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Die Erfindung bezieht sich auf das Entfernen und die Identifikation von
komplex geladenen Einheiten wie z.B. Mikroorganismen aus einer
Flüssigkeitsprobe, die derartige Einheiten zusammen mit Einheiten ähnlicher
Größe enthält.
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Bei der Identifikation von komplex geladenen Einheiten sind die
Einheiten oft in einer Flüssigkeitsprobe, die Einheiten einer Größe enthält,
die ähnlich zu den Einheiten zu identifizierender Größen ist. Solche
Beispiele sind Pyrogene, Mikroorganismen wie z.B. Mycoplasma,
Bakterien, Nukleinsäuren, Chlamydia, Plasmodia, Viren, Proteine und
anorganische Verbindungen wie z.B. Eisenoxid, und der Begriff "komplex
geladener Einheiten", der hier verwendet wird, soll diese Beispiele
umfassen. Ein Beispiel einer komplex geladenen Einheit sind Legionella-
Bakterien, die in Wasser gefunden werden, wobei das Wasser gewöhnlich
auch andere Einheiten enthält.
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Es ist vorgeschlagen worden, das Vorhandensein von Legionella-Bakterien
in der folgenden Art zu testen, indem eine Wasserprobe verwendet wird,
die Bakterien enthält. Als erstes wird die Probe durch eine 0,2 µm
Analysemembran geleitet, die das Wasser entfernt und die Legionella-
Bakterien und Einheiten einer ähnlichen Größe zurückhält. Die Membran
und der Rückstand auf der Membran werden dann in Wasser
resuspendiert und aufgebrochen. Ein Anteil dieser Probe wird dann einem
Vorfilter mit einer Porengröße zugegeben, der ausreichend groß ist, damit
die Legionella-Bakterien hindurchgelangen können, jedoch so viel wie
möglich von den unerwünschten Einheiten zurückgehalten werden. Die
Legionella-Bakterien werden dann physisch gefangen durch eine
Reaktionsmembran mit einer Porengröße, die kleiner als die Größe der
Bakterien ist, und werden dann durch ein Erfassungssystem sichtbar
gemacht.
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Dieses früher vorgeschlagene Verfahren hat eine Anzahl von Nachteilen.
Als erstes ist es erforderlich, daß die Probe von Legionella-Bakterien
konzentriert wird, indem die Analysemembran verwendet wird. Dieser
Schritt ist schwierig zu steuern, und die Variabilität seines Ausgangs bzw.
Ergebnisses erzeugt eine Variabilität bei der Sichtbarmachung. Außerdem
erhöht dieser Konzentrationsschritt deutlich die Gesamtzeit, die für den
Test benötigt wird.
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Da der Vorfilter auch den Durchgang von Einheiten einer ähnlichen
Größe oder kleiner als die Legionella-Bakterien zuläßt, wird zusätzlich
die Reaktionsmembran häufig durch derartige Einheiten blockiert.
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Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Entfernen und
Identifizieren komplex geladener Einheiten aus einer Flüssigkeitsprobe geschaffen,
die diese komplex geladenen Einheiten zusammen mit unerwünschten
Einheiten ähnlicher Größe enthält, wobei das Verfahren ein Leiten der
Flüssigkeitsprobe durch eine amphotere hydrophile Membran mit einer
Porengröße, die größer als die Größe der komplex geladenen Einheiten
ist, wobei der pH-Wert der Flüssigkeit so eingestellt ist, daß eine
Oberflächenladung auf der Membran derart geschaffen wird, daß die komplex
geladenen Einheiten aus der Flüssigkeit durch Ladungsfang entfernt
werden, wobei die unerwünschten Einheiten durch die Membran als
Filtrat hindurchgelangen, ein Spülen der Membran mit einer Flüssigkeit
eines unterschiedlichen pH-Wertes, um die Membranoberflächenladung
derart zu ändern, daß die komplex geladenen Einheiten freigegeben
werden, und dann ein Sichtbarmachen der komplex geladenen Einheiten
aufweist.
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Wie hier nachfolgend verwendet, bezieht sich der Begriff "amphoter" auf
die Fähigkeit der Membranoberfläche, ihr Zeta-Potential von einem
positiven Wert in einen negativen Wert bei Ändern des pH-Wertes zu
ändern. Indem somit eine amphotere hydrophile Membran als ein
Vorfilter verwendet wird, an die die komplex geladenen Einheiten durch
Ladungsfang haften, gelangen unerwünschte Einheiten einer ähnlichen
Größe wie die komplex geladenen Einheiten durch die Membran und
werden entfernt. Demgemäß werden die komplex geladenen Einheiten
konzentriert, und eine zuverlässige Sichtbarmachung ist möglich.
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Vorzugsweise werden die komplex geladenen Einheiten auf eine
Reaktionsmembran mit einer Porengröße freigegeben, die größer als die
Größe der komplex geladenen Einheiten ist und die eine
Oberflächenladung derart aufweist, daß bewirkt wird, daß die komplex geladenen
Einheiten an der Membran haften. Auf diese Weise kann eine
Reaktionsmembran einer vergrößerten Porengröße verwendet werden, die nicht
blockiert werden wird.
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Wenn die komplex geladenen Einheiten Legionella-Bakterien sind, hat
die amphotere Membran vorzugsweise eine Porengröße von 1,2 µm bis
5µm. Am bevorzugtesten ist die Porengröße 3 µm.
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Für Legionella-Bakterien hat die amphotere Membran vorzugsweise eine
Oberflächenladung zum Entfernen bei einem pH-Wert der Flüssigkeit
zwischen 1 und 5 und eine Oberflächenladung zum Freigeben bei einem
pH-Wert der Flüssigkeit zwischen 7 und 11. Am bevorzugtesten ist die
Oberflächenladung zum Entfernen bei einem pH-Wert von 4, und die
Oberflächenladung zum Freigeben ist bei einem pH-Wert von 7.
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Die Flüssigkeitsprobe kann durch die amphotere Membran ohne die
Anwendung eines Vakuums geleitet werden.
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Das Nachfolgende stellt eine Beschreibung einiger Beispiele der
Erfindung in beispielhafter Weise dar, und bezüglich der Entfernung und der
Identifikation von Legionella-Bakterien wird ein Bezug zu Figur 1
hergestellt, die ein Diagramm des Zeta-Potentials (Oberflächenladung) in mV
über dem pH-Wert für spezifizierte amphotere Membranen ist.
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Die Legionella-Bakterien werden in Kühltürmen und Naßklimasystemen
gefunden. Legionella-Bakterien sind in dem Wasser dieser Türme oder
Systeme zusammen mit anderen unerwünschten Einheiten enthalten.
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Es ist gefunden worden, daß bei Wasserproben die Vielzahl derartiger
vorhandener unerwünschter Größen kleiner als 2 µm bezüglich der
Größe ist. Röntgenstrahlemissionsspektren zeigen, daß die Vielzahl
unerwünschter Größen in diesen Proben aus Silika bestehen. Man nimmt
an, daß diese Proben bezüglich der Partikelgröße typisch sind, obwohl
die Zusammensetzung der unerwünschten Größen variieren kann. Zellen
der Legionella-Bakterien haben eine Breite zwischen 0,4 µm und 0,6 µm
und eine Länge zwischen 1 µm und 3 µm.
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Somit ist die Größe der nicht bakteriellen unerwünschten Einheiten in
Wasserproben, die die Legionella-Bakterien enthalten, ähnlich in der
Abmessung wie die Abmessung der Legionella-Bakterien. Das bestätigt
das Vorhandensein des Problems des Entfernens derartiger unerwünschter
Einheiten, um eine Konzentration der Legionella-Bakterien für eine
Identifikation zu ermöglichen.
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Legionella-Bakterien sind als negativ geladen identifiziert worden.
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Die nachfolgende Testprozedur wurde verwendet, um eine Trennung der
Legionella-Bakterien von den unerwünschten Einheiten ähnlicher Größe
wie die Größe der Legionella-Bakterien zu testen. Diese Tests
verwendeten die folgenden Materialien:
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1. eine Reaktionsfiltereinheit, ausgerüstet mit einer 0,45 µm-Polysulfon-
Membran mit einer Porengröße von 0,45 µm;
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2. eine Vorfiltereinheit, ausgerüstet mit einer amphoteren Membran mit
einer Porengröße von 3 µm, die unter dem Handelsnamen
"BIODYNE A" durch die Pall Corporation vertrieben wird. Eine BIODYNE-
A-Membran ist eine ampbotere Nylon-66-Membran, die einen
Bereich von Oberflächenladungen bezogen auf den pH-Wert der
umgebenden Flüssigkeit abdecken kann. Bei niedrigen pH-Werten trägt sie
eine positive Ladung, die optimal bei einem pH-Wert von 4 ist.
Figur 1 ist ein Diagramm des Zeta-Potentials (in mV) über dem
pH-Wert für BIODYNE A. Außerdem sind derartige Membranen
hydrophil und erfordern deshalb kein Benetzen vor einer
Verwendung;
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3. einen Eluierungspuffer aus Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS),
pH-Wert 7,2, die 150 mM NaCl, 40 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 8 mM
NaH&sub2;PO&sub4; enthält.
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4. deionisiertes Wasser, das auf einen pH-Wert von 4 eingestellt ist,
indem Salzsäure verwendet wird;
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5. deionisiertes Wasser, das auf einen pH-Wert von 4 eingestellt ist,
indem eine Puffertablette verwendet wird, die durch British Drug
Houses Ltd. vertrieben wird;
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6. ein Wasch- bzw. Spülpuffer, der ein Detergens enthält;
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7. eine alkalische Phospatase als ein Antikörper-Enzym-Konjugat;
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8. ein Konjugat-Verdünnungsmittel-Puffer;
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9. ein Nitro-Blau-Tetrazolium als eine Substratlösung;
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10. eine Vakuum-Leitung;
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11. einen Farbvergleicher für sichtbar gemachte Legionella-Bakterien;
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12. wärme-getötete Legionella-Bakterien in destillierten Wasserproben
von Kühltürmen;
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13. Wasserproben bei einem pH-Wert von 4;
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14. ein Puffer bei einem pH-Wert von 4.
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Wo in dieser gesamten Beschreibung bezüglich der durch die Pall
Corporation hergestellten Membranen verwendet, bezieht sich der Begriff
"Porengröße" auf die absolute Partikelgröße, abhängig von der Dicke der
Membran und KL5, wie in der EP-B-0005536 beschrieben. Wenn
beispielsweise eine absolute Partikelgröße einer Membran 2 µm ist, die
Dicke der Membran 0,33 mm (0,013 Inch) ist und der KL5 0,92 bar
(13,2 p.s.i.) ist, so ist das äquivalent einer 2-mm-Porengrößenmembran.
Wenn keine Pall-Membranen verwendet werden, sind die Porengrößen
wie durch ihren Hersteller angegeben.
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Die Testprozedur war wie folgt:
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1. Eine BIODYNE-A-(Warenzeichen Pall Corp.)-Membran wurde in der
Vorfiltereinheit angeordnet und an der Vakuumleitung angeordnet.
Eine Menge an Wasser oder eines Puffers mit einem spezifizierten
pH-Wert mit oder ohne vorhandene Legionella-Zellen wurde jeder
Filtereinheit zugegeben und verblieb dort zwei bis zehn Minuten
lang. 30 Sekunden lang wurde ein Vakuum angelegt, um die Probe
hindurchzuziehen.
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Die Vorfiltereinheit wurde dann aus der Vakuumleitung entfernt und
an der Oberseite einer Reaktionsfiltereinheit befestigt. Die Einheiten
wurden dann an der Vakuumleitung angeordnet. Der Vorfilter wurde
dann eluiert, indem 5 ml oder 10 ml von Phosphat-gepufferter
Salzlösung (3) eines spezifizierten pH-Wertes zugegeben wurden, und
das Vakuum wurde verwendet, um die Probe hindurchzuziehen. Der
Vorfilter wurde dann entfernt und entsorgt. Nachdem das gesamte
Fluid durch die Reaktionsmembran hindurchgegangen ist, wurde das
Vakuum erneut 5 Minuten lang angelegt, um die Membran
vollständig zu trocknen.
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Der Reaktionsfilter wurde dann aus der Leitung entfernt und an
einer Kappe angeordnet. 1 ml Enzym-Konjugat wurde hinzugegeben
und 30 min. lang und bei 37ºC inkubiert.
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Die Kappen wurden dann von den Reaktionseinheiten entfernt, und die
Einheiten wurden an der Vakuumleitung erneut angeordnet. 10ml der
Waschpufferung wurden zugegeben und 5 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Das Vakuum wurde angelegt, bis die gesamte Waschpufferung
hindurchgezogen war. Das wurde viermal wiederholt. Zwei
Endwaschvorgänge von 2 ml destillierten Wassers pro Waschvorgang wurden
ausgeführt, wobei das Vakuum sofort angelegt wurde.
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Das Vakuum wurde dann zwei Minuten lang belassen, um die
Medien zu trocknen. Die Reaktionseinheit wurde dann entfernt und
wieder auf einer Kappe angeordnet. Dann wurde jeder Filtereinheit
1 ml Substratlösung zugegeben und 30 min lang bei 37ºC inkubiert.
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Das Substrat wurde abgegossen und die Kappe entfernt und entsorgt.
Die Reaktionsfiltereinheit wurde dann mit 10 ml destilliertem Wasser
durchgespült, indem die Vakuumleitung verwendet wurde.
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Die Reaktionsmembran wurde dann aus der Einheit entfernt und
sichtbar gemacht, und zwar mit einem positiven Ergebnis des
Erscheinens eines blauen ausgefällten Punktes auf der Mitte der
Membran.
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Die Tests wurden mit den folgenden variierenden Parametern
wiederholt.
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1. Die BIODYNE-A-(Warenzeichen der Pall Corp.)-Membran, die in
der Vorfiltereinheit verwendet wurde, wurde mit Porengrößen von
1,2 µm,
3 µm und 5 µm getestet.
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2. Der pH-Wert der Legionella-Lösung, die dem Vorfilter zugegeben
wurde, wurde variiert.
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3. Das Volumen an Flüssigkeit, in die die Legionella-Bakterien
zugegeben wurden, wurde variiert.
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4. Die Konzentration der Legionella wurde variiert.
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5. Die pH-Zusarnmensetzung und das Volumen des Eluierungspuffers
10 wurde variiert.
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6. Die Reaktionsmembran wurde variiert, um eine optimale
Reaktionsmembran zu finden.
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Die Ergebnisse dieser Tests waren wie folgt.
Test 1.
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Eine BIODYNE-A-(Warenzeichen Pall Corp.)-Membran mit einer
Porengröße von 3 µm wurde als optimal zur Verwendung in der
Vorfiltereinheit befunden. Es wurde jedoch gefunden, daß Porengrößen zwischen
1,2 µm und 5 µm auch verwendet werden könnten. Die
Oberflächenladung der BIODYNE-A-(Warenzeichen Pall Corp.)-Membran bei einem
pH-Wert von 4 ist ausreichend, um die Legionella-Bakterien an der
Membran zu binden. Anderes ungeladenes und positiv geladenes
partikelförmiges Material kleiner als 3 µm ging durch die Membran hindurch.
Es ist auch gefunden worden, daß die vergrößerte Porengröße der
Membran das Potential bietet, daß die Probe hindurchtropft, was potentiell
die Notwendigkeit einer Vakuumquelle eliminiert.
Test 2.
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Der optimale pH-Wert der für den Vorfilter angewendeten Legionella-
Lösung war der pH-Wert von 4, obwohl gefunden wurde, daß Lösungen
mit pH-Werten zwischen 1 und 5 verwendet werden könnten.
Test 3.
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Bis zu 200 ml unkonzentrierter Legionella-Lösung konnte durch den
Vorfilter bei einer 100%igen Entfernung der Legionella hindurchgeleitet
werden. Das war infolge der Tatsache, daß die Porengröße
vergleichsweise groß ist, daß die Membran hydrophil ist und daß sie negativ
geladen ist. Demgemäß wurde die Notwendigkeit, die Probe vor einer
Vorfilterung zu konzentrieren, umgangen.
Test 4.
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Eine 100%ige Entfernungsrate und quantitative Erfassung der Legionella-
Bakterien wurde in einem Konzentrationsbereich von 5 x 10&sup4; bis 5 x 10&sup8;
von Legionella pro Probe erhalten, obwohl die Legionella entfernt und
erfaßt wurden bei einer Konzentration von 10³ Legionella pro Probe.
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Das zeigt, daß ein breiter Konzentrationsbereich behandelt werden
könnte.
Test 5.
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Der optimale pH-Wert und die Zusammensetzung der
Eluierungspufferung war Phosphat-gepufferte Salzlösung bei einem pH-Wert von 7 bis
7,2. Es könnten jedoch auch Eluierungspufferungen mit einem pH-Wert
zwischen 6,5 und 11 verwendet werden.
Test 6.
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Eine Reaktionsmembran aus Polysulfon mit einer Porengröße von 0,45
µm wurde blockiert durch unerwünschte Einheiten in Proben von
Kühlwassertürmen bei mindestens 50% der getesteten Proben. Das trifft zu,
sweil, obwohl die amphotere Membran den Durchgang von unerwünschten
Einheiten einer ähnlichen Größe wie die Legionella-Bakterien zuläßt, sie
jegliche derartige unerwünschte Einheiten fängt, die negativ geladen sind.
Derartige unerwünschte Einheiten werden mit den Legionella-Bakterien
freigegeben und neigen dazu, die Reaktionsmembran zu blockieren.
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Mit einer Reaktionsmembran von BIODYNE-B-(Warenzeichen Pall
Corp.)- oder IMMUNODYNE-I-(Warenzeichen Pail Corp.)-Membranen
mit einer Porengröße von 3 µm erzeugten Proben aus Kühlwassertürmen
fast keine Blockierung. Das ist so, weil die Porengröße derartiger
Membranen größer ist als die Legionella-Bakterien und irgendwelcher negativ
geladener unerwünschter Einheiten, die von dem Vorfilter freigegeben
werden.
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Die BIODYNE-B-(Warenzeichen Pall Corp.) ist eine poröse Membran
aus Hochreinheits-Nylon 66, die eine positive ladungsmodifizierte
Oberfläche hat. Die IMMUNODYNE-(Warenzeichen Pall Corp.) ist eine
poröse Membran aus Hochreinheits-Nylon 66 mit einer chemisch
voraktivierten Oberfläche, die eine hohe Dichte kovalenter Bindungsstellen
bietet.
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Da die Membran 100% oder nahezu 100% der Legionella-Bakterien
entfernt, wird die Sichtbarmachung der Bakterien quantitativ sein, was
somit die Notwendigkeit, die im Stand der Technik vorhanden ist, des
Ausführens eines zweiten Tests für eine Quantifizierung reduziert.
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Mit der IMMUNODYNE-I-(Warenzeichen Pall Corp.)-Membran als der
Reaktionsmembran konnten Anti-Legionella-Antikörper auf der Membran
als ein Affinitätsmeßfühler immobilisiert werden, um die von dem
Vorfilter freigegebenen Legionella zu fangen, wodurch wiederum ein
Blockieren vermieden wird und eine Identifikation unterschiedlicher Subtypen
der Legionella-Bakterien ermöglicht wird.
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Man wird anerkennen, daß, obwohl die oben beispielhaft angeführten
Prozeduren für die Sichtbarmachung von Legionella-Bakterien sind, eine
ähnliche Prozedur zum Identifizieren anderer komplexgeladener Einheiten
wie z.B. Pyrogene, Mycoplasma, Bakterien, Nukleinsäuren, Chlamydia,
Plasmodia, Viren, Proteine und anorganische Verbindungen wie z.B.
Eisenoxid angewendet werden könnten. In dem Fall, wenn die
IMMUNODYNE-I als die Reaktionsmembran verwendet wird, kann der
Affinitätsmeßfühler ein anderer als Antikörper sein, z.B. kann eine
Nukleinsäuresequenz als ein Affinitätsmeßfühler verwendet werden, um Viren zu
identifizieren.