&sub5;, (Ph&sub3;P)&sub4;Ru(MeCN), HCo(CO)&sub4;) unterworfen oder wird
die Doppelbindung von 7 im Markovnikovschen Sinne (H&spplus;, H&sub2;O) hydriert und
anschließend eine Dehydrierungsreaktion durchgeführt.
-
Das Zwischenprodukt 15 wird dann anstelle von 7 in den vorstehenden
Reaktionen eingesetzt, um die Doppelbindungs-Regioisomere von 11, 13 und 14 zu
liefern.
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Gesättigte Analoge 18 von Huperzin A sind leicht zu gewinnen, indem man 6
einem Deoxydierungsverfahren nach Barton unterzieht [wobei der Alkohol in seinen
Thiocarbonylester überführt und eine Zinnhydrid-Reduktion durchgeführt wird; siehe D.
H. R. Barton und W. B. Motherwell, Pure Appl. Chem. 53, 15 (1981)]. Das
Zwischenprodukt 17 durchläuft anschließend Reaktionsschritte, die mit denen identisch sind, die
oben für die Überführung von 7 in 11, 13 oder 14 angesetzt werden, um die gesättigten
Analoge 18 von Huperzin A zu erhalten.
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Die Ein-Kohlenstoff-Homologe 20 von Huperzin A lassen sich aus 9 gewinnen
durch Reduktion von Ester in Alkohol, Umwandlung von Alkohol in Azid und
Reduktion des Azids zu Amin mit LAH, um 19 zu erhalten. Das Alkoxypyridin-
Zwischenprodukt 19 (mit R¹ = OR) wird dann in 20 umgewandelt durch
O-Dealkylierung unter Verwendung eines Reaktionsmittels wie TMSI. Amin-Alkylierungsverfahren
wie die in Verbindung mit der Umwandlung von 10 in 13 und 13 in 14 beschriebenen
können angewandt werden, um das Analog 21 hervorzubringen. Wenn man mit 15
beginnt und eine vergleichbare Folge von Reaktionen wie die bereits beschriebenen
durchführt, beginnend mit einem Wittig-Schritt, kann man Zugriff auf das Homolog 22
gewinnen (ein Doppelbindungs-Regioisomer von 21).
SCHEMA II
5. DIE INHIBIERUNG VON CHOLINESTERASE-ENZYMEN
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Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel N sind in der Lage, die
Cholinesterase-Enzyme zu inhibieren und lassen sich daher als pharmazeutische
Hilfsstoffe für Säugetiere und - insbesondere - Menschen nutzen, um Störungen zu
behandeln, an denen Cholinesterase-Enzyme beteiligt sind, wie z. B. Myasthenia gravis,
die Alzheimer-Krankheit, und um eine Verbesserung des altersbedingten
Gedächtnisverlustes zu erzielen.
-
Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel IV können einem Patienten
entweder alleine oder - vorzugsweise - in Kombination mit pharmazeutisch
annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln, wahlweise mit bekannten Hilfsstoffen
wie z. B. Alum, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung entsprechend der üblichen
pharmazeutischen Praxis verabreicht werden. Die Verbindungen können oral oder
parenteral, hierin eingeschlossen intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan,
verabreicht oder äußerlich angewendet werden.
-
Zum innerlichen Gebrauch lässt sich eine Verbindung mit der allgemeinen
Formel IV beispielsweise in Form von Tabletten oder Kapseln oder als wässrige Lösung
oder Suspension verabreichen. Im Falle von Tabletten für den innerlichen Gebrauch
zählen Lactose und Maisstärke zu den häufig verwendeten Trägerstoffen und werden
üblicherweise Gleitmittel zugesetzt wie z. B. Magnesiumstearat. Im Falle von Kapseln
für den innerlichen Gebrauch zählen zu den brauchbaren Verdünnungsmitteln Lactose
und getrocknete Maisstärke. Werden wässrige Suspensionen für den innerlichen
Gebrauch benötigt, dann wird der Wirkstoff mit Emulgatoren und suspendierenden
Hilfsmitteln kombiniert. Bei Bedarf können bestimmte Süßstoffe und/oder
Geschmacksstoffe zugesetzt werden. Für die intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane und
intravenöse Verabreichung werden üblicherweise sterile Lösungen des Wirkstoffes
zubereitet wobei der pH-Wert dieser Lösungen angemessen berichtigt und gepuffert
werden sollte. Für die intravenöse Verabreichung sollte die Gesamtkonzentration der
gelösten Stoffe kontrolliert werden, um die Präparate isotonisch zu machen.
-
Wird eine Verbindung entsprechend der allgemeinen Formel IV bei einem
Menschen eingesetzt, so wird die Tagesdosis normalerweise von dem verschreibenden
Arzt festgelegt, wobei sich die Dosierung im allgemeinen nach dem Alter, dem Gewicht
und dem subjektiven Ansprechen des Patienten auf das Mittel sowie nach dem
Schweregrad der Symptome des Patienten richtet. In den meisten Fällen jedoch wird
eine wirksame Tagesdosis in dem Bereich zwischen ca. 0,05 mg/kg bis ca. 1 mg/kg
Körpergewicht liegen, vorzugsweise zwischen 0,1 mg/kg und ca. 0,5 mg/kg
Körpergewicht, verabreicht als Einzeldosis oder in mehreren Gaben über den Tag verteilt. In
einigen Fällen jedoch kann es sich als notwendiger weisen, Dosierungen außerhalb
dieses Rahmens zu wählen.
BEISPIELE
-
Es ist zu beachten, dass die den benannten Verbindungen nachgestellten Zahlen
auf die benummerten Verbindungen aus SCHEMA I und SCHEMA II verweisen.
Ebenso gilt, dass die in den Beispielen genannten Variablen den in den allgemeinen
Formeln enthaltenen Variablen entsprechen.
6.1 BEISPIELE I
Synthese von Huperzin A
Herstellung von Lactam 2 (n = 1)
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In einen mit einem Wasserabscheider und einem Kondensator ausgestatteten
500-ml-Rundkolben wurden 25 g (0,16 mol) 1,4-Cyclohexandion-monoethylen-ketal,
27 ml (0,32 mol) Pyrrolidin, 1 g p-Toluensulphonsäure und 250 ml Benzen gegeben. Das
Gemisch wurde refluxiert, bis sich kein Wasser mehr im Wasserabscheider absetzte. Das
Benzen wurde verdampft, und der Rückstand wurde in 250 ml Dioxan gelöst. Zu dieser
Lösung wurden 34 g Acrylamid hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht
refluxiert. Dann wurden 100 ml Wasser zugesetzt, und das Gemisch wurde 12 Stunden
lang refluxiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Dioxan durch
Rotationsverdampfung entfernt, und der wässrige Rückstand wurde mit CHCl&sub3;
extrahiert. Die Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, mit kristallwasserfreiem
MgSO&sub4; getrocknet und dann gefiltert. Nach der Verdampfung des Lösemittels wurde der
Rückstand über Silicagel chromatographiert mit Ethylacetat als Eluierungsmittel. Die
Ausbeute betrug 20 g (59%).
(1.) N-Benzylierung von 2 (n = 1)
-
1,38 g Kaliumhydrid (0,0348 mol) wurde in mehreren Portionen einem Gemisch aus
Lactam 2 und Lactam 3 (4,85 g, 0,023 mol), Benzylchlorid (5,3 ml, 0,0464 mol) und
einer katalytischen Menge von Tetrabutylammoniumiodid in 250 ml trockenem THF
zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter dem Schutz eines
Trocknungsrohres gerührt. Es wurde tropfenweise Wasser zugesetzt, um das
überschüssige KH zu quenschen, und das THF wurde durch Rotationsverdampfung entfernt.
Der wässrige Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Rückstände wurden mit
Kochsalzlösung gewaschen, mit kristallwasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und
anschließend gefiltert. Die Verdampfung des Lösemittels sowie die Reinigung des Rückstandes
mittels Flash-Chromatographie (Ethylacetat) ergaben 6,95 g des N-benzylierten Produkts
(quantitative Ausbeute).
(2.) Dehydrierung des N-benzylierten Produkts
-
N-BuLi (24 ml von 1,6 M n-BuLi in Hexanen, 0,038 mol) wurde einer Lösung von
6,2 ml Diisopropylamin (0,044 mol) in 100 ml trockenem THF bei 0ºC unter N&sub2;
zugesetzt. Die Lösung wurde bei 0ºC 20 Minuten lang gerührt, dann auf -78ºC gekühlt.
Bei -78ºC wurde eine Lösung der vorab bereits genannten Benzyl-geschützten Lactame
(3,80 g, 0,0127 mol) in 100 ml des trockenen THF hinzugefügt. Die Farbe des
Reaktionsgemischs schlug sofort um in dunkles Blau. Nach 2-stündigem Rühren bei -
78ºC wurde eine Lösung von Phenylselenylchlorid (4,87 g, 0,0254 mol) in 20 ml
trockenem THF tropfenweise hinzugegeben, und die resultierende Lösung wurde 15
Minuten lang bei -78ºC gerührt.
-
Die Lösung wurde mit Methanol (20 ml) gequencht und ruhen lassen, bis sie
Raumtemperatur erreicht hatte. Dann wurde die Lösung einem Gemisch aus NaIO&sub4;
(10,88 g, 0,051 mol) in 300 ml H&sub2;O-MeOH-THF (1 : 1 : 1) hinzugefügt. Weitere 100 ml
THF wurden gebraucht, um den Rundkolben zu spülen, und wurden dem vorgenannten
Gemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt.
-
THF und Methanol wurden durch Rotationsverdampfung entfernt, und der
wässrige Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Aufkonzentrierung der
Ethylacetat-Lösung ergab einen roten Sirup. Dieser Sirup wurde in 100 ml MeOH gelöst.
1,8 ml Et&sub3;N (0,0127 mol) wurden hinzugefügt, und die Lösung wurde über Nacht
refluxiert. Eine Aufkonzentrierung und Säulen-Chromatographie (Ethylacetat) lieferten
2,78 g (74%) des N-Benzyl-Derivats von 3 in Form eines roten Sirups.
(3.) Hydrogenolyse des N-Benzyl-Derivats von 3
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Das Benzyl-geschützte Pyridon 4(1,33 g, 4,48 mol) wurde mit Pd(OH)&sub2; (20 Gew.-
%) in Essigsäure unter einem H&sub2;-gefüllten Ballon über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt. Die Lösung wurde gefiltert, und das Lösemittel Essigsäure wurde über Nacht
durch Rotationsverdampfung entfernt. Sodann wurde Toluen zu dem Rückstand
gegeben, und die Lösung wurde erneut verdampft, um die restliche Essigsäure zu
entfernen. Das Rohprodukt (80%) wurde direkt in der nachstehenden
O-Methylierungsreaktion verwendet.
Herstellung von Methoxypyridin 4 (n = 1, R¹ = OCH&sub3;)
-
Das Rohpyridon (80% · 4,48 mmol) wurde zusammen mit einem Gemisch aus
Ag&sub2;CO&sub3; (2-mol-Äquivalent), Iodmethan (10-mol-Äquivalent) und Chloroform (50 ml)
im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Eine Filtration, Aufkonzentrierung
und Gel-Chromatographie über Silicagel (40% Ethylacetat/Hexane als Eluierungsmittel)
lieferten 0,74 g (75% für die beiden Schritte) von Produkt 5.
Herstellung von β-Ketoester 5 (n = 1, R¹ = OCH&sub3;)
-
(1) Das Ketal 4 (1,71 g) wurde über Nacht in 5% HCL-Aceton (1 : 1)
refluxiert. Das Aceton wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, und die wässrige
Schicht wurde mit festem NaHCO&sub3; basisch eingestellt. Das resultierende Gemisch wurde
mit Acetylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung
gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und dann gefiltert. Eine
Aufkonzentrierung und Flash-Chromatographie (30% Ethylacetat/Hexane) lieferten 1,16 g (85%)
des Produkts in Form eines klebrigen Feststoffes.
-
(2) Obiges Keton (1,16 g, 6,55 mmol) in 10 ml Dimethylcarbonat
wurde tropfenweise einem Gemisch aus KH (1,05 g, 26,2 mmol) und 40 ml
Dimethylcarbonat unter Stickstoff bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden
lang refluxiert. Die Reaktion wurde mit Methanol gequenscht, und die Lösung wurde mit
einer gesättigten NH&sub4;Cl-Lösung neutralisiert. Das Methanol wurde durch
Rotationsverdampfung entfernt, und der wässrige Rückstand wurde mit Kochsalzlösung
gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und dann gefiltert. Eine
Aufkonzentrierung und Flash-Chromatographie (20% Ethylacetat/Hexane) lieferten 1,34 g (87%)
von Produkt 5 in fester Form.
Herstellung des verbrückten Additionsprodukts 6
(n = 1, R¹ = OCH&sub3;, R² = R³ = CH&sub3;)
-
Der β-Ketoester 5 (502 mg, 2,15 mmol) wurde mit Methacrolein (1,76 ml,
21,4 mmol) und 1,1,3,3-Tetramethyl-guanidin (54 ul, 0,42 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2;
bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt. Eine Aufkonzentrierung und Flash-
Chromatographie (40% Ethylacetat/Hexane) lieferten 604 mg (93%) des verbrückten
Additionsprodukts 6.
Dehydrierung von Alkohol 6
-
(1) 1,89 ml Mesylchlorid (24,5 mmol) wurden tropfenweise einer
Lösung von Alkohol 6 (1,87 g, 6,13 mmol), Triethylamin (8,46 ml, 61,3 mmol) und
einer katalytischen Menge von 4-N,N-Dimethylaminopyridin in 50 ml trockenem
CH&sub2;Cl&sub2; bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Lösung wurde 6 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt. Dann wurde sie mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit gesättigtem NH&sub4;Cl
gewaschen, getrocknet und aufkonzentriert und ergab 2,26 g (96%) des Rohmesylats.
-
(2) Das Rohmesylat (2,26 g, 5,90 mmol) wurde mit wasserfreiem
NaOAc (0,48 g, 5,9 mmol) in AcOH 24 Stunden lang unter N&sub2; mit 120ºC erhitzt. Die
Acetsäure wurde durch Rotationsverdampfung bei 50ºC entfernt. Der Rückstand wurde
in Ethylacetat gelöst, mit gesättigtem Na&sub2;CO&sub3; und Kochsalzlösung gewaschen und
getrocknet. Eine Verdampfung des Ethylacetats und Flash-Chromatographie des
Rückstandes (20% und dann 40% Ethylacetat/Hexane) lieferten 521 mg (31% oder
47% basierend auf einer 66-%igen Umsetzung) von Produkt 7 in fester Form und 0,76 g
(34%) des Ausgangsmaterials.
Wittig-Reaktion von β-Ketoester 7 (n = 1, R¹ = OCH&sub3;, R² = R³ = CH&sub3;)
-
2,57 ml n-BuLi (3,80 mmol) wurden tropfenweise einem Gemisch aus
Ethyltriphenylphosphonium-bromid (1,59 g, 4,28 mmol) in 15 ml trockenem THF bei
Raumtemperatur unter Stickstoff zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten
lang bei Raumtemperatur gerührt und dann auf 0ºC gekühlt. Diesem Gemisch wurde bei
0ºC das Keton (273 mg, 0,951 mmol) in 5 ml trockenem THF tropfenweise zugesetzt.
Das resultierende Gemisch wurde ruhen lassen, bis es Raumtemperatur angenommen
hatte, und wurde dann bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde
mit Wasser abgebrochen. Das THF wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, und der
wässrige Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurde
mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und aufkonzentriert. Eine
Flash-Chromatographie (10% Ethylacetat/Hexane) ergab 208 mg (73%) von Olefin 8 als ein Gemisch
aus E und Z in einem Verhältnis von 10 : 90.
Isomerisierung des Olefin-Gemischs 8 (n = 1, R¹ = OCH&sub3;, R² = R³ = R&sup4; = CH&sub3;)
-
Das Olefin 8 (79 mg, 0,26 mmol) wurde mit Azoisobutyronitril (87 mg, 0,52
mmol) in 10 ml Thiophenol mit 130ºC unter Stickstoff 24 h lang erhitzt. Die Lösung
wurde gekühlt, mit CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt und mit 10%iger NaOH (5 x) und Kochsalzlösung
gewaschen. Nach dem Trocknen und Aufkonzentrieren wurde das Rohprodukt direkt in
der nachfolgenden Hydrolyse-Reaktion eingesetzt. Eine ¹H NMR-Analyse ergab, dass
Olefin 9 aus einem Gemisch aus E- und Z-Alkene in einem Verhältnis von 80 : 20
besteht.
Herstellung von Carbamat 10 (n = 1, R¹ = OCH&sub3;, R² = R³ = CH&sub3;)
-
Der Rohester (0,26 mmol, E : Z = 80 : 20) wurde in einem 1 : 1-Gemisch aus
20%igem NaOH und THF gelöst. Es wurde MeOH in ausreichender Menge
hinzugefügt, um dieses heterogene Gemisch in ein homogenes Gemisch zu überführen, und
diese Lösung wurde unter Stickstoff 2 Tage lang refluxiert. Das THF und MeOH wurden
durch Rotationsverdampfung entfernt, und der wässrige Rückstand wurde mit CH&sub2;Cl&sub2;
extrahiert. Diese organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen,
getrocknet und anschließend aufkonzentriert und ergaben den unhydrolisierten Z-Ester,
der durch den Isomerisationsschritt wiederverwendet werden kann. Der wässrige
Rückstand wurde mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert 7 eingestellt. Eine Extraktion mit
CH&sub2;Cl&sub2;, Trocknung und Aufkonzentrierung ergaben die Rohsäure, die mittels Säulen-
Chromatographie (20% Ethylacetat/Hexane und dann Ethylacetat) weiter gereinigt
wurde, um 36 mg (61% basierend auf dem E-Ester) reine Säure hervorzubringen.
-
Thionylchlorid (51 u, 0,65 mmol) wurde tropfenweise einer Lösung der Säure
(36 mg, 0,13 mmol) in 5 ml Toluen unter Stickstoff bei Raumtemperatur zugesetzt. Die
Lösung wurde 2 h lang mit 80ºC erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Dann wurde Natriumazid (82 mg, 1,3 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde über
Nacht mit 80ºC erwärmt. Das Toluen wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, es
wurden 5 ml MeOH zugesetzt; und das resultierende Gemisch wurde 8 h lang refluxiert.
Durch Rotationsverdampfung wurde das Methanol entfernt und der Rückstand wurde in
Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und
aufkonzentriert. Eine Flash-Chromatographie (20% Ethylacetat/Hexane) ergab 15 mg
(37%) Urethan 10.
Huperzin A
-
Iodtrimethylsilan (50 ug, 0,35 mmol) wurde tropfenweise einer Lösung des
Carbamat 10 (7 mg, 0,02 mmol) in 2 ml Chloroform unter Stickstoff bei
Raumtemperatur zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht refluxiert. Dann wurde
Methanol (2 ml) zugesetzt, und die Lösung wurde weitere 2 Stunden refluxiert. Eine
Aufkonzentrierung und Flash-Chromatographie über Silica-Gel, das halbgesättigt war
mit Ammonium (3% Methanol in Chloroform), ergaben 4 mg (70%) Huperzin A neben
2 mg (30%) des teilweise deprotektierten Carbamats.
-
Im folgenden sind die Spektraldaten für BEISPIEL 1 aufgeführt:
-
2(Isomer-Verhältnis = 85 : 15): Rf = 0,30 Ethylacetat; IR 2900-3700 (br.), 3211, 3063,
2951, 1676, 1473, 1392, 1340, 1255, 1213, 1126, 1097, 1061, 1020, 993, 947, 920, 733
cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 8,45 (br. S, 0,85H), 7,73 (br. s, 0,15H), 4,83-4,87 (m, 0,85H), 3,90
-4,03 (m, 4H), 1,51-2,56 (vier Gruppen von Multiplets, 9,15H); Massenspektrum
(m/z) 209 (M&spplus;), 123, 86, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub5;NO&sub3; 209,1052, festgestellte
Masse 209,1051.
-
N-Benzyl-Derivat von 2: (Isomer-Verhältnis = 70 : 30): Rf = 0,46 (Ethylacetat); IR
2949, 2889, 1668, 1645, 1496, 1454, 1429, 1396, 1375, 1286, 1192, 1145, 1101, 1061,
1026, 947, 698 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 7,13-7,32 (m, 5H), 5,41 (d, 0,7H, J = 16,1 Hz), 4,84
-4,87 (m, 1,3H), 4,50 (d, 0,7H, J = 16,1 Hz), 3,91-4,03 (m, 4H), 1,58-2,81 (vier
Gruppen von Multiplets, 9,3H); Massenspektrum (m/z) 299 (M&spplus;), 213, 185, 91,
berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;NO&sub3; 299,1521, festgestellte Masse 299,1521.
-
N-Benzyl-Derivat von Pyridin 3: Rf = 0,17 (Ethylacetat); IR 2957, 2887, 1664, 1593,
1545, 1496, 1454, 1419, 1398, 1373, 1269, 1228, 1207, 1167, 1113, 1062, 1028, 947,
862, 827, 733, 702 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 7,06-7,34 (m, 6H), 6,57 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 5,34
(s, 2H), 3,97-4,02 (m, 4H), 2,80 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,73 (s, 2H), 1,83 (t, 2H, J =
6,7 Hz); Massenspektrum (m/z) 297 (M&spplus;), 206, 134, 91, berechnete exakte Masse für
C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub9;NO&sub3; 297,1365, festgestellte Masse 297,1364.
-
3: mp = dec. über 250ºC, IR 2930, 1639, 1620, 1554, 1506, 1464, 1446, 1379, 1269,
1130, 1097, 1061, 1014, 949, 837, 696 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 12,56 (br. s, 1H), 7,14 (d,
1H, J = 9.3 Hz), 6,40 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 4,02 (s, 4H), 2,89 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,71 (s,
2H), 1,93 (t, 2H, J = 6,6 Hz), ¹³C NMR δ 165,0, 143,4, 141,8, 117,3, 111,9, 107,3, 64,6,
36,2, 30,1, 25,7; Massenspektrum (m/z) 207 (M&spplus;), 164, 134, 86, 69, 57, berechnete
exakte Masse für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;NO&sub3; 207,0895, festgestellte Masse 207,0896.
-
4: mp = 77,5-78,5ºC; Rf = 0,48 (40% Ethylacetat in Hexanen); IR 2942, 2885, 1601,
1581, 1478, 1466, 1457, 1429, 1420, 1313, 1259, 1120, 1094, 1061, 1032, 1018. 947,
817 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 7,22 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 6,52 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 4,03 (s, 4H),
3,88 (s, 3H), 3,01 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,89 (s, 2H), 2,01 (t, 2H, J = 6,8 Hz);
Massenspektrum (m/z) 221 (M&spplus;), 148, 134, 64, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub5;NO&sub3;
221.1052, festgestellte Masse 221.1053.
-
Ketone abgeleitet von 4: Rf = 0.44 (40% Ethylacetat in Hexanen); IR 2945, 2916, 2891,
1712, 1604, 1582, 1482, 1430, 1337, 1318, 1309, 1296, 1267, 1195, 1188, 1182, 1166,
1108, 1032, 859, 825 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 7,30 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 6,61 (d, 1H, J = 8,3
Hz), 3,93 (s, 3H), 3,51 (s, 2H), 3,16 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 2,66 (t, 2H, J = 6,9 Hz); ¹³C
NMR δ 209,4, 162,7, 153,5, 138,8, 120,2, 108,8, 53,4, 42,5, 38,0, 30,9; Massenspektrum
(m/z) 177 (M&spplus;), 162, 148, 106, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;NO&sub2; 177.0790,
festgestellte Masse 177.0790.
-
5: Rf = 0,33 (20% Ethylacetat in Hexanen); IR 2954, 2895, 2837, 1641, 1603,
1568, 1477, 1448, 1427, 1317, 1263, 1226, 1116, 1059, 1035, 1016, 941, 918, 825, 785,
640, 625 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 13,16 (s, 1H), 7,90 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 6,56 (d, 1H,
J = 8,7 Hz) 3,91 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 2,94 (t, 2H, J = 8,7 Hz), 6,56 (d, 1H, J = 8,7
Hz), 3,91 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 2,94 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 6,56 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 3,91
5 (S. 3H), 3,90 (s, 3H), 2,94 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 2,63 (t, 2H, J = 7,8 Hz); ¹³C NMR δ
176,7, 171,9, 161,1, 151,1, 136,1, 119,8, 107,2, 98,2, 53,3, 51,7, 29,9, 29,0
Massenspektrum (m/z) 235 (M&spplus;), 203, 148, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub3;NO&sub4;
235.0845, festgestellte Masse 235.0845.
-
6: Rf = 0,30-0,35 (40% Ethylacetat in Hexanen); IR 3100-3600 (br), 2953,
1743, 1603, 1576, 1481, 1423, 1325, 1269, 1155, 1118, 1078, 1034, 983, 827, 758 cm&supmin;¹;
¹H NMR (eines der Isomere) δ 7,02 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 6,60 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 3.91 (s,
3H), 3,81 (s, 3H), 3,62-3,69 (m, 2H), 3,03-3,25 (m, 2H), 2,23 (br. s, -OH), 1,98-
2,04 (m, 2H), 1,48-1,59 (m, 1H), 1,03 (d, 3H, J = 6,4 Hz), Massenspektrum (m/z)
305 (M&spplus;), 273, 248, 188, 55, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub9;NO&sub5; 305.1263,
festgestellte Masse 305.1264.
-
7: Rf = 0,27 (20% Ethylacetat in Hexanen); IR 2947, 1745, 1603, 1576, 1479,
1423, 1327, 1263, 1194, 1138, 1111, 1082, 1024, 831 cm&supmin;¹; ¹H NMR (500 MHz) δ 7,11
(d, 1H, J = 8,6 Hz), 6,62 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 5,42-5,43 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,76 (s,
3H), 3,36-3,42 (m, 2H), 3,18 (d, 1H, J = 18,2 Hz), 3,15 (m, 1H), 2,13 (d, 1H, J =
17,5 Hz), 1,60 (s, 3H), ¹³C NMR δ 207,5, 171,4, 163,2, 150,7, 137,7, 133,6, 126,4,
123,8, 109,6, 60,1, 53,4, 52,7, 46,9, 46,0, 40,4, 22,3; Massenspektrum (m/z) 287 (M&spplus;),
255, 228, 200, 184, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub7;NO&sub4; 287.1158, festgestellte
Masse 287.1157.
-
8: (Z-Olefin); Rf = 0,39 (20% Ethylacetat in Hexanen); IR 2909, 1732, 1601, 1578,
1558, 1475, 1423, 1321, 1252, 1205, 1151, 1111, 1086, 1030, 1003, 902, 827, 735, 638
cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 7,09 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 6,54 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 5,51 (q, 1H, J = 7,3
Hz), 5,40-5,42 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 2,99-3,19 (m, 3H), 2,81 (d, 1H,
J = 16,5 Hz), 2.21 (d, 1H, J = 17,0 Hz), 1,57 (s, 3H), 1,51 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 2,21 (d,
1H, J = 17,0 Hz), 1,57 (s, 3H), 1,51 (d, 3H, J = 7,3 Hz); Massenspektrum (m/z) 299
(M&spplus;), 240, 57, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;NO&sub3; 299.1521, festgestellte Masse
299.1521.
-
Säure aus 9; Rf = (Ethylacetat); IR 2500-3500 (br), 2932, 2594, 1705, 1599, 1578,
1477, 1423, 1379, 1323, 1269, 1128, 1111, 1076, 1030, 956, 908, 823, 777, 760, 735,
681, 646 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 7,25 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 6,57 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 5,40- 5,42
(m, 1H), 5,31 (q, 1H, J = 6,7 Hz), 3,89 (s, 3H), 3,62 (m, 1H), 2,84-3,12 (m, 3H),
2,18 (d, 1H, J = 17,0 Hz); 2,74 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,54 (s, 3H); Massenspektrum
(m/z) 285 (M&spplus;), 240, 84, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub9;NO&sub3; 285.1365, festgestellte
Masse 285.1365.
-
10: Rf = 0,15 (20% Ethylacetat in Hexanen); IR 3331 (br), 2930, 1716, 1597, 1581,
1558, 1522, 1475, 1421, 1321, 1304, 1257, 1103, 1068, 1032, 914, 827, 777, 733 cm&supmin;¹;
¹H NMR δ 7.56 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 6,55 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 5,54-5,56 (m, 1H),
5,36 (q, 1H, J = 6,8 Hz), 4,98 (s, -NH), 3,88 (s, 3H), 3,66 (br. s, 1H), 3,62 (s, 3 H),
3,07 (br. d, 1H, J = 17,4 Hz), 2,82 (dd, 1H, J = 16,7, 1,6 Hz), 2,57 (br. d, 1H. J = 15
Hz), 2,23 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 1,72 (d, 3H. J = 6,8 Hz), 1,51 (s, 3H); Massenspektrum
314 (M&spplus;), 224, 84, 69, berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub3; 314.1630, festgestellte
Masse 314.1630.
-
Synthetisches Huperzin A: Rf = 0,10 (basisches SiO&sub2;, CHCl&sub3;-Aceton-MeOH: 50 : 45 : 5);
IR 3277, 2928, 1655, 1616, 1558, 1458, 1406, 1377, 1306, 1174, 1118, 912, 833, 769,
731, 659 cm&supmin;¹; ¹H NMR δ 12,42 (br. s, Pyridon -NH), 7,90 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 6,42 (d,
1H, J = 9,6 Hz), 5,49 (q, 1H, J = 6,7 Hz), 5,42 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 2,89 (dd, 1 H, J
= 16,8, 5,1 Hz), 2,70 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 2,14 (br. s, 2H), 1,68 (d, 3H, J = 6,6 Hz,
1,61 (br. s. -NH&sub2;), 1,55 (s, 3H); Massenspektrum (m/z) 242 (M&spplus;), 227, 187, 57,
berechnete exakte Masse für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub8;N&sub2;O 242.1419, festgestellte Masse 242.1419.
6.2 BEISPIEL II
Biologische Aktivität von Huperzin A und des 1-Kohlenstoff-Analogs von Huperzin A
-
Ermittelt wurde die Fähigkeit des natürlichen Huperzin A und des synthetisch
hergestellten razemischen Huperzin A sowie der Propyliden-Verbindung (allgemeine
Formel IV, R³&sub4; = CH&sub3;, R&sup4;&sub4; = CH&sub2;CH&sub3;, R&sup5;&sub4; = R&sup6;&sub4; = R&sup7;&sub4; = H, n = 1, p = 0, mit einer
Doppelbindung zwischen Kohlenstoff 8 und Kohlenstoff 15), bei der es sich um das 1-
Kohlenstoff-Analog von Huperzin A handelt, die Cholinesterase-Enzyme zu inhibieren.
VERFAHRENSWEISE
-
Es wurden Ratten durch Abtrennen des Kopfes getötet und die Gehirne wurden
schnell entnommen. Der Cortex wurde auf Eis präpariert entsprechend dem Verfahren
von Glowinski und Iversen. (Siehe J. Neurochem. 13, S. 655 (1966)). Es wurden Proben
auf eiskalter 0,32 M Sucrose homogenisiert. Homogenate wurden mit 1000 · g 10
Minuten lang zentrifugiert, um Zellkerne und schwere Trümmerteilchen zu entfernen.
Der Überstand wurde anschließend abgesaugt und erneut 20 Minuten lang zentrifugiert
(mit 12.000 · g), um ein Pellet zu erhalten (Whittakers P&sub2;-Fraktion), das Synaptosome
und Mitochondrien enthält. Siehe E. G. Grey et al., J. Anatomy, 96, S. 70 (1962). Das
Pellet wurde in 0,32 M Sucrose erneut suspendiert. Ein Teil dieser an Synaptosomen
reichen Fraktion wurde dreifach eiskaltem Krebs-Ringer-Medium, pH 7,4, hinzugefügt.
Eine Untersuchung der Acetylcholinesterase wurde entsprechend dem Verfahren von
Johnson und Russell durchgeführt. Siehe C. D. Johnson et al., Anal. Biochem., 64, S.
229 (1978). Das in der Acetat-Hälfte markierte Acetylcholin wurde enzymatisch
hydrolysiert durch zehnminütige Inkubation bei Raumtemperatur in der Gegenwart oben
erwähnter an Synaptosomen reichen und endogenes Acetylcholinesterase-Enzym
enthaltenden Fraktion. Die Reaktion wurde gestoppt, indem in das Reaktionsfläschchen
ein "Abstoppmittel" gegeben wurde, das Chloracetsäure (1,0 M), Natriumhydroxid
(0,5 M) und Natriumchlorid (0,2 M) enthielt. Anschließend wurde in das
Reaktionsfläschchen eine Szintillations-Flüssigkeit auf Toluen-Basis gegeben, um das freigesetzte
markierte Acetat in die organische Phase zu extrahieren. Unter diesen Bedingungen
verbleibt das unhydrolysierte markierte Acetylcholin unextrahiert in der kleinen
wässrigen Reaktionsmenge, aus der seine schwachen beta-Zerfallsteilchen nicht
flüchten, um den Scintillator anzuregen. Auf diese Weise kann die Probe direkt in
demselben Reaktionsgefäß ausgezählt werden, in dem die Hydrolyse der Probe durch
Acetylcholinesterase stattgefunden hat.
-
Die Inhibierung der Cholinesterase-Aktivität wurde dreimal in Gegenwart einer
großen Bandbreite von Konzentrationen (10-9 bis 10-3 M) bestimmt.
ERGEBNISSE
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst.
TABELLE I AUSMASS DER CHOLINESTERASE-ENZYM-INHIBIERUNG
-
* Je kleiner diese Zahl, desto stärker die Verbindung
-
Wie aus Tabelle I ersichtlich, zeigte synthetisches razemisches Huperzin A einen
IC&sub5;&sub0; von 6 · 10&supmin;&sup7; M. Dieser war dem IC&sub5;&sub0;-Wert des natürlichen Huperzin A (10&supmin;&sup7; M) sehr
ähnlich. Ebenso inhibierte das 1-Kohlenstoff-Analog das Cholinesterase-Enzym, jedoch
in einem weit geringeren Umfang als Huperzin A.