KR19990064910A

KR19990064910A - 키틴/키토산 올리고머 및 그 계면활성제의 항균 특성과 이용

Info

Publication number: KR19990064910A
Application number: KR1019990018365A
Authority: KR
Inventors: 최관영; 이무열; 양지원
Original assignee: 최관영; 양지원; 이무열
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 1999-08-05

Abstract

본 발명은 키틴/키토산을 가수분해하여 얻은 올리고머 및 키틴/키토산의 계면활성제의 새로운 제조 방법 및 그들이 가진 항균 특성의 응용에 관한 것이다.

게, 새우 등의 껍질에 많은 키틴을 탈아세틸화시켜 얻어지는 글루코스아민이 β-1,4로 결합된 생체 고분자가 키토산으로서 분해성이 좋고 낮은 독성을 나타내기 때문에 여러분야에서 활용하기 위한 시도가 이루어지고 있으나 이들이 가진 아민 그룹(-NH₂)의 흡착 특성으로 인해 유래되는 항균능을 이용한 응용 예는 비교적 알려진 바가 적다.

본 발명의 목적은 키틴/키토산 올리고머 및 키틴/키토산 계면활성제들이 가진 항균 특성을 이용하여 무독성의 환경친화적인 항균제(anti-microbial agent)를 제조하고 응용하는데 있다.

Description

키틴/키토산 올리고머 및 그 계면활성제의 항균 특성과 이용{Anti-microbial activity of chitin/chitosan oligomers and surfactants derived from chitin/chitosan}

본 발명은 키틴(chitin) 과 키토산(chitosan)을 산 또는 효소 가수분해하여 얻은 키틴/키토산 올리고머(oligomer)와 그 계면활성제(surfactant), 키틴/키토산 그 자체가 가진 흡착 특성 및 항균능을 이용하여 여러 가지 분야에 응용하는 것에 관한 것이다.

게, 새우 등의 껍질에 많은 키틴은 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노실 잔기를 가진 (1→4) 결합의 다당류이고, 키토산은 키틴이 N-탈아세틸화된 생체 고분자로서 생분해성이 좋고 낮은 독성을 나타내므로 여러 분야에서 활용하기 위한 시도가 이루어지고 있다(그림 1).

그림 1. 키틴 및 키토산의 분자구조

위 구조식으로 나타낸 키틴/키토산의 가장 유용한 특징중의 하나는 킬레이션(chelation) 능력으로서 중금속, 지방, 콜레스테롤, 단백질, 암 세포 등에 선택적으로 흡착할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 키틴/키토산은 천연 식품보존제로 쓰이거나 의료용 재료로 인공피부, 생분해성 봉합사 등에 응용되고 있으며 보습성질을 가지고 있기 때문에 화장품이나 샴푸의 재료로 쓰이기도 하였다. 공업적으로는 분리용 재료나 침전제에도 폭넓게 사용되고 있고 환경 분야에서는 중금속이나 전이금속 및 염료에 대한 높은 흡착능으로 인하여 입상물질로 제조되어 수처리에 응용되고 있다. 키토산과 관련된 선행기술로는 키토산 올리고머의 제조방법(한국특허 출원번호 95-30569), 키토산 올리고당 함유하는 건강식품(한국특허 출원번호 97-66930), 생분해성 키틴 봉합사(한국특허 출원번호 93-421) 등이 발표되어 있다. 그러나 키틴/키토산 중에서 높은 분자량의 올리고머를 효과적으로 분리하는 방법과 그것들의 특징 및 키틴/키토산을 이용하여 제조된 여러 가지 계면활성제에 대해서는 아직까지 많은 연구가 진행되지 않았으며, 특히 그들의 항균능에 관한 응용에 관해서는 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은 키틴/키토산을 효소, 염산 또는 sodium nitrite로 가수 분해하여 얻어지는 높은 분자량의 여러 가지 올리고머 및 키틴/키토산 계면활성제를 중성인 물 또는 약 산성 수용액에 녹인 다음, 매체의 표면에 분사하거나 첨가제로 투입하여 항균능을 증가시킨 것으로 키틴/키토산이 가진 천연에서의 뛰어난 분해능, 무독성, 항균능을 잘 이용한 것에 있다.

도 1은 키틴/키토산 고분자 계면활성제(CBPS) 시료(A:원료 키토산, B:CBPS-C₁₂,_0.2, C:CBPS-C₁₂,_0.4, D:CBPS-C₁₂,_0.8)들의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 2는 아민 그룹에 헥실 그룹이 40% 도입된 키틴/키토산 고분자 계면활성제(CBPS-C₆,_0.4)를 1% Deuterium chloride(DCl)Deuterium oxide(D₂O)에 녹인 다음 500 MHz¹H-NMR로 분석한 스펙트럼을 나타낸 것이다.

키틴/키토산은 무독성이며 생분해성이 뛰어난 친수성 물질로서 아민 그룹을 가지고 있기 때문에 흡착능이 뛰어나다. 특히, 아민 그룹의 비공유 전자쌍은 중금속과 같은 물질을 흡착할 수 있으며, 양이온을 띠기 때문에 음이온성인 세포나 지방산의 표면에 흡착하기도 한다. 따라서 본 발명에서는 키틴이나 키토산을 염산 또는 sodium nitrite로 가수분해하여 올리고머를 제조하거나 여러 가지 종류의 키틴/키토산 계면활성제를 합성한 다음, 이것들이 가진 항균 특성을 여러 가지 분야에 응용한 것이다.

실시예 1 : 염산 가수분해법

탈 아세틸화도가 10∼100%의 키틴/키토산 50g을 35% HCl 500mL에 넣은 다음 80℃에서 2시간 동안 교반하면서 가수분해 반응을 진행시켰다. 여기에 50OmL의 증류수를 첨가하여 격렬히 교반한 다음, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 분해되지 않은 찌꺼기를 제거하였다. 상등액에 5g의 활성탄을 투입하여 3시간 동안 교반한 다음 필터하여 색소를 제거하였다. 이것을 -20℃에서 2일동안 보관하여 높은 분자량의 올리고머들을 침전시켜 분리하였다 (oligomer I). 침전물을 제거한 다음 상등액은 냉동건조하여 100mL 정도까지 농축시켰다. 여기에 9배의 에탄올을 투입한 다음 -20℃에서 하루동안 보관하여 올리고머들을 침전시켰다. 이 침전물에 200mL의 메탄올을 투입하여 저분자량의 올리고머를 추출하여 제거한 다음 (oligomer Ⅱ), 나머지 용액은 건조시켜서 최종적인 올리고머를 얻었다 (oligomer Ⅲ).

그림 2. 염산을 이용한 키틴/키토산의 가수분해

실시예 2 : sodium nitrite 가수분해법

탈 아세틸화도가 10∼100%의 키틴/키토산 30g을 0.2M HCl 1L에 넣은 다음 1시간 동안 기계적인 교반하여 녹인다. Sodium nitrite(NaNO₂) 5g을 50mL의 증류수에 녹인다음, 키틴/키토산 용액에 적하(適下)하면서 14시간동안 교반하여 가수분해 반응을 진행시킨다. 분해되지 않은 찌꺼기는 필터를 거쳐 제거하였으며, 깨끗한 키틴/키토산 용액은 냉동건조를 거쳐 100mL까지 농축시켰다. 올리고머의 분획을 위해서 9배 부피의 메탄올을 농축된 키틴/키토산 용액에 투입한 다음 -20℃에서 2일동안 보관하여 높은 분자량의 올리고머들을 침전시켜 분리하였다. 이때 침전물은 에탄올로 여러번 세척한 다음 건조하였다 (oligomer I). 상등액은 상온 감압 하에서 다시 50mL 까지 농축한 다음 9배 부피의 에탄올을 투입하여 저분자량의 올리고머들도 침전시켰다. 이 침전물은 다시 0.2M HCl 50mL에 녹인 다음 다시 에탄올로 재 침전한 다음 -20℃에서 2일동안 보관하여 정제하였다 (oligomer Ⅱ).

실시예 3 : 키틴/키토산 고분자 계면활성제(CBPS)의 합성법

탈 아세틸화도가 10∼100%인 키틴/키토산 0.5g씩을 각각 10mL의 20% 아세트산 용액에 넣고 기계적인 교반을 하면서 다시 50mL의 메탄올을 넣는

그림 3. sodium nitrite를 이용한 키틴/키토산의 가수분해

다. 글루코사민 당량비 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 0.8, 1.0 만큼의 무수화산(acid anhydride, 탄소수가 각각 C₆, C₁₂, C₁₆)을 50mL 메탄올에 각각 넣은 다음, 키토산 용액에 투입하였다(그림 4). 이 혼합 용액은 상온에서 하룻밤 동안 반응을 시키며, 반응이 끝난 후에 100mL 아세톤과 격렬히 교반시켜서 침전시켰다. 탄소수가 높은 무수화산은 상온에서 녹지 않기 때문에 가열하여 녹이며, 반응은 80℃에서 진행시켰다. 그외에도 앞의 방법과 유사하게 키토산의 유리 아미노기를 알킬 알데히드(alkyl aledhyde, 탄소수가 각각 C₆, C₁₂, C₁₆)와 반응시킨 다음 수소화 브롬 나트륨(NaBH₄)으로 환원시켜서 알킬 그룹을 도입하였다(그림 5). 키틴/키토산 고분자 계면활성제는 도입된 알킬 그룹의 탄소 수와 아민기의 치환도에 따라서 CBPS-C_{탄소수, 치환도}의 형식으로 표시하였다(예; 알킬기의 탄소수가 12, 치환도가 10%인 경우 CBPS-C_{12, 0.1}).

그림 4. 키토산의 N-acylation

그림 5. 키토산의 N-alkylation

실시예 4 : 키틴/키토산 계면활성제(CBS)의 산화합성법

탈아세틸화도가 10∼100%인 키틴/키토산 50g에 35% 염산을 10배 부피(w/v)로 첨가한 후 80℃에서 2시간 동안 가수분해 반응을 진행하여 (실시예 1) 키토산 올리고머(chitosan oligomer, (GlcN)_n=1-10)를 얻었다. 이 키토산 올리고머(10g/100mL)를 상온에서 0.5N 요오드 용액과 24시간 동안 반응시켜 말단기를 카르복실 그룹으로 산화시켰다. 이것을 투석막으로 정제하여 염을 제거한 다음, 액체 질소로 동결시켜서 48시간 동안 진공 건조시켜 카르복실 그룹을 델타-락톤(δ-lactone) 그룹으로 변환시켰다. 카르복실 그룹을 델타-락톤 그룹으로 변환시킨 키토산 올리고머는 디메틸 술폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)를 용매로 하여 70℃에서 당량비 200배의 헥실 아민과 반응시켜 키토산 계면활성제(CBS-C₆, hexyl 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranosides surfactant)를 제조하였다. 위 실시예 4과 동일한 방법으로 델타-락톤 그룹으로 변환시킨 키토산 올리고머를 도데실아민과 반응시켜 키토산계 계면활성제(CBS-C₁₂, dodecyl 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranosides surfactant)도 제조하였다.

그림 6. 키틴/키토산계 계면활성제의 산화합성법

실시예 5 : 미생물에 대한 항균능

실시예 1, 2, 3, 4에서 얻어진 시료를 이용하여 여러 가지 종류의 미생물에 대한 항균능을 테스트하였다. 실험에 사용된 균주는 피부병에 관련된Candida albicans, Trichophyton rubrum, Microsporum canis, 그리고 식중독에 관련된Bacillus cereus, Listeria monocytogens, Pseudomonas syringae, Escherichia coliO157,Escherichia coliw3110,Saccharomyces cerevisiae, Fusarium wilt였다. 배양에는 YM, glucose, LB, tryptic soy, brain heart infusion, potato dextrose 배지가 사용되었다. 액체배지에 실시예들에서 얻어진 각각의 키틴/키토산 올리고머와 계면활성제 시료들을 넣고 각각의 균주와 혼합한 다음 shaking incubator에서 30℃, 150rpm에서 배양하였다. 그외에도 agar plate에서 균주들을 도말한 다음 키틴/키토산 시료 용액을 떨어뜨린 후 배양하여 균주의 사멸 정도를 파악하였다. 가수분해하지 않은 키토산은 HCl에 녹인 다음 pH를 5.0으로 조정한 후, 균주들과 혼합하여 사멸 정도를 파악하였다.

비교예 1 :항균능

실시예 1, 2, 3, 4에서 얻어진 시료에 대한 비교예로서 분자량 3만 정도인 microcrystalline chitin (MCC), 증류수, 글루코스를 이용하여 실시예 5와 동일한 균주와 방법을 사용하여 항균능을 테스트하였다.

시험예

상기의 실시예 3에서 침전된 키틴/키토산 고분자 계면활성제는 원심분리하여 회수하였으며, 아세톤과 디에틸 에테르로 3번씩 세척하여 물과 미반응 불순물을 제거한 다음 동결건조시킨 다음 합성 결과를 확인하였다. 먼저 FT-IR 측정결과로서 도 1에서 볼 수 있듯이 2920, 2850 cm^-1에서 CH₂와 CH₃의 특성 피크를, 그리고 1650 cm^-1에서 C=O stretching band, 1555 cm^-1에서 NH bending band가 나타나는 것을 알 수 있었다. 또한 도 2의¹H-NMR 결과에서도 각각의 알킬 그룹 피크를 확인할 수 있었기 때문에 알킬 그룹이 도입된 키틴/키토산 고분자 계면활성제가 만들어진 것을 확인하였다.

상기의 실시예 4에서 합성한 키틴/키토산 계면활성제는 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 침전시키고 아세톤, 메탄올로 수회 세척하여 정제하였다. 합성결과는 마찬가지로 FT-IR,¹H-NMR을 통해 확인하였다. FT-IR 결과에서는 키토산 올리고머를 산화시킨 후에 1735 cm^-1에서 락톤 그룹의 특성 피크를, 그리고 합성반응을 시킨 후에 2905와 2840 cm^-1에서 CH₂와 CH₃의 피크를 볼 수 있었고,¹H-NMR의 결과에서도 각각의 알킬 그룹 피크를 확인할 수 있었기 때문에 말단기에 알킬 그룹이 도입된 키틴/키토산 계면활성제가 만들어진 것을 확인하였다.

적용예

본 발명의 실시예와 같이 제조된 키틴/키토산 올리고머 및 키틴/키토산 고분자 계면활성제, 키틴/키토산 계면활성제를 이용하여 항균능을 살펴보았다(표 1). 사용된 균주들은 각각 피부병과 식중독을 일으킬 수 있는 균주중에서 선택하였다.

표 1. 각각의 미생물에 대한 시료들의 항균능

키틴/키토산 올리고머 및 키틴/키토산 계면활성제는 증류수에 녹여서 사용하였으며, 키틴/키토산 고분자 계면활성제는 미세하게 분쇄한 다음 pH 5.0, 7.0인 증류수에 녹여서 사용하였다. 실시예 1과 2에서 만든 키틴/키토산 올리고머들 중에서는 실시예 1의 oligomer I과 실시예 2의 oligomer I과 Ⅱ가 각각 높은 항균능을 보였다. 특히, 실시예 2의 oligomer I은Candida albicans에 대해서 90% 이상의 항균능을 보였다. 그외에도 실시예 3과 4에서 만들어진 키틴/키토산 고분자 계면활성제와 계면활성제를 이용하여 항균능을 테스트한 경우에도 균주를 균일한 한층(lawn)으로 도말한 agar plate 위에서 넓은 환을 형성하여 각각의 균주들에 대해서 항균능을 나타내었다.

표 1의 결과와 같이 본 발명의 키틴/키토산을 가수분해하여 얻은 올리고머 및 키틴/키토산계 계면활성제가 피부병 또는 식중독을 유발하는 여러 가지 종류의 미생물에 대한 우수한 항균 특성을 나타내었다. 그리고 비교예로 사용한 MCC, 증류수, 글루코스는 항균능을 보이지 않음을 알 수 있었다.

Claims

탈아세틸화도가 5∼100%인 키틴/키토산 올리고머를 -10∼100℃에서 0.1∼10N 요오드 용액으로 산화시켜 말단기를 델타-락톤 그룹으로 만든 다음, 50∼200℃에서 산화 아민화반응(알킬 아민)을 통해 탄소수가 3개에서 26개의 알킬기를 도입하여 제조한 것 및

10∼200℃에서 탈아세틸화도가 5∼100%인 키틴/키토산의 아민기에 아실화반응(무수화산) 또는 알킬화반응(알킬 알데히드)을 통해 탄소수가 3개에서 26개의 알킬기를 2∼100% 도입하여 만든 키틴/키토산계 계면활성제 또는 고분자 계면활성제 및 그 제조법과

3∼35% 염산을 사용하여 탈 아세틸화도가 5∼100%인 키틴/키토산을 30∼150℃에서 20분∼24시간 동안 가수분해 시킨 다음, -20℃이하의 저온에서 분자량이 높은 올리고머를 침전시켜 분리하는 방법 및

탈 아세틸화도가 5∼100%인 키틴/키토산을 1∼20% 염산에 녹인 다음 -10∼50℃에서 NaNO₂를 이용하여 20분∼48시간 동안 가수분해 시켜 분자량이 높은 키틴/키토산 올리고머를 제조하고, -20℃이하의 저온에서 올리고머를 침전시켜 분리 정제하는 방법
제 1항에 있어서,

키틴/키토산 올리고머 및 계면활성제를 우유, 아이스크림, 요거트, 분유, 이유식, 라면, 국수, 라면 및 국수 스프, 빵, 햄버그, 쏘시지, 만두, 스테이크 등에 0.01∼20wt% 첨가하여 방부능을 향상시키고 장내 유해 균주들의 증식을 억제하는 방법
제 1항에 있어서,

키틴/키토산 올리고머 및 계면활성제를 각각 0.01∼100% 농도의 용액으로 만든 다음 양말, 런닝, 팬티 등의 섬유 표면에 도포하거나, 물휴지, 티슈, 여성용 세척액, 콘택트 렌즈 세척액, 안약, 헤어젤, 무스, 스킨로숀, 밀크로숀을 비롯한 화장품, 비누, 샴푸, 바디샴푸, 세제, 섬유 유연제, 세탁 후 첨가제 등에 혼합하여 항균능을 향상시키거나 피부병의 발생을 막는 방법
제 1항에 있어서,

키틴/키토산 올리고머 및 계면활성제를 각각 0.01∼100% 농도로 스프레이에 포함시켜 분사하여 습한 실내 또는 신발 속에서 기생하는 유해 병원균의 성장을 억제시키는 방법
제 1항에 있어서,

키틴/키토산 올리고머 및 계면활성제를 물고기, 닭, 소, 돼지 등의 사료에 0.01∼20wt% 첨가하거나 고체 알약에 0.01∼10wt% 첨가 또는 액체로하여, 수족관 및 축사에서 가금류, 조류, 어류의 배양시 투입하여 유해 병원균의 성장을 막거나 장내 유해 병원균의 증식을 억제하는 방법