JPH0628750B2 - 過渡分析及びフィードバックによる粒子の最適遠心分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遠心分離の間の密度勾配形成溶液中の巨大分子
(macromolecule)の挙動に関し、より詳しくは密度勾配
形成溶液中の巨大分子の時間依存及び位置依存濃度予測
を含むプロセスに関する。

（発明の背景） 等密度勾配分離として知られる溶液中の生物学的巨大分
子（巨大溶質）(macrosolute)の分離に広く使用される
技術には高濃度の勾配形成溶質と称される小(small)溶
質とともに比較的低濃度の巨大分子の高速遠心分離が含
まれる。濃厚な小溶質の濃度勾配から生起する密度勾配
は遠心力場の影響下で予め形成されるか又は自己形成さ
れよう。自己形成勾配実験のために選択される勾配形成
溶質は高濃度溶液が低粘度で（比較的）迅速な勾配形成
ができる、塩化物、臭化物又はヨウ化物などの重塩であ
る。密度勾配が形成されると、各巨大溶質は移行(migra
te)してその浮力密度に対応する密度勾配中のそれぞれ
の位置、すなわち、かけられた遠心力が浮力によって確
実に消去される位置にバンドを形成する。その方法はよ
く作動するが、次の２つの主要な欠点にわずらわされ
る： （ａ）従来行われているように、試料は巨大分子の所望
の分離を確実に得るために勾配形成溶質の平衡分布が得
られるまで（２４時間まで、時にはそれ以上）遠心分離
される。

（ｂ）ローター速度、したがって分離の速度は勾配形成
塩が遠心分離中のどの時間においても塩沈殿の可能性を
排除するよう遠心筒の底（もしくは外縁）で飽和をこえ
ないような条件により制限され、そのためローターに過
度の荷重がかかり、破損させるか分離の目的が損なわれ
る。本発明は新しい種類の時間節約型密度勾配分離を開
発すること及び従来の密度勾配分離が行われている条件
をできる限り短時間で所望の分離が得られるよう最適化
することという要望に応じるものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） （Ａ）実験 運転時間の短縮及びバンド間の量的分離の改善のための
努力として、オー、エム、グリフィスらはバイオケミカ
ル・エンド・バイオメディカル・リサーチ・コミニュケ
ーション、１９８３年１２月２９日号８３５ページに報
告された「２段階塩化セシウム勾配における単一遠心分
離によるプラスミドＤＮＡの迅速精製法」を開発した。
プラスミドＤＮＡの分離にこの文献では次の特色点を利
用している： １）集合的に平衡により早く近ずくのに役立つ予備形成
された段階つきCSC1を入れた筒を有する比較的高速ロー
ター、及び ２）充填液体の平均密度によって制限される比較的高速
で運転した後速度を下げ塩勾配をより狭くなるよう、バ
ンド間のよりよい量的分離が得られるようにする。

速度を下げるもう１つの理由は設計値以上の応力をロー
ターにもたらす高速操作中の塩の沈殿を避けるためであ
る。運転時間は継続時間を変えた運転を行うことにより
経験的に決められた。許容できる結果を与える最短運転
時間が選ばれた。

（Ｂ）バンド移行の理論的シミュレーションサートリー
らはバイオフィジカル・ケミストリー５，１０７：１９
７６において時間の関数としての勾配形成溶質及び巨大
溶質の分布を計算する方法を提供した。その方法は巨大
溶質の分布が対称的なバンドとして表わされる時にのみ
応用することができる。サートリーらにより用いられた
方程式は本発明開示で用いられるそれよりも非常に異っ
ており、かつ非常に複雑である。サートリーらの方程式
の数的解法には本発明よりも多くの計算を必要とすると
考えられ、恐らくＰＣ−型のマイクロコンピューターで
簡単に行うことができないであろう。彼らは時間に対す
るバンドの形、位置のどちらについても解法を示す結果
を公表していない。ステーンスガードとモーラー（サブ
セルラー・バイオケミストリー、第６巻、１１７〜１４
１ページ、ディー・ビー・ローディン編集、プレナム、
Ｎ．Ｙ．、１９７９）は遠心分離中における時間不変性
のスクロース勾配中の時間依存性の溶質移行をシミュレ
ートした。彼らは遠心分離中におかる溶質及び勾配物質
両方の過渡的変化を同時的にはシミュレートしなかっ
た。

ミントン及びそれに続くチャテリィアとミントンは既に
密度勾配形成溶質の不在下で非相互作用及び相互作用溶
質の沈降挙動の迅速シミュレーションの方法を開発し
た。これらの方法は権利消滅状態にある。これらの方法
は遠心力場のみにおける巨大分子の挙動に限定される。
そこでは勾配形成溶質及び分子間相互作用については取
り扱っていない。

（課題を解決するための手段） 遠心分離中の勾配形成溶液中の異った種の巨大分子類の
時間及び位置依存性濃度を予測する方法及び装置が開発
された。それぞれの種の沈降及び拡散を決める根本的な
物理学原則に基く遠心力場での勾配形成巨大分子溶質の
時間依存性挙動の数学的モデルが方式化されている。あ
る一定温度における拡散係数、活性係数及び溶液密度を
記述する経験的関数が公知のデータから得られる。沈降
及び拡散に対する摩擦係数はある有限の濃度において等
しいという仮定がなされる。壁効果は無視できる程度で
あり溶質の輸送は放射距離にのみ依存する一次元工程と
して処理することができるという単純化近似想定がなさ
れる。一次元の沈降分散(Lamm)方程式は数値的に積分さ
れる。巨大分子はお互いに相互作用しないと仮定する。
さらにそれぞれの巨大分子は浮力係数を通じてのみ勾配
形成溶質と相互作用すると仮定する。各々の巨大分子に
ついての沈降拡散方程式（Lamm方程式）は実験に基く密
度依存係数を用いて勾配形成溶質のそれと同時に解かれ
る。方程式は連続する放射セグメント中の遠心試料につ
いて増分時間周期毎に解かれる。方程式は勾配形成溶質
の濃度依存性沈降値及び拡散係数を用いる。全ての溶質
の任意に特定した初期分布についてある固定された温度
での溶質濃度の時間及び位置依存性が得られる。数学的
な解式の迅速な反復手段、前の反復によって得られた量
的な結果を利用しての連続的な反復によって時間及び位
置依存性の遠心分離プロセスの量的な数学モデル及び誘
導マップが実際の遠心分離に先立って得られる。得られ
た数学的解答及び誘導マップは研究者が勾配形成溶質が
平衡に到達する前にセル内の巨大溶質の所望の分離時間
及び位置を予測するのに利用することができる。最終的
にローターを破損させる勾配形成溶質の沈殿をもたらす
初期の遠心力場は勾配形成を促進させるのに用いること
ができ、遠心力場は沈殿の前に減少される。巨大分子溶
質の分離時間及びセル位置の両方を予測するのに開示さ
れたコンピューターモデルを利用するという手段によっ
て研究者は最小限可能な短時間で遠心分離を終らせるこ
とができ、その時間は先行技術において好ましいとされ
る平衡条件よりも相当短い時間である。実際の研究室遠
心分離と同時に使用するためのマス・コプロセッサーを
有する通常のＰＣ・ＡＴに適用できるコンピュータープ
ログラムが開示される。

（その他の目的、特徴及び利点） この発明の目的は遠心分離筒内の勾配形成物と溶質の物
理的相互作用をコンピューター上での有効なシミュレー
ション、超遠心分離用の分離計画を可能にするシミュレ
ーションを研究者に提供することにある。したがって、
実際の研究室遠心分離のコンピューターシミュレーショ
ンが提供される。そのコンピューターシミュレーション
は迅速である。シミュレーションの結果を利用してオペ
レーターは巨大分子が分離されるや否や研究室遠心分離
を停止させることができる。

遠心分離用計画プロトコルとして使用される開示プログ
ラムの利点は遠心分離操作時間が節約できることであ
る。従来の技術で必要だった試行錯誤の反復は必要でな
い。

その上の利点は最終生成物の純度が研究者の判断で変え
られることである。研究者は完全な分離を待つことがで
きる。別に完全でない分離を行うこともできる。遠心分
離の時間は所望の最終生成物の純度に到達するまでしか
必要でない。

さらにその上の利点はそのブログラムが異った遠心分離
ローターに容易に適用できることである。

この発明のさらにその上の利点は開示された装置及びプ
ロセスがすべてのクラスの溶剤及びその溶剤に可溶性の
物質に応用できることである。水溶性の溶質がより一般
的に使用されるけれども、その他のクラスの溶質及び非
水溶性溶剤に応用される溶質もまた使用されよう。

開示されたプロトコール及びコンピュータープログラム
のその上の利点は第一に遠心機内の分離の進行を正確に
モデル化できることである。分析用遠心分離ローター内
の分離の実際像を得る必要はなく、さらに分取遠心機ロ
ーターを止め、試料セルを開け分画する必要はない。

さらにもう１つの利点はプログラムが密度勾配形成溶質
中の巨大分子の最初の位置に容易に適用できることであ
る。そのような巨大分子は最初に均一に分布するか、さ
もなければ不連続の層として位置している。

本発明のさらにその他の目的は密度勾配を迅速に展開さ
せることである。本発明のこの局面によれば遠心機は最
初に溶液から勾配形成溶質が最終的に沈殿するような速
度で運転される。運転は開示プログラムがセル中の局部
的な濃度が沈殿が生じそうなところまで増加しているこ
とを予測する時点まで進行する。この沈殿濃度に到達す
る前に、遠心分離の速度が下げられる。それに続いて溶
質の沈殿が決して生じない濃度になるレベルまで下げら
れる。

発明のこの局面の利点は密度勾配の形成が促進されるこ
とである。したがって所望の分離も同様に促進される。

発明のこの局面のその他の利点はローターの破損を生じ
させる可能性のある溶質沈殿の危険性がないことであ
る。実際、ローターは所望の密度勾配が溶質沈殿するま
で、しかしそれをこえないまで加速されて生成するよう
最適に使用することができる。

本発明のその上の局面は一部溶質平衡の状態での遠心機
運転で得られた実験結果が分類される物質の物理的性質
を予測するのに利用できることである。開示されたプロ
グラムのそのような用途はこの開示の第一次用途ではな
いけれども、そのような結果は開示された装置及びプロ
セスから得ることができる。

（好ましい実施態様） 第１図には分離ローターＲが回転の中心１４の回りに回
転するよう模式的に示される。勾配形成物質Ｇ及び分離
される巨大分子Ｂ１及びＢ２を含有する密封された円筒
型遠心筒Ｃが示される。筒は回転の中心１４から半径Ｂ
min及びＢmaxの距離にある。

この開示は分析用遠心機にもまた応用できると理解され
よう。分析用遠心機には遠心中観察できる頂部及び底部
ウインドウを有する扇形セルが含まれる。

第２図には２つの関数のコンピュータープリントアウト
が図示されている。このコンピューター作成図形はシミ
ュレート構成に入った３０分間である。上方の図形につ
いては線３０が溶液中の密度勾配形成溶質の最終平衡密
度勾配を示していることがわかる。ここで溶媒は水であ
る。密度勾配形成溶質は塩化セシウム(CsCl)である。指
示線３０は平衡においてCsClによって形成された密度を
示す。半時間後の実際の密度勾配は線３１によって示さ
れる。

密度勾配のプロットの下には巨大分子分布のプロットが
見られる。ここでそれぞれの巨大分子Ｂ１及びＢ２はセ
ルの長さ方向に均一に分布している。

第３図にはコンピューターシミュレート運転での5.1/2
時間の分離が示されている。この時間に実際の勾配３１
は平衡勾配３０に向って動き始めていることが見られ
る。

下方の図形では巨大分子Ｂ１が巨大分子Ｂ２から分離し
始めていることがわかる。

第４図にはコンピューター運転１７時間のプロットが示
される。この時、実際の密度勾配３１は最終平衡勾配３
０により密接に接近している。同時に溶質Ｂ１、Ｂ２は
初めて完全に分離した。

種の分離が所望であるとすれば遠心プロセスはこの時に
停止することができよう。その上の遠心は種の分離を広
げ濃度を上げる。平衡化への遠心を生じさせる必要はな
い。

第５図は２４周期の終りにおける遠心プロセスを示す。
勾配形成物の分布が平衡状態に密接に接近していること
が見られる。

同時に、巨大分子Ｂ１、Ｂ２間には第４図に示される分
離から非常に僅かしか追加の分離が生じていないことが
認められる。この場合のように、遠心を継続した場合実
質的に何等定量的な改良が得られなかったことを理解す
ることができる。

オペレーターは、第４図で示される状態の終りでの追加
操作段階としての遠心を停止させたいと望むことができ
ることも理解されよう。

数学的な開示に加えて、ここにＡＴ変形のＰＣ上で操作
できるターボ・パスカル(TURBO PASCAL)（商標）に適し
たソースコードプリントアウトを提出した。このプログ
ラムが実行されると記載の図形が得られる。

勾配形成物質は時間及び遠心力場に応じて種々の密度勾
配を形成する。力場は回転の中心からの距離により直接
変化する。第１図の場合のように２種の巨大分子が存在
すると想定すれば、時間の経過とともに管Ｃの中にそれ
ぞれのバンドＢ１及びＢ２が形成する。これらそれぞれ
のバンドは勾配場における２つの相反する力の産物であ
る。

第１の力は沈降に関連する。この力は物質を回転軸につ
いて移動させる原因となる。第２の、沈降力に反する力
は拡散力である。この力は遠心力場が存在しない時セル
内での物質の均一な分布を維持する。

後でも述べるように、この発明の目的は遠心をシミュレ
ートすることである。このシミュレーションから多くの
有用な結果が得られる。それらの結果には次が含まれ
る。

１）運転時間の最適化 ２）分離した成分の時間および位置依存情報 ３）種のシミュレートした分布と種の実際の分布の比較 この発明が可能にする比較の種類の例として、予測され
た巨大分子の挙動と分析用超遠心での巨大分子の実際の
挙動を比較することができよう。例えば、遠心の目的が
単純な相互作用のない水力学的球体の分子であると想定
しよう。実際の結果がシミュレーションから相違してい
れば想定が間違っていることを示す。その後に他のシミ
ュレーション条件、互いに分子形状が異なり、あるいは
相互作用のあるような条件について試験することができ
る。

分子の沈降と拡散の相違及び対応する分子の沈降係数と
拡散係数の相違について理解すべきである。沈降係数と
拡散係数は巨大分子の物理的パラメーターである。沈降
と拡散はそれぞれ遠心力場と濃度勾配による巨大分子の
濃度変化を表わすものである。巨大分子の移動は係数及
び使用される実験パラメーター（ローター速度、温度、
勾配形成溶質など）の関数である。この理解はLamm方程
式の解式により得ることができる。

我々は巨大分子の両係数と勾配形成溶質の実際の沈降係
数の理論的モデルの評価を用いた。

巨大分子はセル中でその密度が浮力密度と等しくなるよ
う移動する。より高い密度の勾配を有するセルの部分に
ある巨大分子は等浮力密度の分野の内側の方へ浮遊す
る。この浮遊は分子が浮力中和されるまで生じる。より
低い密度の勾配を有するセルの部分にある巨大分子は等
浮力密度の分野の外側へ向って沈降する。この沈降は分
子が浮力中和されるまで生じる。

ぶんりを指示するコンピューターモデルが作られる。こ
のモデルは各々の種の沈降および拡散を支配する基本的
な物理的原理に基いている。コンピューターモデルは分
離巨大分子の時間依存性濃度を予測する。その予測を利
用して遠心工程の最適終結を行い、最も可能な効率的方
法による分離が可能になる。

工程の概要を述べたが、次に数学モデルについて述べ
る。

［４ｂ］数学モデルの説明 勾配形成の動力学 １．勾配形成物の密度は質量／容積 濃度 ρ（Ｗ）＝ρｏ＋（１−ｖρｏ）ｗ ［１］ 式中、ρは溶液密度、ｗは溶質の重量／容積濃度、ｖは
勾配形成物の部分的比容積、ρｏは溶剤の密度である。

２．一定温度Ｔにおける熱力学的活性係数、γ（ｗ，
Ｔ）及び拡散係数、Ｄ（ｗ，Ｔ）の濃度依存性を示す経
験的関数は実験から得られたモデル化データから得られ
る。

３．沈降及び拡散の摩擦係数が一定の濃度において等し
いと仮定すると、勾配形成物の見掛け沈降係数は濃度の
関数として決められる： 式中、Ｍは勾配形成溶質の分子量、Ｔは絶対温度、Ｒは
モルガス定数、νは勾配形成物の分離度（例えば、１−
１塩ではν＝２、非イオン溶質ではν＝１）である。s
(w,T)の経験的分析値は式（２）を用いて得られた多数
の結果の数学的モデル化により得られる。

４．単純化した近似化が壁効果は無視できるものであ
り、溶質の輸送は一次元プロセスとして処理できる、す
なわち、力は放射距離にのみ依存し、放射方向にのみ加
えられると仮定して行われた。この仮定は扇形セルには
正しく、振り回しバケツ型ローター中の円筒形セルには
恐らく全く正確である。それは、原理的には、固定角度
及び垂直ローターには不正確であるが、現在までこの仮
定から誘導された予測で行われた実験テストは固定角度
又は垂直ローターのいずれの場合も大きな定量的誤差を
まだ示していない。したがって、この仮定は実用的な感
覚では有用であるように見える。このモデルを理論的に
非平衡場における「壁効果」を示す（粗表面効果を除
く）何らかの複雑な管配置に演繹することは限られた差
の二次元又は三次元モデルを作ることによってできると
理解すべきである。さらに計算時間は次元の数に対して
指数的に増加することも理解すべきである。一次元の沈
降−拡散(Lamm)方程式は次の通りである。

式中、ｒは放射方向距離、A(r)は遠心管の断面積、ωは
ローターの角速度である。適切な方程式は上述したよう
に局部的濃度w(r,T)の関数として計算された時間及び位
置依存性値s(w,T)及びD(w,T)を用いて数値的に解かれ任
意の特定出発勾配w_o(r)に対する温度Ｔにおけるｗ及び
ρが得られる。方程式（２）の形式はもしラム方程式の
数値的解が正確であれば長い時間における勾配ｗの限ら
れた形が正確に平衡勾配に対応するような形式である。

巨大溶質バンド形成の運動学 １．所望の温度における純粋な溶媒（水）中の低濃度限
界でのぞぞれの生物種の沈降係数及び拡散係数の算定は
直接的な実験測定によるか又は（既知の）巨大分子サイ
ズの（未知の）流体力学的性質に関連する予め確認され
た経験的関数を通じてかのどちらかによって得られる。

濃度(w)の関数としてのCsClの拡散係数(D)を示すデータ
は文献から得られる。これらは公表データ（アール・エ
イ・ロビンソン及びアール・エイチ・ストークス「電解
質溶液」アカデミックプレス、エヌ・ワイ、１９５９）
である。我々はＥＳＰプログラムの目的のこれらのデー
タに次の実験的カーブ−フィットを応用した。

D(w)＝１ｘ10^-5x(1.74+0.262exp[-3.62x10^-2w] ＋1.15x10^-3w-5.26x10^-7w²) 式中、ｗは濃度ｇ／を表わす。

濃度の関数としての活性係数γを表わすデータもまたロ
ビンソンとストークス「電解質溶液」から取り出され
る。そこに公表されたテータは濃度約８００ｇ／の範
囲までをカバーしている。

これらの組み合わせデータは次に下記のように濃度の関
数としてカーブに適合された： γ＝[-AW^1/2]/[1+BW^1/2]+Cw+Dw² ここにＡ＝0.108628、Ｂ＝0.101993、Ｃ＝0.139734x1
0^-3、Ｄ＝0.279410x10^-6である。

これらの活性度係数は濃度の関数としての塩の沈降係数
を求めるのに使用した。活性度係数と沈降係数との関数
Ｓは公知であり、数種のテキストに記載されている。我
々は種々の濃度におけるＳを計算した。通常の場合には
適合するカーブを用いて次のようなＳと濃度ｗの間の簡
単な関係を求めた。

S(w)＝S_o-B_ow-B₁exp(-B₂w) ここにS_o＝.64986x10^-13、B_o＝.375793x10^-16、B₁＝.13
0128x10^-13、B₂＝.288990x10^-2である。

２．簡単にするため、巨大溶質は自己相互作用ないし互
いの相互作用をしないと仮定する。シミュレーションは
もし実際の実験条件下でそれらの相互作用が無視できな
いことが実験によって示されるならばその相互作用を計
算にいれて直ちに修正することができよう。

３．各巨大種は浮力因子を通じてのみ勾配形成溶質と相
互作用し、有効な沈降係数が得られる。： 式中、Soは純粋な溶媒中での限定された低濃度における
実際の沈降係数である。

４．各巨大分子の沈降−拡散方程式は真の沈降係数の代
りに有効（密度依存の）沈降係数を用い勾配形成溶質の
それと同時に解かれる。沈降係数及び拡散係数の粘度補
正は塩溶液の場合には必要でないが、計算がグリセロー
ル又はスクロースのような非イオン性勾配形成溶質にま
で演繹される場合には必要であることが証明されるよう
である。そのような補正は直ちにかつ容易に実施され
る。

沈殿を避け、分離に必要な時間を最小にするプロセスに
ついて理解することができよう。ローターの速度は筒の
底で勾配飽和濃度に到達する寸前までローター強度限界
に一致した可能な最高値に維持される。この時速度が落
され、その結果筒の底の勾配物質濃度が瞬間的に下が
る。それに続く各速度段階の速度はそれの結果として生
じる筒の基部の勾配物質濃度の低下が極微になる、５％
を越えないように選定される。この方法は分離に必要な
時間を劇的に（例えば、５０％までも）減少させる。典
型的には５段階の速度が分離が完了するまでに用いられ
るが、その完了時点の速度は筒の中央部近くの巨大分子
のバンドの付近での過渡的平衡勾配分布と最終平衡勾配
分布とが等しくなるところまで落される。

勾配濃度が沈降濃度をこえない平衡の一定速度（５２０
００ＲＰＭ）で行われる単一遠心でローター内で巨大分
子の１００％分離（収率）が所望だった場合、１００％
収率は１８時間４９分で得られた。これは現在もっとも
よく用いられる研究室平衡技術を代表する。

一定速度（６２５００ＲＰＭ）で行われた単一遠心で
は、１００％収率は１３時間４０分で得られた。

同じローターで２つの不連続速度での運転の場合、第１
の運転は９０，０００rpmで２時間であった。この速度
での運転は最終的にはローターを破損する沈殿を招くで
あろう。

その後ローターは５９，０００rpmで約１２時間運転さ
れた。１２時間４８分で１００％収率が示された。これ
は２速度遠心が時間を節約することになることを示して
いる。

最後に５段階遠心プロトコルが用いられた。遠心は沈殿
を招く速度の９０，０００rpmで２時間運転された。そ
の後、ローターの速度は段階的に落された。その運転は
８０，０００rpmで５０分、７０，０００rpmで２時間、
６５，０００rpmで３時間、６０，０００rpmで残りの時
間に行われた。

１００％収率はプロトコル中１０時間２９分で生じた。
これから全遠心時間で２段階運転のプロトコルより２時
間以上節約されることが分る。

ここに記載したプログラムなしで所望の分離の最小運転
時間を得るには無数の試料についての試行錯誤が必要で
あろうことは理解されよう。ここに含まれるプロトコル
を用いると時間及びセル分画両方の進行とともに所望の
種の分離を得る位置を予測することが可能である。

ここにコンピュータープログラムのマイクロフィシュが
同時に提出される。このプログラムはマサチューセッ
ツ、ケルムスホルドのアポロ・コンピューター社製アポ
ロＤＮ３５００又はＤＮ３００で運転した。このプログ
ラムは図形呼出し及び機能又は図形プリミティブルーチ
ンを支援する他のアポロコンピューターのどれでも運転
されよう。このソフトウエアはここに示した図形と同様
ではあるが同一ではない図形を作る。図形は日本のセイ
コウ社製セイコウ・ハード・コピア・モデル５３０８に
関連したプログラムを使用して得られた。このコンピュ
ータープログラムは我々の好ましい形態である。

プログラムは第６図に示すフローチャートに従って行わ
れる。特に、１００のスタートに関してユーザーはエミ
ュレーション用ローターを選定する。シュレーション運
転がセットされる。

最初にコンピューターの図形機能の初期値設定が行われ
る（１０２参照）。

その後、ステップ１０３としてユーザーは作業アレイに
その初期値を入れる。これらの値には利用される勾配生
成塩及び巨大分子の沈降定数及び拡散定数とともに開始
濃度が含まれる。

ステップ１０４としてジオメトリーに適切な計算がなさ
れ、その計算はその特定のローターについて第７図に模
式的に示される。

第７図において、その特定のローターの内部半径及び外
部半径、円筒長その他を含む初期ジオメトリー値がセッ
トされる（１１０参照）。ステップ１１２について、こ
こに示される増分計算をするのに利用される不連続半径
値が設定される。

ステップ１１４について及び各不連続半径値について、
遠心筒のすべてのシミュレート薄切部分に対する領域値
が計算されねばならない。遠心ローターの特定の形式は
ステップ１１８で選定、換言すればステップ１１９で選
択可能な筒の形式設定するステップ１１８で選定され
る。筒は円筒計でも扇形でもよい。

領域が決定されたならば遠心筒の各シミュレート薄切部
分の容量がステップ１３０で計算される。

ステップ１４０について、固定角度で垂直なローターガ
用いられる場合、水平な薄切部分の容量は筒が遠心機か
ら取り出された時再計算されねばならず、不連続な層は
筒の最終垂直配置で再配列されねばならない。ジオメト
リー計算が完了すれば、プログラムの主要部分が続けら
れる。

ステップ２００において、勾配が計算される。特に、連
続する濃度アレー値はシミュレーションの連続する時間
ステップ毎に計算される。

その後、２つの成分の分離パーセントが計算される。

勾配形成塩の沈殿を防ぐために沈殿についてのチェック
がなされる。計算の割り込みが任意の運転時間になさ
れ、濃度データが保存され、グラフが描かれる。各運転
時間からのデータセットは任意に選定され、記憶され
る。

最終ステップ２２０において、１０運転時間の測定値が
システム中に保存される。監視者はこれらのデータセッ
トを前後に移動させ、それらをグラフとして見たり、そ
こに示された分離を見ることができる。

請求の範囲において実際の分離に平行したプログラムシ
ミュレーションによって用途を強調してある。シミュレ
ート遠心から実際の遠心を区別するため用語「実際遠
心」を用いた。

３つのフィッシュ上の６６フレームからなるマイクロフ
ィッシュをアペンデックスとして別途提出した。

【図面の簡単な説明】

第１図は分取遠心ローターの断面の模式図であり、ロー
ター軸から離れて平行に位置した垂直軸を有する円筒形
試料筒を示し、その筒に勾配形成物質内で不連続のバン
ドで分離する巨大分子を含み、 第２図は実際のコンピューターシミュケーションの図形
であり、遠心短時間後の勾配形成溶液が試料と丁度分離
の始まりが開始したことを示し、 第３図は遠心中のより遅い時間における第２図と同様の
図形でであり、勾配形成溶液が勾配を形成し始め、対の
巨大分子がその分離プロセスを始めたことを示し、 第４図はさらにより遅い時間における遠心分離を表わ
し、巨大分子の完全な分離の達成及び勾配形成溶液の平
衡への近接を示し、 第５図は第４図と同様な図であり、２４時間周期の終に
示される有効な平衡分離とともに勾配形成溶液がほぼ平
衡にあることを示し、ここに本発明方法を用い、第４図
に示した予測された分離時間において遠心を終結するこ
とにより７時間の遠心分離が有効に回避できることを示
し、 第６図は全プログラムのフローチャートのボロックダイ
ヤグラムであり、 第７図はジオメトリー計算を説明するフローチャートを
示し、ジオメトリーはプログラムが種々のローター形態
に順応できることを示す。 符号の説明 Ｒ……ローター、Ｃ……遠心筒 Ｂ１、Ｂ２……巨大分子、 Ｇ……勾配形成物質、 ３０……最終平衡勾配、 ３１……実際密度勾配。

フロントページの続き (72)発明者 ロバート ギーベラー アメリカ合衆国 95014 カリフォルニア 州 キューパティノ レッド ファー 21084

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】溶質及び溶剤を含有する勾配形成溶液中の
   異る種の巨大分子の遠心分離時間及び位置に依存する分
   離を予測する方法であって、 ローターのスピン軸に関するセルの寸法を計算し、 溶剤、勾配形成溶質及び少なくとも１つの種の巨大分子
   の前記セル中の位置を想定し、前記種は前記溶媒中の前
   記勾配形成溶質に関して変化することができる浮力を有
   するものであり、 前記ローターのある時間の増分に対する遠心力場生成回
   転数を想定し、 前記増分時間中の前記遠心力場における前記溶媒中の前
   記勾配形成溶質によってつくられる密度勾配を前記回転
   ローターのスピン軸から固定の距離にある前記セルの増
   分について決定し、 前記少なくとも１つの種の巨大分子の浮力から前記増分
   時間中の前記遠心力場における前記巨大分子についての
   沈降係数を決定し、 前記セルの放射方向の各セグメントについて前記時間の
   増分毎に前記決定段階を繰り返し、それにより前記溶媒
   中の前記溶質の密度勾配及び前記セグメントに関する前
   記巨大分子の分離状態を前記時間の増分について知り、 前記決定段階を次々の時間の増分毎に繰り返し、それに
   より前記セル中の前記溶質密度及び巨大分子の時間依存
   性位置を時間の関数として定量的な見積りを得る 各段階を有してなる予測方法。
2. 【請求項２】不連続の時間について前記溶質の密度の不
   連続マップ及び前記巨大分子の分離の不連続マップを作
   図する前記遠心分離モデルのマッピングをする段階を有
   してなる請求項（１）の方法。
3. 【請求項３】遠心溶媒、勾配形成溶質及び少なくとも１
   つの巨大分子中で遠心する段階、 前記溶媒と前記勾配形成溶質との平衡が達成されるまで
   の時間に前記実際の遠心分離を終らせる段階、及び 前記遠心分離セルを分画するために前記マップを利用す
   る段階 を有してなる請求項（２）の方法。
4. 【請求項４】不連続の時間周期の終りに前記勾配形成溶
   質が前記溶剤から沈殿析出する第１のより大きい遠心力
   場を発生させるよう前記ローターの回転を予想し、 前記不連続の時間周期の終る前により小さい遠心力場を
   つくりそれにより前記溶剤中の前記勾配形成溶質のその
   勾配形成を促進させるが沈殿を生じさせないよう前記ロ
   ーターのより少ない回転速度を予想する 段階を有してなる請求項（２）の方法。
5. 【請求項５】前記セル中の巨大分子の少なくとも第１及
   第２の種の位置を予想する段階を含んでなる請求項
   （１）の方法。
6. 【請求項６】前記セルが分析ローター中のセルであり、
   前記セルが遠心分離中前記セルの取り調べができるよう
   ウインドウを有した少なくとも１つの壁を持つものであ
   る請求項（１）の方法。
7. 【請求項７】前記勾配形成溶媒が前記勾配形成溶質を前
   記不連続な時間の終りに前記溶媒から沈殿させるような
   第一の大遠心力場を発生させる前記ローターの回転数予
   測が前記ローターの回転数を複数の不連続段階で前記溶
   媒から沈殿する速度でローターの運転が徐々に速度を落
   しそれにより遠心時間を低減することができる段階を含
   んでなる請求項（４）の方法。