DE69028001T2

DE69028001T2 - Qualitätssteigerung von mr-bildern von knochen und ähnlichem gewebe mittels paramagnetischer kationenkomplexe und polyphosphonatliganden

Info

Publication number: DE69028001T2
Application number: DE69028001T
Authority: DE
Inventors: Rosa Cyjon; Joseph Klein; Ofer Klein; Elliot Simhon; Harry Winchell; Haim Zaklad
Original assignee: Concat Ltd
Current assignee: Chelator LLC
Priority date: 1989-11-27
Filing date: 1990-10-17
Publication date: 1996-12-19
Anticipated expiration: 2010-10-18
Also published as: WO1991007911A1; ATE140869T1; CA2069638A1; EP0513000A4; EP0513000B1; DK0513000T3; ES2091251T3; DE69028001D1; JPH05504127A; AU649001B2; GR3020861T3; EP0513000A1; JP2593963B2; AU6732290A; CA2069638C

Description

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der magnetischen Resonanzabbildung und betrifft die Technik der Kontrastverstärkermittel, welche in Zusammenhang mit der magnetischen Resonanzabbildung bei der medizinischen Diagnostik verwendet werden.
Die Verfügbarkeit von Vorrichtungen für die magnetische Resonanzabbildung (MRI) führte zu der Verwendung der MRI bei medizinischen Untersuchungen, zum Nachweis und der Diagnose von Krankheitszuständen und anderen inneren Leiden. Die fortlaufende Verwendung und Entwicklung der MRI regte das Interesse in der Entwicklung von pharmazeutischen Agenzien an, welche in der Lage sind, die MRI-Abbildungen auf für die Diagnose brauchbare Weisen zu verändern. Pharmazeutische Agenzien (MRI-Pharmazeutika), welche von Wissenschaftlern auf diesem Gebiet favorisiert werden, sind geeignet komplexierte, paramagnetische Metallkationen. Die Verwendung von Pharmazeutika bei der MRI-Abbildung bietet umfangreiche Möglichkeiten für die Verbesserung des Wertes der diagnostischen Informationen, die erhalten werden kann.
Radiopharmazeutika, welche auf eine zu den MRI-Pharmazeutika analogen Weise in der Radioisotopenabbildung verwendet werden, sind ein hoch entwickeltes Gebiet. Das auf diesem Gebiet vorhandene Wissen stellt einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von MRI-Pharmazeutika dar. MRI-Pharmazeutika müssen bestimmte Charakteristiken erfüllen, welche jedoch im Fall von Radiopharmazeutika nicht notwendig oder deutlich weniger kritisch sind. MRI-Pharmazeutika müssen in größeren Mengen als Radiopharmazeutika verwendet werden. Als Ergebnis müssen sie nicht nur detektierbare Veränderungen hinsichtlich der Protonen-Relaxationsgeschwindigkeit, für gewöhnlich als die longitudinale Protonenrelaxationsfrequenz (Kehrwert der longitudinalen Protonenrelaxationszeit) oder 1/τ&sub1; ausgedrückt, erzeugen, sondern sie müssen ebenfalls (a) deutlich weniger toxisch sein, wodurch die Verwendung von größeren Mengen ermöglicht wird, (b) wasserlöslicher sein, um die Verabreichung einer höheren Dosis in einem physiologisch akzeptablen Lösungsvolumen zu ermöglichen, und (c) in vivo stabiler als ihre radiopharmazeutischen Gegenstücke sein. Die in vivo Stabilität ist wichtig, hinsichtlich der Verhinderung der Freigabe von freien paramagnetischen Metallen und freien Liganden im Körper des Patienten und ebenfalls bedenklich, aufgrund der höheren verwendeten Mengen. Aus denselben Gründen sind MRI-Pharmazeutika besonders wünschenswert, welche innerhalb kurzer Zeiträume eine Ganzkörper-Clearance aufzeigen.
Da Radiopharmazeutika in sehr geringen Dosen verabreicht werden, bestand eine geringe Notwendigkeit die Toxizität dieser Agenzien zu minimieren, bei gleichzeitiger Maximierung ihrer Wasserlöslichkeit, in vivo Stabilität und der Ganzkörper-Clearance. Es ist daher nicht überraschend, daß nur wenige der für die Verwendung als Komponenten in Radiopharmazeutika-Zusammensetzungen entwickelten Liganden für die Verwendung bei der Herstellung von MRI-Pharmazeutika geeignet sind. Eine anzumerkende Ausnahme ist der gut bekannte Ligand Diethylentriaminopentaessigsäure (DTPA), welcher sich als brauchbar erwiesen hatte bei der Bildung von Komplexen mit sowohl Radiokationen, pharmakologisch geeigneten Salzen, welche brauchbare Radiopharmazeutika zur Verfügung stellen, als auch paramagnetischen Kationen wie Gadolinium, deren pharmakologisch geeignete Salze sich als MRI-Pharmazeutika brauchbar erwiesen haben.
Einige Gruppen von Radiopharmazeutika neigen dazu sich in Knochengeweben zu konzentrieren, und werden somit verwendet, um diagnostische Informationen bezüglich Knochenstörungen zur Verfügung zu stellen. Die Eigenschaften dieser Agenzien, wel- che zu Ihrer Lokalisation in Knochen führen, ermöglichen auch deren Verwendung zum Erhalt brauchbarer Informationen bezüglich der Funktion von Nieren, der Größe und Lokalisierung von Herzinfarkten, den regionalen Zusammenbrüchen der Bluthirnschranke und anderen ähnlichen bzw. verwandten organischen Leiden. Es ist verständlich, daß die Verwendung von paramagnetischen Agenzien, welche sich in Knochen konzentrieren, bei der MRI-Abbildung ähnliche spezifische, diagnostische Informationen zur Verfügung stellen würden.
Bei der in vivo Verabreichung konzentrieren sich die meisten bekannten MRI-Pharmazeutika nicht von selbst in spezifischen Geweben, sondern verteilen sich stattdessen auf eine nicht spezifische Weise im extrazellulären Fluidraum. Ein Hilfsmittel zum Erzielen einer Konzentrierung dieser für sich nicht spezifischen Pharmazeutika in ausgewählten Geweben geschieht durch die Konjugation mit Biomolekülen, welche sich in den Bereichen von Interesse konzentrieren. Ein anderes Hilfsmittel ist das Einbringen dieser Komplexe in Körper, welche sich in den Bereichen von Interesse konzentrieren. Bei solchen Anlagerungen oder Einlagerungen wurden Hormone, Albumine, Liposome und Antikörper erwähnt. Siehe Gries, H., et al., US-Patent-Nr. 4,647,477, 3. März 1987.
Es wurde jetzt entdeckt, daß die Steigerung der MRI- Abbildung von Knochengewebe und anderem Gewebe, welches biospezifische Erkennungseigenschaften im Zusammenhang mit Knochen besitzt, durch die Verwendung von Liganden, welche diese Erkennungsspezifität tragen, in Verbindung mit paramagnetischen Metallkationen und der Verabreichung in der Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen erreicht wird. Diese Komplexe sind für die Verwendung als MRI-Kontrastverstärkermittel voll geeignet und neigen dazu, sich im Knochengewebe zu konzentrieren, ohne entweder an knochenspezifischen Biomolekülen konjugiert zu sein, oder in Körper eingelagert zu sein, welche sich in Knochen konzentrieren. Bevorzugt sind Phosphonatgruppen enthaltende Liganden und weiter bevorzugt sind Liganden, welche drei oder mehrere Phosphonatgruppen enthalten, welche vorzugsweise durch Alkylbrücken am Stickstoffatom gebunden sind. Noch weiter bevorzugt sind cyclische Gruppen, insbesondere Polyazacycloalkane. Besonders bevorzugte Liganden sind Triazacyclononane und Tetraazacyclododecane mit an den Stickstoffatomen angelagerten Dihydroxyphosphorylmethyl- oder Dihydroxyphosphorylethylgruppen, wobei diese Gruppen gegebenenfalls an den Methyl- oder Ethylbrücken mit Alkyl-, Aryl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen substituiert sind.
Gemäß eines ersten Aspekts der Erfindung wird ein pharmazeutisches Agens zur Verfügung gestellt, für die Verwendung beim Abbilden von Knochen und anderen Patientengeweben, welche ebenso wie Knochen Erkennungsmerkmale besitzen, mittels magnetischer Resonanz, umfassend ein physiologisch verträgliches Salz eines Chelats eines paramagnetischen Metall- Kations und einer Verbindung mit der Formel:
in welcher:
die R¹¹-Gruppierungen jeweils unabhängig
sind, in welchen R¹&sup4;, R¹&sup5; und R¹&sup6; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, R¹&sup7; aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus H, OH, NH&sub2; und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, und n gleich Null oder 1 ist;
die R¹²-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen;
die R¹³-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen;
t gleich 2 oder 3 ist;
u gleich 2 oder 3 ist;
v gleich 2 oder 3 ist; und
w gleich 1 bis 4 ist.
Vorzugsweise umfaßt das pharmazeutische Agens ein chromatographisch eindeutiges, physiologisch verträgliches Salz eines Chelats eines paramagnetischen Metall-Kations und einer Verbindung mit der Formel
in welcher:
die R²¹-Gruppierungen jeweils unabhängig
sind, in welchen R²&sup4;, R²&sup5; und R²&sup6; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, R²&sup7; aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus H, OH, NH&sub2; und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, und x gleich Null oder 1 ist;
die R²²-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen; und
die R²³-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen.
Gemäß eines zweiten Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung des Kontrastes bei der magnetischen Resonanzabbildung von Knochengewebe und anderem Gewebe eines Patienten, welches ebenso wie Knochengewebe Erkennungsmerkmale besitzt, zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines pharmazeutischen Agens gemäß dem oben beschriebenen ersten Aspekt der Erfindung umfaßt.
US-Patent-Nr. 4,880,007 beschreibt Komplexe, welche zwischen (a) einem Amino-di- oder polyphosphonat, in welchem Phosphonatgruppen separate Kohlenstoffatome beinhalten, und (b) einem paramagnetischen Metallion wie GD³&spplus; gebildet werden, und Eigenschaften für die Suche von calcifiziertem Gewebe besitzen sollen, was sie als Kontrastmittel für die Untersuchung des Knochenmetabolismus durch NMR-Abtastung geeignet macht. Das Dokument identifiziert jedoch lediglich 15 spezifische Polyphosphonatliganden, und in vivo Verteilungsdaten werden lediglich für drei der 15 vorgebracht. Darüber hinaus wird von diesen drei Verbindungen lediglich eine als ein gutes Knochen-suchendes Mittel bezeichnet, jedoch sogar diese angebliche Eigenschaft wird nicht durch aktuelle Testdaten verifiziert.
In den obigen Definitionen von R¹¹ und R²¹ sind einige Verbindungsklassen bevorzugt. Für diese Arten in R¹¹, bei denen n gleich 1 ist, ist eine bevorzugte Klasse die, in welcher R¹&sup4;, R¹&sup5; und R¹&sup6; jeweils H sind, und R¹&sup7; H, OH, NH&sub2;, C&sub1;-C&sub8;-Alkyl, Phenyl oder Benzyl ist. Eine weitere bevorzugte Klasse ist die, in welcher R¹&sup4;, R¹&sup5; und R¹&sup6; jeweils H sind, und R¹&sup7; H, OH, NH&sub2;, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder Benzyl ist. Für diese Arten von R¹¹, in welchen n gleich 0 ist, ist eine bevorzugte Klasse die, in welcher R¹&sup4; und R¹&sup5; unabhängig voneinander H, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder Benzyl sind, wohingegen eine weitere bevorzugte Klasse die ist, in welcher R¹&sup4; und R¹&sup5; beide H sind, und noch eine weitere bevorzugte Klasse ist die, in welcher R¹&sup4; H ist und R¹&sup5; H, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder Benzyl ist. In den entsprechenden bevorzugten Klassen von R²¹, sind die Gruppen für R²&sup4;, R²&sup5;, R²&sup6; und R²&sup7; dieselben, wie R¹&sup4;, R¹&sup5;, R¹&sup6; und R¹&sup7;.
Die R¹² und R²² Gruppen in diesen Formeln können von einer beliebigen einzelnen Art dieselben oder verschiedene und jeweils unabhängig H oder Alkyl- oder Arylgruppen sein, welche die Komplexierung nicht beeinflussen.
Gleichermaßen können die R¹³ und R²³ Gruppen in diesen Formeln von einer beliebigen einzelnen Art dieselben oder verschiedene und jeweils unabhängig H oder Alkyl- oder Arylgruppen sein, welche die Komplexierung nicht beeinflussen.
In der Formel 1 können t, u und v gleich oder verschieden und jeweils entweder 2 oder 3 sein. Der Wert von w ist 1 bis einschließlich 4, weiter vorzugsweise 1 bis einschließlich 3, und am meisten bevorzugt entweder 1 oder 2.
In bevorzugten Ausführungsformen sind alle R¹¹ und R²¹ Gruppen einer beliebigen einzelnen Art dieselben. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind alle R¹² und R²² Gruppen einer beliebigen einzelnen Art gleich, und alle R¹³ und R²³ Gruppen einer beliebigen einzelnen Art sind gleich. In noch weiter bevorzugten Ausführungsformen sind alle R¹² und R²² Gruppen einer beliebigen einzelnen Art H, und alle R¹³ und R²³ Gruppen einer beliebigen einzelnen Art sind gleich und sind H oder Alkyl- oder Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen. In noch weiter bevorzugten Ausführungsformen sind alle R¹² und R²² Gruppen ebenso wie alle R¹³ und R²³ Gruppen einer beliebigen einzelnen Art H.
Die Komplexierung, auf welche bei den Beschreibungen der Alkyl- und Arylgruppen Bezug genommen wird ist die Komplexierung des Liganden mit einem paramagnetischen Metallkation zur Ausbildung eines Chelats. Alkyl- und Arylgruppen, welche eine solche Komplexierung nicht beeinflussen, umfassen im Bezug auf die Größe und Konfiguration einen weiten Bereich. Bevorzugte Alkylgruppen sind solche mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, weiter bevorzugt mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und am meisten bevorzugt Methyl und Ethyl. Es sind sowohl gerad- kettige als auch verzweigtkettige Alkyle enthalten. Bevorzugte Arylgruppen sind Benzyl und Phenyl, insbesondere Benzyl.
Für die Komplexierung mit diesen Liganden bei der Bildung der Kontrastverstärkermittel der vorliegenden Erfindung ist ein weiter Bereich an paramagnetischen Metallen geeignet. Diese Metalle scheinen sich auf Elemente mit Atomzahlen von 22 - 29 (einschließlich), 42, 44 und 58-70 (einschließlich) zu fokusieren und besitzen Oxidationsstufen von 2 oder 3. Von diesen sind diejenigen mit Ordnungszahlen von 22 - 29 (einschließlich) und 58-70 (einschließlich) bevorzugt, und am meisten bevorzugt sind diejenigen mit Ordnungszahlen von 24 - 29 (einschließlich) und 64 - 68 (einschließlich). Beispiele solcher Metalle sind Chrom(III), Mangan(II), Eisen(II), Eisen(III), Kobalt(II), Nickel(II), Kupfer(II), Praseodym(III), Neodym(III), Samarium(III), Gadolinium(III), Terbium(III), Dysprosium(III), Holmium(III), Erbium(III) und Ytterbium(III). Besonders bevorzugt sind Chrom(III), Mangan(II), Eisen(III) und Gadolinium(III), wobei Eisen(III) das am meisten bevorzugteste ist.
Physiologisch oder pharmakologisch verträgliche Salze der Chelate werden durch Neutralisierung von Säuregruppierungen am Chelat mit physiologisch oder pharmakologisch verträglichen Kationen aus den entsprechenden anorganischen und organischen Basen und Aminosäuren hergestellt. Beispiele schließen Alkali- und Erdalkalimetallkationen ein, insbesondere Natrium. Weitere Beispiele sind primäre, sekundäre und tertiäre Amine, insbesondere Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin und N-Methylglucamin (für gewöhnlich als "Meglumin" bezeichnet). Beispiele von Aminosäurekationen sind Lysine, Arginine und Ornithine. Als Basen können diese Kationen in der Form von Hydroxiden, Carbonaten, Bicarbonaten oder beliebigen anderen Basenformen, welche die Kationen freigeben, verwendet werden. Von den vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung besteht eine bevorzugte Klasse aus den physiologisch verträglichen Salzen, welche drei Äquivalente eines physiologisch verträglichen Kations in Kombination mit dem trianionischen Komplex von Fe( III) und N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan bei einem pH von 6,8 bis7,4 enthalten. (Der Begriff "trianionisch" bezeichnet in diesem Zusammenhang ein Anion mit einer Ladung von -3.)
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch bekannte Verfahren hergestellt werden, von denen einige hier beschrieben werden. Die Phosphonsäure, welche hier als der "Ligand" bezeichnet wird, wird zuerst gebildet, gefolgt von der Bildung des Chelatkomplexes und dann des physiologisch verträglichen Salzes.
Gemäß eines üblichen Verfahrens werden Verbindungen mit einer Methylenbrücke zwischen den N- und P-Atomen (d.h. diejenigen, bei welchen n in der obigen Formel gleich 0 ist) hergestellt, indem zuerst das Hydrobromidsalz des unsubstituierten Ausgangsmaterials (z.B. l,4,7-Triazacyclononan oder 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan) mit Formaldehyd und Diethylphosphit in wäßriger Lösung behandelt wird, um den Perethylphosphonatester (d.h. alle Säuregruppen sind mit einer Ethylgruppe verestert) zu bilden. Der Ester kann anschließend zu dem Phosphonsäureliganden hydrolisiert werden. Durch das Behandeln des Perethylesters mit einer starken Base wie Butyllithium bei -78ºC und einem Alkyl- oder Arylhalogenid werden Alkyl- oder Arylsubstituenten an dem Methylenkohlenstoff eingeführt.
Entsprechend beginnt die Herstellung von Verbindungen mit einer Ethylenbrücke zwischen den N- und P-Atomen (n gleich 1) aus denselben nicht substituierten Ausgangsmaterialien durch Behandeln der Ausgangsmaterialien mit Diethyl-2-bromethylphosphonat in Gegenwart eines Überschusses an K&sub2;CO&sub3;. Dies bildet die Phosphonsäureperethylester, welche dann auf dieselbe Weise wie bei den Methylenbrückenverbindungen hydrolisiert werden.
Die Ethylenbrückenverbindungen mit einem Hydroxysubstituenten an dem zu dem P-Atom benachbarten Kohlenstoffatom (d.h. wie Rd) werden durch die Verwendung von Diethylepoxyethylphosphonat anstelle des Diethyl-2-bromethylphosphonats hergestellt, und bei der Umsetzung wird keine Base verwendet. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß ähnliche Verbindun gen, welche eine Aminosubstitution an der Stelle der Hydroxysubstitution enthalten, unter Verwendung von Diethylethyleniminophosphonat auf dieselbe Weise hergestellt werden können.
Es wurde entdeckt, daß das Verfahren der Kombination des Liganden mit einem paramagnetischen Metallkation zur Ausbildung des Chelatkomplexes kritisch ist, wenn versucht wird eine stabile, chromatographisch eindeutige Art zu erhalten. Insbesondere wurde für die meisten der untersuchten Komplexe entdeckt, daß eine stabile, eindeutige Art erhalten wurde, indem eine Lösung des Liganden und eine wasserlösliche Verbindung des Metallkations auf eine Temperatur von mindestens ungefähr 50ºC, vorzugsweise mindestens ungefähr 80ºC, und weiter vorzugsweise unter Rückfluß (100ºC in einem wäßrigen System), bei einem pH von über7,0 erhitzt wird. In bevorzugten Ausführungsformen sind bei dem Verfahren der pH-Wert- Erhöhung und des Erhitzens eine Trennung und Reinigung eingeschlossen. So wird nach der anfänglichen Zugabe der Säureform des Liganden und der Halogenform des paramagnetischen Kations und dem Erhitzen der pH-Wert langsam durch eine langsame Zugabe von Base in einer Menge an Äquivalenten, welche der Ladung des Metallkations entspricht, erhöht. Wenn somit das Metallkation Nn(II) ist, werden zwei Basenäquivalente zugegeben, und wenn das Kation Fe(III) ist, werden drei Äquivalente zugegeben. Die neutrale Form des Komplexes kann dann für gewöhnlich als ein Feststoff aus dem Lösungsmittel auskristallisiert werden. Der kristallisierte Feststoff kann unter Erhitzen in Wasser und ausreichend Base gegeben werden, um alle verbleibenden labil protonierten Stellen des Komplexes zu neutralisieren. Bei der nachfolgenden Bildung des chromatographisch eindeutigen Komplexes kann die neutrale Form des Komplexes typischerweise umkristallisiert werden, gefolgt von einer erneuten Ansäuerung. Die optimale Temperatur und Zugabegeschwindigkeit der Base variiert von einem Metallion zum anderen, und wird auf geeignete Weise durch Routineexperimente bestimmt. In bestimmten Fällen (Z.B. der Fe(III)-Komplex von N,N',N"-Tris-(dihyxdroxyphosphorylethyl)-1,4,7-triazacyclononan, wobei der Komplex beim Ansäuern verschiedene Arten bildet) wurde die Kristallisation des neutralen Komplexes aus dem sauren Medium nicht durchgeführt, und das gewünschte Salz wurde direkt aus der Lösung erhalten.
Die Verwendung des beschriebenen Verfahrens resultiert typischerweise in Arten, welche über die Zeit und beim Aussetzen einer erhöhten Temperatur gegenüber einem Abbau in verschiedene, chromatographisch eindeutige Arten stabil sind. Der Begriff "chromatographisch eindeutig". wird hierbei verwendet, um Arten zu bezeichnen, welche keine Trennung in Komponenten aufzeigen, wenn sie einer geeigneten Chromatographie unterzogen werden.
Es kann eine beliebige wasserlösliche Form des Metalls verwendet werden. Anzumerkende Beispiele sind Halogenidsalze und Carbonatsalze. Besonders bevorzugt sind Chloride. In begrenztem Maße können auch wasserlösliche Oxide verwendet werden. Wenn Oxide verwendet werden, ist die Zugabe von Base nicht notwendig, um die neutrale Form des Komplexes zu bilden.
Durch herkömmliche Verfahren werden aus den neutralen Formen physiologische Salze hergestellt. In einem typischen Verfahren wird aus der neutralen Form des Komplexes durch Zugabe des benötigten Äquivalents der gewünschten Base das gewünschte Salz des Komplexes gebildet. Es kann ein Erwärmen bis zur Stabilisierung des pH-Wertes notwendig sein. Durch herkömmliche Verfahren, wie z.B. Lyophilisation kann eine feste Form des Salzes des Komplexes erhalten werden, und der Feststoff kann vor der Verabreichung an Patienten mit pharmazeutisch geeigneten, wäßrigen Lösungen zu seiner ursprünglichen Konzentration gelöst werden. Die Zahl an den im Endprodukt enthaltenen physiologischen Kationen ist gleich den während des Schrittes der Basenzugabe zugegebenen Äquivalenten und wird durch unabhängige Mittel wie der Elementaranalyse oder potentiometrischen Titration geeignet bestimmt.
Die Verabreichung der MRI-Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung an einen Patienten oder einen Gegenstand, an welchem eine magnetische Resonanzabbildung durchzuführen ist,
wird durch herkömmliche Verfahren erreicht, welche in diesem Stand der Technik bekannt und in der Literatur offenbart sind. Am geeignetsten werden wäßrige Lösungen der Mittel verwendet. Die Konzentrationen der Mittel in diesen Lösungen und die verabreichten Mengen können in weiten Bereichen variieren, wobei das Optimum in jedem Fall mit der Stärke des magnetischen Momentes des paramagnetischen Metalles in dem Mittel, der Kontrastverstärkungsfähigkeit des Chelates als Ganzes, des Verabreichungsverfahrens, des gewünschten oder benötigten Grades an Kontrastverstärkung und des Alters, des Gewichts und der Verfassung des Patienten oder des Gegenstandes, dem eine Verabreichung gegeben wurde, variiert. In den meisten Fällen werden die besten Ergebnisse mit Lösungen mit Konzentrationen von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2,0 Mol des paramagnetischen Komplexes pro Liter, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,0 Mol pro Liter, erhalten. Entsprechend werden für gewöhnlich in den meisten Fällen die besten Ergebnisse mit Dosierungen erhalten, welche von 0,01 bis ungefähr 1,0 Millimol an Agens pro Kilogramm Gesamtkörpergewicht (mmol/kg), vorzugsweise von ungefähr 0,05 bis ungefähr 0,5 mmol/kg, reichen. Die Verabreichung kann durch einen beliebigen parenteralen Weg oder ein Verfahren erreicht werden, wobei die intravenöse Verabreichung am bedeutendsten ist. Die Verabreichungsgeschwindigkeit kann entsprechend variieren, wobei die besten Ergebnisse im allgemeinen bei Geschwindigkeiten erhalten werden, welche von ungefähr 0,1 mmol/min/kg bis ungefähr 1,0 mmol/s/kg reichen.
Die folgenden Beispiele werden zum Zweck der Veranschaulichung gegeben und sind weder dazu gedacht die Erfindung in irgendeiner Weise zu definieren oder sie einzuschränken.

BEISPIEL 1

Synthese von Dihydroxyphosphorylmethylverbindungen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von verschiedenen Dihydroxyphosphorylmethylverbindungen und -komplexen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Arten, welche sowohl aufl,4,7-Triazacyclononan als auch auf 1,4,7,10- Tetraazacyclododecan basieren, werden auf parallele Weise ausgehend von den entsprechenden Hydrobromidsalzen von 1,4,7- Triazacyclononan und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan veranschaulicht.
A. Synthese von Perethylestern von stickstoffsubstituierten Methylenphosphonaten von 1,4,7-Triazacyclononan und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan
Das Trihydrobromidsalz von l,4,7-Triazacyclononan und das Hydrobromidsalz von 1,4,7, 10-Tetraazacyclododecan wurde entsprechend mit 3,5 Äquivalenten und 28 Äquivalenten an wäßriger 37 %-iger Formaldehydlösung umgesetzt. Die Mischungen wurden bei Raumtemperatur während 15 - 30 Minuten gerührt, wonach entsprechend 3,5 Äquivalente und 14 Äquivalente an Diethylphosphit zu jeder Lösung zugegeben wurden, und die Reaktionsmischungen wurden bei Raumtemperatur während weiterer 2 - 5 Stunden gerührt. Dann wurde Wasser zugegeben und die wäßrigen Schichten fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Zu den verbleibenden Wasserfraktionen wurde NaHCO&sub3; zugegeben bis die Lösungen einen pH-Wert von ungefähr7,5 aufwiesen. Die Lösungen wurden dann während 2 - 2,5 Tagen kontinuierlich mit Ether extrahiert. Nach dem Verdampfen des Ethers wurden die Produkte als Öle erhalten und notwendigerweise mittels Chromatographie gereinigt und mittels NMR als die entsprechenden Perethylester von 1,4,7-Triazacyclononan und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan identifiziert.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß dieses Verfahren ebenfalls auf synthetisierte Verbindungen angewendet werden kann, welche aus substituierten Formen von 1,4,7-Triazacyclononan und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan abgeleitet sind, bei welchen solche Substitutionen, welche aus Alkyl- oder Arylgruppen bestehen, wie sie oben aufgelistet sind, an den Ringkohlenstoffatomen vorhanden sind, wobei die Substitutionen an den entsprechenden Positionen der Produktverbindung erhalten bleiben. Der Durchschnittsfachmann wird weiterhin erkennen, daß dieses Verfahren auf eine anab ge Weise zur Synthese anderer substituierter und nicht substituierter, cyclischer und linearer Polyamine verwendet werden kann.
B. Synthese von Perethylestern von stickstoffsubstituierten Methylenphosphonaten, welche am Methylenkohlenstoff mit Benzylgruppen substituiert sind.
In diesem Verfahren wird einer der im obigen Teil A hergestellten Perethylester zu einer analogen Verbindung umgewandelt, welche eine Benzylgruppe am Methylenkohlenstoff enthält.
Der in trockenem Tetrahydrofuran aufgelöste Perethylester von 1,4,7-Triazacyclononan, welcher oben in Teil A hergestellt wurde, wurde mit einem Überschuß an Butyllithium bei -78ºC umgesetzt, und die Reaktionsmischung wurde bei dieser Temperatur während 30 Minuten gerührt. Dann wurde unter Rühren eine Menge an Benzylbromid zugegeben, welche der Zahl an Äquivalenten an eingesetztem Butyllithium entspricht. Man ließ die Mischung dann langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach fortlaufendem Rühren bei Raumtemperatur während weiterer 30 Minuten wurde kaltes Wasser zugegeben und die wäßrige Schicht wurde mit Diethylether extrahiert. Der Ether wurde verdampft und der Rückstand über Silicagel G60 70-230 mesh chromatographiert, um den Perethylester von N,N',N"-Tris (dihydroxyphosphorylbenzylmethyl) -1,4, 7-triazacyclononan, dessen Identität durch Protonen-NMR bestätigt wurde, zu erhalten.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß dieses Verfahren verwendet werden kann, um andere Alkyl- oder Arylhabgenide ebenso an das Methylenkohlenstoffatom zu binden, indem die geeigneten Alkyl- oder Arylhalogenide verwendet werden.
C. Hydrolyse der Perethylester zu den Phosphonsäuren
In diesem Verfahren werden beide Perethylester aus dem obigen Teil A zu den entsprechenden Phosphonsäuren umgewandelt.
Die Perethylester wurden getrennt in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst und während 6 bis 8 Stunden auf 80ºC erhitzt. Die erhaltenen Lösungen wurden bis zur Trockne eingedampft, und die reinen Säureformen wurden durch nachfolgende Kristallisation aus Wasser oder Wasser/Ethanol erhalten. Ihre Identität als die Säuren wurde mittels Protonen-NMR und Elementaranalysen bestätigt.
Für eine weitere Bestätigung der Identität der Produkte wurden unabhängige Synthesen durchgeführt, indem das Verfahren verwendet wurde, welches von Polykarpov, Yu M., et al., "N,N',N"-Tris(phosphonomethyl)-1,4,7-triazacyclononan -- a specific complexing agent for magnesium ion" Izv. Akad. Nauk SSSR. Ser. Khim., 1982, (7), 1669-70 beschrieben wurde. Es zeigte sich, daß die erhaltenen Produkte hinsichtlich des NMR mit denen identisch sind, die durch die oben beschriebene Synthese erhalten wurden.

BEISPIEL 2

Synthesen von Dihydroxyphosphorylethylverbindungen

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung bestimmter zu den in Beispiel 1 hergestellten Verbindungen analoger Dihydroxyphosphorylethylverbindungen. Die Arten, welche sowohl auf 1,4,7-Triazacyclononan als auch auf 1,4,7,10- Tetraazacyclododecan basieren, werden wiederum auf einem parallelen Wege veranschaulicht.

A. Synthese von per-N-substituierten Dihydroxyphosphoryl ethylphosphonaten

Das durch in der Literatur beschriebene Verfahren hergestellte Diethyl-2-bromethylphosphonat wurde getrennt mit den Hydrobromidsalzen von 1,4,7-Triazacyclononan und 1,4,7,10- Tetraazacyclododecan in Wasser in Gegenwart eines Überschusses an K&sub2;CO&sub3; während 4 bis 5 Stunden bei 80ºC umgesetzt. Das Wasser wurde dann durch Verdampfen entfernt, und es wurde Chloroform zu den Feststoffen gegeben, um das Produkt von den anorganischen Salzen zu entfernen. Die Produkte wurden mittels Chromatographie gereinigt, wobei neutrales Aluminiumoxid und ein Elutionslösungsmittel von 10% Methanol in Chloroform verwendet wurde. Die Perethylestergruppen wurden durch Hydrolyse unter Verwendung von HCl, wie in Teil C des obigen Beispieles 1 beschrieben, entfernt. Die reinen Produkte wurden durch Kristallisation aus 10% Ethanol in Wasser erhalten, und ihre Identität wurde mittels Protonen-NMR und Elementaranalyse nach Abzug des Hydratwassers als entsprechend
N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylethyl)-1,4,7-triazacyclononan und N,N',N",N"'-Tetrakis-(dihydroxyphosphorylethyl)- 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan bestätigt.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß dieses Verfahren auf eine analoge Weise zur Synthese ähnlicher Verbindungen mit Alkyl- oder Arylsubstitutionen an den Ethylenkohlenstoffatomen durch Verwendung des entsprechend substituierten Diethyl-2-bromethylphosphonates verwendet werden kann.
B. Synthese von N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylhydroxyethyl)-1,4,7-triazacyclononan
Das unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellte Diethylepoxyethylphosphonat wurde mit einer Lösung von 1,4,7-Triazacyclononan in Methanol bei Raumtemperatur unter Verwendung von 3,3 Äquivalenten des Diethylepoxyphosphonats umgesetzt. Die Lösung wurde während 6 Stunden bei 40-50ºC gerührt. Das Methanol wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst. Der Überschuß an Epoxid wurde dann mittels Diethylether extrahiert und die Wasserschicht wurde verdampft. Der Rückstand wurde unter Verwendung von neutralem Aluminiumoxid mittels Chromatographie gereinigt, wobei die Säule zuerst mit Chloroform und nachfolgend mittels 10% Methanol in Chloroform eluiert wurde. Die Perethylestergruppen wurden, wie oben beschrieben, mittels Hydrolyse in HCl entfernt. Das reine Produkt wurde durch Kristallisation aus 10% Ethanol in Wasser erhalten. Die Identität des Produktes wurde nach Abzug von drei Molekülen Hydratwasser mittels Protonen-NMR und Elementaranalyse als N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylhydroxyethyl)-1,4,7-triazacyclononan bestätigt.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß mittels desselben Verfahrens unter Verwendung von Diethylethyleniminophosphonat anstelle des Diethylepoxyethylphosphonats die analoge Tris-dihydroxyphosphorylaminoethyl-Verbindung auf die gleiche Weise hergestellt wird, und daß ähnliche Verbindungen, welche Alkyl- oder Arylsubstitutionen an den Ethylenkohlenstoffatomen tragen, auf eine analoge Weise hergestellt werden können, indem entsprechend substituierte Formen des Diethylepoxyethylphosphonats oder Diethylethyleniminophosphonats verwendet werden. Dasselbe Verfahren kann gleichermaßen verwendet werden, um Hydroxyphosphorylhydroxyethyl- und Hydroxyphosphorylaminoethyl-Derivate von anderen Polyaminen zu synthetisieren.

BEISPIEL 3

Herstellung von Metallkationenkomplexen

A. Fe(III) und Cr(III)-Komplexe von N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan In getrennten Synthesen wurde N,N',N"-Tris (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan in Wasser mit einem Äquivalent eines wasserlöslichen Salzes des geeigneten, in den Komplex einzuführenden Metallkations (d.h. FeCl&sub3; 6 H&sub2;O oder CrCl&sub3; 6 H&sub2;O) umgesetzt. Die Mischungen wurden in einer Rückflußapparatur bei 100ºC erhitzt, während langsam eine Base in einer Menge zugegeben wurde, welche gleich "n" Äquivalenten ist, wobei "n" gleich der Ladung des Metallkations entspricht. Der aus der wäßrigen Lösung kristallisierte Fe(III)-Komplex ermöglicht eine Rückgewinnung in hoher Ausbeute. Der Cr(III)-Komplex kristallisiert unter Zugabe von Ethanol. In jedem Fall wurde der kristallisierte Komplex zu frischem Wasser gegeben, und es wurde ausreichend Base zugegeben, um letztendlich einen pH-Wert von > 10,0 zu erhalten. In dem Fall des Fe(III)-Komplexes wurde die erhaltene Lösung auf 100ºC erhitzt, während in dem Fall des Cr(III)-Komplexes die erhaltene Lösung auf 140ºC (unter Druck) erhitzt wurde. Das Erhitzen wurde in jedem Fall fort- geführt, bis eine einzelne chromatographische Art erhalten wurde.
Die Lösungen wurden dann gekühlt und zur Entfernung von Feststoffen filtriert, und zu dem Filtrat wurde Säure gegeben, um den Komplex wie zuvor zu kristallisieren oder auszufällen. Es wurden zusätzliche Kristallisationen des Komplexes aus Wasser oder Wasser/Ethanol durchgeführt. Die Reinheit eines jeden Komplexes wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) nachgewiesen. Die Identität eines jeden Produktes wurde mittels Elementaranalyse nachgewiesen.
B. Fe(III)-Komplexe von N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylethyl)-1,4,7-triazacyclononan und N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylhydroxyethyl)-1,4,7-triazacyclononan
Diese Komplexe wurden unter entsprechenden Modifikationen gemäß dem oben erwähnten Verfahren von Teil A hergestellt. Wenn Lösungen des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris- (dihydroxyphosphorylethyl)-1,4,7-triazacyclononan angesäuert wurden, wurden zusätzliche Produkte bei der chromatographischen Analyse bemerkt. Folglich wurde der letzte Rekristallisationsschritt, welcher eine Ansäuerung erfordert, entfernt, und die neutrale Form des Komplexes wurde nicht als ein Feststoff isoliert. Das Trinatriumsalz des Produktes wurde in einer Ionenaustauschersäule gereinigt, und die anorganischen Salze wurden unter Verwendung einer LH20-Säule entfernt. Im Fall des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylhydroxyethyl)-1,4,7-triazacyclononan wurde unter Verwendung dieses Verfahrens kein einzelnes, chromatographisch eindeutiges Produkt erhalten.
C. Mn(II) und Mn(III)-Komplexe von N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan
Aufgrund der Leichtigkeit, mit der Redoxreaktionen stattfinden, wurde das Verfahren für diese Komplexe modifiziert. Durch Zugabe von sechs Äquivalenten an NaOH zu einer 1:1 Mischung von Ligand und MnCl&sub2; in Wasser, gefolgt von einer Kristallisation des Salzes des Komplexes durch Zugabe von Ethanol und Kühlen, wurde direkt das Tetranatriumsalz des Mn(II)-Komplexes gebildet. Zur Herstellung des Trinatriumsalzes des Mn(III)-Komplexes wurde eine stöchiometrische Menge an Persulfationen zu dem Tetranatriumsalz des Mn(II)- Komplexes gegeben, und die Reaktion bei Raumtemperatur solange stehengelassen, bis das gesamte Mn(II) zu Mn(III) oxidiert war. Das Produkt wurde unter Durchleiten durch eine lonenaustauschersäule gereinigt, und anorganische Salze wurden mittels Durchleiten durch eine LH-20 Säule entfernt. Beide Produkte wurden mittels TLC als einzelne, chromatographisch eindeutige Produkte charakterisiert.
D. Gd(III)-Komplexe von N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononane, N,N',N",N'"-Tetrakis- (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan und N,N',N",N'"-Tetrakis-(dihydroxyphosphorylethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan
Das Trinatriumsalz des GD(III)-Komplexes von N,N',N"- Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan wurde direkt aus GdCl&sub3; 6H&sub2;O und der Säureform des Liganden durch Zugabe von jeweils äquivalenten Mengen zu Wasser und Erwärmen auf 100ºC hergestellt. Wenn die Lösung klar war, wurden langsam sechs Äquivalente an NaOH zugegeben, und die Lösung wurde für weitere fünf Tage erwärmt. Nach der Zentrifugation zur Entfernung geringer Mengen an Feststoffrückständen wurde die Lösung getrocknet, um einen Feststoff zu erhalten, welcher mittels TLC als ein einzelnes, chromatographisch eindeutiges Produkt charakterisiert wurde.
Die neutrale Form des Gd(III)-Komplexes von N,N',N",N"'-Tetrakis-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7,10tetraazacyclododecan wurde aus GdCl&sub3; 6 H&sub2;O und der Säureform des Liganden hergestellt, indem die jeweils äquivalenten Mengen zu Wasser gegeben wurden, gefolgt von einer langsamen Zugabe von drei Äquivalenten an NaOH Ein Erwärmen auf 90ºC resultierte in der Bildung eines gelartigen Niederschlages. Das Erwärmen wurde fortgeführt, bis kein weiterer Niederschlag gebildet wurde, und die Reaktionsmischung wurde zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehengelassen. Der als ein Ergebnis gebildete Niederschlag wurde mittels Zentrifugation isoliert und mit Wasser gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde zu Wasser gegeben, der pH-Wert wurde durch Zugabe von NaOH auf über 11 erhöht, und die erhaltene klare Lösung wurde über Nacht auf 100ºC erwärmt. Die Lösung wurde mit konzentrierter HCL auf pH < 3,0 angesäuert und wurde konzentriert und gekühlt, wodurch Feststoffe erhalten wurden, welche mittels Zentrifugation getrennt wurden.
Das Pentameglurninsalz des Gd(III)-Komplexes von N,N',N",N'"-Tetrakis-(dihydroxyphosphorylethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododecan wurde direkt aus Gd&sub2;O&sub3; und der Säureform des Liganden hergestellt, indem 0,5 Moläquivalente des ersteren und 1,0 Moläquivalente des letzteren zu Wasser gegeben und auf 90ºC erwärmt wurde, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Nach der Filtration wurden fünf Äquivalente von Meglurnin zu dem Filtrat gegeben, und die Reaktion wurde während 20 Stunden auf 100ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung getrocknet, um das feste Produkt zu erhalten.

BEISPIEL 4

Herstellung von physiologischen Salzen

A. Natrium und Megluminsalze des Fe(III)-Komplexes mit N,N',N'"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan.
Die feste Form des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"- Tris (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan, der Komplex, dessen Herstellung im obigen Beispiel 3, Teil A beschrieben ist, wurde bei Raumtemperatur in Wasser suspendiert. Zur Trennung der Suspensionen des neutralen Fe(III)- Komplexes von N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)- 1,4,7-triazacyclononan wurde Natriumhydroxid oder Meglumin zugegeben bis die Lösungen einen pH von7,0 bis7,4 aufwiesen. Die Lösungen wurden dann lyophilisiert, um die festen physiologischen Salze des Komplexes zu erhalten. Wenn diese Feststoffe vor der Verwendung mit einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel auf ihre ursprüngliche Konzentration gelöst werden, sind sie für die in vivo Verabreichung geeignet. In jedem Fall zeigten bei den Natriumsalzen der Komplexe potentiometrische Titrationen, das die Hauptform des Komplexes bei pH 7,0 bis 7,4 das Trianion des Komplexes war, und somit, daß das bei diesem pH hauptsächlich gebildete Salz das Trinatrium- und das Trimegluminsalz war.
B. Megluminsalz des Cr(III)-Komplexes mit N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan.
Die feste Form des Cr(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan, der Komplex, dessen Herstellung im obigen Beispiel 3, Teil A beschrieben ist, wurde auf eine zu der im obigen Beispiel 4, Teil A beschriebenen, vergleichbaren Weise mit 3 Äquivalenten an Meglumin behandelt. Eine potentiometrische Titration des Natriumsalzes dieses Komplexes zeigte, daß die Hauptform des erhaltenen Salzes bei pH 7,0 bis7,4 das Trianion war.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß unter Verwendung ähnlicher Verfahren andere Salze des besprochenen Komplexes erhalten werden können.

BEISPIEL 5

Produktbewertung

In den folgenden Untersuchungen sind die besprochenen untersuchte Arten wie folgt: TABELLE 1: Untersuchte Arten Ligand paramagnetisches Kation physiologisch verträgliches Kation N,N',N"-Tris-(dihydroxy-phosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan N,N',N"-Tris-(dihydroxy-phosphorylethyl)-1,4,7-triazacyclononan N,N',N",N"'-Tetrakis-(dihydroxyphosphoryl-ethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan Trinatrium Trimeglumin Tetranatrium Pentameglumin

A. Wasserlöslichkeit

Alle der oben aufgelisteten, untersuchten Arten wurden in Wasser gelöst, wobei sie eine Löslichkeit bei Konzentrationen auf zeigten, welche für die Verwendung als pharmazeutische Agenzien ausreichen. Insbesondere die untersuchten Arten A und B zeigten eine Löslichkeit in Wasser mit Konzentrationen von über 50 % (Gewicht/Volumen).

B. Stabilität

Mit den untersuchten Arten A und D wurde sowohl vor als nach einem Erwärmen auf 100ºC während 2 Stunden eine TLC durchgeführt. In beiden Fällen wurde ein einzelner, chromatographisch eindeutiger Fleck beobachtet, welcher sich als ein Ergebnis des Erwärmens nicht veränderte.

C. Toxizität

Mäusen wurden intravenös physiologische Salze der hier beschriebenen, verschiedenen Ligand/Metallkation-Komplexe verabreicht. Die Mäuse wurden im Anschluß an eine solche Verabreichung während 2 Wochen beobachtet, und die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgelistet. Bei diesen Werten wird die verabreichte Dosis als mmol an Komplex pro kg am gesamten Körpergewicht (mmol/kg) ausgedrückt, und die Verabreichungsgeschwindigkeit wird als mmol an verabreichtem Komplex pro Sekunde oder pro Minute pro kg am gesamten Körpergewicht (mmol/s/kg oder mmol/min/kg) ausgedrückt. Es wurde erachtet, daß die Mäuse die Verabreichung eines jeden Agens "überlebt" haben, wenn sie am Ende der zweiwöchigen Periode am Leben waren. TABELLE 2 Ergebnisse des Toxizitätstests Test untersuchte Arten Dosis Rate Überlebt?
Wenn Komplexe des Fe(III) mit N,N',N"-Tris- (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan (untersuchte Art A) unter Verwendung alternativer Komplexierungsverfahren hergestellt wurden, und welche gemäß der Bestimmung mittels TLC verschiedene Formen des Komplexes enthielten, war die beobachtete Toxizität im wesentlichen größer als die, welche mit Zubereitungen dieses Komplexes beobachtet wurden, welche unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens hergestellt wurden und welche bei der TLC ein einzelnes, chromatographisch eindeutiges Produkt aufzeigten.

D. Untersuchungen der in vivo-Verteilung und Ganzkörper- Clearance

Unter Verwendung von Radioisotopen von Fe(III) (Eisen-59), Cr(III) (Chrom-51) und Gd(III) (Gadolinium-153) und unter Verwendung der oben beschriebenen allgemeinen Syntheseverfahren wurden radioisotopisch markierte analoge Verbindungen zu den aus den in der obigen Liste ausgewählten untersuchten Arten hergestellt. Die erhaltenen Komplexe wurden einer Radiochromatographie unterzogen, um eine ausreichende radioisotopische Reinheit und Übereinstimmung mit den Ausgangskomplexen sicherzustellen. Sie wurden dann intravenös an Mäuse verabreicht, um die in vivo-Verteilung und Ganzkörper-Clearance zu messen.
Die Lokalisierung der untersuchten Arten in den Körpern der Mäuse und die Geschwindigkeit, mit der die untersuchten Arten nach der Verabreichung von den Körpern der Mäuse ausgeschieden wurden, wurden mittels Radioassays von Geweben und Ganzkörpermessungen durchgeführt, wobei beide mittels herkömmlicher Meßtechniken für Gammastrahlen durchgeführt wurden. Die Konzentration der Aktivität in den Geweben wurde als Aktivität pro Gramm an Gewebe bestimmt, und die Ganzkörpermessungen wurden als der Prozentsatz an Ganzkörperaktivität bei einer gegebenen Zeit unter Berücksichtigung der Ganzkör peraktivität sofort nach der Injektion ausgedrückt. Die Ergebnisse waren wie folgt:

1. Radioisotope der untersuchten Arten A und B

In Vivo-Verteilung

Innerhalb zwei Minuten nach der Verabreichung waren Anzeichen für eine Konzentrierung an Radioaktivität in Knochen und Nieren zu sehen. Bei Messungen, welche eine Stunde nach der Verabreichung gemacht wurden, war das Verhältnis der Konzentration der untersuchten Arten im Knochen zu der im gesamten Blut im allgemeinen über 25:1, wohingegen das Verhältnis deren Konzentration in der Niere zu der im Blut im allgemeinen über 10:1 lag. Sogar nach 24 Stunden, wenn weniger als 5 % der verabreichten Dosis im Körper verblieben ist (siehe unten), wurde ein hohes Verhältnis der Konzentration der untersuchten Arten im Knochen und der Niere zu der im Blut erhalten. In Mäusen, welche zwei bis vier Wochen vor der Studie einen Schienbeinbruch hatten, zeigte das Schienbein, welches die Fraktur erlitten hatte, eine deutlich größere Ansammlung an Aktivität als die, welche im kontralateralen, normalen Schienbein gemessen wurde. Alle Mäuse zeigten zu jedem Zeitpunkt nach der Verabreichung eine sehr geringe Aktivität im Gehirn.

Ganzkörper-Clearance

Innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung hatten über 95 % beider untersuchter Arten den Körper so gut wie ausschließlich durch den Urin verlassen.

2. Radioisotope der untersuchten Art C

In vivo-Verteilung

Eine Stunde nach der Verabreichung war das gemessene Knochen-zu-Blut-Konzentrationsverhältnis größer als 4,5:1, und das gemessene Nieren-zu-Blut-Verhältnis war größer als 5,5:1. Innerhalb dieser ersten Stunde wurde eine sehr geringe Konzentration dieses Mittels im Gehirn festgestellt.

Ganzkörper-Clearance

Innerhalb 24 Stunden nach der Verabreichung hatten 95 % der untersuchten Art den Körper verlassen.

3. Radioisotope der untersuchten Art D

In vivo-Verteilung

Eine Stunde nach der Verabreichung war das gemessene Knochen-zu-Blut-Konzentrationsverhältnis größer als 6:1, und das gemessene Nieren-zu-Blut-Verhältnis war größer als 10:1. Innerhalb dieser ersten Stunde wurde eine sehr geringe Konzentration des Mittels im Gehirn festgestellt.

Ganzkörper-Clearance

Innerhalb 24 Stunden nach der Verabreichung hatten mehr als 95% der untersuchten Art den Körper nahezu ausschließlich durch den Urin verlassen.

E. Relaxationsmessungen

Mit einigen der oben aufgelisteten untersuchten Arten wurden Messungen der longitudinalen Protonenrelaxationsfrequenz (1/τ&sub1;) durchgeführt und mit denen verglichen, welche mit den folgenden Komplexen außerhalb des Umfangs dieser Erfindung erhalten wurden: (i) Gd(III) mit Diethylentriaminopentaessigsäure (DTPA) und (ii) Fe(III) mit N,N'-Ethylenbis- [(2-hydroxyphenyl)-glycinat] (EHPG). Alle Messungen wurden unter Verwendung einer Bruckner PC/20 Minispec-Vorrichtung, welche bei 20 MHz arbeitete, erhalten. Alle Proben wurden in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,2 aufgelöst.
Die longitudinale Protonenrelaxationsfrequenz der untersuchten Art A war zwei bis dreimal größer als die, welche für den Fe(III)-Komplex von EHPG erhalten wurde, und zwischen 40 und 45% der, die bei dem Gd(III)-Komplex von DTPA erhalten wurde. Für die untersuchte Art C wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

F. Messungen der relativen Gleichgewichtskonstante

Der stark gefärbte Fe(III)-Komplex von EHPG (als Vergleich in Teil E dieses Beispieles verwendet) wurde in 0,25 M Phosphatpuffer bei pH7,2 gelöst, und es wurde eine äquimolare Menge an N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)- 1,4,7-triazacyclononan zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht auf 100ºC erwärmt. Die erhaltene Lösung war frei von der purpurnen Farbe des Fe(III)-EHPG-Komplexes, und die TLC zeigte lediglich das Vorhandensein des Fe(III)-N,N',N"-Tris- (dihydroxyphosphorylmethyl) -1,4,7-triazacyclononan-Komplexes.
Es wurde ebenfalls das umgekehrte Experiment durchge führt. So wurde der Fe(III)-Komplex von N,N',N"-Tris- (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan in 0,25 M Phosphatpuffer bei pH7,2 gelöst, und es wurde eine äquimolare Menge an EHPG zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht auf 100ºC erwärmt. Wie im ersten Experiment war die erhaltene Lösung frei von der purpurnen Farbe des Fe(III)-EHPG, und die TLC zeigte lediglich das Vorhandensein des Fe(III)-N,N',N"- Tris- (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan- Komplexes.
Diese Ergebnisse zeigen die relative Stabilität des Fe(III)-N,N',N"-Tris-(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7- triazacyclononan-Komplexes im Vergleich mit dem Fe(III)-EHPG- Komplex.

Claims

1. Pharmazeutisches Agens für die Verwendung beim Abbilden von Knochen und anderen Patientengeweben, welche ebenso wie Knochen Erkennungsmerkmale besitzen, mittels magnetischer Resonanz, umfassend ein physiologisch verträgliches Salz eines Chelats eines paramagnetischen Metall-Kations und einer Verbindung mit der Formel:

in welcher:

die R¹¹-Gruppierungen jeweils unabhängig

sind, in welchen R¹&sup4;, R¹&sup5; und R¹&sup6; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, R¹&sup7; aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus H, OH, NH&sub2; und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, und n gleich Null oder 1 ist;

die R¹²-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen;

die R¹³-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen;

t gleich 2 oder 3 ist;

u gleich 2 oder 3 ist;

v gleich 2 oder 3 ist; und

w gleich 1 bis 4 ist.

2. Pharmazeutisches Agens, umfassend ein chromatographisch eindeutiges, physiologisch verträgliches Salz eines Chelats eines paramagnetischen Metall-Kations und einer Verbindung mit der Formel

in welcher: die R²¹-Gruppierungen jeweils unabhängig

sind, in welchen R²&sup4;, R²&sup5; und R²&sup6; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, R²&sup7; aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus H, OH, NH&sub2; und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen, und x gleich Null oder 1 ist;

die R²²-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen; und

die R²³-Gruppierungen jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H und Alkyl- und Arylgruppen, welche die Komplexierung nicht beeinflussen.

3. Pharmazeutisches Agens gemäß Anspruch 2, worin R²&sup4;, R²&sup5;, R²&sup6; und R²&sup7; jeweils H sind, und x gleich 1 ist.

4. Pharmazeutisches Agens gemäß Anspruch 2, worin R²&sup4; und R²&sup5; jeweils H sind, und x gleich Null ist.

5. Pharmazeutisches Agens gemäß Anspruch 2, worin R²&sup4; und R²&sup5; jeweils H sind, x gleich Null ist, die R²²-Gruppierungen jeweils H sind, und die R²³-Gruppierungen jeweils H sind.

6. Pharmazeutisches Agens gemäß Anspruch 2, worin R²&sup4;, R²&sup5;, R²&sup6; und R²&sup7; jeweils H sind, x gleich 1 ist, die R²²-Gruppierungen jeweils H sind, und die R²³-Gruppierungen jeweils H sind.

7. Pharmazeutisches Agens gemäß Anspruch 2, worin das physiologisch verträgliche Salz folgendes ist:

das Trinatriumsalz des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan,

das Trimegluminsalz des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan,

das Trinatriumsalz des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylethyl)-1,4,7-triazacyclononan,

das Trimegluminsalz des Cr(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris (dihydroxyphosphorylmethyl) -1,4,7-triazacyclononan,

das Tetranatriumsalz des Mn(II)-Komplexes von N,N',N"-Tris (dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan, oder

das Trinatriumsalz des Mn(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan.

8. Pharmazeutisches Agens gemäß Anspruch 2, worin das physiologisch verträgliche Salz das Trinatriumsalz des Fe(III)-Komplexes von N,N',N"-Tris(dihydroxyphosphorylmethyl)-1,4,7-triazacyclononan ist.

9. Verfahren zur Verbesserung des Kontrastes beim Abbilden von Knochengewebe und anderem Gewebe eines Patienten, welches ebenso wie Knochengewebe Erkennungsmerkmale besitzt, mittels magnetischer Resonanz, wobei das Verfahren ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines pharmazeutischen Agens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 an den Patienten umfaßt.