DE69030543T2

DE69030543T2 - Chitin-Oligomer mit endständiger 2,5-Anhydromannitolgruppe und Verfahren zur Herstellung von Chitin- oder Chitosan-Oligomeren

Info

Publication number: DE69030543T2
Application number: DE69030543T
Authority: DE
Inventors: Etsuko Nakao
Original assignee: Tamatsukuri Corp
Current assignee: Tamatsukuri Corp
Priority date: 1989-08-29
Filing date: 1990-08-28
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2010-08-29
Also published as: NO177426C; RU2057760C1; EP0415694B1; NO903757L; DE69030543D1; CA2024115C; US5312908A; CA2024115A1; JPH03163092A; EP0415694A2; JP2871822B2; NO903757D0; EP0415694A3; NO177426B

Description

Chitinoligomer mit endständiger 2,5-Anhydromannitgruppe und Verfahren zur Herstellung von Chitin-Chitosanoligomeren'

Hintergrund der Erfindung

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Chitinoligomers oder eines Chitosanoligomers, in welchem ein Chitosanoligosaccharid, welches eine Mischung aus Chitinoligomeren ist, oder ein Chitosanoligosaccharid, welches eine Mischung aus Chitosanoligomeren ist, in hoher Ausbeute aus Chitin oder Chitosan hergestellt werden können.

Stand der Technik

In den letzten Jahren ist unsere Lebensmittelauswahl immer größer geworden und Krabben und Garnelen werden aus dem Ausland importiert, und aus dem Chitinmaterial ihrer Schalen werden Chitin und Chitosan in großen Mengen hergestellt. Dieses Chitin und Chitosan werden nun selbst zu landwirtschaftlichen Chemikalien, künstlicher Haut, lebenswichtigen (liferelated) Substanzen usw. weiterentwickelt , und zunehmend ziehen Chitinoligosaccharide oder Chitosanoligosaccharide, welche einen noch größeren Wertzuwachs haben, die Aufmerksamkeit auf sich.
Es ist im Stand der Technik bekannt, daß solche Chitinoligosaccharide oder Chitosanoligosaccharide im allgemeinen durch Abbau von Chitin mit Chitinase oder von Chitosan mit Chitosanase hergestellt werden können.
Es ist auch bekannt, daß Chitin und Chitosan mit Salzsäure zwecks Herstellung von N-Acetylchitopentaose oder Chitopentaose aus N-Acetylglucosamin oder Glucosamin teilweise hydrolysiert werden kann.
Andererseits war auch das Verfahren unter Verwendung der Van- Slyke-Methode bekannt, in welchem Stickstoff in Aminoform quantitativ genutzt wird, und in welchem Chitosan durch Zugabe von salpetriger Säure bei einer Temperatur von 20 bis 25ºC zu Chitosan depolymerisiert wird (US-Patent 3 922 260).
Mit dem genannten Abbauverfahren mit einem Enzym ist jedoch das Molekulargewicht nur schwer kontrollierbar, wobei eine Mischung aus oligosacchariden mit verschiedenen Molekulargewichten erhalten wird, und die Konzentration ist sehr gering, nämlich bis zu 0,001% und sie muß daher konzentriert werden. Demgemäß muß zwecks Erhalt eines Oligosaccharids mit einem adäquaten Molekulargewicht eine Fraktionierung durchgeführt werden, ein sehr kompliziertes Vorgehen, und weil außerdem ein Produkt mit einer endständigen Gruppe der folgenden Struktur
beim Erhitzen während des Konzentrationsvorgangs oder während des Sterilisationsvorgangs gebildet wird, kann eine Maylardreaktion auftreten , welche mit einer Verfärbung verbunden ist. Auch wenn dieses Produkt mit einem Reduktionsmittel weiter reduziert wird, besteht dennoch das Problem, daß eine Ringöffnung stattfinden kann und es in einen Zuckeralkohol umgewandelt wird. Außerdem arbeitet dieses Verfahren mit einer verdünnten Reaktionskonzentration und es ist daher eine Ausrüstung in großem Maßstab erforderlich, um größere Mengen herzustellen.
Da das genannte Verfahren des teilweisen Hydrolysierens mit Salzsäure zum gleichen Produkt führt wie das genannte Enzym, lassen sich die Probleme der Verfärbung, der Ringöffnung, wie oben erwähnt, nicht lösen.
Andererseits tritt im zuletzt genannten Verfahren des Depolymerisierens von Chitosan mit salpetriger Säure folgende Schwierigkeit auf: weil Chitosan teilweise mit extrem hohem Molekulargewicht eingesetzt wird, wird die salpetrige Säure in einer Menge von 3 bis 5 Mol je Mol der Aminogruppen des Chitosan verwendet, wobei es zu Glucosamin , einem Monosaccharid, abgebaut werden kann. Alternativ dazu können, da die Abbaureaktion bei relativ hoher Temperatur von 20 bis 25ºC stattfindet, Nebenreaktionen, wie die Transferreaktion auftreten, bevor der Abbau in Monosaccharide erfolgt, und diese Reaktionsprodukte können sich wieder miteinander rekombinieren und so Produkte bilden, die keine Chitosanoligosaccharide sind.
Demgemäß können in dem durch dieses Verfahren erhaltenen Produkt außer den genannten Glucosaminen rekombinierte Glukosidverbindungen enthalten sein, welche giftige Wirkungen haben können, und außerdem ist nicht umgesetzte salpetrige Säure in das Produkt eingemischt, wodurch Probleme bei der Verwendung als Nahrungsmittelzusatzstoffe oder als Pharmazeutika auftreten.
Die Herstellung von acetylierten Derivaten von modifizierten Chitooligosacchariden durch Depolymerisation von teilweise Nacetyliertem Chitosan mit salpetriger Säure ist in der Literatur "Carbohydrate Research" 1985, Band 144, Seiten 338-341 beschrieben. In diesem Verfahren werden, da N-acetyliertes Chitosan als Ausgangsverbindung eingesetzt wird, "-CH&sub2;OH"- Gruppen und "-NH&sub2;"-Gruppen, die in Verzweigungen von der Hauptkette vorhanden sind, in eine "-CH&sub2;O-COCH&sub3;"-Gruppe bzw. in eine "-NHO-COCH&sub3;"-Gruppe umgewandelt. Ein Oligosaccharid mit einer endständigen 2,5-Anhydromannosegruppe wird gebildet.
Das USSR-Patent Nr. 220920 beschreibt ein Verfahren zum Reinigen von Lysozym, in welchem Lysozym an Chitin adsorbiert wird. Das Chitin wird mit verdünnter salpetriger Säure bei einer Temperatur von 2 bis 4ºC und einem pH-Wert von 2 bis 3 vorbehandelt. Da die freie Aminogruppe, die in natürlichem Chitin enthalten ist, die Adsorptionsfähigkeit von Lysozym verringert, wird diese Reaktion unter milden Bedingungen durchgeführt, um die Aminosäure durch eine Hydrozylgruppe zu ersetzen und um so die Adsorption von Lysozym zu erleichtern.
Das US-Patent Nr. 4788307 offenbart ein Verfahren, in welchem ein Oligosaccharid mit einer 2,5-Anhydromannosegruppe, die durch Abbau von Heparin mit salpetriger Säure gebildet wurde, mit Natriumborhydrid reduziert wird, wobei ein Oligosaccharid mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe gebildet wird.
Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 184002/1987 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Chitosans mit verringertem Molekulargewicht, welches das Suspendieren eines Chitosanpulvers in Wasser, die Zugabe von Natriumnitrit zu der Suspension, die Zugabe von Essigsäure zwecks Einstellung des pH-Wertes der Suspension auf den Wert 5 und die Behandlung bei einer Temperatur von 5 bis 70ºC zwecks Verringerung des Molekulargewichts von Chitosan umfaßt. Da die Abbaureaktion gleichzeitig mit dem allmählichen Lösen des suspendierten Chitosanpulvers in einer sauren Lösung abläuft, findet die Reaktion in einer Art heterogenem System statt.

Zusammenfassung der Erfindung

Der vorliegende Erfinder hat intensive Studien betrieben im Hinblick auf die beschriebene Aufgabe, und hat dabei ein Verfahren zur Herstellung eines Chitinoligosaccharids, i.e. ein Chitinoligomer mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe, oder eines Chitosanoligosaccharids ,i.e. ein Chitosanoligomer mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe der folgenden Formel an einem Ende entwickelt
in welchem man Chitin oder Chitosan mit salpetriger Säure bei einer Temperatur von loec oder weniger in einer wäßrigen Lösung mit einer Wasserstoffionenkonzentration (pH) von 1 bis 6 reagieren läßt, um eine Desaminierungsreaktion und eine Pinacolumlagerung zu bewirken, und in welchem ferner dieses Produkt mit einem Reduktionsmittel reduziert wird.
Vorzugsweise stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Chitin- oder Chitosanoligomer mit einer endständigen 2,5- Anhydromannitgruppe zur Verfügung, wobei das Oligomer die folgende Formel aufweist:
in welcher R&sub1; CH&sub2;OH und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils NHCOCH&sub3; oder NH&sub2; ist, m+n 0 bis 500 ist und m einen Wert hat, der 50% unterhalb des Wertes von n liegt, mit der Maßgabe, daß, wenn R&sub2; NHCOCH&sub3; ist, R&sub3; NHCOCH&sub3; ist und R&sub4; NH&sub2; ist, und wenn R&sub2; NH&sub2; ist, dann R&sub3; NH&sub2; und R&sub4; ist NHCOCH&sub3; ist..
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Chitin- oder Chitosanoligomers zur Verfügung, welches das Umsetzen von Chitin oder Chitosan mit salpetriger Säure bei einer Temperatur von 10ºC oder darunter in einer wäßrigen Lösung mit einer Wasserstoffionenkonzentration (pH) von 1 bis 6, das Neutralisieren der Reaktionsmischung nach Abschluß der Reaktion durch Zugabe von Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Anionenaustauscherharz zwecks Bildung eines Chitin- oder Chitosanoligomers mit einer endständigen 2,5-Anhydromannosegruppe, und das Reduzieren dieses Oligomers mit einem Reduktionsmittel umfaßt.
Das nach vorliegender Erfindung hergestellte Chitin-oder Chitosanoligomer mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe der folgenden Strukturformel
welches geringe Reaktivität aufweist, sehr stabil ist und daher schwer zu verfärben ist, kann als solches als Ausgangsmaterial oder als Zwischensubstanz bei der Herstellung von Nahrungsmittelzusätzen oder Pharmazeutika usw. eingesetzt werden.

Genaue Beschreibung der Erfindung

(I) Chitin-Chitosan-Oligomer
(1) Chitinoligomer
Als Chitinoligomer ist in der vorliegenden Erfindung ein Chitinoligomer mit einer endständigen 2,5-Anhydromannitgruppe vorgesehen, welches die 2,5-Anhydromannitgruppe mit der Strukturformel
an einem Ende und eine Gruppe der Strukturformel
am anderen Ende aufweist, wobei diese beiden Enden direkt miteinander oder durch eine Kette aus 40 bis 500 Einheiten der Strukturformel
miteinander verbunden sind, wobei die genannte Kette gegebenenfalls die Einheit der folgenden Strukturformel in einem Verhältnis im Bereich von 50% oder darunter, vorzugsweise von 45% oder darunter aufweist:
Das oben genannte Chitinoligomer weist an einem Ende eine endständige 2,5-Anhydromannitgruppe mit der Strukturformel
und eine Gruppe der Strukturformel
am anderen Ende auf , wobei diese beiden Enden direkt oder durch eine Kette aus 40 bis 500 Einheiten der Strukturformel
miteinander verbunden sind, da jedoch im allgemeinen in natürlich vorkommendem Chitin teilweise acetylierte Aminogruppen enthalten sind, kann alternativ durch Verwendung von künstlich deacetyliertem Chitin auch ein Chitinoligomer oder Chitosanoligomer hergestellt werden, bei dem ein Teil der Kette der obigen Strukturformel in die Kette der Formel
umgewandelt worden ist.
Daher ist es schwierig, zwischen dem deacetylierten Chitinoligomer und dem Chitosanoligomer zu unterscheiden.
Im allgemeinen jedoch weist ein Chitinoligomer ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 570 bis 200,000 und einen Deacetylierungsgrad von 0 bis 50% auf, während ein Chitosanoligomer ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 480 bis 100 000 und einen Deacetylierungsgrad im Bereich von 50 bis 100% aufweist.
Ein Chitinoligomer mit einer endständigen 2,5-Anhydromannosegruppe der nachstehenden Strukturformel:
welches eine hohe Reaktivität aufweist, andererseits aber instabil gegenüber Wärme ist und den Nachteil hat, daß es leicht verfärbbar ist, kann mit einem Reduktionsmittel reduziert werden, um die Struktur
in endständiger Position in 2,5-Anhydromannit umzuwandeln, wobei ein thermisch stabiles Chitinoligomer mit geringerer Reaktivität gebildet wird.
(2) Chitosanoligomer, hergestellt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
Das Chitosanoligomer der vorliegenden Erfindung weist eine endständige 2,5-Anhydromannitgruppe der Strukturformel
an einem Ende und eine Gruppe der Strukturformel
am anderen Ende auf, wobei diese beiden Enden direkt oder durch eine Kette mit 0 bis 500, vorzugsweise 0 bis 300, insbesondere 0 bis 30 Einheiten im Fall eines niedrigen Molekulargewichts oder mit 40 bis 280 Einheiten im Fall eines hohen Molekulargewichts, der Strukturformel
miteinander verbunden sind, welche gegebenenfalls als Teil der Kette im allgemeinen 50% oder weniger, vorzugsweise 45% oder weniger der strukturellen Einheiten, dargestellt durch die Formel
enthält.
Das oben genannte Chitosanoligomer weist eine 2,5-Anhydromannitgruppe der Strukturformel
an einem Ende und eine Gruppe der Strukturformel
am anderen Ende auf, wobei diese beiden Enden direkt oder über eine Kette aus 0 bis 500 Einheiten der Strukturformel
miteinander verbunden sind, da jedoch im allgemeinen in natürlich vorkommendem Chitosan teilweise acetylierte Aminogruppen enthalten sind, kann alternativ durch Verwendung von künstlich deacetyliertem Chitosan ein Chitosanoligomer , enthaltend die nachstehende Strukturformel gebildet werden:
Ein Chitosanoligomer mit einer endständigen 2,5-Anhydromannitgruppe der nachstehenden Strukturformel:
welches eine hohe Reaktivität aufweist, jedoch andererseits instabil gegenüber Wärme ist und ferner den Nachteil hat, leicht verfärbbar zu sein, kann mit einem Reduktionsmittel reduziert werden, um die Struktur
an einem Ende in 2,5-Anhydromannit umzuwandeln, wobei ein thermisch stabiles Chitosanoligomer mit geringerer Reaktivität gebildet wird.
(II) Verfahren zur Herstellung von Chitin-Chitosan-Oligomer
(1) Ausgangsmaterialien
(a) Chitin-Chitosan
Für die Herstellung von Chitin-Chitosanoligomeren der vorliegenden Erfindung einsetzbares Chitin und Chitosan sind das Chitin, das durch Behandeln des Chitinmaterials, das als Bestandteil in Schalentieren, wie Garnelen, Krabben usw., in Insekten, wie Käfern, Grillen usw., in Shiitake (Pilz), in den Zellwänden von Schimmelpilzen enthalten ist, mit Salzsäure zwecks Entfernung von Calciumcarbonat und dann durch Behandlung mit einer Alkalilösung über eine kurze Zeit zwecks Entfernung von Proteinen usw., oder das Chitosan, das durch Erhitzen desselben mit konzentriertem Alkali, um eine Deacetylierung zu bewirken, erhalten worden ist.
Im allgemeinen weisen diese natürlich vorkomenden Chitine ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 000 bis einige Millionen auf, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht von Chitosan ca. 20 000 bis ca. 200 000 beträgt, und wenn daher diese natürlich vorkommenden Chitin-Chitosane als solche als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, dann sind sie so zähflüssig, daß keine ausreichende Reaktion mit salpetriger Säure durchgeführt werden kann, es sei denn, sie wird unter sehr strengen Bedingungen durchgeführt.
Das durch die Reaktion unter solch strengen Bedingungen erhaltene Chitin-Chitosanoligomer ist jedoch nur eine Mischung, enthaltend verschiedene Molekulargewichte, wobei die genannte Reaktion findet vor allem an der Oberfläche der Moleküle des Ausgangsmaterials statt. Um ein Chitin-Chitosanoligomer mit einem gleichmäßigen Molekulargewicht zu erhalten, wird daher vorzugsweise ein Chitin oder Chitosan mit geringer Viskosität mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 50000 oder weniger, vorzugsweise von 20000 bis 50000, insbesondere von 30000 bis 40000, als Ausgangsmaterial eingesetzt.
Beim Verfahren zur Herstellung von Chitin oder Chitosan nach vorliegender Erfindung wird im allgemeinen, da die Reaktion durch Alkoholisieren der Aminogruppen im Chitin mit salpetriger Säure ausgelöst wird, Aminogruppen enthaltendes Chitin eingesetzt.
Da jedoch im allgemeinen in den natürlich vorkommenden Chitinen 3 bis 10 % Aminogruppen enthaltende Einheiten enthalten sind, wird die Reaktion in vorliegender Erfindung durch Einsatz derselben durchgeführt, aber alternativ können Chitine oder Chitosane eingesetzt werden, die durch teilweises oder vollständiges Deacetylieren derselben erhalten worden sind.
Diese Chitine oder Chitosane sollten vorzugsweise im gelösten Zustand vorliegen, damit die Reaktion nach vorliegender Erfindung reibungslos ablaufen kann. Daher werden vorzugsweise solche in feiner Pulverform, vor allem in Form von Flocken von weniger als 15 bis 30 Maschensiebweite, vorzugsweise von weniger als 30 Maschensiebweite, eingesetzt.
(b) Salpetrige Säure
Die salpetrige Säure kann in vorliegender Erfindung auch als solche eingesetzt werden, um jedoch die Reaktion langsam ablaufen zu lassen, wird vorzugsweise ein Nitrit verwendet, welches salpetrige Säure in situ abgeben kann.
Beispiele für solche Nitrite umfassen Natriumnitrit, Kaliumnitrit, Zinknitrit, Ammoniumnitrit, Calciumnitrit, Bariumnitrit, Magnesiumnitrit usw., und davon wird vorzugsweise ein Alkalimetallnitrit, vor allem Natriumnitrit und Kaliumnitrit, eingesetzt.
Diese Nitrite werden zum Alkoholisieren der Aminogruppen in dem Chitin oder Chitosan durch Desaminierung verwendet, und daher werden sie im allgemeinen in Mengen im Bereich von 0,01 bis 1 Moläquivalent, vorzugsweise von 0,1 bis 0,6 Moläquivalent in bezug auf die Aminogruppen eingesetzt, und die Molekulargewichte des Chitinoligomers oder des gebildeten Chitosanoligomers können in Abhängigkeit von der Menge kontrolliert werden. Liegt die genannte Menge unterhalb 0,01 Moläquivalent, dann ist es schwierig, die Reaktion durchzuführen, während bei einer Menge von mehr als 1 Moläquivalent Monosaccharide, wie N-Acetylglucosamin oder Glucosamin in großen Mengen gebildet werden können, wodurch die Ausbeute an Chitinoligomer oder an Chitosanoligomer geringer wird.
(2) Reaktion
(a) In Lösung bringen
Um die Reaktion des Chitins oder Chitosans als Ausgangsmaterialien zu erleichtern, wird bei der Herstellung des Chitinoligomers oder des Chitosanoligomers nach vorliegender Erfindung das Chitin oder Chitosan vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung gelöst, indem es in dem wäßrigen Reaktionsmedium mit einem Löslichkeitsvermittler für dieses Chitin oder Chitosan vermischt wird.
Als Löslichkeitsvermittler für das Löslichmachen des genannten Chitins oder Chitosans können organische Säuren mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie Ameisensäure, Essigsäure, Buttersäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bemsteinsäure, Milchsäure, Ascorbinsäure, Propionsäure, Adipinsäure, Benzoesäure usw., Mineralsäuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure usw. eingesetzt werden. Davon werden Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Milchsäure bevorzugt, und besonders geeignet ist Essigsäure.
Diese Löslichkeitsvermittler können entweder einzeln oder als Mischung eingesetzt werden, im allgemeinen werden sie jedoch als Mischung mit Wasser, dem Reaktionslösungsmittel, eingesetzt.
Diese Löslichkeitsvermittler können in Mengen von 0,5 Mol% oder mehr, vorzugsweise in äquimolarer Anteilsmenge oder mehr in bezug auf das Chitin oder Chitosan eingesetzt werden, da jedoch eine höhere Menge zulässig ist, werden sie im allgemeinen in Mengen von nicht mehr als 20 Volumenprozent bezogen auf Wasser, vorzugsweise von 0,1 bis 20 Volumenprozent, insbesondere von 5 bis 10 Volumenprozent bezogen auf Wasser, dem Reaktionslösungsmittel, eingesetzt.
Durch Kontrollieren der Art und der Menge des Löslichkeitsvermittlers wird die Wasserstoffionenkonzentration in der Reaktionsmischung, wie nachstehend beschrieben, in einem spezifischen Bereich gehalten.
(b) Reaktion
Bei der Herstellung des Chitinoligomers oder des Chitosanoligomers nach vorliegender Erfindung ist es wichtig, daß man das Chitin oder Chitosan in einer Mischung mit salpetriger Säure bei einer Temperatur von 10&sup6;C oder darunter, vorzugsweise von -5 bis 10ºC, mehr bevorzugt von 0 bis 8ºC, insbesondere bei 2 bis 6ºC, in einer wäßrigen Lösung mit einer Wasserstoffionenkonzentration (pH) von 1 bis 6, vorzugsweise von 2 bis 4, reagieren läßt.
Durch Mischen unter solchen Bedingungen läuft die Reaktion langsam ab, und daher wird das Chitin oder Chitosan an der mit dem Glycosid verbundenen Stelle, an welche die Glucosaminoglucaneinheit gebunden ist, nicht hydrolysiert, jedoch die Aminogruppe in dem Chitin oder Chitosan wird durch Desaminierung mit salpetriger Säure alkoholisiert, und die Alkoholgruppe bildet ein Pseudoglykol, das sich näher an dem Sauerstoff an der Stelle der Glucosaminoglucaneinheit, an die das Glykosid gebunden ist, befindet, wobei man davon ausgeht, daß wahrscheinlich die Pinacolumlagerungsreaktion, wie nachstehend dargestellt, stattgefunden hat.
Wenn die Reaktionstemperatur bei den genannten Reaktionsbedingungen 10ºC übersteigt, dann findet eine Hydrolysereaktion statt, und ferner tritt eine Transferreaktion und eine Rekombination ein, wobei zu befürchten ist, daß toxische Glucosideinheiten gebildet werden können. Wenn andererseits die Wasserstoffionenkonzentration weniger als 1 beträgt, dann findet wahrscheinlich eine Hydrolysereaktion statt, in welcher die Glycosidbindung aufgespalten wird, wobei auch eine Transferreaktion und eine Rekombination auftreten können. Ist die Wasserstoffionenkonzentration höher als 6, dann wird die salpetrige Säure abgebaut und verliert ihre Wirkung, oder das Molekulargewicht kann nicht mehr kontrolliert werden.
Die genannte Reaktion wird in wäßriger Lösung bei den Bedingungen der genannten Temperatur und der genannten Wasserstoffionenkonzentration durchgeführt, es können jedoch auch andere organische Lösungsmittel und Puffer in die wäßrige Lösung eingemischt sein.
Die Reaktion wird im allgemeinen in einem Zeitraum von einigen Minuten bis zu 10 Stunden, vorzugsweise von ca. 0,5 bis 3 Stunden, durchgeführt.
(c) Neutralisation
Die Mischung des Chitinoligomers oder des Chitosanoligomers mit einer endständigen 2,5-Anhydromannosegruppe, enthaltend salpetrige Säure oder ein durch die oben genannte Reaktion erhaltenes Nitrit, enthält eine große Menge an nicht umgesetzter salpetriger Säure oder ein Nitrit und ist daher stark sauer, und da verschiedene Probleme auftreten können, wenn man bei Vorliegen dieser salpetrigen Säure oder des Nitrits in solchem Zustand in der folgenden Stufe die Reaktion durchzuführen versucht, ist es wichtig, die Mischung zu neutralisieren.
Eine solche Neutralisation kann durch Zugabe eines Neutralisationsmittels bis zu einer Wasserstoffionenkonzentration (pH) von 7 oder höher, vorzugsweise von 7 bis 8, durchgeführt werden.
Eine solche Neutralisation kann die nachfolgende Reaktion und auch die Ausfällung des gebildeten Chitinoligomers oder des Chitosanoligomers erleichtern.
Das zuzugebende Neutralisationsmittel ist Ammoniak, ein Alkylamin oder ein Ionenaustauscherharz, und spezifische Beispiele dafür werden nachstehend angeführt.

Ammoniak

Als das erwähnte Ammoniak kann konzentriertes Ammoniakwasser, i.e. Ammoniakwasser mit darin gelöstem Ammoniakgas, im allgemeinen in einer Konzentration von 20 bis 30 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 26 bis 30 Gewichtsprozent, eingesetzt werden.
Die zugegebene Menge kann so hoch sein, daß die Wasserstoffionenkonzentration in dem genannten wäßrigen Medium im genannten Bereich liegt, spezifischerweise wird eine Menge von im allgemeinen 40 bis 70 Millilitern Ammoniakwasser/Liter Reaktionsmischung zugegeben.

Alkylamine

Die genannten Alkylamine können Amine von Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen sein, wie Methylamin, Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, n-Propylamin, Isopropylamin, n- Butylamin u.ä.
Die zugegebene Menge kann so hoch sein, daß die Wasserstoffionenkonzentration in dem genannten wäßrigen Medium im genannten Bereich liegt, spezifischerweise wird eine Menge von im allgemeinen 50 bis 200 giliter Reaktionsmischung zugegeben.

Anionenaustauscherharz

Als Anionenaustauscherharz können Harze mit einer Basizitäts funktion, wie Aminogruppen (-NH&sub2;, -NHR, -NR&sub2;), quartäre Ammoniumgruppen (-&spplus;NR3), usw., die in die Matrix der synthetischen Harze integriert ist, eingesetzt werden.
Was die zuzugebende Menge an dem genannten Anionenaustauscherharz betrifft, so wird es so lange zugegeben, bis Säuren, wie salpetrige Säure neutralisiert sind, genauer gesagt in einer Menge von im allgemeinen 200g/Liter oder mehr, vorzugsweise von 300 g bis 1 kg Iliter oder mehr, bezogen auf die Reaktionsmischung.

(3) Reduktionsreaktion

In der neutralisierten Mischung, wie oben beschrieben, ist Chitin- oder Chitosanoligomer mit 2,5-Anhydromannosegruppen enthalten, und das genannte Oligomer weist eine Aldehydgruppe mit hoher Reaktivität mit der Strukturformel
an einem Ende auf und ist daher sehr reaktiv, wodurch es den Nachteil aufweist, daß es sich leicht verfärbt oder rekombiniert, und es kann zu einem Alkohol reduziert werden, wobei die Strukturformel am Ende zu 2,5-Anhydromannit der Formel
wird, wodurch ein stabiles Chitin- oder Chitosanoligomer mit verringerter Reaktivität entsteht.
Für eine solche Reduktionsreaktion können alle im Stand der Technik bekannten Reduktionsmittel eingesetzt werden, die Aldehydgruppen sanft reduzieren können. Als spezifisch dafür seien Katalysatoren vom Nickeltyp für die Hydrierungsreduktion genannt, wie Raneynickel, Ni-Kohlenstoff usw.; Katalysatoren vom Palladiumtyp für die Hydrierungsreduktion, wie Pd- Kohlenstoff; Metallhydride, wie Aluminiumdiisobutylhydrid, organische Zinnhydride, Hydrosilan u.ä.; Metallwasserstoffkomplexverbindungen, wie Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumborhydrid, Calciumborhydrid, Zinkborhydrid u.ä.; Diboran, Alkylboran u.ä.
Von diesen Reduktionsmitteln werden vor allem die folgenden bevorzugt: Metallhydride, wie Aluminiumdiisobutylhydrid, organische Zinnhydride, Hydrosilan etc.; Metallwasserstoffkomplexverbindungen, wie Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumborhydrid, Calciumborhydrid, Zinkborhydrid u.ä., Diboran, Alkylborane etc. Davon wiederum sind Metallwasserstoffkomplexverbindungen, insbesondere Borhydridverbindungen, wie Natriumborhydrid, Kahumborhydrid u.ä. am besten geeignet.
Eine solche Reduktionsreaktion wird durch Zugabe des genannten Reduktionsmittels zu der genannten neutralisierten Mischung, wie oben beschrieben, als solcher oder nach Entfernen der Unreinheiten in der genannten neutralisierten Mischung durch einfaches Filtrieren usw. durchgeführt.
Das Reduktionsmittel kann in einem Verhältnis von im allgemeinen 1 Mol oder mehr, vorzugsweise von 1,5 bis 3 Mol je Mol 2,5-Anhydromannosegruppe in dem Chitin- oder Chitosanoligomer zugegeben werden, um die 2,5-Anhydromannosegruppe in dem Chitinoligomer oder dem Chitosanoligomer zu einer 2,5-Anhydromannitgruppe zu reduzieren.
Die genannte Reduktionsreaktion kann bei einer Temperatur von im allgemeinen 100ºC oder darunter, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder darunter, im allgemeinen bei normalem Druck während eines Zeitraums von mehreren Stunden durchgeführt werden.
Die genannte Reduktionsreaktion wird so lange durchgeführt, bis im wesentlichen keine 2,5-Anhydromannosegruppe mehr vorliegt.

(4) Fraktionieren

Zu einem wäßrigen Medium, in welchem Chitin- oder Chitosanoligomere mit verschiedenen Molekulargewichten mit einer 2,5- Anhydromannitgruppe an einem Ende, wie oben beschrieben, vorliegen, wird ein Lösungsmittel zum Ausfällen, welches mit dem genannten wäßrigen Medium kompatibel ist und die genannten Chitin- oder Chitosanoligomere kaum lösen kann, allmählich oder stufenweise zugegeben, wobei die Chitin-Chitosanoligomere durch sukzessives Fraktionieren aus dem genannten wäßrigen Medium der Reihe nach, beginnend mit dem größten Molekulargewicht, ausgefällt werden. Durch diesen Fraktioniervorgang können Fraktionen mit einer engen Molekulargewichtsverteilung erhalten werden.

(a) Zugabe eines Ausfällungsmediums

Nach Abschluß der Neutralisation unter Verwendung von Ammoniakwasser, einem Alkylamin oder einem Anionenaustauscherharz als Neutralisationsmittel, wie oben beschrieben, wird das Chitinoligomer oder das Chitosanoligomer mit 2,5-Anhydromannosegruppe, das aus dem wäßrigen Medium gebildet wurde, leicht ausfällbar, und daher werden durch allmähliche oder stufenweise Zugabe eines weiteren Mediums zum Ausfällen, welches mit dem genannten wäßrigen Medium kompatibel ist und das genannte Chitin- oder Chitosanoligomer kaum lösen kann, die Chitin- oder Chitosanoligomere aus dem genannten wäßrigen Medium sukzessiv der Reihe nach, beginnend mit dem größten Molekulargewicht, ausgefällt.

(b) Ausfällungsmedium

Als Medium, welches mit dem genannten wäßrigen Medium kompatibel ist und welches die genannten Chitin- oder Chitosanoligomere kaum lösen kann, können z.B. Alkohole, Ketone, Äther, Ester, Kohlenwasserstoffe u.a. eingesetzt werden.
Spezifisch werden Alkohole mit 1 bis 5, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Ethylenglykol u.ä. eingesetzt; spezifische Ketone sind solche mit 1 bis 5, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Aceton, Methylethylketon u.ä.; spezifische Äther sind solche mit 2 bis 6, vorzugsweise mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Ethyläther u.a., spezifische Ester sind solche mit 2 bis 10, vorzugsweise mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie Ethylacetat u.ä.; spezifische Kohlenwasserstoffe sind solche mit 1 bis 10, vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie n-Hexan, Petroleumäther usw.

(c) zugegebene Menge

Die zugegebene Menge an diesem Ausfällungsmedium kann so hoch sein, daß die Chitin- oder Chitosanoligomere mit den größeren Molekulargewichten aus dem genannten wäßrigen Medium ausgefällt werden, genauer gesagt liegt sie im allgemeinen bei 0,4 bis 1,5 Litern, vorzugsweise bei 0,5 bis 1 Liter je 1 Liter des genannten wäßrigen Mediums.
Durch sukzessives Fraktionieren der so ausgefällten Chitin- oder Chitosanoligomere können die Chitinoligosaccharide oder die Chitosanoligosaccharide zu entsprechend verschiedenen Polysacchariden mit verschiedenen größeren Molekulargewichten fraktioniert werden.

(5) Produkt

Durch Isolieren des Chitin- oder Chitosanoligosaccharids mit konstantem Molekulargewicht, erhalten durch Fraktionieren zu entsprechend verschiedenen Polysacchariden, enthält jede Fraktion ein Chitinoligosaccharid oder ein Chitosanoligosaccharid mit einem Molekulargewicht hoher Wirksamkeit, wodurch eine noch größere Wirkung erzielt werden kann.
Die Chitin- oder Chitosanoligomere mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe an der Seite des reduzierten Endes weisen geringe Reaktivität und hohe thermische Stabilität auf und sind daher kaum verfärbbar und als solche für den Einsatz als Nahrungsmittelzusatz oder Pharmazeutikum oder als Zwischensubstanz dafür geeignet.
Nachdem das Chitin- oder Chitosanoligomer der vorliegenden Erfindung so erhalten wurde, und zwar mit einer 2-5-Anhydromannosegruppe, die zu einer 2,5-Anhydromannitgruppe reduziert wurde, die auch thermisch stabil ist, wird salpetrige Säure ausreichend in der Mischung neutralisiert, und ein Ausfällmedium, welches ein schlechtes Lösungsmittel für das Chitinoligomer oder das Chitosanoligomer ist, wird in dem Stadium, wo die genannte salpetrige Säure in Wasser gelöst ist, allmählich zugegeben, um nur das Chitin- oder Chitosanoligomer, das in der Mischung gelöst ist, auszufällen und zu gewinnen. Demgemäß ist in dem Chitin- oder Chitosanoligomer salpetrige Säure oder ein Nitrit nur in einer Menge von im allgemeinen ca. 20 TpM oder weniger, vorzugsweise von 2 TpM oder weniger, insbesondere von 0 bis 0,7 TpM enthalten, und das ist weniger als der Grenzwert von 25 TpM, der vom Lebensmittelrecht (Food Law) festgelegt worden ist, und daher ist es bei der Entwicklung von Einsatzzwecken bei der Herstellung von Nahrungsmittelzusätzen und Pharmazeutika uneingeschränkt einsetzbar.

(Versuchsbeispiele )

Beispiel 1

In einen Glaskolben mit einem Innenvolumen von 5 Liter, der mit einem Rührer ausgestattet ist, werden 100 g Chitosan in Flocken von weniger als 30 Siebmaschenweite, und 2 Liter 10- prozentige wäßrige Essigsäure nach und nach zugegeben, um das Chitosan zu lösen, woraufhin die Lösung in einem Eisbad bis zu 4ºC ausreichend gekühlt wird.
Anschließend werden 300 ml 1-prozentiges wäßriges Natriumnitrit (salpetrige Säure/Glucosaminrest= Molverhältnis 0,1) zugegeben, um die Wasserstoffionenkonzentration (pH) auf 3 einzustellen, und die Reaktion findet unter Rühren bei 4ºC während eines Zeitraums von 1,5 Stunden statt, um ein Chitosanoligomer mit einer 2,5-Anhydromannosegruppe zu erhalten.
Nach Ablauf der Reaktion wird die Mischung mit 393 ml konzentriertem Ammoniakwasser neutralisiert, und ferner wird durch Zugabe von 3,2 g Natriumborhydrid (2 -fache Molmenge in bezug auf Natriumnitrit) die Reduktionsreaktion unter Rühren in einem Eiswasserbad 5 Stunden lang durchgeführt, um ein Chitosanoligomer mit 2,5-Anhydromannitgruppe zu erhalten.
Nach Ablauf der Reduktionsreaktion wird, um das Produkt ausfällbar zu machen, konzentriertes Ammoniakwasser zugegeben, um den pH-Wert der Mischung auf 8 zu halten, woraufhin 2,5 l Aceton zugegeben werden, um das Produkt auszufällen.
Die Ausfällungen werden abfiltriert, sorgfältig mit Aceton gewaschen, im Vakuumofen getrocknet und dann mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie und Elementaranalyse analysiert.
Die Analysebedingungen bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie sind wie folgt:
Säule: Asahipack GS-220
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min.
Temperatur: 50ºC
Mobile Phase: 0,5 M Acetatpuffer
pH: 4,0.
Die Ergebnisse sind in Fig.1 dargestellt. Das Produkt enthält 1,0% Monosaccharide, 6,9% Disaccharide und 80,6% 8-29 Saccharide, und die Ausbeute an dem Produkt beträgt 59,7 g, d.h. 60% der theoretischen Ausbeute von 99,49.

Beispiel 2

Unter Verwendung des gleichen Glaskolbens, der mit einem Rührer ausgestattet ist, werden 100 g eines Chitosans zugegeben und durch Zugabe von 1 Liter 10-prozentiger wäßriger Essigsäure nach und nach gelöst und dann ausreichend mit Eiswasser gekühlt.
Anschließend werden 88 ml 10-prozentigen wäßrigen Natriumnitrits (salpetrige Säure/Glucosaminrest = Molverhältnis 0,3) zugegeben, um die Wasserstoffionenkonzentration (pH) auf 3 einzustellen, und die Reaktion wird im Eiswasserbad 4 Stunden lang durchgeführt.
Nach Ablauf der Reaktion wird die Mischung mit 210 ml konzentriertem Ammoniakwasser neutralisiert und ferner werden 9,6 g Natriumborhydrid (2-f ache Molmenge in bezug auf Natriumnitrit) zugegeben, um die Reduktionsreaktion unter Rühren in einem Eiswasserbad 4 Stunden lang durchzuführen.
Nach Ablauf der Reduktionsreaktion wird, um das Produkt leicht ausfällbar zu machen, konzentriertes Ammoniakwasser zugegeben, um den pH-Wert der Mischung auf 8 bis 9 zu halten, woraufhin auf die Hälfte des Volumens (ca. 500 ml) konzentriert wird.
Anschließend werden 3,5 l Methanol zu dem Konzentrat gegeben, und die gebildeten Ausfällungen werden abfiltriert und mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie analysiert, wobei die in Fig.2 dargestellten Ergebnisse erzielt werden. Die Ausfällungen enthalten, wie festgestellt wird, 0,2% Monosaccharide, 5,3% Disaccharide und 69,3% 10-25 Saccharide.
Das genannte Filtrat wird weiter aufkonzentriert, eine Mischung von Methanol-Aceton (1:1) wird zu dem Konzentrat gegeben, um eine weitere Ausfällung zu bewirken, und die Ausfällungen werden wiederum mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie analysiert, wobei die in Fig.3 dargestellten Ergebnisse erzielt werden. Es wird festgestellt, daß die Ausfällungen 3,7% Monosaccharide, 4,1% Disaccharide, 0,2% Trisaccharide, 0,1% Tetrasaccharide, 10,4 % Pentasaccharide und 67,5 % 6-23 Saccharide enthalten.
Als Ergebnis beträgt die Ausbeute des Produkts 74,3 g, was 76% der theoretischen Ausbeute von 98,29 entspricht.

Beispiel 3

Unter Verwendung des gleichen Glaskolbens, der mit einem Rührer ausgestattet ist, werden 100 g eines Chitosans zugegeben und durch Zugabe von 1 Liter 10-prozentiger wäßriger Essigsäure nach und nach gelöst und dann ausreichend mit Eiswasser gekühlt.
Anschließend werden 146 ml 10-prozentigen wäßrigen Natriumnitrits (salpetrige Säure/Glucosaminrest = Molverhältnis 0,3) zugegeben, um die Wasserstoffionenkonzentration (pH) auf 3 einzustellen, und die Reaktion wird in Eiswasserbad 4 Stunden lang durchgeführt.
Nach Ablauf der Reaktion wird die Mischung mit 220 ml konzentriertem Ammoniakwasser neutralisiert und ferner werden 16,0 g Natriumborhydrid (2-fache Molmenge in bezug auf Natriumnitrit) zugegeben, um die Reduktionsreaktion unter Rühren in einem Eiswasserbad 4 Stunden lang durchzuführen.
Nach Ablauf der Reduktionsreaktion wird, um das Produkt leicht ausfällbar zu machen, konzentriertes Ammoniakwasser zugegeben, um den pH-Wert der Mischung auf 8 bis 9 zu halten, woraufhin auf die Hälfte des Volumens (ca. 500 ml) konzentriert wird.
Anschließend werden 1,5 Liter Methanol zu dem Konzentrat gegeben, und die gebildeten Ausfällungen werden filtriert und mit Aceton gewaschen.
Die erhaltenen Ausfällungen werden mittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie analysiert, wobei die in Fig.4 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Die Ausfällungen enthalten, wie festgestellt wird, 2,1% Monosaccharide, 9,8% Disaccharide, 1,1% Trisaccharide, 3,1% Tetrasaccharide, 0,8% Pentasaccharide, 0,4% Hexasaccharide und 79,3 % 7-25 Saccharide. Die Ausbeute an erhaltenen Ausfällungen beträgt 26,6 g, was 27% der theoretischen Ausbeute entspricht.
Zu dem genannten Filtrat werden ferner 4 Liter Methanol zugegeben, um wiederum eine Ausfällung zu bewirken, die Ausfällungen werden filtriert und mit Aceton gewaschen. Die erhaltenen Ausfällungen werden mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie analysiert, wobei die in Fig.5 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Es wird festgestellt, daß die Ausfällungen 0,1% Monosaccharide, 2,1% Disaccharide, 0,7% Tetrasaccharide, 0,6% Pentasaccharide, 0,3% Hexasaccharide, 0,6 % Pentasaccharide, 0,3% Hexasaccharide und 79,1% 7-25- Saccharide enthalten. Die Ausbeute an dem Produkt beträgt 11,2 g, was 12% der theoretischen Ausbeute beträgt.
Das Filtrat wird nach dem Wiederausfällen, wie oben beschrieben, auf 200 ml konzentriert und zu dem Konzentrat wird eine Mischung aus Methanol (300 ml)-Aceton (500 ml) zugegeben, um Ausfällungen zu erhalten. Die Ausfällungen werden abfiltriert und mit Aceton gewaschen.
Die Ausfällungen werden mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie analysiert, wobei die in Fig.6 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Die Ausfällungen enthalten 2,3% Monosaccharide, 4,4% Disaccharide, 0,6 Trisaccharide, 0,3% Tetrasaccharide, 0,2% Pentasaccharide und 88,7% 6-23 Saccharide.
Die Ausbeute an Ausfällungen beträgt 11,29, d.h. 12% der theoretischen Menge.
Daher beträgt die Gesamtausbeute 52,9 g, d.h. 54% der theoretischen Ausbeute von 97,2 g.

Beispiel 4

Der Versuch wird nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 durchgeführt, mit der Abänderung, daß ein natürliches Chitin anstelle von Chitosan eingesetzt wird und daß das Molverhältnis von salpetriger Säure zu Glucosaminrest auf 0,5 verändert wird, um ein Chitinoligomer mit einer 2,5-Anhydromannosegruppe zu erhalten, woraufhin die Reduktionsreaktion durchgeführt wird, um ein Chitinoligomer mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe zu bilden.
Die Ergebnisse der Analyse des Produkts mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie und IR-Absorptionsspektralanalyse sind in Fig.10 dargestellt. Daß die Absorptionsspitze bei 1600 bis 1700 cm&supmin;¹ dargestellt ist, ist die Bestätigung dafür, daß es sich um ein Chitinoligomer mit 2,5-Anhydromannitgruppe handelt. Auch in Fig.7 ist bestätigt, daß es sich um ein Chitinoligomer mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe handelt, i.e. eine Mischung von 40-250 Sacchariden.

Beispiel 5

In einen Glasbecher mit 500 ml Innenvolumen, der mit einem Rührer ausgestattet ist, werden 10 g eines Chitosans in Flocken von weniger als 30 Maschensiebweite (Molekulargewicht: 40,000) gefüllt, und dazu werden nach und nach 100 ml wäßrige Essigsäure (Löslichkeitsvermittler /Wasser: 10 Vol%) gegeben, woraufhin die Lösung in einem Eiswasserbad auf 3ºC ausreichend gekühlt wird.
Anschließend werden 14,5 ml 10-prozentigen wäßrigen Natriumnitrits (salpetrige Säure/Glucosaminrest im Chitosan (Molverhältnis): 0,5) zugegeben, um die Wasserstoffionenkonzentration (pH) auf 3 zu halten, und die Reaktion wird in wäßriger Lösung bei 3ec unter Rühren 2 Stunden lang durchgeführt, um ein Chitosanoligomer mit 2,5-Anhydromannosegruppe zu erhalten.
Nach Ablauf der Reaktion wird die Mischung mit 15 ml Ammoniakwasser neutralisiert, und ferner wird unter Zugabe von 1,6 g Natriumborhydrid (2-fache Molmenge in bezug auf Natriumnitrit), die Reduktionsreaktion durch Rühren der Mischung bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt, um ein Chitosanoligomer mit 2,5-Anhydromannitgruppe zu erhalten.
Nach Ablauf der Reduktionsreaktion wird die Reaktionsmischung filtriert, um unlösliche Bestandteile daraus zu entfernen, und das Filtrat wird auf 100 ml konzentriert. Anschließend wird das Produkt durch Zugabe von Methanol ausgefällt. Bei diesem Vorgang wird die eingesetzte Menge an Methanol verändert, was das Verhältnis von Konzentrat zu Methanol von 1:3 betrifft (erste Fraktion), nämlich auf 1:5 (zweite Fraktion), und 1:10 (dritte Fraktion), um eine Fraktionierung zu erzielen.
Ferner wird bis zur Trockne aufkonzentriert, und dann wird das Produkt durch Zugabe von Methanol und Aceton ausgefällt. Bei diesem Vorgang wird das Fraktionieren durch ein Verhältnis von Methanol: Aceton von 1:2 (vierte Fraktion) durchgeführt. Diese Ausfällungen werden sorgfältig mit Aceton und Äther gewaschen und in einem Vakuumtrockner getrocknet.
Die Ausfällungen werden mittels Infrarotstrahlen-Analyse analysiert, wobei die in Fig. 9 dargestellten Ergebnisse erhalten werden. Mittels der Infrarotabsorptionsspektralanalyse wird festgestellt, daß die Ausfällungen ein Chitosanoligomer mit 2,5-Anhydromannitgruppe sind.
Die Feststoffe, die durch diese Fraktionierung aus der ersten bis vierten Fraktion erhalten worden sind, werden mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie und Elementaranalyse entsprechend analysiert
Die Analysebedingungen in der Hochleistungs-Flüssigchromatographie sind wie folgt:
Säule: Asahipack GFA-30F
Fließgeschwindigkeit: 0,3 ml/Min
Temperatur: 50ºC
Mobile Phase: 0,5% Acetatpuffer
pH: 4,
Die Ergebnisse sind in Fig. 8(a) bis (d) dargestellt.
Die Produkte in den entsprechenden Fraktionen sind wie folgt:
Erste Fraktion (Fig.8(a))
Ausbeute: 7,2 Gewichtsprozent
Peak a-1: Ausgangsmaterial Chitosan
Peak a-2: Chitosanoligomer 88,5 Molprozent
Molekulargewicht: 40,000 bis 1,300 (245 Saccharide-7 Saccharide)
Peak a-3: Natriumacetat
Zweite Fraktion (Fig.8(b))
Ausbeute: 15,2 Gewichtsprozent
Peak b-1: Ausgangsmaterial Chitosan
Peak b-2: Chitosanoligomer 99,7 Molprozent
Molekulargewicht: 45,000 bis 1,300 (277 Saccharide-7 Saccharide)
Peak b-3 : Natriumacetat
Dritte Fraktion (Fig.8(c))
Ausbeute: 8,4 Gewichtsprozent
Peak c-1: Chitosanoligomer 100 Molprozent
Molekulargewicht: 25,000 bis 1,000 (154 Saccharide-5 Saccharide)
Peak c-2: Natriumacetat
Vierte Fraktion (Fig.8(d))
Ausbeute: 42,2 Gewichtsprozent
Peak d-1: Chitosanoligomer 97,4 Molprozent
Molekulargewicht: 25,000 bis 1,300 (154 Saccharide - 7 Saccharide)
Peak d-2: Chitosanoligomer 2,6 Molprozent
Molekulargewicht: 1,300 - 900 (7 Saccharide - 5 Saccharide)
Peak d-3-7: verschiedene Salze

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Die Figuren 1 bis 6 sind graphische Darstellungen, die aufgrund der Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Analyse der Chitosanoligomere, die in den Beispielen nach vorliegender Erfindung hergestellt worden sind, erstellt wurden, Fig.7 ist eine graphische Darstellung, die aufgrund der Hochleistungs- Flüssigchromatographieanalyse des in dem Beispiel nach vorliegender Erfindung hergestellten Chitinoligomers erstellt wurde, die Figuren 8(a)-(d) sind graphische Darstellungen, die aufgrund der Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Analyse der entsprechenden Bestandteile des Chitosanoligomers, welche durch Fraktionieren in den Beispielen nach vorliegender Erfindung erhalten worden sind, erstellt wurden, Fig.9 ist eine graphische Darstellung, die aufgrund der Infrarotstrahlen-Absorptionsspektralanalyse des im Beispiel nach vorliegender Erfindung erhaltenen Chitosanoligomers erstellt wurde, Fig.10 ist eine graphische Darstellung, die aufgrund der Infrarotstrahlen-Absorptionsspektralanalyse des im Beispiel nach vorliegender Erfindung erhaltenen Chitinoligomers erstellt wurde.
1: Monosaccharid, 2: Disaccharid, 3: Trisaccharid, 4: Tetrasaccharid, 5: Pentasaccharid, 6: Hexasaccharid, 6-23: 6-23 Saccharide, 7-25: 7-25 Saccharide, 8-29: 8-29 Saccharide, 10- 25: 10-25 Saccharide, 40-250: 40-250 Saccharide.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Chitin- oder Chitosanoligomers mit einer 2,5-Anhydromannitgruppe an einem Ende, umfassend die Umsetzung von Chitin oder Chitosan mit salpetriger Säure bei einer Temperatur von 10ºC oder darunter in einer wäßrigen Lösung mit einer Wasserstoffionenkonzentration (pH) von 1 bis 6, das Neutralisieren der Reaktionsmischung nach Abschluß der Reaktion durch Zugabe von Ammoniak, von einem Alkylamin oder einem Anionenaustauscherharz zwecks Herstellung eines Chitin-oder Chitosanoligomers mit einer 2,5- Anhydromannosegruppe an einem Ende, und das Reduzieren dieses Oligomers mit einem Reduktionsmittel.

2 Ein Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Reduktionsmittel eine Borhydridverbindung ist.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , in welchem nach der Reduktion durch Mischen mit einem Medium, das mit einem wäßrigen Medium kompatibel ist und in welchem das Chitinoligomer oder das Chitosanoligomer schwer löslich sind, das Chitin- oder Chitosanoligomer mit einer endständigen 2,5-Anhydromannitgruppe, das in dem genannten wäßrigen Medium gelöst ist, ausgefällt wird.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, in welchem das Oligomer die folgende Formel aufweist:

in welcher R&sub1; CH&sub2;OH ist und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils NHCOCH&sub3; oder NH&sub2; bedeuten, m+n 0 bis 500 beträgt und m 50% oder weniger der Summe m+n ausmacht, mit der Maßgabe, daß wenn R&sub2; NHCOCH&sub3; ist, R&sub3; NHCOCH&sub3; und R&sub4; NH&sub2; ist, und wenn R&sub2; NH&sub2; ist, dann R&sub3; NH&sub2; und R&sub4; NHCOCH&sub3; ist.

5. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem das oligomer ein Chitinoligomer mit einer endständigen 2,5- Anhydromannitgruppe ist, wobei das Oligomer die folgende Formel aufweist:

in welcher n=40 bis 500, R&sub1; CH&sub2;OH und R&sub2; NHCOCH&sub3; ist; und R&sub3; NHCOCH&sub3; oder NH&sub2; bedeutet, mit der Maßgabe, daß 50% oder weniger von R&sub3; NH&sub2; ist.

6. Ein Chitinoligomer mit einer endständigen 2,5-Anhydromannitgruppe, wobei das oligomer die folgende Formel hat:

in welcher n=40 bis 500; R&sub1; CH&sub2;OH und R&sub2; NHCOCH&sub3; und R&sub3; NHCOCH&sub3; oder NH&sub2; ist, mit der Maßgabe, daß 50% oder weniger von R&sub3; NH&sub2; ist.