DE69029881T2

DE69029881T2 - Verfahren zur verbesserten Zentrifugaltrennung von Teilchen mit Übergangsanalyse und Feedback

Info

Publication number: DE69029881T2
Application number: DE69029881T
Authority: DE
Inventors: Steven John Chulay; Robert Giebeler; Allen P Minton
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1989-07-10
Filing date: 1990-07-06
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2010-07-07
Also published as: EP0408262B1; DE69029881D1; JPH0628750B2; EP0408262A2; EP0408262A3; JPH0342059A; US4941868A

Description

Anlagen

Beiliegend werden drei Anlagen eingereicht, die Computerausdrucke enthalten.
Diese Erfindung bezieht sich auf das Verhalten von Makromolekülen in dichtegradientbildenden Lösungen während der Zentrifugation. Genauer gesagt wird ein Verfahren beschrieben, das die Vorhersage von zeit- und positionsabhängigen Konzentrationen von Makromolekülen in einer dichtegradientbildenden Lösung umfaßt.

Ausgangspunkt der Erfindung

Eine weitverbreitete Technik zur Trennung oder Separation von biologischen Makromolekülen in einer Lösung (Makrolösungen), die als isopycnische Dichtegradient-Separation bekannt ist, umfaßt die Hochgeschwindigkeitszentrifugation der Makrolösungen mit relativ niedriger Konzentration zusammen mit einem kleinen gelösten Stoff mit hoher Konzentration, der als der gradientbildende gelöste Stoff bezeichnet wird. Der Dichtegradient, der aus dem Konzentrationsgradient des konzentrierten kleinen Stoffes entsteht, kann vorgebildet oder durch den Einfluß des Zentrifugalfeldes selbstbildend sein. Gradientbildende gelöste Stoffe der Wahl für den Versuch mit dem selbstbildenden Gradient sind schwere Salze, wie zum Beispiel Chloride, Bromide oder Jodide, weil deren konzentrierte Lösungen eine niedrige Viskosität aufweisen, wodurch eine (relativ) schnelle Gradientbildung ermöglicht wird. Wenn der Dichtegradient gebildet ist, wandert jedes gelöste Makromolekül, um ein Band in dem Dichtegradient an einer speziellen Position zu bilden, die seiner Schwebedichte entspricht, d.h. der Position, an der die wirkende Zentrifugalkraft genau durch die Schwebe- oder Auftriebskraft aufgehoben wird. Das Verfahren arbeitet gut, weist jedoch zwei große Nachteile auf:
5 (a) Normalerweise wird die Probe solange zentrifugiert, bis eine Gleichgewichtsverteilung des gradientbildenden gelösten Stoffes erreicht ist (bis zu 24 Stunden und manchmal länger), um die gewünschte Separation der gelösten Makromoleküle sicherzustellen.
(b) Die Rotorgeschwindigkeit oder Rotordrehzahl und damit die Geschwindigkeit der Separation, sind durch die Bedingung begrenzt, daß die Lösung des gradientbildenden Salzes zu keinem Zeitpunkt der Zentrifugation am Boden (oder an der äußeren Kante) des Rohres eine Sättigung überschreiten darf, um die Möglichkeit einer Salzabscheidung zu verhindern, die den Rotor überbelasten und beschädigen oder den Zweck der Separation auf andere Art zunichte machen könnte.
Zu dieser Erfindung ist es durch den Wunsch gekommen, neue Arten von zeitsparenden Dichtegradient-Separationen zu entwickeln und die Bedingungen zu optimieren, unter denen herkömmliche Dichtegradient-Separationen durchgeführt werden, um somit die gewünschte Separation in so kurzer Zeit wie möglich zu erhalten.

Stand der Technik

[A] Experimentell

In dem Bemühen, die Laufzeiten zu verkürzen und die volumetrische Separation zwischen Bändern zu verbessern, haben O.M. Griffith et al die "Rapid Purification" von Plasmid-DNA durch eine einzige Zentrifugation in einem Zwei-Schritt Cäsium-Chlorid-Gradient entwickelt, die im Biochemical und Biomedical Research Communication, 29. Dezember 1983, S. 835 veröffentlicht wurde. Zur Plasmid-DNA-Separation wurden dabei die folgenden Merkmale verwendet:
1.) Relativ schnelle Rotoren mit Rohren, gefüllt mit einem vorgebildeten stufenförmigen CsCl-Gradient, was insgesamt zu einem schnelleren Erreichen des Gleichgewichts führt; und
2.) nach dem Betrieb mit einer relativ hohen Geschwindigkeit, die durch die mittlere Dichte der flüssigen Ladungen begrenzt ist, wird die Geschwindigkeit reduziert, um zu ermöglichen, daß der Salzgradient flacher wird und bessere volumetrische Separationen zwischen Bändern ergibt.
Ein anderer Grund für eine reduzierte Geschwindigkeit besteht darin, während des Hochgeschwindigkeitsbetriebs jegliche Salzabsetzung bzw. Salzausfällung zu vermeiden, die zu einer Rotorbelastung oberhalb der Betriebsparameter führen könnte. Die Laufzeiten wurden empirisch bestimmt, indem Durchläufe mit unterschiedlicher Dauer durchgeführt wurden. Es wurde die kürzeste Laufzeit gewählt, die zu akzeptablen Ergebnissen führt.

[B] Theoretische Simulation der Bandmigration

Die Veröffentlichung von Satory et al im Biophys. Chem. 5, 107; 1976 beschreibt ein Verfahren zum Betrieb einer Zentrifuge, wie es im Oberbegriff des Anspruchs 1 definiert ist.
Steensgaard und Moller (Subcellular Biochemistry, Vol 6, S. 117-141, D.B. Roodyn, ed., Plenum, N.Y., 1979) haben die zeitabhängige Migration gelöster Teilchen in einem zeitunabhängigen Sukrosegradienten während der Zentrifugation simuliert. Sie haben nicht gleichzeitig die vorübergehenden Änderungen in dem Material der gelösten Teilchen sowie dem Gradientmaterial während der Zentrifugation simuliert.
Minton, und später Chatelier und Minton, haben in der Vergangenheit Verfahren zur schnellen Simulation des Absetzverhaltens von nicht miteinander reagierenden und miteinander reagierenden Makromolekülen in einer Lösung ohne gradientbildende gelöste Stoffe oder Teilchen entwickelt. Diese Verfahren sind allgemein bekannt. Diese Verfahren sind auf das Verhalten von Makromolekülen beschränkt, die sich alleine in dem Zentrifugalfeld befinden. gradientbildende gelöste Teilchen und die damit auftretenden Wechselwirkungen mit Molekülen werden nicht behandelt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ergibt ein Verfahren zum Betrieb einer Zentrifuge, wie es im Anspruch 1 definiert ist.

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile

Ein Ziel dieser Erfindung ist es, dem Forscher eine wirkungsvolle Computer-Simulation der physikalischen Wechselwirkung von Gradienten und gelösten Teilchen innerhalb eines Zentrifugenrohres zur Verfügung zu stellen, wobei die Simulation Planungsvorbereitungen zur Ultrazentrifugation ermöglicht. Folglich wird eine Computer-Simulation der tatsächlichen Labor-Zentrifugation geschaffen. Die Computer-Simulation ist schnell. Der Benutzer, der die Ergebnisse der Simulation verwendet, kann die Labor- Zentrifugation beenden, sobald die Makromoleküle separiert oder getrennt sind.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen, als Planungsprotokoll zur Ultrazentrifugation verwendeten Programms ist, daß Zentrifugenbetriebszeit gespart wird. Die beim Stand der Technik erforderlichen Wiederholungen des Annäherungsverfahrens sind nicht erforderlich.
Ein zusätzlicher Vorteil ist, daß die Reinheit der Endprodukte nach dem Ermessen des Forschers verändert werden kann. Der Forscher kann die vollständige Separation abwarten. Alternativ kann eine geringere als die vollständige Separation erzielt werden. Die Zentrifugationszeit muß lediglich zu der gewünschten Reinheit des Endproduktes führen.
Noch ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das Programm einfach an unterschiedliche Zentrifugenrotoren angepaßt werden kann.
Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, daß das Gerät und das Verfahren nach der Erfindung auf alle Klassen von Lösungsmitteln und Materialien, die in diesen Lösungsmitteln lösbar sind, angewendet werden kann. Obwohl im allgemeinen mehr wasserlösliche gelöste Teilchen verwendet werden, können ebensogut andere Klassen von gelösten Teilchen und geeigneten nicht-wäßrigen Lösungsmitteln verwendet werden.
Ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls und Computer-Programms besteht darin, daß es zum ersten Mal möglich ist, das Fortschreiten der Separation innerhalb einer Zentrifuge genau zu modellieren. Es ist nicht erforderlich, daß eine tatsächliche Ansicht der Separation innerhalb eines analytischen Zentrifugenrotors erhalten wird; es ist weiterhin nicht erforderlich, daß ein präparativer Zentrifugenrotor angehalten und die Probenzelle geöffnet und fraktioniert wird.
Noch ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das Programm einfach an die anfängliche Position der Makromoleküle in den den Dichtegradient bildenden gelösten Teilchen angepaßt werden kann. Derartige Makromoleküle können ursprünglich gleichmäßig verteilt oder alternativ als diskrete Schichten angeordnet sein.
Eine weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, einen Dichtegradienten schnell zu entwickeln. Gemäß diesem Grundgedanken der Erfindung wird die Zentrifuge am Anfang mit einer Geschwindigkeit betrieben, die die gradientbildenden gelösten Teilchen endgültig aus der Lösung ausfällen würde. Der Betrieb wird bis zu einem Zeitpunkt aufrechterhalten, für den das hier beschriebene Programm voraussagt, daß eine lokale Konzentration in der Zelle soweit ansteigt, daß ein Ausfällen wahrscheinlich ist. Bevor diese vorhergesagte Konzentration erreicht ist, wird die Zentrifugationsgeschwindigkeit verringert. Sie wird nacheinander auf eine Höhe verringert, bei der niemals eine Konzentration erreicht wird, die zu einer Ausfällung der gelösten Teilchen führt.
-Ein Vorteil von diesem Grundgedanken der Erfindung besteht darin, daß die Bildung des Dichtegradienten beschleunigt werden kann. Folglich kann die gewünschte Separation gleichfalls beschleunigt werden.
Ein weiterer Vorteil von diesem Grundgedanken der Erfindung besteht darin, daß keine Gefahr der Ausfällung der gelösten Teilchen mit möglicher Rotorbeschädigung auftritt. Stattdessen kann der Rotor optimal zur Erzeugung des gewünschten Dichtegradienten auf einer beschleunigten Grundlage bis hin zum Ausfällen der gelösten Teilchen, jedoch nicht darüber hinaus, verwendet werden.
Ein weiterer Grundgedanke dieser Erfindung besteht darin, daß die experimentellen Ergebnisse, die bei einem Zentrifugenlauf bis zu einem teilweisen Gleichgewicht der gelösten Teilchen erhalten wurden, zur Vorhersage der physikalischen Eigenschaften der in Klassen eingeteilten Materialien verwendet werden können. Obwohl eine derartige Verwendung des hier beschriebenen Programms nicht dem hauptsächlichen Zweck der Erfindung entspricht, wird ein derartiges Ergebnis mit dem hier beschriebenen Gerät und Verfahren erzielt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein schematischer Querschnitt eines präparativen Zentrifugenrotors, der ein zylinderförmiges Probenrohr zeigt, das so angeordnet ist, daß seine senkrechte Achse mit einem Abstand von und parallel zur Drehachse verläuft, wobei das Rohr Separationen von Makromolekülen in zwei diskreten Bändern innerhalb eines gradientbildenden Materials enthält;
Fig. 2 ist eine Kurvendarstellung einer tatsächlichen Computer-Simulation, die die gradientbildende Lösung kurz nach dem Beginn der Zentrifugation zeigt, wobei die Separation der Probe gerade beginnt;
Fig. 3 ist eine der Fig. 2 ähnliche Ansicht zu einem späteren Zeitpunkt während der Zentrifugation, wobei die gradientbildende Lösung beginnt ihren Gradient zu bilden und die gepaarten Makromoleküle ihren Separationsvorgang beginnnen;
Fig. 4 zeigt die Zentrifugation zu einem noch späteren Zeitpunkt, wobei die vollständige Separation der Makromoleküle erreicht ist und die gradientbildende Lösung das Gleichgewicht erreicht;
Fig. 5 ist eine der Fig. 4 ähnliche Darstellung, die die gradientbildende Lösung ungefähr im Gleichgewicht mit der dargestellten wirksamen Gleichgewichtsseparation am Ende eines 24-Stunden Intervalls zeigt, wobei darauf hingewiesen wird, daß sieben Stunden der Zentrifugation wirksam durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung und die Beendigung der Zentrifugation zu dem vorhergesagten, in Fig. 4 gezeigten, Separationszeitpunkt vermieden werden können.
Fig. 6 ist ein Blockschaltbild des Ablaufdiagramms des Hauptprogramms;
Fig. 7 ist ein Ablaufdiagramm, das die Geometrieberechnungen durchführt, wobei die Geometrie darstellt, wie das Programm an verschiedene Rotorkonfigurationen angepaßt werden kann.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Fig. 1 zeigt einen schematisch dargestellten präparativen Rotor R, der sich um einen Drehmittelpunkt oder eine Drehachse 14 dreht. Es ist ein verschlossenes zylinderförmiges Rohr C gezeigt, das ein gradientbildendes Material G und separierte Makromoleküle B1 und B2 enthält. Das Rohr weist Radien Rmin und Rmax von der Drehachse 14 auf.
Es ist verständlich, daß diese Erfindung auch auf analytische Zentrifugen anwendbar ist. Analytische Zentrifugen schließen eine sektorförmige Zelle ein, die obere und untere Fenster aufweist, die eine Beobachtung während der Zentrifugation ermöglichen.
In Fig. 2 ist ein Computer-Ausdruck von zwei Funktionen gezeigt. Diese durch einen Computer erzeugte Darstellung zeigt die erste halbe Stunde einer simulierten Zentrifugation. In der oberen Darstellung ist zu erkennen, daß die Linie 30 das sich schließlich ergebende Dichtegradientgleichgewicht der dichtegradientbildenden gelösten Teilchen in der Lösung zeigt. Hier ist das Lösungsmittel Wasser. Der den gradientbildende gelöste Stoff ist Cäsium-Chlorid (CsCl). Die Linie 30 zeigt die Dichte an, die durch das CsCl beim Gleichgewicht gebildet ist. Am Ende einer halben Stunde wird der tatsächliche Dichtegradient durch die Linie 31 angezeigt.
Unterhalb der Kurve des Dichtegradienten ist eine Kurve der Verteilung der Makromoleküle in der Lösung zu erkennen. Hier sind die jeweiligen Makromoleküle in der Lösung B1 und B2 gleichmäßig über die Länge der Zelle verteilt.
In Fig. 3 ist die Separation bei 5 1/2 Stunden des computersimulierten Zentrifugenbetriebs gezeigt. Es ist zu erkennen, daß der tatsächliche Gradient 31 begonnen hat, sich auf den Gleichgewichtsgradienten 30 zu zu bewegen.
In der unteren Darstellung ist zu erkennen, daß das Makromolekül B1 beginnt, sich von den Makromolekül B2 zu trennen.
Fig. 4 zeigt eine Darstellung für 17 Stunden bei dem Computerlauf. Zu diesem Zeitpunkt nähert sich der tatsächliche Dichtegradient 31 mehr dem endgültigen Gleichgewichtsdichtegradienten 30. Zum selben Zeitpunkt sind die gelösten Teilchen B1, B2 zum ersten Mal vollständig separiert.
Unter der Annahme, daß die Separation der Spezies erwünscht ist, ist es verständlich, daß der Zentrifugationsvorgang zu diesem Zeitpunkt beendet werden könnte. Eine weitere Zentrifugation kann die Separation vergrößern und die Spezies weiter konzentrieren. Eine Zentrifugation bis zum Gleichgewicht ist nicht erforderlich.
In Fig. 5 ist der Zentrifugationsvorgang am Ende des 24-Stunden-Intervalls gezeigt. Es ist zu erkennen, daß die Verteilung des Gradienten sich weiter dem Gleichgewichtszustand nähert.
Zu diesem Zeitpunkt ist zu erkennen, daß eine sehr kleine weitere Separation zwischen den Makromolekülen B1, B2 bezüglich der in Fig. 4 gezeigten Separation aufgetreten ist. In diesem Fall ist verständlich, daß im wesentlichen keine quantifizierbare Verbesserung in den folgenden Stunden der Zentrifugation erzielt wurde.
Es ist verständlich, daß ein Benutzer als einen nach dem Betrieb folgenden Schritt, am Ende des in Fig. 4 gezeigten Zustandes, sehr wohl wünschen könnte, die Zentrifugation zu beenden.
Zusätzlich zu der hierin beschriebenen mathematischen Grundlagen werden drei Anlagen eingereicht, die einen Quellcodeausdruck enthalten, der für TURBO PASCAL geeignet ist, das auf einem PC der AT-Bauart betrieben werden kann. Dieses Programm produziert bei der Ausführung die vorliegenden Graphiken.
Weiterhin, und unter Bezugnahme auf die Fig. 6 und 7, kann nun die Gesamtfunktion des Programms, sowie seine Anpassung an Rotoren verschiedener Bauart beschrieben werden.
Das gradientbildende Material bildet einen veränderbaren Dichtegradient in Abhängigkeit von der Zeit und dem Zentrifugalfeld. Das Feld verändert sich direkt mit dem Abstand von der Drehachse. Unter der Annahme, daß im Fall der Fig. 1 zwei Makromoleküle vorliegen, bilden sich die jeweiligen Bänder B1 und B2 über ein Zeitintervall in dem Rohr C. Diese jeweiligen Bänder sind die Folge von zwei entgegengesetzten Kräften innerhalb des Gradientenfeldes.
Die erste Kraft steht mit der Absetzung in Verbindung. Diese Kraft bringt das Material dazu, sich relativ zur Drehachse zu bewegen. Die zweite, der Kraft der Absetzung entgegengerichtete Kraft, ist die Diffusionskraft. Diese Kraft würde beim Fehlen des Zentrifugalfeldes eine gleichmäßige Verteilung der Materialien innerhalb der Zelle aufrechterhalten.
Wie dies im folgenden noch ausgeführt wird, besteht der Zweck der Erfindung in der Simulation der Zentrifugation. Aus dieser Simulation können viele nützliche Ergebnisse folgen. Diese Ergebnisse können einschließen:
1) Optimierung der Laufzeit;
2) zeit- und positionsabhängige Informationen des separierten Bestandteils bzw. der separierten Bestandteile;
3) Vergleich der tatsächlichen Verteilung der Spezies mit der simulierten Verteilung der Spezies
Als Beispiel für die Art von Vergleich, den diese Erfindung ermöglicht, kann das vorhergesagte Verhalten von Makromolekülen mit dem tatsächlichen Verhalten von Makromolekülen in einer analytischen Ultrazentrifuge verglichen werden. Beispielsweise könnte zum Zweck der Zentrifugation angenommen werden, daß Moleküle einfache, nicht in Wechselwirkung stehende hydrodynamische Kugeln sind. Die Abweichung der tatsächlichen Ergebnisse von der Simulation könnte anzeigen, daß die Annahme falsch ist.
Andere simulierte Bedingungen, wie zum Beispiel unterschiedliche Molekülformen oder die Wechselwirkung der Moleküle - eines bezüglich eines anderen - , können danach untersucht werden.
Dem Leser sollte der Unterschied zwischen der Absetzung und der Diffusion von Molekülen und der zugehörige Absetz-Koeffizient und der Diffusions-Koeffizient der Moleküle bekannt sein. Der Absetz-Koeffizient und der Diffusions-Koeffizient sind physikalische Parameter von Makromolekülen. Die Absetzung und die Diffusion beschreiben die Änderungen in der Konzentration der Makromoleküle, die durch das Zentrifugalfeld bzw. den Konzentrationsgradienten verursacht werden. Die Bewegung der Makromoleküle ist eine Funktion der Koeffizienten und der verwendeten Versuchsparameter (Rotorgeschwindigkeit, Temperatur, gradientbildende gelöste Teilchen, usw.). Dieses Verständnis kann durch das Lösen einer Lamm-Gleichung gewonnen werden.
Wir verwenden Schätzungen der Koeffizienten der Makromoleküle und modellieren den tatsächlichen Absetz-Koeffizienten der gradientbildenden gelösten Teilchen theoretisch.
Die gelösten Makromoleküle wandern zu der Dichte, die gleich ihrer Schwebedichte in der Zelle ist. Die Makromoleküle, die sich in einem Abschnitt der Zelle mit höherer Dichte befinden, werden nach innen zu einem Bereich gleicher Schwebedichte treiben. Dieses Treiben wird auftreten, bis die Moleküle auftriebsmäßig neutral werden. Die Makromoleküle, die in einem Abschnitt der Zelle sind, der einen Gradient mit einer niedrigeren Dichte aufweist, werden sich nach außen in einen Bereich mit gleicher Schwebedichte absetzen. Diese Absetzung wird solange auftreten, bis die Moleküle auftriebsmäßig neutral werden.
Ein die Separation anzeigendes Computer-Modell wird erzeugt. Dieses Modell basiert auf den zugrundeliegenden physikalischen Gesetzmäßigkeiten, die die Absetzung und die Diffusion von jeder der Spezies bestimmen. Das Computer-Modell sagt die zeitabhängige Konzentration der sich separierenden Makromoleküle vorher.
Durch die Verwendung der Vorhersage kann eine optimale Beendigung des Zentrifugationsvorgangs erfolgen, wodurch eine Separation auf die wirkungsvollste Art ermöglicht wird.
Nachdem das Verfahren umrissen wurde, kann nun die Beschreibung des mathematischen Modells erfolgen.

[4b] Beschreibung des mathematischen Modells Kinetik der Gradientbildung

1. Die Dichte des Gradientbilders ist in der Massen-/Volumen-Konzentration linear.
(w) = &sub0; + (1 - &sub0;)w [1]
Dabei ist r die Dichte der Lösung, w ist die Gewichts-/Volumen-Konzentration der gelösten Teilchen, ist das partiale spezifische Volumen des Gradientbilders und &sub0; ist die Dichte des Lösungsmittels.
2. Empirische Funktionen, die die Konzentrationsabhängigkeit der thermodynamischen Aktivitätskoeffizienten γ(w,T) und den Diffusions-Koeffizienten D(w,T) bei festen Temperaturen T beschreiben, werden durch das Modellieren von im Experiment erhaltenen Daten erhalten. Aus der Funktion γ(w,T) wird eine zweite Funktion dln γ(w,T)/dw abgeleitet.
3. Unter der Voraussetzung, daß die Reibungskoeffizienten für die Absetzung und die Diffusion bei finiten Konzentrationen gleich sind, kann ein scheinbarer Absetz-Koeffizient des Gradientbilders als eine Funktion der Konzentration definiert werden:
Dabei ist M das Molekulargewicht der gradientbildenden gelösten Teilchen, T ist die absolute Temperatur, R ist die molare Gaskonstante und ist der Grad der Disassoziation des Gradientbilders (zum Beispiel ist = 2 für ein 1-1 Salz, und = 1 für eine nicht-ionische Lösung). Ein empirischer analytischer Ausdruck für s(w,T) wird durch die mathematische Modellierung numerischer Ergebnisse erhalten, die durch die Verwendung von Gleichung [2] erhalten werden.
4. Die vereinfachende Näherung wird durchgeführt, damit Wandeffekte ignoriert und der Transport der gelösten Teilchen als ein eindimensionaler Vorgang behandelt werden kann, d.h. die Kräfte hängen nur vom radialen Abstand ab und wirken nur in die radiale Richtung. Diese Annahme ist exakt für eine sektorförmige Zelle und sie ist wahrscheinlich ziemlich genau für eine zylinderförmige Zelle in einem Schwingbehälter-Rotor. Sie ist im Prinzip für Festwinkel- und Senkrecht-Rotoren ungenau, obwohl die bisher durchgeführten experimentellen Versuche hinsichtlich der sich aus dieser Anahme ergebenden Vorhersagen weder für den Festwinkel- noch den Senkrecht-Rotor wesentliche quantitative Fehler gezeigt haben. Die Annahme scheint somit in praktischer Hinsicht nützlich zu sein.
Es sollte verstanden werden, daß dieses Modell auf jede komplexe Rohrorientierung zur theoretischen Darstellung von 'Wandeffekten' in einer Nicht-Gleichgewicht-Situation (mit Ausnahme von Oberflächenrauheiten-Auswirkungen) ausgeweitet werden kann, indem das finite Differenzmodell 2- oder 3-dimensional gemacht wird. Es sollte weiterhin verstanden werden, daß die Berechnungszeit exponentiell mit der Anzahl der Dimensionen ansteigt. Die Absetz-Diffusionsgleichung (Lamm) in einer Dimension lautet:
Worin r der radiale Abstand, A (r) ist der Querschnitt des Zentrifugenrohres und ω die Winkelgeschwindigkeit des Rotors ist. Die entsprechende Gleichung wird numerisch gelöst, wobei zeit und positionsabhängige Werte von s(w,T) und D(w,T), die wie oben beschrieben als Funktionen der lokalen Konzentration w(r,T) berechnet wurden, um die Zeit- und Positionsabhängigkeit von w und bei der Temperatur T für einen beliebig gewählten Startgradienten w&sub0;(r) zu erhalten. Die Gleichung [2] ist derart formuliert, daß wenn die numerische Lösung der Lamm- Gleichung genau ist, die einschränkende Form des Gradienten von w über eine lange Zeit genau mit dem Gleichgewichts-Gradienten übereinstimmt.

Kinetik der Bandbildung der gelösten Makromoleküle

1. Die Abschätzungen der Absetz-Koeffizienten und der Diffusions-Koeffizienten von jeder der Bio-Spezies werden innerhalb der Grenze einer niedrigen Konzentration in reinem Lösungsmittel (Wasser) bei der gewünschten Temperatur entweder durch direkte experimentelle Messung oder über früher validierte empirische Funktionen erhalten, die eine (bekannte) makromolekulare Größe zu (unbekannten) hydrodynamischen Eigenschaften in Relation bringen.
Daten, die den Diffisions-Koeffizienten (D) für CsCl als Funktion der Konzentration (w) beschreiben, werden der Literatur entnommen. Dies sind veröffentlichte Daten (R.A. Robinson und R.H. Stokes, 'Electrolyte Solutions', Academic Press, NY, 1959). Zum Zweck des ESP-Programms haben wir die folgende empirische Kurvenanpassung auf diese Daten angewendet:
Dabei beschreibt w die Konzentration in gm/L.
Daten, die den Aktivitäts-Koeffizienten γ als Funktion der Konzentration beschreiben, werden ebenfalls den 'Electrolyte Solutions' von Robinson und Stokes entnommen. Die dort veröffentlichten Daten decken den Bereich von Konzentrationen bis zu ca. 800 gm/L ab.
Diese kombinierten Daten wurden dann, wie beschrieben, an eine Kurve als Funktion der Konzentration angepaßt.
dabei ist A = 0,108628, B = 0,101993, C = 0,139734 x 10&supmin;³ und D = 0,279410 x 10&supmin;&sup6;.
Diese Aktivitäts-Koeffizienten wurden dann zur Bestimmung der Absetz-Koeffizienten des Salzes als eine Funktion der Konzentration verwendet. Die Beziehung zwischen dem Aktivitäts- Koeffizienten und dem Absetz-Koeffizienten S ist hinreichend bekannt und in verschiedenen Texten beschrieben. Wir haben S bei verschiedenen Konzentrationen berechnet. Es wurde die folgende Kurvenanpassungsmethode verwendet, um einen einfacheren empirischen Zusammenhang zwischen S und der Konzentration w zu erhalten:
dabei ist S&sub0; = 0,64986 x 10&supmin;¹³, B&sub0; = 0,375793 x 10&supmin;¹&sup6;, B&sub1; = 0,130128 x 10&supmin;¹³ und B&sub2; = 0,288990 x 10&supmin;².
2. Zur Vereinfachung wird angenommen, daß die gelösten Makromoleküle nicht mit sich selbst oder miteinander in Wechselwirkung stehen. Die Simulation kann einfach modifiziert werden, um derartige Wechselwirkungen zu berücksichtigen, wenn das Experiment zeigt, daß diese unter den Bedingungen des tatsächlichen Experiments nicht unbedeutend sind.
3. Es wird angenommen, daß jede Makro-Spezies nur durch den Auftriebsfaktor mit den gradientbildenden gelösten Teilchen in Wechselwirkung steht, wodurch sich ein effektiver Absetz- Koeffizient ergibt: dabei ist s&sub0; der tatsächliche Absetz-Koeffizient bei der den Grenzwert bildenden niedrigen Konzentration in reinem Lösungsmittel.
4. Die Absetz-Diffusionsgleichung wird für jedes gelöste Makromolekül gleichzeitig mit der für die gradientbildenden gelösten Teilchen gelöst, wobei der effektive (dichteabhängige) Absetz-Koeffizient anstelle des tatsächlichen Absetz-Koeffizienten verwendet wird. Eine Viskositätskorrektur der Absetz- und Diffusions-Koeffizienten ist bei Salzlösungen nicht erforderlich, dürfte sich jedoch als notwendig erweisen, wenn die Berechnungen auf nicht-ionische gradientbildende Lösungen, wie zum Beispiel Glycerin oder Saccharose, ausgeweitet werden. Eine derarttige Korrektur ist direkt und einfach ausführbar.
Der Leser wird das Verfahren zur Vermeidung der Ausfällung und zur Minimierung der zur Separation erforderlichen Zeit verstehen. Die Drehzahl des Rotors wird bis kurz vor dem Erreichen der Gradientsättigungskonzentration am Boden des Rohrs auf dem höchst möglichen Wert gehalten, der mit der begrenzten Rotor-Festigkeitsgrenze in Einklang steht. Zu diesem Zeitpunkt wird die Drehzahl schrittweise reduziert, was zu einem vorübergehenden Absinken der Konzentration des Gradientmaterials am Boden des Rohrs führt. Die Größe von jedem aufeinanderfolgenden Drehzahlschritt ist derart gewählt, daß das nachfolgende Absinken der Gradientmaterialkonzentration an der Grundfläche des Rohrs minimal ist und 5 % nicht übersteigt. Dieses Verfahren reduziert drastisch die zur Separation erforderliche Zeit (z.B. um 50 %). Typischerweise werden 5 Drehzahlschritte verwendent, bevor die Separation abgeschlossen ist, wobei zu diesem Zeitpunkt die Drehzahl soweit reduziert wurde, daß der bestehende Übergang und die endgültige Gleichgewichtsgradientverteilung im Bereich der Makromolekülbänder nahe der Mitte des Rohrs gleich sind.
In einem Rotor, in dem eine 100%-ige Separation der gelösten Makromoleküle (Ausbeute) durch eine einzige Zentrifugation erwünscht war, die bei einer konstanten Drehzahl (52000 U/min) durchgeführt wurde, bei der die Gradientkonzentration beim Gleichgewicht nicht die Ausfällung übersteigt, wurde eine 100 %ige Ausbeute nach 18 Stunden, 49 Minuten erzielt. Dies stellt die im allgemeinen am häufigsten verwendete Labor-Gleichgewichts-Technik dar.
Bei einer einzigen Zentrifugation, die bei einer konstanten Drehzahl (von 62500 U/Min) durchgeführt wurde, trat eine 100%-ige Ausbeute nach 13 Stunden und 40 Minuten auf.
Unter Verwendung des gleichen Rotors und dessen Betrieb bei zwei diskreten Drehzahlen, wurde dieser zuerst für 2 Stunden und 90.000 U/Min betrieben. Ein Betrieb bei dieser Drehzahl würde im Endeffekt eine den Rotor beschädigende Ausfällung verursachen.
Danach wurde der Rotor für ungefähr 12 Stunden bei 59.000 U/Min betrieben. Nach 12 Stunden und 48 Minuten lag eine 100%-ige Ausbeute vor. Das zeigt, daß eine Zentrifugation mit zwei Geschwindigkeiten Zeit spart.
Zum Schluß wurde ein Fünf-Schritt-Zentrifugations-Protokoll verwendet. Die Zentrifuge wurde für zwei Stunden bei 90.000 U/Min betrieben, der die Ausfällung verursachenden Drehzahl. Danach wurde die Drehzahl des Rotors schrittweise, mit sich allmählich verringernder Schrittweite, verringert. Er wurde für 50 Minuten bei 80.000 U/Min, 2 Stunden bei 70.000 U/Min, 3 Stunden bei 65.000 U/Min und für die verbleibende Zeit bei 60.000 U/Min betrieben.
Eine 100%-ige Ausbeute trat nach 10 Stunden und 29 Minuten innerhalb des Protokolls auf. Es ist zu erkennen, daß damit über zwei Stunden der bei dem Zweischritt-Prokokoll erforderlichen gesamten Zentrifugationszeit gespart werden.
Dem Leser wird klar sein, daß ohne das hier beschriebene Programm Annäherungsverfahren für zahlreiche Proben erforderlich wären, um die minimale Laufzeit für die erwünschte Separation zu erhalten. Mit dem beigefügten Protokoll ist es möglich, im voraus sowohl die Zeit als auch die Lage der Zellfraktionierung vorherzusagen, um die gewünschte Separation der Spezies zu erhalten.
Hiermit werden gleichzeitig drei Anhänge eingereicht, die Ausdrucke eines Computer-Programms enthalten. Dieses Programm läuft auf einem Apollo DN 3500 oder DN 3000 Minicomputer, der von der Apollo Computer Company, Chelmsford, Massachusetts hergestellt wird. Dieses Programm wird auf jedem Apollo-Computer laufen, der Graphik-Aufrufe und -Funktionen oder einfache Graphikroutinen unterstützt. Diese Software erzeugt Graphiken, die ähnlich, jedoch nicht identisch mit den hier gezeigten Graphiken sind. Die Graphiken werden durch die Verwendung des Programms in Verbindung mit einem Seiko-Drucker, Modell 5303 erhalten, der von der Seiko Corporation, Japan hergestellt wird. Dieses Computer-Programm stellt unsere bevorzugte Ausführungsform dar.
Das Programm arbeitet gemäß dem in Fig. 6 gezeigten Flußdiagramm. Zum Start bei 100 wählt der Benutzer insbesondere einen Rotor für die Emulation. Ein Simulationsdurchlauf beginnt.
Am Anfang werden die Graphikfunktionen des Computers initialisiert (siehe 102).
Danach trägt der Benutzer beim Schritt 103 die Anfangswerte in die Arbeitsfelder ein. Diese Werte umfassen die Startkonzentration des gradientbildenden Salzes und die Makromoleküle zusammen mit den verwendeten Absetz- und Diffusionskonstanten.
Beim Schritt 104 werden die auf die Geometrie anwendbaren Berechnungen durchgeführt, wobei die Berechnungen schematisch für einen bestimmten Rotor in Fig. 7 gezeigt sind.
Wie dies in Fig. 7 gezeigt ist, werden die anfänglichen Geometriewerte, die den inneren und äußeren Radius, die Zylinderlänge und dergleichen umfassen, für einen speziellen Rotor eingestellt (siehe 110). Gemäß Schritt 112 werden die für die hierin beschriebenen weiteren Berechnungen verwerteten diskreten Radius-Werte festgelegt.
Gemäß Schritt 114 und für jeden der diskreten Radius-Werte müssen für alle simulierten Scheiben des Zentrifugenrohres Bereichswerte berechnet werden. Die spezielle Art des Zentrifugenrotors wird in Schritt 118 ausgewählt, der weiterhin die Art der Rohre festlegt, die in Schritt 119 auswählbar sind. Die Rohre können entweder zylinder- oder sektorförmig sein.
Wenn die Bereiche festgelegt wurden, wird das Volumen für jede simulierte Scheibe des Zentrifugenrohrs beim Schrit 130 berechnet.
Beim Schritt 140, bei dem Festwinkel- und Senkrecht-Rotoren verwendet werden, muß das Volumen der horizontalen Scheiben erneut berechnet werden, wenn das Rohr aus der Zentrifuge entnommen wird und sich die diskreten Schichten wieder mit der endgültigen senkrechten Lage des Rohres ausrichten. Wenn die Geometrieberechnungen vollständig durchgeführt wurden, wird der Hauptabschnitt des Programms fortgeführt.
Beim Schritt 200 werden die Gradienten berechnet. Insbesondere werden für jeden aufeinanderfolgenden Zeitschritt der Simulation die aufeinanderfolgenden Konzentrations-Feldwerte berechnet.
Danach wird die prozentuale Separation der zwei Bestandteile berechnet.
Um eine Ausfällung des gradientbildenden Salzes zu verhindern, wird eine Ausfällungsüberprüfung durchgeführt. Die Berechnung wird zu beliebigen Laufzeitpunkten unterbrochen, um die Konzentrationsdaten abzuspeichern und einen Graph zu zeichnen. Datensätze von jedem Laufzeitpunkt können beliebig ausgewählt und abgespeichert werden.
Als ein letzter Schritt 220 werden die zehn Beobachtungen der Laufzeit in dem System abgespeichert. Der Betrachter kann sich durch diese Datensätze vor und zurück bewegen, um diese als Kurven zu betrachten und um die dabei stattgefundene Separation anzusehen.
In den folgenden Ansprüchen wird die Nützlichkeit durch das gleichzeitige Vorliegen der Programmsimulation und einer echten Zentrifugation hervorgehoben. Um die tatsächliche Zentrifugation von der simulierten Zentrifugation zu unterscheiden, wurde der Ausdruck 'tatsächliche Zentrifugation' verwendet.

Claims

1. Verfahren zum Betrieb einer Zentrifuge, mit den folgenden Schritten:

Schaffung einer Zentrifuge, mit einem Rotor, der sich um eine Drehachse dreht, mit einer Zelle mit meßbaren Abmessungen, die mit einem bekannten Abstand von der Drehachse des Rotors gehalten wird, wobei die Zelle ein Lösungsmittel, gradientbildende gelöste Teilchen und wenigstens eine Art von Makromolekülen beinhaltet, und die Art der Makromoleküle bezüglich der gelösten Teilchen eine beliebige Verteilung und eine variable Schwebefähigkeit aufweist;

Bestimmung der Abmessungen der Zelle bezüglich der Drehachse;

für ein radiales Segment der Zelle mit einem festen Abstand von der Drehachse des Rotors wird die Näherung eines Dichtegradienten berechnet, der durch die gradientbildenden gelösten Teilchen in dem Lösungsmittel in einem Zentrifugalfeld, das durch die Rotation des Rotors bei einer bekannten Winkelgeschwindigkeit erzeugt wird, während eines Zeitzuwachses gebildet würde;

Simulation einer Migration der wenigstens einen Art von Makromolekülen als vielzahl einzelner hydrodynamischer Teilchen zur Bildung von Bändern, durch Berechnung eines Absetz- Koeffizienten für die wenigstens eine Art von Makromolekülen in dem Zentrifugalfeld während des Zeitzuwachses aus der Schwebefähigkeit der wenigstens einen Art von Makromolekülen;

Wiederholung der Berechnungsschritte für jedes radiale Segment für den Zeitzuwachs, wobei der Dichtegradient der Lösung in dem Lösungsmittel und ein Separationszustand der Makromoleküle im Verhältnis zu den Segmenten für den Zeitzuwachs und eine Vielzahl von Winkelgeschwindigkeiten mit zugehörigen vorhergesagten für die Lösungsausfällung abgeschätzten Zeitabschnitten bekannt sind;

Wiederholung der genannten Berechnungsschritte für aufeinanderfolgende Zeitzuwächse, wobei eine quantitative Abschätzung einer zeitabhängigen Position der Lösungsdichte und der Makromoleküle in der Zelle als Funktion der Zeit erhalten wird;

dadurch gekennzeichnet, daß die oben genannten Schritte der Berechnung, Simulation und Wiederholung für eine Vielzahl von nacheinander verringerten konstanten Winkelgeschwindigkeiten mit zugehörigen vorhergesagten Zeitabschnitten durchgeführt werden, die abgeschätzt wurden, um eine Lösungsausfällung gerade zu vermeiden, und daß die Rotation des Rotors bei jeder der Vielzahl von nacheinander verringerten konstanten Winkelgeschwindigkeiten für die zugehörigen vorhergesagten Zeitabschnitte erfolgt, wobei die gradientbildenden gelösten Teilchen in dem Lösungsmittel bei der Bildung ihres Gradienten im Vergleich zur Rotation bei einer einzigen Winkelgeschwindigkeit beschleunigt werden, wodurch wenigstens ein Band von Makromolekülen aus der beliebigen Verteilung auf der Grundlage der quantitativen Abschätzung der zeit- und winkelgeschwindigkeits-abhängigen Position der Makromoleküle in der Zelle gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Abbildung der quantitativen Abschätzung der zeitabhängigen Position der Lösungsdichte und der Makromoleküle einschließt, um zu diskreten Zeitpunkten diskrete Abbildungen der Dichte der Lösung und der Konzentration der Makromoleküle zu konstruieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin die folgenden Schritte einschließt:

Beenden der Zentrifugation zu einem Zeitpunkt bevor das Gleichgewicht des Lösungsmittels und der gradientbildenden gelösten Teilchen erreicht ist; und

Verwendung der Abbildungen zur Fraktionierung der Zentrifugenzelle.

4. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Anordnung von wenigstens ersten und zweiten Arten von Makromolekülen in der Zelle einschließt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zelle eine Zelle in einem analytischen Rotor ist, wobei die Zelle wenigstens eine Wand mit einem Fenster aufweist, um eine Beobachtung bzw. Abfrage der Zelle während der Zentrifugation zu ermöglichen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste der Vielzahl von konstanten Winkelgeschwindigkeiten ein erstes Zentrifugalfeld erzeugt, in dem das gradientbildende Lösungsmittel die gradientbildenden gelösten Teilchen aus dem Lösungsmittel ausfällen würde, und bei dem die Rotation bei jeder der Vielzahl der nacheinander verringerten konstanten Winkelgeschwindigkeiten vor der Ausfällung der gelösten Teilchen beendet wird.